JP2022533245A - 抗体のドメイン特異的電荷変異体の特徴付け - Google Patents
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Abstract
本発明は、好ましくは二重特異性抗体内のドメイン特異的電荷変異体を特徴付けるための、酵素消化補助画像化キャピラリー電気泳動（ＤｉＣＥ）に基づいて、抗体などのペプチドまたはタンパク質の生物物理学的特徴を分析するための方法およびシステムを提供する。方法およびシステムは、タンパク質を消化酵素で処理してタンパク質の成分を生成すること、成分を還元するかまたは変性させること、およびそれらの等電点に基づいて成分を分離することを含む。
Description
本発明は、概して、ドメイン特異的変異体の生物物理学的特徴付けを含む抗体を特徴付けるための方法およびシステムに関する。
ドメイン特異的変異体を含む、治療用ペプチドおよびタンパク質の生物物理学的特性は、それらの安全性、有効性、および貯蔵寿命に影響を及ぼす可能性がある。例えば、異なる電荷変異体の存在は、溶解度、結合および安定性を変化させることがある。
抗体などの治療用ペプチドまたはタンパク質は、様々な翻訳後修飾（ＰＴＭ）、タンパク質分解、酵素修飾および化学修飾により、異なる変異体を獲得し、不均一になることがある。生物物理学的特性に対するこれらの変化は、ペプチドおよびタンパク質が産生されている間および産生された後のほぼあらゆる時点で生じ得る。生物物理学的特徴のこれらの変更は、治療用ペプチドおよびタンパク質の安全性、有効性および貯蔵寿命に影響を及ぼし得るため、特定の治療用ペプチドまたはタンパク質についての異なる変異体、ならびにそれらに関連する安全性、有効性および貯蔵寿命プロファイルを同定することが重要である。
治療用タンパク質の不均一性をより効率的に正確に特徴付けるための方法およびシステムについての必要性が存在することが認識されるであろう。さらに、方法およびシステムは、特定の結合能力、生物学的活性、薬物安全性、および貯蔵寿命に関連し得る電荷変異体を同定するための貴重な情報を提供することができる。
抗体などの治療用ペプチドまたはタンパク質の製造中の不均一性の発生は、治療用タンパク質の安全性、有効性および品質に影響を及ぼし得るため、懸念される可能性がある。本出願は、治療用ペプチドまたはタンパク質のドメイン特異的変異体を分析するための、治療用ペプチドまたはタンパク質の生物物理学的特徴付けを提供する。
本明細書に開示の例示的な実施形態は、抗体内、好ましくは二重特異性抗体内の様々なドメイン特異的電荷変異体のレベルを検出および定量するための等電点電気泳動を含む、消化補助画像化キャピラリー電気泳動（ＤｉＣＥ）法を使用して抗体の電荷変異体を同定または定量するための方法およびシステムを提供することによって、前述の要求を満たす。
本開示は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の変異体を同定するための方法およびシステムを提供し、方法およびシステムは、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を１つ以上の消化酵素で処理して、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を生成すること、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を還元するかまたは変性させること、および、続いて少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の２つ以上の成分を分離することを含む。
いくつかの態様において、消化酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリンＧ分解酵素、シアリダーゼ、システインプロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、パパイン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、ペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテアーゼ、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の変異体を同定するための方法は、１つ以上の成分を、複数の相において１つ以上の消化酵素で処理して、追加の成分を生成することをさらに含む。
いくつかの態様において、還元または変性の条件は、尿素、塩化グアニジニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、有機溶媒、アルカリ性溶液、酸性溶液、またはそれらの組み合わせの使用を含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分は、成分の電荷変異体に基づいて分離され、物理パラメータは、電荷不均一性、分子量、電荷、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分は、等電点電気泳動法、キャピラリー等電点電気泳動法、画像化キャピラリー等電点電気泳動法、クロマトグラフィー結合キャピラリー電気泳動法、クロマトグラフィー結合画像化キャピラリー電気泳動法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、または液体クロマトグラフィー質量分析法を使用して分離される。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための方法は、分離プロファイルを生成することをさらに含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための方法は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の分離された成分を定量することをさらに含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための方法は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の分離された成分を同定することをさらに含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための方法は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を、異なる電荷変異体を有する少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質についての分離プロファイルの比較に基づいて同定することをさらに含む。
さらに他の態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための方法は、同定された成分の糖化またはＣ末端リジンのレベルを定量することをさらに含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための方法において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質は、二重特異性抗体である。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質は、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片またはタンパク質医薬品である。
本開示は、少なくとも部分的に、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するためのシステムを提供し、システムは、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質；少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を生成することができる第１の消化酵素；少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を還元するかまたは変性させることができる環境；ならびに１つ以上のキャピラリーにおける１つ以上の物理パラメータによって消化および還元または変性された少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を分離することができる装置、を含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するためのシステムにおいて、環境は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を処理することができる第２の消化酵素をさらに含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するためのシステムにおいて、第１または第２の消化酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素、シアリダーゼ、システインプロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、パパイン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、ペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、またはプロテアーゼである。
さらに他の態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するためのシステムにおいて、環境は、還元剤または変性剤をさらに含み、還元剤または変性剤は、尿素、塩化グアニジニウム、還元剤、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、有機溶媒、アルカリ性溶液、酸性溶液、またはこれらの組み合わせである。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するためのシステムにおいて、装置は、例えば、物理パラメータが電荷不均一性、分子量、電荷、またはそれらの組み合わせである場合を含む、１つ以上のキャピラリーにおける１つ以上の物理パラメータに基づいて成分を分離する。
いくつかの態様において、装置は、等電点電気泳動装置、キャピラリー等電点電気泳動装置、画像化キャピラリー等電点電気泳動装置、クロマトグラフ結合キャピラリー電気泳動装置、クロマトグラフ結合画像化キャピラリー電気泳動装置、陽イオン交換クロマトグラフ装置、または液体クロマトグラフィー質量分析装置である。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するためのシステムにおいて、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質は、二重特異性抗体である。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するためのシステムにおいて、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質は、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片、またはタンパク質医薬品である。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考慮される場合、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、様々な実施形態および多数の具体的な詳細を示すが、限定としてではなく、例示として与えられ得る。多くの置換、修正、追加、または再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。
詳細な説明
いくつかの場合において、治療用タンパク質の電荷の変化が、結合能力、生物学的活性、および貯蔵寿命に影響を及ぼし得るため、治療用タンパク質の電荷変異体の存在に起因する薬物有効性、薬物効力、および患者の安全性に関する懸念がある。本出願の方法およびシステムは、生物学的薬剤の投与などの薬物投与のための薬物動態、有効性および安全性に関連する臨床薬理学に影響を与える治療用タンパク質の電荷不均一性に関する貴重な情報を提供し得る。
いくつかの場合において、治療用タンパク質の電荷の変化が、結合能力、生物学的活性、および貯蔵寿命に影響を及ぼし得るため、治療用タンパク質の電荷変異体の存在に起因する薬物有効性、薬物効力、および患者の安全性に関する懸念がある。本出願の方法およびシステムは、生物学的薬剤の投与などの薬物投与のための薬物動態、有効性および安全性に関連する臨床薬理学に影響を与える治療用タンパク質の電荷不均一性に関する貴重な情報を提供し得る。
本開示は、抗体などのペプチドまたはタンパク質の生物物理学的特徴を分析するための方法およびシステムを提供することによって、前述の要求を満たす方法およびシステムを提供する。本出願の方法およびシステムは、好ましくは、二重特異性抗体とその親単一特異性抗体との間の電荷変異体の比較における、ドメイン特異的電荷変異体などのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を特徴付けるための酵素消化補助画像化キャピラリー電気泳動（ＤｉＣＥ）に基づく。変異体は、電荷不均一性、分子量、電荷、またはそれらの組み合わせを含む生物物理学的パラメータによって特徴付けられ得る。本出願の方法およびシステムは、ヒト免疫グロブリンのすべてのサブクラスに使用され得る。本出願の方法またはシステムにおけるペプチドまたはタンパク質は、例えば、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片またはタンパク質医薬品であり得る。
モノクローナル抗体産物などの治療用タンパク質は、グリコシル化、脱グリコシル化、アミド化、脱アミド化、酸化、糖化、末端環化、Ｃ末端リジン変異、Ｃ末端アルギニン変異、Ｎ末端ピログルタミン酸変異、Ｃ末端グリシンアミド化、Ｃ末端プロリンアミド化、スクシンイミド形成、シアリル化、または脱シアリル化などの様々な翻訳後修飾、酵素および化学修飾の存在により、非常に不均一である。さらに、タンパク質産物の凝集、分解、変性、断片化、または異性化もまた、電荷不均一性をもたらし得る。表１は、例示的な化学分解経路、およびペプチドまたはタンパク質の電荷を変化へのそれらの影響を示す。
（表１）電荷変異体の化学分解経路
（表１）電荷変異体の化学分解経路
モノクローナル抗体などの治療用ペプチドまたはタンパク質の製造中に、タンパク質分解および／または翻訳後修飾（ＰＴＭ）の存在の結果として電荷不均一性が潜在的にもたらされる。製造された薬物原料内のタンパク質の電荷変異体の特徴付けは、効力などのタンパク質の特性と、電荷変異体に関連する物理的および化学的変化との間の相関関係を完全に理解するために必要である。
特に、モノクローナル抗体を製造するために、抗体の異なるドメイン上のＰＴＭは、異なる生物学的効果をもたらし得、薬物品の安定性、安全性および効力に潜在的に影響を与え得る。したがって、ドメイン特異的修飾の特徴付けおよび所定の監視は、治療用抗体産物の品質を確保するために重要である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＩｄｅＳ）の免疫グロブリンＧ分解酵素を使用して、モノクローナル抗体産物における個々のドメインの不均一性を調べた。ＩｄｅＳは、ヒンジ領域の下で抗体の重鎖を切断し、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’断片を産生し得る。これらの抗体断片は、液体クロマトグラフィー／質量分析、キャピラリー等電点電気泳動、グリカンマッピング、または逆相クロマトグラフィーによって分析されるような、さらなる特徴付けのために、さらに還元されて、３つの抗体ドメイン、例えば、ＬＣ（軽鎖）、Ｆｄ’、およびＦｃ’／２を生成し得る。（Ａｎ，Ｙ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎａｌｙｓｉｓ．ｍＡｂｓ ６（４）： ８７９－８９３）。
本出願は、二重特異性抗体を含む抗体内の様々なドメイン特異的電荷変異体のレベルを検出および定量するための等電点電気泳動を含むＤｉＣＥに基づく方法およびシステムを提供する。いくつかの例示的な実施形態において、方法およびシステムは、Ｆ （ａｂ’）２およびＦｃ’断片を生成するためのＩｄｅＳを使用した酵素消化、続く、ＬＣ、Ｆｄ’およびＦｃ’／２を分離するための、還元され、変性された条件下での画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）を含む。
本出願の利点は、二重特異性抗体の異なるアームのドメイン特異的ＰＴＭを検出および定量するためのＤｉＣＥに基づく高感度な方法を提供することを含む。いくつかの例示的な実施形態において、ＤｉＣＥベースの方法を使用して、抗原Ｃおよび抗原Ａの両方を標的とする二重特異性抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）における部位特異的糖化を検出および定量する。抗原Ｃ×抗原Ａ二重特異性抗体の抗原ＣアームのＣＤＲにおける残基Ｘの部位特異的糖化を、ｉｃＩＥＦおよび陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）などの従来の完全なままの電荷分析を使用して正確に定量することができなかった。本出願の利点は、Ｆｃドメイン上の未処理のＣ末端リジンのレベルを評価する際に、抗体のドメイン特異的電荷変異体を検出するためのＤｉＣＥに基づく高感度な方法を提供することを含む。
本出願はまた、ＰＴＭの定量化のためのＤｉＣＥに基づく高感度の方法またはシステムを提供し、これは、ペプチドマッピングを使用して得られた結果に相当すると考えられる。本出願の方法およびシステムは、特定のＰＴＭを監視するためのペプチドマッピングに相当する直交方法を提供し、抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、および同時に投与される抗体などの治療用ペプチドおよびタンパク質の産物の品質を保証する。
本出願の利点は、二重特異性抗体およびその親単一特異性抗体を単一の分析において分析するためのＤｉＣＥベースの方法またはシステムをさらに含み、これは、二重特異性抗体分子内のドメイン特異的電荷不均一性のより完全なビューを提供することができる。ＤｉＣＥベースの方法またはシステムにおける酵素消化の使用は、完全なままの二重特異性抗体を消化することによって、結果として得られる抗体断片の固有電荷における差を顕在化する利点を提供する。これにより、結果として得られた抗体断片またはドメインを等電点電気泳動によってより完全に分離することができる。
ＤｉＣＥに基づく本出願の方法またはシステムは、約０．５ｍｇ未満の最小限の試料を必要とする迅速なミディアムスループット方法を提供することにより、いくつかの二重特異性抗体の個々のアームに関する電荷変異体を区別するために二重特異性抗体に適用され得る。本出願はまた、糖化および未処理のＣ末端リジンなどの特定の翻訳後修飾のレベルを正確に定量するために使用され得る。本出願は、二重特異性抗体を超えて適用され、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）および組み合わせ産物などの他の様式の電荷変異体をより完全に特徴付けることができる。
本出願の方法およびシステムは、ペプチドまたはタンパク質の成分を生成するための酵素消化反応を提供する。これらの成分は、ペプチドまたはタンパク質のより小さな断片である。続いて、ペプチドまたはタンパク質の成分は、ペプチドまたはタンパク質の成分の電荷に基づいて還元および／または変性された状態で分離され、ペプチドまたはタンパク質内の個々のドメインの電荷不均一性を分析され得る。これらの成分は、成分間の等電点における差が増加したより小さい断片であるため、ペプチドまたはタンパク質の成分はまた、成分間の等電点における差に基づいて分離され得る。
いくつかの例示的な実施形態において、二重特異性抗体またはその親単一特異性抗体を、酵素消化反応に供して、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’などの抗体の断片を生成する。続いて、これらの抗体断片は、等電点電気泳動を使用して、それらの電荷に基づいて分離され得る。いくつかの例示的な実施形態において、これらの抗体断片はさらに、ＬＣ、Ｆｄ’、およびＦｃ’／２などの特定のドメインを生成するために、還元および／または変性された条件に供される。続いて、これらの抗体ドメインは、電荷に基づいて分離され、抗体内の個々のドメインの電荷不均一性を分析され得る。抗体ドメイン間の等電点における差は、これらのドメインが完全なままの抗体分子と比較してより小さい分子量を有するため、等電点における測定可能な差での分離を可能にする。これらの抗体ドメインは、抗体ドメインの等電点間の等電点における差が増加している。
他の例示的な実施形態において、本出願は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための方法を提供し、方法は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を１つ以上の消化酵素で処理して、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を生成することと、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を還元するかまたは変性させることと、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の２つ以上の成分を分離することであって、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分が、等電点電気泳動などの成分の電荷変異体に基づいて分離される、ことと、を含む。いくつかの態様において、成分の分離プロファイルを生成し、比較して、電荷変異体の修飾レベルを検出または定量する。これらは、薬物投与についての薬物動態、有効性、および安全性に関連する臨床薬理学に影響を与える治療用タンパク質の電荷不均一性の特徴付けおよび定量化の長期的に感じられるニーズを満たす。
既存の方法の限界を考慮して、治療用ペプチドまたはタンパク質の電荷不均一性の同定、検出、または定量するための有効で感度の高い方法が、ＤｉＣＥベースの方法を使用して開発されてきた。
「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解される必要があり、用語「約」および「およそ」は、当業者によって理解されるように標準的な変化を可能にすると理解される必要があり、範囲が提供される場合、端点が含まれる。
本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、それぞれ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。
いくつかの例示的な実施形態において、本開示は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の変異体を同定するための方法を提供し、方法は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を１つ以上の消化酵素で処理して、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を生成すること、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を還元するかまたは変性させること、および、成分の等電点に基づいて少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の２つ以上の成分を分離することを含む。いくつかの例示的な実施形態において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための方法において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質は、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片、またはタンパク質医薬品である。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、共有結合で連結されたアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、概して「ペプチド」または「ポリペプチド」として当技術分野で知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。タンパク質は、単一の機能的生体分子を形成するために、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。いくつかの態様において、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、宿主細胞タンパク質、またはそれらの組み合わせであり得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質医薬品」は、本質的に完全にまたは部分的に生物学的であり得る活性成分を含む。いくつかの例示的な実施形態において、タンパク質医薬品は、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗原、ワクチン、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、タンパク質－薬物コンジュゲート、細胞、組織、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの他の例示的な実施形態において、タンパク質医薬品は、ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗体、抗原、ワクチン、ペプチド－薬物コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、タンパク質－薬物コンジュゲート、細胞、組織、またはそれらの組み合わせの組み換え、操作された、修飾された、変異した、または切断されたバージョンを含み得る。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域などの完全なままの抗体の一部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、ならびに抗体断片から形成されるトリアボディ、テトラボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、および多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子である。抗体断片は、様々な手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、完全なままの抗体の断片化によって酵素的または化学的に産生され得、および／またはそれは、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生され得る。代替的または追加的に、抗体断片は、完全にまたは部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意に単鎖抗体断片を含み得る。代替的または追加的に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合によりともに連結された複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意に多分子複合体を含み得る。
本明細書で使用される場合、「抗体－薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」という用語は、不安定な結合を有するリンカーによって生物学的活性薬物に結合された抗体を指し得る。ＡＤＣは、抗体のアミノ酸残基の側鎖に共有結合で連結され得る生物学的活性薬物（またはペイロード）のいくつかの分子を含み得る（Ｓｉｌｅｒ Ｐａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ，６ ｍＡｂｓ ３４－４５（２０１３））。ＡＤＣに使用される抗体は、標的部位での選択的蓄積および持続的保持のために十分な親和性で結合し得る。ほとんどのＡＤＣは、ナノモル範囲におけるＫｄ値を有し得る。ペイロードは、ナノモル／ピコモル範囲における効力を有し得、標的組織へのＡＤＣの分布に続いて達成可能な細胞内濃度に到達することが可能であり得る。最後に、ペイロードと抗体との間の接続を形成するリンカーは、抗体部分の薬物動態学的特性（例えば、長い半減期）を利用するために、およびペイロードが組織内に分布するときに抗体に結合したままであることを可能にするために、循環において十分に安定であることができ、ＡＤＣが標的細胞内に取り込まれ得ると、生物学的活性薬物の効率的な放出も可能であろう。リンカーは、細胞処理中には切断不可能であり、およびＡＤＣが標的部位に到達すると切断可能であるものを含み得る。切断不可能なリンカーの場合、呼び出し内に放出される生物学的活性薬物は、リソソーム内のＡＤＣの完全なタンパク質分解の後に、ペイロードおよび抗体のアミノ酸残基、典型的にはリジンまたはシステイン残基に依然として結合しているリンカーの全ての要素を含む。切断可能なリンカーは、その構造がペイロードと抗体上のアミノ酸結合部位との間の切断部位を含むものである。切断機構は、酸性細胞内区画における酸に不安定な結合の加水分解、細胞内プロテアーゼまたはエステラーゼによるアミドまたはエステル結合の酵素切断、および細胞内の還元環境によるジスルフィド結合の還元的切断を含み得る。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）および重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域のものである。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり得る。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するためにトランスフェクションされた宿主細胞から単離された抗体などの組換え手段によって調製、発現、作成または単離されたものを含むが、これに限定されない。ＩｇＧは、抗体のサブセットを含む。
例示的な実施形態
本明細書に開示の実施形態は、ＤｉＣＥベースの方法を使用して、治療用ペプチドまたはタンパク質の電荷不均一性を同定、検出、または定量するための組成物、方法、およびシステムを提供する。
本明細書に開示の実施形態は、ＤｉＣＥベースの方法を使用して、治療用ペプチドまたはタンパク質の電荷不均一性を同定、検出、または定量するための組成物、方法、およびシステムを提供する。
いくつかの例示的な実施形態において、本開示は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための方法を提供し、方法は、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を１つ以上の消化酵素で処理して、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を生成すること、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を還元するかまたは変性させること、および、電荷変異体の電荷不均一性に基づいて少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の２つ以上の成分を分離することを含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための方法を使用して、ペプチドまたはタンパク質の修飾のレベルを定量する。
いくつかの例示的な実施形態において、ペプチドまたはタンパク質の修飾は、翻訳後修飾、酵素、化学修飾、凝集、分解、変性、断片化または異性化を含む。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質の修飾は、グリコシル化、脱グリコシル化、アミド化、脱アミド化、酸化、糖化、末端環化、Ｃ末端リジン変異、Ｃ末端アルギニン変異、Ｎ末端ピログルタミン酸変異、Ｃ末端グリシンアミド化、Ｃ末端プロリンアミド化、スクシンイミド形成、シアリル化、脱シアリル化、付加物形成、ジスルフィド媒介修飾、アシアリル化（末端ガラクトース）、またはＣ末端リジンおよびグリシンアミド化を含む。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質の修飾は、メチオニン、システイン、リジン、ヒスチジンまたはトリプトファンの酸化を含む。
いくつかの態様において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための方法において、消化酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素、シアリダーゼ、システインプロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、パパイン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、ペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテアーゼ、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、酵素消化は、ＩｄｅＳを使用して、１×ＤＰＢＳ中、約５ｍｇ／ｍＬで約１００μｌの抗体試料（約０．５ｍｇの総タンパク質）を調製することによって実施された。
いくつかの例示的な実施形態において、ペプチドまたはタンパク質の成分は、等電点電気泳動法、キャピラリー等電点電気泳動法、画像化キャピラリー等電点電気泳動法、クロマトグラフィー結合キャピラリー電気泳動法、クロマトグラフィー結合画像化キャピラリー電気泳動法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、または液体クロマトグラフィー質量分析法を使用して、電荷変異体の電荷不均一性に基づいて分離される。
いくつかの例示的な実施形態において、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するための法において、還元または変性の条件は、尿素、塩化グアニジニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、有機溶媒、アルカリ性溶液、酸性溶液、またはそれらの組み合わせの使用を含む。いくつかの態様において、ペプチドまたはタンパク質の成分は、約１～５０ｍＭのＴＣＥＰ、約５～１５ｍＭのＴＣＥＰ、または好ましくは約１０ｍＭのＴＣＥＰを有する約１～１０Ｍの塩化グアニジニウム、約３～８Ｍの塩化グアニジニウム、または好ましくは約６Ｍの塩化グアニジニウムを使用して還元および変性され、室温で約０．１～２時間、約０．５～１．５時間、または好ましくは約１時間インキュベートされる。
その後の緩衝液交換は、好ましくは、約３５ｍＭのリン酸塩、約ｐＨ６．０、約８Ｍの尿素および約１ｍＭのＴＣＥＰを含む緩衝液を使用して、帯電した緩衝液成分を除去するために実施される。ペプチドまたはタンパク質の成分は、好ましくは、約２１ｍＭのリン酸塩、約ｐＨ６．０、約８Ｍの尿素、約０．６ｍＭのＴＣＥＰ、約０．３５％（ｗ／ｖ）のメチルセルロース、約４％（ｖ／ｖ）のｐＨ３～１０のファルマライトを含む組成物の下でｉｃＩＥＦに供される。
方法またはシステムは、前述のペプチド、タンパク質、抗体、タンパク質医薬品、消化酵素、還元／変性条件、等電点電気泳動、画像化キャピラリー等電点電気泳動、クロマトグラフィー結合キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー結合画像化キャピラリー電気泳動法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、または液体クロマトグラフィー質量分析法のうちのいずれかに限定されないことが理解される。
本明細書で提供される方法ステップの数字および／または文字での連続したラベル付けは、方法またはその任意の実施形態を特定の指示された順序に限定することを意味しない。
特許、特許出願、公開された特許出願、アクセッション番号、技術論文、および学術論文を含む様々な出版物が、本明細書全体で引用される。これらの引用文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、本開示をより詳細に説明するために提供される以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。これらは、説明を意図しており、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
材料および試薬の調製
１．１．単一特異性抗体および二重特異性抗体。
いくつかの治療用抗体を、二重特異性抗体およびそれらの親単一特異性抗体を含む生物物理学的特徴付けに供した。二重特異性抗体の形式は、２つの異なる重鎖（ＨＣ）を２つの共通軽鎖（ＬＣ）と対合させることを含み、これにより、２つの異なる抗原を標的とする２つの独自の抗原結合部位を可能にする。例えば、ＭＡＢ４は、抗原Ｂおよび抗原Ａの両方を標的とする二重特異性抗体である。ＭＡＢ４の重鎖における抗原Ａアームは、２つのアミノ酸置換を有する。ＭＡＢ４の重鎖のうちの１つのＦｃ領域における２つのアミノ酸の置換は、例えば、星置換またはＦｃ＊と称されるＲＦを有する置換されたＨＹとのタンパク質Ａ結合を無効にする。この星置換は、非置換重鎖と置換重鎖との間の理論的等電点の差に寄与し、経験による（例えば、観察された、または実験に基づく）等電点に基づく抗体精製または分離を促進し得る。
１．１．単一特異性抗体および二重特異性抗体。
いくつかの治療用抗体を、二重特異性抗体およびそれらの親単一特異性抗体を含む生物物理学的特徴付けに供した。二重特異性抗体の形式は、２つの異なる重鎖（ＨＣ）を２つの共通軽鎖（ＬＣ）と対合させることを含み、これにより、２つの異なる抗原を標的とする２つの独自の抗原結合部位を可能にする。例えば、ＭＡＢ４は、抗原Ｂおよび抗原Ａの両方を標的とする二重特異性抗体である。ＭＡＢ４の重鎖における抗原Ａアームは、２つのアミノ酸置換を有する。ＭＡＢ４の重鎖のうちの１つのＦｃ領域における２つのアミノ酸の置換は、例えば、星置換またはＦｃ＊と称されるＲＦを有する置換されたＨＹとのタンパク質Ａ結合を無効にする。この星置換は、非置換重鎖と置換重鎖との間の理論的等電点の差に寄与し、経験による（例えば、観察された、または実験に基づく）等電点に基づく抗体精製または分離を促進し得る。
ＭＡＢ３は、重鎖において星置換を有さない、例えば、Ｆｃ／Ｆｃである、抗原Ｂを標的とする単一特異性抗体である。ＭＡＢ１は、両方の重鎖において星置換基を有する、例えば、Ｆｃ＊／Ｆｃ＊である、抗原Ａを標的とする単一特異性抗体である。ＭＡＢ４は、抗原Ｂおよび抗原Ａの両方を標的とする二重特異性抗体である。ＭＡＢ４（Ｆｃ／Ｆｃ＊）は、図１Ａに示されるように、ＭＡＢ３（Ｆｃ／Ｆｃ）由来の単一重鎖およびＭＡＢ１（Ｆｃ＊／Ｆｃ＊）由来の単一重鎖を組み合わせることによって得られる。ＭＡＢ３とＭＡＢ１との間のアミノ酸配列の比較において、図１Ａに示されるように、重鎖のＦｃ領域が異なる。図１Ａに示される対応する位置において、ＭＡＢ３は、ヒスチジン（Ｈ）およびチロシン（Ｙ）残基を有し、ＭＡＢ１は、アルギニン（Ｒ）およびフェニルアラニン（Ｆ）を有する。
ＭＡＢ２は、約４０％の糖化を有し、抗原Ｃおよび抗原Ａの両方を標的とする二重特異性抗体である。図１Ｂに示されるように、ＭＡＢ２の糖化は、ＭＡＢ２の重鎖の抗原ＣアームのＣＤＲ領域における単一残基 残基Ｘで生じる。残基Ｘでの糖化は、薬物活性および効力に影響を及ぼす。ＭＡＢ２の重鎖の抗原Ａアームは、Ｆｃ領域において星置換を有するＧ親生殖細胞系列に由来する。
２．１抗体の酵素消化
図２に示されるように、抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｄｅＳ）を使用してＦ（ａｂ’）２およびＦｃ’断片を生成するなど、抗体断片を生成するための酵素消化に供される。Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’断片はさらに、ＬＣ、Ｆｄ’およびＦｃ’／２などの抗体ドメインを生成するために、還元および／または変性された条件に供され得る。例えば、ＭＡＢ４（抗原Ｂ×抗原Ａ、Ｆｃ／Ｆｃ＊）がＩｄｅＳ消化に供される場合、ＭＡＢ４のＦ（ａｂ’）２断片およびＦｃ’断片を生成する。ＭＡＢ４のＦ（ａｂ’）２断片が還元および／または変性された条件に供される場合、２つのＦｄ’（例えば、抗原Ｂ－Ｆｄ’および抗原Ａ－Ｆｄ’）、および２つの軽鎖（ＬＣ）を生成する。ＭＡＢ４のＦｃ’断片が還元および／または変性された条件に供される場合、それは、２つの抗体ドメイン、例えば、Ｆｃ’の抗原ＢアームおよびＦｃ’の抗原Ａアーム（星置換を有する）を生成する。
図２に示されるように、抗体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｄｅＳ）を使用してＦ（ａｂ’）２およびＦｃ’断片を生成するなど、抗体断片を生成するための酵素消化に供される。Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’断片はさらに、ＬＣ、Ｆｄ’およびＦｃ’／２などの抗体ドメインを生成するために、還元および／または変性された条件に供され得る。例えば、ＭＡＢ４（抗原Ｂ×抗原Ａ、Ｆｃ／Ｆｃ＊）がＩｄｅＳ消化に供される場合、ＭＡＢ４のＦ（ａｂ’）２断片およびＦｃ’断片を生成する。ＭＡＢ４のＦ（ａｂ’）２断片が還元および／または変性された条件に供される場合、２つのＦｄ’（例えば、抗原Ｂ－Ｆｄ’および抗原Ａ－Ｆｄ’）、および２つの軽鎖（ＬＣ）を生成する。ＭＡＢ４のＦｃ’断片が還元および／または変性された条件に供される場合、それは、２つの抗体ドメイン、例えば、Ｆｃ’の抗原ＢアームおよびＦｃ’の抗原Ａアーム（星置換を有する）を生成する。
等電点電気泳動のための器具．
１．１．消化補助画像化キャピラリー電気泳動（ＤｉＣＥ）のワークフロー
ＤｉＣＳを使用したペプチドまたはタンパク質の電荷を同定する方法は、ペプチドまたはタンパク質を酵素消化反応で処理して、ペプチドまたはタンパク質の成分を生成すること、および成分の電荷または等電点に基づいて、ペプチドまたはタンパク質の成分を分離することを含む。図２は、二重特異性抗体の断片を分離するためのｉｃＩＥＦ電気泳動を使用する一般的なＤｉＣＥワークフローの実施形態を示し、二重特異性抗体は、ＩｄｅＳを使用して断片化される。
１．１．消化補助画像化キャピラリー電気泳動（ＤｉＣＥ）のワークフロー
ＤｉＣＳを使用したペプチドまたはタンパク質の電荷を同定する方法は、ペプチドまたはタンパク質を酵素消化反応で処理して、ペプチドまたはタンパク質の成分を生成すること、および成分の電荷または等電点に基づいて、ペプチドまたはタンパク質の成分を分離することを含む。図２は、二重特異性抗体の断片を分離するためのｉｃＩＥＦ電気泳動を使用する一般的なＤｉＣＥワークフローの実施形態を示し、二重特異性抗体は、ＩｄｅＳを使用して断片化される。
いくつかの例示的な実施形態において、酵素消化は、ＩｄｅＳを使用して、１×ＤＰＢＳ中、約５ｍｇ／ｍＬで約１００μｌの抗体試料（約０．５ｍｇの総タンパク質）を調製することによって実施された。続いて、試料を、室温で約１時間インキュベーションした約１０ｍＭのＴＣＥＰを有する約６Ｍの塩化グアニジニウムを使用して還元し、変性させた。緩衝液交換は、約３５ｍＭのリン酸塩、約ｐＨ６．０、約８Ｍの尿素および約１ｍＭのＴＣＥＰを含む緩衝液を使用して、帯電した緩衝液成分を除去するために実施された。試料を、約２１ｍＭのリン酸塩、約ｐＨ６．０、約８Ｍの尿素、約０．６ｍＭのＴＣＥＰ、約０．３５％（ｗ／ｖ）のメチルセルロース、約４％（ｖ／ｖ）のｐＨ３～１０のファルマライトを含む組成物の下で、ｉｃＩＥＦに供した。未消化物質は、ＤｉＣＥを使用して、ピーク定量化に影響を及ぼさない約２％未満であると推定された。
実施例１．ＣＥＸ、ｉｃＩＥＦおよびＣｈｒｏｍｉＣＥを使用して抗体の電荷不均一性を分析する
ＣＥＸ、ｉｃＩＥＦまたはクロマトグラフィー画像化キャピラリー電気泳動（ｃｈｒｏｍｉＣＥ）を使用して、抗体の電荷不均一性を分析した。図３に示されるように、分析のために、治療用抗体、例えば、ＭＡＢ４、ＭＡＢ３、およびＭＡＢ１を使用した。
ＣＥＸ、ｉｃＩＥＦまたはクロマトグラフィー画像化キャピラリー電気泳動（ｃｈｒｏｍｉＣＥ）を使用して、抗体の電荷不均一性を分析した。図３に示されるように、分析のために、治療用抗体、例えば、ＭＡＢ４、ＭＡＢ３、およびＭＡＢ１を使用した。
ＣＥＸを使用して、完全なままの抗体分子の表面電荷を分析し、図３Ａに示されるように、低～中分解能が提供された。ｉｃＩＥＦを使用して、完全なままの抗体分子の全体的な、例えば、固有の電荷を分析し、図３Ｂに示されるように、完全なままの分子の等電位点に基づいたベースライン分離を有する高分解能が提供された。ｃｈｒｏｍｉＣＥを使用して、抗体の個々の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の固有の電荷を分析し、抗体を還元および／または変性された条件下で分析した。約１時間のインキュベーションを伴う約６Ｍの塩化グアニジニウムおよびトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）の存在下などの還元および／または変性された条件下で、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法を使用してＨＣおよびＬＣを分離し、続いてｉｃＩＥＦの分析を行った。ＨＣおよびＬＣの等電点の間に顕著な重複があった場合、ＨＣおよびＬＣは完全に分離することができず、図３Ｃに示されるように、重複したＨＣおよびＬＣのピークがもたらされる。ＣＥＸ、ｉｃＩＥＦおよびＣｈｒｏｍｉＣＥの分析結果、例えば、従来の電荷ベースのアッセイは、二重特異性抗体内の２つの固有の重鎖間の電荷差を識別することができなかった。
還元および／または変性された条件下で完全なままのｉｃＩＥＦを使用して分析を行った場合、個々のＨＣを表す異なるピークが検出され、分解された。しかしながら、Ｆ（ａｂ’）２断片とＦｃ’断片との間の電荷差は、シグナルが単一のＨＣシグナルに畳み込まれたため、識別可能ではなかった。これらの電荷変異体は、ＶＨドメインまたは定常領域における配列差（例えば、星置換）による翻訳後修飾に関連する電荷差を含む。
実施例２．抗体のＩｄｅＳ消化
ＩｄｅＳを使用して、抗体の酵素消化反応を約３７℃で少なくとも約２時間実施した。この条件下でのＩｄｅＳ消化は、図４Ａに示されるように、抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’を生成するために免疫グロブリン（ＩｇＧ）分子を切断するのに効率的であった。いくつかの治療用抗体、例えば、ＭＡＢ９、ＭＡＢ１０、ＭＡＢ５、ＭＡＢ４、ＭＡＢ１およびＭＡＢ３をＩｄｅＳ消化に使用し、続いて、ｉｃＩＥＦ分析に供した。ＩｄｅＳの消化効率は、記録された消化時間および高分子量（ＨＭＷ）分子の存在の監視を有する図４Ｂに示されるピーク面積パーセンテージの下で示されるように、完全なままの抗体分子および抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’）の存在を検出することによって分析された。ＧＧが低いヒンジ配列は、ＡＧが低いヒンジ配列と比較して、より良好な切断効率をもたらした。
ＩｄｅＳを使用して、抗体の酵素消化反応を約３７℃で少なくとも約２時間実施した。この条件下でのＩｄｅＳ消化は、図４Ａに示されるように、抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’を生成するために免疫グロブリン（ＩｇＧ）分子を切断するのに効率的であった。いくつかの治療用抗体、例えば、ＭＡＢ９、ＭＡＢ１０、ＭＡＢ５、ＭＡＢ４、ＭＡＢ１およびＭＡＢ３をＩｄｅＳ消化に使用し、続いて、ｉｃＩＥＦ分析に供した。ＩｄｅＳの消化効率は、記録された消化時間および高分子量（ＨＭＷ）分子の存在の監視を有する図４Ｂに示されるピーク面積パーセンテージの下で示されるように、完全なままの抗体分子および抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’）の存在を検出することによって分析された。ＧＧが低いヒンジ配列は、ＡＧが低いヒンジ配列と比較して、より良好な切断効率をもたらした。
約３７℃で約４時間または一晩などＩｄｅＳ消化反応の様々な消化条件を試験して、切断効率を改善した。ＩｄｅＳの消化効率は、高分子量（ＨＭＷ）分子の存在を監視することを含む、図５に示される保持時間でのピーク面積パーセンテージの下で示されるように、完全なままの抗体分子（図５Ｂにモノマーとして示される）および抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’）の存在を検出することによって分析された。未消化ＭＡＢ４抗体を対照として使用した（図５ＡにおいてＭＡＢ４ ＤＳとして示される）。試験した結果は、切断効率が分子依存的であったことを示している。
実施例３．Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’断片における推定等電点
ＭＡＢ４（Ｆｃ／Ｆｃ＊）は、抗原Ｂおよび抗原Ａの両方を標的とする二重特異性抗体であり、図１Ａに示されるように、ＭＡＢ３（抗原Ｂ、Ｆｃ／Ｆｃ）由来の単一重鎖および、ＭＡＢ１（抗原Ａ、Ｆｃ＊／Ｆｃ＊）由来の単一重鎖を組み合わせることによって得られる。ＭＡＢ３およびＭＡＢ１の重鎖は、Ｆｃ領域において異なる。アミノ酸配列における差、例えば、ＨＹからＲＦへのアミノ酸置換により、抗原Ａ重鎖は、Ｆｃ領域において星置換を有する。図６Ａおよび６Ｂに示されるように、ＭＡＢ４の推定ｐＩ（等電点）は、抗原Ｂアームが二重特異性抗体よりもより酸性である一方で、抗原Ａアームがより塩基性であることを示唆した。
ＭＡＢ４（Ｆｃ／Ｆｃ＊）は、抗原Ｂおよび抗原Ａの両方を標的とする二重特異性抗体であり、図１Ａに示されるように、ＭＡＢ３（抗原Ｂ、Ｆｃ／Ｆｃ）由来の単一重鎖および、ＭＡＢ１（抗原Ａ、Ｆｃ＊／Ｆｃ＊）由来の単一重鎖を組み合わせることによって得られる。ＭＡＢ３およびＭＡＢ１の重鎖は、Ｆｃ領域において異なる。アミノ酸配列における差、例えば、ＨＹからＲＦへのアミノ酸置換により、抗原Ａ重鎖は、Ｆｃ領域において星置換を有する。図６Ａおよび６Ｂに示されるように、ＭＡＢ４の推定ｐＩ（等電点）は、抗原Ｂアームが二重特異性抗体よりもより酸性である一方で、抗原Ａアームがより塩基性であることを示唆した。
実施例４．Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’断片の分析
ＭＡＢ４、ＭＡＢ３またはＭＡＢ１を、抗体をＩｄｅＳで処理して、抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’断片を生成することを含む、酵素消化に供した。続いて、抗体断片を、それらの電荷または等電点に基づいて分離した。ＤｉＣＥワークフローについては、約０．３ｍｇでのタンパク質濃度を使用した。等電点電気泳動については、ｐＨ３～１０のファルマライトおよびｐＨ８～１０．５のファルマライトの比率は約３：１であった。図７Ａおよび図７Ｂに示されるように、試験結果に基づいて、ＭＡＢ１のＦｃ’断片は、ＭＡＢ４およびＭＡＢ３の断片と比較して、より塩基性であった。ＭＡＢ３のＦｃ’断片は、より酸性であった。結果は、ＭＡＢ１のＦｃ’断片が２つの星置換の存在により塩基性であることを示し、これはｐＩ推定値と一致した。結果はまた、ＭＡＢ４における１つの星置換の存在により、ＭＡＢ３と比較して、ＭＡＢ４のＦｃ’断片がより塩基性であったことを示す。結論として、結果は、二重特異性抗体内のドメイン特異的電荷変異体の検出のために、１つまたは２つの星置換の存在が等電点の測定可能な変化に寄与し得ることを示した。星置換を有するＦｃ’断片は、天然のＦｃ’断片よりも塩基性の全体的な電荷を有することが実験的に検証され、これはｐＩ予測と一致した。
ＭＡＢ４、ＭＡＢ３またはＭＡＢ１を、抗体をＩｄｅＳで処理して、抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’断片を生成することを含む、酵素消化に供した。続いて、抗体断片を、それらの電荷または等電点に基づいて分離した。ＤｉＣＥワークフローについては、約０．３ｍｇでのタンパク質濃度を使用した。等電点電気泳動については、ｐＨ３～１０のファルマライトおよびｐＨ８～１０．５のファルマライトの比率は約３：１であった。図７Ａおよび図７Ｂに示されるように、試験結果に基づいて、ＭＡＢ１のＦｃ’断片は、ＭＡＢ４およびＭＡＢ３の断片と比較して、より塩基性であった。ＭＡＢ３のＦｃ’断片は、より酸性であった。結果は、ＭＡＢ１のＦｃ’断片が２つの星置換の存在により塩基性であることを示し、これはｐＩ推定値と一致した。結果はまた、ＭＡＢ４における１つの星置換の存在により、ＭＡＢ３と比較して、ＭＡＢ４のＦｃ’断片がより塩基性であったことを示す。結論として、結果は、二重特異性抗体内のドメイン特異的電荷変異体の検出のために、１つまたは２つの星置換の存在が等電点の測定可能な変化に寄与し得ることを示した。星置換を有するＦｃ’断片は、天然のＦｃ’断片よりも塩基性の全体的な電荷を有することが実験的に検証され、これはｐＩ予測と一致した。
ＩｄｅＳ消化後、ＶＨドメインを含むＦ（ａｂ’）２断片をｉｃＩＥＦを使用して精製し、分離し、図８Ａに示されるように実験に基づく等電点を決定した。図８Ｂに示されるように、完全なままの抗体分子の実験に基づく等電点を、ｉｃＩＥＦを使用して決定した。結果は、ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、およびＭＡＢ１のＦ（ａｂ’）２断片間の実験に基づく等電点における差が、対応する完全なままの抗体分子間の差と良好に相関していることを示した。しかしながら、ｉｃＩＥＦを使用したＦ（ａｂ’）２断片の分離は、例えば、星置換の有無にかかわらず、ＩｄｅＳ消化後にＦｃ’断片が除去された場合、２つの重鎖間の電荷差を区別するのに十分な識別を提供しなかった。
実施例５．還元および／または変性された条件下で抗体断片を分析する
ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、またはＭＡＢ１を、ＩｄｅＳを使用して、約３７℃で一晩（約１６時間）消化して、抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’を生成した。続いて、抗体断片を、約６Ｍの塩化グアニジニウムおよびトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で１時間処理して、４つまたは５つの異なる抗体ドメイン、例えば、抗原Ｂ－Ｆｄ’、抗原Ａ－Ｆｄ’、ＬＣ（軽鎖）、Ｆｃ’の抗原Ｂアーム、および／またはＦｃ’の抗原Ａアームを得た。これらの抗体断片およびドメインを、ｉｃＩＥＦを使用して分析し、図９に示されるように、それらの実験に基づく等電点を決定した。
ＭＡＢ３、ＭＡＢ４、またはＭＡＢ１を、ＩｄｅＳを使用して、約３７℃で一晩（約１６時間）消化して、抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’を生成した。続いて、抗体断片を、約６Ｍの塩化グアニジニウムおよびトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で１時間処理して、４つまたは５つの異なる抗体ドメイン、例えば、抗原Ｂ－Ｆｄ’、抗原Ａ－Ｆｄ’、ＬＣ（軽鎖）、Ｆｃ’の抗原Ｂアーム、および／またはＦｃ’の抗原Ａアームを得た。これらの抗体断片およびドメインを、ｉｃＩＥＦを使用して分析し、図９に示されるように、それらの実験に基づく等電点を決定した。
ＭＡＢ４をＩｄｅＳで消化し、ｉｃＩＥＦを使用して還元および／または変性された条件下で分析した場合、結果は、図１０Ａに示されるように、識別可能な等電点を有するＦｃ’、ＬＣ、および２つのＦｄに対応する５つの異なるピークを示した。図１０Ｂは、ＭＡＢ４をＩｄｅＳで消化し、還元および／または変性された条件を使用せずにｉｃＩＥＦを使用して分析した場合の、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ’断片の分析結果を示した。図１０Ａおよび図１０Ｂの結果を比較すると、還元および／または変性した条件は、抗体のドメイン特異的電荷変異体の同定のための等電点における差を強調した。特に、図１０Ａに示されるように、ＬＣおよび２つの異なるＦｄ’に対応する３つの十分に分離されたピークを観察することができる。
図１１Ａに示されるように、ＭＡＢ３またはＭＡＢ１をＩｄｅＳで消化し、ｉｃＩＥＦを使用して還元および／または変性された条件下で分析した場合、結果は、Ｆｃ’、ＬＣおよびＦｄ’に対応する識別可能な等電点を有する各抗体についての３つの異なるピークを示した。ＭＡＢ３、ＭＡＢ４およびＭＡＢ１の結果間のピークの比較において、ＭＡＢ４の結果における３つのピークは、酸性から塩基性ｐＩまでの共通のＬＣ、抗原Ｂ－Ｆｄ’、および抗原Ａ－Ｆｄ’として同定され得る。親単一特異性モノクローナル抗体および精製Ｆｃ’およびＦ（ａｂ’）２断片に対してＤｉＣＥを同時に行うことにより、各ピークの同一性を確認した。Ｆｄ’断片の実験に基づくｐＩ値は、ＭＡＢ４およびその親単一特異性抗体に関するそれらの予想されたｐＩ値と良好に相関した。Ｆｄ’断片間のシグナルのいくつかの重複が観察された。いくつかのＬＣシグナルは、酸性Ｆｄ’のシグナルと重複した。全体として、各断片（またはドメイン）についての３つの主要ピークのほぼベースライン分離が観察された。
結果は、Ｆｄ’におけるｐＨの差が、還元／変性された条件下でＤｉＣＥを使用して得られた約０．３～０．４ｐＨ単位であることを示し、これは、ｃｈｒｏｍｉＣＥを使用して得られた試験結果と同様であった。ｃｈｒｏｍｉＣＥを用いて得られたＨＣ間のｐＩ範囲は、約ｐＨ６．８～７．６であり、これは、約０．８ｐＨ単位の差であった。ＤｉＣＥを用いて得られたＦｄ’断片間のｐＩ範囲は、約ｐＨ７．５～８．０であり、これは、約０．５ｐＨ単位の差であった。
図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、還元／変性された条件下でＤｉＣＥを使用して得られた結果は、ｃｈｒｏｍｉＣＥに対して補完的であった。しかしながら、抗体を還元／変性された条件下でＤｉＣＥを使用して分析した場合、結果は、二重特異性抗体の２つの重鎖間のｐＩの差を示すことができ、特に、Ｆｃ’およびＦｄ’間のｐＩの差を示すことができた。
還元／変性された条件下でのＤｉＣＥを用いた試験結果の再現性を調べるために、図１２および図１３に示すように、実験を、ＭＡＢ１、ＭＡＢ４およびＭＡＢ３について三重の注入で繰り返した。図１２に示されるように、対応するピークのｐＩ値は、高度に再現可能であった。図１３に示されるように、対応するピークのピーク面積パーセンテージは、高度に再現可能であった。
Ｆｃ／Ｆｃ＊ピークをさらに同定するために、精製したＭＡＢ４ Ｆｃ’断片をカルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）で処理して、Ｃ末端リジンを特異的に切断した。図１４に示されるように、ピーク５および６の存在量の減少は、これらのピークが、未処理のＣ末端リジンを含むことを示した。
実施例６．二重特異性抗体における糖化の同定
ＭＡＢ２は、抗原Ｃおよび抗原Ａの両方を標的とする二重特異性抗体である。ＭＡＢ２の糖化は、ＭＡＢ２の重鎖の抗原ＣアームのＣＤＲ領域における単一残基 残基Ｘで生じる。ＭＡＢ２の糖化は、完全なままの抗体分子のｉｃＩＥＦ分析を使用して検出することができなかった。ＣＥＸの使用はＭＡＢ２の糖化を検出することができたが、ＣＥＸを使用して得られた試験結果は、糖化種に対応するピークと隣接するピークとの間の分解能が悪いため、糖化のレベルを定量することができなかった。図１５に示されるように、重鎖の抗原Ｃアームの糖化は、ｃｈｒｏｍｉＣＥにおいてわずかに見られ、重鎖のピークと（抗原Ｃ重鎖の肩部で）重複した。解像度が低いため、ＭＡＢ２の糖化レベルを、ｃｈｒｏｍｉＣＥを使用して正確に定量することができなかった。
ＭＡＢ２は、抗原Ｃおよび抗原Ａの両方を標的とする二重特異性抗体である。ＭＡＢ２の糖化は、ＭＡＢ２の重鎖の抗原ＣアームのＣＤＲ領域における単一残基 残基Ｘで生じる。ＭＡＢ２の糖化は、完全なままの抗体分子のｉｃＩＥＦ分析を使用して検出することができなかった。ＣＥＸの使用はＭＡＢ２の糖化を検出することができたが、ＣＥＸを使用して得られた試験結果は、糖化種に対応するピークと隣接するピークとの間の分解能が悪いため、糖化のレベルを定量することができなかった。図１５に示されるように、重鎖の抗原Ｃアームの糖化は、ｃｈｒｏｍｉＣＥにおいてわずかに見られ、重鎖のピークと（抗原Ｃ重鎖の肩部で）重複した。解像度が低いため、ＭＡＢ２の糖化レベルを、ｃｈｒｏｍｉＣＥを使用して正確に定量することができなかった。
ＭＡＢ２およびその親単一特異性抗体、例えば、抗原Ｃおよび抗原Ａモノクローナル抗体をＩｄｅＳ消化に供し、還元／変性された条件下でＤｉＣＥを使用して分析した。図１６に示されるように、３つの抗体の試験結果をピーク同定のために並べて比較した。ピーク１～６は、Ｆｃドメインに対応するものとして同定された。ピーク８は、全ての試料において存在し、ＬＣに対応するものとして同定された。ピーク１１は、優勢な抗抗原ＡＦｄ’断片を表すものとして同定された。ピーク９～１０は、抗抗原Ａ Ｆｄ’の酸性形態を表す可能性があった。抗抗原Ｃ Ｆｄ’断片は、高度に分解された分割ピーク、例えば、抗原Ｃの糖化形態および非糖化形態を表す可能性があるピーク１５および１６として現れた。ピーク１２～１４は、抗抗原Ｃ Ｆｄ’断片の酸性形態を表す可能性があった。
抗原Ｃに対応するピーク１５および１６の同一性を確認するために、糖化種および非糖化種をＣＥＸを用いて均一に濃縮した。図１７Ａに示されるように、濃縮された糖化種および非糖化種は、ＣＥＸにおいて明確で識別可能なプロファイルを有する。しかしながら、図１７Ｂに示されるように、ピークプロファイルは、ｉｃＩＥＦを使用して分析された場合、識別可能ではなかった。
濃縮された糖化種および非糖化種をＩｄｅＳ消化に供し、還元／変性された条件下でＤｉＣＥを使用して分析した。図１８Ａに示されるように、ピーク１５（＊）の相対存在量は、糖化濃縮された試料においてより高く、ピーク１６と比較して、濃縮された非糖化試料においてより低かった。ピーク数に対応するパーセンテージでの平均ピーク面積を図１８Ｂに示す。
表２に示されるピーク１５および１６の比較において、非糖化試料は、ピーク１６について濃縮される。しかしながら、糖化濃縮された試料は、ピーク１５について濃縮される。ピーク１５（＊）の相対存在量は、糖化濃縮された試料においてより高かったが、非糖化試料においてはピーク１６が増加した。これらの２つの主要な抗原Ｃ Ｆｄ’ピークの観察に基づいて、ピーク１５および１６の合計に対するピーク１５の相対比をとることによって、糖化レベルの定量化を推定することができる。
（表２）ＤｉＣＥを使用して分析した抗原Ｃ Ｆｄ’ピークの相対存在量。
（表２）ＤｉＣＥを使用して分析した抗原Ｃ Ｆｄ’ピークの相対存在量。
表３に示されるように、ＭＡＢ２試料における糖化レベルの定量化を、ペプチドマッピングを使用してさらに検証した。表３は、ＣＥＸ、ペプチドマッピング、およびＤｉＣＥを使用した比較を示す。結果は、ＤｉＣＥを用いた定量化がペプチドマッピングと同等であることを示した。
（表３）ＭＡＢ２試料における糖化レベルの定量化
（表３）ＭＡＢ２試料における糖化レベルの定量化
実施例７．電荷変異体の監視における細胞株の開発
産生された抗体の電荷変異体を監視することによって、抗体を産生するための細胞株を開発した。新しい細胞株から生じ得る様々な翻訳後修飾（ＰＴＭ）の代用として、電荷に基づくアッセイを使用して、細胞株の開発をモニタリングした。２つの細胞株、例えば、Ａ２８－Ｌ２１およびＡ３０－Ｌ９１を、Ｃ１臨床比較器試料に対してＣＥＸおよびｉｃＩＥＦを使用して分析し、比較可能性を評価した。図１９に示されるように、電荷塩基性変異体の総存在量に関して、ＣＥＸとｉｃＩＥＦとの間に不一致が観察された。Ａ２８－Ｌ２１においては、対照試料およびＡ３０－Ｌ９１と比較して、糖化のわずかな増加が観察された。両方のＣ２細胞株は、主にＦｃ＊上でＣ末端リジンの増加を示した。図２０および図２１に示されるように、ＭＡＢ２ Ｃ２細胞選択のためにＤｉＣＥを使用した場合、試料は、ＦｃＣ末端リジンのける穏やかな増加（ピーク５）を示すが、Ｆｃ＊Ｃ末端リジンにおいては顕著な増加（ピーク６）を示す。ＤｉＣＥ分析は、ｉｃＩＥＦにおいて観察された塩基性種の増加は、Ｆｃドメイン上の未処理のＣ末端リジンによるものであり、Ｆｃ＊ドメインは、クリッピングの影響を受けにくいことを示唆した。さらに、Ａ２８－Ｌ２１クローンについての糖化のレベルは、ＭＡＢ２について典型的に観察されるものよりもわずかに高かった。ＤｉＣＥは、ＭＡＢ２の細胞株およびプロセス開発を支持するために、抗原Ｃ上の糖化レベルを迅速に評価するために使用され得る。
産生された抗体の電荷変異体を監視することによって、抗体を産生するための細胞株を開発した。新しい細胞株から生じ得る様々な翻訳後修飾（ＰＴＭ）の代用として、電荷に基づくアッセイを使用して、細胞株の開発をモニタリングした。２つの細胞株、例えば、Ａ２８－Ｌ２１およびＡ３０－Ｌ９１を、Ｃ１臨床比較器試料に対してＣＥＸおよびｉｃＩＥＦを使用して分析し、比較可能性を評価した。図１９に示されるように、電荷塩基性変異体の総存在量に関して、ＣＥＸとｉｃＩＥＦとの間に不一致が観察された。Ａ２８－Ｌ２１においては、対照試料およびＡ３０－Ｌ９１と比較して、糖化のわずかな増加が観察された。両方のＣ２細胞株は、主にＦｃ＊上でＣ末端リジンの増加を示した。図２０および図２１に示されるように、ＭＡＢ２ Ｃ２細胞選択のためにＤｉＣＥを使用した場合、試料は、ＦｃＣ末端リジンのける穏やかな増加（ピーク５）を示すが、Ｆｃ＊Ｃ末端リジンにおいては顕著な増加（ピーク６）を示す。ＤｉＣＥ分析は、ｉｃＩＥＦにおいて観察された塩基性種の増加は、Ｆｃドメイン上の未処理のＣ末端リジンによるものであり、Ｆｃ＊ドメインは、クリッピングの影響を受けにくいことを示唆した。さらに、Ａ２８－Ｌ２１クローンについての糖化のレベルは、ＭＡＢ２について典型的に観察されるものよりもわずかに高かった。ＤｉＣＥは、ＭＡＢ２の細胞株およびプロセス開発を支持するために、抗原Ｃ上の糖化レベルを迅速に評価するために使用され得る。
実施例８．翻訳後修飾（ＰＴＭ）の監視
二重性ｐＨ－塩勾配陽イオン交換クロマトグラフィーによって濃縮された電荷変異体について完全なままのｉｃＩＥＦおよびＤｉＣＥプロファイルは、２つの方法間の直交性を明らかにした。図２２および２３に示されるように、Ｆｃ／Ｆｃ＊、ＬＣ、および抗原Ａ－Ｆｄ’断片に対応するピークは、全ての試料にわたって比較的一定のままであったが、抗原Ｃ Ｆｄ’ピーク（１２～１６）は、酸性画分にわたって分布の顕著な変化を示した。ＭＡＢ２の濃縮された電荷変異体のＤｉＣＥ分析は、抗原Ｃアームが抗原Ａアームと比較してＰＴＭに対してより感受性であり得ることを示唆した。
二重性ｐＨ－塩勾配陽イオン交換クロマトグラフィーによって濃縮された電荷変異体について完全なままのｉｃＩＥＦおよびＤｉＣＥプロファイルは、２つの方法間の直交性を明らかにした。図２２および２３に示されるように、Ｆｃ／Ｆｃ＊、ＬＣ、および抗原Ａ－Ｆｄ’断片に対応するピークは、全ての試料にわたって比較的一定のままであったが、抗原Ｃ Ｆｄ’ピーク（１２～１６）は、酸性画分にわたって分布の顕著な変化を示した。ＭＡＢ２の濃縮された電荷変異体のＤｉＣＥ分析は、抗原Ｃアームが抗原Ａアームと比較してＰＴＭに対してより感受性であり得ることを示唆した。
実施例９．ＤｉＣＥを使用したＭＡＢ５の濃縮された電荷変異体の分析
図２４に示されるように、ＤｉＣＥを使用して、ＭＡＢ５の濃縮された電荷変異体を分析した。ピーク６、８、および１１は、主に帯電した種を表した。ピーク６はＦｃに対応する。ピーク８はＬＣに対応する。ピーク１１は、優勢なＦｄに対応する。酸性３は、ピーク５、７について特異的に濃縮される。ピーク１０は、濃縮された塩基性２において最も高い存在量を有し、おそらく、未処理のＣ末端リジンを有するＭＡＢ５ Ｆｃ断片に対応する。
図２４に示されるように、ＤｉＣＥを使用して、ＭＡＢ５の濃縮された電荷変異体を分析した。ピーク６、８、および１１は、主に帯電した種を表した。ピーク６はＦｃに対応する。ピーク８はＬＣに対応する。ピーク１１は、優勢なＦｄに対応する。酸性３は、ピーク５、７について特異的に濃縮される。ピーク１０は、濃縮された塩基性２において最も高い存在量を有し、おそらく、未処理のＣ末端リジンを有するＭＡＢ５ Ｆｃ断片に対応する。
実施例１０．ＤｉＣＥを用いた組み合わせＥｂの分析
図２５に示されるように、ピーク１～２は、ＭＡＢ６ ＬＣに対応する。ピーク３～５は、Ｆｃ／２に対応し、全ての試料において存在する。ピーク６は、ＭＡＢ７およびＭＡＢ８のＬＣを表す。それらの配列は互いにほぼ同一である。ピーク７～８は、ＭＡＢ６ Ｆｄ断片に対応する。ピーク９は、ＭＡＢ７ Ｆｄ断片を表す。ピーク１０～１１は、ＭＡＢ８ Ｆｄ断片に対応する。
図２５に示されるように、ピーク１～２は、ＭＡＢ６ ＬＣに対応する。ピーク３～５は、Ｆｃ／２に対応し、全ての試料において存在する。ピーク６は、ＭＡＢ７およびＭＡＢ８のＬＣを表す。それらの配列は互いにほぼ同一である。ピーク７～８は、ＭＡＢ６ Ｆｄ断片に対応する。ピーク９は、ＭＡＢ７ Ｆｄ断片を表す。ピーク１０～１１は、ＭＡＢ８ Ｆｄ断片に対応する。
[本発明1001]
少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質を1つ以上の消化酵素で処理して、前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の2つ以上の成分を生成することと、
前記成分を還元するかまたは変性させることと、
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記2つ以上の成分を分離することであって、分離プロファイルが生成される、ことと、
変異体を同定することであって、同定は、前記分離プロファイルに任意に基づく、ことと
を含む、少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の1つ以上の変異体を同定するための方法。
[本発明1002]
前記成分が、生物物理学的パラメータに基づいて分離される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記消化酵素が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリンＧ分解酵素、シアリダーゼ、システインプロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、パパイン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、ペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテアーゼ、シアリダーゼ、エキソグリコシダーゼ、またはそれらの組み合わせである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記1つ以上の成分を、複数の相において1つ以上の消化酵素で処理して、追加の成分を生成することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記還元または変性の条件が、尿素、塩化グアニジニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（2－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、有機溶媒、アルカリ性溶液、酸性溶液、またはそれらの組み合わせの使用を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分が、前記成分の電荷変異体に基づいて分離される、本発明1002の方法。
[本発明1007]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分が、等電点電気泳動法、キャピラリー等電点電気泳動法、画像化キャピラリー等電点電気泳動法、クロマトグラフィー結合キャピラリー電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、クロマトグラフィー結合画像化キャピラリー電気泳動法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、または液体クロマトグラフィー質量分析法を使用して分離される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記分離された成分を定量または同定することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を、異なる電荷変異体を有する少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質についての分離プロファイルの比較に基づいて同定することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記変異体のレベルを定量することをさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記変異体が、翻訳後修飾由来の変異体を含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記変異体が、前記成分の糖化またはＣ末端リジン由来である、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質が、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片またはタンパク質医薬品である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質と、
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の成分を生成することができる第1の消化酵素と、
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を還元するかまたは変性させることができる環境と、
還元または変性された前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を分離することができる装置と
を含む、少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するためのシステム。
[本発明1015]
前記環境が、前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を処理することができる第2の消化酵素をさらに含む、本発明1014のシステム。
[本発明1016]
前記第1または第2の消化酵素が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素、シアリダーゼ、システインプロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、パパイン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、ペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、またはプロテアーゼである、本発明1015のシステム。
[本発明1017]
前記環境が、還元剤または変性剤をさらに含み、前記還元剤または変性剤が、尿素、塩化グアニジニウム、還元剤、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（2－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、有機溶媒、アルカリ性溶液、酸性溶液、またはこれらの組み合わせである、本発明1014のシステム。
[本発明1018]
前記装置が、電荷不均一性に基づいて分離する、本発明1014のシステム。
[本発明1019]
前記装置が、等電点電気泳動装置、キャピラリー等電点電気泳動装置、画像化キャピラリー等電点電気泳動装置、クロマトグラフ結合キャピラリー電気泳動装置、クロマトグラフ結合画像化キャピラリー電気泳動装置、陽イオン交換クロマトグラフ装置、または液体クロマトグラフィー質量分析装置である、本発明1014のシステム。
[本発明1020]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質が、二重特異性抗体である、本発明1014のシステム。
[本発明1021]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質が、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片またはタンパク質医薬品である、本発明1014のシステム。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考慮される場合、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、様々な実施形態および多数の具体的な詳細を示すが、限定としてではなく、例示として与えられ得る。多くの置換、修正、追加、または再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。
少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質を1つ以上の消化酵素で処理して、前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の2つ以上の成分を生成することと、
前記成分を還元するかまたは変性させることと、
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記2つ以上の成分を分離することであって、分離プロファイルが生成される、ことと、
変異体を同定することであって、同定は、前記分離プロファイルに任意に基づく、ことと
を含む、少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の1つ以上の変異体を同定するための方法。
[本発明1002]
前記成分が、生物物理学的パラメータに基づいて分離される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記消化酵素が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリンＧ分解酵素、シアリダーゼ、システインプロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、パパイン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、ペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテアーゼ、シアリダーゼ、エキソグリコシダーゼ、またはそれらの組み合わせである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記1つ以上の成分を、複数の相において1つ以上の消化酵素で処理して、追加の成分を生成することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記還元または変性の条件が、尿素、塩化グアニジニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（2－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、有機溶媒、アルカリ性溶液、酸性溶液、またはそれらの組み合わせの使用を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分が、前記成分の電荷変異体に基づいて分離される、本発明1002の方法。
[本発明1007]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分が、等電点電気泳動法、キャピラリー等電点電気泳動法、画像化キャピラリー等電点電気泳動法、クロマトグラフィー結合キャピラリー電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、クロマトグラフィー結合画像化キャピラリー電気泳動法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、または液体クロマトグラフィー質量分析法を使用して分離される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記分離された成分を定量または同定することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を、異なる電荷変異体を有する少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質についての分離プロファイルの比較に基づいて同定することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記変異体のレベルを定量することをさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記変異体が、翻訳後修飾由来の変異体を含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記変異体が、前記成分の糖化またはＣ末端リジン由来である、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質が、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片またはタンパク質医薬品である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質と、
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の成分を生成することができる第1の消化酵素と、
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を還元するかまたは変性させることができる環境と、
還元または変性された前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を分離することができる装置と
を含む、少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するためのシステム。
[本発明1015]
前記環境が、前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を処理することができる第2の消化酵素をさらに含む、本発明1014のシステム。
[本発明1016]
前記第1または第2の消化酵素が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素、シアリダーゼ、システインプロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、パパイン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、ペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、またはプロテアーゼである、本発明1015のシステム。
[本発明1017]
前記環境が、還元剤または変性剤をさらに含み、前記還元剤または変性剤が、尿素、塩化グアニジニウム、還元剤、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（2－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、有機溶媒、アルカリ性溶液、酸性溶液、またはこれらの組み合わせである、本発明1014のシステム。
[本発明1018]
前記装置が、電荷不均一性に基づいて分離する、本発明1014のシステム。
[本発明1019]
前記装置が、等電点電気泳動装置、キャピラリー等電点電気泳動装置、画像化キャピラリー等電点電気泳動装置、クロマトグラフ結合キャピラリー電気泳動装置、クロマトグラフ結合画像化キャピラリー電気泳動装置、陽イオン交換クロマトグラフ装置、または液体クロマトグラフィー質量分析装置である、本発明1014のシステム。
[本発明1020]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質が、二重特異性抗体である、本発明1014のシステム。
[本発明1021]
前記少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質が、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片またはタンパク質医薬品である、本発明1014のシステム。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考慮される場合、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、様々な実施形態および多数の具体的な詳細を示すが、限定としてではなく、例示として与えられ得る。多くの置換、修正、追加、または再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。
Claims (21)
- 少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質を１つ以上の消化酵素で処理して、前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の２つ以上の成分を生成することと、
前記成分を還元するかまたは変性させることと、
前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の前記２つ以上の成分を分離することであって、分離プロファイルが生成される、ことと、
変異体を同定することであって、同定は、前記分離プロファイルに任意に基づく、ことと
を含む、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の１つ以上の変異体を同定するための方法。 - 前記成分が、生物物理学的パラメータに基づいて分離される、請求項１に記載の方法。
- 前記消化酵素が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリンＧ分解酵素、シアリダーゼ、システインプロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、パパイン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、ペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、プロテアーゼ、シアリダーゼ、エキソグリコシダーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
- 前記１つ以上の成分を、複数の相において１つ以上の消化酵素で処理して、追加の成分を生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記還元または変性の条件が、尿素、塩化グアニジニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、有機溶媒、アルカリ性溶液、酸性溶液、またはそれらの組み合わせの使用を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の前記成分が、前記成分の電荷変異体に基づいて分離される、請求項２に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の前記成分が、等電点電気泳動法、キャピラリー等電点電気泳動法、画像化キャピラリー等電点電気泳動法、クロマトグラフィー結合キャピラリー電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、クロマトグラフィー結合画像化キャピラリー電気泳動法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、または液体クロマトグラフィー質量分析法を使用して分離される、請求項１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の前記分離された成分を定量または同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を、異なる電荷変異体を有する少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質についての分離プロファイルの比較に基づいて同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記変異体のレベルを定量することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の前記変異体が、翻訳後修飾由来の変異体を含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記変異体が、前記成分の糖化またはＣ末端リジン由来である、請求項１０に記載の方法。
- 前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質が、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片またはタンパク質医薬品である、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質と、
前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の成分を生成することができる第１の消化酵素と、
前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を還元するかまたは変性させることができる環境と、
還元または変性された前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を分離することができる装置と
を含む、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の電荷変異体を同定するためのシステム。 - 前記環境が、前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質の前記成分を処理することができる第２の消化酵素をさらに含む、請求項１４に記載のシステム。
- 前記第１または第２の消化酵素が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素、シアリダーゼ、システインプロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、パパイン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、ペプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、またはプロテアーゼである、請求項１５に記載のシステム。
- 前記環境が、還元剤または変性剤をさらに含み、前記還元剤または変性剤が、尿素、塩化グアニジニウム、還元剤、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、有機溶媒、アルカリ性溶液、酸性溶液、またはこれらの組み合わせである、請求項１４に記載のシステム。
- 前記装置が、電荷不均一性に基づいて分離する、請求項１４に記載のシステム。
- 前記装置が、等電点電気泳動装置、キャピラリー等電点電気泳動装置、画像化キャピラリー等電点電気泳動装置、クロマトグラフ結合キャピラリー電気泳動装置、クロマトグラフ結合画像化キャピラリー電気泳動装置、陽イオン交換クロマトグラフ装置、または液体クロマトグラフィー質量分析装置である、請求項１４に記載のシステム。
- 前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質が、二重特異性抗体である、請求項１４に記載のシステム。
- 前記少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質が、薬物、抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、融合タンパク質、抗体－薬物コンジュゲート、抗体断片またはタンパク質医薬品である、請求項１４に記載のシステム。
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