KR20220012263A - 항체의 도메인-특이적 전하 변이체의 특징규명 - Google Patents

항체의 도메인-특이적 전하 변이체의 특징규명 Download PDF

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마이클 로스코니
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Abstract

본 발명은 바람직하게는 이중특이성 항체 내에서, 도메인-특이적 전하 변이체를 특징규명하기 위해 효소적 소화-보조 이미지화된 모세관 전기영동 (DiCE)에 기초하여 펩티드 또는 단백질, 예컨대 항체의 생물물리적 특성을 분석하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 상기 방법 및 시스템은 단백질을 소화 효소로 처리하여 상기 단백질의 성분을 생성하는 단계, 상기 성분을 환원 또는 변성시키는 단계, 및 이들의 등전점에 기초하여 상기 성분을 분리하는 단계를 포함한다.

Description

항체의 도메인-특이적 전하 변이체의 특징규명
본 발명은 일반적으로 도메인-특이적 변이체의 생물물리적 특징규명을 포함하는 항체를 특징규명하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.
치료 펩티드 및 단백질의 도메인-특이적 변이체를 포함한, 생물물리적 특성은 이들의 안전성, 효능 및 저장 수명에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 상이한 전하 변이체의 존재가 용해도, 결합 및 안정성을 변경시킬 수 있다.
치료 펩티드 또는 단백질, 예컨대 항체는 다양한 번역 후 변형 (PTM), 단백질 분해, 효소적 변형 및 화학적 변형으로 인해 상이한 변이체를 획득하고, 불균일해질 수 있다. 생물물리적 속성에 대한 이러한 변화는 펩티드 및 단백질이 생산되는 동안 및 후에 거의 임의의 시점에서 일어날 수 있다. 생물물리적 특성에 대한 이러한 변화는 치료 펩티드 및 단백질의 안전성, 효능 및 저장 수명에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 특정 치료 펩티드 또는 단백질에 대한 상이한 변이체 및 이들의 관련 안전성, 효능 및 저장 수명 프로파일을 식별하는 것이 중요하다.
치료 단백질의 불균일성을 보다 효율적이고 정확하게 특징규명하기 위한 방법 및 시스템에 대한 필요성이 존재하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 방법 및 시스템은 특정 결합 능력, 생물학적 활성, 약물 안전성 및 저장 수명과 관련될 수 있는 전하 변이체를 식별하기 위한 가치있는 정보를 제공할 수 있다.
요약
치료 펩티드 또는 단백질, 예컨대 항체의 제조 동안 불균일성(heterogeneity)의 도입은 치료 단백질의 안전성, 효능 및 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에 우려될 수 있다. 본 출원은 치료 펩티드 또는 단백질의 도메인-특이적 변이체를 분석하기 위한 치료 펩티드 및 단백질의 생물물리적 특징규명을 제공한다.
본원에 개시된 예시적인 구현예는, 항체 내에서, 바람직하게는 이중특이성 항체 내에서 다양한 도메인-특이적 전하 변이체의 수준을 검출하고 정량하기 위한 등전 초점화를 포함하는, 소화-보조 이미지화된 모세관 전기영동 (digestion-assisted imaged capillary electrophoresis, DiCE) 방법을 사용하여 항체의 전하 변이체를 식별 또는 정량화하기 위한 방법 및 시스템을 제공함으로써 전술한 요구를 충족시킨다.
본 개시는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 변이체를 식별하기 위한 방법 및 시스템을 제공하며, 이는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 하나 이상의 소화 효소로 처리하여 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 생성하는 단계; 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 환원 또는 변성시키는 단계; 및 후속적으로 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 둘 이상의 성분을 분리하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 상기 소화 효소는 스트렙토코커스 피오게네스의 면역글로불린 G-분해 효소, 시알리다제, 시스테인 프로테아제, 엔도펩티다제, 파파인, 엔도프로테이나제 Lys-C, 펩신, 트립신, 카르복시펩티다제 B, 프로테아제 또는 이들의 조합이다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 변이체를 식별하기 위한 방법은 상기 하나 이상의 성분을 다중상(multiple phase)에서 하나 이상의 소화 효소로 처리하여 추가의 성분을 생성하는 단계를 더 포함한다.
일부 측면에서, 상기 환원 또는 변성 조건은 우레아, 구아니디늄 클로라이드, 디티오트레이톨 (DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP), 유기 용매, 알칼리 용액, 산성 용액 또는 이들의 조합의 사용을 포함한다.
일부 측면에서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 성분은 상기 성분의 전하 변이체에 기초하여 분리되고, 여기서 물리적 파라미터는 전하 불균일성, 분자량, 전하 또는 이들의 조합이다.
일부 측면에서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 성분은 등전 초점화 전기영동 방법, 모세관 등전 초점화 전기영동 방법, 이미지화된 모세관 등전 초점화 전기영동 방법, 크로마토그래피 결합 모세관 전기영동 방법, 모세관 전기영동, 크로마토그래피 결합 이미지화된 모세관 전기영동 방법, 양이온-교환 크로마토그래피 방법 또는 액체 크로마토그래피-질량 분석 방법을 사용하여 분리된다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법은 분리 프로파일을 생성하는 단계를 더 포함한다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법은 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 분리된 성분을 정량화하는 단계를 더 포함한다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법은 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 분리된 성분을 식별하는 단계를 더 포함한다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법은 상이한 전하 변이체를 갖는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질에 대한 분리 프로파일의 비교에 기초하여 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 식별하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법은 상기 식별된 성분의 당화 또는 C-말단 라이신의 수준을 정량화하는 단계를 더 포함한다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법에서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질은 이중특이성 항체이다.
일부 측면에서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질은 약물, 항체, 이중특이성 항체, 단클론성 항체, 융합 단백질, 항체-약물 접합체, 항체 단편 또는 단백질 의약품이다.
본 개시는, 적어도 부분적으로, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 시스템을 제공하며, 이는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질; 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 생성할 수 있는 제1 소화 효소; 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 성분을 환원 또는 변성시킬 수 있는 환경; 및 하나 이상의 모세관에서 하나 이상의 물리적 파라미터에 의해 소화되고, 환원 또는 변성된 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 성분을 분리할 수 있는 장치;를 포함한다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 시스템에서, 상기 환경은 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 성분을 처리할 수 있는 제2 소화 효소를 더 포함한다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 시스템에서, 상기 제1 또는 제2 소화 효소는 스트렙토코커스 피오게네스의 면역글로불린 G-분해 효소, 시알리다제, 시스테인 프로테아제, 엔도펩티다제, 파파인, 엔도프로테이나제 Lys-C, 펩신, 트립신, 카르복시펩티다제 B 또는 프로테아제이다.
또 다른 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 시스템에서, 상기 환경은 환원제 또는 변성제를 더 포함하고, 여기서 상기 환원제 또는 변성제는 우레아, 구아니디늄 클로라이드, 환원제, 디티오트레이톨 (DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP), 유기 용매, 알칼리 용액, 산성 용액, 또는 이들의 조합이다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 시스템에서, 상기 장치는 하나 이상의 모세관에서 하나 이상의 물리적 파라미터에 기초하여 성분을 분리하며, 예를 들어, 상기 물리적 파라미터는 전하 불균일성, 분자량, 전하, 또는 이들의 조합인 경우를 포함한다.
일부 측면에서, 상기 장치는 등전 초점화 장치, 모세관 등전 초점화 전기영동 장치, 이미지화된 모세관 등전 초점화 전기영동 장치, 크로마토그래프 결합 모세관 전기영동 장치, 크로마토그래프 결합 이미지화된 모세관 전기영동 장치, 양이온-교환 크로마토그래프 장치, 또는 액체 크로마토그래피-질량 분석 장치이다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 시스템에서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질은 이중특이성 항체이다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 시스템에서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질은 약물, 항체, 이중특이성 항체, 단클론성 항체, 융합 단백질, 항체-약물 접합체, 항체 단편, 또는 단백질 의약품이다.
본 발명의 이러한 측면, 및 다른 측면은 하기의 설명 및 첨부 도면과 관련하여 고려될 때 더 잘 인식되고 이해될 것이다. 하기의 설명은, 다양한 구현예 및 이들의 다수의 특정 세부사항을 나타내지만, 이는 제한이 아닌 예시의 방식으로 제공될 수 있다. 많은 치환, 변형, 추가, 또는 재배열이 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있다.
도 1a는 MAB4 (Fc/Fc*)가 MAB3 (Fc/Fc)으로부터의 단일 중쇄 및 MAB1 (Fc*/Fc*)으로부터의 단일 중쇄를 조합하여 파생됨을 나타낸다. MAB3은 히스티딘 (H) 및 티로신 (Y) 잔기를 갖고, MAB1은 아르기닌 (R) 및 페닐알라닌 (F)을 갖는다.
도 1b는 MAB2가 ANTIGENC 및 ANTIGENA 둘 다를 표적화하는 이중특이성 항체임을 나타낸다. MAB2의 당화는 MAB2 중쇄의 ANTIGENC 암(arm)의 CDR 영역 내의 단일 잔기 (잔기X)에서 일어난다.
도 2는 항체에 효소적 소화를 적용하여 항체 단편을 생성, 예컨대 스트렙토코커스 피오게네스 (IdeS)의 면역글로불린 G-분해 효소를 사용하여 F(ab')2 및 Fc' 단편을 생성함을 나타낸다. 항체 단편은 환원 및/또는 변성된 조건에 더 적용될 수 있고, 이미지화된 모세관 등전 초점화 (icIEF) 전기영동을 사용하여 분석될 수 있다.
도 3은 MAB4, MAB3, 및 MAB1이 양이온-교환 크로마토그래피 (CEX, 도 3a), 이미지화된 모세관 등전-초점화 (icIEF, 도 3b), 또는 크로마토그래피 이미지화된 모세관 전기영동 (chromiCE, 도 3c)을 사용하여 분석되었음을 나타낸다.
도 4a는 IdeS의 절단 부위를 나타낸다.
도 4b는 피크 면적 백분율로 표시된 온전한 항체 분자 및 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 및 Fc')의 존재를 검출함에 의해 분석된 IdeS 절단 효율을 시험한 결과를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 37℃에서 4시간 또는 하룻밤을 포함하는, 절단 효율을 개선하기 위한 IdeS 소화 반응의 소화 조건을 나타내며, 이는 도 5a에서 MAB4 DS로 표시되고, 도 5b에서 단량체로 표시되는 온전한 항체 분자의 존재를 검출한다.
도 6a 및 도 6b는 MAB4, MAB3 및 MAB1의 추정된 pI (등전점)을 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 MAB4, MAB3 또는 MAB1이 IdeS 소화 및 icIEF 분석을 적용받은 경우의 Fc' 단편의 분석 결과를 나타낸다.
도 8a는 VH 도메인을 함유하는 F(ab')2 단편의 분석 결과를 나타낸다. F(ab')2 단편을 icIEF를 사용하여 정제하고 분리하여 IdeS 소화 후 실험적 등전점을 결정하였다. 온전한 항체 분자의 실험적 등전점은 도 8b에 나타낸 바와 같이 icIEF를 사용하여 결정하였다.
도 9는 온전한 항체 분자와 비교하여 Fc', F(ab')2, ANTIGENB-Fd', ANTIGENA-Fd', 및 LC의 실험적 pI를 결정하기 위해 DiCE를 사용한 환원 및/또는 변성된 조건 하에서의 MAB4, MAB3 또는 MAB1의 분석 결과를 나타낸다.
도 10a는 DiCE를 사용한 환원, 변성된 조건 하에서의 MAB4의 분석 결과를 나타낸다.
도 10b는 icIEF를 사용한 천연 조건 하에서의 MAB4의 F(ab')2 및 Fc' 단편의 분석 결과를 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 환원된/변성된 조건 하에서 DiCE를 사용하여 수득된 결과를 나타낸다.
도 12는 상응하는 피크의 pI 값을 결정하기 위해 DiCE를 사용한 환원, 변성된 조건 하에서의 MAB1, MAB4 및 MAB3의 3회 반복 분석을 나타낸다.
도 13은 상응하는 피크의 피크 면적 백분율을 결정하기 위해 DiCE를 사용한 환원, 변성된 조건 하에서의 MAB1, MAB4 및 MAB3의 3회 반복 분석을 나타낸다.
도 14는 MAB4 Fc' 단편을 처리하기 위해 카르복시펩티다제 B (CPB)를 사용한 Fc/Fc* 피크의 식별을 나타낸다.
도 15는 chromiCE를 사용하여 MAB2의 당화를 검출한 분석 결과를 나타낸다.
도 16은 DiCE를 사용한 환원, 변성된 조건 하에서의 MAB2 및 이의 모(parental) 단일특이성 항체의 당화를 검출한 분석 결과를 나타낸다.
도 17a 및 도 17b는 CEX 및 icIEF를 사용하여 MAB2의 당화된 종(species) 및 비-당화된 종을 분석하고 농축한 결과를 나타낸다.
도 18a 및 도 18b는 DiCE를 사용한 환원, 변성된 조건 하에서의 MAB2와 비교하여 당화-농축된 샘플 및 농축된 비-당화 샘플의 분석 결과를 나타내며, 이는 도 18a에 나타낸 피크의 상대 존재비 및 도 18b에 나타낸 피크 번호에 상응하는 백분율의 평균 피크 면적을 갖는다.
도 19는 CEX 및 icIEF를 사용하여 2개의 세포주로부터 수득된 샘플에 대한 전하 변이체의 분석 결과를 나타낸다.
도 20은 DiCE를 사용하여 환원, 변성된 조건 하에서 2개의 세포주로부터 수득된 샘플에 대한 전하 변이체의 분석 결과를 나타낸다.
도 21은 DiCE를 사용하여 환원, 변성된 조건 하에서 2개의 세포주로부터 수득된 샘플에 대한 전하 변이체의 분석 결과를 나타낸다.
도 22는 온전한 icIEF를 사용하여 이중 pH-염 구배 양이온 교환 크로마토그래피로 농축된 전하 변이체의 분석 결과를 나타낸다.
도 23은 DiCE를 사용하여 이중 pH-염 구배 양이온 교환 크로마토그래피로 농축된 전하 변이체의 분석 결과를 나타낸다.
도 24는 DiCE를 사용한 MAB5의 농축된 전하 변이체의 분석 결과를 나타낸다.
도 25는 DiCE를 사용한 콤보-Eb의 분석 결과를 나타낸다.
치료 단백질의 전하 변이체의 존재로 인해 약물 효능, 약물 역가 및 환자 안전성에 대한 우려가 있으며, 이는 일부 경우에 치료 단백질의 전하의 변화가 결합 능력, 생물학적 활성 및 저장 수명에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 본 출원의 방법 및 시스템은 약물 투여, 예컨대 생물학적 제제(biologics)의 투여에 대한 약동학, 효능 및 안전성과 관련된 임상 약리학에 영향을 미치는 치료 단백질의 전하 불균일성에 관한 가치있는 정보를 제공할 수 있다.
본 개시는 펩티드 또는 단백질, 예컨대 항체의 생물물리적 특성을 분석하기 위한 방법 및 시스템을 제공함에 의해 전술한 요구를 충족시키는 방법 및 시스템을 제공한다. 본 출원의 방법 및 시스템은 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체, 예컨대 도메인-특이적 전하 변이체를 특징규명하기 위해, 바람직하게는 이중특이성 항체 및 이의 모 단일특이성 항체 간의 전하 변이체를 비교함에 있어서, 효소적 소화-보조 이미지화된 모세관 전기영동 (enzymatic digestion-assisted imaged capillary electrophoresis, DiCE)에 기초한다. 변이체는 전하 불균일성, 분자량, 전하, 또는 이들의 조합을 포함하는 생물물리적 파라미터를 특징으로 할 수 있다. 본 출원의 방법 및 시스템은 인간 면역글로불린의 모든 서브클래스에 사용될 수 있다. 본 출원의 방법 또는 시스템에서의 펩티드 또는 단백질은, 예를 들어, 약물, 항체, 이중특이성 항체, 단클론성 항체, 융합 단백질, 항체-약물 접합체, 항체 단편, 또는 단백질 의약품일 수 있다.
치료 단백질, 예컨대 단클론성 항체 생성물은 다양한 번역 후 변형, 효소적 및 화학적 변형, 예컨대 글리코실화, 탈글리코실화, 아미드화, 탈아미드화, 산화, 당화, 말단 고리화, C-말단 라이신 변이, C-말단 아르기닌 변이, N-말단 피로글루타메이트 변이, C-말단 글리신 아미드화, C- 말단 프롤린 아미드화, 숙신이미드 형성, 시알릴화 또는 탈시알릴화의 존재로 인해 매우 불균일하다. 또한, 단백질 생성물의 응집, 분해, 변성, 단편화 또는 이성질체화도 전하 불균일성을 도입할 수 있다. 표 1은 예시적인 화학적 분해 경로와 펩티드 또는 단백질의 전하 변화에 대한 이들의 영향을 나타낸다.
표 1. 전하 변이체의 화학적 분해 경로
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치료 펩티드 또는 단백질, 예컨대 단클론성 항체의 제조 동안, 단백질 분해 및/또는 번역 후 변형 (PTM)의 존재의 결과로서 전하 불균일성이 잠재적으로 도입된다. 제조된 약물 물질 내에서 단백질의 전하 변이체 형태의 특징규명은 단백질의 속성, 예컨대 효력, 및 전하 변이체와 관련된 물리적 및 화학적 변화 간의 상관관계를 완전히 이해하는 데 필요하다.
특히, 단클론성 항체를 제조하기 위해, 항체의 상이한 도메인 상의 PTM은 상이한 생물학적 효과를 초래할 수 있고, 잠재적으로 약물 생성물의 안정성, 안전성 및 효력에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 도메인-특이적 변형의 특징규명 및 정례적인 모니터링은 치료 항체 생성물의 품질을 보장하는 데 중요하다. 스트렙토코커스 피오게네스 (IdeS)의 면역글로불린 G-분해 효소는 단클론성 항체 생성물에서 개별 도메인의 불균일성을 조사하는 데 사용되었다. IdeS는 힌지 영역 아래에서 항체의 중쇄를 절단하여, F(ab')2 및 Fc' 단편을 생성할 수 있다. 이러한 항체 단편은 예컨대, 액체 크로마토그래피/질량 분석, 모세관 등전 초점화, 당사슬(glycan) 매핑, 또는 역상 크로마토그래피에 의해 분석되는, 추가의 특징규명을 위해 3개의 항체 도메인, 예를 들어 LC (경쇄), Fd' 및 Fc'/2를 생성하도록 추가로 환원될 수 있다. (An, Y 등 (2014) A new tool for monoclonal antibody analysis. mAbs 6(4): 879-893).
본 출원은 이중특이성 항체를 포함하는, 항체 내의 다양한 도메인-특이적 전하 변이체의 수준을 검출하고 정량하기 위한, 등전 초점화를 포함하는 DiCE에 기초한 방법 및 시스템을 제공한다. 일부 예시적인 구현예에서, 상기 방법 및 시스템에는 IdeS를 사용하여 F(ab')2 및 Fc' 단편을 생성하는 효소적 소화 후, 환원된 변성 조건 하에서 LC, Fd' 및 Fc'/2를 분리하기 위해 이미지화된 모세관 등전-초점화 (icIEF)가 포함된다.
본 출원의 이점은 이중특이성 항체의 상이한 암의 도메인-특이적 PTM을 검출하고 정량화하기 위한, DiCE에 기초한 고도로 민감한 방법을 제공하는 것을 포함한다. 일부 예시적인 구현예에서, DiCE 기반 방법은 ANTIGENC 및 ANTIGENA 둘 다를 표적화하는 이중특이성 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 부위-특이적 당화를 검출하고 정량화하는 데 사용된다. ANTIGENCxANTIGENA 이중특이성 항체의 ANTIGENC 암의 CDR에서 잔기X의 부위-특이적 당화는 종래의 온전한 전하 분석, 예컨대 icIEF 및 양이온-교환 크로마토그래피 (CEX)를 사용하여 정확하게 정량될 수 없었다. 본 출원의 이점은 Fc 도메인 상의 미처리된 C-말단 라이신의 수준을 평가하는데 있어서 항체의 도메인-특이적 전하 변이체를 검출하기 위한, DiCE에 기초한 고도로 민감한 방법을 제공하는 것을 포함한다.
본 출원은 또한 PTM의 정량을 위한 DiCE에 기초한 고도로 민감한 방법 또는 시스템을 제공하며, 이는 펩티드 매핑을 사용하여 수득된 결과에 필적하는 것으로 간주된다. 본 출원의 방법 및 시스템은 치료 펩티드 및 단백질, 예컨대 항체, 융합 단백질, 항체-약물 접합체 (ADC), 및 동시에 투여되는 항체의 생성물 품질을 보장하기 위해 특정 PTM을 모니터링하기 위한 펩티드 매핑에 필적하는 직교 방법을 제공한다.
본 출원의 이점은 이중특이성 항체 분자 내의 도메인-특이적 전하 불균일성에 대한 보다 완전한 관점을 제공할 수 있는 단일 분석에서 이중특이성 항체 및 이의 모 단일특이성 항체를 분석하기 위한, DiCE 기반 방법 또는 시스템을 더 포함한다. DiCE 기반 방법 또는 시스템에서 효소적 소화의 사용은 온전한 이중특이성 항체를 소화시킴으로써 생성된 항체 단편의 고유 전하에 있어서 차이 노출의 이점을 제공한다. 이는 등전 초점화에 의해 생성된 항체 단편 또는 도메인의 보다 완전한 분리를 허용한다.
DiCE에 기초한 본 출원의 방법 또는 시스템은 약 0.5 mg 미만의 최소 샘플을 필요로 하는 신속한, 중간-처리량 방법을 제공함으로써, 여러 이중특이성 항체의 개별 암에 관련된 전하 변이체를 구별하기 위해 이중특이성 항체에 적용될 수 있다. 본 출원은 또한 특정 번역 후 변형, 예컨대 당화 및 미처리된 C-말단 라이신의 수준을 정확하게 정량화하는데 사용될 수 있다. 본 출원은 항체-약물 접합체 (ADC) 및 조합 생성물과 같은 다른 양상의 전하 변이체를 보다 완전히 특징규명하기 위해 이중특이성 항체를 넘어 적용될 수 있다.
본 출원의 방법 및 시스템은 펩티드 또는 단백질의 성분을 생성하기 위한 효소적 소화 반응을 제공한다. 이러한 성분은 펩티드 또는 단백질의 더 작은 단편이다. 펩티드 또는 단백질의 성분은 펩티드 또는 단백질 내의 개별 도메인의 전하 불균일성을 분석하기 위해 펩티드 또는 단백질에 대한 성분의 전하에 기초하여 환원 및/또는 변성된 조건에서 후속적으로 분리될 수 있다. 펩티드 또는 단백질의 성분은 또한 성분 간의 등전점의 차이에 기초하여 분리될 수 있는데, 이는 이러한 성분이 성분 간의 등전점에 있어서 증가된 차이를 갖는 더 작은 단편이기 때문이다.
일부 예시적인 구현예에서, 이중특이성 항체 또는 이의 모 단일특이성 항체는 효소적 소화 반응이 적용되어 항체의 단편, 예컨대 F(ab')2 및 Fc'가 생성된다. 이러한 항체 단편은 등전 초점화를 사용하여 이들의 전하에 기초하여 후속적으로 분리될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 이러한 항체 단편은 환원 및/또는 변성된 조건이 추가로 적용되어 특이적 도메인, 예컨대 LC, Fd', 및 Fc'/2가 생성된다. 이러한 항체 도메인은 전하에 기초하여 후속적으로 분리되어 항체 내의 개별 도메인의 전하 불균일성이 분석될 수 있다. 항체 도메인 간의 등전점의 차이는 등전점에서 측정가능한 차이로 분리를 가능하게 하는데, 이는 이러한 도메인이 온전한 항체 분자와 비교하여 더 작은 분자량을 갖기 때문이다. 이러한 항체 도메인은 항체 도메인의 등전점 간에 증가된 등전점 차이를 갖는다.
다른 예시적인 구현예에서, 본 출원은 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법을 제공하며, 이는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 하나 이상의 소화 효소로 처리하여 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 생성하는 단계; 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 환원 또는 변성시키는 단계; 및 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 둘 이상의 성분을 분리하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분은 성분의 전하 변이체, 예컨대 등전 초점화에 기초하여 분리된다. 일부 측면에서, 상기 성분의 분리 프로파일이 생성되고, 전하 변이체의 변형 수준을 검출 또는 정량화하기 위해 비교된다. 이들은 약물 투여에 대한 약동학, 효능 및 안전성과 관련된 임상 약리학에 영향을 미치는 치료 단백질의 전하 불균일성을 특징규명하고 정량화함에 있어 오랫동안 느껴온 요구를 충족시킨다.
기존 방법의 한계를 고려하여, 치료 펩티드 또는 단백질의 전하 불균일성을 식별, 검출 또는 정량화하기 위한 효과적이고 민감한 방법이 DiCE 기반 방법을 사용하여 개발되었다.
용어 "하나"는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고; 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 표준 변형을 허용하는 것으로 이해되어야 하며; 범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다.
본원에 사용된 용어, "포함하다", "포함한다", 및 "포함하는"은 비-제한적인 것을 의미하고, 각각 "구성하다", "구성한다", 및 "구성하는"을 의미하는 것으로 이해된다.
일부 예시적인 구현예에서, 본 개시는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 변이체를 식별하기 위한 방법을 제공하며, 이는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 하나 이상의 소화 효소로 처리하여 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 생성하는 단계; 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 환원 또는 변성시키는 단계; 및 성분의 등전점에 기초하여 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 둘 이상의 성분을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 예시적인 구현예에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법에서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질은 약물, 항체, 이중특이성 항체, 단클론성 항체, 융합 단백질, 항체-약물 접합체, 항체 단편, 또는 단백질 의약품이다.
본원에 사용된 용어, "펩티드" 또는 "단백질"은 공유결합으로 연결된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함한다. 단백질은 일반적으로 당업계에 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"로 공지된, 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. 단백질은 하나 또는 다수의 폴리펩티드를 함유하여 단일 기능 생체분자를 형성할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 단백질은 항체, 이중특이성 항체, 다중특이성 항체, 항체 단편, 단클론성 항체, 숙주-세포 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다.
본원에 사용된, "단백질 의약품"은 본질적으로 완전히 또는 부분적으로 생물학적일 수 있는 활성 성분을 포함한다. 일부 예시적인 구현예에서, 상기 단백질 의약품은 펩티드, 단백질, 융합 단백질, 항체, 항원, 백신, 펩티드-약물 접합체, 항체-약물 접합체, 단백질-약물 접합체, 세포, 조직, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 다른 예시적인 구현예에서, 상기 단백질 의약품은 펩티드, 단백질, 융합 단백질, 항체, 항원, 백신, 펩티드-약물 접합체, 항체-약물 접합체, 단백질-약물 접합체, 세포, 조직, 또는 이들의 조합 중 재조합, 조작, 변형, 돌연변이, 또는 절단된 형태를 포함할 수 있다.
본원에 사용된, "항체 단편"은 예를 들어 항체의 항원-결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fc 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디(diabody), dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 영역, 뿐만 아니라, 항체 단편으로부터 형성된 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 및 다중 특이성 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 조합이고, ScFv 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자이다. 항체 단편은 다양한 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생성될 수 있고/있거나 부분 항체 서열을 암호화하는 유전자로부터 재조합적으로 생성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생성될 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 단일쇄 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은 예를 들어, 이황화 결합에 의해 함께 연결된 다중쇄를 포함할 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 다중-분자 복합체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어, "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 불안정한 결합(들)을 갖는 링커(들)에 의해 생물학적 활성 약물(들)에 부착된 항체를 지칭할 수 있다. ADC는 항체의 아미노산 잔기의 측쇄에 공유결합으로 연결될 수 있는 생물학적 활성 약물 (또는 페이로드)의 여러 분자를 포함할 수 있다 (Siler Panowski 등,　Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy, 6　mAbs　34-45 (2013)). ADC에 사용되는 항체는 표적 부위에서의 선택적 축적 및 지속적인 유지를 위해 충분한 친화도로 결합할 수 있다. 대부분의 ADC는 나노몰 범위의 Kd 값을 가질 수 있다. 페이로드는 나노몰/피코몰 범위의 효력을 가질 수 있고, 표적 조직 내로의 ADC의 분포 후에 달성가능한 세포내 농도에 도달할 수 있다. 마지막으로, 페이로드 및 항체 간의 연결을 형성하는 링커는 순환에 있어서 충분히 안정하여 항체 모이어티의 약동학적 속성 (예를 들어, 긴 반감기)의 이점을 취할 수 있고, 페이로드가 조직 내로 분포되는 경우 항체에 부착된 채로 남아있도록 허용하면서도, ADC가 표적 세포 내로 흡수될 수 있으면 생물학적 활성 약물의 효율적인 방출을 허용해야 한다. 링커에는 세포 처리(cellular processing) 동안 절단 불가능(non-cleavable)한 링커 및 ADC가 표적 부위에 도달하면 절단 가능(cleavable)한 링커가 포함될 수 있다. 절단 불가능한 링커를 가진, 호출 내에서 방출되는 생물학적 활성 약물은 리소좀 내에서 ADC의 완전한 단백질 가수분해성(proteolytic) 분해 후, 페이로드 및 항체의 아미노산 잔기, 전형적으로 라이신 또는 시스테인 잔기에 여전히 부착된 링커의 모든 요소를 포함한다. 절단 가능한 링커는 이의 구조가 페이로드 및 항체 상의 아미노산 부착 부위 간에 절단 부위를 포함하는 것이다. 절단 메카니즘은 산성 세포내 구획에서 산-불안정성 결합의 가수분해, 세포내 프로테아제 또는 에스테라아제에 의한 아미드 또는 에스테르 결합의 효소적 절단, 및 세포 내부의 환원 환경에 의한 이황화 결합의 환원적 절단을 포함할 수 있다.
본원에 사용된, "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 4개의 폴리펩티드 쇄, 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)로 이루어진 면역글로불린 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 함유한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열되는, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성될 수 있다. 용어 "항체"는 임의의 동형(isotype) 또는 서브클래스의 당화(glycosylated) 및 비당화된(non-glycosylated) 면역글로불린 둘 모두에 대한 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된것, 예컨대 항체를 발현하도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. IgG는 항체의 서브세트를 포함한다.
예시적인 구현예
본원에 개시된 구현예는 DiCE 기반 방법을 사용하여 치료 펩티드 또는 단백질의 전하 불균일성을 식별, 검출 또는 정량화하기 위한 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다.
일부 예시적인 구현예에서, 본 개시는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법을 제공하며, 이는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 하나 이상의 소화 효소로 처리하여 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 생성하는 단계; 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 환원 또는 변성시키는 단계; 및 전하 변이체의 전하 불균일성에 기초하여 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 둘 이상의 성분을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법은 펩티드 또는 단백질의 변형 수준을 정량화하는데 사용된다.
일부 예시적인 구현예에서, 펩티드 또는 단백질의 변형은 번역 후 변형, 효소적, 화학적 변형, 응집, 분해, 변성, 단편화 또는 이성질체화를 포함한다. 일부 측면에서, 펩티드 또는 단백질의 변형은 글리코실화, 탈글리코실화, 아미드화, 탈아미드화, 산화, 당화, 말단 고리화, C-말단 라이신 변이, C-말단 아르기닌 변이, N-말단 피로글루타메이트 변이, C-말단 글리신 아미드화, C- 말단 프롤린 아미드화, 숙신이미드 형성, 시알릴화, 탈시알릴화, 부가물 형성, 이황화물-매개 변형, 아시알릴화 (말단 갈락토오스), 또는 C-말단 라이신 및 글리신 아미드화를 포함한다. 일부 측면에서, 펩티드 또는 단백질의 변형은 메티오닌, 시스테인, 라이신, 히스티딘 또는 트립토판의 산화를 포함한다.
일부 측면에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법에서, 소화 효소는 스트렙토코커스 피오게네스의 면역글로불린 G-분해 효소, 시알리다제, 시스테인 프로테아제, 엔도펩티다제, 파파인, 엔도프로테이나제 Lys-C, 펩신, 트립신, 카르복시펩티다제 B, 프로테아제, 또는 이들의 조합이다. 일부 측면에서, 효소적 소화는 1X DPBS에서 약 5 mg/mL로 약 100 μl의 항체 샘플 (총 단백질 약 0.5 mg)을 제조하여 IdeS를 사용하여 수행하였다.
일부 예시적인 구현예에서, 펩티드 또는 단백질의 성분은 등전 초점화 전기영동 방법, 모세관 등전 초점화 전기영동 방법, 이미지화된 모세관 등전 초점화 전기영동 방법, 크로마토그래피 결합 모세관 전기영동 방법, 크로마토그래피 결합 이미지화된 모세관 전기영동 방법, 양이온-교환 크로마토그래피 방법, 또는 액체 크로마토그래피-질량 분석 방법을 사용하여 전하 변이체의 전하 불균일성에 기초하여 분리된다.
일부 예시적인 구현예에서, 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 방법에서, 환원 또는 변성 조건은 우레아, 구아니디늄 클로라이드, 디티오트레이톨 (DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP), 유기 용매, 알칼리 용액, 산성 용액, 또는 이들의 조합의 사용을 포함한다. 일부 측면에서, 펩티드 또는 단백질의 성분은 약 1-10M 구아니디늄 클로라이드, 약 3-8 M 구아니디늄 클로라이드, 또는 바람직하게는 약 6M 구아니디늄 클로라이드를 사용하여, 약 1-50 mM TCEP, 약 5-15 mM TCEP와 함께, 또는 바람직하게는 약 10 mM TCEP와 함께, 약 0.1-2시간, 약 0.5-1.5시간, 또는 바람직하게는 약 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 환원 및 변성시킨다.
후속 완충액 교환은 바람직하게는 약 35 mM 인산염, 약 pH 6.0, 약 8 M 우레아 및 약 1 mM TCEP를 함유하는 완충액을 사용하여 하전된 완충액 성분을 제거하기 위해 수행된다. 상기 펩티드 또는 단백질의 성분은 바람직하게는 약 21 mM 인산염, 약 pH 6.0, 약 8 M 우레아, 약 0.6 mM TCEP, 약 0.35% (w/v) 메틸 셀룰로오스, 약 4% (v/V) pH 3-10 파말라이트(pharmalyte)를 함유하는 조성물 하에서 icIEF에 적용된다.
상기 방법 또는 시스템은 임의의 전술한 펩티드, 단백질, 항체, 단백질 의약품, 소화 효소, 환원/변성 조건, 등전 초점화 전기영동, 이미지화된 모세관 등전 초점화 전기영동, 크로마토그래피 결합 모세관 전기영동, 크로마토그래피 결합 이미지화된 모세관 전기영동 방법, 양이온-교환 크로마토그래피 방법 또는 액체 크로마토그래피-질량 분석 방법에 제한되지 않는 것으로 이해된다.
숫자 및/또는 문자로 본원에 제공된 방법 단계의 연속적인 라벨링은 방법 또는 이의 임의의 구현예를 특정 지시된 순서로 제한하는 것을 의미하지 않는다.
특허, 특허출원, 공개된 특허출원, 수탁번호, 기술 논문(technical article) 및 학술 논문을 포함하는, 다양한 간행물이 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된다. 이들 인용된 참고문헌 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 개시는 본 개시를 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 하기 실시예를 참조하여 보다 완전히 이해될 것이다. 이는 예시를 위한 것이며, 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
재료 및 시약 제조
1.1. 단일특이성 및 이중특이성 항체.
여러 치료 항체는 이중특이성 항체 및 이의 모 단일특이성 항체를 포함하여 생물물리적 특징규명에 적용되었다. 이중특이성 항체의 포맷은 2개의 상이한 중쇄 (HC)를 2개의 공통 경쇄 (LC)와 페어링(pairing) 하는 것을 포함하며, 이는 2종의 상이한 항원을 표적화하는 2개의 고유한 항원-결합 부위를 가능하게 한다. 예를 들어, MAB4는 ANTIGENB 및 ANTIGENA 둘 다를 표적화하는 이중특이성 항체이다. MAB4의 중쇄에서 ANTIGENA 암은 2개의 아미노산 치환을 갖는다. MAB4의 중쇄 중 하나의 Fc 영역에서 2개의 아미노산의 치환, 예를 들어, 별-치환 또는 Fc*로 지칭되는 RF로 치환된 HY가 단백질 A 결합을 폐지한다. 이러한 별-치환은 비치환 및 치환된 중쇄 사이의 이론적 등전점의 차이에 기여하며, 이는 경험적 (예를 들어, 관찰되거나 실험적) 등전점에 기초하여 항체 정제 또는 분리를 용이하게 할 수 있다.
MAB3은 ANTIGENB를 표적화하는 단일특이성 항체이며, 이는 예를 들어, Fc/Fc로, 중쇄에서 별-치환을 갖지 않는다. MAB1은 ANTIGENA를 표적화하는 단일특이성 항체이며, 이는 예를 들어 Fc*/Fc*로, 두 중쇄에서 별-치환을 갖는다. MAB4는 ANTIGENB 및 ANTIGENA 둘 다를 표적화하는 이중특이성 항체이다. MAB4 (Fc/Fc*)는 도 1a에 나타낸 바와 같이 MAB3 (Fc/Fc)으로부터의 단일 중쇄 및 MAB1 (Fc*/Fc*)로부터의 단일 중쇄를 조합하여 파생된다. MAB3 및 MAB1 간의 아미노산 서열의 비교에 있어서, 이들은 도 1a에 나타낸 바와 같이 중쇄의 Fc 영역에서 상이하다. 도 1a에 표시한 바와 같이 상응하는 위치에서, MAB3은 히스티딘 (H) 및 티로신 (Y) 잔기를 갖고, MAB1은 아르기닌 (R) 및 페닐알라닌 (F)을 갖는다.
MAB2는 약 40% 당화를 가지며, ANTIGENC 및 ANTIGENA 둘 다를 표적화하는 이중특이성 항체이다. MAB2의 당화는 도 1b에 나타낸 바와 같이 MAB2의 중쇄의 ANTIGENC 암의 CDR 영역에서 단일 잔기 ResidueX에서 일어난다. ResidueX에서의 당화는 약물 활성 및 효력에 영향을 미친다. MAB2의 중쇄의 ANTIGENA 암은 Fc 영역에서 별-치환을 갖는 G 모 생식계열로부터 파생된다.
2.1 항체의 효소적 소화
항체는 도 2에 나타낸 바와 같이, 효소적 소화를 적용하여 항체 단편을 생성하며, 예컨대, 스트렙토코커스 피오게네스 (IdeS)의 면역글로불린 G-분해 효소를 사용하여 F(ab')2 및 Fc' 단편을 생성한다. F(ab')2 및 Fc' 단편은 환원 및/또는 변성 조건을 추가로 적용하여 항체 도메인, 예컨대 LC, Fd' 및 F'/2를 생성할 수 있다. 예를 들어, MAB4 (ANTIGENBxANTIGENA, Fc/Fc*)가 IdeS 소화에 적용되는 경우, 이는 MAB4의 F(ab')2 및 Fc' 단편을 생성한다. MAB4의 F(ab')2 단편을 환원 및/또는 변성 조건에 적용하는 경우, 이는 2개의 Fd', 예를 들어, ANTIGENB-Fd' 및 ANTIGENA-Fd', 및 2개의 경쇄 (LC)를 생성한다. MAB4의 Fc' 단편을 환원 및/또는 변성 조건에 적용하는 경우, 이는 2개의 항체 도메인, 예를 들어, Fc'의 ANTIGENB 암 및 Fc'의 ANTIGENA 암 (별-치환을 가짐)을 생성한다.
등전 초점화를 위한 기구.
1.1. 소화-보조 이미지화된 모세관 전기영동 ( d igestion-assisted i maged c apillary e lectrophoresis, DiCE)의 워크플로우
DiCS를 사용하여 펩티드 또는 단백질의 전하를 식별하는 방법은 펩티드 또는 단백질을 효소적 소화 반응으로 처리하여 펩티드 또는 단백질의 성분을 생성하는 단계, 및 상기 성분의 전하 또는 등전점에 기초하여 펩티드 또는 단백질의 성분을 분리하는 단계를 포함한다. 도 2는 이중특이성 항체의 단편을 분리하기 위해 icIEF 전기영동을 사용하는 일반적인 DiCE 워크플로우의 구현예를 나타내며, 여기서 이중특이성 항체는 IdeS를 사용하여 단편화된다.
일부 예시적인 구현예에서, 효소적 소화는 1X DPBS에서 약 5 mg/mL로 약 100 μl의 항체 샘플 (총 단백질 약 0.5 mg)을 제조하여 IdeS를 사용하여 수행하였다. 샘플을 후속적으로 약 6M 구아니디늄 클로라이드를 사용하여 약 10 mM TCEP와 함께 약 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 환원 및 변성시켰다. 완충액 교환은 약 35 mM 인산염, 약 pH 6.0, 약 8 M 우레아 및 약 1 mM TCEP를 함유하는 완충액을 사용하여 하전된 완충액 성분을 제거하기 위해 수행되었다. 샘플은 약 21 mM 인산염, 약 pH 6.0, 약 8 M 우레아, 약 0.6 mM TCEP, 약 0.35% (w/v) 메틸 셀룰로오스, 약 4% (v/V) pH 3-10 파말라이트를 함유하는 조성물 하에서 icIEF에 적용되었다. 소화되지 않은 물질은 DiCE를 사용한 피크 정량에 영향을 미치지 않는 약 2% 미만인 것으로 추정되었다.
실시예 1. CEX, icIEF 및 chromiCE를 사용한 항체의 전하 불균일성 분석
CEX, icIEF 또는 크로마토그래피 이미지화된 모세관 전기영동 (chromiCE)을 사용하여 항체의 전하 불균일성을 분석하였다. 치료 항체, 예를 들어, MAB4, MAB3 및 MAB1을 도 3에 나타낸 바와 같이 분석에 사용하였다.
CEX는 온전한 항체 분자의 표면 전하를 분석하는 데 사용되었으며, 이는 도 3a에 나타낸 바와 같이 중저(low-to-medium) 해상도를 제공하였다. icIEF는 전체, 예를 들어, 온전한 항체 분자의 고유한, 전하를 분석하는 데 사용되었으며, 이는 도 3b에 나타낸 바와 같이 온전한 분자의 등전점에 기초하여 기준선 분리를 갖는 고해상도를 제공하였다. chromiCE는 항체의 개별 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)의 고유 전하를 분석하는 데 사용되었으며, 여기서 항체는 환원 및/또는 변성 조건 하에서 분석되었다. HC 및 LC를 환원 및/또는 변성 조건 하에서, 예컨대 6 M 구아니디늄 클로라이드 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP)의 존재 하에서 약 1 시간 인큐베이션하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 방법을 사용하여 분리하였으며, icIEF의 분석이 뒤따랐다. HC 및 LC의 등전점 간의 상당한 중첩이 있는 경우, HC 및 LC는 완전히 분리될 수 없었으며, 이는 도 3c에 나타낸 바와 같이 중첩된 HC 피크 및 LC 피크를 생성하였다. CEX, icIEF 및 chromiCE의 분석 결과, 예를 들어, 종래의 전하-기반 검정에서는 이중특이성 항체 내의 2개의 고유한 중쇄 간의 전하 차이를 구별할 수 없었다.
분석을 환원 및/또는 변성된 조건 하에서 온전한 icIEF를 사용하여 수행하는 경우, 개별 HC를 나타내는 뚜렷한 피크가 검출 및 분해되었다. 그러나, F(ab')2 및 Fc' 단편 사이의 전하 차이는 신호가 단일 HC 신호로 회선되었기 때문에 구별가능하지 않았다. 이러한 전하 변이체는 VH 도메인 또는 불변 영역 (예를 들어, 별-치환)에서의 서열 차이로 인한 번역 후 변형과 관련된 전하 차이를 포함한다.
실시예 2. 항체의 IdeS 소화
IdeS를 사용하여 약 37℃에서 적어도 약 2시간 동안 항체의 효소적 소화 반응을 수행하였다. 이 조건 하에서의 IdeS 소화는 도 4a에 나타낸 바와 같이, 면역글로불린 (IgG) 분자를 절단하여 항체 단편, 예를 들어 F(ab')2 및 Fc'를 생성하는데 효율적이었다. 여러 치료 항체, 예를 들어 MAB9, MAB10, MAAB5, MAB4, MAB1 및 MAB3을 IdeS 소화에 사용하고, 후속적으로 icIEF 분석에 적용하였다. IdeS의 소화 효율은 기록된 소화 시간으로 도 4b에 나타낸 바와 같이, 피크 면적 백분율 하에 표시된 바와 같은 온전한 항체 분자 및 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 및 Fc')의 존재를 검출하고, 고분자량 (HMW) 분자의 존재를 모니터링하여 분석하였다. GG 하부 힌지 서열은 AG 하부 힌지 서열과 비교하여 더 나은 절단 효율을 산출하였다.
약 37℃에서 약 4시간 또는 하룻밤 같이, 절단 효율을 개선하기 위해 IdeS 소화 반응의 다양한 소화 조건을 시험하였다. IdeS의 소화 효율은 고분자량 (HMW) 분자의 존재를 모니터링하는 것을 포함하여, 도 5에 나타낸 바와 같이 체류 시간에서 피크 면적 백분율 하에 표시된 바와 같은 온전한 항체 분자 (도 5b에서 단량체로 표시됨) 및 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 및 Fc')의 존재를 검출함으로써 분석하였다. 소화되지 않은 MAB4 항체를 대조군으로서 사용하였다 (도 5a에서 MAB4 DS로 표시됨). 시험된 결과는 절단 효율이 분자-의존적임을 나타낸다.
실시예 3. F(ab')2 및 Fc' 단편에서 추정된 등전점
MAB4 (Fc/Fc*)는 도 1a에 나타낸 바와 같이 MAB3 (ANTIGENB, Fc/Fc)으로부터의 단일 중쇄 및 MAB1 (ANTIGENA, Fc*/Fc*)으로부터의 단일 중쇄를 조합하여 파생된, ANTIGENB 및 ANTIGENA 둘 다를 표적화하는 이중특이성 항체이다. MAB3 및 MAB1의 중쇄는 Fc 영역에서 상이하다. 아미노산 서열에서의 차이, 예를 들어, HY로부터 RF로의 아미노산 치환으로 인해, ANTIGENA 중쇄는 Fc 영역에서 별-치환을 갖는다. MAB4의 추정된 pI (등전점)는 ANTIGENB 암이 이중특이성 항체보다 더 산성인 반면, ANTIGENA 암은 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이 더 염기성임을 시사하였다.
실시예 4. F(ab')2 및 Fc' 단편의 분석
MAB4, MAB3 또는 MAB1은 항체를 IdeS로 처리하여 항체 단편, 예를 들어, F(ab')2 및 Fc' 단편을 생성하는 것을 포함하는 효소적 소화에 적용되었다. 후속적으로, 항체 단편을 이들의 전하 또는 등전점에 기초하여 분리하였다. DiCE 워크플로우의 경우, 약 0.3 mg의 단백질 농도가 사용되었다. 등전 초점화의 경우, pH 3-10 파말라이트 및 pH 8-10.5 파말라이트의 비는 약 3:1이었다. 도 7a 및 도 7b에 표시된 바와 같이, 시험 결과에 기초하여, MAB1의 Fc' 단편은 MAB4 및 MAB3의 것과 비교하여 더 염기성이었다. MAB3의 Fc' 단편은 더 산성이었다. 결과는 MAB1의 Fc' 단편이 2개의 별-치환의 존재로 인해 더 염기성임을 나타내었고, 이는 pI 추정치와 일치하였다. 결과는 또한 MAB4에서 하나의 별-치환의 존재로 인해, MAB4의 Fc' 단편이 MAB3와 비교하여 더 염기성임을 나타낸다. 결론적으로, 결과는 1개 또는 2개의 별-치환의 존재가 이중특이성 항체 내의 도메인-특이적 전하 변이체의 검출을 위한 등전점의 측정가능한 변화에 기여할 수 있음을 나타내었다. 별-치환을 갖는 Fc' 단편은 천연 Fc' 단편보다 더 염기성인 전체 전하를 갖는 것으로 실험적으로 검증되었으며, 이는 pI 예측과 일치하였다.
IdeS 소화 후, VH 도메인을 함유하는 F(ab')2 단편을 정제하고 icIEF를 사용하여 분리하여 도 8a에 나타낸 바와 같은 실험적 등전점을 결정하였다. 온전한 항체 분자의 실험적 등전점은 도 8b에 나타낸 바와 같이 icIEF를 사용하여 결정하였다. 결과는 MAB3, MAB4 및 MAB1의 F(ab')2 단편 사이의 실험적 등전점의 차이가 상응하는 온전한 항체 분자 사이의 차이와 잘 상관되어 있음을 나타내었다. 그러나, icIEF를 사용한 F(ab')2 단편의 분리는 Fc' 단편이 IdeS 소화 후 제거되는 경우, 예를 들어 별-치환이 있거나 없는 2개의 중쇄 간의 전하 차이를 구별하기에 충분한 차별을 제공하지 않았다.
실시예 5. 환원 및/또는 변성된 조건 하에서 항체 단편 분석
MAB3, MAB4 또는 MAB1을 IdeS를 사용하여 약 37℃에서 하룻밤 (약 16시간) 소화시켜 항체 단편, 예를 들어, F(ab')2 및 Fc'를 생성하였다. 항체 단편을 후속적으로 약 6M 구아니디늄 클로라이드 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP)로 1시간 동안 처리하여 4개 또는 5개의 별개의 항체 도메인, 예를 들어, ANTIGENB-Fd', ANTIGENA-Fd', LC (경쇄), Fc'의 ANTIGENB 암, 및/또는 Fc'의 ANTIGENA 암을 수득하였다. 이러한 항체 단편 및 도메인을 icIEF를 사용하여 분석하여 도 9에 나타낸 바와 같이 이들의 실험적 등전점을 결정하였다.
MAB4를 IdeS로 소화시키고, icIEF를 사용하여 환원 및/또는 변성된 조건 하에서 분석한 경우, 결과는 도 10a에 나타낸 바와 같이 차별화 가능한 등전점을 갖는, Fc', LC 및 2개의 Fd에 상응하는 5개의 별개의 피크를 나타내었다. 도 10b는 MAB4를 IdeS로 소화시키고, 환원 및/또는 변성 조건의 사용 없이 icIEF를 사용하여 분석한 경우의 F(ab')2 및 Fc' 단편의 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 10a 및 도 10b의 결과를 비교함에 있어서, 환원 및/또는 변성된 조건은 항체의 도메인-특이적 전하 변이체의 식별을 위한 등전점의 차이를 강조하였다. 특히, LC에 상응하는 3개의 잘 분리된 피크 및 2개의 별개의 Fd'가 도 10a에 나타낸 바와 같이 관찰될 수 있다.
MAB3 또는 MAB1을 IdeS로 소화시키고, icIEF를 사용하여 환원 및/또는 변성된 조건 하에서 분석한 경우, 결과는 도 11a에 나타낸 바와 같이, Fc', LC 및 Fd'에 상응하는 차별화 가능한 등전점을 갖는 각 항체에 대해 3개의 별개의 피크를 나타내었다. MAB3, MAB4 및 MAB1의 결과 간의 피크를 비교함에 있어서, MAAB4의 결과에서 3개의 피크는 산성에서 염기성 pI까지 공통 LC, ANTIGENB-Fd' 및 ANTIGENA-Fd'로 식별할 수 있다. 모 단일특이성 단클론성 항체 및 정제된 Fc' 및 F(ab')2 단편에 대해 DiCE를 동시에 수행하여, 각 피크의 동일성(identity)을 확인하였다. Fd' 단편의 실험적 pI 값은 MAB4 및 이의 모 단일특이성 항체에 관한 이의 예상된 pI 값과 잘 상관되었다. Fd' 단편 사이의 신호에서 일부 중첩이 관찰되었다. 일부 LC 신호는 산성 Fd'의 신호와 중첩된다. 전반적으로, 각 단편 (또는 도메인)에 대한 3개의 주요 피크의 근-기준선(near-baseline) 분리가 관찰되었다.
결과는 Fd'에서의 pH 차이가 환원/변성된 조건 하에서 DiCE를 사용하여 수득한 약 0.3-0.4 pH 단위임을 나타내었으며, 이는 chromiCE를 이용하여 수득한 시험 결과와 유사하였다. chromiCE를 사용하여 수득한 HC 간의 pI 범위는 약 pH 6.8-7.6이었고, 이는 차이가 약 0.8 pH 단위이었다. DiCE를 사용하여 수득한 Fd' 단편 간의 pI 범위는 약 pH 7.5-8.0이었고, 이는 차이가 약 0.5 pH 단위이었다.
도 11a 및 도 11b에 나타낸 바와 같이, 환원/변성된 조건 하에서 DiCE를 사용하여 수득한 결과는 chromiCE와 상보적이었다. 그러나, 항체가 환원/변성된 조건 하에서 DiCE를 사용하여 분석한 경우, 그 결과는 이중특이성 항체의 2개의 중쇄 간의 pI 차이를 보여줄 수 있었고, 특히 Fc' 및 Fd' 간의 pI 차이를 보여주고 있다.
환원/변성된 조건 하에서 DiCE를 사용한 시험 결과의 재현성을 시험하기 위해, 실험은 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이 MAB1, MAB4 및 MAB3에 대한 3회 주입으로 반복하였다. 상응하는 피크의 pI 값은 도 12에 나타낸 바와 같이 고도로 재현가능하였다. 상응하는 피크의 피크 면적 백분율은 도 13에 나타낸 바와 마찬가지로 고도로 재현가능하였다.
Fc/Fc* 피크를 추가로 확인하기 위해, 정제된 MAB4 Fc' 단편을 카르복시펩티다제 B (CPB)로 처리하여 C-말단 라이신을 특이적으로 절단하였다. 피크 5 및 6의 감소된 풍부도는 이들 피크가 도 14에 나타낸 바와 같이 미처리된 C-말단 라이신을 함유함을 입증하였다.
실시예 6. 이중특이성 항체에서의 당화 식별
MAB2는 ANTIGENC 및 ANTIGENA 둘 다를 표적화하는 이중특이성 항체이다. MAB2의 당화는 MAB2의 중쇄의 ANTIGENC 암의 CDR 영역에서 단일 잔기 ResidueX에서 일어난다. MAB2의 당화는 온전한 항체 분자의 icIEF 분석을 사용하여 검출할 수 없었다. CEX의 사용으로 MAB2의 당화를 검출할 수 있었음에도 불구하고, CEX를 사용하여 수득한 시험 결과는 당화된 종에 상응하는 피크 및 인접 피크 간의 불량한 해상도로 인해 당화의 수준을 정량화할 수 없었다. 중쇄의 ANTIGENC 암의 당화는 도 15에 나타낸 바와 같이 chromiCE에서 약간 볼 수 있었고, 중쇄의 피크 (ANTIGENC 중쇄의 숄더에서)와 중첩되었다. MAB2의 당화 수준은 불량한 해상도로 인해 chromiCE를 사용하여 정확하게 정량화할 수 없었다.
MAB2 및 이의 모 단일특이성 항체, 예를 들어, ANTIGENC 및 ANTIGENA 단클론성 항체를 IdeS 소화에 적용하고, 환원/변성된 조건 하에서 DiCE를 사용하여 분석하였다. 3개의 항체에 대한 시험 결과를 도 16에 나타낸 바와 같이 피크 식별을 위해 나란히 비교하였다. 피크 1-6은 Fc 도메인에 상응하는 것으로 식별되었다. 피크 8은 모든 샘플에 존재하였으며, LC에 상응하는 것으로 식별되었다. 피크 11은 우세한 항-ANTIGENA Fd' 단편을 나타내는 것으로 식별되었다. 피크 9-10은 항-ANTIGENA Fd'의 산성 형태를 나타낼 수 있다. 항-ANTIGENC Fd' 단편은 고도로 분해된, 분할 피크, 예를 들어, ANTIGENC의 당화 및 비-당화된 형태를 나타낼 수 있는 피크 15 및 16으로 나타났다. 피크 12-14는 항-ANTIGENC Fd' 단편의 산성 형태를 나타낼 수 있다.
ANTIGENC에 상응하는 피크 15 및 16의 동일성을 확인하기 위해, 당화된 종 및 비-당화된 종을 CEX를 사용하여 균일하게 농축하였다. 농축된 당화된 종 및 비-당화된 종은 도 17a에 나타낸 바와 같이 CEX에서 뚜렷하고 구별가능한 프로파일을 갖는다. 그러나, 피크 프로파일은 도 17b에 나타낸 바와 같이 icIEF를 사용하여 분석한 경우 구별가능하지 않았다.
농축된 당화된 종 및 비-당화된 종을 IdeS 소화에 적용하고, 환원/변성된 조건 하에서 DiCE를 사용하여 분석하였다. 도 18a에 나타낸 바와 같이, 피크 15(*)의 상대 풍부도는 피크 16과 비교하여 당화-농축된 샘플에서 더 높았고, 농축된 비-당화 샘플에서는 더 낮았다. 피크 번호에 상응하는 백분율의 평균 피크 면적을 도 18b에 나타낸다.
표 2에 나타낸 바와 같이 피크 15 및 16을 비교함에 있어서, 비-당화된 샘플은 피크 16의 경우에 농축된다. 그러나, 당화-농축된 샘플은 피크 15의 경우에 농축된다. 피크 15 (*)의 상대 풍부도는 당화-농축된 샘플에서 더 높은 반면, 피크 16은 비-당화 샘플에서 증가하였다. 이들 2개의 주요 ANTIGENC Fd' 피크의 관찰에 기초하여, 당화 수준의 정량화는 피크 15 및 16의 합에 대한 피크 15의 상대비를 취하여 추정할 수 있다.
표 2. DiCE를 사용하여 분석된 ANTIGENC Fd' 피크의 상대 풍부도.
Figure pct00002
MAB2 샘플에서 당화 수준의 정량화는 표 3에 나타낸 바와 같이 펩티드 매핑을 사용하여 추가로 검증되었다. 표 3은 CEX, 펩티드 매핑 및 DiCE를 사용한 비교를 나타낸다. 결과는 DiCE를 사용한 정량화가 펩티드 매핑과 필적함을 나타내었다.
표 3. MAB2 샘플에서 당화 수준의 정량화
Figure pct00003
실시예 7. 전하 변이체 모니터링에서의 세포주 개발
생산된 항체의 전하 변이체를 모니터링하여 항체를 생산하기 위한 세포주를 개발하였다. 세포주 개발은 새로운 세포주로부터 초래될 수 있는 다양한 번역 후 변형 (PTM)에 대한 대용물로서 전하-기반 검정을 사용하여 모니터링되었다. 비교가능성을 평가하기 위해, C1 임상 비교 샘플에 대해 CEX 및 icIEF를 사용하여 2개의 세포주, 예를 들어 A28-L21 및 A30-L91을 분석하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 전하 염기성 변이체의 총 풍부도와 관련하여 CEX 및 icIEF 간의 불일치가 관찰되었다. 대조군 샘플 및 A30-L91과 비교하여 A28-L21에서 당화의 약간의 증가가 관찰되었다. 두 C2 세포주는 모두 Fc* 상에서 우세하게 C-말단 라이신의 증가를 나타내었다. DiCE가 MAB2 C2 세포 선택에 사용되는 경우, 도 20 및 도 21에 나타낸 바와 같이, 샘플은 Fc C-말단 라이신 (피크 5)에서 약간의 증가를, 그러나 Fc* C-말단 라이신 (피크 6)에서는 현저한 증가를 나타낸다. DiCE 분석은 icIEF에서 관찰된 염기성 종의 증가가 Fc 도메인 상의 미처리된 C-말단 라이신에 기인하며, Fc* 도메인이 클리핑(clipping)에 덜 민감하다는 것을 시사하였다. 또한, A28-L21 클론에 대한 당화 수준은 MAB2에 대해 전형적으로 관찰되는 것보다 약간 더 높았다. DiCE는 세포주 및 MAB2의 공정 개발을 지원하기 위해 ANTIGENC에 대한 당화 수준을 신속하게 평가하는데 사용할 수 있다.
실시예 8. 번역 후 변형 (PTM) 모니터링
이중(dual) pH-염 구배 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 농축된 전하 변이체에 대한 온전한 icIEF 및 DiCE 프로파일은 두 방법 간의 직교성을 보여주었다. 도 22 및 도 23에 나타낸 바와 같이, Fc/Fc*, LC 및 ANTIGENA-Fd' 단편에 상응하는 피크가 모든 샘플에 걸쳐 비교적 일정하게 유지된 반면, ANTIGENC Fd' 피크 (12-16)는 산성 분획에 걸쳐 분포에 유의한 변화를 나타내었다. MAB2의 농축 전하 변이체에 대한 DiCE 분석은 ANTIGENC 암이 ANTIGENA 암과 비교하여 PTM에 더 민감할 수 있음을 시사하였다.
실시예 9. DiCE를 사용한 MAB5의 농축된 전하 변이체의 분석
DiCE를 사용하여 도 24에 나타낸 바와 같이 MAB5의 농축된 전하 변이체를 분석하였다. 피크 6, 8 및 11은 우세한 하전된 종을 나타낸다. 피크 6은 Fc에 상응한다. 피크 8은 LC에 상응한다. 피크 11은 우세한 Fd에 상응한다. 산성 3은 피크 5, 7의 경우에 특히 농축된다. 피크 10은 농축된 염기성 2에서 가장 높은 풍부도를 가지며, 이는 미처리된 C-말단 라이신을 갖는 MAB5 Fc 단편에 상응할 가능성이 있다.
실시예 10. DiCE를 사용한 콤보-Eb의 분석
도 25에 나타낸 바와 같이, 피크 1-2는 MAB6 LC에 상응한다. 피크 3-5는 Fc/2에 상응하고 모든 샘플에 존재한다. 피크 6은 MAB7 및 MAB8의 LC를 나타낸다. 이들의 서열은 서로 거의 동일하다. 피크 7-8은 MAB6 Fd 단편에 상응한다. 피크 9는 MAB7 Fd 단편을 나타낸다. 피크 10-11은 MAB8 Fd 단편에 상응한다.

Claims (21)

  1. 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 하나 이상의 변이체를 식별하기 위한 방법으로서,
    상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질을 하나 이상의 소화 효소로 처리하여 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 둘 이상의 성분을 생성하는 단계;
    상기 성분을 환원 또는 변성시키는 단계;
    상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 둘 이상의 성분을 분리하는 단계로서, 여기서 분리 프로파일이 생성되는 단계; 및
    상기 변이체를 식별하는 단계로서, 여기서 식별은 선택적으로 상기 분리 프로파일에 기초하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 성분은 생물물리적 파라미터에 기초하여 분리되는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 소화 효소는 스트렙토코커스 피오게네스의 면역글로불린 G-분해 효소, 시알리다제, 시스테인 프로테아제, 엔도펩티다제, 파파인, 엔도프로테이나제 Lys-C, 펩신, 트립신, 카르복시펩티다제 B, 프로테아제, 시알리다제, 엑소글리코시다아제 또는 이들의 조합인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 성분을 다중상에서 하나 이상의 소화 효소로 처리하여 추가의 성분을 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 환원 또는 변성 조건은 우레아, 구아니디늄 클로라이드, 디티오트레이톨 (DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP), 유기 용매, 알칼리 용액, 산성 용액 또는 이들의 조합의 사용을 포함하는, 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 성분은 상기 성분의 전하 변이체에 기초하여 분리되는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 성분은 등전 초점화 전기영동 방법, 모세관 등전 초점화 전기영동 방법, 이미지화된 모세관 등전 초점화 전기영동 방법, 크로마토그래피 결합 모세관 전기영동 방법, 모세관 전기영동, 크로마토그래피 결합 이미지화된 모세관 전기영동 방법, 양이온-교환 크로마토그래피 방법 또는 액체 크로마토그래피-질량 분석 방법을 사용하여 분리되는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 분리된 성분을 정량화 또는 식별하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상이한 전하 변이체를 갖는 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질에 대한 분리 프로파일의 비교에 기초하여 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 식별하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 변이체의 수준을 정량화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 변이체는 번역 후 변형으로부터의 변이체를 포함하는, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 변이체는 상기 성분의 당화 또는 C-말단 라이신 유래의 것인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질은 약물, 항체, 이중특이성 항체, 단클론성 항체, 융합 단백질, 항체-약물 접합체, 항체 단편 또는 단백질 의약품인, 방법.
  14. 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 전하 변이체를 식별하기 위한 시스템으로,
    적어도 하나의 펩티드 또는 단백질;
    상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 성분을 생성할 수 있는 제1 소화 효소;
    상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 성분을 환원 또는 변성시킬 수 있는 환경; 및
    환원 또는 변성된 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 성분을 분리할 수 있는 장치;를 포함하는 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 환경은 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질의 상기 성분을 처리할 수 있는 제2 소화 효소를 더 포함하는, 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 소화 효소는 스트렙토코커스 피오게네스의 면역글로불린-분해 효소, 시알리다제, 시스테인 프로테아제, 엔도펩티다제, 파파인, 엔도프로테이나제 Lys-C, 펩신, 트립신, 카르복시펩티다제 B, 또는 프로테아제인, 시스템.
  17. 제14항에 있어서, 상기 환경은 환원제 또는 변성제를 더 포함하고, 여기서 상기 환원제 또는 변성제는 우레아, 구아니디늄 클로라이드, 환원제, 디티오트레이톨 (DTT), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP), 유기 용매, 알칼리 용액, 산성 용액 또는 이들의 조합인, 시스템.
  18. 제14항에 있어서, 상기 장치는 전하 불균일성에 기초하여 분리하는 것인, 시스템.
  19. 제14항에 있어서, 상기 장치는 등전 초점화 장치, 모세관 등전 초점화 전기영동 장치, 이미지화된 모세관 등전 초점화 전기영동 장치, 크로마토그래프 결합 모세관 전기영동 장치, 크로마토그래프 결합 이미지화된 모세관 전기영동 장치, 양이온-교환 크로마토그래프 장치, 또는 액체 크로마토그래피-질량 분석 장치인, 시스템.
  20. 제14항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질은 이중특이성 항체인, 시스템.
  21. 제14항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질은 약물, 항체, 이중특이성 항체, 단클론성 항체, 융합 단백질, 항체-약물 접합체, 항체 단편 또는 단백질 의약품인, 시스템.
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