CN113874720A - 抗体结构域特异性电荷变异体的表征分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基于酶消化辅助成像毛细管电泳(DiCE)技术分析肽或蛋白(如抗体)生物物理特性的方法和系统，用于优选在双特异性抗体内表征结构域特异性电荷变异体。所述方法和系统包括用消化酶处理蛋白来产生蛋白组分、还原组分或使组分变性、根据其等电点分离组分。

Description

抗体结构域特异性电荷变异体的表征分析
技术领域
本发明一般涉及抗体表征方法和系统，包括结构域特异性变异体的生物物理表征分析。
背景技术
治疗性肽和蛋白的生物物理特性(包括结构域特异性变异体的生物物理特性)可能影响其安全性、有效性和保质期。例如，存在不同电荷变异体可能会改变溶解度、结合性和稳定性。
由于各种翻译后修饰(PTM)、蛋白降解、酶修饰和化学修饰，治疗性肽或蛋白(如抗体)可能会获得不同的变异体并变得异质。这些生物物理特性的改变可能发生在肽和蛋白产生期间或之后的任何时间点。因为这些生物物理特性的改变可能会影响治疗性肽和蛋白的安全性、有效性和保质期，因此识别特定治疗性肽或蛋白的不同变异体及其相关安全性、有效性和保质期曲线非常重要。
应认识到，需要更有效、更准确表征治疗性蛋白异质性的方法和系统。此外，方法和系统可为识别电荷变异体(可能与特定结合能力、生物活性、药物安全性和保质期相关)提供宝贵信息。
发明内容
在治疗性肽或蛋白(如抗体)的生成过程中引入异质性可能会引起人们的担忧，因为它可能影响治疗性蛋白的安全性、有效性和质量。本申请提供治疗性肽或蛋白的生物物理特性，以分析治疗性肽或蛋白的结构域特异性变异体。
本文公开的示例性实施例通过使用消化辅助成像毛细管电泳法(DiCE)来识别或量化抗体电荷变异体的方法和系统，满足上述需求，包括使用等电聚焦法在抗体中(优选在双特异性抗体中)检测和定量不同结构域特异性电荷变异体的水平。
本公开提供了识别至少一种肽或蛋白变异体的方法和系统，包括：使用一种或多种消化酶处理至少一种肽或蛋白来产生所述至少一种肽或蛋白的组分；还原所述至少一种肽或蛋白的组分或使所述至少一种肽或蛋白的组分变性；以及随后分离所述至少一种肽或蛋白的两种或多种组分。
在某些方面，所述消化酶为酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶、唾液酸酶、半胱氨酸蛋白酶、内肽酶、木瓜蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C、胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白酶或其组合。
在某些方面，所述识别至少一种肽或蛋白的变异体的方法进一步包括在多相中用一种或多种消化酶处理所述一种或多种组分来产生其他组分。
在某些方面，所述还原或变性条件包括使用尿素、盐酸胍、二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、有机溶剂、碱溶液、酸溶液或其组合。
在某些方面，根据所述组分的电荷变异体分离所述至少一种肽或蛋白的组分，其中，物理参数为电荷异质性、分子量、电荷或其组合。
在某些方面，使用以下方法分离所述至少一种肽或蛋白的所述组分：等电聚焦电泳法、毛细管等电聚焦电泳法、成像毛细管等电聚焦电泳法、色谱耦合毛细管电泳法、色谱耦合成像毛细管电泳法、阳离子交换色谱法或液相色谱-质谱法。
在某些方面，所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法进一步包括生成一条分离曲线。
在某些方面，所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法进一步包括量化所述至少一种肽或蛋白的分离组分。
在某些方面，所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法进一步包括识别所述至少一种肽或蛋白的分离组分。
在某些方面，所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法进一步包括根据具有不同电荷变异体的至少一种肽或蛋白的分离曲线比较来识别所述至少一种肽或蛋白的组分。
在其他方面，所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法进一步包括量化所述识别组分的糖化或C端赖氨酸的水平。
在某些方面，在所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法中，所述至少一种肽或蛋白为双特异性抗体。
在某些方面，所述至少一种肽或蛋白是一种药物、抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物偶联物、抗体片段或蛋白药物。
本公开至少部分提供了一种识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的系统，包括：至少一种肽或蛋白；一种能够产生所述至少一种肽或蛋白组分的第一种消化酶；一种能够还原所述至少一种肽或蛋白所述组分或使所述至少一种肽或蛋白所述组分变性的环境；以及一个能够分离所述至少一种肽或蛋白所述组分(已通过一个或多个毛细管中的一个或多个物理参数进行消化和还原或变性)的装置。
在某些方面，在所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体系统中，所述环境进一步包括一种能够处理所述至少一种肽或蛋白所述组分的第二种消化酶。
在某些方面，在所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的系统中，所述第一种或第二种消化酶为酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶、唾液酸酶、半胱氨酸蛋白酶、内肽酶、木瓜蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C、胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶B或蛋白酶。
在其他方面，在所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的系统中，所述环境进一步包括一种还原剂或变性剂，其中，所述还原剂或变性剂为尿素、盐酸胍、还原剂、二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、有机溶剂、碱溶液、酸溶液或其组合。
在某些方面，在所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的系统中，所述装置根据一个或多个毛细管中的一个或多个物理参数分离组分，所述物理参数包括(例如)电荷异质性、分子量、电荷或其组合。
在某些方面，所述装置为等电聚焦装置、毛细管等电聚焦电泳仪、成像毛细管等电聚焦电泳仪、色谱耦合毛细管电泳仪、色谱耦合成像毛细管电泳仪、阳离子交换色谱装置或液相色谱-质谱联用仪。
在某些方面，在所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的系统中，所述至少一种肽或蛋白为双特异性抗体。
在某些方面，在所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的系统中，所述至少一种肽或蛋白是一种药物、抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物偶联物、抗体片段或蛋白药物。
结合以下说明和附图可以更好地理解本发明的上述方面和其他方面。以下说明给出了各种实施例及其众多具体详细信息，仅用作示例，而非对本发明进行限制。在本发明范围内可进行许多替换、修改、添加或重排。
附图说明
图1A显示了通过MAB3(Fc/Fc)的单重链和MAB1(Fc*/Fc*)的单重链组合衍生的MAB4(Fc/Fc*)。MAB3具有组氨酸(H)和酪氨酸(Y)残基，MAB1具有精氨酸(R)和苯基丙氨酸(F)残基。
图1B显示了MAB2是靶向ANTIGENC和ANTIGENA的双特异性抗体。在MAB2重链ANTIGENC臂CDR区域的单个残基(ResidueX)处发生MAB2的糖化。
图2显示了经过酶消化的抗体产生抗体片段，例如使用酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)产生F(ab')2和Fc'片段。抗体片段可进一步经受还原和/或变性条件，并使用成象毛细管等电聚焦(icIEF)电泳进行分析。
图3显示了使用阳离子交换色谱法(CEX，图3A)、成像毛细管等电聚焦(icIEF，图3B)或色谱成像毛细管电泳法(chromiCE，图3C)分析MAB4、MAB3和MAB1。
图4A显示了酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)的酶切位点。
图4B显示了酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)酶切效率(通过检测是否存在完整的抗体分子和抗体片段(如F(ab')2和Fc')进行分析)的测试结果，如峰面积百分比下方所示。
图5A和5B显示了用于提高酶切效率的酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化反应的消化条件，包括在37℃下4小时或过夜，检测是否存在完整的抗体分子，在图5A中表示为MAB4DS、在图5B中表示为单体。
图6A和6B显示了MAB4、MAB3和MAB1的估计pI(等电点)。
图7A和7B显示了MAB4、MAB3或MAB1经酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化和icIEF分析后Fc'片段的分析结果。
图8A显示了包含VH结构域的F(ab')2片段的分析结果。使用icIEF对F(ab')2片段进行净化和分离，确定酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化后的实验等电点。使用icIEF确定完整抗体分子的实验等电点，如图8B所示。
图9显示了在还原和/或变性条件下使用DiCE对MAB4、MAB3或MAB1的分析结果，确定Fc'、F(ab')2、ANTIGENB-Fd'、ANTIGENA-Fd'和LC(与完整抗体分子比较)的实验pI。
图10A显示了在还原、变性条件下使用DiCE对MAB4的分析结果。
图10B显示了在自然条件下使用icIEF对MAB4的F(ab')2和Fc'片段的分析结果。
图11A和11B显示了在还原/变性条件下使用DiCE获得的结果。
图12显示了在还原、变性条件下使用DiCE对MAB1、MAB4和MAB3进行三次分析，确定对应峰的pI值。
图13显示了在还原、变性条件下使用DiCE对MAB1、MAB4和MAB3进行三次分析，确定对应峰的面积百分比。
图14显示了使用羧肽酶B(CPB)处理MAB4 Fc'片段时对Fc/Fc*峰的识别情况。
图15显示了使用chromiCE检测MAB2糖化的分析结果。
图16显示了在还原、变性条件下使用DiCE检测MAB2及其亲本单特异性抗体糖化的分析结果。
图17A和17B显示了使用CEX和icIEF分析和富集MAB2糖化种类和非糖化种类的结果。
图18A和18B显示了在还原、变性条件下使用DiCE对糖化富集样本和富集的非糖化样本(与MAB2比较)进行比较的分析结果，图18A显示了峰相对丰度，图18B显示了对应峰数的平均峰面积百分比。
图19显示了使用CEX和icIEF从两个细胞系中获得样本的电荷变异体的分析结果
图20显示了在还原、变性条件下使用DiCE从两个细胞系中获得样本的电荷变异体的分析结果。
图21显示了在还原、变性条件下使用DiCE从两个细胞系中获得样本的电荷变异体的分析结果。
图22显示了使用完整icIEF通过双pH盐梯度阳离子交换色谱法富集的电荷变异体的分析结果。
图23显示了使用DiCE通过双pH盐梯度阳离子交换色谱法富集的电荷变异体的分析结果。
图24是使用DiCE对MAB5富集电荷变异体的分析结果。
图25是使用DiCE对组合Eb的分析结果。
具体实施方式
由于治疗性蛋白存在电荷变异体，人们对药物功效、药物效力和患者安全感到担忧，因为在某些情况下，治疗性蛋白的电荷变化可能会影响结合能力、生物活性和保质期。本申请的方法和系统可提供关于治疗性蛋白电荷异质性的宝贵信息，这对与药物施用(如生物制剂给药)的药代动力学、疗效和安全性相关的临床药理学具有影响。
本公开提供了用于分析肽或蛋白(如抗体)生物物理特性的方法和系统，从而满足上述需求。本申请的方法和系统根据酶消化辅助成像毛细管电泳(DiCE)来表征肽或蛋白的电荷变异体，例如结构域特异性电荷变异体，优选比较双特异性抗体及其亲本单特异性抗体之间的电荷变异体。可通过生物物理参数表征变异体，包括电荷异质性、分子量、电荷或其组合。本申请的方法和系统可用于所有亚类的人免疫球蛋白。本申请的方法或系统中的肽或蛋白可以是药物、抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物偶联物、抗体片段或蛋白药物。
由于存在各种翻译后修饰、酶和化学修饰，如糖基化、去糖基化、酰胺化、脱酰胺化、氧化、糖化、末端环化、C端赖氨酸变异、C端精氨酸变异、N末端焦谷氨酸盐变异、C端甘氨酸酰胺化、C端脯氨酸酰胺化、丁二酰亚胺形成、唾液酸化或去唾液酸化，治疗性蛋白(如单克隆抗体产品)具有异常异质性。此外，蛋白产物的聚集、降解、变性、片段化或异构化也会引起电荷异质性。表1显示了典型化学降解途径及其对改变肽或蛋白电荷的影响。
表1电荷变异体的化学降解途径
Figure BDA0003366751070000061
在生产治疗性肽或蛋白(如单克隆抗体)的过程中，由于蛋白降解和/或存在翻译后修饰(PTM)，可能会引入电荷异质性。要充分了解蛋白特性(如效力)以及与电荷变异体相关的物理和化学变化之间的相关性，需要对生产的药物物质中蛋白的电荷变异体形式进行表征。
特别是在生产单克隆抗体时，抗体不同结构域的PTM可能会引起不同的生物效应，并可能影响药品的稳定性、安全性和效力。因此，结构域特异性修饰的表征和常规监测对于确保治疗性抗体产品的质量非常重要。酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)已用于检查单克隆抗体产品中各个结构域的异质性。酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)可酶切铰链区下方的抗体重链，产生F(ab')2和Fc'片段。可进一步还原这些抗体片段，产生三个抗体结构域，例如LC(轻链)、Fd'和Fc'/2，用于进一步表征，例如通过液相色谱/质谱、毛细管等电聚焦、聚糖图或反相色谱进行分析。(An，Y等人(2014)单克隆抗体分析的新工具。mAbs 6(4)：879-893)。
本申请提供了基于DiCE(包括等电聚焦)的方法和系统，用于检测并量化抗体(包括双特异性抗体)中不同结构域特异性电荷变异体的水平。在某些示例性实施例中，这些方法和系统包括使用酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)产生F(ab')2和Fc'片段的酶消化，然后在还原、变性条件下进行成像毛细管等电聚焦(icIEF)来分离LC、Fd'和Fc'/2。
本发明的优势包括提供一种基于DiCE的高灵敏度方法，用于检测并量化双特异性抗体不同臂的结构域特异性PTM。在某些示例性实施例中，基于DiCE的方法用于检测并量化靶向ANTIGENC和ANTIGENA的双特异性抗体的互补性决定区(CDR)中位点特异性糖化。使用传统完整电荷分析(如icIEF和阳离子交换色谱法(CEX))无法准确量化ANTIGENCxANTIGENA双特异性抗体的ANTIGENC臂CDR中ResidueX位点特异性糖化。本申请的优势包括提供一种基于DiCE的高敏灵敏度方法，用于检测抗体结构域特异性电荷变异体，以评估Fc结构域上未处理C端赖氨酸的水平。
本申请还提供了一种用于PTM定量的基于DiCE的高灵敏度方法或系统，所述方法或系统的结果可与使用肽图获得的结果相媲美。本申请的方法和系统提供了一种在监测特异性PTM方面可与肽图相媲美的正交法，确保治疗性肽和蛋白(如抗体、融合蛋白、抗体-药物偶联物(ADC)和伴随施用的抗体)的产品质量抗体-药物偶联物。
本申请的优势进一步包括一种基于DiCE的方法或系统，以便在独立分析中分析双特异性抗体及其亲本单特异性抗体，可以更全面地了解双特异性抗体分子的结构域特异性电荷异质性。在基于DiCE的方法或系统中使用酶消化，优势在于通过消化完整双特异性抗体来暴露所产生抗体片段内在电荷的差异。所述方法或系统可通过等电聚焦法更完整地分离所产生的抗体片段或结构域。
本申请基于DiCE的方法或系统可应用于双特异性抗体，通过提供一种快速、中等通量的方法来区分与多个双特异性抗体单臂相关的电荷变异体，其所需最小样本量小于0.5mg。本申请还可用于准确量化某些翻译后修饰的水平，例如糖化和未处理的C端赖氨酸。本申请可应用于双特异性抗体以外的其他产品，以更完整地表征其他形态的电荷变异体，如抗体-药物偶联物(ADC)和组合产品。
本申请的方法和系统提供了一种酶消化反应来产生肽或蛋白的组分。这些组分是肽或蛋白的较小片段。随后，可在还原和/或变性条件下根据肽或蛋白组分的电荷分离肽或蛋白的组分，以分析肽或蛋白中独立结构域的电荷异质性。还可根据组分中等电点的差异分离肽或蛋白的组分，因为这些组分属于较小片段，增加了组分间等电点的差异。
在某些示例性实施例中，双特异性抗体或其亲本单特异性抗体经过酶消化反应产生抗体片段，如F(ab')2和Fc'。随后可使用等电聚焦法根据这些抗体片段的电荷对其进行分离。在某些示例性实施例中，这些抗体片段进一步经过还原和/或变性条件，产生特异性结构域，如LC、Fd'和Fc'/2。然后，可根据电荷分离这些抗体结构域，以分析抗体内独立结构域的电荷异质性。因为与完整抗体分子相比，这些结构域具有较小的分子量，所以抗体结构域之间等电点的差异能够实现根据等电点的可测量差异进行分离。这些抗体结构域增加了抗体结构域等电点之间的等电点差异。
在其他示例性实施例中，本申请提供了一种识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法，包括：用一种或多种消化酶处理至少一种肽或蛋白来产生至少一种肽或蛋白的组分；还原所述至少一种肽或蛋白的组分或使所述至少一种肽或蛋白的组分变性；以及分离所述至少一种肽或蛋白的两种或多种组分，其中，采用等电聚焦根据组分的电荷变异体分离所述至少一种肽或蛋白的组分。在某些方面，生成并比较组分的分离曲线，以检测或量化电荷变异体的修饰水平。它们满足了表征并量化治疗性蛋白电荷异质性的长期需求，这对与药物施用的药代动力学、疗效和安全性相关的临床药理学具有影响。
考虑到现有方法的局限性，使用基于DiCE的方法开发了一种用于识别、检测或量化治疗性肽或蛋白电荷异质性的灵敏有效方法。
术语“一个(a)”是指“至少一个”；术语“大约(about)”和“大约(approximately)”是指允许本领域普通技术人员理解的标准偏差；只要提供了范围，即包含端点。
在本文中，术语“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”是非限制性的，并分别理解为“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”。
在某些示例性实施例中，本公开提供了一种识别至少一种肽或蛋白的变异体的方法，包括：用一种或多种消化酶处理至少一种肽或蛋白来产生至少一种肽或蛋白的组分；还原所述至少一种肽或蛋白的组分或使所述至少一种肽或蛋白的组分变性；以及根据组分的等电点分离所述至少一种肽或蛋白的两种或多种组分。在某些示例性实施例中，在识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法中，所述至少一种肽或蛋白是一种药物、抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物偶联物、抗体片段或蛋白药物。
在本文中，术语“肽”或“蛋白”包括任何共价连接的酰胺键的氨基酸聚合物。蛋白包含一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域通常称为“肽(peptide)”或“多肽(polypeptides)”。蛋白可包含一个或多个多肽，从而形成单一功能的生物分子。在某些方面，蛋白可以是抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、宿主细胞蛋白或其组合。
在本文中，“蛋白药物”包括完全或部分具有生物性质的活性成分。在某些示例性实施例中，蛋白药物可包括肽、蛋白、融合蛋白、抗体、抗原、疫苗、肽-药物偶联物、抗体-药物偶联物、蛋白-药物偶联物、细胞、组织或其组合。在其他示例性实施例中，蛋白药物可包括含肽、蛋白、融合蛋白、抗体、抗原、疫苗、肽-药物偶联物、抗体-药物偶联物、蛋白-药物偶联物、细胞、组织或其组合的重组、改造、修饰、突变或截短版本。
在本文中，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如，抗原-结合区或抗体可变区。抗体片段的示例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fc片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双特异性抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段和独立互补性决定区(CDR)，以及三特异性抗体、四特异性抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链可变区的组合，scFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接基团连接。可通过不同方法生产抗体片段。例如，可通过完整抗体的片段化通过酶促或化学方式生产抗体片段，和/或可由编码部分抗体序列的基因重组生产抗体片段。另外，可完全或部分合成生产抗体片段。抗体片段可选择性包含单链抗体片段。另外，抗体片段可包含多个例如通过二硫键连接在一起的链。抗体片段可选择性包含多分子配合物。
在本文中，术语“抗体-药物偶联物”或“ADC”是指通过具有不稳定键的连接基团连接至生物活性药物的抗体。ADC可包含多个生物活性药物分子(或有效载荷)，这些分子可以共价连接到抗体氨基酸残基的侧链上(Siler Panowski等人，用于癌症治疗的位点特异性抗体药物偶联物，6mAbs 34–45(2013))。用于ADC的抗体能够以足够的亲和力结合，在靶位点选择性积累并持久保留。大多数ADC的Kd值都在纳米摩尔范围内。有效载荷的效力可以在纳米摩尔/皮摩尔范围内，并且可在ADC分布到靶组织后达到可实现的细胞内浓度。最后，在有效载荷和抗体之间形成连接的连接基团能够在循环中充分稳定，以利用抗体部分的药代动力学特性(如长半衰期)，并允许有效载荷在分布到组织上时附着在抗体上，并且在ADC被吸收到靶细胞后，允许有效释放生物活性药物。连接基团可包括在细胞处理中不可酶切的连接基团以及ADC到达靶位点后就可以酶切的连接基团。对于不可酶切的连接基团，在细胞内释放的生物活性药物包括有效载荷和仍然附着在抗体氨基酸残基上的连接基团的所有构件(一般为赖氨酸或半胱氨酸残基)，随后ADC在溶酶体内经过完全蛋白降解。可酶切连接基团是指在有效载荷和抗体上胺基酸连接位点之间存在酶切位点的连接基团。酶切机制可包括酸性细胞内区室中酸不稳定键的水解、通过细胞内蛋白酶或酯酶对酰胺键或酯键进行酶切、通过还原环境内的细胞对二硫键进行还原酶切。
在本文中，“抗体”是指由四条多肽链、两条重链(H)和两条轻链(L)组成的免疫球蛋白分子。每个重链具有一个重链可变区(HCVR或VH)和一个重链恒定区。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每个轻链具有一个轻链可变区和一个轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH和VL区域可进一步细分为称为互补性决定区(CDR)的高可变性区，以及散布在更保守区域的框架区(FR)。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端的排列顺序如下；FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括任何同型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包括但不限于通过重组方法制备、表达、创造或分离的抗体，如从转染后表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。IgG包含抗体亚群。
示例性实施例
本文公开的实施例提供使用基于DiCE方法识别、检测或量化治疗性肽或蛋白的电荷异质性的组合物、方法和系统。
在某些示例性实施例中，本公开提供了一种识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法，包括：用一种或多种消化酶处理至少一种肽或蛋白来产生至少一种肽或蛋白的组分；还原所述至少一种肽或蛋白的组分或使所述至少一种肽或蛋白的组分变性；以及根据电荷变异体的电荷异质性分离所述至少一种肽或蛋白的两种或多种组分。在某些方面，所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法可用于量化肽或蛋白的修饰水平。
在某些示例性实施例中，肽或蛋白的修饰包括翻译后修饰、酶促、化学修饰、聚集、降解、变性、片段化或异构化。在某些方面，肽或蛋白的修饰包括糖基化、去糖基化、酰胺化、脱酰胺化、氧化、糖化、末端环化、C端赖氨酸变异、C端精氨酸变异、N末端焦谷氨酸盐变异、C端甘氨酸酰胺化、C端脯氨酸酰胺化、丁二酰亚胺形成、唾液酸化、去唾液酸化，加合物形成、二硫化物介导修饰、α-唾液酸化(末端半乳糖)或C端赖氨酸和甘氨酸酰胺化。在某些方面，肽或蛋白的修饰包括甲硫氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸或色氨酸的氧化。
在某些方面，在所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法中，所述消化酶为酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶、唾液酸酶、半胱氨酸蛋白酶、内肽酶、木瓜蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C、胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白酶或其组合。在某些方面，在1X DPBS(总蛋白约0.5mg)中制备约100μl浓度约5mg/mL的抗体样本，使用酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)进行酶消化。
在某些示例性实施例中，使用以下方法根据电荷变异体的电荷异质性分离肽或蛋白组分：等电聚焦电泳法、毛细管等电聚焦电泳法、成像毛细管等电聚焦电泳法、色谱耦合毛细管电泳法、色谱耦合成像毛细管电泳法、阳离子交换色谱法或液相色谱-质谱法。
在某些示例性实施例中，在所述识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的方法中，所述还原或变性条件包括使用尿素、盐酸胍、二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、有机溶剂、碱溶液、酸溶液或其组合。在某些方面，使用约1-10M盐酸胍、约3-8M盐酸胍或优选约6M盐酸胍，加上约1-50mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、约5-15mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)或优选约10mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)，在室温下培养约0.1-2小时、约0.5-1.5小时或优选约1小时，还原肽或蛋白的组分或使肽或蛋白的组分变性。
随后进行缓冲液更换，去除带电的缓冲液组分，优选使用包含约35mM磷酸盐、pH值约6.0的约8M尿素和约1mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)的缓冲液。在优选包含约21mM磷酸盐、pH值约6.0的约8M尿素、约0.6mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、约0.35％(w/v)甲基纤维素、约4％(v/v)pH 3-10的两性电解质的组合物条件下，对肽或蛋白组分进行icIEF。
应理解，所述方法或系统不限于上述肽、蛋白、抗体、蛋白药物、消化酶、还原/变性条件、等电聚焦电泳、成像毛细管等电聚焦电泳、色谱耦合毛细管电泳、色谱耦合成像毛细管电泳法、阳离子交换色谱法或液相色谱-质谱法。
本发明所述的方法步骤的连续标记与数字和/或字母并不意味着将所述方法或任何实施例限制为特定显示顺序。
本说明书引用了各种出版物，包括专利、专利申请、已发表的专利申请、登录号、技术文献和学术文献。这些参考文献通过引用成为本发明的一部分。
参考以下示例可更充分地了解本公开，提供这些示例是为了更详细地描述本公开。这些示例旨在说明，不应视为限制本公开的范围。
示例
材料和试剂制备
1.1.单特异性和双特异性抗体。
对数个治疗性抗体(包括双特异性抗体及其亲本单特异性抗体)进行生物物理表征双特异性抗体。双特异性抗体的形式包括将两个不同的重链(HC)与两个常见的轻链(LC)配对，从而实现针对两个不同抗原的两个独特抗原结合位点。例如，MAB4是靶向ANTIGENB和ANTIGENA的双特异性抗体。MAB4重链中的ANTIGENA臂有两个氨基酸取代。MAB4一个重链的Fc区中两个氨基酸的取代会破坏蛋白A结合，例如用RF取代HY，称为星形取代或Fc*。这种星形取代导致未取代和取代重链之间理论等电点存在差异，这可能有助于基于经验(如观察或实验)等电点的抗体纯化或分离。
MAB3是靶向ANTIGENB的单特异性抗体，该抗体在重链中没有星形取代，如Fc/Fc。MAB1是靶向ANTIGENA的单特异性抗体，该抗体在两个重链中均具有星形取代，如Fc*/Fc*。MAB4是靶向ANTIGENB和ANTIGENA的双特异性抗体。MAB4(Fc/Fc*)由MAB3(Fc/Fc)的单重链和MAB1(Fc*/Fc*)的单重链组合而成，如图1A所示。比较MAB3和MAB1间的氨基酸序列，它们在重链Fc区存在差异，如图1A所示。在图1A所示的对应位置，MAB3具有组氨酸(H)和酪氨酸(Y)残基，MAB1具有精氨酸(R)和苯基丙氨酸(F)残基。
MAB2具有约40％的糖化，并且是靶向ANTIGENC和ANTIGENA的双特异性抗体。在MAB2重链ANTIGENC臂CDR区域的单个残基ResidueX处发生MAB2的糖化，如图1B所示。ResidueX的糖化影响药物活性和效力。MAB2重链的ANTIGENA臂来源于G亲本种系，在Fc区有星形取代。
2.1抗体的酶消化
抗体经过酶消化产生抗体片段，例如使用酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)产生F(ab')2和Fc'片段，如图2所示。F(ab')2和Fc'片段可以进一步经过还原和/或变性条件，产生抗体结构域，如LC、Fd'和Fc'/2。例如，MAB4(ANTIGENBxANTIGENA，Fc/Fc*)经过酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化会产生MAB4的F(ab')2和Fc'片段。MAB4的F(ab')2片段经过还原和/或变性条件会产生两个Fd'(如ANTIGENB-Fd'和ANTIGENA-Fd')和两个轻链(LC)。MAB4的Fc'片段经过还原和/或变性条件会产生两个抗体结构域，如Fc'的ANTIGENB臂和Fc'的ANTIGENA臂(具有星形取代)。
等电聚焦仪器。
1.1.消化辅助成像毛细管电泳(DiCE)的工作流程
所述使用DiCS识别肽或蛋白电荷的方法包括用酶消化反应处理肽或蛋白来产生肽或蛋白组分，并根据组分的电荷或等电点分离肽或蛋白组分。图2显示了使用icIEF电泳分离双特异性抗体的一般DiCE工作流程的实施例，其中双特异性抗体使用酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)进行片段化。
在某些示例性实施例中，在1X DPBS(总蛋白约0.5mg)中制备约100μl浓度约5mg/mL的抗体样本，使用酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)进行酶消化。然后使用约6M盐酸胍和约10mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)在室温下培养约1小时使样本还原并变性。使用包含约35mM磷酸盐、pH值约6.0的约8M尿素和约1mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)的缓冲液更换缓冲液，去除带电的缓冲液组分。在包含约21mM磷酸盐、pH值为6.0的约8M尿素、约0.6mM三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、约0.35％(w/v)甲基纤维素、约4％(v/v)pH 3-10的两性电解质的组分条件下，对样本进行icIEF。未消化材料估计小于2％，不会影响使用DiCE的峰定量。
示例1.使用CEX、icIEF和chromiCE分析抗体的电荷异质性
使用CEX、icIEF或色谱成像毛细管电泳(chromiCE)分析抗体的电荷异质性。分析使用治疗性抗体(如MAB4、MAB3和MAB1)，如图3所示。
CEX用于分析完整抗体分子的表面电荷，并提供中低分辨率，如图3A所示。icIEF用于分析完整抗体分子的整体固有电荷，并提供高分辨率和基于完整分子等电点的基线分离，如图3B所示。chromiCE用于分析抗体单重链(HC)和轻链(LC)的固有电荷，其中在还原和/或变性条件下分析抗体。在还原和/或变性条件下使用排阻色谱(SEC)法分离HC和LC，例如在约6M盐酸胍和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)的条件下培养1小时，然后进行icIEF分析。当HC和LC的等电点之间存在明显重叠时，HC和LC无法完全分离，从而导致HC和LC峰重叠，如图3C所示。CEX、icIEF和chromiCE的分析结果(如传统基于电荷的试验)无法区分双特异性抗体中两个独特重链之间的电荷差异。
当在还原和/或变性条件下使用完整icIEF进行分析时，可检测并分辨代表各个HC的不同峰。但是，因为信号卷积成单个HC信号，所以无法区分F(ab')2和Fc'片段之间的电荷差异。这些电荷变异体包括由于VH结构域或恒定区的序列差异(如星形取代)导致的翻译后修饰相关的电荷差异。
示例2.抗体酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化
酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)用于在37℃左右进行至少2小时的酶消化反应。该条件下的酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化可有效酶切免疫球蛋白(IgG)分子来产生抗体片段，如F(ab')2和Fc'，如图4A所示。数个治疗性抗体(MAB9、MAB10、MAB5、MAB4、MAB1和MAB3)用于酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化，然后进行icIEF分析。通过检测是否存在完整抗体分子和抗体片段(如F(ab')2和Fc')分析酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)的消化效率，如图4B所示，并记录消化时间，监测是否存在高分子量(HMW)分子。与AG下铰链序列相比，GG下铰链序列具有更好的酶切效率。
测试酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化反应的不同消化条件，提高酶切效率，例如在37℃条件下约4小时或过夜。通过检测是否存在完整抗体分子(如图5B所示)和抗体片段(如F(ab')2和Fc')来分析酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化效率，如图5中的保留时间峰面积百分比所示，包括检测是否存在高分子量(HMW)分子。未消化MAB4抗体用作对照(表示为图5A中的MAB4 DS)。测试结果表明，酶切效率与分子有关。
示例3.F(ab')2和Fc'片段中的估计等电点
MAB4(Fc/Fc*)是靶向ANTIGENB和ANTIGENA的双特异性抗体，由MAB3(ANTIGENB，Fc/Fc)的单重链和MAB1(ANTIGENA，Fc*/Fc*)的单重链组合而成双特异性抗体，如图1A所示。Fc区的MAB3和MAB1重链存在差异。由于氨基酸序列的差异，例如从HY到RF的氨基酸取代，ANTIGENA重链在Fc区有星形取代。MAB4的估计pI(等电点)表明，ANTIGENB臂比双特异性抗体酸性更强，而ANTIGENA臂碱性更强，如图6A和6B所示。
示例4.F(ab')2和Fc'片段的分析
MAB4、MAB3或MAB1经过酶消化，包括用酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)处理抗体来产生抗体片段，如F(ab')2和Fc'片段。然后，根据其电荷或等电点分离抗体片段。对于DiCE工作流程，使用0.3mg左右的蛋白浓度。在等电聚焦条件下，pH 3-10的两性电解质与pH 8-10.5的两性电解质的比例约为3:1。如图7A和7B所示，根据测试结果，与MAB4和MAB3相比，MAB1的Fc'片段碱性更强。MAB3的Fc'片段酸性更强。结果表明，由于存在两个星形取代，MAB1的Fc'片段碱性更强，这与pI估计一致。结果还表明，由于MAB4中存在一个星形取代，所以与MAB3相比，MAB4的Fc'片段碱性更强。综上所述，结果表明，存在一个或两个星形取代有助于测量等电点的变化，以检测双特异性抗体的结构域特异性电荷变异体。经实验验证，具有星形取代的Fc'片段比天然Fc'片段在总体电荷方面碱性更强，这与pI预测一致。
酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化后，使用icIEF纯化和分离包含VH结构域的F(ab')2片段，以确定实验等电点，如图8A所示。使用icIEF确定完整抗体分子的实验等电点，如图8B所示。结果表明，MAB3、MAB4和MAB1的F(ab')2片段之间的实验等电点差异与对应的完整抗体分子之间的差异具有很好的相关性。然而，在酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化后取去除Fc'片段时，使用icIEF的F(ab')2片段分离没有提供充分的分化来区分两个重链(如有/无星形取代)之间的电荷差异。
示例5.在还原和/或变性条件下分析抗体片段
使用酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)在37℃条件下过夜(约16小时)消化MAB3、MAB4或MAB1来产生抗体片段，如F(ab')2和Fc'。然后使用约6M盐酸胍和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)处理抗体片段1小时，获得四个或五个抗体结构域，例如ANTIGENB-Fd'、ANTIGENA-Fd'、LC(轻链)、Fc'的ANTIGENB臂和/或Fc'的ANTIGENA臂。使用icIEF分析这些抗体片段和结构域，确定其实验等电点，如图9所示。
当使用酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化MAB4并在还原和/或变性条件下使用icIEF分析时，结果显示5个不同峰(等电点可区分)分别与Fc'、LC和两个Fd相对应，如图10A所示。图10B显示了使用酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化MAB4以及不使用还原和/或变性条件通过icIEF分析MAB4时，F(ab')2和Fc'片段的分析结果。对比图10A和10B的结果，还原和/或变性条件强调了等电点的差异，用于识别抗体的结构域特异性电荷变异体。特别是可观察到与LC和两个不同Fd'相对应的三个分离良好的峰，如图10A所示。
当使用酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化MAB3或MAB1并在还原和/或变性条件下使用icIEF分析时，结果显示每个抗体的3个不同峰(等电点可区分)分别与Fc'、LC和Fd'相对应，如图11A所示。在比较MAB3、MAB4和MAB1结果的峰时，可将MAB4结果中的三个峰识别为从酸性到碱性pI的常见LC、ANTIGENB-Fd'和ANTIGENA-Fd'。同时对亲本单特异性单克隆抗体和纯化的Fc'和F(ab')2片段进行DiCE，可以确认峰的同一性。Fd'片段的实验pI值与MAB4及其亲本单特异性抗体的预期pI值具有良好的相关性。我们观察到Fd'片段之间的信号存在一些重叠。一些LC信号与酸性Fd'的信号重叠。总体来说，我们观察到每个片段(或结构域)有三个主要峰出现近基线分离。
结果表明，在还原/变性条件下，使用DiCE获得的Fd'的pH差异约为0.3-0.4个pH单位，这与使用chromiCE获得的测试结果相似。使用chromiCE获得的HC之间的pI范围约为pH6.8-7.6，相差约0.8个pH单位。用DiCE获得的Fd'片段之间的pI范围约为pH 7.5-8.0，相差约0.5个pH单位。
如图11A和11B所示，在还原/变性条件下使用DiCE获得的结果与chromiCE互补。然而，在还原/变性条件下使用DiCE分析抗体后，结果能够表明双特异性抗体的两个重链之间存在pI差异，特别是Fc'和Fd'之间存在pI差异。
为了验证在还原/变性条件下使用DiCE的测试结果的重现性，对MAB1、MAB4和MAB3进行三次重复进样实验，如图12和13所示。对应峰的pI值具有高度重现性，如图12所示。对应峰的峰面积百分比具有高度重现性，如图13所示。
为了进一步识别Fc/Fc*峰，使用羧肽酶B(CPB)处理纯化的MAB4 Fc'片段，专门酶切C端赖氨酸。峰5和6的还原丰度表明这些峰包含未处理C端赖氨酸，如图14所示。
示例6.在双特异性抗体中识别糖化
MAB2是靶向ANTIGENC和ANTIGENA的双特异性抗体。在MAB2重链ANTIGENC臂CDR区域的单个残基ResidueX处发生MAB2的糖化。使用完整抗体分子的icIEF分析无法检测MAB2的糖化。尽管使用CEX能够检测MAB2的糖化，但由于糖化种类的对应峰与相邻峰之间的分辨率较差，使用CEX获得的测试结果无法量化糖化水平。在chromiCE中重链ANTIGENC臂的糖化略微可见，并与重链的峰重叠(在ANTIGENC重链的肩部)，如图15所示。由于分辨率较差，使用chromiCE无法准确量化MAB2的糖化水平。
MAB2及其亲本单特异性抗体(如ANTIGENC和ANTIGENA单克隆抗体)经过酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化，并在还原/变性条件下使用DiCE分析。三个抗体的测试结果并排比较进行峰识别，如图16所示。峰1-6识别为与Fc结构域相对应。峰8存在于所有样本中，并识别为与LC相对应。峰11识别为代表主要抗ANTIGENA Fd'片段。峰9-10可以代表抗ANTIGENA Fd'的酸性形式。抗ANTIGENC Fd'片段显示为高分辨率的分裂峰，如峰15和16，这两个峰可代表ANTIGENC的糖化和非糖化形式。峰12-14可代表抗ANTIGENC Fd'片段的酸性形式。
为了确认与ANTIGENC相对应的峰15和16的同一性，使用CEX将糖化种类和非糖化种类富集至同质性。富集的糖化种类和非糖化种类在CEX中具有明显且可区分的曲线，如图17A所示。然而，在使用icIEF分析时，峰曲线不可区分，如图17B所示。
富集的糖化种类和非糖化种类经过酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化，并在还原/变性条件下使用DiCE分析。如图18A所示，与峰16相比，峰15(*)的相对丰度在糖化富集样本中较高，在富集的非糖化样本中较低。图18B显示了对应峰数的平均峰面积百分比。
与表2所示的峰15和16相比，富集了峰16的非糖化样本。然而，富集了峰15的糖化富集样本。峰15(*)的相对丰度在糖化富集样本中较高，而峰16的相对丰度在非糖化样本中增加。根据对两个主要ANTIGENC Fd'峰的观察，通过峰15与峰15和16之和的相对比可估计糖化水平的量化。
表2.使用DiCE分析的ANTIGENC Fd'峰的相对丰度。
峰15 峰16
对照MAB2-L26 4.1(0.2) 6.8(0.3)
非糖化样本 0.6(0.1) 11.9(0.1)
糖化富集样本 10.2(0.1) 2.1(0.1)
使用肽图进一步验证MAB2样本中糖化水平的量化，如表3所示。表3显示了使用CEX、肽图和DiCE的比较情况。结果表明，使用DiCE的量化与肽图相当。
表3.MAB2样本中糖化水平的量化
Figure BDA0003366751070000171
示例7.监测电荷变异体的细胞系开发
通过监测所产生抗体的电荷变异体，开发了用于生产抗体的细胞系。使用基于电荷的试验(作为可能由新细胞系引起的各种翻译后修饰(PTM)的替代)监测细胞系的开发情况翻译后修饰。使用CEX和icIEF针对C1临床比较样本分析两个细胞系(如A28-L21和A30-L91)，评估其可比性。在电荷碱性变异体的总丰度方面观察到CEX和icIEF之间存在差异，如图19所示，与对照样本和A30-L91相比，在A28-L21中观察到糖化略微增加。两个C2细胞系均表现出C端赖氨酸主要在Fc*上增加。当DiCE用于MAB2C2细胞选择时，样本显示Fc C端赖氨酸轻度增加(峰5)，但Fc*C端赖氨酸明显增加(峰6)，如图20和21所示。DiCE分析表明，在icIEF中观察到的碱性种类增加是由于Fc结构域上未处理的C端赖氨酸，而Fc*结构域不易受到剪切影响。此外，A28-L21克隆的糖化水平略高于一般在MAB2中观察到的水平。DiCE可用于快速评估ANTIGENC的糖化水平，支持MAB2的细胞系和过程开发。
示例8.监测翻译后修饰(PTM)
通过双pH盐梯度阳离子交换色谱法富集的电荷变异体的完整icIEF和DiCE曲线证明了两种方法之间的正交性。虽然与Fc/Fc*、LC和ANTIGENA-Fd'片段相对应的峰在所有样本中保持相对恒定，但ANTIGENC Fd'峰(12-16)在酸性组分中的分布表现出显著变化，如图22和23所示。MAB2富集电荷变异体的DiCE分析表明，与ANTIGENA臂相比，ANTIGENC臂可能更易受到PTM的影响。
示例9.使用DiCE分析MAB5富集电荷变异体
DiCE用于分析MAB5的富集电荷变异体，如图24所示。峰6、8和11代表主要带电种类。峰6与Fc相对应。峰8与LC相对应。峰11与主要Fd相对应。峰5、7的酸性3特别富集。峰10在富集碱性2中丰度最高，可能与带有未处理C端赖氨酸的MAB5Fc片段相对应。
示例10.使用DiCE分析组合Eb
如图25所示，峰1-2与MAB6 LC相对应。峰3-5与Fc/2相对应，并存在于所有样本中。峰6代表MAB7和MAB8的LC。它们的序列几乎完全相同。峰7-8与MAB6 Fd片段相对应。峰9与MAB7 Fd片段相对应。峰10-11与MAB8 Fd片段相对应。

Claims (21)

1.一种识别至少一种肽或蛋白的一种或多种变异体的方法，包括：
用一种或多种消化酶处理所述至少一种肽或蛋白，产生所述至少一种肽或蛋白的两种或多种组分；
还原所述组分或使所述组分变性；
分离所述至少一种肽或蛋白的所述两种或多种组分，其中，生成一条分离曲线；以及
识别所述变异体，其中，可选择根据所述分离曲线进行识别。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，根据生物物理参数分离所述组分。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述消化酶为酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶、唾液酸酶、半胱氨酸蛋白酶、内肽酶、木瓜蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C、胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶B、蛋白酶、唾液酸酶、外切糖苷酶或其组合。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在多相中用一种或多种消化酶处理所述一种或多种组分来产生其他组分。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述还原或变性条件包括使用尿素、盐酸胍、二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、有机溶剂、碱溶液、酸溶液或其组合。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，根据所述组分的电荷变异体分离所述至少一种肽或蛋白的所述组分。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，使用以下方法分离所述至少一种肽或蛋白的所述组分：等电聚焦电泳法、毛细管等电聚焦电泳法、成像毛细管等电聚焦电泳法、色谱耦合毛细管电泳法、毛细管电泳法、色谱耦合成像毛细管电泳法、阳离子交换色谱法或液相色谱-质谱法。
8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括量化或识别所述至少一种肽或蛋白的所述分离组分。
9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括比较根据具有不同电荷变异体的至少一种肽或蛋白的分离曲线来识别所述至少一种肽或蛋白的组分。
10.根据权利要求9所述的方法，进一步包括量化所述变异体的水平。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述至少一种肽或蛋白的所述变异体包括翻译后修饰的变异体。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述变异体来自所述组分的糖化或C端赖氨酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种肽或蛋白是一种药物、抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物偶联物、抗体片段或蛋白药物。
14.一种识别至少一种肽或蛋白的电荷变异体的系统，包括：
至少一种肽或蛋白；
一种能够产生所述至少一种肽或蛋白组分的第一种消化酶；
一种能够还原所述至少一种肽或蛋白所述组分或使所述至少一种肽或蛋白所述组分变性的环境；以及
一个能够分离所述至少一种肽或蛋白已还原或变性的所述组分的装置。
15.根据权利要求14所述的系统，其中，所述环境进一步包括一种能够处理所述至少一种肽或蛋白所述组分的第二种消化酶。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述第一种或第二种消化酶为酿脓链球菌免疫球蛋白G降解酶、唾液酸酶、半胱氨酸蛋白酶、内肽酶、木瓜蛋白酶、胞内蛋白酶赖氨酸-C、胃蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶B或蛋白酶。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述环境进一步包括一种还原剂或变性剂，其中，所述还原剂或变性剂为尿素、盐酸胍、还原剂、二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、有机溶剂、碱溶液、酸溶液或其组合。
18.根据权利要求14所述的系统，其中，所述装置根据电荷异质性进行分离。
19.根据权利要求14所述的系统，其中，所述装置为等电聚焦装置、毛细管等电聚焦电泳仪、成像毛细管等电聚焦电泳仪、色谱耦合毛细管电泳仪、色谱耦合成像毛细管电泳仪、阳离子交换色谱装置或液相色谱-质谱联用仪。
20.根据权利要求14所述的系统，其中，所述至少一种肽或蛋白为双特异性抗体。
21.根据权利要求14所述的系统，其中，所述至少一种肽或蛋白是一种药物、抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物偶联物、抗体片段或蛋白药物。
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