CN116615434A - 用于生物材料纯化的过滤单元和方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了一种从水性生物组合物中纯化目标分子的方法，该方法包括：(a)使阳离子聚合物和该水性生物组合物接触以形成混合物，该混合物在液体中包含生物聚合物复合物和目标非结合分子，其中该生物聚合物复合物具有至少50微米的平均粒径；(b)提供过滤单元，该过滤单元包括：(i)具有入口和出口的壳体，(ii)与该入口和该出口流体连接的多孔连续过滤介质，以及(iii)相对于该多孔连续过滤介质位于上游的收集区；(c)将该混合物添加到该入口；以及(d)允许该混合物在该过滤单元中分离，由此该生物聚合物复合物在该收集区中收集并且所述目标非结合分子穿过所述过滤介质，并且其中通过所述多孔连续过滤介质的所述液体的大部分流基本上不与重力方向平行。
Description
技术领域
公开了一种将所需的生物分子(诸如抗体、蛋白质、酶等)从水性生物组合物(诸如来自细胞培养或发酵过程的收集物)中分离的过滤单元和方法。
背景技术
大规模或商业量的治疗有用的目标生物材料(如蛋白质)的制造可以通过生长细胞来完成，该细胞经工程化改造以在生物反应器中的受控条件下产生所需蛋白质。所用的技术涉及例如已经通过重组DNA技术改变的微生物发酵，或者培养已经通过杂交瘤技术改变的哺乳动物细胞。细胞悬浮在发酵液中，其中包含盐、糖、蛋白、和维持特定细胞生长所需的各种因子。期望的产物可由细胞分泌到发酵液中，或者保留在细胞体内。收获的发酵液随后进行加工以回收、纯化、并浓缩期望的产物。
发明内容
通常，细胞培养物和/或发酵产物的收获后处理涉及初级回收步骤，该步骤去除较大的颗粒固体、细胞和细胞碎片(通常通过连续离心或深度过滤)；以及次级回收步骤，该步骤去除较小的亚微米颗粒(通常是由深度过滤器和随后的膜过滤器构成的两级过滤组)。在此回收之后，然后将包含目标分子的滤液暴露于广泛的下游处理，包括柱色谱法(如蛋白A或阳离子交换)，以产生大量纯化的目标分子。
在生物材料制造方面的进步已经产生具有例如更高抗体滴度的细胞培养物，这提高了细胞培养物密度并延长了培养时间。这体现为更高含量的过程相关杂质，诸如宿主细胞蛋白和DNA、脂质、胶体和细胞碎片。这些更高的杂质含量给目标分子的回收、纯化、和/或浓缩带来挑战。例如，较高的PCV(红细胞压积)浓度会超过堆叠盘离心的容量，并且如果亚微米细胞碎片未被充分去除，则会导致下游过程如深度过滤器和/或膜过滤器的结垢。
因此，本领域需要与目标生物材料(如蛋白质、酶和抗体)的回收、分离和/或纯化有关的改进方法，该方法涉及的程序耗时较少、允许更有效地回收所需产物和/或可以在较低压降下操作。
在一个方面，公开了一种从包含结合物质的水性生物组合物中纯化非结合目标分子的方法，该方法包括：
(a)使阳离子聚合物和水性生物组合物接触以形成混合物，混合物在液体中包含生物聚合物复合物和目标非结合分子，其中生物聚合物复合物具有至少50微米的平均粒径；
(b)提供过滤单元，该过滤单元包括：(i)具有入口和出口的壳体，(ii)与入口和出口流体连接的多孔连续过滤介质，以及(iii)相对于多孔连续过滤介质位于上游的收集区；
(c)将混合物添加到入口；以及
(d)允许混合物在过滤单元中分离，其中通过多孔连续基底的液体的大部分流基本上不平行于重力方向，并且生物聚合物复合物在收集区中收集，并且目标非结合分子穿过出口。
另一方面，公开了一种套件，其中套件包括：阳离子聚合物；以及过滤单元，该过滤单元包括多孔连续过滤介质。
另一方面，公开了一种过滤单元。过滤单元包括壳体，该壳体具有入口、出口和多孔连续过滤介质，该多孔连续过滤介质流体连接入口和出口，其中过滤单元包括收集区，该收集区定位在入口与多孔连续过滤介质之间，其中收集区为每1m2多孔连续过滤介质正面面积至少40L。
以上发明内容并非旨在描述每个实施方案。在下面的具体实施方式中还列出了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据本说明书和权利要求书，其他特征、目标和优点将显而易见。
附图说明
图1为示例性过滤单元的剖视图。
图2为示例性过滤单元的剖视图。
图3为示例性过滤单元的剖视图。
应当理解，本领域的技术人员可设计出落入本公开原理的范围和实质内的许多其他修改形式和实施方案。附图未按比例绘制。
具体实施方式
如本文所用，术语
“烷基”是指具有一个至约十二个碳原子(C1-C12)的直链或支链、环状或无环的饱和单价烃基，例如甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、戊基等。
“烷亚基”是指具有一个至约十二个碳原子(即C1-C12)的直链饱和二价烃基或具有三个至约十二个碳原子(即C3-C12)的支链饱和二价烃基，例如甲亚基、乙亚基、丙亚基、2-甲基丙亚基、戊亚基、己亚基等。
“烯基”是指具有两个至约十二个碳原子(即C2-C12)的直链不饱和单价烃基或具有三个至约十二个碳原子(即C3-C12)的支链不饱和烃基。
“芳基”是指一价芳族，诸如苯基、萘基等。
“胍基”是指选自胍和双胍中的至少一者的官能团。
(杂)烷基包括烷基和杂烷基，后者包含一个或多个链内杂原子，如氧原子或氮原子。它们可以是具有一个至约十二个碳原子的直链或支链、环状或无环的饱和单价部分。
(杂)烷亚基包括二价烷亚基和杂烷亚基，后者包含一个或多个链内杂原子，如氧原子或氮原子。
(杂)芳基包括芳基和杂芳基，后者包含一个或多个链内杂原子，如氧原子或氮原子。
(杂)芳亚基包括二价芳族芳亚基和杂芳亚基，后者包含一个或多个链内杂原子，如氧原子或氮原子。
“一个”，“一种”和“所述”可交换使用并指一个或多个。
“和/或”用于表示一种或两种所述的情况可以发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
如本文所用，由端点描述的范围包括该范围内所包含的所有数字(例如，1至10包括1.4、1.9、2.33、5.75、9.98等)。
如本文所用，表述“至少一个”包括一个及以上的所有数目(例如，至少2个、至少4个、至少6个、至少8个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个等)。
如本文所用，“包含A、B、和C中的至少一者”是指只包含元素A、只包含元素B、只包含元素C、包含A和B、包含A和C、包含B和C、以及包含所有这三者的组合。
术语“水性生物组合物”是指包含所有生物来源的所需大分子以及不期望的大分子的任何水性组合物。组合物不必完全是生物来源的。在一个实施方案中，水性生物组合物是发酵或细胞培养过程的收获流体。
所需的生物来源大分子是待分离和/或纯化的目标分子。此类目标分子包括(例如)蛋白质，如酶、抗体或其它所需蛋白质。通常，目标分子(也称为非结合目标分子)在所需流体(如水性生物组合物或水性缓冲溶液)的pH下是阳离子性的。在一个实施方案中，本公开的方法可用于将阳离子蛋白，更优选地为单克隆抗体与收获流体的不期望组分分离。
水性生物组合物还包含各种近中性或带负电荷的生物来源大分子，如全细胞和不溶性细胞碎片，以及可溶性杂质，包括蛋白质杂质，如宿主细胞蛋白、DNA和染色质，它们需要与目标分子分离。这些物质有时由于其与阳离子基团结合的倾向而被称为结合物质。
细胞碎片通常是指裂解(破裂)细胞的组分，包括细胞壁脂质、细胞器(例如线粒体、溶酶体、囊泡等)和蛋白质性聚集体。通常细胞碎片较大，主要是带负电荷的材料，能够堵塞过滤器。浊度是用于测量流体中细胞碎片浓度的一种方式，其中浊度值越高，存在的细胞碎片越多。例如，在一个实施方案中，水性生物组合物的浊度为至少100、200、500或甚至1000NTU(比浊法浊度单位)且至多6000、5000、4000、3000或甚至2000NTU。在一些实施方案中，水性生物组合物中的固体含量太大而导致无法测量浊度。
通常带负电荷的细胞和细胞碎片包括源自古细菌、细菌和真核生物的那些。细菌包括但不限于革兰氏阴性菌，如假单胞菌(Pseudomonas)种、大肠杆菌(Escherichiacoli)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcesens)；革兰氏阳性菌，如葡萄球菌(Staphylococcus)种、肠球菌(Enterococcus)种、梭菌(Clostridium)种、芽孢杆菌(Bacillus)种和乳酸杆菌(Lactobacillus)种；通常不用革兰氏方法染色的细菌，如分枝杆菌(Mycobacterium)种和细菌的非营养形式如孢子。真核生物包括(但不限于)动物细胞、藻类、杂交瘤细胞、干细胞、癌症细胞、植物细胞、真菌菌丝、真菌孢子、酵母细胞、寄生生物、寄生卵囊、昆虫细胞和蠕虫。蛋白包括但不限于天然蛋白、重组蛋白、酶和宿主细胞蛋白。病毒包括(但不限于)有包膜病毒种类，例如疱疹病毒、痘病毒、腺病毒、乳多泡病毒、冠状病毒、还原病毒(例如HIV)和原生病毒；和无包膜类，例如杯状病毒、覆盖噬菌体，肌病毒和小核糖核酸病毒。
具有近中性或负电荷的不需要的蛋白质(如蛋白质杂质和宿主细胞蛋白)通常也存在于水性生物组合物中。在一个实施方案中，水性生物组合物具有至少50,000ng/mL(纳克/毫升)、100,000ng/mL或甚至200,000ng/mL并且至多2,000,000ng/mL、1,000,000ng/mL或甚至500,000ng/mL的宿主细胞蛋白浓度。这些可溶蛋白天然较小，并且需要与目标分子分离。
DNA是核苷酸序列，它是细胞复制的蓝图，也可以存在于水性生物组合物中并且也带负电荷。在一个实施方案中，水性生物组合物具有至少105皮克/毫升、106皮克/毫升、107皮克/毫升、108皮克/毫升或者甚至109皮克/毫升的DNA浓度。
这些以上提到的生物材料，包括其它生物材料诸如细菌孢子、核酸、内毒素和病毒需要在治疗用途之前与目标分子分离。
通常，水性生物组合物是缓冲溶液，其抵抗pH变化。在一个实施方案中，水性生物组合物具有高盐浓度。术语“盐”意在包括有助于溶液电导率的所有低分子量离子。生物药物或酶制造中使用的许多工艺溶液具有15mS/cm-30mS/cm(毫西门子/厘米)(约150mM-300mM盐)或更大的电导率。
在一些实施方案中，水性生物组合物具有至少1重量％、2重量％、5重量％、8重量％、10重量％或甚至15重量％和高达20重量％的填充细胞体积。
水性生物组合物的液体部分主要是水。通常，水性生物组合物基本上不含(即，小于1重量％、0.5重量％、0.1重量％或甚至0.05重量％或甚至不可检测的)有机溶剂。
在一个实施方案中，目标分子是以至少0.1克/升(g/L)、0.2克/升(g/L)、0.5克/升(g/L)、1克/升(g/L)、2克/升(g/L)、4克/升(g/L)、6克/升(g/L)或甚至10克/升(g/L)的浓度存在于水性生物组合物中。在一个实施方案中，生物来源的所需大分子以至多10g/L、12g/L、15g/L、18g/L或甚至20g/L的浓度存在于水性生物组合物中。在一些实施方案中，生物来源的所需大分子的浓度在水性生物组合物中甚至高于20g/L。
本公开涉及一种从水性生物组合物中分离目标生物分子的方法。上文所描述的初级和/或二级回收步骤可以由本文公开的方法替代，其中阳离子聚合物用于使来自水性生物组合物的近中性和/或带负电荷的生物材料絮凝，形成生物聚合物复合物。然后使用多孔连续过滤介质将生物聚合物复合物与包含目标生物分子的水性液体分离。
使阳离子聚合物与水性生物组合物接触。阳离子聚合物包含具有结合生物来源的近中性或带负电荷大分子(如全细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、DNA等)所需的亲和力的基团，该大分子与阳离子聚合物结合形成生物聚合物复合物。
本文公开的阳离子聚合物是水溶性或水分散性的。如本文所用，术语“水溶性”是指可在水中溶解的材料。溶解度通常为至少约0.1克/毫升水。如本文所用，术语“水分散性”是指非水溶性，但可以在水中乳化或悬浮的物质。阳离子聚合物还包含与聚合物主链连接(例如，间接或直接共价键合)的官能团，其中该官能团是具有足够碱性从而在pH为5.0-8.0的水性介质中基本上是质子化的胍基基团。例如，合适的此类碱性基团包括其质子化阳离子形式在水中的pKa为至少9，优选至少10，并且更优选至少12.5的基团，或者意味着该基团能够被水质子化。
在一个实施方案中，阳离子聚合物包含至少一个根据式(I)的含胍基侧链：
-[C(R1)＝N-R2]n-N(R3)-[C(＝N-R4)N(R4)]m-R5(I)
在式(I)中，基团R1为氢、C1-C12(杂)烷基、或C5-C12(杂)芳基或聚合物链的残基。基团R2为共价键、C2-C12(杂)烷亚基或C5-C12(杂)芳亚基。基团R3为氢、C1-C12(杂)烷基或C5-C12(杂)芳基，或者当n为0时可为聚合物链的残基。每个基团R4独立地为氢、C1-C12(杂)烷基或C5-C12(杂)芳基。基团R5为氢、C1-C12(杂)烷基、C5-C12(杂)芳基或-N(R4)2。变量n等于0或1，取决于用于形成含胍基的聚合物的前体聚合物。变量m等于1或2，取决于阳离子基团是胍基还是二胍基基团。
大多数阳离子聚合物具有多于一个含胍基的侧链基团。含胍基的侧链基团的数量可根据用于制备阳离子聚合物的方法而变化。在一些实施方案中，阳离子聚合物包含至少1个、2个、4个或甚至5个含胍基的侧链基团。在一些实施方案中，阳离子聚合物包含至多10个、20个、40个、60个、80个、100个、200个、500个或甚至1000个含胍基的侧链基团。
含胍基的阳离子聚合物可衍生自含氨基的聚合物和/或含羰基的聚合物。
在一些实施方案中，通过含氨基的聚合物前体与鸟苷酸化剂的反应来制备阳离子聚合物。此类含胍基的聚合物和其制造方法可见于(例如)美国专利第10,087,405号(Swanson等人)中，该专利通过引用并入本文。当使用含氨基的聚合物时，通常式(I)中的n为0。
适合使用的含氨基聚合物的示例包括但不限于聚乙烯胺、聚(N-甲基乙烯胺)、聚烯丙基胺、聚烯丙基甲胺、聚二烯丙基胺、聚(4-氨基甲基苯乙烯)、聚(4-氨基苯乙烯)、聚(丙烯酰胺-共-甲基氨基丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酰胺-共-氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚赖氨酸、聚氨基酰胺和聚二甲基胺-环氧氯丙烷-乙二胺。
具有伯氨基或仲氨基端基的其它可用的含氨基的聚合物包括但不限于由聚酰胺基胺(PAMAM)和聚丙烯亚胺形成的树枝状大分子(高支化聚合物)。由PAMAM形成的示例性树枝状大分子材料可以商品名STARBURST(PAMAM)树枝状大分子”(例如，具有4个伯氨基的0代、具有8个伯氨基的1代、具有16个伯氨基的2代、具有32个伯氨基的3代和具有64个伯氨基的4代)从威斯康星州密尔沃基的奥德里奇化学公司(Aldrich Chemical(Milwaukee,WI))商购获得。由聚丙烯亚胺形成的树枝状大分子材料可以商品名DAB-Am从奥德里奇化学公司商购获得。例如，DAB-Am-4是具有4个伯氨基的1代聚丙烯亚胺四胺树枝状大分子，DAB-Am-8是具有8个伯氨基的2代聚丙烯亚胺八胺树枝状大分子，DAB-Am-16是具有16个伯氨基的3代聚丙烯亚胺十六胺树枝状大分子，DAB-Am-32是具有32个伯氨基的4代聚丙烯亚胺三十二胺树枝状大分子，而DAB-Am-64是具有64个伯氨基的5代聚丙烯亚胺六十四胺树枝状大分子。
作为生物聚合物的合适的含氨基的聚合物的示例包括脱乙酰壳多糖以及淀粉，所述淀粉用试剂诸如甲基氨基氯乙烷接枝。
含氨基的聚合物的其他示例包括聚丙烯酰胺均聚物或共聚物以及含氨基的聚丙烯酸酯均聚物或共聚物，它们是用包含含氨基的单体(诸如氨基烷基(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺烷基胺和二烯丙基胺)的单体组合物制备的。
合适的可商购获得的含氨基的聚合物包括但不限于可以商品名ANQUAMINE(例如，ANQUAMINE 360、401、419、456和701)从宾夕法尼亚州阿伦敦的空气产品和化学品公司(AirProducts and Chemicals(Allentown,PA))获得的聚酰胺基胺，可以商品名LUPASOL(例如，LUPASOL FG、PR 8515、Waterfree、P和PS)从纽约州伦斯勒的巴斯夫公司(BASFCorporation(Rensselaer,NY))获得的聚乙烯亚胺聚合物，诸如可以商品名CORCAT P-600从南卡罗来纳州威利湖的EIT公司(EIT Company(Lake Wylie,SC))获得的聚乙烯亚胺聚合物，以及诸如可以商品名VERSAMID系列树脂从俄亥俄州辛辛那提的科宁公司(CognisCorporation(Cincinnati,OH))获得的聚酰胺树脂，这些树脂通过使二聚不饱和脂肪酸与烷亚基多胺反应而形成。
在一些实施方案中，可能有利的是使含氨基的聚合物前体反应以提供除含胍基的基团之外的其他配体或基团。例如，可用的是包含疏水性配体、离子配体或氢键合配体。
可易于通过本领域熟知的烷化或酰化过程，将附加配体掺入含氨基的聚合物中。例如，可使用卤化物、磺酸盐和硫酸盐置换反应或使用环氧化物开环反应，使含氨基聚合物的氨基发生反应。用于这些反应的可用的烷基化剂包括例如，硫酸二甲酯、丁基溴、丁基氯、苄基溴、十二烷基溴、2-氯乙醇、溴乙酸、2-氯乙基三甲基氯化铵、氧化苯乙烯、缩水甘油基十六烷基醚、缩水甘油基三甲基氯化铵和缩水甘油基苯基醚。可用的酰化剂包括(例如)酰基氯和酸酐，诸如苯甲酰氯、乙酸酐、琥珀酸酐和癸酰基氯，以及异氰酸酯，诸如三甲基甲硅烷基异氰酸酯、异氰酸苯酯、异氰酸丁酯和异硫氰酸丁酯。在这些实施方案中，可使含氨基的聚合物的可用氨基的0.1摩尔％至20摩尔％，优选地2摩尔％至10摩尔％烷基化和/或酰化。
在一些实施方案中，通过含羰基聚合物和合适的与羰基反应的鸟苷酸化剂的反应来制备阳离子聚合物。此类含羰基聚合物和其制造方法可见于(例如)美国专利第10,087,405号(Swanson等人)中，该专利通过引用并入本文。
当使用含羰基聚合物时，通常式(I)中的n为1，并且该聚合物包含基团—C(O)-R1，该基团可与鸟苷酸化剂反应。羰基-C(O)-R1为醛基(当R1为氢时)或酮基(当R1为(杂)烷基或(杂)芳基时)。虽然羰基可以是聚合物主链的一部分或来自聚合物主链的侧基的一部分，但其通常是侧基。
在一些实施方案中，含羰基的聚合物为单体组合物的聚合产物，所述单体组合物包含具有羰基基团、优选地具有酮基基团的烯键式不饱和单体。具有羰基基团的合适的单体包括但不限于丙烯醛、乙烯基甲基酮、乙烯基乙基酮、乙烯基异丁基酮、异丙烯基甲基酮、乙烯基苯基酮、二丙酮(甲基)丙烯酰胺、丙烯酸丙酮酯和(甲基)丙烯酸乙酰乙酰氧基乙酯。
在其他实施方案中，含羰基聚合物为单体组合物的聚合产物，该单体组合物包含一氧化碳及一种或多种烯键式不饱和单体(即，含羰基聚合物为一氧化碳共聚物)。含一氧化碳的共聚物的示例为ELVALOY 741，其为乙烯/乙酸乙烯基酯/一氧化碳的三元共聚物，得自美国特拉华州威尔明顿的杜邦公司(DuPont(Wilmington,DE,USA))。
除了一氧化碳和/或具有羰基基团(例如，酮基基团)的烯键式不饱和单体之外，用于形成该含羰基的聚合物的单体组合物可任选地还包含烯键式不饱和亲水单体单元。如本文所用，“亲水单体”是具有至少1重量％、优选地至少5重量％的水混溶性(单体中的水)而没有达到浊点的那些可聚合的单体，并且不包含将妨碍生物物质结合到配体基团的官能团。含羰基的聚合物可包含例如单体组合物中0至90重量％的亲水单体。当存在时，基于单体组合物的总重量计，亲水单体可以1重量％至90重量％、1重量％至75重量％、1重量％至50重量％、1重量％至25重量％、或1重量％至10重量％范围内的量存在。
亲水单体的亲水基团可为中性的和/或具有正电荷。具有离子基团的亲水单体可为中性的或带电的，具体取决于pH条件。亲水单体通常用于赋予含羰基聚合物所需亲水性(即水溶性、混溶性或分散性，或使聚合物能够被水润湿或吸收水)。
能够提供正电荷的一些示例性亲水单体是式(II)的氨基(甲基)丙烯酸酯类或氨基(甲基)丙烯酰胺类或者它们的季铵盐。季铵盐的抗衡离子通常是卤离子、硫酸根、磷酸根、硝酸根等等。
在式(II)中，基团X为氧基(即，–O-)或–NR3-，其中R3为氢、C1-C12(杂)烷基或C5-C12(杂)芳基。基团R6为C2至C10中的任，优选地C2-C6中的任。基团R7独立地为氢或甲基。每个R8独立地为氢、烷基、羟烷基(即被羟基取代的烷基)、或氨基烷基(即被氨基取代的烷基)。另选地，两个R8基团与它们所连接的氮原子合在一起可形成芳族的、部分不饱和(即不饱和但不是芳族的)或饱和的杂环基团，其中该杂环基团可任选地稠合至芳族的另一个环(例如，苯)、部分不饱和的另一个环(例如，环己烯)或饱和的另一个环(例如，环己烷)。
应当理解，对于式(II)，所描绘的烯键式不饱和(甲基)丙烯酰基(CH2＝C(R7)-C(O)-基团)可被反应性降低的另一个烯键式不饱和基团(如乙烯基、乙烯氧基、烯丙基、烯丙氧基和乙炔基)取代。
在式(II)的一些实施方案中，两个R8基团都为氢。在其他实施方案中，一个R8基团为氢并且另一个为具有1至10个、1至6个、或1至4个碳原子的烷基。在其他实施方案中，至少一个R8基团为含有1至10个、1至6个、或1至4个碳原子的羟烷基或氨基烷基，其中羟基或氨基基团位于烷基基团的碳原子中的任何一个上。在其他实施方案中，R8基团与它们所连接的氮原子组合成以形成杂环基团。杂环基团包括至少一个氮原子并且可含有其他杂原子，诸如氧或硫。示例性的杂环基团包括但不限于咪唑基。杂环基团可被稠合至另外的环，诸如苯、环己烯或环己烷。稠合至另外环的示例性杂环基团包括但不限于苯并咪唑基。
示例性氨基丙烯酸酯(即，式(II)中“X”为氧基)包括(甲基)丙烯酸N,N-二烷基氨基烷基酯，诸如(例如)(甲基)丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯、丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸N,N-二甲基氨基丙酯、(甲基)丙烯酸N-叔丁基氨基丙酯等。
示例性氨基(甲基)丙烯酰胺(即，式(II)中的“X”为-NR3-)包括例如N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)丙烯酰胺、N-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、N-[3-(二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺、N-(3-咪唑基丙基)甲基丙烯酰胺、N-(3-咪唑基丙基)丙烯酰胺、N-(2-咪唑基乙基)甲基丙烯酰胺、N-(1,1-二甲基-3-咪唑基丙基)甲基丙烯酰胺、N-(1,1-二甲基-3-咪唑基丙基)丙烯酰胺、N-(3-苯并咪唑基丙基)丙烯酰胺和N-(3-苯并咪唑基丙基)甲基丙烯酰胺。
式(II)的单体的示例性季盐包括但不限于(甲基)丙烯酰胺基烷基三甲基铵盐(例如3-甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵和3-丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵)和(甲基)丙烯酰氧基烷基三甲基铵盐(例如2-丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵、2-甲基丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵、3-甲基丙烯酰氧基-2-羟丙基三甲基氯化铵、3-丙烯酰氧基-2-羟丙基三甲基氯化铵和2-丙烯酰氧基乙基三甲基硫酸甲酯铵)。
可以向聚合物提供带正电荷基团的其它单体包括链烯吖内酯的二烷基氨基烷基氨加合物(如乙烯基二甲基吖内酯的2-(二乙基氨基)乙胺、(2-氨基乙基)三甲基氯化铵和3-(二甲基氨基)丙胺加合物)和二烯丙基胺单体(如二烯丙基氯化铵和二烯丙基二甲基氯化铵)。
在一些优选实施方案中，任选的亲水单体可具有烯键式不饱和基团，诸如(甲基)丙烯酰基团和聚(环氧烷)基团。例如，亲水单体可为聚(环氧烷)单(甲基)丙烯酸酯化合物，其中末端为羟基或烷基醚基团。此类单体由通式(III)表示。
R9-O-(CH(R9)-CH2-O)p-C(O)-C(R9)＝CH2
(III)
在式(III)中，每个R9独立地为氢或C1-C4烷基。变量p为至少2，诸如例如2至100、2至50、2至20、或2至10。
在一个实施方案中，含羰基聚合物包含聚(环氧烷)基团(描绘为-(CH(R9)-CH2-O)p-)，其中聚(环氧烷)基团是聚(环氧乙烷)。在另一个实施方案中，聚(环氧烷)基团是聚(环氧乙烷-共-环氧丙烷)。此类共聚物可为嵌段共聚物、无规共聚物或梯度共聚物。
合适的亲水单体的其他代表性示例包括但不限于(甲基)丙烯酸2-羟乙酯；N-乙烯基吡咯烷酮；N-乙烯基己内酰胺；丙烯酰胺；单或二-N-烷基取代的丙烯酰胺；叔丁基丙烯酰胺；二甲基丙烯酰胺；N-辛基丙烯酰胺；聚(烷氧基烷基)(甲基)丙烯酸酯，其包括(甲基)丙烯酸2-(2-乙氧基乙氧基)乙酯、(甲基)丙烯酸2-乙氧基乙酯、(甲基)丙烯酸2-甲氧基乙氧基乙酯、甲基丙烯酸2-甲氧基乙酯、聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯；烷基乙烯基醚，包括乙烯基甲基醚；以及它们的混合物。优选的亲水单体包括选自二甲基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸2-羟乙酯和N-乙烯基吡咯烷酮的那些。
在一些实施方案中，用于形成含羰基的聚合物的单体组合物可任选地包含疏水单体。如本文所用，术语“疏水单体”是指这样的单体，其具有小于1重量％的水混溶性(单体中的水)。疏水单体的用量不会不利地影响含胍基的单体聚合物的结合性能和/或含胍基的聚合物的水分散性。当存在时，基于单体组合物中的单体的总重量计，疏水单体通常以1重量％至20重量％、1重量％至10重量％、或1重量％至5重量％范围内的量存在。
疏水单体的可用类别包括丙烯酸烷基酯和酰胺，示例为含有C1-C30烷基的烷基酯和含有C1-C30烷基的单烷基丙烯酰胺或二烷基丙烯酰胺的直链、环状和支链异构体。丙烯酸烷基酯的可用的具体示例包括：丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异戊酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸正庚基酯、丙烯酸异冰片酯、丙烯酸正辛酯、丙烯酸异辛酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸异壬酯、丙烯酸癸酯、丙烯酸十一烷基酯、丙烯酸十二烷基酯、丙烯酸月桂酯、丙烯酸十三烷基酯和丙烯酸十四烷基酯。烷基丙烯酰胺的可用的具体示例包括可使用的具有戊基、己基、庚基、异冰片基、辛基、2-乙基己基、异壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基和十四烷基的单烷基丙烯酰胺和二烷基丙烯酰胺。可使用对应的甲基丙烯酸酯。
另外的可用类别的疏水单体还包括乙烯基单体诸如乙酸乙烯基酯、苯乙烯、和烷基乙烯基醚、以及马来酸酐。
包含根据式(I)的侧链的含胍基聚合物通常为含羰基的聚合物前体与式(IV)的鸟苷酸化剂的反应产物。
在式(IV)中，基团R2为共价键、C2-C12(杂)烷亚基或C5-C12(杂)芳亚基。基团R3是氢、C1-C12(杂)烷基或C5-C12(杂)芳基。每个R4独立地为氢、C1-C12(杂)烷基或C5-C12(杂)芳基。基团R5为H、C1-C12(杂)烷基或C5-C12(杂)芳基或-N(R4)2。变量m等于1或2。
为了方便描述，含羰基聚合物可由式聚合物-C(＝O)-R1表示。羰基可位于主链中或位于侧基中，但通常位于侧基中。当与式(IV)的鸟苷酸化剂反应时，含羰基的聚合物中的羰基基团与鸟苷酸化剂的末端胺基团发生缩合反应。含胍基聚合物通常具有式(V)的含胍基的侧基。
基团R2、R3、R4和R5与以上针对式(IV)所述的相同，并且波浪线表示聚合物。式(V)中的式的基团
是式(IV)的配体化合物的末端胺和含羰基聚合物的羰基之间形成的键接。波浪线表示基团经由共价键连接到聚合物其余部分的连接位点。基团R1为氢(当羰基为醛基时)、C1-C12(杂)烷基(当羰基为酮基并且酮基为侧基的一部分时)、或C5-C12(杂)芳基(当羰基为酮基并且酮基为侧基的一部分时)、或聚合物链的残基(当羰基为含羰基聚合物的主链中的基团时)。在大多数实施方案中，式(V)的基团为含胍基聚合物的侧基的一部分。
在其他实施方案中，可制备含胍基聚合物，其中亚胺连接基团(～～C(R1)＝N—)被还原为胺连接基团(～～CH(R1)—NH—)。这可以通过用还原剂(诸如氰基硼氢化钠)处理现存的配体官能化聚合物来实现，或者还原可通过向羰基官能化(共)聚合物与式V的化合物的反应混合物中添加还原剂而原位实现。
在许多实施方案中，含羰基的聚合物的一些但并非所有的羰基基团与式(IV)的鸟苷酸化剂反应。通常，含羰基的聚合物前体中至少0.1摩尔％、至少0.5摩尔％、至少1摩尔％、至少2摩尔％、至少10摩尔％、至少20摩尔％或至少50摩尔％的羰基基团与鸟苷酸化剂反应。至多100摩尔％、至多90摩尔％、至多80摩尔％、或至多60摩尔％的羰基基团可与鸟苷酸化剂反应。例如，鸟苷酸化剂的用量可足以使含羰基的聚合物中0.1摩尔％至100摩尔％、0.5摩尔％至100摩尔％、1摩尔％至90摩尔％、1摩尔％至80摩尔％、1摩尔％至60摩尔％、2摩尔％至50摩尔％、2摩尔％至25摩尔％、或2摩尔％至10摩尔％的羰基官能化。
并非使前体聚合物与鸟苷酸化剂反应来制备含胍基的聚合物，而是可通过含胍基的单体的自由基聚合来制备含胍基的聚合物，所述含胍基的单体是指具有烯键式不饱和基团和含胍基的基团的单体。示例性含胍基单体由式(VI)和(VII)表示。
在式(VI)和(VII)中，基团R1为氢、C1-C12烷基或C5-C12(杂)芳基。基团R2为共价键、C2至C12烷亚基、C5-C12(杂)芳亚基、下式的二价基团
或下式的二价基团
基团R10为C2至C12烷亚基或C5-C12(杂)芳亚基。每个R3独立地为氢、羟基、C1-C12烷基或C5-C12(杂)芳基。R3优选为氢或C1-C4烷基。基团R4是氢、C1-C12烷基、C5-C12(杂)芳基或–N(R3)2，其中R3独立地为氢、羟基、C1-C12烷基或C5-C12(杂)芳基。优选地，R4为氢或C1-C4烷基。基团X是氧基或-NR3-，其中R3是氢、羟基、C1-C12烷基或C5-C12(杂)芳基。基团R6为C2至C12烷亚基。基团R7为氢或CH3。
相对于水性生物组合物的量添加的阳离子聚合物的量可以在宽广范围内变化。在一个实施方案中，添加到水性生物组合物中的阳离子聚合物的量为至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100、250或甚至500微克/毫升。在一个实施方案中，添加到水性生物组合物中的阳离子聚合物的量为至多50、100、250、500、1000、2000、5000、7500或甚至10000微克/毫升。添加的阳离子聚合物的最佳量将取决于水性生物组合物中存在的近中性或带负电荷的生物材料(即，结合物质)的浓度。通常，阳离子聚合物的量相对于结合物质的量将在0.01重量％至100重量％，优选0.05重量％至30重量％，更优选约0.1重量％至10重量％的范围内。
使阳离子聚合物与水性生物组合物接触足以使近中性和带负电荷的结合物质与阳离子聚合物相互作用以形成生物聚合物复合物的一段时间。阳离子聚合物与近中性或带负电荷的大分子结合(例如离子键合、氢键结合等)。在一个实施方案中，水性生物组合物和阳离子聚合物在被搅拌的同时彼此紧密接触以形成生物聚合物复合物。合适的混合方法包括用手、实验室搅拌器、机械和/或磁力搅拌器摇动，并且例如通过静态混合器。搅拌可进行足以有效地将生物化合物结合到阳离子聚合物的任何长度的时间，并且可取决于搅拌的材料体积。在一些实施方案中，搅拌优选地小于60秒、小于45秒或甚至小于30秒。在其它实施方案中，例如，搅拌可长达20分钟或更久。
所得混合物包含在水性溶液/悬浮液中的生物聚合物复合物和目标分子。在一个实施方案中，当溶液包含至少50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或甚至100mM盐以及至多125mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM或甚至400mM盐时，可以将目标分子置于(溶解或悬浮于)该溶液中。
在多个实施方案中，在水性介质中带正电荷的阳离子聚合物的阳离子官能团将与近中性或带负电荷的物质结合，而其他物质(例如带正电荷的蛋白，如单克隆抗体)将被排除或排斥在阳离子聚合物之外。另外，阳离子聚合物可以衍生自一种或多种离子单体。具体地讲，阳离子聚合物可包含在选定的水性生物溶液的pH下带正电荷的额外离子基团，以增强对蛋白质(例如单克隆抗体，它们中的许多在中性pH下带正电荷)的静电排斥。
生物聚合物复合物的平均粒径为至少45微米、50微米、60微米、70微米、75微米或甚至80微米。在一个实施方案中，生物聚合物复合物的平均粒径为至多100微米、110微米、120微米、130微米、140微米、150微米、160微米、170微米、180微米、190微米、200微米、220微米、240微米、260微米、280微米、300微米、350微米、400微米、450微米、500微米或甚至1000微米。可使用本领域已知的技术如反射比或光散射来测定平均粒径。通常，所得生物聚合物复合物不溶于水并且从水溶液中沉淀析出。
在另一个实施方案中，使用本领域已知的技术如机械搅拌将生物聚合物复合物悬浮于水溶液中。在悬浮之后，随后(例如，立即)如下所述过滤水性混合物，以将目标分子与生物聚合物复合物分离。有利地，在本公开中，生物聚合物复合物不需要在过滤之前从混合物中沉淀出来。
使混合物穿过过滤单元。如图1所示，过滤单元10包括壳体，该壳体具有入口12和出口14，从而限定其间的液体流动路径。多孔连续过滤介质16定位在入口与出口之间的液体流动路径中，使得进入过滤单元的液体在离开该单元之前穿过多孔连续过滤介质。箭头13指示从入口12到出口14通过多孔连续过滤介质16的大部分流体流的净方向。收集区18相对于多孔连续过滤介质定位在上游。如图1所示，通过多孔连续过滤介质的大部分整体流体流(由箭头13所示)正好在相反方向上与由箭头15所示的重力方向反向。
将在液体中包含生物聚合物复合物和目标生物分子的混合物添加到入口并使其与多孔连续过滤介质相互作用。含有目标大分子的澄清液体(或滤液)经由出口离开。过滤单元被定位成使得通过多孔连续过滤介质的液体的大部分流的方向基本上不与地球的重力的方向平行。如本文所用，大部分流是指通过过滤介质的液体的大于50体积％、60体积％、75体积％、85体积％或甚至95体积％的流。
尽管不希望受理论限制，但据信当平行于重力并且在与重力相同的方向上过滤混合物时，生物聚合物复合物可以沉积在多孔连续过滤介质的顶部(或头部)上，从而形成“饼”和/或可嵌入到多孔连续过滤介质中。这可导致多孔连续过滤介质的堵塞；可减少通过过滤介质的流体流；和/或增加过滤单元的背压。如果足够显著，则堵塞可阻止目标非结合分子从出口排出。本申请已经发现，操作过滤单元使得液体的大部分流基本上不平行于重力并且不在与重力方向相同的方向上，可导致目标非结合分子从生物聚合物复合物的有效分离和目标非结合分子的收集。如本文所用，重力是指地球的重力。
通过本公开的多孔连续过滤介质的整体液体的流动方向基本上不平行于重力方向。如本文所用，基本上不平行是指通过多孔连续过滤介质的大部分流体流的方向与重力方向成大于30度、40度或甚至60度。在一个实施方案中，通过多孔连续过滤介质的大部分流体流的方向与重力方向成至多330度、320度、300度、270度或甚至180度。如图2所示，具有入口22和出口24的过滤单元20具有在箭头23的方向上的流体流。通过过滤单元20的多孔连续过滤介质的大部分流体流与重力方向(由箭头25所示)成θ度。角度θ可测量为通过过滤介质的大部分流体流(由箭头23所示)不同于重力方向(由箭头25所示)的程度。在一个实施方案中，通过多孔连续过滤介质的整体流体流垂直于重力方向(例如，θ为约90度或约270度)。在另一个实施方案中，通过多孔连续过滤介质的整体流体流与重力方向正好相反(例如，θ为约180度)。在一个实施方案中，通过多孔连续过滤介质的整体流体流的方向与重力方向反向，其中通过多孔连续过滤介质的整体流体流的方向在地面至天空的方向上流动(即，θ为约90度至约270度)。
过滤单元包括收集区，该收集区相对于多孔连续过滤介质位于上游。通常，在过滤中，空隙体积(换句话讲，包含在过滤单元内的液相的体积)被保持为最小以减少滤液的稀释。在本公开中，收集区(具体地，过滤单元的多孔连续过滤介质的入口和正面之间的体积)足够大。该区(在本文中被称为收集区)是其中生物聚合物复合物进行收集，以便不阻塞多孔连续过滤介质的区。在一个实施方案中，收集区为每多孔连续过滤介质正面面积(以m2为单位)至少40L、45L、50L、75L、100L、150L或甚至200L。多孔连续过滤介质的表面积可以使用几何表面积来确定。例如，在圆形正面积的情况下，正面面积可以使用等式πr2来确定，其中r为半径。通常，收集区足够大以允许收集生物聚合物复合物，但不大到使得过滤单元变成为难以处理(例如，每1m2多孔连续过滤介质正面面积2000L)。
本文所公开的过滤单元包括多孔连续过滤介质。过滤介质是连续的，意味着它是跨过滤单元宽度的单个制品，而不是跨过滤单元宽度的制品的集合，如松散纤维。示例性连续多孔过滤介质包括非织造基底或微孔幅材。过滤介质是多孔的，意味着制品包括在整个制品中的小孔穴(或孔)，使得流体能够从入口流到出口。在一个实施方案中，孔具有至少0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、10、20或甚至40微米；并且至多50、75、100、125、150、175或甚至200微米的平均直径。在一个实施方案中，本公开的多孔连续过滤介质具有在整体液体流的方向上对称的平均孔径。换句话讲，多孔连续过滤介质在该多孔连续过滤介质的一端(例如，入口端)不包括较大的平均孔径。
非织造基底为非织造网，其可包括由用于制备非织造网的任何通常已知工艺所制造的非织造网。如本文所用，术语“非织造网”是指这样的织物，该织物具有以毡状方式随机和/或单向插入的单纤维或细丝的结构。
例如，纤维非织造网可通过以下方法制成：梳理成网法、气纺法、湿法成网法、射流喷网法、纺粘法、静电纺纱法或熔喷法技术(例如熔纺法或熔喷法)、或它们的组合。纺粘纤维通常为小直径纤维，它们是通过经由喷丝头的多个细小的、通常为圆形的毛细管将熔融的热塑性聚合物以细丝形式挤出而形成的，其中挤出的纤维的直径迅速减小。熔喷纤维通常通过经由多个细小的通常圆形的模头毛细管将熔融的热塑性材料以熔融的线或丝挤出到高速的通常被加热的气体(例如空气)流中而形成，该气体流使熔融的热塑性材料的丝细化以减小它们的直径。此后，熔喷纤维由高速气流运送并沉积在收集面上，以形成随机分配的熔喷纤维。非织造网中的任何一种均可由单一类型的纤维或在热塑性聚合物的类型和/或厚度方面不同的两种或多种纤维制成。
短纤维也可存在于料片中。短纤维的存在通常提供比仅仅熔喷的微纤维幅材更为蓬松、不太致密的幅材。优选存在不超过约20重量％、更优选不超过约10重量％的短纤维。这样的含短纤维的网在美国专利号4,118,531(Hauser)中有公开。
非织造制品还可以任选包括一层或多层稀松布。例如，一个或全部两个主表面还可以任选各包括稀松布层。将稀松布(其通常为由纤维制成的织造或非织造的增强层)包括在内，以向非织造制品提供强度。合适的稀松布材料包括但不限于尼龙、聚酯、玻璃纤维、聚乙烯、聚丙烯等等。稀松布的平均厚度可以是变化的。通常，稀松布的平均厚度为约25微米至约100微米、优选约25微米至约50微米。稀松布的层可以任选粘结到非织造制品。多种粘合剂材料可用于将稀松布粘结到聚合物材料。或者，稀松布可以热粘结到非织造物。
非织造基底的微纤维通常具有至少0.5、1、2或甚至4微米并且至多20、18、16、15、10、8或甚至6微米的有效纤维直径，如根据Davies,C.N.,“《空气携带的灰尘和颗粒的分离》(The Separation of Airborne Dust and Particles),”伦敦机械工程师学会(Institution of Mechanical Engineers)，论文集1B,1952)所提出的方法计算。非织造基底优选地具有在至少5g/m2、10g/m2、20g/m2或甚至50g/m2；并且至多800g/m2、600g/m2、400g/m2、200g/m2或甚至100g/m2的范围内的基重。非织造纤维网的最小拉伸强度为约4.0牛顿。通常认为，由于在横幅方向的纤维粘结与缠结更佳，所以非织造物的拉伸强度在纵向低于在横幅方向。
关于非织造网的制备方法的更多细节可见于Wente，“超细热塑性纤维”，第48卷，工业工程化学，第1342页(1956)(Superfine Thermoplastic Fibers,48INDUS.ENG.CHEM.1342(1956))或Wente等人，“超细有机纤维的制造”，美国海军研究实验室第4364号报告，1954年(Wente et al.,Manufacture OfSuperfine Organic Fibers(Naval Research Laboratories Report No.4364,1954))。
非织造纤维网蓬松度通过纤维网的密实度来测量，密实度是限定纤维网体积中的固体比率的参数。密实度值越低指示纤维网蓬松度越大。可用的非织造基底的密实度低于20％，或者甚至低于15％。密实度为通常由α表示的无单位分数：
α＝mf÷ρf×L非织造物
其中mf为每样品表面积的纤维质量，其中ρf为纤维密度；并且
L非织造物为非织造物厚度。本文所用的密实度是指非织造基底本身而不是官能化非织造物。当非织造基底含有两种或更多种纤维的混合物时，使用相同的L非织造物确定每一种纤维的单独的密实度，并且将这些单独的密实度加在一起来获得网的密实度α。
非织造基底可由任何合适的热塑性聚合物材料制成的纤维或细丝形成。合适的聚合物材料包括但不限于聚烯烃、聚(异戊二烯)、聚(丁二烯)、氟化聚合物、氯化聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚醚、聚(醚砜)、聚(砜)、聚(乙酸乙烯酯)、乙酸乙烯酯的共聚物如聚(乙烯)-共-聚(乙烯醇)、聚(磷腈)、聚(乙烯基酯)、聚(乙烯基醚)、聚(乙烯醇)以及聚(碳酸酯)。
合适的聚烯烃包括但不限于聚(乙烯)、聚(丙烯)、聚(1-丁烯)、乙烯和丙烯的共聚物、α-烯烃共聚物(诸如乙烯或丙烯与1-丁烯、1-己烯、1-辛烯和1-癸烯的共聚物)、聚(乙烯-共-1-丁烯)以及聚(乙烯-共-1-丁烯-共-1-己烯)。
合适的氟化聚合物包括但不限于聚(氟乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、偏二氟乙烯的共聚物(诸如聚(偏二氟乙烯-共-六氟丙烯))以及三氟氯乙烯的共聚物(诸如聚(乙烯-共-三氟氯乙烯))。
合适的聚酰胺包括但不限于聚(亚胺基己二酰亚胺基六甲亚基)、聚(亚胺基己二酰亚胺基十甲亚基)以及聚己内酰胺。合适的聚酰亚胺包括聚(均苯四酰亚胺)。
合适的聚(醚砜)包括但不限于聚(二苯醚砜)和聚(二苯砜-共-氧化二亚苯砜)。
合适的乙酸乙烯酯的共聚物包括(但不限于)聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)和其中乙酸酯基团中的至少一部分已经水解以提供各种聚(乙烯醇)的此类聚合物，包括聚(乙烯-共-乙烯醇)。
微孔膜为多孔聚合物基底(如片材或膜)，其包含具有小于5微米的平均流孔径的微孔，如通过ASTM标准测试方法第F316-03号《用于通过泡点和平均流量孔测试进行的针对膜过滤器的孔径特性的标准测试方法》(“Standard Test Methods for Pore SizeCharacteristics of Membrane Filters by Bubble Point and Mean Flow Pore Test”)来表征。在一个实施方案中，微孔膜具有至少0.1、0.2、0.5、0.8、或者甚至1微米；并且至多5、3、或者甚至2微米的中流量孔径。期望的孔径可根据用途而变化。微孔膜可在流体流动方向上具有对称或非对称(例如梯度)的孔径分布。
在一个实施方案中，非织造物的平均孔径可通过公式df((2α/π)(-1/2)-1)来确定，其中df为有效纤维直径，并且α为幅材密实度。非织造物的纤维的有效纤维直径通常为3至20微米。可根据戴维斯(Davies,C.N.)的《空气携带的灰尘和颗粒的分离》(“TheSeparation of Airborne Dust and Particles”)，伦敦机械工程师学会(Institution ofMechanical Engineers)，论文集1B,1952年中所述的方法来计算有效纤维直径。在一个实施方案中，非织造膜具有至少12微米；并且至多64微米的平均流孔径。
微孔膜可由任何合适的热塑性聚合物材料形成。合适的聚合物材料包括但不限于聚烯烃、聚(异戊二烯)、聚(丁二烯)、氟化聚合物、氯化聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚醚、聚(醚砜)、聚(砜)、聚(乙酸乙烯酯)、聚酯例如聚(乳酸)、乙酸乙烯酯的共聚物，例如聚(乙烯)-共-聚(乙烯醇)、聚(磷腈)、聚(乙烯基酯)、聚(乙烯基醚)、聚(乙烯醇)以及聚(碳酸酯)。
合适的聚烯烃包括但不限于聚(乙烯)、聚(丙烯)、聚(1-丁烯)、乙烯和丙烯的共聚物、α-烯烃共聚物(诸如乙烯或丙烯与1-丁烯、1-己烯、1-辛烯和1-癸烯的共聚物)、聚(乙烯-共-1-丁烯)以及聚(乙烯-共-1-丁烯-共-1-己烯)。
合适的氟化聚合物包括但不限于聚(氟乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、偏二氟乙烯的共聚物(诸如聚(偏二氟乙烯-共-六氟丙烯))以及三氟氯乙烯的共聚物(诸如聚(乙烯-共-三氟氯乙烯))。
合适的聚酰胺包括但不限于聚(亚氨基己二酰亚氨基六甲亚基)、聚(亚氨基己二酰亚氨基十甲亚基)以及聚己内酰胺。合适的聚酰亚胺包括但不限于聚(均苯四酰亚胺)。
合适的聚(醚砜)包括但不限于聚(二苯醚砜)和聚(二苯基砜-共-氧化二苯亚基砜)。
合适的乙酸乙烯酯的共聚物包括但不限于聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)以及其中乙酸酯基团中的至少一些已被水解而提供多种聚(乙烯醇)的那些共聚物。
在一个实施方案中，微孔膜是溶剂诱导的相分离(SIPS)膜。通常通过如下方式制得SIPS膜：制备聚合物在第一溶剂中的均匀溶液，将溶液浇铸成所需形状，例如，平片或中空纤维，使铸膜溶液与另一种第二溶剂接触，该第二溶剂不是聚合物的溶剂，而是第一溶剂的溶剂(即，第一溶剂可与第二溶剂混溶，但聚合物不可与第二溶剂混溶)。通过如下方式诱导相分离：使第二溶剂扩散到铸膜聚合物溶液中并且使第一溶剂扩散出聚合物溶液并扩散到第二溶剂中，从而使聚合物沉淀。移除聚合物稀相并干燥聚合物而得到多孔结构。SIPS也称为相转化或扩散致相分离或非溶剂致相分离，此类技术是本领域通常已知的。微孔SIPS膜进一步公开于美国专利号6,056,529(Meyering等人)、6,267,916(Meyering等人)、6,413,070(Meyering等人)、6,776,940(Meyering等人)、3,876,738(Marinacchio等人)、3,928,517(Knight等人)、4,707,265(Knight等人)和5,458,782(Hou等人)中。
在另一个实施方案中，微孔膜是热致相分离(TIPS)膜。通常通过如下方式制备TIPS膜：通过在塑料配混设备例如挤出机中在升高的温度下混合，形成热塑性材料和第二材料(诸如稀释剂)(并任选地包括成核剂)的均匀溶液。可通过穿过孔板或挤出模具使溶液成形，并且在冷却后，热塑性材料结晶并与第二材料发生相分离。通常对结晶的热塑性材料进行拉伸。任选地在拉伸之前或之后移除第二材料，从而留下多孔聚合结构。微孔TIPS膜进一步公开于美国专利号4,529,256(Shipman)；4,726,989(Mrozinski)；4,867,881(Kinzer)、5,120,594(Mrozinski)；5,260,360(Mrozinski)；和5,962,544(Waller，Jr.)中。一些示例性的TIPS膜包含聚(偏二氟乙烯)(PVDF)、聚烯烃诸如聚(乙烯)或聚(丙烯)、含乙烯基的聚合物或共聚物诸如乙烯-乙烯基醇共聚物、以及含丁二烯的聚合物或共聚物、和含丙烯酸酯的聚合物或共聚物。包含PVDF的TIPS膜还描述于美国专利7,338,692(Smith等人)中。
可处理非织造基底和微孔膜以提供阳离子表面电荷，例如用含阳离子的单体或可阳离子电离的单体接枝。“可阳离子电离的”包括可在适当pH的溶液中制成阳离子的单体。此类单体包括：如上所述的氨基(甲基)丙烯酸酯类或氨基(甲基)丙烯酰胺类、季铵盐类和/或含胍基的基团。此类技术和单体在本领域中是已知的。参见例如美国专利号10,722,848(Hester等人)，该专利以引用方式并入本文。
通过在收集区内收集生物聚合物复合物来实现目标分子与生物聚合物复合物的分离，同时液体中的目标分子和任何其他非复合物分子可以穿过多孔连续过滤介质。收集已穿过多孔连续过滤介质的液体，本文称为滤液。然后可以进一步处理包含目标分子的滤液以分离和/或浓缩目标分子。
多孔连续过滤介质可以为容纳在过滤单元(如图1所示的过滤单元)内的柱或平面过滤介质。通常，过滤介质(即，多孔连续过滤介质)的平面盘或塞可根据待过滤混合物的量在尺寸上进行变化。例如，对于小批量(即，小于1升)的混合物，可使用筒式注射器过滤单元。随着混合物体积的增加，盘的直径可以增加，例如从1英寸直径盘增加到8英寸直径盘，用于过滤1升或更多的混合物。
随着混合物体积的增加(例如，大于5升)，使用包括一个透镜状过滤或多个透镜状过滤器的过滤单元可能是有帮助的。图3描绘了封装的透镜状过滤器设计的剖视图。过滤器单元30包括封装在壳体中的透镜状过滤器37。透镜状过滤器37包括多孔连续过滤介质36。经由入口32将混合物添加到过滤单元30中。液体从透镜状过滤器周围流出，穿过多孔连续过滤介质36，并且滤液从透镜状过滤器的内部通过出口34流出。尽管在操作中描绘了图3，其中流体流从透镜状单元的外部进入内部，但是透镜状单元也可以在相反方向上运行，其中流体流从透镜状单元的内部并且向外前进。透镜状过滤器单元和制备透镜状过滤器单元的方法的示例可见于例如美国专利号6,464,084(Pulek)；6,939,466(Pulek)；7,178,676(Pulek等人)；和6,712,966(Pulek等人)；和美国专利公开2011/0259812(Marks等人)。
水性生物溶液通常包括细胞生长或发酵所需的缓冲液、电解质和/或糖，但是这些组分可以影响用于回收和分离目标分子的传统过滤器的性能，并且因此将工艺溶液(例如，水性生物溶液)稀释以降低离子浓度。在本公开的一个实施方案中，水性生物溶液在与阳离子聚合物接触和/或与连续过滤介质接触之前未被稀释。
在本申请中已经发现，生物聚合物复合物的粒度与多孔连续过滤介质的配置的组合允许水性生物组合物中的细胞碎片和其他近中性或带负电荷的组分与目标生物分子的高容量分离、针对来自流体的DNA的大量减少的高容量和/或宿主细胞蛋白的高度减少，同时还最大程度地减少工艺步骤的数量。
在一个实施方案中，本公开的方法使得能够澄清水性生物组合物，产生浊度小于20NTU、15NTU、10NTU、5NTU或甚至4NTU的滤液。
本公开的示例性实施方案如下：
实施方案1.一种从包含结合物质的水性生物组合物中纯化目标非结合分子的方法，所述方法包括：
(a)使阳离子聚合物和所述水性生物组合物接触以形成混合物，所述混合物在液体中包含生物聚合物复合物和所述目标非结合分子，其中所述生物聚合物复合物具有至少50微米的平均粒径；
(b)提供过滤单元，所述过滤单元包括：(i)具有入口和出口的壳体，(ii)与所述入口和所述出口流体连接的多孔连续过滤介质，以及(iii)相对于所述多孔连续过滤介质位于上游的收集区；
(c)将所述混合物添加到所述入口；以及
(d)允许所述混合物在所述过滤单元中分离，由此所述生物聚合物复合物在所述收集区中收集并且所述目标非结合分子穿过所述过滤介质，并且其中通过所述过滤介质的所述液体的大部分流基本上不平行于重力方向。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质中的孔的平均直径在液体流方向上是对称的。
实施方案3.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质具有至少0.1微米并且至多200微米的孔径。
实施方案4.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质具有至少0.8微米并且至多50微米的孔径。
实施方案5.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质为非织造基底。
实施方案6.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质为多孔膜。
实施方案7.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多孔连续介质具有正面面积，并且其中所述收集区具有每1m2正面面积至少40L的体积。
实施方案8.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中通过所述多孔连续过滤介质的所述液体的所述流在与重力反向的方向上。
实施方案9.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中通过所述多孔连续过滤介质的所述液体的所述流在与所述重力方向成从30度到90度的方向上。
实施方案10.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中流体流的净方向不平行于所述重力方向。
实施方案11.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物是水溶性或水分散性聚合物。
实施方案12.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物经胍基基团官能化。
实施方案13.根据实施方案12所述的方法，其中所述阳离子聚合物包含下式的基团：
-[C(R1)＝N-R2]n-N(R3)-[C(＝N-R4)N(R4)]m-R5，
其中
R1为H、C1-C12烷基、C5-C12(杂)芳基或聚合物链的残基；
R2为共价键、C2-C12(杂)烷亚基或C5-C12(杂)芳亚基；每个R3独立地为H、C1-C12烷基或C5-C12(杂)芳基；
每个R4为H、C1-C12烷基或烷亚基、C5-C12(杂)芳基或(杂)芳亚基、氰基或-C(＝NH)-N(R2)-聚合物；
n为0或1；并且
m为1或2。
实施方案14.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物进一步经季铵基团官能化。
实施方案15.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物来源于氨基聚合物。
实施方案16.根据实施方案15所述的方法，其中所述氨基聚合物选自由以下项组成的组：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚氨基酰胺类、聚烯丙基胺、聚乙烯胺、聚二甲基胺-环氧氯丙烷-乙二胺、以及由聚酰氨基胺(PAMAM)和聚丙烯亚胺所形成的树枝状体。
实施方案17.根据实施方案14至16中任一项所述的方法，其中所述氨基聚合物的0.1至100摩尔％的可用氨基基团经胍基基团官能化。
实施方案18.根据实施方案17所述的方法，其中所述胍基基团在所述氨基聚合物链中。
实施方案19.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物来源于羰基聚合物。
实施方案20.根据实施方案19所述的方法，其中所述羰基聚合物选自由以下项组成的组；丙烯醛、乙烯基甲基酮、乙烯基乙基酮、乙烯基异丁基酮、双丙酮(甲基)丙烯酰胺、丙烯酸丙酮酯、一氧化碳共聚物、和双丙酮(甲基)丙烯酸酯(共)聚合物。
实施方案21.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中每毫升所述水性生物组合物中添加0.01微克至10,000微克的阳离子聚合物。
实施方案22.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述水性生物组合物包含多孔材料。
实施方案23.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述生物组合物来源于细胞培养或发酵过程。
实施方案24.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述生物聚合物复合物具有至多200微米的平均粒径。
实施方案25.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述液体包括水。
实施方案26.根据前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：在添加到所述过滤单元之前，将所述生物聚合物复合物悬浮在所述液体中。
实施方案27.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之后立即将所述混合物添加到所述入口。
实施方案28.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质的至少一部分包括聚烯烃类、氟化聚合物类、氯化聚合物类、聚酯类、聚酰胺类、乙酸乙烯酯均聚物类和共聚物类、以及乙酸乙烯酯均聚物类和共聚物类的水解衍生物、聚醚砜类和聚酰亚胺类中的至少一种。
实施方案29.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质的至少一部分是亲水性的。
实施方案30.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质的至少一部分是亲水改性的。
实施方案31.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质是接枝的。
实施方案32.根据实施方案31所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质具有改性表面层，所述改性表面层包含接枝丙烯酸类聚合物，所述接枝丙烯酸类聚合物包含10重量％至100重量％的阳离子或可阳离子电离的单体单元。
实施方案33.根据实施方案32所述的方法，其中所述接枝丙烯酸类聚合物进一步包含聚醚(甲基)丙烯酸酯的二价残基。
实施方案34.根据实施方案32至33中任一项所述的方法，其中所述接枝丙烯酸类聚合物进一步包含0.1重量％至90重量％的至少一种非可电离亲水单体单元。
实施方案35.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述目标非结合分子包含蛋白质、酶或抗体中的至少一种。
实施方案36.一种套件，所述套件包括：
(a)过滤单元，所述过滤单元包括多孔连续过滤介质；和
(b)阳离子聚合物。
实施方案37.一种过滤单元，所述过滤单元包括壳体，所述壳体具有入口、出口和多孔连续过滤介质，所述多孔连续过滤介质流体连接所述入口和所述出口，其中所述多孔连续过滤介质具有正面面积，并且其中过滤容器包括收集区，所述收集区定位在所述入口与所述多孔连续过滤介质之间，其中所述收集区具有每1m2正面面积至少40L的体积。
实施方案38.根据实施方案37所述的过滤器单元，其中所述过滤单元是包括至少一个透镜状装置的壳体，所述透镜状装置包括：
隔板元件；
封边；
其中所述隔板元件包括
中心芯，所述中心芯与所述流体入口流体连通；
第一侧面；和
第二侧面；并且
其中所述过滤单元进一步包括
介质盘，所述介质盘包括多孔连续过滤介质，所述多孔连续过滤介质定位在所述隔板元件的所述第一侧面上并具有外周边缘和内周边缘；
其中所述介质盘的所述外周边缘由所述封边连接，并且所述介质盘的所述内周边缘连接到所述中心芯。
实施例
除非另外指明，否则在实施例和说明书的其余部分中的所有份数、百分数、比率等均按重量计，并且实施例中使用的所有试剂均得自或购自普通化学品供应商，诸如例如密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Company,Saint Louis,Missouri)，或者可以通过常规方法合成。
在这部分中使用以下缩写：cm＝厘米，g＝克，kGy＝千戈瑞，kV＝千伏，L＝升，mL＝毫升，mm＝毫米，mM＝毫摩尔，N＝正常，NMR＝核磁共振，℃＝摄氏度，mol＝摩尔，ppm＝百万分之一，并且IR＝红外。
材料
双丙酮丙烯酰胺和VAZO 67自由基引发剂从密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO)获得。
氨基胍盐酸盐从俄勒冈州波特兰的TCI美国公司(TCI America,Portland,OR)获得。
N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)从肯塔基州卡温顿的亚什兰特种化学品公司(AshlandSpecialty Chemicals,Covington,KY)获得。
甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)从密歇根州米德兰的陶氏化学公司(Dow ChemicalCompany,Midland,MI)获得。
制备例1[PE1；鸟苷酸化聚乙烯亚胺(G-PEI)]
将聚乙烯亚胺(PEI)，MW(分子量)＝60,000g/mol(100克的50重量％水溶液；从比利时海尔的阿克洛斯有机化学品公司(ACROS Organics,Geel,Belgium)获得)加入1L烧瓶中，并将去离子水(259g)加入烧瓶中以将固体含量％降至约25％。将O-甲基异脲半硫酸盐(36.9g)添加到烧瓶中，并将所得溶液在环境温度下机械搅拌约20小时。NMR光谱分析指示转化为其中PEI的25％的胺基(主要是伯胺基)转化为胍的所需产物。浓盐酸(38g)用于将混合物滴定至约pH 7(使用pH纸测量)。使用梅特勒托利多(Mettler Toledo)水分天平分析仪(型号HR73，获自俄亥俄州哥伦布市的梅特勒托利多公司(Mettler Toledo Corporation,Columbus,OH))确定固体百分比为21.0％。
制备例2[PE2；聚(双丙酮丙烯酰胺丙脒腙(pDAAGH)]
将双丙酮丙烯酰胺(160g)、乙醇(240g)和VAZO 67自由基引发剂(0.8g)装入具有热电偶套管端口的1000mL折痕圆底3颈烧瓶中。反应烧瓶配备有顶置式搅拌器、氮气入口和冷水冷凝器。用缓慢氮气流吹扫混合物5分钟，并且然后在60℃下(使用加热套)伴随搅拌加热20小时，以使单体转化为聚合物。添加乙醇(133g)以稀释聚合物溶液至约30重量％。将该聚合物溶液的一部分(253.3g)置于配备有顶置式搅拌器的圆底烧瓶中。将盐酸氨基胍(49.7g)溶解于去离子水(150g)中，并且然后添加到反应烧瓶中。添加浓盐酸(0.5mL)，并且在环境温度下搅拌溶液20小时。IR光谱法和1H-NMR分析确认形成了聚(双丙酮丙烯酰胺丙脒腙)。接着将反应混合物置于真空中以去除大部分乙醇；通过添加1N NaOH中和至pH 7；并且最后通过添加去离子水调节至约20％固体。
制备例3[PE-3；聚(氯化二烯丙基二甲基铵)(pDADMAC)]
聚(氯化二烯丙基二甲基铵)(pDADMAC)(平均MW 400,000-500,000g/mol；20重量％水溶液)溶液从西格玛-奥德里奇公司获得，并且在去离子水中稀释至10重量％。
制备例4.非织造过滤介质
使用TOTAL 3860X聚丙烯酸树脂(从德克萨斯州迪尔帕克的道达尔石化公司(Total Petrochemicals USA,Deer Park,TX)获得)来制备熔喷聚丙烯微纤维非织造片材。非织造片材具有4.2微米的有效纤维直径、200克每平方米的基重、10％的密实度、12微米的平均孔径和0.9mm的基底厚度。
制备例5.非织造过滤介质
使用TOTAL 3860X聚丙烯树脂来制备熔喷聚丙烯微纤维非织造片材。非织造片材具有8微米的有效纤维直径、200克每平方米的基重、10％的密实度、24微米的平均孔径和1.6mm的基底厚度。
制备例6.非织造过滤介质
使用TOTAL 3860X聚丙烯树脂来制备熔喷聚丙烯微纤维非织造片材。非织造片材具有16微米的有效纤维直径、200克每平方米的基重、10％的密实度、47微米的平均孔径和1.8mm的基底厚度。
制备例7.共聚物接枝的非织造过滤介质
在手套箱中，在氮气氛下清除制备例4的非织造基底(21.6cm乘21.6cm)样品的空气。一旦氧气水平达到<20ppm，将非织造基底插入塑料袋中并密封。
将按重量计含有12％NVP、4％GMA、84％去离子水的单体接枝溶液(150克)添加到玻璃广口瓶中。将广口瓶封盖并用手摇动以混合内容物。然后打开广口瓶，并用氮气使溶液鼓泡2分钟以从溶液中去除任何溶解的氧气。将广口瓶再封盖并转移到低氧手套箱中。然后移除广口瓶盖以冲洗来自广口瓶顶部空间的任何残留空气。
从手套箱中取出含有非织造样品的密封袋，并且通过使该密封袋在大约5.5米/分钟的速度和300kV的加速电压下以单程操作穿过CB-300电子束设备(马萨诸塞州威明顿的能源科学公司(Energy Sciences,Inc.,Wilmington,MA))，从而使其经受40kGy剂量水平的照射。然后将含有经照射的非织造样品的袋放回手套箱中。
将单体接枝溶液添加到含有非织造样品的塑料袋中。将袋密封并使用手动辊将溶液分配成遍布非织造样品，使得非织造片材被溶液均匀地覆盖。将袋密封并使非织造样品在袋中保持平坦达3小时。将所得共聚物接枝非织造样品从袋中取出并在去离子水中煮沸一小时。将样品从水浴中取出，并且在室温下风干24小时。从干燥样品冲压出盘(直径为25mm)。
制备例8.共聚物接枝的非织造过滤介质
遵循与制备例7中所述的相同的接枝程序，不同之处在于从制备例5的非织造过滤介质制备共聚物接枝的非织造过滤介质。
CHO细胞培养物制备
在READYTOPROCESS WAVE 25生物反应器(伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司(GE Healthcare,Chicago,IL))中使用补料分批工艺历经10至12天制备产单克隆抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。将80％活力下的培养物收获到2L无菌培养基瓶中。将收获的细胞培养物在4℃下冷藏过夜以沉淀细胞和细胞碎片。通过将上清液泵出容器来获得浓缩的生物质。通过在PCV细胞计数管(从西格玛-奥德里奇公司获得)中用定角转子以2,500rcf(相对离心力)离心200微升CHO细胞培养物1分钟来确定浓缩生物质的红细胞压积(PCV)。使用上清液将PCV调节至所需水平。将CHO培养物在4℃下储存长达3天。
生物聚合物复合物的粒度测量
将如上所述制备的五十毫升CHO细胞培养物(8％ PCV)加入到玻璃烧杯中并使用磁力搅拌棒以100rpm搅拌。将选自制备例1-制备例3的单一聚合物在水中稀释至10重量％。使用微通道移液管将稀释的聚合物样品在90秒时间内添加到搅拌的CHO细胞培养物中，以达到0.1重量％的最终浓度。将混合物搅拌15分钟，同时测量所得生物聚合物复合物的粒度。将聚焦束反射测量探针(ParticleTrack G400；俄亥俄州哥伦布市的梅特勒托利多公司(Mettler Toledo,Columbus,OH))插入液体中达2英寸深度，使其不位于涡旋中。使用iCFBRM 4.4软件(梅特勒托利多公司)追踪和评估粒度。表1中报告了在15分钟时间点测量的平均粒度(微米)。
表1.
实施例1
将五十毫升CHO细胞培养物(8％ PCV)加入到玻璃烧杯中并使用磁力搅拌棒以100rpm搅拌。将制备例1的G-PEI聚合物在水中稀释至10重量％。使用微通道移液管将稀释的聚合物样品在90秒时间内添加到搅拌的CHO细胞培养物中，以达到0.1重量％的最终浓度。持续搅拌15分钟后，将所得生物聚合物复合物悬浮液立即递交到过滤单元(如下文描述)用于进一步处理。
将根据制备例4制备的非织造过滤介质的25mm盘插入过滤单元中。使用O形环将盘保持在适当位置，从而产生284mm2的暴露的盘正面面积。过滤单元包含直的、圆柱形聚碳酸酯主体，其中盖连接到过滤单元主体的一端。盖含有入口端口和排气端口。相反端含有带有活塞的出口端口。收集区为81L每1m2正面面积。压力传感器置于入口端口的上游。使用连接到入口端口的具有MASTERFLEX L/S PharMed BPTflex 16号管的PendoTech(新泽西州普林斯顿(Princeton,NJ))常规流量过滤系统(伊利诺伊州弗农希尔斯的科尔帕默公司(Cole-Parmer Company,Vernon Hills,IL))，将生物聚合物复合物悬浮液以2毫升/分钟泵送到过滤单元中。过滤单元以倒置位置操作(即，过滤单元以垂直取向与入口端口上方的出口端口对准，使得泵送的液体以与重力方向相反的方向流过基材)。将滤液通过出口端口收集到接收容器中。当(a)入口压力达到5psi(磅每平方英寸或34千帕)或(b)在单元中没有观察到可见液体并且历经2分钟没有观察到液体离开出口端口时，停止收集滤液。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表2中。
使用Hach 2100AN浊度计(科罗拉多州拉夫兰的哈希公司(Hach Company，Loveland，CO))测量收集的滤液的浊度。通过以下公式确定产率：
产率(％)＝[(回收的滤液体积)/(细胞培养液体积)]×100。
通过将细胞培养物的初始体积乘以PCV值来确定细胞培养液的体积。
实施例2
遵循与实施例1中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例5的非织造过滤介质代替制备例4的非织造基底。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表2中。
实施例3
遵循与实施例1中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例6的非织造过滤介质代替制备例4的非织造基底。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表2中。
实施例4
遵循与实施例1中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例7的共聚物接枝的非织造过滤介质代替制备例4的非织造过滤介质。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表2中。
实施例5
遵循与实施例1中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例8的共聚物接枝的非织造过滤介质代替制备例4的非织造过滤介质。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表2中。
实施例6
遵循与实施例1中所述的相同的程序，不同之处在于使用尼龙膜(尼龙6,6，单增强层三区膜，标称孔径0.8微米，来自康涅狄格州梅里登的3M净化公司(3M Purification，Inc.，Meriden，CT的#080ZN))代替制备例4的非织造过滤介质。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表2中。
实施例7
遵循与实施例1中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例2的pDAAGH聚合物代替制备例1的G-PEI聚合物来制备生物聚合物复合物悬浮液。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表2中。
比较例A
遵循与实施例1中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例3的pDADMAC聚合物代替制备例1的G-PEI聚合物来制备生物聚合物复合物悬浮液。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表2中。
表2.产率和浊度结果，其中液体的流在与重力方向相反的方向上
| 实施例 | 阳离子聚合物 | 过滤介质 | 收率(％) | 滤液浊度(NTU) |
| 实施例1 | PE1(G-PEI) | 制备例4 | 93 | 17 |
| 实施例2 | PE1(G-PEI) | 制备例5 | 66 | 25 |
| 实施例3 | PE1(G-PEI) | 制备例6 | 76 | 20 |
| 实施例4 | PE1(G-PEI) | 制备例7 | 68 | 16 |
| 实施例5 | PE1(G-PEI) | 制备例8 | 76 | 22 |
| 实施例6 | PE1(G-PEI) | 尼龙膜 | 87 | 2 |
| 实施例7 | PE2(pDAAGH) | 制备例4 | 81 | 6 |
| 比较例A | PE3(pDADMAC) | 制备例4 | 69 | 384 |
实施例8
遵循与实施例1中所述的相同的程序，不同之处在于将液体以2mL/分钟泵送到过滤单元中，其中过滤单元以水平位置操作(即过滤单元以水平取向放置，使得泵送的液体在垂直于重力方向的方向上流过基底)。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表3中。
实施例9
遵循与实施例8中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例2的pDAAGH聚合物代替制备例1的G-PEI聚合物来制备生物聚合物复合物悬浮液。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表3中。
比较例B
遵循与实施例8中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例3的pDADMAC聚合物代替制备例1的G-PEI聚合物来制备生物聚合物复合物悬浮液。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表3中。
表3.产率和浊度结果，其中液体的流垂直于重力方向
| 实施例 | 阳离子聚合物 | 收率(％) | 滤液浊度(NTU) |
| 实施例8 | PE1(G-PEI) | 94％ | 18 |
| 实施例9 | PE2(pDAAGH) | 82％ | 29 |
| 比较例B | PE3(pDADMAC) | 85％ | 67 |
实施例10
遵循与实施例1中所述的相同的程序，不同之处在于液体以45°角泵送通过基底(即过滤单元如图2中所示以角度θ＝45°对准)。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表4中。
实施例11
遵循与实施例10中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例2的pDAAGH聚合物代替制备例1的G-PEI聚合物来制备生物聚合物复合物悬浮液。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表4中。
比较例C
遵循与实施例10中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例3的pDADMAC聚合物代替制备例1的G-PEI聚合物来制备生物聚合物复合物悬浮液。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表4中。
表4.产率和浊度结果，其中液体的流与重力方向成约45度
| 实施例 | 阳离子聚合物 | 收率(％) | 滤液浊度(NTU) |
| 实施例10 | PE1(G-PEI) | 94％ | 18 |
| 实施例11 | PE2(pDAAGH) | 82％ | 29 |
| 比较例C | PE3(pDADMAC) | 105％ | 2680 |
实施例12.具有不同收集区体积的过滤单元
遵循与实施例1中所述的相同的程序，不同之处在于所测试的过滤单元具有不同的尺寸并且具有不同的收集区。对具有每1m2正面面积32L、81L、116L和162L的收集区的四种不同过滤单元进行评估。对每个过滤单元进行单个试验。所回收滤液的滤液通过量(L/1m2正面面积)和浊度(NTU)的结果报告于表5中。滤液通过量计算为收集的滤液体积除以非织造盘的正面面积。
表5.产率和浊度结果，其中液体的流在与重力方向相反的方向上
比较例D
遵循与实施例1中所述的相同的程序，不同之处在于，过滤单元以竖直位置操作，其中入口端口定向在出口端口上方，使得泵送的液体在与重力方向相同的方向上(换句话讲，θ＝0)流过基底。进行了单个试验。由于入口压力达到5psi，停止滤液收集。产率(％)结果报告于表6中。无法测量滤液的浊度，因为回收不到足量的滤液用于测试。
比较例E
遵循与比较例D中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例2的pDAAGH聚合物代替制备例1的G-PEI聚合物来制备生物聚合物复合物悬浮液。进行了单个试验。由于入口压力达到5psi，停止滤液收集。产率(％)结果报告于表6中。无法测量滤液的浊度，因为回收不到足量的滤液用于测试。
比较例F
遵循与比较例D中所述的相同的程序，不同之处在于使用制备例3的pDADMAC聚合物代替制备例1的G-PEI聚合物来制备生物聚合物复合物悬浮液。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表6中。
表6.产率和浊度结果，其中液体的流在与重力相同的方向上
| 实施例 | 阳离子聚合物 | 收率(％) | 滤液浊度(NTU) |
| 比较例D | PE1(G-PEI) | 4％ | NM |
| 比较例E | PE2(pDAAGH) | 3％ | NM |
| 比较例F | PE3(pDADMAC) | 94％ | 2606 |
NM＝未测量
在不脱离本发明的范围和实质的情况下，本发明的可预知修改和更改对于本领域技术人员而言将显而易见。本发明不应受限于本申请中为了说明目的所示出的实施方案。如果在所写的本说明书和以引用方式并入本文的任何文档中的公开内容之间存在任何冲突或矛盾，则将以所写的本说明书为准。
Claims (20)
1.一种从包含结合物质的水性生物组合物中纯化目标非结合分子的方法，所述方法包括：
(e)使阳离子聚合物和所述水性生物组合物接触以形成混合物，所述混合物在液体中包含生物聚合物复合物和所述目标非结合分子，其中所述生物聚合物复合物具有至少50微米的平均粒径；
(f)提供过滤单元，所述过滤单元包括：(i)具有入口和出口的壳体，(ii)与所述入口和所述出口流体连接的多孔连续过滤介质，以及(iii)相对于所述多孔连续过滤介质位于上游的收集区；
(g)将所述混合物添加到所述入口；以及
(h)允许所述混合物在所述过滤单元中分离，由此所述生物聚合物复合物在所述收集区中收集并且所述目标非结合分子穿过所述过滤介质，并且其中通过所述过滤介质的所述液体的大部分流基本上不平行于重力方向。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质中的孔的平均直径在液体流方向上是对称的。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质具有至少0.1微米并且至多200微米的孔径。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多孔连续介质具有正面面积，并且其中所述收集区具有每1m2正面面积至少40L的体积。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过所述多孔连续过滤介质的所述液体的所述流在与重力反向的方向上。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过所述多孔连续过滤介质的所述液体的所述流在与所述重力方向成30度到90度的方向上。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中流体流的净方向不平行于所述重力方向。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物是水溶性或水分散性聚合物。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物经以下项中的至少一者官能化：
(a)胍基基团，其任选地根据下式：
-[C(R1)＝N-R2]n-N(R3)-[C(＝N-R4)N(R4)]m-R5，
其中
R1为H、C1-C12烷基、C5-C12(杂)芳基、或聚合物链的残基；
R2为共价键、C2-C12(杂)烷亚基或C5-C12(杂)芳亚基；
每个R3独立地为H、C1-C12烷基、或C5-C12(杂)芳基；
每个R4为H、C1-C12烷基或烷亚基、C5-C12(杂)芳基或(杂)芳亚基、氰基、或-C(＝NH)-N(R2)-聚合物；
n为0或1；并且
m为1或2；和
(b)季铵基团。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物衍生自氨基聚合物，任选地，其中所述氨基聚合物选自：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚氨基酰胺、聚烯丙基胺、聚乙烯胺、聚二甲基胺-环氧氯丙烷-乙二胺、和由聚酰胺基胺(PAMAM)和聚丙烯亚胺形成的树枝状大分子。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物衍生自羰基聚合物，任选地，其中所述羰基聚合物选自：丙烯醛、乙烯基甲基酮、乙烯基乙基酮、乙烯基异丁基酮、双丙酮(甲基)丙烯酰胺、丙烯酸丙酮酯、一氧化碳共聚物、和双丙酮(甲基)丙烯酸酯(共)聚合物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每毫升所述水性生物组合物中添加0.01微克至10,000微克的阳离子聚合物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物聚合物复合物的平均粒径为至多200微米。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体包括水。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：在添加到所述过滤单元之前，将所述生物聚合物复合物悬浮在所述液体中。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之后立即将所述混合物添加到所述入口。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质是接枝的。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多孔连续过滤介质具有改性表面层，所述改性表面层包含接枝丙烯酸类聚合物，所述接枝丙烯酸类聚合物包含10重量％至100重量％的阳离子或可阳离子电离的单体单元以及任选的聚醚(甲基)丙烯酸酯的二价残基。
19.一种套件，所述套件包括：
(a)过滤单元，所述过滤单元包括多孔连续过滤介质；和
(b)阳离子聚合物。
20.一种过滤单元，所述过滤单元包括壳体，所述壳体具有入口、出口和多孔连续过滤介质，所述多孔连续过滤介质流体连接所述入口和所述出口，其中所述多孔连续过滤介质具有正面面积，并且其中过滤容器包括收集区，所述收集区定位在所述入口与所述多孔连续过滤介质之间，其中所述收集区具有每1m2所述正面面积至少40L的体积。
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