CN114793436A

CN114793436A - 生物材料纯化的方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN114793436A
Application number: CN202080079392.9A
Authority: CN
Inventors: 克里斯托弗·E·理查森; 丹尼尔·J·欧尼尔; 杰拉尔德·K·拉斯穆森; 安德鲁·W·魏尔
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Current assignee: Shuwanuo Intellectual Property Co
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2022-07-26
Also published as: US20240059731A1; EP4065594A1; WO2021105864A1

Abstract

本文描述了一种从水性生物组合物中纯化目标分子的方法，该方法包括：(a)使阳离子聚合物和该水性生物组合物接触以形成在液体中包含生物聚合物复合物和该目标分子的混合物，其中该生物聚合物复合物的平均粒径为至少45微米；(b)将该混合物添加到容器的过滤体积中，其中该容器包含松散填充的短纤维；(c)使该混合物通过该松散填充的短纤维分离；以及(d)收集包含该目标分子的滤液。

Description

生物材料纯化的方法及其试剂盒

技术领域

公开了一种将所需的生物分子(如抗体、蛋白质、酶等)从水性生物组合物(如来自细胞培养或发酵过程的收集物)中分离的方法。

背景技术

大规模或商业量的治疗有用的目标生物材料(如蛋白质)的制造可以通过生长细胞来完成，该细胞经工程化改造以在生物反应器中的受控条件下产生所需蛋白质。所用的技术涉及例如已经通过重组DNA技术改变的微生物发酵，或者培养已经通过杂交瘤技术改变的哺乳动物细胞。细胞悬浮在发酵液中，其中包含盐、糖、蛋白、和维持特定细胞生长所需的各种因子。期望的产物可由细胞分泌到发酵液中，或者保留在细胞体内。收获的发酵液随后进行加工以回收、纯化、并浓缩期望的产物。

发明内容

通常，细胞培养物和/或发酵产物的收获后处理涉及初级回收步骤，该步骤去除较大的颗粒固体、细胞和细胞碎片(通常通过连续离心或微滤)；以及次级回收步骤，该步骤去除较小的亚微米颗粒(通常是由深度过滤器和随后的膜过滤器构成的两级过滤组)。在此回收之后，然后将包含目标分子的滤液暴露于广泛的下游处理，包括柱色谱法(如蛋白A或阳离子交换)，以产生大量纯化的目标分子。

在生物材料制造方面的进步已经产生具有例如更高抗体滴度的细胞培养物，这提高了细胞培养物密度并延长了培养时间。这体现为更高含量的过程相关杂质，诸如宿主细胞蛋白和DNA、脂质、胶体和细胞碎片。这些更高的杂质含量给目标分子的回收、纯化、和/或浓缩带来挑战。例如，较高的PCV(红细胞压积)浓度会超过堆叠盘离心的容量，并且如果亚微米细胞碎片未被充分去除，则会导致下游过程如深度过滤器和/或膜过滤器的结垢。

因此，本领域需要与目标生物材料(如蛋白质、酶和抗体)的回收、分离和/或纯化有关的改进方法，该方法涉及的程序耗时较少、允许更有效地回收所需产物和/或可以在较低压降下操作。

在一个方面，公开了一种从包含结合物质的水性生物组合物中纯化非结合目标分子的方法，该方法包括：

(a)使阳离子聚合物和该水性生物组合物接触以形成在液体中包含生物聚合物复合物和该目标分子的混合物，其中该生物聚合物复合物的平均粒径为至少45微米，

(b)将该混合物添加到容器的过滤体积中，其中该容器包含松散填充的短纤维；

(c)使该混合物通过该松散填充的短纤维分离；以及

(d)收集包含该目标分子的滤液。

在另一方面，公开了一种试剂盒，其中该试剂盒包含阳离子聚合物和多个松散填充的短纤维。

以上发明内容并非旨在描述每个实施方案。在下面的具体实施方式中还列出了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据本说明书和权利要求书，其它特征、目标和优点将显而易见。

附图说明

图1是含有松散填充的短纤维的示例性过滤容器的横截面图。

应当理解，本领域的技术人员可设计出落入本公开原理的范围和实质内的许多其他修改形式和实施方案。附图可以不按比例绘制。

具体实施方式

如本文所用，术语

“烷基”是指具有一个至约十二个碳原子(C1-C12)的直链或支链、环状或无环的饱和单价烃基，例如甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、戊基等。

“烷亚基”是指具有一个至约十二个碳原子(即C1-C12)的直链饱和二价烃基或具有三个至约十二个碳原子(即C3-C12)的支链饱和二价烃基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、2-甲基亚丙基、亚戊基、亚己基等。

“烯基”是指具有两个至约十二个碳原子(即C2-C12)的直链不饱和单价烃基或具有三个至约十二个碳原子(即C3-C12)的支链不饱和烃基。

“芳基”是指一价芳族，诸如苯基、萘基等。

“胍基”是指选自胍和双胍中的至少一者的官能团。

(杂)烷基包括烷基和杂烷基，后者包含一个或多个链内杂原子，如氧原子或氮原子。它们可以是具有一个至约十二个碳原子的直链或支链、环状或无环的饱和单价部分。

(杂)烷亚基包括二价烷亚基和杂烷亚基，后者包含一个或多个链内杂原子，如氧原子或氮原子。

(杂)芳基包括芳基和杂芳基，后者包含一个或多个链内杂原子，如氧原子或氮原子。

(杂)芳亚基包括二价芳族芳亚基和杂芳亚基，后者包含一个或多个链内杂原子，如氧原子或氮原子。

“一个”，“一种”和“所述”可交换使用并指一个或多个。

“和/或”用于表示一种或两种所述的情况可以发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。

如本文所用，由端点描述的范围包括该范围内所包含的所有数字(例如，1至10包括1.4、1.9、2.33、5.75、9.98等)。

如本文所用，表述“至少一个”包括一个及以上的所有数目(例如，至少2个、至少4个、至少6个、至少8个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个等)。

如本文所用，“包含A、B、和C中的至少一者”是指只包含元素A、只包含元素B、只包含元素C、包含A和B、包含A和C、包含B和C、以及包含所有这三者的组合。

术语“水性生物组合物”是指包含所有生物来源的所需大分子以及不期望的大分子的任何水性组合物。组合物不必完全是生物来源的。在一个实施方案中，水性生物组合物是发酵或细胞培养过程的收获流体。

所需的生物来源大分子是待分离和/或纯化的目标分子。此类目标分子包括(例如)蛋白质，如酶、抗体或其它所需蛋白质。通常，目标分子(也称为非结合目标分子)在所需流体(如水性生物组合物或水性缓冲溶液)的pH下是阳离子性的。在一个实施方案中，本公开的方法可用于将阳离子蛋白，更优选地为单克隆抗体与收获流体的不期望组分分离。

水性生物组合物还包含各种近中性或带负电荷的生物来源大分子，如全细胞和不溶性细胞碎片，以及可溶性杂质，包括蛋白质杂质，如宿主细胞蛋白、DNA和染色质，它们需要与目标分子分离。这些物质有时由于其与阳离子基团结合的倾向而被称为结合物质。

细胞碎片通常是指裂解(破裂)细胞的组分，包括细胞壁脂质、细胞器(例如线粒体、溶酶体、囊泡等)和蛋白质性聚集体。通常细胞碎片较大，主要是带负电荷的材料，能够堵塞过滤器。浊度是用于测量流体中细胞碎片浓度的一种方式，其中浊度值越高，存在的细胞碎片越多。例如，在一个实施方案中，水性生物组合物的浊度为至少100、200、500或甚至1000NTU(比浊法浊度单位)且至多6000、5000、4000、3000或甚至2000NTU。在一些实施方案中，水性生物组合物中的固体含量太大而导致无法测量浊度。

通常带负电荷的细胞和细胞碎片包括源自古细菌、细菌和真核生物的那些。细菌包括但不限于革兰氏阴性菌，如假单胞菌(Pseudomonas)种、大肠杆菌(Escherichiacoli)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)和粘质沙雷氏菌(Serratia marcesens)；革兰氏阳性菌，如葡萄球菌(Staphylococcus)种、肠球菌(Enterococcus)种、梭菌(Clostridium)种、芽孢杆菌(Bacillus)种和乳酸杆菌(Lactobacillus)种；通常不用革兰氏方法染色的细菌，如分枝杆菌(Mycobacterium)种和细菌的非营养形式如孢子。真核生物包括(但不限于)动物细胞、藻类、杂交瘤细胞、干细胞、癌症细胞、植物细胞、真菌菌丝、真菌孢子、酵母细胞、寄生生物、寄生卵囊、昆虫细胞和蠕虫。蛋白包括但不限于天然蛋白、重组蛋白、酶和宿主细胞蛋白。病毒包括(但不限于)有包膜病毒种类，例如疱疹病毒、痘病毒、腺病毒、乳多泡病毒、冠状病毒、还原病毒(例如HIV)和原生病毒；和无包膜类，例如杯状病毒、覆盖噬菌体，肌病毒和小核糖核酸病毒。

具有近中性或负电荷的不需要的蛋白质(如蛋白质杂质和宿主细胞蛋白)通常也存在于水性生物组合物中。在一个实施方案中，水性生物组合物的宿主细胞蛋白浓度为至少50,000；100,000或者甚至200,000ng/mL并且至多2,000,000；1,000,000ng/mL；或者甚至500,000ng/mL(纳米/毫升)。这些可溶蛋白天然较小，并且需要与目标分子分离。

DNA是核苷酸序列，它是细胞复制的蓝图，也可以存在于水性生物组合物中并且也带负电荷。在一个实施方案中，水性生物组合物具有至少10⁵皮克/毫升、10⁶皮克/毫升、10⁷皮克/毫升、10⁸皮克/毫升或者甚至10⁹皮克/毫升的DNA浓度。

这些以上提到的生物材料，包括其它生物材料如细菌孢子、核酸、内毒素和病毒需要在治疗用途之前与目标分子分离。

通常，水性生物组合物是缓冲溶液，其抵抗pH变化。在一个实施方案中，水性生物组合物具有高盐浓度。术语“盐”意在包括有助于溶液电导率的所有低分子量离子。生物药物或酶制造中使用的许多工艺溶液具有15mS/cm-30mS/cm(毫西门子/厘米)(约150mM-300mM盐)或更大的电导率。

在一些实施方案中，水性生物组合物具有至少5重量％、8重量％、10重量％或甚至15重量％和高达20重量％的填充细胞体积。

水性生物组合物的液体部分主要是水。通常，水性生物组合物基本上不含(即，小于1重量％、0.5重量％、0.1重量％或甚至0.05重量％或甚至不可检测)有机溶剂。

在一个实施方案中，目标分子是以至少0.1克/升(g/L)、0.2克/升(g/L)、0.5克/升(g/L)、1克/升(g/L)、2克/升(g/L)、4克/升(g/L)、6克/升(g/L)或甚至10克/升(g/L)的浓度存在于水性生物组合物中。在一个实施方案中，生物来源的所需大分子以至多10g/L、12g/L、15g/L、18g/L或甚至20g/L的浓度存在于水性生物组合物中。在一些实施方案中，生物来源的所需大分子的浓度在水性生物组合物中甚至高于20g/L。

本公开涉及一种从水性生物组合物中分离目标生物分子的方法。上文所描述的初级和/或二级回收步骤可以由本文公开的方法替代，其中阳离子聚合物用于使来自水性生物组合物的近中性和/或带负电荷的生物材料絮凝，形成生物聚合物复合物。然后使用松散填充的短纤维床将生物聚合物复合物与包含目标生物分子的水性液体分离。

使阳离子聚合物与水性生物组合物接触。阳离子聚合物包含具有结合生物来源的近中性或带负电荷大分子(如全细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、DNA等)所需的亲和力的基团，该大分子与阳离子聚合物结合形成生物聚合物复合物。

本文公开的阳离子聚合物是水溶性或水分散性的。如本文所用，术语“水溶性”是指可在水中溶解的材料。溶解度通常为至少约0.1克/毫升水。如本文所用，术语“水分散性”是指非水溶性，但可以在水中乳化或悬浮的物质。阳离子聚合物还包含与聚合物主链连接(例如，间接或直接共价键合)的官能团，其中该官能团是具有足够碱性从而在pH为5.0-8.0的水性介质中基本上是质子化的胍基。例如，合适的此类碱性基团包括其质子化阳离子形式在水中的pK_a为至少9，优选至少10，并且更优选至少12.5的基团，或者意味着该基团能够被水质子化。

在一个实施方案中，阳离子聚合物包含至少一个根据式(I)的含胍基侧链：

-[C(R¹)＝N-R²]_n-N(R³)-[C(＝N-R⁴)N(R⁴)]_m-R⁵(I)

在式(I)中，基团R¹为氢、C1-C12(杂)烷基、或C5-C12(杂)芳基或聚合物链的残基。基团R²为共价键、C2-C12(杂)烷亚基或C5-C12(杂)芳亚基。基团R³为氢、C1-C12(杂)烷基或C5-C12(杂)芳基，或者当n为0时可为聚合物链的残基。每个基团R⁴独立地为氢、C1-C12(杂)烷基或C5-C12(杂)芳基。基团R⁵为氢、C1-C12(杂)烷基、C5-C12(杂)芳基或-N(R⁴)₂。变量n等于0或1，取决于用于形成含胍基的聚合物的前体聚合物。变量m等于1或2，取决于阳离子基团是胍基还是二胍基基团。

大多数阳离子聚合物具有多于一个含胍基的侧链基团。含胍基的侧链基团的数量可根据用于制备阳离子聚合物的方法而变化。在一些实施方案中，阳离子聚合物包含至少1个、2个、4个或甚至5个含胍基的侧链基团。在一些实施方案中，阳离子聚合物包含至多10个、20个、40个、60个、80个、100个、200个、500个或甚至1000个含胍基的侧链基团。

含胍基的阳离子聚合物可衍生自含氨基的聚合物和/或含羰基的聚合物。

在一些实施方案中，通过含氨基的聚合物前体与鸟苷酸化剂的反应来制备阳离子聚合物。此类含胍基的聚合物和其制造方法可见于(例如)美国专利第10,087,405号(Swanson等人)中，该专利通过引用并入本文。当使用含氨基的聚合物时，通常式(I)中的n为0。

适合使用的含氨基聚合物的示例包括但不限于聚乙烯胺、聚(N-甲基乙烯胺)、聚烯丙基胺、聚烯丙基甲胺、聚二烯丙基胺、聚(4-氨基甲基苯乙烯)、聚(4-氨基苯乙烯)、聚(丙烯酰胺-共-甲基氨基丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯酰胺-共-氨基乙基甲基丙烯酸酯)、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚赖氨酸、聚氨基酰胺和聚二甲基胺-环氧氯丙烷-乙二胺。

具有伯氨基或仲氨基端基的其它可用的含氨基的聚合物包括但不限于由聚酰胺基胺(PAMAM)和聚丙烯亚胺形成的树枝状大分子(高支化聚合物)。由PAMAM形成的示例性树枝状大分子材料可以商品名STARBURST(PAMAM)树枝状大分子”(例如，具有4个伯氨基的0代、具有8个伯氨基的1代、具有16个伯氨基的2代、具有32个伯氨基的3代和具有64个伯氨基的4代)从威斯康星州密尔沃基的奥德里奇化学公司(Aldrich Chemical(Milwaukee,WI))商购获得。由聚丙烯亚胺形成的树枝状大分子材料可以商品名DAB-Am从奥德里奇化学公司商购获得。例如，DAB-Am-4是具有4个伯氨基的1代聚丙烯亚胺四胺树枝状大分子，DAB-Am-8是具有8个伯氨基的2代聚丙烯亚胺八胺树枝状大分子，DAB-Am-16是具有16个伯氨基的3代聚丙烯亚胺十六胺树枝状大分子，DAB-Am-32是具有32个伯氨基的4代聚丙烯亚胺三十二胺树枝状大分子，而DAB-Am-64是具有64个伯氨基的5代聚丙烯亚胺六十四胺树枝状大分子。

作为生物聚合物的合适的含氨基的聚合物的示例包括脱乙酰壳多糖以及淀粉，所述淀粉用试剂诸如甲基氨基氯乙烷接枝。

含氨基的聚合物的其他示例包括聚丙烯酰胺均聚物或共聚物以及含氨基的聚丙烯酸酯均聚物或共聚物，它们是用包含含氨基的单体(诸如氨基烷基(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺烷基胺和二烯丙基胺)的单体组合物制备的。

合适的可商购获得的含氨基的聚合物包括但不限于可以商品名ANQUAMINE(例如，ANQUAMINE 360、401、419、456和701)从宾夕法尼亚州阿伦敦的空气产品和化学品公司(AirProducts and Chemicals(Allentown,PA))获得的聚酰胺基胺，可以商品名LUPASOL(例如，LUPASOL FG、PR 8515、Waterfree、P和PS)从纽约州伦斯勒的巴斯夫公司(BASFCorporation(Resselaer,NY))获得的聚乙烯亚胺聚合物，诸如可以商品名CORCAT P-600从南卡罗来纳州威利湖的EIT公司(EIT Company(Lake Wylie,SC))获得的聚乙烯亚胺聚合物，以及聚酰胺树脂，诸如可以商品名VERSAMID系列树脂从俄亥俄州辛辛那提的科宁公司(Cognis Corporation(Cincinnati,OH))获得的聚酰胺树脂，这些树脂通过二聚不饱和脂肪酸与烷亚基多胺反应形成。

在一些实施方案中，可能有利的是使含氨基的聚合物前体反应以提供除含胍基的基团之外的其他配体或基团。例如，可用的是包含疏水性配体、离子配体或氢键合配体。

可易于通过本领域熟知的烷化或酰化过程，将附加配体掺入含氨基的聚合物中。例如，可使用卤化物、磺酸盐和硫酸盐置换反应或使用环氧化物开环反应，使含氨基聚合物的氨基发生反应。用于这些反应的可用的烷基化剂包括例如，硫酸二甲酯、丁基溴、丁基氯、苄基溴、十二烷基溴、2-氯乙醇、溴乙酸、2-氯乙基三甲基氯化铵、氧化苯乙烯、缩水甘油基十六烷基醚、缩水甘油基三甲基氯化铵和缩水甘油基苯基醚。可用的酰化剂包括(例如)酰基氯和酸酐，诸如苯甲酰氯、乙酸酐、琥珀酸酐和癸酰基氯，以及异氰酸酯，诸如三甲基甲硅烷基异氰酸酯、异氰酸苯酯、异氰酸丁酯和异硫氰酸丁酯。在这些实施方案中，可使含氨基的聚合物的可用氨基的0.1摩尔％至20摩尔％，优选地2摩尔％至10摩尔％烷基化和/或酰化。

在一些实施方案中，通过含羰基聚合物和合适的与羰基反应的鸟苷酸化剂的反应来制备阳离子聚合物。此类含羰基聚合物和其制造方法可见于(例如)美国专利第10,087,405号(Swanson等人)中，该专利通过引用并入本文。

当使用含羰基聚合物时，通常式(I)中的n为1，并且该聚合物包含基团—C(O)-R¹，该基团可与鸟苷酸化剂反应。羰基-C(O)-R¹为醛基(当R¹为氢时)或酮基(当R¹为(杂)烷基或(杂)芳基时)。虽然羰基可以是聚合物主链的一部分或来自聚合物主链的侧基的一部分，但其通常是侧基。

在一些实施方案中，含羰基的聚合物为单体组合物的聚合产物，所述单体组合物包含具有羰基基团、优选地具有酮基基团的烯键式不饱和单体。具有羰基基团的合适的单体包括但不限于丙烯醛、乙烯基甲基酮、乙烯基乙基酮、乙烯基异丁基酮、异丙烯基甲基酮、乙烯基苯基酮、二丙酮(甲基)丙烯酰胺、丙烯酸丙酮酯和(甲基)丙烯酸乙酰乙酰氧基乙酯。

在其他实施方案中，含羰基聚合物为单体组合物的聚合产物，该单体组合物包含一氧化碳及一种或多种烯键式不饱和单体(即，含羰基聚合物为一氧化碳共聚物)。含一氧化碳的共聚物的示例为ELVALOY 741，其为乙烯/乙酸乙烯基酯/一氧化碳的三元共聚物，得自美国特拉华州威尔明顿的杜邦公司(DuPont(Wilmington,DE,USA))。

除了一氧化碳和/或具有羰基基团(例如，酮基基团)的烯键式不饱和单体之外，用于形成该含羰基的聚合物的单体组合物可任选地还包含烯键式不饱和亲水单体单元。如本文所用，“亲水单体”是具有至少1重量％、优选地至少5重量％的水混溶性(单体中的水)而没有达到浊点的那些可聚合的单体，并且不包含将妨碍生物物质结合到配体基团的官能团。含羰基的聚合物可包含例如单体组合物中0至90重量％的亲水单体。当存在时，基于单体组合物的总重量计，亲水单体可以1重量％至90重量％、1重量％至75重量％、1重量％至50重量％、1重量％至25重量％、或1重量％至10重量％范围内的量存在。

亲水单体的亲水基团可为中性的和/或具有正电荷。具有离子基团的亲水单体可为中性的或带电的，具体取决于pH条件。亲水单体通常用于向含羰基的聚合物赋予所需亲水性(即水溶性或分散性)。

能够提供正电荷的一些示例性亲水单体是式(II)的氨基(甲基)丙烯酸酯类或氨基(甲基)丙烯酰胺类或者它们的季铵盐。季铵盐的抗衡离子通常是卤离子、硫酸根、磷酸根、硝酸根等等。

在式(II)中，基团X为氧基(即，–O-)或–NR³-，其中R³为氢、C₁-C₁₂(杂)烷基或C₅-C₁₂(杂)芳基。基团R⁶为C₂至C₁₀中的任，优选地C₂-C₆中的任。基团R⁷独立地为氢或甲基。每个R⁸独立地为氢、烷基、羟烷基(即被羟基取代的烷基)、或氨基烷基(即被氨基取代的烷基)。另选地，两个R⁸基团与它们所连接的氮原子合在一起可形成芳族的、部分不饱和(即不饱和但不是芳族的)或饱和的杂环基团，其中该杂环基团可任选地稠合至芳族的另一个环(例如，苯)、部分不饱和的另一个环(例如，环己烯)或饱和的另一个环(例如，环己烷)。

应当理解，对于式(II)，所描绘的烯键式不饱和(甲基)丙烯酰基(CH₂＝C(R⁷)-C(O)-基团)可被反应性降低的另一个烯键式不饱和基团(如乙烯基、乙烯氧基、烯丙基、烯丙氧基和乙炔基)取代。

在式(II)的一些实施方案中，两个R⁸基团都为氢。在其他实施方案中，一个R⁸基团为氢并且另一个为具有1至10个、1至6个、或1至4个碳原子的烷基。在其他实施方案中，至少一个R⁸基团为含有1至10个、1至6个、或1至4个碳原子的羟烷基或氨基烷基，其中羟基或氨基基团位于烷基基团的碳原子中的任何一个上。在其他实施方案中，R⁸基团与它们所连接的氮原子组合成以形成杂环基团。杂环基团包括至少一个氮原子并且可含有其他杂原子，诸如氧或硫。示例性的杂环基团包括但不限于咪唑基。杂环基团可被稠合至另外的环，诸如苯、环己烯或环己烷。被稠合至另一环上的示例性杂环基团包括但不限于苯并咪唑基。

示例性氨基丙烯酸酯(即，式(II)中“X”为氧基)包括(甲基)丙烯酸N,N-二烷基氨基烷基酯，诸如(例如)(甲基)丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯、丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯、丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸N,N-二甲基氨基丙酯、(甲基)丙烯酸N-叔丁基氨基丙酯等。

示例性氨基(甲基)丙烯酰胺(即，式(II)中的“X”为-NR³-)包括例如N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)丙烯酰胺、N-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、N-[3-(二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺、N-(3-咪唑基丙基)甲基丙烯酰胺、N-(3-咪唑基丙基)丙烯酰胺、N-(2-咪唑基乙基)甲基丙烯酰胺、N-(1,1-二甲基-3-咪唑基丙基)甲基丙烯酰胺、N-(1,1-二甲基-3-咪唑基丙基)丙烯酰胺、N-(3-苯并咪唑基丙基)丙烯酰胺和N-(3-苯并咪唑基丙基)甲基丙烯酰胺。

式(II)的单体的示例性季盐包括但不限于(甲基)丙烯酰胺基烷基三甲基铵盐(例如3-甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵和3-丙烯酰胺基丙基三甲基氯化铵)和(甲基)丙烯酰氧基烷基三甲基铵盐(例如2-丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵、2-甲基丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵、3-甲基丙烯酰氧基-2-羟丙基三甲基氯化铵、3-丙烯酰氧基-2-羟丙基三甲基氯化铵和2-丙烯酰氧基乙基三甲基硫酸甲酯铵)。

可以向聚合物提供带正电荷基团的其它单体包括链烯吖内酯的二烷基氨基烷基氨加合物(如乙烯基二甲基吖内酯的2-(二乙基氨基)乙胺、(2-氨基乙基)三甲基氯化铵和3-(二甲基氨基)丙胺加合物)和二烯丙基胺单体(如二烯丙基氯化铵和二烯丙基二甲基氯化铵)。

在一些优选实施方案中，任选的亲水单体可具有烯键式不饱和基团，诸如(甲基)丙烯酰基团和聚(环氧烷)基团。例如，亲水单体可为聚(环氧烷)单(甲基)丙烯酸酯化合物，其中末端为羟基或烷基醚基团。此类单体由通式(III)表示。

R⁹-O-(CH(R⁹)-CH₂-O)_p-C(O)-C(R⁹)＝CH₂

(III)

在式(III)中，每个R⁹独立地为氢或C₁-C₄烷基。变量p为至少2，诸如例如2至100、2至50、2至20、或2至10。

在一个实施方案中，含羰基聚合物包含聚(环氧烷)基团(描绘为-(CH(R⁹)-CH2-O)_p-)，其中聚(环氧烷)基团是聚(环氧乙烷)。在另一个实施方案中，聚(环氧烷)基团是聚(环氧乙烷-共-环氧丙烷)。此类共聚物可为嵌段共聚物、无规共聚物或梯度共聚物。

合适的亲水单体的其他代表性示例包括但不限于(甲基)丙烯酸2-羟乙酯；N-乙烯基吡咯烷酮；N-乙烯基己内酰胺；丙烯酰胺；单或二-N-烷基取代的丙烯酰胺；叔丁基丙烯酰胺；二甲基丙烯酰胺；N-辛基丙烯酰胺；聚(烷氧基烷基)(甲基)丙烯酸酯，其包括(甲基)丙烯酸2-(2-乙氧基乙氧基)乙酯、(甲基)丙烯酸2-乙氧基乙酯、(甲基)丙烯酸2-甲氧基乙氧基乙酯、甲基丙烯酸2-甲氧基乙酯、聚乙二醇单(甲基)丙烯酸酯；烷基乙烯基醚，包括乙烯基甲基醚；以及它们的混合物。优选的亲水单体包括选自二甲基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸2-羟乙酯和N-乙烯基吡咯烷酮的那些。

在一些实施方案中，用于形成含羰基的聚合物的单体组合物可任选地包括疏水单体。如本文所用，术语“疏水单体”是指这样的单体，其具有小于1重量％的水混溶性(单体中的水)。疏水单体的用量不会不利地影响含胍基的单体聚合物的结合性能和/或含胍基的聚合物的水分散性。当存在时，基于单体组合物中的单体的总重量计，疏水单体通常以1重量％至20重量％、1重量％至10重量％、或1重量％至5重量％范围内的量存在。

疏水单体的可用类别包括丙烯酸烷基酯和酰胺，示例为含有C₁-C₃₀烷基的烷基酯和含有C₁-C₃₀烷基的单烷基丙烯酰胺或二烷基丙烯酰胺的直链、环状和支链异构体。丙烯酸烷基酯的可用的具体示例包括：丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异戊酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸正庚基酯、丙烯酸异冰片酯、丙烯酸正辛酯、丙烯酸异辛酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸异壬酯、丙烯酸癸酯、丙烯酸十一烷基酯、丙烯酸十二烷基酯、丙烯酸月桂酯、丙烯酸十三烷基酯和丙烯酸十四烷基酯。烷基丙烯酰胺的可用的具体示例包括可使用的具有戊基、己基、庚基、异冰片基、辛基、2-乙基己基、异壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基和十四烷基的单烷基丙烯酰胺和二烷基丙烯酰胺。可使用对应的甲基丙烯酸酯。

另外的可用类别的疏水单体还包括乙烯基单体诸如乙酸乙烯基酯、苯乙烯、和烷基乙烯基醚、以及马来酸酐。

包含根据式(I)的侧链的含胍基聚合物通常为含羰基的聚合物前体与式(IV)的鸟苷酸化剂的反应产物。

在式(IV)中，基团R²为共价键、C2-C12(杂)烷亚基或C5-C12(杂)芳亚基。基团R³是氢、C1-C12(杂)烷基或C5-C12(杂)芳基。每个R⁴独立地为氢、C1-C12(杂)烷基或C5-C12(杂)芳基。基团R⁵为H、C1-C12(杂)烷基或C5-C12(杂)芳基或-N(R⁴)₂。变量m等于1或2。

为了方便描述，含羰基聚合物可由式聚合物-C(＝O)-R¹表示。羰基可位于主链中或位于侧基中，但通常位于侧基中。当与式(IV)的鸟苷酸化剂反应时，含羰基的聚合物中的羰基基团与鸟苷酸化剂的末端胺基团发生缩合反应。含胍基聚合物通常具有式(V)的含胍基的侧基。

基团R²、R³、R⁴和R⁵与以上针对式(IV)所述的相同，并且波浪线表示聚合物。式(V)中的式的基团

是式(IV)的配体化合物的末端胺和含羰基聚合物的羰基之间形成的键接。波浪线表示基团经由共价键连接到聚合物其余部分的连接位点。基团R¹为氢(当羰基为醛基时)、C1-C12(杂)烷基(当羰基为酮基并且酮基为侧基的一部分时)、或C5-C12(杂)芳基(当羰基为酮基并且酮基为侧基的一部分时)、或聚合物链的残基(当羰基为含羰基聚合物的主链中的基团时)。在大多数实施方案中，式(V)的基团为含胍基聚合物的侧基的一部分。

在其他实施方案中，可制备含胍基聚合物，其中亚胺连接基团(～～C(R¹)＝N—)被还原为胺连接基团(～～CH(R¹)—NH—)。这可以通过用还原剂(如氰基硼氢化钠)处理现存的配体官能化聚合物来实现，或者还原可通过向羰基官能化(共)聚合物与式V的化合物的反应混合物中添加还原剂而原位实现。

在许多实施方案中，含羰基的聚合物的一些但并非所有的羰基基团与式(IV)的鸟苷酸化剂反应。通常，含羰基的聚合物前体中至少0.1摩尔％、至少0.5摩尔％、至少1摩尔％、至少2摩尔％、至少10摩尔％、至少20摩尔％或至少50摩尔％的羰基基团与鸟苷酸化剂反应。至多100摩尔％、至多90摩尔％、至多80摩尔％、或至多60摩尔％的羰基基团可与鸟苷酸化剂反应。例如，鸟苷酸化剂的用量可足以使含羰基的聚合物中0.1摩尔％至100摩尔％、0.5摩尔％至100摩尔％、1摩尔％至90摩尔％、1摩尔％至80摩尔％、1摩尔％至60摩尔％、2摩尔％至50摩尔％、2摩尔％至25摩尔％、或2摩尔％至10摩尔％的羰基官能化。

并非使前体聚合物与鸟苷酸化剂反应来制备含胍基的聚合物，而是可通过含胍基的单体的自由基聚合来制备含胍基的聚合物，所述含胍基的单体是指具有烯键式不饱和基团和含胍基的基团的单体。示例性含胍基单体由式(VI)和(VII)表示。

在式(VI)和(VII)中，基团R¹为氢、C1-C12烷基或C5-C12(杂)芳基。基团R²为共价键、C2至C12烷亚基、C5-C12(杂)芳亚基、下式的二价基团

或下式的二价基团

基团R¹⁰为C2至C12烷亚基或C5-C12(杂)芳亚基。每个R³独立地为氢、羟基、C1-C12烷基或C5-C12(杂)芳基。R³优选为氢或C1-C4烷基。基团R⁴是氢、C1-C12烷基、C5-C12(杂)芳基或–N(R³)₂，其中R³独立地为氢、羟基、C1-C12烷基或C5-C12(杂)芳基。优选地，R⁴为氢或C1-C4烷基。基团X是氧基或-NR³-，其中R³是氢、羟基、C1-C12烷基或C5-C12(杂)芳基。基团R⁶为C2至C12烷亚基。基团R⁷为氢或CH₃。

相对于水性生物组合物的量添加的阳离子聚合物的量可以在宽广范围内变化。在一个实施方案中，添加到水性生物组合物中的阳离子聚合物的量为至少0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100、250或甚至500微克/毫升。在一个实施方案中，添加到水性生物组合物中的阳离子聚合物的量为至多50、100、250、500、1000、2000、5000、7500或甚至10000微克/毫升。添加的阳离子聚合物的最佳量将取决于水性生物组合物中存在的近中性或带负电荷的生物材料(即，结合物质)的浓度。通常，阳离子聚合物的量相对于结合物质的量将在0.01重量％至100重量％，优选0.05重量％至30重量％，更优选约0.1重量％至10重量％的范围内。在一个实施方案中，添加到水性生物组合物中的阳离子聚合物的量小于当阳离子聚合物在载体(如纤维)上时所需的量。

阳离子聚合物与水性生物组合物接触足以使近中性和带负电荷的结合物质与阳离子聚合物相互作用以形成生物聚合物复合物的一段时间。阳离子聚合物与近中性或带负电荷的大分子结合(例如离子键合、氢键结合等)。在一个实施方案中，水性生物组合物和阳离子聚合物在被搅拌的同时彼此紧密接触以形成生物聚合物复合物。合适的混合方法包括用手、实验室搅拌器、机械和/或磁力搅拌器摇动，并且例如通过静态混合器。搅拌可进行足以有效地将生物化合物结合到阳离子聚合物的任何长度的时间，并且可取决于搅拌的材料体积。在一些实施方案中，搅拌优选地小于60秒、小于45秒或甚至小于30秒。在其它实施方案中，例如，搅拌可长达20分钟或更久。

所得混合物包含在水性溶液/悬浮液中的生物聚合物复合物和目标分子。在一个实施方案中，当溶液包含至少50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或甚至100mM盐以及至多125mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM或甚至400mM盐时，可以将目标分子置于(溶解或悬浮于)该溶液中。

在多个实施方案中，在水性介质中带正电荷的阳离子聚合物的阳离子官能团将与近中性或带负电荷的物质结合，而其他物质(例如带正电荷的蛋白，如单克隆抗体)将被排除或排斥在阳离子聚合物之外。另外，阳离子聚合物可以衍生自一种或多种离子单体。具体地讲，阳离子聚合物可包含在选定的水性生物溶液的pH下带正电荷的额外离子基团，以增强对蛋白质(例如单克隆抗体，它们中的许多在中性pH下带正电荷)的静电排斥。

生物聚合物复合物的平均粒径为至少45微米、50微米、60微米、70微米、75微米或甚至80微米。在一个实施方案中，生物聚合物复合物的平均粒径为至多100微米、110微米、120微米、130微米、140微米、150微米、160微米、170微米、180微米、190微米、200微米、220微米、240微米、260微米、280微米、300微米、350微米、400微米、450微米、500微米或甚至1000微米。可使用本领域已知的技术如反射比来测定平均粒径。通常，所得生物聚合物复合物不溶于水并且从水溶液中沉淀析出。

在一个实施方案中，允许生物聚合物复合物沉降(例如经由一段时间内的重力，或经由机械分离如离心)，并且然后可以如下所述过滤澄清的水性部分以将目标分子与生物聚合物复合物分离。

在另一个实施方案中，使用本领域已知的技术如机械搅拌将生物聚合物复合物悬浮于水溶液中。在悬浮之后，随后(例如，立即)如下所述过滤水性混合物，以将目标分子与生物聚合物复合物分离。

在一个实施方案中，包含水性生物溶液和阳离子聚合物的混合物基本上不含纤维，这意味着该混合物在添加到分离容器中之前包含相对于该混合物的重量为小于1重量％、0.5重量％或甚至0.1重量％的纤维或甚至不含纤维，其中纤维不是水溶性的并且长度为至少100nm。示例性纤维可包括下文公开的那些纤维类型。

将水性部分或混合物添加到容器的过滤体积中。如图1所示，容器10包括入口12和出口14，以限定其间的液体流动路径。松散填充的短纤维的床16位于入口和出口之间的液体流动路径中，任选的支撑物18可以包含在短纤维的下游。任选的支撑物可为仅用于支撑短纤维床的玻璃料或网状物(如烧结金属、玻璃或聚合物，或者金属或聚合物网)；或者任选的支撑物可为例如微孔膜、非织造物、编织物，其可以提供目标分子的进一步分离；或前述的组合。将在液体中包含生物聚合物复合物和目标生物分子的混合物添加到入口中并使其与松散填充的纤维相互作用。含有目标大分子的澄清液体(或滤液)经由出口离开。

松散填充的纤维是短纤维；也就是说，它们不是连续纤维。优选地，纤维的长度为至少0.1mm、0.3mm或甚至0.5mm；并且为至多2mm、3mm、4mm或甚至5mm；然而，也可使用其他长度。例如，可使纤维卷曲或不卷曲和/或原纤化。

如本文所用，应用于短纤维的术语“松散”意指纤维不成形为纸、织物或扭曲的丝束(例如，线、纱线或绳)。然而，纤维可聚集在一起，但是这通常是不太优选的。

合适的纤维包括以下纤维，其包含合成聚合物，诸如聚烯烃(例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯和丙烯的共聚物、聚(1-丁烯)、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚苯乙烯和聚异丁烯，以及它们的组合)；氟化聚合物(例如，聚(氟乙烯)、聚(亚乙烯基)、偏二氟乙烯的共聚物(如聚(偏二氟乙烯-共-六氟丙烯))、四氟乙烯的共聚物、氯三氟乙烯的共聚物如聚(乙烯-共-氯三氟乙烯)、它们的组合，以及前述各项与聚乙烯和/或聚丙烯的共聚物)；氯化聚合物(例如，聚偏二氯乙烯、聚氯丁二烯和聚氯乙烯)；聚酯(例如，聚己内酯和聚对苯二甲酸乙二酯)；聚酰胺(例如，聚(亚氨基己二酰亚氨基六亚甲基)、聚(亚氨基己二酰亚氨基十二亚甲基)和聚己内酰胺)；乙酸乙烯酯均聚物和共聚物(例如，与乙烯的共聚物)和其水解衍生物(例如，聚(乙烯醇)，包括聚(乙烯-共-乙烯醇))；聚醚砜，如聚(二苯醚砜)和聚(二苯砜-共-二亚苯基氧化物砜)；以及聚酰亚胺，如聚(均苯四甲酸二酰亚胺)。一种优选的合成纤维是原纤化高密度聚乙烯(HDPE)；例如，可以商品名SHORT STUFF FIBRILLATED HDPE(例如，等级ESS2F、ESS5F、ESS50F、E380F、E505F、E780F、E990F)从田纳西州约翰逊城的MiniFibers公司获得的原纤化HDPE纤维。有用的天然纤维包括人造丝、纤维素、棉、亚麻、壳聚糖和淀粉。

短纤维松散地填充以实现生物聚合物复合物的有效收集而不会过度阻碍流体从中流动通过。可将松散的短纤维填充到分离容器中，或者松散的短纤维可按特定的填充密度被预成形为成形物或纤维床，例如圆盘或匣盒，然后将其放置在分离容器中。在一个实施方案中，松散填充的短纤维的填充密度为至少0.01g/cm³、0.02g/cm³、0.03g/cm³、0.04g/cm³、0.05g/cm³、0.08g/cm³或甚至0.10g/cm³。在一个实施方案中，松散填充的短纤维的填充密度为至多0.15g/cm³、0.18g/cm³、0.20g/cm³、0.22g/cm³或甚至0.23g/cm³。如果填充密度不够密，则生物聚合物复合物将通过短纤维，从而产生具有更高浊度和澄清不足的滤液。如果填充密度太密，则生物聚合物复合物可在滤床的顶部形成层或滤饼，从而导致流体无法通过滤床和/或入口压力的增加。如下文将更详细地描述，在一个实施方案中，短纤维可包括官能化，其可以结合未被捕获在生物聚合物复合物中的生物物质。在此类情况下，可优选的是，分离容器包含至少1g松散填充的短纤维/50g水性生物组合物。

在一个实施方案中，用阳离子官能团处理松散填充的短纤维以结合未与阳离子聚合物复合的近中性或带负电荷的物质。在一个实施方案中，短纤维的阳离子官能团不同于阳离子聚合物的阳离子官能团。

可以通过根据已知方法将例如丙烯酸聚合物接枝到短纤维上来使短纤维阳离子官能化。丙烯酸聚合物可以通过至少一种丙烯酸单体任选地与至少一种不是丙烯酸单体的可自由基聚合单体的聚合来制备。在一个实施方案中，接枝到纤维表面上的丙烯酸聚合物包含至少10重量％、20重量％、30重量％、40重量％或甚至50重量％以及至多55重量％、60重量％、70重量％、80重量％、90重量％或甚至100重量％的阳离子单体单元或可阳离子电离的单体单元。也可包括可自由基聚合的多官能单体(例如，具有两个或更多个可自由基聚合的基团)，只要纤维不变得那么紧密交联，以致它们不再会实现本文所述的填充密度。然而，如果纤维变得过度交联，则可以使用诸如机械断裂的步骤来减轻聚集。多官能单体可为具有至少两个可自由基聚合基团的单体，或者这些单体可具有单个可自由基聚合基团和另一个可聚合基团(例如，环氧基)，其可以在聚合后的后续步骤中反应。

可自由基聚合的丙烯酸单体的示例包括(甲基)丙烯酰胺、二甲基(甲基)丙烯酰胺、2-羟乙基(甲基)丙烯酰胺、2-羟乙基(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、2-羟丙基(甲基)丙烯酰胺、二(乙二醇)甲基醚(甲基)丙烯酸酯、聚(乙二醇)(甲基)丙烯酸酯、聚(丙二醇)(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸2-乙氧基乙酯、n-乙基甲基丙烯酰胺、n-丙基丙烯酰胺、2-羟丙基(甲基)丙烯酰胺、N-羟丙基(甲基)丙烯酸酯、2-羟基-3-苯氧基丙基(甲基)丙烯酸酯、四氢糠基(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基化合物如(例如)N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基己内酰胺，以及阳离子或可阳离子电离的自由基可聚合丙烯酸单体如(例如)3-[(甲基丙烯酰胺基)丙基]三甲基氯化铵、3-(丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵、2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵、3-甲基丙烯酰氧基-2-羟丙基三甲基氯化铵、3-丙烯酰氧基-2-羟丙基三甲基氯化铵、2-丙烯酰氧基乙基三甲基硫酸甲酯铵、2-[(丙烯酰基氧)乙基]三甲基氯化铵、N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸2-(二甲氨基)乙酯、丙烯酸2-(二甲氨基)乙酯、2-氨基乙基甲基丙烯酰胺盐酸盐、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐和IEM-胍丁胺加合物(如美国专利第8,652,582号(Bothof等人)中所述，该专利通过引用并入本文)。也可使用酸性单体如丙烯酸、甲基丙烯酸和(甲基)丙烯酰胺丙基磺酸，但是这些酸性单体可倾向于干扰阳离子官能化短纤维的性能和/或引起纤维的聚集，并且如果有的话，通常应当审慎地使用，但这不是必需的。在一些实施方案中，那些更亲水或水溶性的单体由于其与含有阳离子基团或可阳离子电离基团的丙烯酸单体的相容性或可溶性特性而可以是优选的。

在一个实施方案中，有用的可自由基聚合非丙烯酸单体可含有阳离子基团或可阳离子电离基团。在此类情况下，不需要具有阳离子基团或可阳离子电离基团的丙烯酸单体来形成接枝丙烯酸聚合物。

示例性的此类可自由基聚合非丙烯酸单体包括由下式表示的那些：

其中R¹是H或具有1至4个碳原子的烷基(例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基)，并且Z^-是非干扰阴离子(例如，不会引起阳离子配体官能化短纤维的聚集或与季氮原子紧密结合的阴离子，或者对生物组合物具有氧化性的阴离子)，其优选地具有-1、-2或-3的电荷，更优选地具有-1的电荷。优选的非干扰阴离子包括氯离子和溴离子。

可自由基聚合的多官能单体的示例包括(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、亚甲基双(甲基)丙烯酰胺、双(甲基)丙烯酰基哌嗪、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、乙氧基化(10)双酚A二(甲基)丙烯酸酯乙氧基化(30)双酚A二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇(200)二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇(400)二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇(600)二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯以及它们的组合。同样地，由于相容性或可溶性原因，亲水性或水溶性多官能单体是优选的。

如果包括的话，多官能单体的量通常小于用于制备接枝丙烯酸聚合物的可自由基聚合单体的5重量％，优选地小于2重量％，并且更优选地小于1重量％；然而，这不是必需的。

接枝丙烯酸聚合物可进一步包含0.1重量％至90重量％的至少一种非可电离亲水单体单元，或者其可以根本不含有。例如，接枝丙烯酸聚合物可含有至少1重量％、至少5重量％、至少10重量％、至少15重量％或至少25重量％到至多30重量％、40重量％、50重量％、75重量％或90重量％的至少一种非可电离亲水单体单元。在一些实施方案中，非可电离亲水单体单元包含如下所示的具有5至7个碳原子的N-乙烯基内酰胺的二价残基，其中n＝1、2或3。

可以通过在聚合制备接枝丙烯酸聚合物的单体中包括N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基戊内酰胺和/或N-乙烯基己内酰胺来容易地引入此类单体单元。

在一些实施方案中，非可电离亲水单体单元包含如下所示的聚醚(甲基)丙烯酸酯的二价残基，其中R¹和R³如前所定义，并且w是≥2的整数。

可以通过在聚合制备接枝丙烯酸聚合物的单体中包括聚醚(甲基)丙烯酸酯来容易地引入此类单体单元。制造此类单体的方法在本领域中是众所周知的，并且许多可商购获得。示例包括丙烯酸2-(2-乙氧基乙氧基)乙酯、甲氧基聚乙二醇(350)单丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇(350)单甲基丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇(550)单丙烯酸酯和甲氧基聚乙二醇(550)单甲基丙烯酸酯，它们全部可从宾夕法尼亚州埃克斯顿的沙多玛公司(SartomerCo.,Exton,Pennsylvania)获得。

在一个实施方案中，表面活性剂或相容剂可用于纤维接枝以促进纤维被水溶液润湿。示例性表面活性剂和/或相容剂包括但不限于聚乙二醇200；聚乙二醇400；单异硬脂酸甘油酯；聚乙二醇二辛酸酯/癸酸酯(可以商品名ESTOL 1526从新泽西州爱迪生市的克罗达公司(Croda Inc.,Edison,NJ)获得)；可以商品名SPAN 80从俄勒冈州波特兰的梯希爱美国公司(TCI America,Portland,OR)获得的非离子表面活性剂；聚乙二醇三甲基壬基醚；可以商品名TERGITOL TMN-10从密歇根州米德兰的陶氏公司(Dow,Midland,MI)获得的非离子表面活性剂；可以商品名BRIJ L4-LQ-AP从新泽西州爱迪生市的克罗达公司获得的表面活性剂；甲氧基聚乙二醇(可以商品名CARBOWAX 750从密歇根州米德兰的陶氏公司获得)；被称为泊洛沙姆的非离子三嵌段共聚物，其包含夹在两个亲水性聚氧乙烯嵌段之间的中心疏水性聚氧丙烯嵌段，并且可以商品名Pluronic从巴斯夫公司获得；可以商品名ABILQUAT 3272(弗吉尼亚州霍普韦尔的戈德施米特化学公司(Goldschmidt Chemical Corp,Hopewell,VA))获得的头发护理调理剂；月桂基吡咯烷酮；烷基聚葡糖苷，可以商品名GLUCOPON和PLANTACARE从新泽西州弗洛勒姆帕克的BASF公司(BASF,Florham Park,NJ)获得；山梨糖醇酐异硬脂酸酯(可以商品名SPAN 120LQ从新泽西州爱迪生市的克罗达公司获得)；以及可以商品名NIKKOL TL-40从日本东京的日宏化学公司(Nikko Chemicals,Tokyo,Japan)获得的聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯。

通过将生物聚合物复合物捕获在松散填充的短纤维内来实现目标分子与生物聚合物复合物的分离，该短纤维可用于机械地去除纯化的生物组合物中残余的颗粒碎片。收集通过纤维的液体，本文称为滤液。然后可以进一步处理包含目标分子的滤液以分离和/或浓缩目标分子。

水性生物溶液通常包括细胞生长或发酵所需的缓冲液、电解质和/或糖，但是这些组分可以影响用于回收和分离目标分子的传统过滤器的性能，并且因此将工艺溶液(例如，水性生物溶液)稀释以降低离子浓度。在本公开的一个实施方案中，水性生物溶液在与阳离子聚合物接触和/或与松散短纤维的床接触之前未被稀释。

在本申请中已经发现，生物聚合物复合物的粒度与松散填充的短纤维的组合允许水性生物组合物中的细胞碎片和其它近中性或带负电荷的组分与目标生物分子的高度分离、来自流体的DNA的大量减少和/或宿主细胞蛋白的高度减少，同时还最大程度地减少工艺步骤的数量。

在一个实施方案中，本公开的方法使得能够澄清水性生物组合物，产生浊度小于20NTU、15NTU、10NTU、5NTU或甚至4NTU的滤液。

实施例

除非另外指明，否则在实施例和说明书的其余部分中的所有份数、百分数、比率等均按重量计，并且实施例中使用的所有试剂均得自或购自普通化学品供应商，诸如例如密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Company,Saint Louis,Missouri)，或者可以通过常规方法合成。

在这部分中使用以下缩写：cm＝厘米，g＝克，kGy＝千戈瑞，kV＝千伏，L＝升，mL＝毫升，mm＝毫米，mM＝毫摩尔，N＝正常，NMR＝核磁共振，℃＝摄氏度，mol＝摩尔，ppm＝百万分之一，并且IR＝红外。

材料表

制备例1[PE1；鸟苷酸化聚乙烯亚胺(G-PEI)]

将聚乙烯亚胺(PEI)，Mw(分子量)＝60,000g/mole(100克的50重量％水溶液；获自比利时海尔的阿克洛斯有机化学品公司(ACROS Organics,Geel,Belgium))加入1L烧瓶中，并将去离子水(259g)加入烧瓶中以将固体含量％降至约25％。将O-甲基异脲半硫酸盐(36.9g)添加到烧瓶中，并将所得溶液在环境温度下机械搅拌约20小时。NMR光谱分析指示转化为其中PEI的25％的胺基(主要是伯胺基)转化为胍的所需产物。浓盐酸(38g)用于将混合物滴定至约pH 7(使用pH纸测量)。使用梅特勒托利多(Mettler Toledo)水分天平分析仪(型号HR73，获自俄亥俄州哥伦布市的梅特勒托利多公司(Mettler Toledo Corporation,Columbus,OH))确定固体百分比为21.0％。

制备例2[PE2；聚(双丙酮丙烯酰胺脒腙(pDAAGH)]

将双丙酮丙烯酰胺(160g)、乙醇(240g)和引发剂(0.8g)装入具有热电偶套管端口的1000mL折痕圆底三颈烧瓶中。反应烧瓶配备有顶置式搅拌器、氮气入口和冷水冷凝器。用缓慢氮气流吹扫混合物5分钟，并且然后在60℃下(使用加热套)伴随搅拌加热20小时，以使单体转化为聚合物。添加乙醇(133g)以稀释聚合物溶液至约30重量％。将该聚合物溶液的一部分(253.3g)置于配备有顶置式搅拌器的圆底烧瓶中。将盐酸氨基胍(49.7g)溶解于去离子水(150g)中，并且然后添加到反应烧瓶中。添加浓盐酸(0.5mL)，并且在环境温度下搅拌溶液20小时。IR光谱法和¹H-NMR分析确认形成了聚(双丙酮丙烯酰胺脒腙)。接着将反应混合物置于真空中以去除大部分乙醇；通过添加1N NaOH中和至pH 7；并且最后通过添加去离子水调节至约20％固体。

制备例3[PE3；聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pDADMAC)]

从西格玛-奥德里奇公司获得聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(pDADMAC)(平均MW为400,000-500,000g/mol，20重量％水溶液)溶液，并且在去离子水中稀释至10重量％。

制备例4(PE4)

将短纤维I(5g)置于开放的塑料袋中并在低氧(<20ppm氧气)手套箱中用氮气吹扫。密封含有纤维的塑料袋。

将按重量计含有12％NVP、10％MAPTAC、4％GMA、74％去离子水的单体接枝溶液(150克)添加到玻璃广口瓶中。将广口瓶封盖并用手摇动以混合内容物。然后打开广口瓶，并用氮气使溶液鼓泡2分钟以从溶液中去除任何溶解的氧气。将广口瓶再封盖并转移到低氧手套箱中。然后移除广口瓶盖以冲洗来自广口瓶顶部空间的任何残留空气。

从手套箱中取出含有纤维的密封袋，并且使该密封袋在大约5.5米/分钟的速度和300kV的加速电压下以单程操作通过能源科学公司(Energy Sciences Incorporated)的CB-300电子束装置，从而使其经受40kGy剂量水平的照射。然后将含有经照射的纤维的袋放回手套箱中。

将接枝溶液添加到含有经照射的纤维的袋中，并将密封袋在氮气吹扫的手套箱中维持3小时。将所得共聚物接枝纤维用去离子水洗涤三次，允许水通过筛网排出，同时保留纤维。然后将纤维转移到大铝盘中并使其干燥。干燥后，使用搅拌器以低设置参数分离任何聚集的纤维。

制备例5(PE5)

遵循如制备例4中所报道的相同程序，不同之处在于使用5g短纤维II代替短纤维I。

制备例6(PE6)

遵循如制备例5中所报道的相同程序，不同之处在于使用按重量计含有12％NVP、10％MAPTAC、0.4％TERGITOL TMN 10和77.6％去离子水的不同接枝溶液(150g)。

制备例7(PE7)

遵循如制备例5中所报道的相同程序，不同之处在于使用按重量计含有12％NVP、4％GMA和84％去离子水的不同接枝溶液(150g)。

制备例8(PE8)

由熔喷聚丙烯微纤维(PP)非织造基底(特征在于1.85mm的基底厚度、8微米的有效纤维直径、200克/平方米的基重和10％的实度)制备共聚物接枝非织造基底。在手套箱中，在氮气氛下清除熔喷聚丙烯微纤维非织造基底(8.5英寸×8.5英寸)样品的空气。一旦氧气水平达到<20ppm，将非织造基底插入塑料袋中并密封。

从手套箱中取出含有非织造样品的密封袋，并且使该密封袋在大约5.5米/分钟的速度和300kV的加速电压下以单程操作通过能源科学公司(Energy SciencesIncorporated)的CB-300电子束装置，从而使其经受40kGy剂量水平的照射。然后将含有经照射的非织造样品的袋放回手套箱中。

将单体接枝溶液添加到含有非织造样品的塑料袋中。将袋密封并使用手动辊将溶液分配成遍布非织造样品，使得非织造片材被溶液均匀地覆盖。将袋密封并使非织造样品在袋中保持平坦达3小时。将所得共聚物接枝非织造样品从袋中取出并在去离子水中煮沸一小时。将样品从水浴中取出，并且在室温下风干24小时。从干燥样品冲压出圆盘(直径为25mm)备用。

制备例9(PE9)

从3M ZETA PLUS SP Depth Filters(等级05，从明尼苏达州圣保罗的3M公司(3MCorporation,St.Paul,MN)获得)冲压出圆盘(直径为25mm)。

CHO细胞培养液制备

在生物反应器(可以商品名READYTOPROCESS WAVE 25从伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司(GE Healthcare,Chicago,IL)获得)中使用补料分批工艺在10-12天内制造产单克隆抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。将80％活力下的培养物收获到2L无菌培养基瓶中。将收获的细胞培养液在4℃下冷藏过夜以沉淀细胞和细胞碎片。通过将上清液泵出容器来获得浓缩的生物质。通过在PCV细胞计数管(从西格玛-奥德里奇公司获得)中用定角转子以2,500rcf(相对离心力)离心200微升CHO细胞培养物1分钟来确定浓缩生物质的红细胞压积(PCV)。使用上清液将PCV调节至所需水平。将CHO培养物在4℃下储存长达3天。

分离方法

将五十毫升CHO细胞培养液(8％PCV)添加到玻璃烧杯中，并且使用磁力搅拌棒[SPINFIN磁力搅拌棒(22mm直径×12.7mm高度)，从新泽西州韦恩的Bel-Art SPScienceware公司(Bel-Art SP Scienceware,Wayne,NJ)获得]和搅拌板以100rpm搅拌。将指定的阳离子聚合物在水中稀释至10重量％。使用微通道移液管将稀释的聚合物样品在90秒时间内添加到搅拌的CHO细胞培养物中，以达到0.1重量％的最终浓度。持续搅拌15分钟后，将所得生物聚合物复合物悬浮液立即递交到分离容器(如下文描述)中用于进一步处理。

除非另有说明，否则分离容器用1g纤维松散地填充至分离容器中的高度为3.175cm。1g纤维占据9立方厘米的体积，因此纤维密度为0.11g/cm³。分离容器含有透明的聚碳酸酯容器主体(1.9cm内径和5.1cm高度)，其中容器主体的顶部加盖。容器盖含有入口端口和排气端口。容器底部含有带有活塞的出口端口。容器在垂直方向上操作，其中入口距地球最远，并且出口最接近地球。将压力传感器放置在入口端口的上游。将10mL Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH 8)的溶液添加到容器中。使用连接到入口端口的具有MASTERFLEX L/SPharMed BPTflex 16号管的PendoTech(Princeton，NJ)常规流量过滤系统(伊利诺伊州弗农希尔斯的科尔帕默公司(Cole-Parmer Company,Vernon Hills,IL))，将生物聚合物复合物悬浮液以2毫升/分钟泵送到分离容器中。当填充容器时，接着打开出口端口，并且关闭排气端口。继续泵送，并且将滤液通过出口端口收集到锥形接收管中。当a)入口压力达到5psi或b)当在分离装置中没有观察到任何可见液体并且在两分钟时间段内未观察到任何液体离开分离容器时，停止收集离开容器出口的液体(称为“滤液”)。

浊度

使用Hach 2100AN浊度计(科罗拉多州拉夫兰的哈希公司(Hach Company，Loveland，CO))测量收集的滤液的浊度。

％收率

通过以下公式确定产率：

产率(％)＝[(回收的滤液体积)/(细胞培养液体积+tris缓冲液体积)]×100。

通过将细胞培养物的初始体积乘以表示为小数的PCV值来确定细胞培养液的体积。

生物聚合物复合物的粒度

将五十毫升CHO细胞培养液(8％PCV)添加到玻璃烧杯中，并且使用磁力搅拌棒[SPINFIN磁力搅拌棒(22mm直径×12.7mm高度)，从Bel-Art SP Scienceware公司获得]以100rpm搅拌。将选自制备例1-制备例3的单一聚合物在水中稀释至10重量％。使用微通道移液管将稀释的聚合物样品在90秒时间内添加到搅拌的CHO细胞培养物中，以达到0.1重量％的最终浓度。将混合物搅拌15分钟，同时测量所得生物聚合物复合物的粒度。将聚焦光束反射测量探针(ParticleTrack G400；俄亥俄州哥伦布市的梅特勒托利多公司)插入液体中达2英寸深度，使其不位于涡旋中。使用iC FBRM 4.4软件(梅特勒托利多公司)追踪和评估粒度。表1中报告了在15分钟时间点测量的平均粒度(微米)。

表1.

实施例1

按照如上所述的分离方法，使用制备例1的G-PEI聚合物作为阳离子聚合物，并且分离容器用制备例6的纤维(1.0g)松散地填充到分离容器中的高度为3.175cm。1g纤维占据9立方厘米的体积，因此纤维密度为0.11g/cm³。进行该程序的两个独立试验，并且在表2中报告回收滤液的产率(％)和浊度(NTU)的平均结果和标准偏差计算值(n＝2)。

实施例2

按照如上所述的分离方法，使用制备例2(pDAAGH)作为阳离子聚合物，并且分离容器用制备例6的纤维(1.0g)松散地填充到分离容器中的高度为3.175cm。1g纤维占据9立方厘米的体积，因此纤维密度为0.11g/cm³。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表2中。

实施例3

按照如上所述的分离方法，使用制备例1的G-PEI聚合物作为阳离子聚合物，并且分离容器用制备例6的纤维(0.8g)松散地填充到分离容器中的高度为5cm。0.8g纤维占据15立方厘米的体积，因此纤维密度为0.05g/cm³。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表2中。

比较例A(CE A)

按照如上所述的分离方法，使用制备例3(pDADMAC)作为阳离子聚合物，并且分离容器用制备例6的纤维(1.0g)松散地填充到分离容器中的高度为3.175cm。1g纤维占据9立方厘米的体积，因此纤维密度为0.11g/cm³。进行该程序的两个独立试验，并且在表2中报告回收滤液的产率(％)和浊度(NTU)的平均结果和标准偏差计算值(n＝2)。

比较例B(CE B)

按照如上所述的分离方法，使用制备例1的G-PEI聚合物作为阳离子聚合物，并且分离容器用制备例6的纤维(0.8g)填充到分离容器中的高度为1.2cm。0.8g纤维占据3.4立方厘米的体积，因此纤维密度为0.24g/cm³。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表2中。由于入口压力达到5psi，停止滤液收集。

表2.

实施例4至实施例6

按照如上所述的分离方法，使用制备例1的G-PEI聚合物作为阳离子聚合物，并且用表3中所述的不同的共聚物接枝短纤维填充分离容器。将每种短纤维以3.175cm的高度置于分离容器中，使得针对每个实施例的体积为9立方厘米。由于使用不同质量的每种样品，因此对于每个实施例，纤维填充不同。实施例4使用1.0g的PE4，实施例5使用1.3g的PE5，并且实施例6使用1.0g的PE7，从而产生表3中描述的纤维填充密度。针对每个实施例进行单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表3中。

表3.

实施例	阳离子聚合物	纤维	纤维填充(g/cm<sup>3</sup>)	收率(％)	滤液浊度(NTU)
						4	PE1(G-PEI)	PE4	0.11	87％	20
5	PE1(G-PEI)	PE5	0.14	79％	22
						6	PE1(G-PEI)	PE7	0.11	82％	17

实施例7

重复如上所述的实施例6，不同之处在于不立即将生物聚合物复合物悬浮液添加到分离容器中，而是使生物聚合物复合物悬浮液沉降10分钟，然后将悬浮液泵送到分离容器中用于进一步处理，并且分离容器使用PE6纤维。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表4中。

实施例8

遵循实施例7中报告的程序，不同之处在于使用制备例2的聚合物(pDAAGH)代替制备例1的G-PEI聚合物。回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表4中。

比较例C(CE C)

遵循实施例7中报告的程序，不同之处在于使用制备例3的聚合物(pDADMAC)代替制备例1的G-PEI聚合物。进行了单个试验，并且回收的滤液的产率(％)和浊度(NTU)结果报告于表4中。

表4.

比较例D(CE D)

遵循如上所述的分离方法，使用制备例1的G-PEI聚合物作为阳离子聚合物。将来自制备例8的共聚物接枝非织造物的25mm圆盘插入分离容器的底部，以代替填充纤维的分离容器。使用o形环将圆盘固定就位。将2mL Tris缓冲溶液(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH8)添加到容器中，而不是如上所述的分离方法中描述的10mL。

进行了单个试验。由于入口压力达到5psi，停止滤液收集。产率(％)结果报告于表5中。无法测量滤液的浊度，因为回收不到足量的滤液用于测试。

比较例E(CE E)

遵循如比较例D中所述的程序，不同之处在于使生物聚合物复合物悬浮液沉降10分钟，然后将其递交到分离容器中用于进一步处理。进行了单个试验，并且产率(％)结果报告于表5中。由于入口压力达到5psi，停止滤液收集。无法测量滤液的浊度，因为回收不到足量的滤液用于测试。

比较例F(CE F)

遵循如比较例D中所述的程序，不同之处在于使用来自制备例9(PE9)的圆盘代替来自制备例8(PE8)的圆盘。进行了单个试验，并且产率(％)和浊度的结果报告于表5中。由于入口压力达到5psi，停止滤液收集。

比较例G(CE G)

遵循如比较例F中所述的程序，不同之处在于使生物聚合物复合物悬浮液沉降10分钟，然后将其递交到分离容器中用于进一步处理。进行了单个试验，并且产率(％)结果报告于表5中。由于入口压力达到5psi，停止滤液收集。无法测量滤液的浊度，因为回收不到足量的滤液用于测试。

表5.

实施例	阳离子聚合物	非织造圆盘	收率(％)	滤液浊度(NTU)
					CE D	PE1(G-PEI)	PE8	8％	NM
比较例E	PE1(G-PEI)	PE8	3％	NM
					比较例F	PE1(G-PEI)	PE9	43％	25
比较例G	PE1(G-PEI)	PE9	3％	NM

NM＝未测量

在不脱离本发明的范围和实质的情况下，本发明的可预知修改和更改对于本领域技术人员而言将显而易见。本发明不应受限于本申请中为了说明目的所示出的实施方案。如果在所写的本说明书和以引用方式并入本文的任何文档中的公开内容之间存在任何冲突或矛盾，则将以所写的本说明书为准。

Claims

1.一种从包含结合物质的水性生物组合物中纯化目标非结合分子的方法，所述方法包括：

(a)使阳离子聚合物和所述水性生物组合物接触以形成在液体中包含生物聚合物复合物和所述目标非结合分子的混合物，其中所述生物聚合物复合物的平均粒径为至少45微米，

(b)将所述混合物添加到容器的过滤体积中，其中所述容器包含松散填充的短纤维；

(c)使所述混合物通过所述松散填充的短纤维分离；以及

(d)收集包含所述目标非结合分子的滤液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述松散填充的短纤维的填充密度为至少0.03g/cm³。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述松散填充的短纤维的填充密度为至多0.24g/cm³。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物是水溶性或水分散性聚合物。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物经胍基官能化。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述阳离子聚合物包含下式的基团：

-[C(R¹)＝N-R²]_n-N(R³)-[C(＝N-R⁴)N(R⁴)]_m-R⁵

其中

R¹为H、C1-C12烷基、C5-C12(杂)芳基或聚合物链的残基；

R²为共价键、C2-C12(杂)烷亚基或C5-C12(杂)芳亚基；每个R³独立地为H、C1-C12烷基或C5-C12(杂)芳基；

每个R³独立地为H、C1-C12烷基或C5-C12(杂)芳基；并且

每个R⁴为H、C1-C12烷基或烷亚基、C5-C12(杂)芳基或(杂)芳亚基、氰基或-C(＝NH)-N(R²)-聚合物，并且

n为1或2。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物进一步经季铵基团官能化。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物衍生自氨基聚合物，任选地，其中所述氨基聚合物选自：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚氨基酰胺、聚烯丙基胺、聚乙烯胺、聚二甲基胺-环氧氯丙烷-乙二胺、和由聚酰胺基胺(PAMAM)和聚丙烯亚胺形成的树枝状大分子。

9.根据权利要求8中任一项所述的方法，其中所述氨基聚合物的可用氨基的0.1摩尔％至100摩尔％经胍基官能化，任选地，其中所述胍基在所述氨基聚合物链中。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阳离子聚合物衍生自羰基聚合物，任选地，其中所述羰基聚合物选自：丙烯醛、乙烯基甲基酮、乙烯基乙基酮、乙烯基异丁基酮、双丙酮(甲基)丙烯酰胺、丙烯酸丙酮酯、一氧化碳共聚物、和双丙酮(甲基)丙烯酸酯(共)聚合物。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每毫升所述水性生物组合物中添加0.01微克至10,000微克的阳离子聚合物。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水性生物组合物包含细胞材料。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物组合物来源于细胞培养物或发酵过程。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物聚合物复合物的平均粒径为至多200微米。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体包括水。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在添加到所述容器中之前将所述生物聚合物复合物悬浮在所述液体中。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之后立即将所述生物聚合物复合物添加到所述容器的过滤体积中。

18.根据权利要求16所述的方法，其中将所述生物聚合物复合物悬浮在液体中包括搅拌所述液体中的所述生物聚合物复合物。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述松散填充的短纤维的至少一部分包括人造丝、纤维素、棉、亚麻、壳聚糖和淀粉中的至少一种。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述松散填充的短纤维的至少一部分包括聚烯烃、氟化聚合物、氯化聚合物、聚酯、聚酰胺、乙酸乙烯酯均聚物和共聚物、以及乙酸乙烯酯均聚物和共聚物的水解衍生物、聚醚砜和聚酰亚胺中的至少一种。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述松散填充的短纤维的至少一部分是亲水性的。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述松散填充的短纤维的至少一部分包括亲水改性纤维中的至少一种。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述松散填充的短纤维被接枝，任选地，其中所述松散填充的短纤维具有包含接枝丙烯酸聚合物的经改性的表面层，所述接枝丙烯酸聚合物包含10重量％至100重量％的阳离子单体单元或可阳离子电离单体单元。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述接枝丙烯酸聚合物进一步包含聚醚(甲基)丙烯酸酯的二价残基。

25.根据权利要求23至24中任一项所述的方法，其中所述接枝丙烯酸聚合物进一步包含0.1重量％至90重量％的至少一种非可电离亲水单体单元。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述松散填充的短纤维的至少一部分是原纤化的。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述滤液包含蛋白质、酶或抗体中的至少一种。

28.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)多个短纤维；和

(b)阳离子聚合物。

29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述短纤维松散地填充在床中，任选地，其中所述床中的所述纤维的填充密度为至少0.03g/cm³且至多0.24g/cm³。

30.根据权利要求28至29中任一项所述的试剂盒，其中所述多个短纤维呈成形形式。