JPS6111663A - 酵素免疫測定法に用いられる酵素で標識されたロイコトリエン類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡ法と略記する。

）に適したロイコトリエン（以下、ＬＴと略記する。）
類の新規な鰐導体に関するものである。さらに詳しく述
べると、ＥＩＡ法に用いられる酵素で標識されたＬＴ類
に関するものである。

〔従来の技術〕

近年、アラキドン酸カスケードのひとつとして、リポキ
シゲナーゼ系を介して生体内で産生され、血管透過性九
進作用、気管支収縮作用及び白血球遊走作用などの生理
作用を有する物質、ＬＴ類が明らかにされ、現在までに
以下のようなＬＴ類の存在が確認されている（　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａ１１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　ヱ６．４２７５（１９７９）、　　Ｂｉｏｃ
ｈｔｘ　Ｂｉｏｐルｙｓ。

Ｒｔｓ、　Ｇｏｒｍｔｕｂｎ、、　９１．１２６６（１
９７９）、ｐｒｏｃ。

ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、Ｅ３ｃｉ、、　ＵＳＡ、　７７
、２０１４（１９８０）、ＮａｔＩＬｒｅ、２８５，１
０４（１９８０）参照のこと〕。

Ｒ：５−ＯＨ Ｒ：５−ＣＨ２ ０ＨＣ，０ＮＨＧＨ２ＣＯＯＨＬ　Ｔ　Ｄ　４「 Ｈ２ Ｒ：５−ＯＨ ＣＨＣＯＯＨＬ　Ｔ　Ｂ　４ Ｈ２ それに伴って種々の疾患とＬＴ類との関連が議論される
ようになシ、ＬＴ類の生体内濃度を正確かつ簡便に測定
する方法を確立することが非常に重要になってきた。

ＬＴ類の測定法としては、ＵＶ法及びＥＩＡ法が知られ
ているがＥＩＡ法については全く知られていない。従っ
て、ＥＩＡ法に用いられる酵素で標識されたＬＴ類も全
く知られていない。一方、一般的にハプテンを酵素で標
識する方法としては種々の方法が知られているが、高感
度かつ正確に測定するためには、特異的かつ選択性の高
い酵素標識抗原を用いる必要がある。

〔発明の目的〕

本発明者らは、ＬＴ類の特異的かつ選択的ＥＩＡ法を開
発していくなかで、ＬＴ類の酵素標識抗原として最適の
ものを見い出すべく、特に縮合法及び架橋剤について鋭
意検討を重ねた結果、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミドエステルを用いた架橋縮合法が特異性、選択性の
点で最もすぐれていることを見い出し本発明を完成した
。

〔発明の構成〕

すなわち、本発明はＥＩＡ法に用いられる一般（式中、
Ｒは −ＯＨ Ｈ− −ＯＨ ＧＨＣＯＯＨ（ＩＶ） 量 ＮＨ〜 で示される基を表わし、Ｒ２は酵素を表わす。）で示さ
れる酵素標ＲＬＴ類に関する。

一般式（Ｉ）において、Ｒ１が式（ＩＩ）で示される基
を表わす場合はＬＴ（３４であシ、Ｒが式（至）で示さ
れる基を表わす場合はＩ、ＴＤ４であシ、Ｒ１が式（５
）で示される基を表わす場合はＬＴＥ４を表わす。Ｒ１
としてはいずれの場合も好ましいが、特に好ましいのは
ＬＴＣ４である。

一般式（１）において、Ｒ２によって示される酵素は、
ＥＩＡ法で一般的に用いられる酵素であれば何でもよい
。酵素はそれ自体に活性に関与しないＳＨ基を有してい
るものが望ましいが、８１−Ｉ基をまったく有していな
いものでもよい。ＳＨ基を有していない酵素の場合には
、当業者によく知られた方法でフリーのＳＨ基を導入す
ることができる。

本発明に用いられるＲ２によって示される酵素としては
、例えばマレートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−
リン酸脱水素酵素、グルコース酸化酵素、被ルオキシダ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼが挙げられるが、好ましくはβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼである。

一般式（１）で示されるＬＴ類は、以下に示す方法によ
シ製造することができる。

（式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ意味を表わす。）一
般式（ロ）で示される化合物は、リン酸緩衝液に溶解し
た一般式（至）で示される化合物と適当な有機溶媒（好
ましくはテトラヒドロフラン）に溶ｊｌた４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）フクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＣＡＥ）を反応
させることによシ得られる。反応はアルゴンのような不
活性ガス雰囲気下室源で３０分間から１時間で行なわれ
る。反応波通常の後処理を行ない精製することができる
。

得られた一般式（ロ）で示される化合物をＲ２で示され
る酵素（フリーの一８Ｈ基を有していない場合は、公知
の方法によ、９−８Ｈ基を導入した形で用いる。）と反
応させることによシ、目的とする一般式（すで示される
酵素標識ＬＴ類が得られる。

反応は不活性ガス雰囲気下、リン酸緩衝液中室温で３０
分間〜１時間で行なわれる。反応後生酸物をゲルクロマ
トグラフィーで分画し、酵素活性を有する一般式（すで
示されるＬＴ類を回収することができる。

本発明の一般式（Ｉ）で示されるＬＴ類は、ＥＩＡ法に
おいてＬＴＣ４，ＬＴＤ４及びＬＴＥ４　を定量する場
合の酵素標識抗原として用いることができる。

ＥＩＡ法としては、第１抗体同相法、第２抗体同相法及
び液相法が知られているが、本発明のＬＴ類はいずれの
方法においても、特異的かつ選択性の高い酵素標識抗原
として用いることができる。

一般式（Ｉ）で示される酵素標識抗原を用いてＥＩＡ法
を実施するには、最適な濃度に希釈した抗血清と検体ま
たは標準品及び一般式（Ｉ）で示される酵素標識抗原を
至適温度下にインキュベートし、生成した抗原−抗体複
合体管二抗体法等によル遊離型と結合型に分離した後、
抗原−抗体複合体に酵素基質を作用させ生成物の螢光強
度から目的とするＬＴ類の濃度を求めることができる。

ＥＩＡ法を行なうに当っては、生体試料は必要に応じて
前処理を行ない、抗原抗体反応に阻害を与えない程度に
精製してから測定に供する。

上記ＥＩＡ法に用いる抗血清は公知の方法により得られ
る。すなわち適当なアジュバント、例えばインコンプリ
ートンロインドアシュバントに抗原を乳化し、宿主動物
、例え５家兎、モルキット等に感作することによって得
られる。抗原はハプテンとしてのＬＴ類とタンパク、例
えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を公知の方法によシ縮
合させることによシ得られる。ＬＴ類の抗原としては、
ＰｒｏｚｔａｇＬａｎｄｉｒＬｚ、　２３（４）、　６
０３（１９８２）にいくつか開示されている。本発明に
用いられる抗原はこれらに限定されるものではないが、
１．５−ジフルオロ−２，４−：）ニトロベンゼンを架
橋剤として用いた場合に、特異性の高い良好な抗原が得
られる。

抗体を産生ずる抗原として２．４−ジニトロ−ｍ−フェ
ニレン基を介して、例えばＢＳＡとハプテンが結合した
物質を用いると、この架橋部分に対する抗体が産生され
る可能性がある。このとき同じ架橋剤を用いて調製した
酵素標識抗原を用いＥＩＡを行なうと、抗原抗体反応に
おいてハプテンに対する抗体の結合力に比べ、酵素標識
抗原への抗体結合力の方が強く現われ、酵素標識ＬＴ類
と被測定ＬＴ類との置換が完全に行なわれず測定感度が
低下することがある。従ってＥＩＡにあってはへテロロ
ジイーを考慮した方が好適な場合もある。しかしながら
抗体の性質によってはこれらの現象が常に生ずるとは限
らず、同じ架橋法の組合せでＥＩＡを実施できる場合も
ある。従って最適の酵素標識抗原を見い出すためには実
際にＥＩＡを行なって判断する必要がある。

〔実施例〕

以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明はこ
れら実施例によって限定されるものではない。

実施例　ＬＴＣ４とβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの縮合体
〔一般式（Ｉ）においてＲ１が式（ＩＩ）で示される基
を表わし、Ｒ２がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを表わす化
合物〕の製造方法 ＬＴＣ４１００μＩを０．０７５Ｍリン酸緩衝液（７）
Ｒ７，２、脱気後アルゴンガスで置換）１Ｍに溶解し、
ここへ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル
（ＭＣＡＥ）ＩＩｎ９を含むテトラヒドロンラン浴液０
．１ｄを加え、アルゴンガス雰囲気下２４Ｃで３０分間
反応させた。反応終了後テトラヒドロフランをアルゴン
ガスで留去し、未反応のＭＣＡＥをジエチルエーテル（
１ｙｘ３回）で抽出して除去した。水層に残存するジエ
チルエーテルをアルゴンガスで十分留去してＬＴＣ４の
シクロヘキシルマレイミド誘導体〔一般式（ロ）におい
てＲ１が式（ＩＦ）で示される基を表わす化合物〕を得
た。得られたシクロヘキシルマレイミド誘導体を、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ１．５〜を含む０．０７５Ｍリン
酸緩衝液（，１）Ｒ７，２、脱気後アルゴンガスで置換
）１ｄにアルゴンガス雰囲気下で滴下した。滴下終了後
この混合液を２４Ｃで３０分間かきまぜた。反応混合物
をセファデックスＧ−２５カラム（登録商標、ファルマ
シア社製）（１，０ｘ５０ｃｆｒＬ）で分画し、酵素活
性を有する標題縮合体分画を回収した。酵素量としての
回収率は９４％であった。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼの分子量を ５４０．０００としで計算すると、β−Ｄ−ガラクト７
ダーゼ１モル当＃）　ＬＴＣ４１８，３モルが縮合して
いた。またβ−Ｄ−ガ２クトシダーゼに遊離のＳＨ基が
２３個あるとして計算すると、その８０チが理論上ＬＴ
Ｇ４と反応していると考えられる。

さらに、標題縮合体は、もとの酵素の約７０％の活性を
有していた。

〔効果〕

前記実施例で得られた本発明の酵素様ＲＬＴ類を効果を
ＥＩＡ法（液相法）によって確認した。

本実験では本発明の酵素標識ＬＴ類以外に５種類の方法
によって酵素標識されたＬＴ類も比較対照として行った
。

対ｆｆ、１　：　１，５−ジフルオロ−２，４−ジニト
ロベンゼンを架橋剤とする酵素標識ＬＴＧ４ 実施例と同様にして、１．５−ジフルオロ−２，４−ジ
ニトロベンゼンを架橋剤として用いて、次の酵素標識Ｌ
ＴＣ４を得た。

対照２：ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミト８エステルを架橋剤とする酵素標識Ｉ、ＴＧ４ 実施例と同様にして、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒト
９０キシサクシンイミドエステルを架橋剤として用いて
、次の酵素標識ＬＴＣ４を得た。

対照３ニゲルタールアルデヒド法によって得られた酵素
標識ＬＴＣ４ 縮合反応は一段階法によって行なった。すなわち、遮光
下にＬＴＣ４１００ｐｌ／を含む０，１Ｍリン酸緩衝液
（ＰＨ６，８、脱気後アルゴンガスで置換）１ｍにβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ１ダを加え、アルゴンガス雰囲気
下ゆるやかにがきまぜながら、１％グルタールアルデヒ
）”５０ｐｌを滴下した。

室温で２時間反応させた後、４ｃで０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ＰＨ７，２、脱気後アルゴンガスで置換）に対し
て透析した。縮合反応はランダムカップリングであるた
め複合体は不均一なものと考えられる。

対照４：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド”（ＥＤＣ）法によって得られた酵
素標識ＬＴＣ＜ 遮光下ＫＬＴＧ４１００ｐｌ　を含む０．１Ｍリン酸緩
衝液（ＰＨ６，８、脱気後アルゴンガスで置換）１ｄに
ＥＤＣ１１ｖを含む同緩衝液０．５　ｍを加え、室温で
２時間かきませた。反応液にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
１１ｖを含む同組成のリン酸緩衝液０、５１１Ｌｌ！を
加え、４Ｃで２４時間かきまぜた。縮合物は透析操作で
精製した。ＬＴＣ４は３つのカルボキシル基を有するた
め、ランダムカップリングした複合体が得られたものと
考えられる。

対照５：インメチルクロロホルタイト法によって得られ
た酵素機［ＬＴＣ４ ＬＴＣ４１００μｇを含むテトラヒドロンラン５０μｌ
に、トリーループチルアミン２．５μ）及びイソプチル
クロロホルメイト１．３μｌを加えた。

テトラヒドロフランで反応液量を１００μｌとした後、
遮光及びアルゴンガス雰囲気下に１０Ｃで１時間かきま
ぜた。次にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ１ダを含む０．５
％炭酸水素ナトリウム水溶液０．５−に、１分間に１０
ｐＨの割合で先に得られた酸無水物反応液をかきまぜな
がら滴下し、滴下終了後４Ｃで２時間かきまぜた。反応
混合液は０、ＯＩＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，２、脱気
後アルゴンガスで置換）に対して透析した。

ＬＴＣ４の抗血清は次のようにして調製した。

ＬＴＣ４２，５雫を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２
、脱気後アルゴンガスで置換）Ｑ、５＋＋＋Ａ！に溶解
し、１゜５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（
ＤＦＤＮＢ）１０〜を含むメタノール０．７　ｍを加え
、２４Ｃで３０分間かきまぜた。反応終了後アルゴンガ
スでメタノールを留去した後ジエチルエーテル（０，５
１ＬｌＸ３回）で未反応のＤＦＤＮＢを抽出除去した。

溶液中に残存するジエチルエーテルをアルゴンガスで留
去した後、Ｂ５Ａｌ０〜を含む０．２Ｍのボレート緩衝
液（ＰＨ８，５，脱気後アルゴンガスで置換）１１１Ｌ
Ｉ！を加え、アルゴンガス雰囲気下遮光条件で室温で２
日間静置した。反応終了後、反応液を遮光下にセファデ
ックスＧ−２５カラム（登録商標、ファルマシア社製）
（１，ｏｘｓ。

ｃｌｒＬ）に負荷し、蒸留水（脱気後アルゴンガスで置
換）で溶出し蛋白画分を回収して、目的とするハプテン
抗原を得た。なお蛋白としての回収率は９５〜１００チ
であった。蛋白画分は蛋白重量として１１ｖ毎にバイア
ルに分注し、凍結乾燥後アルゴンガス雰囲気下に一８０
Ｃで保存した。ＢＳＡの分子量ｆ：５４，３００とした
場合、Ｂ５Ａｌモル当ｐ８．１４モルのＬＴＣ４が結合
していた。

家兎への感作は１回の感作につき上記で得たハプテン抗
原をＢＳＡ量として１η投与した。すなわち、上記で得
たハプテン抗原１ヤを０．５　ｄの生理食塩水に浴解し
、１Ｍのインコンプリートフロインドアジュバントと共
に注射筒内でアルゴンガス雰囲気下にエマルジョンとし
た。このエマルジョン１．５属を家兎背部頚部約１５ケ
所に皮肉投与した。感作間隔は３週間毎に実施した。抗
体価の上昇は第４同感作後１０日間の試採血で認められ
た。

実験例　各種酵素標識抗原を用いたＬＴＣ４のＥＩＡ（
液相法） 実施例及び対照１から５で調製した６種類の酵素標識抗
原と抗血清を用いて、実際にＬＴＣ４の測定をＥＩＡ（
液相法）にて行ない、その場合の検出感度、検出範囲か
ら６種類の酵素標識抗原について比較検討を行なった。

すなわち、検体または標準品を含むリン酸緩衝液１００
μｌ及び酵素標識抗原を含むリン酸緩衝液１００μノを
混合した後、３７ｉＣで１時間インキュベートした。次
に希釈家兎血清１００μｌ及び抗家兎■ｙｃｉｏｏμｌ
を加え、４ｃで一夜放置した。反応終了後、反応液を４
Ｃで３　Ｑ　Ｑ　Ｑ　ｒ７ｙｍ１０分間遠心分離し、上
清を吸引除去した後、０．１ｍＭの４−メテルーウンベ
リフニリルβ−り一ガラクトシド０．２　ｄ”ｅ加え、
３７Ｃで３０分反応した。０．１Ｍグリシン緩衝液３．
０　ｄを加え反応を停止させた後、４Ｃ１３０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離し、上溝の螢光強度を励起波長λ
６ツ３６０ルｍ、螢光波長λＥｒｎ４５０ｒＬｍで測定
した。標準ＬＴＣ；４についての測定値をもとにして作
成した検量線を第１図に示す。６種類の酵素標識体のう
ち、実施例で調製したＭＣＡＥを架橋剤として用いた酵
素標識体の場合に最もすぐれた感度及び検量範囲が得ら
れることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は６種類の酵素標識体を用いた場合のＥＩＡにお
ける検量線を示すグラフでめる。 −〇−二実施例で調製した酵素標識体 −・−：対照１で調製した酵素標識体 −ロー：対照２で調製した酵素標識体 −一一二対照３で調製した酵素標識体 −△−：対照４で調製した酵素標識体 −ムー：対照５で調製した酵素標識体 （ほか３名） 第　　１　　図 ＬＴＣＪｐｇ／ｌ、Ｌｌ＝ａ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾１は ▲数式、化学式、表等があります▼（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（III）または ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） で示される基を表わし、Ｒ＾２は酵素を表わす。）で示
   される酵素標識ロイコトリエン類。 ２、Ｒ＾１が式（II）で示される基を表わす特許請求の
   範囲第１項記載の酵素標識ロイコトリエン類。 ３、Ｒ＾１が式（III）で示される基を表わす特許請求
   の範囲第１項記載の酵素標識ロイコトリエン類。 ４、Ｒ＾１が式（IV）で示される基を表わす特許請求の
   範囲第１項記載の酵素標識ロイコトリエン類。 ５、Ｒ＾２がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである特許請求
   の範囲第１項乃至第４項のいずれかの項に記載の酵素標
   識ロイコトリエン類。