JPH05502103A

JPH05502103A - 血小板減少症判定

Info

Publication number: JPH05502103A
Application number: JP3513943A
Authority: JP
Inventors: アミラル，ジャン
Original assignee: セルビオ
Priority date: 1990-08-09
Filing date: 1991-08-09
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2013-11-05
Also published as: DE69128238D1; EP0495971B1; ES2110998T3; EP0495971A1; JP2821951B2; FR2665769A1; DE69128238T2; ATE160448T1; WO1992002823A1; FR2665769B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】血小板減少症判定発明の分野本発明は、血小板減少症（ｔｈｒｏ＋５ｂｏｐｅｎｉａ）　（ｔｈｒｏ＠−ｂｏｃｙ　ｔｏｐｅｎ　ｉａとも呼ばれる）の判定への特定の抗原物質の使用に関する。さらに本発明はこの疾患、特に種々のＴＩＥ’Ｓ物質薬物特賞薬物−ネ（キニジンによって誘導される（すなわち、キニーネ、そのジアステレオマーであるキニジンおよびその混合物によって誘導される）および特にヘパリンによって誘導される形態のこの疾患の改良された判定法に関する。

先行技術特にＭ、Ｃ，Ｂｅｒｎｄｔ等のＢｌｏｏｄ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、　１＋　１１１− １１８頁（１９８７）から、血小板減少症が多数の薬物によって誘導されうろことおよび最も頻繁な形態の血小板減少症がキニーネ／キニジンおよび特にヘパリンによって惹起されることが知られている。

ヘパリンが静脈または動脈血栓の危険性を防止するために抗凝血剤として入院患者に投与されることは知られている。統計的に１．（ｉ）入院患者の少なくとも５０％が注射によってヘパリンを投与されること、および（ｉ　ｉ）ヘパリン療法を受けた患者の１〜５％がヘパリン療法の５日日〜１５日目に特に重度に発症しうる血小板減少症に罹患することは知られている。これに関してはＪ、Ｇ、　ＫＥＬＴＯＮら、　Ｂｌｏｏｄ、　ｎ、（ｎ”　２）、　９２５−９３０　（１９８８）、　Ｂ、１１．　ＣＨＯＮＧら、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ。

Ｕ、　５３１−５４０　（１９８１）；　Ｂ、Ｈ，ＣＨＯＮＧ、　Ｂｌｏｏｄ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、　、Ｚ。

１０８−１１４　（１９８６）、　Ｄ、　５ＨＥＲＩＤＡＮら、　Ｂｌｏｏｄ、　Ｈｌ　（ｎ″′１）。

２７−３０　（１９８６）；　Ｙ、　ＧＲＵＥＬ、Ｓａｎｇ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｅ　Ｖａｉｓｓｅａｕｘ↓、（ｎ”　４）、　２３３−２３６　（１９８９）；　Ｍ、　ＳＡＭＡＭＡら＋　Ｊｏｕｒｎａｌｄｅｓ　Ｍａｌａｄｉｅｓ　Ｖａｓｃｕｌａｉｒｅｓ、７．２３７−２４２　（１９８２）　；およびＪ、　Ｃ０ＮＡＲ１ｌら、標題：　”Ｌｅｓ　ｔｈｒｏｍｂｏｐ６ｎｉｅｓ　ａ１’　ｈ６ｐａｒｉｎｅ”（“ヘパリン誘導血小板減少症”）および’Ｐｒｏｇｒａｓ　ｅｎ　Ｉ’１６ｓ＋ａｔｏｌｏｇｉｅ　４＋　Ｌｅｓ　ＰｌａｑｕｅｔｔｅｓＳａｎｇｕｉｎｅｓ’　（’Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　４＋　ＢｌｏｏｄＰｌａｔｅｌｅｔｓ’）、　１０７−１１８．　Ｄｏｉｎ出版、　Ｐａｒｉｓ　（１９８３）を参照できる。ヘパリン療法を受けて血小板減少症を発症した患者では２形態が知られている：・無症候性である、いわゆる軽度又は中等度の形態の血小板減少症、および・ヘパリン存在下で血小板に対する抗体の出現に起因する動脈又は静脈の血栓塞栓性併発症をしばしば伴う、いわゆる重度の形態の血小板減少症。

抗体のこの出現は特にり、？１．　ＬＹＮＣＩＩら、　Ｂｌｏｏｄ、　６６（ｎ ’　５）、　１１７６−１１８１．　（１９８５）、およびＭ、Ｃ，ＢＥＩｉＮＤＴら。

Ｊ、Ｇ、ＫＥＬＴＯＮら、Ｂ、Ｈ，Ｃ）ＩＯＮＧら、Ｂ、Ｈ，ＣＨＯＮＧ、Ｄ。

５ｌ（ＥＲＩＤＡＮら、およびＪ、　Ｃ０ＮＡＲＤらの上記論文において示されている〔特に、Ｊ、　Ｃ０ＮＡｌ？Ｄ等の前記論文の１１５頁特表子５−５０２１０３　（４）の表■に示されているヘパリン誘導血小板減少症の機構を参照のこと〕。

この疾患、血小板減少症の予防の問題はまだ解決されていない、それにも拘らず血小板減少症の発症の危険性の評価を可能にし、従って誘導物質薬物の投与を充分に早期に停止できる迅速でかつ信顛できるアッセイ方法が必要とされている。

現在血小板減少症の診断に用いられている方法には次のものがある：（１）血小板減少症以外の病因（感染、他の療法等）が存在しないことを調べる、この方法は長時間を要し、退屈である；（２）治療の前、中、後に血液の血小板を計数する、この方法も長時間を要し、むしろ非特異的である；又は（３）誘導物質薬物の存在下における血小板に対する抗体の出現を試験する生物学的試験（以下に記載）。

最も頻繁に用いられる生物学的検査は血小板凝集試験であることが判明しており、この試験は適合する装置を必要とし、かつ長時間を要しある場合には感度に欠ける操作を必要とする。

上記（３）に関する、今までに述べられている他の方法（特にＪ、Ｇ、　ＫＥＬＴＯＮら、　Ｂ、Ｈ，ＣＨＯＮＧら、　Ｂ、Ｈ，ＣＨＯＮＧ。

Ｄ、　５ＨＥＲＩＤＡＮら、Ｄ０本ＬＹＮＣＨら、およびＹ、　Ｇ１１ＵＥＬによる上記論文参照のこと〕は、血清ｒｇｃの血小板結合、２種類の異なるヘパリン濃度でのＩ４Ｃ放射性標識セロトニンの放出、血小板因子３の入手可能性、補体の結合、補体の溶解阻止および感作赤血球（特にヒツジ赤血球）の凝集の研究が包含される。これらの生物学的アッセイ方法は（ａ）むしろ非感受性であるか又はむしろ信鯨できないか、又は（ｂ）それらが感受性である場合には実施に長時間を要することが判明した。

本発明の目的本発明の第一の特徴によれば、誘導物質薬物（Ｚ）によって誘導される血小板減少症の判定のための新規な解決法が提供される。この新規な解決法は、（ｉ）特異的抗原物質（Ａｇ）によるか、または特に誘導物質薬物ＺおよびＡｇとのその複合体に対する抗（Ｙ）抗体（Ｙは特にＺ又はＺ−Ａ、複合体である）から成る群から選択される、被検者の匍漿中に含有される抗体型免疫物質による検出、に基づく。

出願人によって行われた研究結果に照らして、温血動物特にヒトおよび他の哺乳動物では、血小板減少症誘導性薬物の投与が抗（Ｚ）、抗（Ｚ−血小板）、抗（Ｚ−Ａｇ）および抗（Ｚ−Ａｇ−血小板）を産生して血小板を凝集もしくは活性化させ、血小板減少症を惹起することが判明している。

血小板減少症の判定のための本発明による新規な解決法は、特に血液血小板の開裂もしくは溶解によって得られ、誘導物質薬物に強い親和性を有する抗原物質（Ａｇ）を使用するもので、該抗原物質は次の機構によって抗（誘導物質薬物）抗体と反応することが意図される：Ａｇ＋＋抗（Ｙ）→Ａｇ＋−抗（Ｙ）・・・・・・・（１）式中、Ａｇｌ　は前記抗原物質Ａｇ又は前記抗原物質を含有する複合体を意味し、抗（Ｙ）は被検血漿中に含まれかつ誘導物質薬物Ｚおよび同抗体物質が存在する複合体（特にＺ− Ａｇ、、　Ｚ−血小板およびＺ−Ａｇｌ−血小板複合体）に対するものである抗体物質を意味し、これらは血液血小板凝集もしくは活性化を生じ、そして血小板減少症を惹起する。

先行技術で知られた解決法と対照的に、この新規な解決法は信顧でき、非常に感度が良く迅速に実施できるという利点を提供する。

上記反応（１）の結果はそれ自体知られた方法によって（特に凝集、ＥＩＡ、　Ｉ？ＴＡ又はＦＩＡによって）検出、表示又は増幅できる。

本発明の第二の特徴によれば、任意の誘導物質薬物、特にキニーネ／キニジンおよび特にヘパリンによって誘導される血小板減少症の確実でかつ迅速な判定のための方法が推奨される。

本発明の主題それ故本発明によれば、誘導物質薬物（Ｚ）によって誘導される血小板減少症の判定において抗原物質の使用が提案される。これに用いる抗原物質は（１）血小板中に存在し、該血小板から開裂又は溶解によって放出されかつ（ｉｉ　）誘導物質薬物（Ｚ）および／又は前記誘導物質薬物と血小板との複合体に対して強い親和性を有するフラクションから成る群から選択され、前記抗原物質は被検血漿中に含有されかつ誘導物質薬物、そのフラグメント、又は該誘導物質薬物もしくはそのフラグメントの１つを含有する生成物に対するものである抗（Ｙ）抗体物質と反応することが意図されるものである。

このような使用は免疫起源の血小板減少症を誘導するすべての薬物（Ｚ）、特にパラセタモール、アセタゾールアミド、アスピリン、アリルイソプロピルカルバミド、アルプレノロール、アムリノン、アンタゾリン、プレオマイシン、カルバマゼピン、セファロチン、クロロチアジド、クロルプロパミド、シメチジン、クロナゼバム、スルホンアミド類（特にスルファメトキサゾール、スルファメタシン、スルファメトキシピリダジン等）、スルホンアミド−トリメトプリム混合物（特に５／１の重量比でのスルファメトキサゾール−トリメトプリム混合物）、ＤＤＴ、デシブラミン、ジアゼパム、ジギトキシン、ジフェニルヒダントイン、フェ特表千５−５０２１０３　（５）ノプロフェン、ヘロイン、ヒドロクロロチアジド、イソニアシト、Ｌ　−（−） −テトラミソール、レボドーパ、リグノカイン、メブロバメート、メチシリンナトリウム、ミノキシジル、モルヒネ、ノボビオシン、有機ヒ素誘導体、オキシフェンブタシン、オフクスブレノロール、ｐ−アミンサリチル酸、ペニシリン類、プロカインアミド、プロクロルペラジン、プロピルチオウラシル、リファムピシン、スピロノラクトン、スチボフェン、スリンダクおよびトルブタミドに対して適する。

この使用は、キニーネ／キニジンおよび特にヘパリンによって誘導される、最も頻繁な形態の血小板減少症の判定に特に有利である。

前記反応（１）を包含する、任意の誘導物質薬物（Ｚ）によって誘導される血小板減少症の判定法が推奨され、この方法では抗（Ｙ）抗体物質は下記物質：・誘導物質薬物Ｚ；・前記誘導物質薬物を含有する物質（特にＺ−Ａｇ＋。

２−血小板又はＺ−Ａｇ、−血小板複合体、およびＺのポリマー）；・Ｚから誘導されるか又はＺに類似する物ｆ（特にＺのフラグメントおよびＺの代謝産物）；・Ｚから誘導されるか又はＺに類似する前記物質を含有する生成物（特にそれらの複合体）、又は・それらの混合物、に対するものである。

最後に本発明によれば、血小板減少症判定用アツセイキントであって、前記抗原＠ＩＪ質の少なくとも１種のサンプル又はその複合体の１種、および適当な場合には適当な希釈媒質および／又は他の試薬を含むアツセイキ・シトが提供される。

略語以下、略記が便宜上使用される：Ａｇ　誘導物質薬物Ｚに対して強い親和性を有する、本発明による抗原物質を意味する二Ａｇ＋　前記抗原物質Ａｇおよびそれが存在する複合体を意味する：抗（Ｚ）　誘導物質薬物（Ｚ）に対して生成された抗体を示す；抗（Ｘ）　物質Ｘに対して生成された抗体を意味する；従って、抗（Ｚ）、抗（Ｉｇ）、抗（ＩｇＡ）、抗（ｒｇＧ）および抗（ＩｇＭ）はそれぞれ誘導物質薬物Ｚ、免疫グロブリンＩｇ、　１ｇＭ類、ＩｇＧ類および１ｇＭ類に対して生成された抗体を示す；ＥＩＡ　エンザイムイムノアッセイを示す；ＥＬＩＳＡ　特定のＥＩＡ法である、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイを意味する；Ｆ（ａｂ）　パパインによる第一抗体の開裂によって得られる該抗体フラグメントを示す；Ｆ　（ａｂ”）２ペプシンによる第二抗体の開裂によって得られる該抗体フラグメントを示す；Ｐｃ　パパインによる開裂によるフラグメントＦ　（ａｂ）かう分離されるか、又はペプシンによる開裂によるフラグメントＦ（ａｂ’）ｚから分離される任意の抗体フラグメントを示す；これらフラグメントＦｃは相同であるが、パパイン又はペプシンのいずれによって開裂されたかにより構造的に幾らか異なる（Ｆ　（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）ｚ、およびＦｃの構造とそれらを得る方法はフランス特許出願第８９０４５８９号、　１９８９年４月７日出願、に説明される）；ＦＩＡ　蛍光イムノアッセイを示す；Ｈｅｐ　ヘパリン、その誘導体又はその類似体（それらの血小板との複合体をも含む）を示す；１（１？ＧＰ　冨ヒスチジン垢蛋白質を示す；１ｇ　任意の免疫グロブリンを意味する；ＩｇＡ　任意の免疫グロブリンＡを意味する；ＩｇＧ　任意の免疫グロブリンＧを意味する；ＩｇＭ　任意の免疫グロブリンＭを意味する；ＬＡ−ｐＦ４　βＴＧ（低親和性ｐＦ４）の前駆体を示す；−一　分子量を示す；ＯＤ　光学濃度（特に４９２ｎ−の波長において測定′）を意味する；ＯＰＤ　オルトフェニレンジアミノを意味する；ＰＢＰ　ＬＡ−ｐＦ４の前駆体、すなわち血小板塩基性蛋白質を示す；ｐＦ３　血小板因子３を示す；ｐＦ４　血小板因子４を示す「ＰＯＤ　ペルオキシダーゼを意味する；Ｑｎ／Ｑｎｄ　キニーネ、キニジン、それらの混合物および対応する誘導体又は類似体を意味する；Ｒｌｊ　標識手段を意味する；ＩＩＦ　リウマトイド因子を示す；ＲＩＡ　ラジオイムノアッセイを意味する；ＲＴ　室温（１５〜２５°Ｃ）を意味する；βＴＧ　ＬＡ−ｐＦ４の分解又は部分的開裂から生ずるベータートロンボグロブリンを意味する；Ｙ　誘導物質薬物Ｚ、Ｚが存在する生成物、Ｚの誘導体および／又は類似体を意味する；Ｚ　血小板減少症誘導薬物を意味する。

発明の詳細な説明本発明は免疫起源の血小板減少症の判定に関する。

本発明による抗原物質Ａｇ＋　は、一方では血小板フラグメント　（壁を含む）、開裂もしくは溶解によって血液血小板から放出されうる血小板内フラクションおよび適当な場合には血漿又は血液物質から成る抗原′＃Ｊ質Ａｇを包含し、他方では前記血小板フラグメント、前記特表平５−５０２１０３　（６）血小板内フラクションおよび前記血漿又は血液物質の複合体を包含する。

抗原物質に適用される「誘導物質薬物Ｚに対して強い親和性を有する」なる表現は、抗原物質Ａｇが誘導物質薬物Ｚ、Ｚの誘導体、Ｚの類似体およびＺを含有する生成物と容易に反応することを意味すると理解される。

誘導物質薬物Ｚ、Ｚの誘導体（特に代謝産物）、Ｚの類似体（特に、ＺがＨｅｐである場合のヘパリノイド）およびＺを含有する生成物に対するＡｇの親和性を考慮すると、Ａｇ＋　の定義に含まれる全ての生成物および複合体が得られる。

抗原物質の新規使用は（ａ）ヘパリン又は（ｂ）キニーネ／キニジンのような誘導物質薬物によって誘導される血小板減少症の判定、特に最も頻繁な形態の血小板減少症の判定に推奨され、この使用では前記抗原物質は（ｉ）特に血液血小板の開裂又は溶解によって得られる血小板フラクションであり、　（ｉｉ　）　（ａ）　）Ｉｅｐ又は（ｂ）Ｑ　ｎ／Ｑｎｄに対して強い親和性を有するフラクションから成る群から選択され、該抗原物質は被検血漿中に含有されかつ（ａ）　Ｈｅ＋１又はＨｅｐ−血小板、Ｈｅｐ−抗原物質および／又はＨｅｐ−抗原物質 −血小板複合体、又はそれぞれ（ｂ）Ｑ　ｎ　／　Ｑ　ｎ　ｄ又はＱｎ／Ｑｎｄ −血小板、Ｑｎ／Ｑｎｄ−抗原物質および／又はＱｎ／Ｑｎｄ−抗原物質−血小板複合体に対するものである（ｂ）抗ヘパリン、又は、それぞれ（６）抗−キニーネ／キニジン抗体物質と反応することが意図され（ここでＨｅｐはヘパリン、ヘパリンから誘導された化合物、ヘパリンに類似する化合物又はそれらの混合物であり、口ｎ／Ｑｎｄはキニーネ／キニジン、キニーネ／キニジンから誘導される化合物、キニーネ／キニジンに類似する化合物又はそれらの混合物である、前記抗体物質は血液血小板の凝集又は活性化を生じ、血小板減少症を惹起する。

上記定義に留意すると、誘導物質薬物Ｚがヘパリンである場合に、）Ｉｅｐなる用語は下記：・平均ｎｙ　６，０００〜３０．０００ダルトンおよび約＋５５° の旋光度［αｊ６°を有するヘパリンそれ自体；・ヘパリン誘導体、特にヘパリン金属塩（Ｃａ”、　Ｌｆ”。

Ｎａ”、　Ｍｇ”等）およびヘパリンフラグメント；・ヘパリン類似体、特にヘパソノイド類（ヘパリンとその塩、コンドロイチン類およびそれらの塩等）および６０００ダルトン未満の平均分子量を有するヘパリン類；・ヘパリンおよびその誘導体および類似体を含有する物質、特にヘパリンの複合体ならびにヘパリンの誘導体およびｌ（（以体の複合体；および・それらの混合物、から成る群から選択される任意の生成物を包含する。

上述したように、誘導物質薬物（Ｚ）によって誘導される血小板減少症の判定のための本発明による方法は、（ｉ）（ａ）誘導物質薬物、（ｂ）その誘導体、（Ｃ）その類似体、（ｄ）　Ｚ、その誘導体もしくはその類似体を含有する生成物、又は（ｅ）それらの混合物、から成る群に対して強い親和性を有し、特に血液血小板の開裂又は溶解によって得られるフラクション（Ａｇ）　；および（ｉｉ＞　少なくとも１種のＡｇ−Ｚ複合体を含有する物質、からなる群から選択される（Ａ）抗原物質（Ａｇ＋）を（Ｂ）抗（Ｙ）抗体物質と反応させることを包含し、ここで抗体（Ｙ）は（ａ）Ｚ、（ｂ）Ｚの誘導体、（Ｃ）　Ｚの類似体、（ｄ）　Ｚ、その誘導体もしくはその類似体を含有する生成物、又は（ｅ）それらの混合物に対する抗体物質である。

抗（Ｙ）抗体物質は好ましくは、抗（Ｚ）、抗（２−血小板）、抗（Ｚ−Ａｇ）および抗（Ｚ−Ａｇ−血小板）抗体から成る群から選択される；実際には、一般に抗（Ｚ）そして特に抗＜２−Ａｇ）抗体を含有する抗（Ｙ）物質の供給源として被検患者の血漿が用いられよう。

上記反応（１）を実施するには、最初にＡｇ−Ｚ複合体をＡｇとＺとの反応によって製造し、次に下記反応反応が実施されよう：Ａｇ−Ｚ＋抗（Ｙ）→Ａｇ−Ｚ−抗（Ｙ）さらに、Ａｇ−Ｚ複合体を包含する抗原物質Ａｇ、から出発する場合、このアッセイの感度が前記複合体に誘導物質薬物Ｚの適当量を加えることによって改良されることも判明した。

本発明によれば、（ａ）ヘパリン又は（５）キニーネ／キニジンによって誘導される血小板減少症の判定には、誘導物質の投与後に誘導物質薬物によって生成される自己抗体（２）と特異的である抗原（１）を前記抗体（２）と反応させることを含む方法が推奨され、この方法では前記抗原（］）は下記：（ｉ）（ａ）ヘパリン、（ｂ）その誘導体、（Ｃ）その類似体、（ｄ）ヘパリン、その誘導体もしくはその類似体を含有する生成物、又は（ｅ）それらの混合物から成る群に対して、又はそれぞれ、（ａ）キニーネ／キニジン、ｂ）その誘導体、（Ｃ）その類似体、（ｄ）キニーネ／キニジン、その誘導体もしくはその類似体を含有する生成物、又は（ｅ）それらの混合物から成る群に対して強い活性を有し、特に血液血小板の開裂又は溶解によって得られるフラクション（Ａｇ）　；および（ｉｉ）　前記フラクション（Ａｇ）とＨｅｐと、又はそれぞれ、Ｑｎ／Ｑｎｄとの少なくとも１種の複合体（ここで１（ｅｐおよびＱｎ／Ｑｎｄは前記定義のとおりある）を含有する物質、から成る群から選択される抗原物質（Ａｇｅ）である。

ヘパリン又はキニーネ／キニジンによって誘導される血小板減少症の判定に関するこの特定の方法で特表平５−５０２１０３　（７）は、抗（Ｈｅｐ）、抗（Ｈｅｐ−血小板）、抗（Ｈｅｐ−Ａｇｅ）および抗（Ｈｅｐ−Ａｇｅ−血小板）抗体から、又はそれぞれ、抗（Ｑｎ／Ｑｎｄ）、抗（Ｑｎ／Ｑｎｄ−血小板）、抗（Ｑｎ／Ｑｎｄ−Ａｇｅ　）および抗（Ｑｎ／Ｑｎｄ −Ａｇｅ−血小板）抗体から、前記のようにして自己抗体（２）が選択され、好ましい自己抗体は誘導物質薬物と手段（ｍｅａｎｓ）　Ａｇとの少なくとも１種の複合体に対するものである。

ヘパリン誘導血小板減少症の判定には、前記抗原物質Ａｇは、下記：（Ａ）血小板因子４　ｃｐｐ　４　）、（Ｂ）ｐＦ４を含有するフラクション、（Ｃ）ｐＦ４と同時に溶離される少なくとも１種の物質を含有するフラクション、（Ｄ）　ｍ換えｐＦ４およびその変異体、（Ｅ）ｐＦ４のアミノ酸塩基配列の全部又は一部を再現する合成ペプチド（特にカルボキシ末端ペプチド１〜１３又は１３〜２４）、（Ｆ）プロテオグリカン、（Ｇ）プロテオグリカン−ｐＦ４複合体、および（ＩＩ）それらの混合物、から成る群から選択されよう。

上記手段（Ｂ）と呼ばれる、ｐＦ４含有フラクションの中、特にモノマーｐＦ４の幾つかの平行鎖を含有するｐＦ４ポリマーを挙げることができる。

上記手段（Ｃ）と呼ばれる、ｐＦ４と同時に溶離される少なくとも１種の物質を含有するフラクションの中では、特に物質ＰＢＰ、　ＬＡ−ｐＦ４、βＴＧおよびそれらの混合物を挙げることができる。

上記手段（Ｇ）と呼ばれる、プロテオグリカン−ｐＦ４複合体の中では、各プロテオグリカン基が４個のテトラマーｐＦ４基に結合しているダイマープロテオグリカンからなり、平均分子１３６８，０００ダルトンを有する複合体を特に挙げることができ、該複合体はｒｐＦ４の天然型ｊとも呼ばれ、ヘパリンに対して強い親和性を有する。前記複合体は下記式によって表されうる：ヘパリン誘導血小板減少症の判定に特に好ましい抗原物質Ａｇは下記：・平均分子量８０００ダルｉンを有するモノマーｐＦ４、・ポリマーｐＦ４、特に平均分子量３２．０００ダルトンを有するテトラマーｐＦ４、・平均分子量５６，０００ダルトンを有するプロテオグリカン、・プロテオグリカン−ｐＦ４複合体、特に各プロテオグリカン基が４個のテトラマーｐＦ４基に結合するダイマープロテオグリカンからなりかつ平均分子量３６８、０００ダルトンを有する複合体、および・それらの混合物、から成る群から選択される。

本発明の最良の実施態様によれば、前記物質ＡｇとＨｅｐとの複合体である抗原物ｔ　Ａ　ｇ　＋を用いることが有利に好ましい。

ヘパン誘導血小板減少症判定の範囲内で、上記反応（１）の実施は、１°）機構：Ａｇ＋Ｈｅｐ　４Ａｇ−Ｈｅｐ　（２）による抗原物質の形成および／または活性化、２°）対応反応の１つ：Ａｇ−＋Ｉｅｐ＋抗（Ｉｌｅｐ）　→Ａｇ−Ｈｅｐ−抗（［１ｅｐ　）　（３）Ａｇ−Ｈｅｐ＋抗（Ｈｅｐ−Ａｇ）　→Ａｇ−Ｈｅｐ−抗（Ｈｅｐ−Ａｇ）　（４）Ａｇ４ｅｐ十抗０１ｅｐ−Ａｇ−血小板）→Ａｇ−Ｈｅｐ−抗（Ｈｅｐ−Ａｇ−血小板）（５）〔式中、８ｅｐは前記定義のとおりであり、ＡｇはｐＦ４、そのポリマーの１種、プロテオグリカン、プロテオグリカン−ｐＦ４複合体又はそれらの混合物である〕を包含する。

上記手段Ａ−Ｈを得るには、血液血小板を開裂又は溶解する。好都合には、ｐＦ４、そのポリマーおよびブロテオグリカンーｐＦ４複合体は、ヘパリン−アガロースゲルへの結合、およびｐＨ６，５〜７，５で０．６０以上のイオン強度を有する水性溶離剤を用いた、温度１５〜２５°Ｃにおける前記ゲルの溶離によって、溶解血小板から収集される。

本発明によれば、前記抗原物質と前記抗体物質との反応から生ずる複合体の形成は、ＥＩＡ、　ＲｒＡ、　ＦＩＡおよび凝集方法から成る群から選択される方法によって検出される。

反応（１）を発生させるためには、又はヘパリン誘導血小板減少症を判定する特殊な場合に反応（３）〜（５）を発生させるためには、前記抗原物質（１）を前記抗体物質（２）と反応させ、次にこのようにして形成された複合体を標識抗（Ｉｇ）抗体特に標識抗（ＩｇＡ）抗体、標識抗（ＩｇＧ）抗体又は標識抗（ＩｇＭ）抗体と反応させることを包含する機構による、いわゆる競合ＥＩＡ法さもなければいわゆるサンドインチＥＴＡ法を実施することが可能である。

ヘパリン誘導血小板減少症の判定の１例として、反応（３）〜（５）の生成物、すなわちＡｇ−Ｈｅｐ−抗（Ｈｅｐ）、Ａｇ−１１ｅｐ−抗（Ｈｅｐ−Ａｇ）又はＡｇ−Ｈｅｐ−抗（Ｈｅｐ−Ａｇ−血小板）はサンドインチ法によって式抗（Ｉｇ）−Ｒ”［式中、標識手段Ｒ°は適当な基質によって検出可能な酵素を包含する；従ってＲ″はＰＯＤであることができ、対応する適当な基質はＯＲＤであることができる］を有する抗体と反応されよう。

特表千５−５０２１０３　（８）ヘパリン又は他の誘導物質薬物の１つによって誘導される血小板減少症の判定の１例として、本発明による抗原物質Ａｇｅ（有利には、適当な支持体に結合）はいわゆる競合法によって被検血漿に由来する抗（Ｙ）抗体と抗（Ａｇ＋）−Ｒ” 抗体（標識手段Ｒゝは適当な基質によって検出可能な酵素を含み、上述したように、Ｒ１がＰＯＤであり対応する適当な基質がＯＰＤであることができる）とから成る混合物と反応されよう。

ヘパリン又は任意の他の誘導物質薬物によって誘導される血小板減少症判定の他の例として、適当な支持体（ラテックス粒子、リポソーム、リポソームフラグメント、ベントナイト、木炭又はコロイド状金又は、免疫化学上知られた任意の他の不活性粒子）に結合された抗原物質Ａｇ＋を、抗（Ｙ）抗体を含有する患者血漿と反応させる凝集法を用いることも可能であろう。凝集は測光法によって測定できるし又はスライド上もしくは試験管内で直接読み取ることができる。

変更態様として、抗原が適当な支持体（好ましくは壁）に結合されているものである、生成する抗原／抗体複合体は、適当な標識抗体（酵素、蛍光発生手段、放射性同位元素、着色ラテックス粒子、コロイド状金等で標識された抗体）との反応によって発生させることもできる。

実際上の見地から、光度計によって光学濃度の変化が測定される場合には、反応（１）の実施とこの反応の発生に用いられる希釈媒質は、正常血漿に対するその光学濃度が０．２またはそれ以下、好ましくは０．１またはそれ以下である水性媒質である。このような初期光学濃度はヤギ血清を含有するリン酸塩緩衝液である血漿希釈媒質を用いて得られることが好ましく、用いられる条件は正常な被検者血漿および病的被検者血漿の希釈度カ１ノ５０〜１／１００（Ｖ／Ｖ）でありそしてヤギ血清量が前記希釈媒質を基準として５〜１０容量％であることである。換言すると、測光法による判定には、被検血漿に用いられる希釈媒質は０．２またはそれ以下、好ましくは０．１またはそれ以下の光学濃度を有しよう。

通常の希釈媒質では、同じ条件下で正常血漿に対して得られる光学濃度は０．６またはそれ以上であり、病的血漿に関する分析で正確に評価されるべき光学濃度の変化の増大を可能にしない。

本発明の実施に関係する抗（Ｉｇ）と抗（Ａｇ＋）抗体はポリクローナルでもモノクローナル抗体でもいずれでも良い、モノクローナル抗体を用いる場合には、ＲＦがフラグメントＦＣに対して非常に感受性であるので、ＲＦとのありうる相互作用を避けるためにそれらのフラグメントＦ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）ｚを用いることができる（所望の）場合、但しこれは本発明の実施に本質的に必要なわけではない）。

最後に、本発明によれば、下記：・平均分子量８．０００ダルトンを有するモノマーｐＦ４、・ポリマーｐＦ４、特に平均分子量３２．０００ダルトンを有するテトラマーｐＦ４、・平均分子量５６．０００ダルトンを有するプロテオグリカン、および・プロテオグリカン−ｐＦ４複合体、特に各プロテオグリカン基が４個のテトラマーｐＦ４基に結合したダイマープロテオグリカンから成り、３７８，０００ダルトンの平均分子量を有する複合体、から成る群から選択される前記抗原物質の少なくとも１種のサンプル、又は前記抗原物質とヘパリンとの複合体の少なくとも１種のサンプル、および適当な場合には希釈媒質およびその他の試薬を包含する、ヘパリン誘導血小板減少症判定用キットが提供される。

本発明の他の利点および特徴は下記実施例の記載および図面からさらに明確に理解されよう、これらのデータは全体として、本発明を限定するものではなく、説明のために記載されるものである。

図面において：図１はｐＦ４を得るための血小板フラクシゴン分離のクロマトグラムであり；そして図２は１１５０　（バートＡ）または１／１００　（パー）Ｂ）に希釈した、血小板減少症血漿および正常血漿のＯＤを示し、前記血漿の希釈媒質にヤギ血清を加えることの利点を説明する。

実施例１ｐＦ４の製造出発物質は凍結血小板溶解物であり、これを連続３回洗浄および解凍する。このように処理された溶解物を硫酸アンモニウム含有水溶液（６０％ｗ／いと接触させる；沈澱が形成される。上清を回収し、透析操作にかける。透析物をヘパリン −アガロースゲルカラムに付着させ、そのイオン強度がｐＨ６，５〜７．５において０．６０またはそれ以上である水性溶離剤（塩勾配）を用い、ＲＴで溶離する。

自動アナライザー−セパレーターを用いた、塩勾配による溶離により２８０ｎ− での００　（縦座標）／溶離量（１）（横座４１）の系において下記の図１のクロマトグラム（１）を生ずる。この系において；ａ　「不感（ｄｅａｄ）　Ｊ量を示す；ｂ　３０＊Ｉでの第１ピークを示す（塩勾配の注入）；ｃＩ！蛋白質と痕跡量のトロンポスポンジンに関連した６０〜９０１の第１フラクシヨンを示し、７０１１において最大ビークを示す；ｄ　主としてトロンポスポンジンに関スる９０〜１３２ｍ１の第２フラクシヨンを示し、１０１００ｌ　（トロンポスポンジン＋糖蛋白質）で最大ピーク、および１１２特表千５−５０２１０３　（９）１（トロンポスポンジン）で最大ピークを示す；ｅ　主としてβＴＧに関する１３２〜１８０１の第３フラクシヨンを示し、１４２ｍ１　（ｌｉ蛋白質）で最大ピーク；及び１７０ｍ１　（βＴＧ）で最大ピークを示す；及びｆ　ｐＦ４に関する第４フラクシヨンを示す。

ビーク７０（すなわち７０ｍ１）　、１．００．１１２．１４２および１７０のフラクション及びｐＦ４フラクシジンを、ヘパリン、ヘパリンカルシウム又はヘパリン酸マグネシウムによって誘導される充分に特徴的な形態の血小板減少症に罹患した被検者からの病的血漿に対して、及び正常被検者からの血漿に対して、これら血漿を希釈媒質（１０％ｖ／ｖのヤギ血清を添加したリン酸塩緩衝液）で１１５０〜１／１００に希釈して、付着前の上清を用いて及びマイクロセルの壁もしくは底部への被覆後の不感量を用いて試験した。

免疫接合体、すなわちペルオキシダーゼ標識抗（Ｉｇ）抗体〔特に抗（ＩｇＡ） −ＰＯＤ　、抗（ＩｇＧ）−ＰＯＤ及び抗（ＩｇＭ）−ＰＯＤ　）を用いて反応を発生させ（サンドインチＥＴＡ法）ｏｐｏ／ＬＯ□カップルを用いて発色させた。

正常血漿と病的血漿との比較反応性により、ｐＦｄ含をフラクションが血小板減少症の原因である抗（Ｙ）自己抗体の結合に最も効果的であることが実証された。

実施例２ヘパリン誘導血小板減少症の判定ヘパリンおよびその金属塩によって誘導される血小板減少症の判定に下記プロトコールが推奨される。

サンドインチＩＥＩＡ法を血漿に直接適用する。Ｈｅｐ（この場合ヘパリン及び、／又はその金属塩を意味する）によって生成され、血漿中に含有される自己抗体を、血小板に由来する抗原によってヘパリン（ｐＦ４−Ｈｅｐ）の存在下結合させ、抗（ヒトＩｇ）−ＰＯＤ抗体〔特に抗（ＩｇＡ）−ＰＯＤ、抗（ＩｇＧ） −ＰＯＤ又は抗（ＴｇＭ）−ＰＯＤ）　ニよッテ発生させ、次にＯＰＤ／ＨｚＯ □カップルによって発色させる。

試薬このアッセイキットは次の試薬を含有するニー子ＪＩＪＬ覆１］コニ寸−：　Ｈｅｐ　Ｏ，０２〜１１Ｕ／ｍｌ　（好マシくハ０、１　ＩＵ／■ｌ）に対してｐＦ４２〜８μｇ／ｍｌ　（好ましくは５μｇ／■１）の割合でＨｅｐの存在下でｐＦ４抗原で被覆した、各１６カツプ（ｃｕｐｕｌａｅ）の６シツプ（ｓｈｉｐ）に分割可能なプレート１ ■皇亘旦〔：ベルオキシダーゼに結合した抗（ヒトＩｇＡ、　Ｇ又はＭ）ヤギ免疫グロブリン〔すなわち抗（ＩｇＡ）　−ＰＯＤ、抗（ＩｇＧ）−ＰＯＤ又は抗（ＩｇＭ）　−ＰＯＩＩ　）　。

希ｌ■ｉ：　１ｏ％（Ｖ／Ｖ）ヤギ血清含有リン酸塩緩衝液；ｉ！ｌＪ！！＃Ｌ：　２０倍に濃縮した界面活性剤ツイーン（Ｔ賀ＥＥＮ　＠　）２０を含有する水溶液（使用時に希釈）；ｆｉ：各々がＯＰＤ　２ｓｇを含有する５〜１０錠；及び逍１痰播豆に量、検量のための標準化基準サンプル、及びＨ，Ｏ□の供給源。

亙作皿理病的又は正常のいずれであれ、被検血漿を収集し、下記のようにして処理する：　０．１０９Ｍクエン酸三ナトリウムで血漿を取り出し、３０００ｒｐ■で１０分間遠心分離し、上清を回収する。

・検査すべき血漿サンプルは希釈媒質を用いて１１５０〜１／１００に希釈しなければならない。

手順１、ｔＪｉＬｐＦ４５　ｕｇ／ｄとＨｅｐ　Ｏ，Ｉ　ＩＩ／ｌｌｌ　とを用いて、各カップ中ｐＦ４−１１ｅｐ抗原物質の結合を実施する。

２、拉婆夏塁加被検血漿含有希釈媒Ｗ２Ｏ０ｕ　Ｉ！　（Ｈｅｐ誘導血小板減少症の原因である自己抗体が存在する）を各カップに加える。

３、インキュベーション　′ 反応媒質をＲＴで２時間インキュベートし、次に洗浄溶液を希釈後これを用いて連続３回洗浄する。

４、免股亙金体重塁皿ペルオキシダーゼ標識免疫接合体２００．ｆｆｉを各カップに加える。

５、インキュベーション　°′− 得られた反応媒質をＲＴで２時間インキュベートし、次に希釈洗浄溶液を用いて連続３回洗浄する。

６．！ＬＪ！！ＬＯＰＤ／Ｈ！０□カップル２００μｌを各カップに加え、反応媒質をＲＴで３分間インキュベートし、各カップに３−ＨｔＳＯａ　５０μ２を添加して反応を停止させ、ＯＤ値を４９２ｎ−で読み取る。

実施例３関連ヘパリンによる血液血小板の凝集を必要とする先行技術と比較することにより、実施例２のプロトロールに従って、臨床試験を平行して実施した。この目的には、ヘパリン誘導血小板減少症に罹患していると推定される各入院患者からの血漿を、各方法に対して１バツチずつ、２バツチに分けた。得られた結果を下記表Ｉに対照する。

これらの結果は下記のことを示している：（１）　ヘパリンによる血小板凝集試験が疑わしい場合は、本発明による判定によりこの疑いの解消が可能となる：患者隘４と１５は血小板減少症であり、患者隘２と２５は血小板減少症でない；（ｉｉ　）　本発明による判定により、患者ＮＣＬ１４と１６（明白に、ヘパリン誘導血小板減少症を有さなかった）および患者Ｎα１７と２２（明白に、ヘパリン誘導血小板減少症に罹患）に対する凝集試験の診断過誤の軽減が可能と特表平５−５０２１０３　（１０）なる；及び（ｉｉ）　残りの患者に対して得られた結果には良好な相互関係が存在する。

これらの臨床試験は、迅速性と確実性に関するかぎり先行技術の血小板凝集法と比較した本発明による血小板減少症の利点を証明する。

実施例４他の臨床試験ヘパリン誘導血小板減少症に罹患した患者からの血漿のバンチに対して、実施例２のプロトコールに従って、正常被検者からの血漿バッチと比較して第２系列の臨床試験を実施した。この第２系列の試験では、２１人の血小板減少症患者と３２人の正常被検者からの血漿を用い、抗原物質は下記割合：ｐＦ４５μｇ／ｍｌおよびヘパリン酸カルシウム０．１１Ｕ／謹ｌ、で製造されたｐＦ４−ヘパリン複合体であった。

下記図２に対照される結果（パート“ａ”は各被検血漿の１１５０希釈に関し、バードｂ″は前記各血漿の１／１００希釈に関する）は、正常血漿に関して常に０．１未満であるＯＤを有するために希釈媒質に１０％（ｖ／ｖ）のヤギ血清を加えることの利点を示す、　１１５０又は１／１００に希釈した正常血漿のＯＤが０．３より大きく、もしくは０．６でさえある場合には、血小板減少症血漿のＯＤを光度計で評価することが困難になる。

表■ 要約書本発明は誘導物質薬物によって誘導される血小板減少症の判定に関する。本発明によれば、　（ｉ）血液血小板中に存在し、該血小板から溶解によって放出され、かつ（ｉｉ　）誘導物質薬物（Ｚ）および／又は該誘導物質薬物と血小板との複合体に対して強い親和性を有するものであるフラクシヨンから成る群から選択される抗原’ｌｙ＋ｔが前記判定に用いられ、前記抗原物質は被検血漿中に含有されかつ誘導物質薬物、そのフラグメント又は誘導物質薬物もしくはそのフラグメントの１つを含有する生成物に対するものである抗（Ｙ）抗体物質と反応することが意図される。

本発明はさらに前記血小板減少症、特に−・バリンにより誘導された形態の血小板減少症の判定法に関する。

図面なし。

国際調査報告１−崗一−＾−社−−■ゴ／ＦＲ９１１００６５９

Claims

【特許請求の範囲】

１．誘導物質薬物（Ｚ）によって誘導れた血小板減少症の判定における抗原物質の使用であって、前記抗原物質が（ｉ）血液血小板中に存在し、該血液血小板から開裂又は溶解によって放出されかつ（ｉｉ）誘導物質薬物（Ｚ）および／又は前記誘導物質薬物と血小板との複合体に強い親和性を有するフラクションから成る群から選択され、前記抗原物質が被検血漿中に含まれかつ誘導物質薬物、そのブラウンド又は前記誘導物質薬物もしくはそのフラグメントの１つを含有する生成物に対するものである抗（Ｙ）抗体物質と反応することが意図されるものである使用。
２．前記抗原物質が（ｉ）特に血液血小板の開裂又は溶解によって得られる血小板フラクションであり、そして（ｉｉ）（ａ）Ｈｅｐ又は（ｂ）Ｑｎ／Ｑｎｄに強い親和性を有するフラクションから成る群から選択され、かつ前記抗原物質が被検血漿中に含まれ、（ａ）ＨｅｐもしくはＨｅｐ−血小板、Ｈｅｐ−抗原物質および／又はＨｅｐ−抗原物質−血小板複合体、又はそれぞれ（ｂ）Ｑｎ／ＱｎｄもしくはＱｎ／Ｑｎｄ−血小板、Ｑｎ／Ｑｎｄ−抗原物質および／又はＱｎ／Ｑｎｄ−抗原物質−血小板複合体に対するものである（ａ）抗−ヘパリン又は、それぞれ（ｂ）抗−キニーネ／キニジン抗体物質と反応することが意図されるものであり、ここでＨｅｐはヘパリン、ヘパリンから誘導される化合物、ヘパリンに類似する化合物またはそれらの混合物であり、そしてＱｎ／Ｑｎｄはキニーネ／キニジン、キニーネ／キニジンから誘導される化合物、キニーネ／キニジンに類似する化合物またはそれらの混合物であり、前記抗体物質が血液血小板の凝集又は活性化を生じて、血小板減少症を惹起するものである、（ａ）ヘパリン又は（ｂ）キニーネ／キニジンのような誘導物質薬物によって誘導された血小板減少症の判定における抗原物質の請求の範囲１記載の使用。
３．ヘパリン誘導血小板減少症の判定のために、前記抗原物質が下記：（Ａ）血小板因子４（ｐＦ４）、（Ｂ）ｐＦ４含有フラクション、（ｃ）ｐＦ４と同時に溶離される少なくとも１種の物質を含有するフラクション、（Ｄ）組換えｐＦ４およびその変異体、（Ｅ）ｐＦ４のアミノ酸配列の全部又は −部（特にカルボキシ末端ペプチド１〜１３又は１３〜２４）を再現する合成ペプチド、（Ｆ）プロテオグリカン、（Ｇ）プロテオグリカン−ｐＦ４複合体、および（Ｈ）それらの混合物、から成る群から選択され、前記抗原物質が上記で定義したＨｅｐとの反応によって活性化される請求の範囲２記載の使用。
４．抗原物質が、（Ａ）血小板因子４（ｐＦ４）、（Ｂ）ｐＦ４含有フラクション、（Ｃ）ｐＦ４と同時に溶離される少なくとも１種の物質を含有するフラクション、（Ｄ）組換えｐＦ４およびその変異体、（Ｅ）ｐＦ４のアミノ酸配列の全部又は −部（特にカルボキシ末端ペプチド１〜１３又は１３〜２４）を再現する合成ペプチド、（Ｆ）プロテオグリカン、（Ｇ）プロテオグリカン−ｐＦ４複合体、および（Ｈ）それらの混合物、と前記定義したＨｅｐとの複合体から成る群から選択される請求の範囲３記載の使用。
５．Ｈｅｐが下記；平均ＭＷ６０００〜３０，０００ダルトンおよび旋光度［α］■約＋５５°を有するヘパリンそれ自体；ヘパリン誘導体、特にヘパリン金属塩（特にＣａ２＋、Ｈｇ２＋、Ｌｉ＋およびＮａ＋）およびへバリンフラグメント；ヘパリン類似体、特にへバリノイド類（へバラミンおよびその塩、コンドロイチン類およびそれらの塩）および６０００ダルトン未満の平均分子量を有するヘパリン；ヘパリンおよびその誘導体および類似体を含有する物質、特にヘパリン並びにその誘導体および類似体の複合体；およびそれらの混合物、から成る群から選択される請求の範囲３又は４に記載の使用。
６．前記抗原物質が溶解血液血小板からヘパリン−アガロースゲルヘの結合およびその後の、ｐＨ６．５〜７．５で０．６またはそれ以上のイオン強度を有する水性溶離剤による、前記ゲルの１５〜２５℃における溶離によって収集されたものである請求の範囲３記載の使用。
７．誘導物質薬物（Ｚ）によって誘導される血小板減少症を判定する方法であって、（Ａ）（ｉ）（ａ）誘導物質薬物、（ｂ）その誘導体、（ｃ）その類似体、（ｄ）その誘導体もしくはその類似体を含有する生成物、又は（ｅ）それらの混合物からなる群に対して強い親和性を有し、特に血液血小板の開裂又は溶解によって得られるフラクション（Ａｇ）；および（ｉｉ）少なくとも１種のＡｇ−Ｚ複合体を含有する物質、から成る群から選択される抗原物質（Ａｇ１）を、（Ｂ）抗（Ｙ）抗体物質［ここで抗（Ｙ）は（ａ）Ｚ、（ｂ）Ｚの誘導体、（ｃ）Ｚの類似体、（ｄ）Ｚ、その誘導体もしくはその類似体を含有する生成物、又は（ｅ）それらの混合物、に対する抗体物質である］、と反応させることを包含する、抗原／抗体型反応を含む方法。
８．抗（Ｙ）抗体物質が抗（Ｚ）、抗（Ｚ−血小板）、抗（Ｚ−Ａｇ）および抗（Ｚ−Ａｇ−血小板）抗体並びにそれらの混合物から成る群から選択される請求の範囲７記載の方法。
９．（ａ）ヘパリン又は（ｂ）キニーネ／キニジンにより誘導される血小板減少症の判定のための請求の範囲７又は８に記載の方法において、誘導物質薬物の投与後に誘導物質薬物によって生成される自己抗体（２）に対して特異的である抗原（ｌ）を前記自己抗体（２）と反応させることを含み、前記抗原（ｌ）が下記：（ｉ）（ａ）ヘパリン、（ｂ）その誘導体、（ｃ）その類似体、（ｄ）ヘパリン、その誘導体もしくはその類似体を含有する生成物、又は（ｅ）それらの混合物、から成る群に対して、又はそれぞれ、（ａ）キニーネ／キニジン、（ｂ）その誘導体、（ｃ）その類似体、（ｄ）キニーネ／キニジン、その誘導体もしくはその類似体を含有する生成物、又は（ｅ）それらの混合物、から成る群に対して強い親和活性を有し、特に血液血小板の開裂又は溶解によって得られるフラクション（Ａｇ）；および（ｉｉ）前記フラクション（Ａｇ）とＨｅｐ又はそれぞれ、Ｑｎ／Ｑｎｄとの少なくとも１種の複合体を含有する物質［ＨｅＰとＱｎ／Ｑｎｄは前記定義のとおりである］、から成る群から選択される抗原物質（Ａｇ１）である方法。
１０．ヘパリン誘導血小板減少症の判定のための請求の範囲９記載の方法において、前記抗原物質（Ａｇ）が下記：（Ａ）血小板因子４（ｐＦ４）、（Ｂ）ｐＦ４含有フラクション、（ｃ）ｐＦ４と同時に溶離される少なくとも１種の物質を含有するフラクション、（Ｄ）組換えｐＦ４およびその変異体、（Ｅ）ｐＦ４のアミノ酸配列の全部又は −部（特にカルボキシ末端ペプチド１〜１３又は１３〜２４）を再現する合成ペプチド、（Ｆ）プロテオグリカン、（Ｇ）プロテオグリカン−ｐＦ４複合体、および（Ｈ）それらの混合物、から成る群から選択される方法。
１１．ヘパリン誘導血小板減少症の判定のための請求の範囲９記載の方法において、抗原物質が下記：（Ａ）血小板因子４（ｐＦ４）、（Ｂ）ｐＦ４含有フラクション、（Ｃ）ｐＦ４と同時に溶離される少なくとも１種の物質を含有するフラクシヨン、（Ｄ）プロテオグリカン、（Ｅ）プロテオグリカン−ｐＦ４複合体、および（Ｆ）それらの混合物、と前記定義のＨｅｐとの複合体から成る群から選択される方法。
１２．抗原物質が下記：（Ａ）平均分子量８０００ダルトンを有するモノマーｐＦ４；ポリマーｐＦ４、特に平均分子量３２，０００ダルトンを有するテトラマーｐＦ４；平均分子量５６，０００ダルトンを有するプロテオグリカン；プロテオグリカン−ｐＦ４複合体、特に各プロテオグリカン基が４個のテトラマーｐＦ４基に結合するダイマープロテオグリカシからなり、平均分子量３６８，０００ダルトンを有する複合体；およびそれらの混合物、および（Ｂ）これら生成物とＨｅｐとの複合体［Ｈｅｐは前記定義のとおりである〕、から成る群から選択される請求の範囲１０又は１１記載の方法。
１３．前記抗原物質（１）と前記抗体物質（２）との反応から生ずる複合体の形成が、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡおよび凝集法から成る群から選択される方法によって検出される請求の範囲９〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．ヘパリン誘導血小板減少症の判定のための請求の範囲９〜１３のいずれかに記載の方法であって、前記抗原物質（１）と前記抗体物質（２）とを反応させて、抗原物質−抗体物質複合体となし、次にこのようにして形成された複合体を標識抗（Ｉｇ）抗体と反応させることを含んでなる方法。
１５．標識抗体（Ｉｇ）抗体がペルオキシダーゼ標識抗（ＩＧＡ）、抗（ＩｇＧ）および抗（ＩｇＭ）抗体から成る群から選択される請求の範囲１４記載の方法。
１６．ヘパリン誘導血小板減少症の判定のための請求の範囲９〜１３のいずれかに記載の方法であって、前記抗原物質（１）を、前記抗体物質（２）および標識抗（抗原物質）抗体を含有する混合物と反応させることを含んでなる方法。
１７．測光法によるヘパリン誘導血小板減少症の判定のための請求の範囲９〜１６のいずれかに記載の方法であって、被検血漿の希釈媒質が該媒質中における１／５０〜１／１００（ｖ／ｖ）濃度での正常被検者血漿に対して０．２またはそれ以下、好ましくは０．１またはそれ以下の光学濃度を有するような媒質である方法。
１８．前記血漿希釈媒質がヤギ血清を含有するリン酸塩緩衝液である請求の範囲１７記載の方法。
１９．ヘパリン誘導血小板減少症の判定のための請求の範囲９又は１０に記載の方法であって、前記抗原物質をＨｅｐの存在下で反応させる［Ｈｅｐは前記定義のとおりである］方法。
２０．下記：平均分子量８０００ダルトンを有するモノマーｐＦ４；ポリマーｐＦ４、特に平均分子量３２，０００ダルトンを有するテトラマーｐＦ４；平均分子量５６，０００ダルトンを有するプロテオグリカン；およびプロテオグリカン−ｐＦ４複合体、特に各プロテオグリカン基が４個のテトラマーｐＦ４基に結合するダイマープロテオグリカンからなり、平均分子量３６８，０００ダルトンを有する複合体、から成る群から選択される前記抗原物質の少なくとも１種のサンプル、又は前記抗原物質とヘパリンとの複合体の少なくとも１種のサンプルと、適当な場合には、希釈媒質およびその他の試薬を含んでなる、ヘパリン誘導血小板減少症の判定キット。