ES2205593T3 - Anticuerpos contra vasp (fosfoproteina estimulada por vasodilatadores), celulas de hibridoma para su preparacion, y empleo de dichos anticuerpos. - Google Patents
Anticuerpos contra vasp (fosfoproteina estimulada por vasodilatadores), celulas de hibridoma para su preparacion, y empleo de dichos anticuerpos.Info
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Abstract
Anticuerpo monoclonal 16C2, producido por la línea de células de hibridoma que tienen el número de registro DSM ACC 2330, o fragmentos del mismo, capaces de fijar fosfoproteína estimulada por vasodilatadores (VASP), solamente cuando la VASP está fosforilada en la posición serina 239 (VASP fosfoserina 239).
Description
Anticuerpos contra VASP (fosfoproteína estimulada
por vasodilatadores), células de hibridoma para su preparación, y
empleo de dichos anticuerpos.
La presente invención se refiere al anticuerpo
16C2 dirigido contra VASP (fosfoproteína estimulada por
vasodilatadores), que solo fija VASP como antígeno cuando éste se
halla en forma fosforilada, a la célula de hibridoma para su
preparación, y al empleo del anticuerpo o de fragmentos del mismo
como agentes de diagnóstico.
Los trastornos del sistema vascular son
responsables de un gran número de enfermedades crónicas y peligrosas
para la vida, como el infarto cardíaco, la hemorragia cerebral, las
oclusiones arteriales y muchas formas de insuficiencia renal.
Las células endoteliales, que, entre otras cosas,
controlan el sistema de coagulación de la sangre, el estado
funcional de los trombocitos, la migración de las células
inflamatorias y tumorales hacia la pared vascular, el estado de
contracción y desarrollo de las células del músculo liso y por tanto
también la presión sanguínea y la estructura de las paredes
vasculares así como la neovascularización, son especialmente
importantes en la regulación del sistema vascular. Muchas de estas
funciones de la pared vascular se alteran, produciendo enfermedades
vasculares graves, una situación que finalmente puede desembocar en
infarto cardíaco, hemorragia cerebral y muchas formas de
insuficiencia renal.
En el endotelio se forman sustancias importantes
como la prostaciclina (PGI_{2}) y el monóxido de nitrógeno (NO),
también conocido como factor relajante derivado del endotelio
(EDRF), que inhiben tanto los trombocitos como las células del
músculo vascular. Las funciones del endotelio son controladas por
dichos factores endoteliales, como la prostaciclina (PGI_{2}) o el
EDRF, p.ej. NO.
En consecuencia, para tratar de manera específica
las enfermedades relacionadas con una disfunción endotelial, hay que
desarrollar parámetros bioquímicos que permitan diagnosticarla y
controlar su curso.
Se aspira a poder reconocer las disfunciones
endoteliales lo más pronto posible, es decir, en una fase en que aún
no se haya manifestado un daño irreversible, como por ejemplo las
lesiones ateroscleróticas.
La identificación precoz de una disfunción
endotelial permite desarrollar nuevos enfoques terapéuticos, que
pueden llevar al tratamiento reversible de tal alteración.
Los métodos conocidos para determinar in
vivo las funciones endoteliales son métodos invasivos de
detección, tales como la angiografía cuantitativa, u otros no
invasivos, como los métodos de diagnóstico por imágenes. Estos
métodos tienen el inconveniente de que las investigaciones se llevan
a cabo directamente sobre el paciente, son difíciles de cuantificar
y además muy caras.
Por tanto también es deseable disponer de unos
métodos bioquímicos/inmunobiológicos que permitan determinar de modo
rápido y sencillo las funciones endoteliales en material biológico
ex vivo, por ejemplo en muestras de células o sangre,
mediante ensayos rutinarios de laboratorio.
Son funciones endoteliales aquellas que se pueden
regular mediante factores endoteliales tales como prostaciclina
(PGI_{2}) o EDRF, p.ej. NO.
Uno de los objetivos de la presente invención
consiste en proporcionar reactivos para evaluar y modular la función
endotelial. De acuerdo con este y otros objetivos de la presente
invención se ofrece el anticuerpo 16C2, que va dirigido contra VASP
(fosfoproteína estimulada por vasodilatadores) y fija VASP solo
cuando está fosforilada en la posición serina 239 (VASP de
fosfoserina 239).
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar células de hibridoma que sean útiles para elaborar
los anticuerpos de la presente invención. En relación con el citado
objetivo de la presente invención, se ofrece la línea de células de
hibridoma 16C2 (DSM ACC2330), productora del anticuerpo monoclonal
16C2 dirigido contra VASP, el cual fija VASP solo cuando esta
proteína está fosforilada.
Otro objetivo más de la presente invención
consiste en ofrecer métodos para evaluar la función endotelial.
Conforme a este objetivo de la presente invención, se ofrecen
métodos para determinar el estado de fosforilación de VASP. Según un
aspecto de la presente invención se pone en contacto material
biológico con el anticuerpo 16C2 anti-VASP (la
fosfoproteína estimulada por vasodilatadores), el cual solo fija
VASP como antígeno, cuando la proteína está fosforilada en la
posición serina 239.
Según otro aspecto de la presente invención,
también se ofrece un método consistente en cuantificar la cantidad
del anticuerpo anti-VASP que fija el material
biológico. Una de las formas de ejecución específicas incluye un
método Western blot, que implica la resolución de la VASP por
electroforesis y su puesta en contacto con el anticuerpo 16C2. Otra
forma de ejecución consiste en un método de citometría de flujo, que
comprende la puesta en contacto de una muestra con el anticuerpo
16C2.
En otro aspecto más de la presente invención se
ofrecen unos métodos de diagnosis. Un método representativo supone
la puesta en contacto de una muestra con el anticuerpo 16C2 y la
evaluación del estado de fosforilación de la VASP. En una de las
formas de ejecución, este método implica la determinación
cuantitativa de la fosforilación de la VASP en la muestra. En otra
de las formas de ejecución, la muestra es de trombocitos humanos o
de sangre humana total.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar métodos para detectar marcadores de función
endotelial. En una variante se ofrece un método para detectar
sustancias que afectan al nivel de cGMP y/o cAMP, consistente en
analizar una muestra de un paciente expuesto a una sustancia que
altera los niveles de cGMP y/o cAMP, poner en contacto la muestra
con el anticuerpo 16C2 y valorar el grado de fosforilación de la
VASP respecto a una muestra de control.
En otra variante se especifica un método para
detectar disfunciones endoteliales, que supone poner en contacto una
muestra de un paciente con el anticuerpo 16C2, determinando el grado
de fosforilación de la VASP respecto a una muestra normal de
control.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar un equipo práctico para realizar los métodos de
diagnóstico aquí expuestos. En relación con dicho objetivo se ofrece
un equipo de diagnosis que lleva el anticuerpo 16C2.
La VASP humana (fosfoproteína estimulada por
vasodilatadores), que está fosforilada en los trombocitos y células
de pared vascular como respuesta a las hormonas y fármacos
hipotensores (vasodilatadores), ha sido recientemente descubierta,
aislada y analizada desde el punto de vista genético molecular
(Haffner y otros, EMBO J. 14, 19-27, 1995).
La VASP es un componente importante de la señal
vía ANF/NO/cGMP/cGMP de la proteína cinasa, que es muy relevante
desde el punto de vista fisiológico, patofisiológico y
farmacológico, y también de la señal vía cAMP/cAMP de la proteína
cinasa (U. Walter, Blick 1/97 Universidad de Würzburg, págs.
79-81, 1997). La VASP se expresa en casi todas las
células humanas y animales, encontrándose concentraciones
particularmente altas en trombocitos, células de músculo liso
vascular y fibroblastos. En las células cultivadas, la VASP está
relacionada con los contactos focales (sitios de contacto célula/
matriz), contactos célula/célula, microfilamentos y regiones
dinámicas de la membrana (p.ej. el borde anterior) (Walter y otros,
Agentes y Acciones 45S, 255-268, 1995).
La fosforilación de la VASP en el sistema
vascular está correlacionada con la inhibición de la
adhesión/agregación de trombocitos, la inhibición de la
contracción/migración del músculo liso y la inhibición de la
permeabilidad paracelular del endotelio.
La VASP se fosforila y desfosforila en tres
sitios distintos (serina 157, serina 239 y treonina 278, véase
Horstrup y otros, Eur. J. Biochem. 225, 21-27
(1994)). La serina 239 también se designa a veces serina 238,
concretamente cuando la primera metionina de la VASP no se incluye
en el cómputo.
La serina 239 de la VASP se fosforila en células
vasculares humanas e intactas (trombocitos, células endoteliales y
del músculo liso) como respuesta a los donadores fisiológicos y
farmacológicos de NO, a los inhibidores de trombocitos y a los
vasodilatadores.
La fosforilación de la serina 239 de VASP tiene
lugar con la mediación particular de proteocinasas dependientes de
cGMP, las cuales son activadas a través del cGMP por hormonas
importantes como los péptidos natriuréticos, o por sustancias y
fármacos que liberan NO. En la fosforilación de la serina 239 de
VASP también median las proteocinasas dependientes de cAMP, las
cuales son activadas por hormonas y fármacos que incrementan el
cAMP.
Aunque las proteocinasas dependientes del cAMP
fosforilan sobre todo la posición serina 157, también fosforilan la
posición serina 239 de la VASP. Asimismo, se ha observado que la
fosforilación de la VASP en la posición serina 157 está
estrechamente correlacionada con la inhibición del enlace del
fibrinógeno a la glucoproteína IIb-IIIa en las
plaquetas de la sangre humana (Horstrup y otros, Eur. J. Biochem.
225, 21-27 (1994)).
La determinación del grado de fosforilación de la
VASP en el material biológico, por ejemplo en extractos de tejidos y
células, y en particular la determinación de la fosforilación de la
VASP en la posición 239 y/o en la posición 157, sería un parámetro
bioquímico importante cuya medición permitiría desarrollar un
sistema diagnóstico para detectar todas las hormonas o fármacos que
incrementan el cGMP y/o el cAMP, como el factor natriurético atrial
(ANF), la guanilina y las sustancias y fármacos que liberan NO, y
además haría posible sacar conclusiones sobre las funciones
endoteliales in vivo.
En las patentes US 5,599,681, WO 93/21230 y en U.
Walter, Blick 1/97 Universidad de Würzburg, págs.
79-81, 1997 se han descrito anticuerpos que se unen
de manera específica a proteínas fosforiladas reversiblemente.
El objeto de la presente invención era
desarrollar unos métodos bioquímicos/inmunológicos que permitieran
determinar cualitativamente y/o cuantitativamente el grado de
fosforilación de la VASP en un material biológico, de manera rápida
y sencilla.
Este objetivo se logró mediante la provisión del
anticuerpo monoclonal 16C2, el cual solo fija VASP como antígeno
cuando ésta se encuentra en forma fosforilada, concretamente en la
posición serina 239.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere de un modo totalmente general a anticuerpos que solo fijan
VASP como antígeno cuando ésta se encuentra en forma
fosforilada.
Según el sentido de la presente invención debe
entenderse como anticuerpo tanto el anticuerpo monoclonal (Mab) y
sus fragmentos, como los fragmentos SCFV u otros dominios de
proteínas sintéticas o recombinantes que reconocen específicamente
la serina 239 en la VASP.
Los fragmentos del anticuerpo incluyen cualquier
porción suya capaz de fijar el antígeno diana, en este caso VASP o
una porción específica de la misma. Los fragmentos de anticuerpo
incluyen específicamente las porciones F(ab')_{2}, Fab,
Fab' y Fv, que pueden generarse a partir de cualquier clase de
anticuerpo, aunque normalmente se forman a partir de IgG o IgM.
Pueden prepararse usando las técnicas convencionales del ADN
recombinante o, conforme al método clásico, por digestión
proteolítica con papaína o pepsina. Véase MÉTODOS USUALES EN
INMUNOLOGÍA, capítulo 2, Coligan y otros, eds., (John Wiley &
Sons 1991-92).
Los fragmentos F(ab')_{2} suelen ser de
unos 110 kDa (IgG) o 150 kDa (IgM) y llevan dos regiones fijadoras
de antígenos unidas por el extremo mediante enlace(s)
disulfuro. Casi todo o todo el Fc está ausente de estos fragmentos.
Los fragmentos Fab' suelen ser de unos 55 kDa (IgG) o 75 kDa (IdM) y
pueden formarse, por ejemplo, reduciendo el(los)
enlace(s) disulfuro en un fragmento F(ab')_{2}.
El(los) grupo(s) sulfhidrilo resultante(s) se
puede(n) utilizar para conjugar convenientemente fragmentos
Fab' con otras moléculas, tales como reactivos de detección (p.ej.
enzimas). Los fragmentos Fab son monovalentes y de unos 50 kDa (de
cualquier fuente). Los fragmentos Fab incluyen las regiones de
cadena ligera (L) y pesada (H), variable (V_{L} y V_{H}
respectivamente) y constante (C_{L},C_{H} respectivamente) de
la porción fijadora de antígeno del anticuerpo. Las porciones H y L
están enlazadas por un puente disulfuro intramolecular.
Los fragmentos Fv suelen ser de unos 25 kDa
(independientemente de la fuente) y llevan ambas regiones variables
de cadena ligera y pesada (V_{L} y V_{H} respectivamente).
Normalmente, las cadenas V_{L} y V_{H} solo se mantienen juntas
mediante interacciones no covalentes y por tanto se disocian con
facilidad. No obstante tienen como ventaja su pequeño tamaño y
conservan las mismas propiedades fijadoras de los fragmentos Fab más
grandes. Por tanto, se han desarrollado métodos para reticular las
cadenas V_{L} y V_{H}, empleando, por ejemplo, glutaraldehído (u
otros reticulantes químicos), enlaces disulfuro intermoleculares
(por incorporación de cisteínas) y péptidos conectores. El Fv
resultante es entonces una cadena sencilla (p.ej. SCFv).
Un método preferido implica la generación de
SCFvs por procedimientos de recombinación, que permiten la
producción de SCFvs con nuevas características, mezclando y
combinando cadenas variables procedentes de anticuerpos diferentes.
En un método corriente se habilitaría un vector recombinante que
comprendiera los elementos de regulación apropiados para inducir la
expresión de una región cassette. La región cassette llevaría un ADN
codificante de un péptido conector, con unos sitios oportunos en los
extremos 5' y 3' del conector, para generar proteínas de fusión. El
ADN codificador de una región o regiones de interés puede clonarse
en el vector para formar proteínas de fusión con el conector,
generando así un SCFv.
Según otro planteamiento a manera de ejemplo, se
pueden ligar ADNs codificadores de dos Fvs con el ADN que codifica
el conector, y la fusión tripartita resultante se puede ligar
directamente a un vector de expresión convencional. Los SCFv ADNs
generados por cualquiera de dichos métodos puede expresarse en
células procarióticas o eucarióticas, en función del vector
escogido.
En el sentido de la presente invención, el
término VASP también su aplica a sus derivados, es decir a mitades,
mutantes, fragmentos o variantes de la VASP, por ejemplo la VASP de
fosfoserina 239, que está adicionalmente fosforilada en la posición
serina 157 y/o treonina 278, y también, por ejemplo, mutantes por
glicolización u otras modificaciones covalentes y elementos
estructurales importantes para las interacciones proteína/proteína.
En el sentido de la presente invención, el término VASP comprende
tanto la VASP humana como la VASP de otras especies, especialmente
de mamíferos como rata, ratón, conejo, perro, cerdo o mono.
Los anticuerpos como el 16C2 se pueden producir
usando métodos convencionales, por ejemplo según la técnica descrita
por Köhler y Milstein (Köhler y Milstein, Nature 256; 495, 1975). De
modo característico, ahí donde se desea una selectividad basada en
el grado de fosforilación se producen anticuerpos dirigidos contra
las formas fosforiladas de la VASP. Los anticuerpos aislados se
pueden chequear mediante métodos convencionales para determinar su
selectividad. Preferentemente se producen anticuerpos dirigidos
contra los fragmentos peptídicos de la VASP que contienen serina
239.
La longitud del péptido antigénico de la VASP no
tiene importancia, siempre que sea capaz de provocar una respuesta
humoral. Los típicos péptidos antigénicos tienen una longitud menor
de unos 50 aminoácidos. Algunos péptidos preferidos son de una
longitud inferior a unos 20 aminoácidos. La mayoría de péptidos
preferidos tiene una longitud comprendida entre unos 6 y 12
aminoácidos. Entre ellos figura el KLRKVS^{239}KQ o el
RKVS^{239}KQE. El péptido está preferentemente fosforilado en la
posición serina 239. Los péptidos pueden obtenerse por medios
recombinantes. Usualmente se producen por degradación proteolítica
de la VASP o por síntesis in vitro, seguida de
fosforilación.
Además se da preferencia a los anticuerpos
monoclonales que presentan las propiedades arriba mencionadas y se
pueden usar en citometría de flujo, lo cual requiere que los nuevos
anticuerpos retengan la especificidad, aunque el antígeno se someta
a unas condiciones que puedan alterar su estructura, como es de
esperar en las etapas de fijación practicadas normalmente en la
citometría de flujo. Por ejemplo, la idoneidad de los anticuerpos
para su empleo en citometría de flujo se puede examinar simplemente
probándolos.
El anticuerpo monoclonal 16C2 es adecuado para
tal uso.
Los anticuerpos se pueden preparar empleando
métodos de por sí conocidos del especialista. Cabe citar en concreto
la preparación de células de hibridoma mediante la técnica descrita
por Köhler y Milstein (Köhler y Milstein, Nature 256; 495, 1975)
para producir anticuerpos monoclonales. La especificidad de los
anticuerpos purificados puede comprobarse, por ejemplo, aplicando
los siguientes métodos de ensayo:
a) Western blot usando VASP recombinante,
fosforilada hasta diferentes grados mediante proteocinasas
dependientes de cAMP o cGMP, de modo que solo puede observarse una
señal positiva con VASP fosforilada.
b) Western blot empleando extractos celulares,
por ejemplo de células Pkt2, transfectados con VASP humana o con
VASP que ha sido mutada de distintas maneras y en la cual se ha
mutado y por tanto eliminado, en cada caso, uno de los tres sitios
de fosforilación (VASP (S157A), VASP (S239A) y VASP (T278A)), y en
cada caso proteocinasa humana de cGMP. Aquellos anticuerpos son
apropiados porque las señales positivas en el ensayo de Western
blot son eliminadas por la mutación S239A, pero no por las otras dos
mutaciones.
c) Western blot usando trombocitos humanos
tratados con diferentes vasodilatadores (p.ej. prostaciclina o
dadores de NO) o activadores de proteocinasa de cAMP o proteocinasa
de cGMP. Luego, el anticuerpo es adecuado cuando una banda
específica en el extracto solo se detecta con la VASP fosforilada.
Los anticuerpos también se pueden chequear de modo análogo usando
fibroblastos humanos o de rata y ratón.
d) Ensayos de inmunofluorescencia usando
trombocitos humanos fijados y células endoteliales. Se observa una
señal positiva cuando la VASP está presente como fosfoproteína.
Asimismo, la presente invención se refiere a la
línea de células de hibridoma 16C2, que produce el anticuerpo
monoclonal 16C2.
La línea de células de hibridoma 16C2, productora
del anticuerpo monoclonal 16C2, ha sido depositada en el Banco
alemán de microorganismos y cultivos celulares, Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, Alemania, conforme a las
reglas del tratado de Budapest del 6 de noviembre de 1997, con el
siguiente número: DSM ACC2330.
El nuevo anticuerpo es adecuado para la
determinación cualitativa y/o cuantitativa, preferiblemente
cuantitativa, de la fosforilación de la VASP, la cual tiene lugar
tanto in vitro como in vivo, en este caso en la
posición serina 239.
Los métodos cuantitativos de empleo de
anticuerpos son bien conocidos del estado técnico y pueden
encontrarse, por ejemplo, en MÉTODOS USUALES EN INMUNOLOGÍA, antes
mencionado. Estos métodos incluyen los ensayos inmunosorbentes
ligados a enzima (ELISA), los radioinmunoanálisis (RIAs) y
análogos.
El nuevo anticuerpo también es adecuado para la
determinación cualitativa y/o cuantitativa, preferiblemente
cuantitativa, de la VASP fosfoserina 239 en material biológico.
Como material biológico se entiende, por ejemplo:
los extractos celulares, los cortes de células, el tejido celular y
células tales como trombocitos, leucocitos, células endoteliales,
células de músculo liso y fibroblastos. El material biológico puede
proceder de humanos o bien de otros mamíferos como rata, ratón,
conejo, perro, cerdo o mono. Se prefiere el material biológico de
origen humano.
El nuevo anticuerpo se puede usar para determinar
cuantitativamente la VASP fosfoserina 239 en material biológico,
evaluando por medios cuantitativos los autorradiogramas de los
Western blots según métodos conocidos del especialista, por ejemplo
mediante el programa informático NIH gel blotting Image 1.6 o por
inmunofluorescencia.
Gracias a la correlación existente entre la
fosforilación de la serina 239 y la serina 157 de la VASP y la
actividad de las proteocinasas dependientes de cGMP y/o de cAMP, el
nuevo anticuerpo también es adecuado para emplear como agente
diagnóstico de las señales vía cGMP y cAMP, particularmente para
diagnosticar las señales vía cGMP.
El empleo del nuevo anticuerpo para determinar la
VASP fosfoserina 239 en material biológico mediante la técnica de
Western blot y la inmunofluorescencia también permite desarrollar
métodos de diagnóstico para detectar las sustancias, hormonas o
fármacos que aumentan el cGMP. Como ejemplos cabe citar: ANF,
guanilina y sustancias o fármacos que liberan NO. Por ejemplo, se
puede controlar el curso y la terapia de los dadores de NO, lo
cual, entre otras cosas, proporciona información sobre cualquier
fenómeno de tolerancia a los nitratos que se pueda desarrollar.
\newpage
Gracias a la correlación existente entre la
fosforilación de la serina 157 de la VASP y la actividad de las
proteocinasas dependientes de cAMP, el nuevo anticuerpo también
puede emplearse como agente para diagnosticar las sustancias,
hormonas o fármacos que incrementan el cAMP.
Por consiguiente, la presente invención también
se refiere al uso del nuevo anticuerpo o de fragmentos del mismo en
diagnosis.
Los nuevos métodos diagnósticos se pueden llevar
a cabo en el laboratorio, fuera del cuerpo humano (ex
vivo).
El nuevo anticuerpo se puede emplear para
determinar el grado de fosforilación de la VASP en material
biológico procedente de diferentes especies. Como ejemplos cabe
mencionar: hombre, rata, ratón, conejo, perro, cerdo o mono. Se da
preferencia al empleo del nuevo anticuerpo para determinar VASP
fosforilada en material biológico humano, de rata, de ratón o de
perro. Se da especial preferencia al uso del nuevo anticuerpo para
determinar VASP fosforilada en material biológico humano.
El nuevo anticuerpo o sus fragmentos también se
pueden usar como biosensores. Los biosensores son de por sí
conocidos del especialista. Se prefiere especialmente un método que
emplee un segundo componente fijador específico, tal como un
anticuerpo, una lectina o un receptor. En este caso, para la
detección y la cuantificación, uno de los componentes fijadores
específicos puede llevar un marcador detectable. Estos marcadores
son de por sí conocidos del especialista y pueden ser, por ejemplo,
un cromóforo, un luminóforo, un fluoróforo, un enzima, un isótopo
radiactivo o una partícula coloreada o incolora. Se prefiere un
método en que el componente fijador específico no marcado se acopla
directa o indirectamente, por ejemplo a través de otro anticuerpo o
de un puente biotina/ avidina, a una fase sólida, empleando métodos
de por sí conocidos del especialista.
El nuevo anticuerpo, o sus fragmentos, también se
puede marcar radiactivamente según métodos conocidos del
especialista, para que puedan emplearse en inmunogammagrafía o bien
en inmunoterapia. Asimismo, estos anticuerpos monoclonales se pueden
utilizar como portadores de compuestos activos, destinados a la
terapia de enfermedades causadas por disfunciones endoteliales.
Según el análisis de la secuencia total de
nucleótidos de los genes V del Mab 16C2, también es técnicamente
posible producir estructuras de anticuerpo, por ejemplo, insertando
las regiones hipervariables en un esqueleto de Mab humano (Jones y
otros, Nature 321, 522-525, 1986; Verhoyen y otros,
Science 239, 1534-1536, 1988).
Para cuantificar el anticuerpo unido al antígeno
en las plaquetas sanguíneas, se prefiere la citometría de flujo,
por ejemplo con muestras de sangre total fijadas, si es preciso,
mediante métodos conocidos del especialista. Los métodos de
citometría de flujo son conocidos del especialista y pueden
realizarse según lo descrito, por ejemplo en G. Otten y W.M.
Yokoyama (1992), Análisis por citometría de flujo por medio del
Becton Dickinson FACScan, Métodos usuales en inmunología, 5.4
1-5.4.19.
El análisis de la fosforilación de la VASP por
citometría de flujo, empleando el nuevo anticuerpo, en este caso de
VASP fosforilada en la posición serina 239, no está limitado a los
trombocitos humanos y también se puede llevar a cabo en otros tipos
de células, tales como los linfocitos, monocitos, leucocitos,
células endoteliales y células del músculo liso.
El empleo de la citometría de flujo para
determinar con el nuevo anticuerpo la fosforilación de la VASP, en
este caso VASP fosfoserina 239, en trombocitos de sangre humana
recién extraída, permite medir ex vivo la actividad in
vivo de factores endoteliales como el NO y la prostaciclina, y
evaluar por lo tanto la función o disfunción endotelial en
trastornos cardiovasculares como los hallados, por ejemplo, en la
arteriosclerosis, hipertensión, diabetes, insuficiencia cardíaca e
insuficiencia renal.
La medición de la fosforilación de la VASP, en
ese caso en la posición serina 239 de la VASP, con la ayuda del
nuevo anticuerpo permite controlar también la terapia de las
enfermedades arriba citadas. También se puede determinar el
desarrollo de resistencias a dicha terapia, como la tolerancia a
los nitratos.
Asimismo, la presente invención se refiere de
modo completamente general a un proceso de diagnóstico in
vitro para medir la fosforilación de la VASP, en este caso en
la posición serina 239 de la VASP, con la ayuda de otras pruebas
específicas, tales como fragmentos SCFV u otros dominios proteicos
sintéticos o recombinantes capaces de reconocer específicamente
secuencias en la VASP, sobre todo en la VASP fosfoserina 239.
También se da especial preferencia a las formas
de ejecución descritas en los ejemplos de aplicación.
Los ejemplos siguientes sirven para aclarar la
presente invención, sin limitarla en absoluto.
\newpage
Se sintetiza un péptido fosforilado y otro no
fosforilado, cada uno de los cuales comprende la secuencia
peptídica KLRKVS^{239}KQ o RKVS^{239}KQE en torno a la serina
239, mediante un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems
(modelo 431A), según la química Fmoc, conocida del
especialista.
La fosfoserina se incorpora al péptido
fosforilado, en la síntesis peptídica, usando la
Fmoc-serina
[PO(Obzl)OH-OH] de Calbiochem. Los
péptidos confirmados por MS se purifican por RPC, con una columna
VYDAC 218TP (pureza > 98%).
Una vez activados con ácido bromoacético o
bromoaceto-N-hidroxisuccinimido-éster
(Sigma), los péptidos así preparados se conjugan con KLH tiolado
(hemocianina de lapa californiana, nano herramientas). Se inmunizan
ratones Balb/c hembra (6 semanas de edad) con 4 inyecciones
subcutáneas, a intervalos de 14 días, del fosfopéptido KLH (10
\mug/ratón), que lleva el adyuvante de Freund completo en la
primera inyección y el adyuvante de Freund incompleto en las 3
inyecciones siguientes. Luego (2 semanas más tarde) los ratones se
inyectan tres días consecutivos con 10 \mug de refuerzo del
inmunógeno en PBS (solución salina de fosfato tamponado). Un día
después de la última inyección de refuerzo, se sacrifican los
ratones y se extraen los bazos. Se aíslan células del bazo y se
fusionan con células no productoras de mieloma (p.ej. células PAI,
J.W. Stocker y otros (1982) Res. Disclosure, 21713) mediante el
método establecido por Köhler/Milstein.
Para comprobar si las células de hibridoma tienen
capacidad de secretar anticuerpos dirigidos contra la VASP
fosfoserina 239, se usa un método de chequeo diferencial mediante
péptido fosforilado/no fosforilado o VASP humana recombinante
fosforilada/no fosforilada.
Para el ensayo con péptido fosforilado/no
fosforilado, estos péptidos se acoplan por enlace covalente a unas
placas de ADN-FIJADO A-ELISA (de
Costar) y los hibridomas sobrenadantes se chequean por el método
ELISA.
Los sobrenadantes que reconocen el fosfopéptido
se examinan adicionalmente por si tienen la capacidad de reconocer
VASP humana recombinante (sistema E. coli) completamente
fosforilada, pero no la correspondiente VASP desfosforilada.
Los anticuerpos monoclonales, procedentes de los
sobrenadantes de células de hibridoma, que han sido identificados
como positivos mediante los métodos anteriormente descritos, se
pueden purificar, preferiblemente, a partir de cultivos de células
de hibridoma exentos de suero, mediante cromatografía de adsorción
tiofílica (POROS 50-OH, nanoherramientas).
Usando distintos métodos de ensayo, se pudo
identificar y analizar uno de los anticuerpos separados (clon 16C2)
como anticuerpo monoclonal de la clase IgG1 \kappa de ratón, que
solo reconoce la VASP cuando esta proteína está fosforilada en la
posición serina 239. En las condiciones utilizadas, el anticuerpo
16C2 no reconoce otras proteínas ni otros sitios de fosforilación
de la VASP.
Los anticuerpos monoclonales que reconocen
específicamente VASP fosfoserina 157 o VASP fosfotreonina 278 se
pueden aislar de modo análogo al método descrito anteriormente, con
el uso de péptidos fosforilados que comprenden como antígeno las
conocidas secuencias peptídicas alrededor de la serina 157 o la
treonina 278 de la proteína VASP, respectivamente.
La generación de anticuerpos monoclonales que
reconocen la VASP fosforilada en posición Ser 239 también está
descrita en Smolenski y otros, J. Biol. Chem., 32,
20029-20035 (1998).
Análisis en trombocitos humanos lavados de la
fosforilación de la VASP en la posición serina 239
Se preparan trombocitos humanos y se estimula la
fosforilación de la VASP, incubándolos con sustancias vasoactivas,
según se describe (Eigenthaler y otros, Eur. J. Biochem, 205,
471-481, 1992). La reacción se para por fijación con
formaldehído, durante 10 minutos a temperatura ambiente, hasta una
concentración final de aproximadamente 3,5%. Tras un proceso de
lavado (opcional), las células se permeabilizan con Triton
X-100 y luego se lavan. La tinción se efectúa
incubando con el anticuerpo apropiado, el cual se marca
directamente como fluorescente o se colorea con un segundo
anticuerpo marcado como fluorescente. Para este fin conviene
emplear 0,5-5 \mug, preferiblemente
1-2 \mug de anticuerpo primario por ml. Cuando se
usa Mab 16C2 como anticuerpo primario, son adecuados, por ejemplo,
1,7 \mug/ml. Luego en el citómetro de flujo se determina y analiza
la fijación del anticuerpo 16C2, tal como está descrito, por
ejemplo, en G. Otten y W. M. Yokoyama (1992), Análisis por
citometría de flujo mediante el Becton Dickinson FACScan, Métodos
usuales en inmunología, 5.4 1-5.4.19.
En paralelo con la citometría de flujo (ejemplo
2), se emplea un Western blot para determinar la fosforilación de
la Vasp en extractos celulares, mediante métodos que son familiares
para el especialista y que se describen por ejemplo en Eigenthaler y
otros (Eur. J. Biochem, 205, 471-481, 1992). La
concentración del anticuerpo utilizado está comprendida, por
conveniencia, entre 0,1 y 5, preferiblemente entre 0,5 y 1,0
\mug/ml, según el contenido de VASP en la muestra objeto de la
medición. Por ejemplo, para trombocitos humanos y de rata es
ventajoso usar 0,5 \mug de anticuerpo/ml, mientras que para las
células endoteliales de cordón umbilical humano es ventajoso usar
1,0 \mug de anticuerpo/ml. En principio, el análisis de la
fosforilación de la VASP en la posición serina 239 mediante Western
blot de extractos celulares y citometría de flujo con células
fijadas dio idénticos resultados.
Se incuba sangre total o PRP con sustancias
vasoactivas y la incubación se para por fijación con formaldehído,
durante 10 minutos a temperatura ambiente, hasta una concentración
final de aproximadamente 3,5%. El PRP se prepara partiendo de
sangre total, tal como está descrito en Eigenthaler y otros (Eur. J.
Biochem, 205, 471-481, 1992). Los trombocitos del
PRP se aglomeran por centrifugación y se resuspenden en un tampón
fisiológico (Eigenthaler y otros, 1992, véase arriba). Los
trombocitos se permeabilizan y luego se tiñen tal como se ha
descrito anteriormente para los trombocitos lavados.
Se trataron trombocitos humanos con 100 \muM de
SNP. Se tomaron muestras de células a los 0, 1, 3 y 5 minutos. Se
usó el anticuerpo 16C2 para determinar la fosforilación de VASP en
la posición serina 239, de manera paralela, por análisis Western
blot de extractos de las muestras celulares extraídas y mediante
citometría de flujo en trombocitos humanos fijados y
permeabilizados del modo descrito anteriormente. Los
autorradiogramas de los Western blots se analizaron
cuantitativamente con el programa informático NIH gel blotting
Image 1.6.
En la tabla 1 se registra el aumento de la unión
anticuerpo 16C2/VASP fosfoserina 239 (% de incremento, 5 minutos =
efecto máximo = 100%).
| t | % de aumento | Trombocitos | Extracto celular |
| (minutos) | Citometría | Western blot | |
| 0 | 0 | 0 | |
| 1 | 62,5 | 83,5 | |
| 3 | 89,3 | 95,2 | |
| 5 | 100,0 | 100,0 |
Se fosforiló VASP recombinante purificada y
marcada con hexahistidina (25 \mug/ml), mediante una subunidad
catalítica purificada (11 \mug/ml) de proteína cinasa cAMP (cAPK)
o proteína cinasa cGMP (cGPK; 24 \mug/ml) purificada. Se
extrajeron alícuotas de la mezcla reaccionante a intervalos fijos,
se mezclaron enseguida con solución de paro que contenía SDS, se
hirvieron y se fraccionaron mediante SDS-PAGE. La
fosforilación de la VASP se analizó por tinción con azul Coomassie
y Western blot, empleando un anticuerpo policlonal de la VASP (M4,
Halbrügge M. y otros, J. Biol. Chem. 265, 3088-3093
(1990), que puede obtenerse de Alexis Corporation, Alte
Hauensteinstrasse 4, CH-4448 Läufelfingen, Suiza) o
el anticuerpo monoclonal de la VASP 16C2. En la tinción con azul
Coomassie, la banda por debajo de la VASP es cAPK, mientras que la
banda por encima de la VASP es cGMP-PK. El
SDS-PAGE efectuado demostró el cambio en el
comportamiento migrador de la VASP, de 46 a 50 kDA, debido a la
fosforilación de la serina 157, que es preferida por la cAPK. La
fosforilación de la serina 239 (detectada por el anticuerpo 16C2) es
preferida por la cGMP-PK.
Se investigó en células Ptk2 la fosforilación de
VASP humana transfectada y de mutantes de VASP. Junto con proteína
cinasa humana 1â de cGMP se transfectó, en células Ptk2,
VASP de tipo natural y mutantes de VASP con sitios de fosforilación
(alteración de serina 157, serina 238 o treonina 277) mutados
(inactivados) y se expresaron bajo control del promotor CMV. Las
células Ptk2 hospedan muy poca cantidad de VASP endógena y de
proteína cinasa cGMP. Dos días después de la transfección, las
células se incubaron durante 30 minutos con 30 \muM de
8pCPT-cGMP y luego se aislaron los extractos
celulares. Luego se investigó la fosforilación de la VASP en estos
extractos celulares mediante Western blots con el anticuerpo
policlonal M4 y el anticuerpo monoclonal 16C2. El cambio de la
VASP, en función de la fosforilación, de 46 kDA a 50 kDA, ya no se
detectó al inactivar la serina 157 (mutación S157A). La señal
reconocida por el anticuerpo 16C2 ya no se detectó al inactivar la
serina 239 (S239A). En estos análisis, las mutaciones de treonina
277 se comportaron como VASP natural.
Se incubaron trombocitos humanos (0,7
\texttimes 10^{9} células/ml) con 1 \muM de PgI_{2}
(prostaciclina), 0,5 mM de
5,6-DCI-cBIMPS (análogo de cAMP
permeable por la membrana celular), 10 \muM de SNP
(nitroferricianuro sódico) o 1 mM de 8pCPTcGMP (análogo de cGMP
permeable por la membrana celular). Se tomaron unos alícuotas (2,8
\texttimes 10^{7} células/ml) a intervalos prefijados, se
mezclaron con la solución de paro SDS y se hirvieron. Luego se
investigó la fosforilación de la VASP, empleando el método de
Western blot. Los análisis se efectuaron mediante el anticuerpo
policlonal M4 o el anticuerpo monoclonal 16C2. La fosforilación de
la serina 157 se cuantificó por el desplazamiento de 46 a 50 kDa,
mientras que la fosforilación de la serina 239 se cuantificó
mediante la señal proporcionada por el anticuerpo 16C2.
Se incubaron trombocitos de rata (0,7
\texttimes 10^{9} células/ml), durante 5 minutos, con 100
\muM de nitroferricianuro sódico (SNP), 10 \muM de
prostaglandina E1 (PgE1) o sin ninguna de las dos adiciones. Los
extractos de estos trombocitos de rata se analizaron por Western
blot. Así se demostró que el desplazamiento de la VASP en función de
la fosforilación, de 46 kDa a 50 kDa (fosforilación de la serina
157), y la señal dependiente de la fosforilación proporcionada por
el anticuerpo 16C2 (fosforilación de la serina 239) también tuvieron
lugar en los trombocitos de rata. Asimismo, se obtienen resultados
similares con trombocitos de ratón.
Se depositaron trombocitos humanos (de plasma
rico en plaquetas, PRP) sobre un portaobjetos, dejando que se
adhirieran y extendieran durante 45 minutos. Luego se incubaron
estos trombocitos sobre el portaobjetos, durante 15 minutos, sin (A
y C) o con 100 \muM de 8pCPTcGMP (B y D). Después, las células se
fijaron inmediatamente con paraformaldehído al 4% y se
permeabilizaron con 0,2% de Triton X-100. Luego se
incubaron con el anticuerpo policlonal M4 (1:1000) o con el
anticuerpo monoclonal 16C2, seguidos de los usuales anticuerpos
secundarios. Las fotografías muestran el aspecto de la señal
dependiente de la fosforilación al usar el anticuerpo monoclonal
16C2, mientras que la señal con el anticuerpo policlonal M4 (en la
inmunofluorescencia, la suma de VASP de 46 kDa y de 50 kDa, puesto
que no hay fraccionamiento) es independiente de la
fosforilación.
Claims (12)
1. Anticuerpo monoclonal 16C2, producido por la
línea de células de hibridoma que tienen el número de registro DSM
ACC 2330, o fragmentos del mismo, capaces de fijar fosfoproteína
estimulada por vasodilatadores (VASP), solamente cuando la VASP está
fosforilada en la posición serina 239 (VASP fosfoserina 239).
2. El uso del anticuerpo 16C2 o de fragmentos del
mismo, tal como se define en la reivindicación 1, como agente
diagnóstico.
3. El uso de la reivindicación 2 para la
determinación cualitativa o cuantitativa de VASP fosfoserina 239 en
material biológico.
4. El uso de la reivindicación 3, en que el
material biológico está formado por trombocitos humanos o sangre
humana.
5. El uso de la reivindicación 3 ó 4, en que la
determinación de la fosfoserina 239 se realiza mediante la técnica
de Western blot.
6. El uso de la reivindicación 3 ó 4, en que la
determinación de la fosfoserina 239 se realiza mediante citometría
de flujo.
7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 2
a 6 para detectar sustancias que afectan al nivel de cGMP y/o de
cAMP en material biológico.
8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 2
a 6 para determinar la actividad in vivo de factores
endoteliales.
9. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 2
a 8 para detectar una disfunción endotelial.
10. La línea de células de hibridoma DSM ACC 2330
productora del anticuerpo monoclonal 16C2.
11. Un equipo de diagnóstico que contiene el
anticuerpo 16C2 o un fragmento del mismo, tal como se define en la
reivindicación 1.
12. Un proceso de diagnóstico in vitro que
comprende el uso del anticuerpo 16C2 o de fragmentos del mismo, tal
como se define en la reivindicación 1, para determinar o influenciar
el grado de fosforilación de la fosfoserina 239 de la VASP y/o las
interacciones proteicas de la VASP en un material biológico.
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