JP2005508195A - 組換えタンパク質のｉｎｖｉｖｏ生産と抗体生成用用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、タンパク質をコードする核酸を動物に投与することによって該タンパク質を生産する方法を対象とする。動物へ核酸を投与すると、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質が生産され、このタンパク質は動物から生物試料を採取することによって単離される。上記の方法により、任意の目的とする核酸配列によってコードされるタンパク質を迅速かつ効率的に生産および単離できるようになり、この方法はタンパク質配列に結合する抗体を生成するためにも用いることができる。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質生産および抗体生成のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、基礎研究や様々な疾病の診断および治療にとって有用な道具である。タンパク質特異的結合抗体によって、生物試料中の特定のタンパク質種を精確に同定および定量することができる。さらに、タンパク質とその結合抗体との間の相互作用によって、タンパク質の活性または機能を調節することができる。タンパク質の活性または機能の調節は、所与のタンパク質の活性が過剰もしくは不十分であることを特徴とする疾病状態の治療に特に有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
タンパク質特異抗体の生成には、抗体を得ようとするタンパク質を精製したものを用いた免疫化が伴うことが多い。特異的かつ適切に折り畳まれたタンパク質を用いて免疫化するために十分な量を提供することが、抗体生成の分野における一般的な課題となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、タンパク質をコードする核酸を動物に投与することによる、タンパク質の生産方法に関するものである。上記方法によれば、任意の目的核酸配列を動物に投与することができる。動物への核酸の投与に続いてｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質が生産され、このタンパク質は動物から生体試料を採取した後に単離することができる。
【０００５】
上記方法に従って生産されたタンパク質は、第２の動物において、目的タンパク質配列に結合する抗体を生成するために用いることができる。いくつかの例において、本方法は、最初に生物試料からタンパク質を単離することを含む。次にこの単離タンパク質を、動物を免疫化するために用いる。したがって、本発明は、標的アミノ酸配列に対する抗体の効率的な生成を可能にする。
【０００６】
１つの態様において、本発明は次の（１）〜（４）の工程を実施することによる抗体の生成方法を含む。（１）第１の哺乳動物に融合タンパク質をコードする核酸を投与して、該第１の哺乳動物内で融合タンパク質を発現させる工程であって、融合タンパク質は第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とを含み、第２のアミノ酸配列は特異的結合対の第１のメンバーを含む工程。（２）第１の哺乳動物から、融合タンパク質を含む生物試料を採取する工程。（３）特異的結合対の第２のメンバーを、特異的結合対の第１のメンバーを介して融合タンパク質に結合させることにより、融合タンパク質を単離する工程。（４）融合タンパク質を第２の哺乳動物に投与することにより、第２の哺乳動物において融合タンパク質の第１のアミノ酸配列に対する抗体反応を生起させる工程。
【０００７】
１つの実施形態において、本発明は、第２のアミノ酸配列から第１のアミノ酸配列を切断する工程も含む。
１つの実施形態において、特異的結合対の第１のメンバーは、少なくとも５アミノ酸長のペプチドである。例えば、特異的結合対の第１のメンバーは、免疫グロブリンＦｃドメインであってもよい。
【０００８】
本方法において用いる生物試料の例としては、血清または組織溶解物が挙げられる。本方法は、生物試料の溶解物を生成する追加の工程をさらに含んでいてもよい。
１つの実施形態において、特異的結合対の第２のメンバーは抗体、例えばモノクローナル抗体である。
【０００９】
本方法は、動物から生物試料を採取する前に、動物にプロテアーゼ阻害剤を投与する追加の工程を含んでいてもよい。
本方法は、融合タンパク質を固定化する追加の工程を含んでいてもよい。
【００１０】
１つの実施形態において、融合タンパク質の第１のアミノ酸配列は、天然に存在するあるヒトタンパク質の全体または一部と同一である。
本方法は、融合タンパク質の第１のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を含む抗血清を第２の哺乳動物から単離する追加の工程を含んでいてよく、該工程において、抗体は融合タンパク質の投与後に第２の哺乳動物内で産生される。
【００１１】
本方法は、第２の哺乳動物からＢリンパ球を採取して、該Ｂリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで第２の細胞と融合してハイブリドーマを作成する追加の工程を含んでいてもよく、該工程において、ハイブリドーマは、融合タンパク質の第１のアミノ酸配列に特異的に結合するモノクローナル抗体を生産する。
【００１２】
本方法は、特異的結合対の第２のメンバーに結合しない生物試料の成分を除去することにより精製融合タンパク質を生産する追加の工程を含んでいてもよい。
他の態様において、本発明は、次の工程（１）〜（３）を実施することによる抗体の生成方法を特徴とする。（１）第１の哺乳動物に、タンパク質をコードする単離核酸を投与して、該第１の哺乳動物内で前記タンパク質を発現させる工程。（２）第１の哺乳動物から、前記タンパク質を含む生物試料を採取する工程。（３）前記タンパク質を第２の哺乳動物に投与することにより、第２の哺乳動物において前記タンパク質に対する抗体反応を生起させる工程。
【００１３】
本方法において用いるタンパク質は、随意で融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とを含んでいてもよく、該第２のアミノ酸配列は特異的結合対の第１のメンバーを含む。１つの実施形態において、特異的結合対の第１のメンバーは、少なくとも５アミノ酸長のペプチドである。例えば、特異的結合対の第１のメンバーは、免疫グロブリンのＦｃドメインであってもよい。
【００１４】
本方法において用いる生物試料には、例えば、血清または組織溶解物があげられる。本方法は、生物試料の溶解物を作成する追加の工程を含んでいてもよい。
本方法は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体を含む抗血清を第２の哺乳動物から単離する追加の工程を含んでいてもよく、該工程において、抗体は前記タンパク質の投与後に第２の哺乳動物において産生される。
【００１５】
本方法は、第２の哺乳動物からＢリンパ球を採取し、該Ｂリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで第２の細胞と融合してハイブリドーマを作成する追加の工程を含んでいてもよく、該工程において、ハイブリドーマは前記タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する。
【００１６】
本発明の利点は、大量のタンパク質またはその一部をその天然型のコンフォメーションを有する状態で生産するための迅速かつ効率的な方法を提供できることにある。次いで精製タンパク質を、対応する天然型タンパク質配列に結合する抗体を生成するために用いることができる。上記生産方法では、タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ生産および精製に伴う、時間と費用と労力を要する作業を回避している。
【００１７】
本発明の他の利点は、細菌内での組み換えタンパク質の生産に付随するいくつかの問題を回避できることにある。細菌内で発現される哺乳動物タンパク質は、翻訳後修飾を欠き、自らの天然型のコンフォメーションを有していないことも多い。さらに、核酸構築物の中には細菌内では殆ど使用されないコドンを含むものがあるため、ある種の細菌内では翻訳さえ不可能なタンパク質もある。
【００１８】
特に定義しない限り、本発明中で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施および試験の際に、本発明中に記載のものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、最適な方法および材料は後述の通りである。本発明中に記載のすべての出版物、特許出願、特許および他の参照文献は、参照によりその全体を本願に組み込むものとする。用語に矛盾が生じた場合は、本明細書が優先する。さらに、記載されている物質および方法は単に説明のために過ぎず、限定しようとするものではない。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、目的とするタンパク質またはその一部をコードする核酸を動物に投与することにより、該タンパク質に対する抗体を生成する方法を対象とする。前記タンパク質またはその一部を動物内で生産して該動物から採取した後、第２の動物を免疫化して前記タンパク質に対する抗体を生成するために用いる。いくつかの例において、本方法は、前記タンパク質に特異的に結合する（例えば、アフィニティタグを含むように人為操作されたタンパク質の一部に結合する）アフィニティ試薬を用いることよって、タンパク質を単離する工程を含む。
【００２１】
（核酸構築物）
本発明は、融合タンパク質をコードする様々な核酸構築物を使用することを包含する。本発明に記載する核酸によってコードされる融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列と呼ぶことにする少なくとも２つの異種アミノ酸配列を含んでいる。これらの２つのアミノ酸配列は異種起源のものであるので、融合タンパク質の配列は、天然に存在するタンパク質のものとは異なっている。
【００２２】
第１のアミノ酸配列は基本的に何であってもよい。第１のアミノ酸配列は、この配列上で様々な用途を実施できるという点で、一般に本発明の方法の焦点となる。様々な用途としては、限定はされないが、この配列に結合する抗体を生成するための方法等が挙げられる。１つの例において、第１のアミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質の全部または一部と一致する。好ましくは、第１のアミノ酸配列は少なくとも６，１０，２５，５０，１００または２００アミノ酸長である。別の例において、第１のアミノ酸配列は抗体によって認識可能なエピトープを含む。
【００２３】
融合タンパク質の第２のアミノ酸配列は、融合タンパク質の固定化および／または精製を可能にする配列を含む。したがって、第２のアミノ酸配列は、特異的結合対の第２のメンバーに結合可能な特異的結合対の第１のメンバーを含んでいる。特異的結合対の１つの例において、対の第１のメンバーは、対の第２のメンバー、例えばモノクローナル抗体などの抗体が結合する一続きのアミノ酸である。このような結合対の１つの実施形態は、免疫グロブリンＦｃ定常領域（特異的結合対の第１のメンバー）と、抗免疫グロブリンＦｃ定常領域抗体（特異的結合対の第２のメンバー）との対である。特異的結合対の他の例において、結合対の第１のメンバーは、非タンパク質アフィニティ試薬が結合する一続きのアミノ酸である。このような特異的結合対の例としては、ポリヒスチジンタグ（特異的結合対の第１のメンバー）と、ニッケルアフィニティ試薬（特異的結合対の第２のメンバー）との対が挙げられる。例えば、６〜１０個のヒスチジン残基からなるタグが、融合タンパク質内に含まれる場合には、このタグを用いて、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を行うことができる（例えば、コープランド（Ｃｏｐｅｌａｎｄ）ら（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ 第３７９巻、１６２〜１６５頁を参照のこと）。
【００２４】
融合タンパク質は、本明細書で記載される第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列に加えて、別のアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、融合タンパク質の輸送を行うターゲティング配列（たとえば、ターゲティング配列は、融合タンパク質を特定の細胞内コンパートメントや原形質膜に誘導することができるか、あるいは、タンパク質の分泌を誘導することができる）を用いることができる。１例において、融合タンパク質はシグナルペプチド配列を含む。シグナルペプチド配列とは、生成したばかりの分泌型および膜結合型ポリペプチドのアミノ末端に位置する短い（通常は約１５〜６０アミノ酸）連続した一続きのアミノ酸のことをいい、このシグナルペプチド配列は、前記ポリペプチドの様々な場所への搬送を誘導する。シグナル配列は通常は、約４〜１５個のアミノ酸の疎水性コアを含み、該疎水性コアのすぐ直前には塩基性アミノ酸がある場合が多い。シグナルペプチドのカルボキシル末端には、シグナルペプチド切断部位を規定する１個の介在アミノ酸によって隔てられた一対の小さい非荷電アミノ酸が存在する（例えば、フォン・ヘイジュン（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ）（１９９０年）、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．、第１１５巻、１９５〜２０１頁を参照）。
【００２５】
融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列に加えて、第１および／または第２のアミノ酸配列と実質的に同じ機能を行う他のアミノ酸配列を随意で含んでいてもよい。例えば、融合タンパク質は、特異的結合対の追加のメンバー、および／または、抗体生成の対象となる追加のアミノ酸配列を含んでいてもよい。このように、１つの融合タンパク質は、第２のアミノ酸配列に加えて、異なるタンパク質に由来する複数の配列（または同一タンパク質に由来する複数のエピトープ）を含んでいてもよく、様々な配列に対する抗体を生成するために用いることができる。
【００２６】
融合タンパク質は、随意で、該融合タンパク質の切断を可能にするアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、タンパク質切断部位は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間に配置することができる。このような切断部位によって、融合タンパク質を精製した後に、第２のアミノ酸配列から第１のアミノ酸配列を分離することが可能になる。例えば、融合タンパク質は、その分子内の他の場所には存在しない、酵素的切断のための特異的認識部位を含むアミノ酸配列を含んでいてもよい。有用な部位の例としては、血液凝固第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼによって認識および切断される配列が挙げられる。切断酵素は、その認識配列を参照して選ぶことができる。
【００２７】
融合タンパク質は、随意で、１つまたはそれ以上のリンカー配列を含んでいてもよい。リンカー配列は、第１および／または第２のアミノ酸配列に間隔（スペーシング）と方向性とを与えて、各配列の生物学的機能を促進するために用いることができる。リンカー配列は一般に、２つの配列の間を、それぞれの配列に対して二次構造への折り畳みを確保する十分な距離を隔てて分離する。機能的タンパク質ドメインを適切に分離するために、約２０アミノ酸長のリンカー配列を用いることができるが、それよりも長いもしくは短いリンカー配列を用いることもできる（例えば、３〜１００アミノ酸長）。リンカーとして有用なアミノ酸配列としては、限定はされないが、（ＳｅｒＧｌｙ４）ｙ（配列番号：１）（式中、ｙは少なくとも２）、またはＧｌｙ４ＳｅｒＧｌｙ５Ｓｅｒ（配列番号：２）が挙げられる。好ましいリンカー配列は、式（ＳｅｒＧｌｙ４）４（配列番号：３）を有する。他の好ましいリンカーは、配列（（Ｓｅｒ４Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）（配列番号：４）を有する。あるいは、融合タンパク質はリンカー配列を持たなくてもよい。
【００２８】
本発明は、タンパク質をコードする単離核酸を使用する方法も包含する。「単離」核酸は、その構造が、天然に存在する核酸の構造または２つ以上の遺伝子にわたる天然に存在するゲノム核酸の任意断片の構造とは同一ではない核酸分子である。上記実施形態において、核酸によってコードされるタンパク質は融合タンパク質である必要はなく、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列の全部または一部と同一の配列を含んでいてもよい。好ましくは、本タンパク質は、天然に存在するタンパク質の少なくとも６，１０，２５，５０，１００または２００個連続したアミノ酸と同一のアミノ酸配列を含んでいる。
【００２９】
核酸構築物は、従来の分子生物学技術を用いて調製することができる。核酸は、コーディング配列の発現を誘導する調節エレメントに作動可能なように連結させてもよい。調節エレメントとしては、限定はされないが、誘導性もしくは非誘導性のプロモーター、エンハンサー、および当業者によって知られる、遺伝子発現を駆動またはいずれにせよ調節する他のエレメントが挙げられる。このような調節エレメントとしては、限定はされないが、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子、レトロウィルスＬＴＲプロモーター、およびＳＶ４０の初期または後期プロモーターが挙げられる。好ましい実施形態において、核酸の発現はヒトＣＭＶ前初期プロモーターによって制御される。
【００３０】
核酸構築物は好ましくは、ベクター、例えば、プラスミドやウィルスベクターなどの発現ベクターに組み込まれる。核酸分子を効率的に翻訳するためには、特別の開始シグナルが必要になるかもしれない。そうした翻訳制御シグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列と同等の配列）が挙げられる。さらに、開始コドンは、インサート全体を確実に翻訳できるように所望のコーディング配列の読み枠と同じ読み枠でなければならない。翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の様々な起源のものであってよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ、またはイントロンを含めることによって高めてもよい（ビトナー（Ｂｉｔｔｎｅｒ）ら、（１９８７年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ 第１５３巻、５１６頁を参照）。
【００３１】
（タンパク質のＩｎ Ｖｉｖｏ生産）
タンパク質、例えば融合タンパク質は、本発明に記載の核酸を、動物、例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、またはヒトなどの哺乳動物に投与することによって生産される。核酸の投与に続いて、ｉｎ ｖｉｖｏにて翻訳（ならびに、核酸がＤＮＡ配列である場合には転写も）が起こり、動物内でタンパク質が生産される。核酸は、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、鼻腔内、または皮下などの様々な経路によって動物に投与することができる。
【００３２】
核酸は「裸（ｎａｋｅｄ）」であってもよし、あるいは送達用ビヒクルと複合化されていてもよい。有用な送達用ビヒクルとしては、限定はされないが、例えば、微粒子、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳまたは任意の他の適当な送達用ビヒクルが挙げられる。有用な遺伝子導入方法については、例えば、テンプレトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）ら（１９９７年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５巻、６４７〜６５２頁および米国特許第６，２１４，８０４号を参照のこと。
【００３３】
動物において高レベルで核酸を発現させるための特に有用な手段のひとつとして、流体力学に基づいたトランスフェクション法（例えば、リウ（Ｌｉｕ）ら（１９９９年）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第６巻、１２５８〜１２６６頁；ザン（Ｚｈａｎｇ）ら（１９９９年）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１０巻、１７３５〜１７３７頁；ザン（Ｚｈａｎｇ）ら（２０００年）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第７巻、１３４４〜１３４９頁；へー（Ｈｅ）ら（２０００年）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１１巻、５４７〜５５４頁を参照のこと）を用いるものがある。上記の方法にしたがって、目的とする核酸を含む大量の液体を迅速に動物に注入する。この方法により、８〜２４時間以内に遺伝子が発現するとともに、遺伝子発現は数日から数週間のあいだ続く。例えば、約５〜２５μｇのプラスミドＤＮＡを含有する約１．５〜２．５ｍＬの溶液を、約０．３ｍＬ／秒の速度でマウスの尾静脈に注射すると、該核酸によってコードされるタンパク質が発現される。核酸構築物が、タンパク質の分泌を誘導する配列、例えばシグナルペプチド配列をコードする場合には、動物の血液中に相当な量のタンパク質が分泌される。
【００３４】
上述のような動物におけるタンパク質の生産にあたり、該動物に１つのプロテアーゼ阻害剤または複数の異なるプロテアーゼ阻害剤を投与してもよい。例としては、セリン、システインまたはアスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤、ならびに、アミノペプチダーゼの阻害剤が挙げられる。動物にプロテアーゼ阻害剤を投与することにより、動物から単離される機能的タンパク質の収率を高めることができる。プロテアーゼ阻害剤は、核酸を動物に投与する前、投与中、または投与後のいずれに投与してもよい。
【００３５】
タンパク質が動物内で生産されると、タンパク質を含む生物試料を動物から採取することができる。流体力学に基づくトランスフェクション法（例えば、プロテアーゼ阻害剤のｉｎ ｖｉｖｏ投与と同時に行われるとして）について上述したように、核酸の投与後約８〜２４時間以内に相当な量のタンパク質が生産される。採取する試料の性質によっては動物を屠殺する必要があるかもしれない。例えば、タンパク質は血液中、あるいは、限定はされないが肝臓、腎臓、脾臓、心臓、および／または肺を含む固体の臓器内に見出すことができる。固体の臓器の採取後には、タンパク質の単離とプロセシングを容易にするために、随意で組織溶解物を調製してもよい。いくつかの実施形態において、動物から採取した生物試料は、少なくとも５μｇ、２５μｇ、５０μｇ、２００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、またはそれ以上のタンパク質を含んでいる。
【００３６】
（融合タンパク質の精製）
融合タンパク質を含む生物試料を動物から採取した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの手法を実施して融合タンパク質を精製することができる。本発明に記載したように、融合タンパク質は特異的結合対の第１のメンバーを含む。生物試料を特異的結合対の第２のメンバーと接触させると、試料中に含まれる融合タンパク質は第２のメンバーに結合される。生物試料中に含まれる未結合の物質は、洗浄により除去することができる。特異的結合対のメンバー間の相互作用を用いてタンパク質を固定化する方法は、当業者によって周知である。本発明に記載のように、特異的結合対の第２のメンバーとしては、抗体などのタンパク質、ならびに、ニッケルなどの非タンパク質アフィニティ試薬（ポリヒスチジンタグを含むタンパク質の精製時に使用）などが挙げられる。
【００３７】
一例において、固相表面上にコーティングした抗体（融合タンパク質の第２のアミノ酸配列に特異的）を用いることにより融合タンパク質を捕捉することができる。第２のアミノ酸配列に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体（一般に、免疫化のために用いたものと同じ動物種に由来するもの）を、当業者によって知られる様々な方法によって適切な固相表面上に固定化することができる。本発明の好ましい実施形態においては、ヒト免疫グロブリンＦｃ定常γ−１（Ｃｒ１）特異抗体を用いる。固相表面としては、何らかの特定の形態に限定されることはなく、プラスチックチューブ、マイクロタイタープレート、セルロースビーズやアガロースビーズなどのビーズ類、ラテックス粒子、磁性粒子、紙、ディップスティック等が挙げられる。抗体の固定化方法としては、受動吸着、共有結合、物理的捕捉等が挙げられる。融合タンパク質は、融合タンパク質を含有する生物試料（例えば、血清または組織溶解物）を、予め固相表面に固定化した第２のアミノ酸配列特異抗体とともにインキュベートすることにより、該表面上に捕捉することができる。未結合の材料は、洗浄によって除去することができる。
【００３８】
固定化融合タンパク質を精製して、動物を免疫化して抗体を生成させるために用いることができる（免疫化の方法は、次の項で詳細に説明する）。融合タンパク質またはその一部を、固定化工程と洗浄工程の後に、随意で均一になるまで精製することができる。本発明に記載するように、融合タンパク質は、例えば第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間に位置する配列など、融合タンパク質の切断を可能にし、第１のアミノ酸を単離し、動物を免疫化して抗体を生成させるために使用することを可能にする配列を随意で含んでいてもよい。
【００３９】
あるいは、融合タンパク質を、第１の動物から採取して、該タンパク質が含まれている生物試料から精製せずに第２の動物を免疫化するために用いることもできる。
融合タンパク質を随意で、抗体の生成に用いられる同一の動物種（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）内で生産することができる。本方法の各段階で用いられる動物は遺伝的に同一であるので、第１の動物において生産される融合タンパク質を、第２の動物における免疫化処置に利用可能とするために精製する（または均一になるまで精製する）必要はない。第１の動物由来の生物試料中に含まれるあらゆる混入タンパク質は免疫化した動物中で自己抗原として扱われるので、前記核酸によってコードされる融合タンパク質のみが体液の免疫応答を誘導することになる。
【００４０】
（抗体の生成）
免疫化工程のために、本発明のタンパク質を動物、例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウサギまたはヒトなどの哺乳動物に投与する。タンパク質、例えば融合タンパク質は、部分的に精製してもよいし、均一になるまで精製してもよいし、あるいは、該融合タンパク質が含まれる生物試料から精製せずに免疫化に用いてもよい。上記のようにして生産される融合タンパク質に加えて、融合タンパク質の一部（例えば、融合タンパク質を切断して生産される）を代替として免疫化のために用いてもよい。
【００４１】
動物にタンパク質を投与することにより、該タンパク質のアミノ酸配列に対する免疫応答が動物内で生み出される。この免疫応答を、例えば融合タンパク質の第１のアミノ酸配列などのアミノ酸配列を認識するポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの抗体を調製するために活用することができる。タンパク質を、体液性免疫応答を誘導するのに十分な経路および用量で送達する。例えば、タンパク質を、腹腔内、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、鼻腔内または皮下に投与することができる。
【００４２】
次に本明細書に記載のタンパク質を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体を調製する方法の説明的実施形態を示す。タンパク質、例えば融合タンパク質を、タンパク質含有血清または組織溶解物から単離し、完全フロイントアジュバントまたは水酸化アルミニウムと１：１の割合で混合し、マウス一匹あたり少なくとも１マイクログラムのタンパク質の用量でマウスに注射する。同一の投与量かつ同一の経路にて９日目と１８日目に追加免疫注射を実施する。ポリクローナル血清の力価は、本発明に記載のアッセイを用いて決定することができる。２５日目にポリクローナル血清の力価が十分であれば、第３回目の追加免疫を２６日目に実施し、その後に血清を回収するか、あるいは、ハイブリドーマを生産するための細胞融合を３１日目に実施することもできる。
【００４３】
例えば、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の周知の細胞融合法（（１９７６年）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第６巻、５１１〜５１９頁）を適用して、培養上清中に所望の抗体を分泌するハイブリドーマを生産することによって、モノクローナル抗体を生産することができる。通常は限界希釈クローニングによって、均一な細胞集団を得た後、ハイブリドーマを生産する抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養し、次いでモノクローナル抗体の特異性を解析することができる。
【００４４】
（抗体のスクリーニング）
上述のように、タンパク質、例えば融合タンパク質を、動物内で生産した後に特異的結合対のメンバー間の相互作用を介して固定化することができる。任意の目的とする配列（第１のアミノ酸配列）を含むタンパク質を生産かつ固定化する上記迅速かつ効率的な方法は、第１のアミノ酸配列に結合する、および／またはリガンドの第１のアミノ酸配列への結合能を阻害する抗体のスクリーニングに用いることができる。上記の方法は、融合タンパク質の第１のアミノ酸配列部分に特異的に結合する抗体のハイスループットスクリーニングに特によく適合している。スクリーニング系に加えて、あるいはその一部として、本発明の方法は、抗体の同定、定量、および／または精製を含む。
【００４５】
本発明の１つの方法において、組換え標的タンパク質抗原を用いて標的タンパク質特異抗体をスクリーニングする。動物内での抗体生産に続いて、試験血清を回収し、本発明に記載のようにスクリーニングすることができる。
【００４６】
スクリーニングアッセイは、様々な方法で実施することができる。例えば、このようなアッセイの一実施方法には、タンパク質を（特異的結合対のメンバーの結合によって）固相に繋留し、反応終了時に固相上に繋留されたタンパク質／抗体複合体を検出することが含まれる。そのような方法の１つの実施形態では、タンパク質を固体表面に繋留し、繋留されてない抗体を直接または間接的に標識する。
【００４７】
融合タンパク質の固定化について上述したように、多種多様な固相を固定化およびスクリーニング工程において用いることができる。例えば、マイクロタイタープレートを、固相として都合良く用いることができる。特異的結合対の第２のメンバー、例えばモノクローナル抗体を、非共有結合または共有結合によって固相に固定化することができる。非共有結合は特異的結合対の第２のメンバーを含有する溶液で固体表面を単純にコーティングすることによって実現することができる。表面を前もって準備し、保存しておいてもよい。
【００４８】
アッセイを実施するために、抗血清または抗体を含む培養上清を、タンパク質を含む表面に対して加える。反応完了後、形成されたすべての複合体が固体表面上に固定化されたままであるような条件下において、未結合の成分を（例えば洗浄によって）除去する。固体表面上に繋留された複合体の検出は、様々な方法で実行可能である。予め固定化されていない標的結合抗体が予め標識されていない場合には、例えば、予め固定化されていない標的結合抗体に対して特異的な標識抗体を用いる間接標識によって、表面上に繋留された複合体を検出するとよい（次に抗体を標識抗Ｉｇ抗体で直接的または間接的に標識してもよい）。
【００４９】
あるいは、反応を液層において実施し、結合した産物を未結合の成分から分離し、複合体を、例えば、溶液中に形成されるあらゆる複合体を繋留するためのタンパク質特異的な固定化抗体と、繋留された複合体を検出するための、形成される可能性のある複合体の標的結合抗体に特異的な標識抗体とを用いて検出するようにしてもよい。
【００５０】
上記の手順に対するインキュベーション時間と温度は、さほど重大ではない。例えば、インキュベーション時間は１０分から４８時間の範囲であってもよく、好ましくは１〜２時間で実施される。インキュベーション温度は、４℃〜３７℃の範囲とすることができる。好ましいインキュベーション温度は、２０℃〜３７℃である。
【００５１】
タンパク質含有血清または組織溶解物を、表面上に予め固定された特異抗体とともにインキュベートすることによって、タンパク質を回収する。未結合の非特異的物質を除去した後、試験抗体を固相とともにインキュベートし、シグナル発生マーカーで標識またはタグ付けした結合相手を用いて標的タンパク質特異抗体を定量的に検出する。例えば、試験血清がマウスに由来するものであれば、結合相手は、シグナル発生マーカーで標識したマウスＩｇＧ抗体特異抗体とすることができる。
【００５２】
本発明の上記１つの実施形態において、結合相手を様々なシグナル発生マーカーによって標識またはタグ付けすることができる。上記シグナル発生マーカーとしては、（限定はされないが）、酵素、化学発光化合物、蛍光標識、色素、放射性同位体標識、酵素補因子、およびビオチンがあげられる。この結合相手は、当業者に周知の様々な方法によって、シグナル発生マーカーに化学的に連結することができる。
【００５３】
次に本発明の実施例をあげるが、実施例は多少なりとも本発明の範囲を限定するものでないと解釈される。
【実施例１】
【００５４】
（ＥＧＦＰ−ｍｅｎ１−免疫グロブリンＦｃ定常領域融合タンパク質特異的抗体反応のＩｎ Ｖｉｖｏ生成）
ＥＧＦＰ−ｍｅｎ１をコードする核酸配列をヒト免疫グロブリンＦｃ定常領域γ１（Ｃｒ１）に融合させた。ＥＧＦＰ−ｍｅｎ１−Ｃｒ１融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物１０μｇを、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈し、ＢＡＬＢ／ｃｊマウス（メイン州バーハーバー所在のジャクソンラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））に１０秒間以内の間に静脈注射した。
【００５５】
ＤＮＡを注射してから２０時間後にマウスから肝臓を回収した。肝臓を回収する１時間前に、１００μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ），Ｐ８３４０）をマウスに静脈注射した。肝臓をホモジナイズし、溶解物中に含まれるＥＧＦＰ−ｍｅｎ１−Ｃｒ１融合タンパク質を、Ｃｒ１特異抗体で予めコーティングしたプロテインＡビーズ上で捕捉した。マウス抗Ｃｒ１抗体（捕捉抗体）は、２０μｇ／ｍＬ濃度の抗体を３０分間インキュベートすることにより、プロテインＡビーズに予めコーティングした。免疫沈降は、４℃で２時間行った。沈降物をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎバッファで２回洗浄し、融合タンパク質の量をウェスタンブロットによって調べた。次に単離融合タンパク質をＡｌ（ＯＨ）３とともに４℃で２時間インキュベートした（１ｍｇミョウバン（ａｌｕｍ）／１２５μｇタンパク質）。２００μＬのミョウバン／タンパク質混合物をＢＡＬＢ／ｃｊマウスに皮下注射した。１回目の免疫の８日後および２３日後に、同じ手順によりマウスを再度免疫化した。抗血清を回収し、融合タンパク質特異的抗体反応を検出した。
【００５６】
抗体検出のために、ＥＧＦＰ含有融合タンパク質（ＥＧＦＰ−ＴｎＩｆ）を上述のようにして製造した。溶解物中に含まれるＥＧＦＰ−ＴｎＩｆ融合タンパク質を、ＥＧＦＰ特異的ウサギ抗体（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．））で予めコーティングしたマイクロタイタープレート上に捕捉した。ウサギ抗ＥＧＦＰ抗体（層１；捕捉抗体）を、２μｇ／ｍＬの濃度で一晩インキュベートすることにより、マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標）プレート、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）Ｓｕｒｆａｃｅ）上に固定化した。
【００５７】
肝臓溶解物（１％ＢＳＡおよび１０％正常ヤギ血清を含むブロッキングバッファ中に希釈）を、マイクロタイタープレートのウェル中、室温で２時間インキュベートすることにより、ＥＧＦＰ−ＴｎＩｆ融合タンパク質（層２）を層１に結合させた。融合タンパク質を含まない正常な肝臓溶解物を、バックグラウンド減算のための対照として、別のウェル中で並行して用いた。４回洗浄して未結合の物質を除去した後、プレートをＥＧＦＰ−ｍｅｎ１−Ｃｒ１融合タンパク質特異的抗血清の系列希釈物とともにインキュベートした。ルシフェラーゼ−Ｃｒ１融合タンパク質で免疫化したマウス由来の血清を対照の抗血清として使用した。プレートに結合したＥＧＦＰ特異抗体（層３）の量を、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１／５０００）（層４）、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ酵素コンジュゲート（１／１００００）（層５）、および１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルホスフェート（酵素基質）を加えた後、４℃で１５時間インキュベートすることによって決定した。ストレプトアビジンとコンジュゲートしたアルカリホスファターゼを、酵素基質を添加した後に、ＯＤ４０５ｎｍの吸収を測定することによって検出した。
【００５８】
図１において、Ｘ軸は抗血清（層３）の希釈率を示し、Ｙ軸はΔＯＤ（融合タンパク質含有肝臓溶解物を用いて得たＯＤから、正常な肝臓溶解物を用いて得たＯＤを差し引いて算出）を示す。図１からは、アッセイによってマイクロタイタープレート上に標的タンパク質特異抗体の存在が検出されたこと、および、陽性の血清の各希釈についてのΔＯＤが、希釈率に対して線形相関を示すことが分かる。図中の各点は３つのウェルの平均であり、図面は少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。
【実施例２】
【００５９】
（ルシフェラーゼ−免疫グロブリンＦｃ定常領域融合タンパク質特異的抗体反応のＩｎ Ｖｉｖｏ生成）
ルシフェラーゼをコードする核酸配列を、ヒト免疫グロブリンＦｃ定常領域γ１（Ｃｒ１）に融合させた。ルシフェラーゼ−Ｃｒ１融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物１０μｇを、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈し、マウスに１０秒間以内の間に静脈注射した。
【００６０】
ＤＮＡを注射してから２０時間後にマウスから肝臓を回収した。肝臓を回収する１時間前に、１００μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ、Ｐ８３４０）をマウスに静脈注射した。肝臓をホモジナイズし、溶解物中に含まれるルシフェラーゼ−Ｃｒ１融合タンパク質を、Ｃｒ１特異抗体で予めコーティングしたプロテインＡビーズ上で捕捉した。マウス抗Ｃｒ１抗体（捕捉抗体）を、２０μｇ／ｍＬの濃度で３０分間インキュベートすることにより、プロテインＡビーズに予めコーティングした。免疫沈降を、４℃で２時間行った。沈降物をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎバッファで２回洗浄し、融合タンパク質の量をウェスタンブロットによって調べた。次に単離融合タンパク質をＡｌ（ＯＨ）３とともに４℃で２時間インキュベートした（１ｍｇミョウバン（ａｌｕｍ）／１２５μｇタンパク質）。２００μＬのミョウバン／タンパク質混合物をＢＡＬＢ／ｃｊマウスに皮下注射した。１回目の免疫の８日後および２３日後に、同じ手順によりマウスを再度免疫化した。抗血清を回収し、融合タンパク質特異的抗体反応を検出した。
【００６１】
ルシフェラーゼ特異抗体を検出するために、ルシフェラーゼ組換えタンパク質（シグマ（Ｓｉｇｍａ）；層２）をマイクロタイタープレートのウェルに室温で２時間コーティングした。無関係の組換えタンパク質であるリポタンパク質リパーゼを、バックグラウンド減算のための対照として、別のウェル中で並行して用いた。２回洗浄して未結合の物質を除去した後、１％ＢＳＡおよび１０％正常ヤギ血清を含むブロッキングバッファとともにプレートを２時間インキュベートした。４回洗浄後、プレートをルシフェラーゼ特異的抗血清の系列希釈物とともにインキュベートした。ＥＧＦＰ−ｍｅｎ１−Ｃｒ１融合タンパク質で免疫化したマウス由来の血清を対照抗血清として用いた。プレートに結合した抗体（層３）の量は、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１／５０００）（層４）、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（１／１００００）（層５）、および１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルホスフェート（酵素基質）を加えた後、４℃で１５時間インキュベートすることによって決定した。ストレプトアビジンとコンジュゲートしたアルカリホスファターゼを、酵素基質を添加した後にＯＤ４０５ｎｍの吸収を測定することによって検出した。
【００６２】
図２において、Ｘ軸は試験血清（層３）の希釈率を示し、Ｙ軸はΔＯＤ（融合タンパク質含有肝臓溶解物を用いて得たＯＤから、正常な肝臓溶解物を用いて得たＯＤを差し引いて算出）を示す。図２からは、アッセイによってマイクロタイタープレート上に標的タンパク質特異抗体の存在が検出されたこと、および、陽性の血清の各希釈についてのΔＯＤが、希釈率に対して線形相関を示すことが分かる。図中の各点は３つのウェルの平均であり、図面は少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。
【００６３】
（他の実施形態）
本発明をその詳細な説明とともに記載してきたが、上記の記載は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定することは意図していない。本発明の他の態様、利点、および変更は、特許請求の範囲の範囲内に収まる
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】Ｃｒ１‐ＥＧＦＰ融合タンパク質をコードする核酸で免疫した動物からのＣｒ１‐ＥＧＦＰ融合タンパク質特異抗体の生成と検出を示す図。
【図２】Ｃｒ１‐ルシフェラーゼ融合タンパク質をコードする核酸で免疫した動物からのＣｒ１‐ルシフェラーゼ融合タンパク質特異抗体の生成と検出を示す図。
【０００１】
本発明は、タンパク質生産および抗体生成のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、基礎研究や様々な疾病の診断および治療にとって有用な道具である。タンパク質特異的結合抗体によって、生物試料中の特定のタンパク質種を精確に同定および定量することができる。さらに、タンパク質とその結合抗体との間の相互作用によって、タンパク質の活性または機能を調節することができる。タンパク質の活性または機能の調節は、所与のタンパク質の活性が過剰もしくは不十分であることを特徴とする疾病状態の治療に特に有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
タンパク質特異抗体の生成には、抗体を得ようとするタンパク質を精製したものを用いた免疫化が伴うことが多い。特異的かつ適切に折り畳まれたタンパク質を用いて免疫化するために十分な量を提供することが、抗体生成の分野における一般的な課題となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、タンパク質をコードする核酸を動物に投与することによる、タンパク質の生産方法に関するものである。上記方法によれば、任意の目的核酸配列を動物に投与することができる。動物への核酸の投与に続いてｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質が生産され、このタンパク質は動物から生体試料を採取した後に単離することができる。
【０００５】
上記方法に従って生産されたタンパク質は、第２の動物において、目的タンパク質配列に結合する抗体を生成するために用いることができる。いくつかの例において、本方法は、最初に生物試料からタンパク質を単離することを含む。次にこの単離タンパク質を、動物を免疫化するために用いる。したがって、本発明は、標的アミノ酸配列に対する抗体の効率的な生成を可能にする。
【０００６】
１つの態様において、本発明は次の（１）〜（４）の工程を実施することによる抗体の生成方法を含む。（１）第１の哺乳動物に融合タンパク質をコードする核酸を投与して、該第１の哺乳動物内で融合タンパク質を発現させる工程であって、融合タンパク質は第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とを含み、第２のアミノ酸配列は特異的結合対の第１のメンバーを含む工程。（２）第１の哺乳動物から、融合タンパク質を含む生物試料を採取する工程。（３）特異的結合対の第２のメンバーを、特異的結合対の第１のメンバーを介して融合タンパク質に結合させることにより、融合タンパク質を単離する工程。（４）融合タンパク質を第２の哺乳動物に投与することにより、第２の哺乳動物において融合タンパク質の第１のアミノ酸配列に対する抗体反応を生起させる工程。
【０００７】
１つの実施形態において、本発明は、第２のアミノ酸配列から第１のアミノ酸配列を切断する工程も含む。
１つの実施形態において、特異的結合対の第１のメンバーは、少なくとも５アミノ酸長のペプチドである。例えば、特異的結合対の第１のメンバーは、免疫グロブリンＦｃドメインであってもよい。
【０００８】
本方法において用いる生物試料の例としては、血清または組織溶解物が挙げられる。本方法は、生物試料の溶解物を生成する追加の工程をさらに含んでいてもよい。
１つの実施形態において、特異的結合対の第２のメンバーは抗体、例えばモノクローナル抗体である。
【０００９】
本方法は、動物から生物試料を採取する前に、動物にプロテアーゼ阻害剤を投与する追加の工程を含んでいてもよい。
本方法は、融合タンパク質を固定化する追加の工程を含んでいてもよい。
【００１０】
１つの実施形態において、融合タンパク質の第１のアミノ酸配列は、天然に存在するあるヒトタンパク質の全体または一部と同一である。
本方法は、融合タンパク質の第１のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を含む抗血清を第２の哺乳動物から単離する追加の工程を含んでいてよく、該工程において、抗体は融合タンパク質の投与後に第２の哺乳動物内で産生される。
【００１１】
本方法は、第２の哺乳動物からＢリンパ球を採取して、該Ｂリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで第２の細胞と融合してハイブリドーマを作成する追加の工程を含んでいてもよく、該工程において、ハイブリドーマは、融合タンパク質の第１のアミノ酸配列に特異的に結合するモノクローナル抗体を生産する。
【００１２】
本方法は、特異的結合対の第２のメンバーに結合しない生物試料の成分を除去することにより精製融合タンパク質を生産する追加の工程を含んでいてもよい。
他の態様において、本発明は、次の工程（１）〜（３）を実施することによる抗体の生成方法を特徴とする。（１）第１の哺乳動物に、タンパク質をコードする単離核酸を投与して、該第１の哺乳動物内で前記タンパク質を発現させる工程。（２）第１の哺乳動物から、前記タンパク質を含む生物試料を採取する工程。（３）前記タンパク質を第２の哺乳動物に投与することにより、第２の哺乳動物において前記タンパク質に対する抗体反応を生起させる工程。
【００１３】
本方法において用いるタンパク質は、随意で融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とを含んでいてもよく、該第２のアミノ酸配列は特異的結合対の第１のメンバーを含む。１つの実施形態において、特異的結合対の第１のメンバーは、少なくとも５アミノ酸長のペプチドである。例えば、特異的結合対の第１のメンバーは、免疫グロブリンのＦｃドメインであってもよい。
【００１４】
本方法において用いる生物試料には、例えば、血清または組織溶解物があげられる。本方法は、生物試料の溶解物を作成する追加の工程を含んでいてもよい。
本方法は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体を含む抗血清を第２の哺乳動物から単離する追加の工程を含んでいてもよく、該工程において、抗体は前記タンパク質の投与後に第２の哺乳動物において産生される。
【００１５】
本方法は、第２の哺乳動物からＢリンパ球を採取し、該Ｂリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで第２の細胞と融合してハイブリドーマを作成する追加の工程を含んでいてもよく、該工程において、ハイブリドーマは前記タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する。
【００１６】
本発明の利点は、大量のタンパク質またはその一部をその天然型のコンフォメーションを有する状態で生産するための迅速かつ効率的な方法を提供できることにある。次いで精製タンパク質を、対応する天然型タンパク質配列に結合する抗体を生成するために用いることができる。上記生産方法では、タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ生産および精製に伴う、時間と費用と労力を要する作業を回避している。
【００１７】
本発明の他の利点は、細菌内での組み換えタンパク質の生産に付随するいくつかの問題を回避できることにある。細菌内で発現される哺乳動物タンパク質は、翻訳後修飾を欠き、自らの天然型のコンフォメーションを有していないことも多い。さらに、核酸構築物の中には細菌内では殆ど使用されないコドンを含むものがあるため、ある種の細菌内では翻訳さえ不可能なタンパク質もある。
【００１８】
特に定義しない限り、本発明中で用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施および試験の際に、本発明中に記載のものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、最適な方法および材料は後述の通りである。本発明中に記載のすべての出版物、特許出願、特許および他の参照文献は、参照によりその全体を本願に組み込むものとする。用語に矛盾が生じた場合は、本明細書が優先する。さらに、記載されている物質および方法は単に説明のために過ぎず、限定しようとするものではない。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、目的とするタンパク質またはその一部をコードする核酸を動物に投与することにより、該タンパク質に対する抗体を生成する方法を対象とする。前記タンパク質またはその一部を動物内で生産して該動物から採取した後、第２の動物を免疫化して前記タンパク質に対する抗体を生成するために用いる。いくつかの例において、本方法は、前記タンパク質に特異的に結合する（例えば、アフィニティタグを含むように人為操作されたタンパク質の一部に結合する）アフィニティ試薬を用いることよって、タンパク質を単離する工程を含む。
【００２１】
（核酸構築物）
本発明は、融合タンパク質をコードする様々な核酸構築物を使用することを包含する。本発明に記載する核酸によってコードされる融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列と呼ぶことにする少なくとも２つの異種アミノ酸配列を含んでいる。これらの２つのアミノ酸配列は異種起源のものであるので、融合タンパク質の配列は、天然に存在するタンパク質のものとは異なっている。
【００２２】
第１のアミノ酸配列は基本的に何であってもよい。第１のアミノ酸配列は、この配列上で様々な用途を実施できるという点で、一般に本発明の方法の焦点となる。様々な用途としては、限定はされないが、この配列に結合する抗体を生成するための方法等が挙げられる。１つの例において、第１のアミノ酸配列は、天然に存在するタンパク質の全部または一部と一致する。好ましくは、第１のアミノ酸配列は少なくとも６，１０，２５，５０，１００または２００アミノ酸長である。別の例において、第１のアミノ酸配列は抗体によって認識可能なエピトープを含む。
【００２３】
融合タンパク質の第２のアミノ酸配列は、融合タンパク質の固定化および／または精製を可能にする配列を含む。したがって、第２のアミノ酸配列は、特異的結合対の第２のメンバーに結合可能な特異的結合対の第１のメンバーを含んでいる。特異的結合対の１つの例において、対の第１のメンバーは、対の第２のメンバー、例えばモノクローナル抗体などの抗体が結合する一続きのアミノ酸である。このような結合対の１つの実施形態は、免疫グロブリンＦｃ定常領域（特異的結合対の第１のメンバー）と、抗免疫グロブリンＦｃ定常領域抗体（特異的結合対の第２のメンバー）との対である。特異的結合対の他の例において、結合対の第１のメンバーは、非タンパク質アフィニティ試薬が結合する一続きのアミノ酸である。このような特異的結合対の例としては、ポリヒスチジンタグ（特異的結合対の第１のメンバー）と、ニッケルアフィニティ試薬（特異的結合対の第２のメンバー）との対が挙げられる。例えば、６〜１０個のヒスチジン残基からなるタグが、融合タンパク質内に含まれる場合には、このタグを用いて、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を行うことができる（例えば、コープランド（Ｃｏｐｅｌａｎｄ）ら（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ 第３７９巻、１６２〜１６５頁を参照のこと）。
【００２４】
融合タンパク質は、本明細書で記載される第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列に加えて、別のアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、融合タンパク質の輸送を行うターゲティング配列（たとえば、ターゲティング配列は、融合タンパク質を特定の細胞内コンパートメントや原形質膜に誘導することができるか、あるいは、タンパク質の分泌を誘導することができる）を用いることができる。１例において、融合タンパク質はシグナルペプチド配列を含む。シグナルペプチド配列とは、生成したばかりの分泌型および膜結合型ポリペプチドのアミノ末端に位置する短い（通常は約１５〜６０アミノ酸）連続した一続きのアミノ酸のことをいい、このシグナルペプチド配列は、前記ポリペプチドの様々な場所への搬送を誘導する。シグナル配列は通常は、約４〜１５個のアミノ酸の疎水性コアを含み、該疎水性コアのすぐ直前には塩基性アミノ酸がある場合が多い。シグナルペプチドのカルボキシル末端には、シグナルペプチド切断部位を規定する１個の介在アミノ酸によって隔てられた一対の小さい非荷電アミノ酸が存在する（例えば、フォン・ヘイジュン（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ）（１９９０年）、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．、第１１５巻、１９５〜２０１頁を参照）。
【００２５】
融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列に加えて、第１および／または第２のアミノ酸配列と実質的に同じ機能を行う他のアミノ酸配列を随意で含んでいてもよい。例えば、融合タンパク質は、特異的結合対の追加のメンバー、および／または、抗体生成の対象となる追加のアミノ酸配列を含んでいてもよい。このように、１つの融合タンパク質は、第２のアミノ酸配列に加えて、異なるタンパク質に由来する複数の配列（または同一タンパク質に由来する複数のエピトープ）を含んでいてもよく、様々な配列に対する抗体を生成するために用いることができる。
【００２６】
融合タンパク質は、随意で、該融合タンパク質の切断を可能にするアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、タンパク質切断部位は、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間に配置することができる。このような切断部位によって、融合タンパク質を精製した後に、第２のアミノ酸配列から第１のアミノ酸配列を分離することが可能になる。例えば、融合タンパク質は、その分子内の他の場所には存在しない、酵素的切断のための特異的認識部位を含むアミノ酸配列を含んでいてもよい。有用な部位の例としては、血液凝固第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼによって認識および切断される配列が挙げられる。切断酵素は、その認識配列を参照して選ぶことができる。
【００２７】
融合タンパク質は、随意で、１つまたはそれ以上のリンカー配列を含んでいてもよい。リンカー配列は、第１および／または第２のアミノ酸配列に間隔（スペーシング）と方向性とを与えて、各配列の生物学的機能を促進するために用いることができる。リンカー配列は一般に、２つの配列の間を、それぞれの配列に対して二次構造への折り畳みを確保する十分な距離を隔てて分離する。機能的タンパク質ドメインを適切に分離するために、約２０アミノ酸長のリンカー配列を用いることができるが、それよりも長いもしくは短いリンカー配列を用いることもできる（例えば、３〜１００アミノ酸長）。リンカーとして有用なアミノ酸配列としては、限定はされないが、（ＳｅｒＧｌｙ４）ｙ（配列番号：１）（式中、ｙは少なくとも２）、またはＧｌｙ４ＳｅｒＧｌｙ５Ｓｅｒ（配列番号：２）が挙げられる。好ましいリンカー配列は、式（ＳｅｒＧｌｙ４）４（配列番号：３）を有する。他の好ましいリンカーは、配列（（Ｓｅｒ４Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）（配列番号：４）を有する。あるいは、融合タンパク質はリンカー配列を持たなくてもよい。
【００２８】
本発明は、タンパク質をコードする単離核酸を使用する方法も包含する。「単離」核酸は、その構造が、天然に存在する核酸の構造または２つ以上の遺伝子にわたる天然に存在するゲノム核酸の任意断片の構造とは同一ではない核酸分子である。上記実施形態において、核酸によってコードされるタンパク質は融合タンパク質である必要はなく、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列の全部または一部と同一の配列を含んでいてもよい。好ましくは、本タンパク質は、天然に存在するタンパク質の少なくとも６，１０，２５，５０，１００または２００個連続したアミノ酸と同一のアミノ酸配列を含んでいる。
【００２９】
核酸構築物は、従来の分子生物学技術を用いて調製することができる。核酸は、コーディング配列の発現を誘導する調節エレメントに作動可能なように連結させてもよい。調節エレメントとしては、限定はされないが、誘導性もしくは非誘導性のプロモーター、エンハンサー、および当業者によって知られる、遺伝子発現を駆動またはいずれにせよ調節する他のエレメントが挙げられる。このような調節エレメントとしては、限定はされないが、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子、レトロウィルスＬＴＲプロモーター、およびＳＶ４０の初期または後期プロモーターが挙げられる。好ましい実施形態において、核酸の発現はヒトＣＭＶ前初期プロモーターによって制御される。
【００３０】
核酸構築物は好ましくは、ベクター、例えば、プラスミドやウィルスベクターなどの発現ベクターに組み込まれる。核酸分子を効率的に翻訳するためには、特別の開始シグナルが必要になるかもしれない。そうした翻訳制御シグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列と同等の配列）が挙げられる。さらに、開始コドンは、インサート全体を確実に翻訳できるように所望のコーディング配列の読み枠と同じ読み枠でなければならない。翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の様々な起源のものであってよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ、またはイントロンを含めることによって高めてもよい（ビトナー（Ｂｉｔｔｎｅｒ）ら、（１９８７年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ 第１５３巻、５１６頁を参照）。
【００３１】
（タンパク質のＩｎ Ｖｉｖｏ生産）
タンパク質、例えば融合タンパク質は、本発明に記載の核酸を、動物、例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、またはヒトなどの哺乳動物に投与することによって生産される。核酸の投与に続いて、ｉｎ ｖｉｖｏにて翻訳（ならびに、核酸がＤＮＡ配列である場合には転写も）が起こり、動物内でタンパク質が生産される。核酸は、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、鼻腔内、または皮下などの様々な経路によって動物に投与することができる。
【００３２】
核酸は「裸（ｎａｋｅｄ）」であってもよし、あるいは送達用ビヒクルと複合化されていてもよい。有用な送達用ビヒクルとしては、限定はされないが、例えば、微粒子、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳまたは任意の他の適当な送達用ビヒクルが挙げられる。有用な遺伝子導入方法については、例えば、テンプレトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）ら（１９９７年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５巻、６４７〜６５２頁および米国特許第６，２１４，８０４号を参照のこと。
【００３３】
動物において高レベルで核酸を発現させるための特に有用な手段のひとつとして、流体力学に基づいたトランスフェクション法（例えば、リウ（Ｌｉｕ）ら（１９９９年）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第６巻、１２５８〜１２６６頁；ザン（Ｚｈａｎｇ）ら（１９９９年）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１０巻、１７３５〜１７３７頁；ザン（Ｚｈａｎｇ）ら（２０００年）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第７巻、１３４４〜１３４９頁；へー（Ｈｅ）ら（２０００年）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１１巻、５４７〜５５４頁を参照のこと）を用いるものがある。上記の方法にしたがって、目的とする核酸を含む大量の液体を迅速に動物に注入する。この方法により、８〜２４時間以内に遺伝子が発現するとともに、遺伝子発現は数日から数週間のあいだ続く。例えば、約５〜２５μｇのプラスミドＤＮＡを含有する約１．５〜２．５ｍＬの溶液を、約０．３ｍＬ／秒の速度でマウスの尾静脈に注射すると、該核酸によってコードされるタンパク質が発現される。核酸構築物が、タンパク質の分泌を誘導する配列、例えばシグナルペプチド配列をコードする場合には、動物の血液中に相当な量のタンパク質が分泌される。
【００３４】
上述のような動物におけるタンパク質の生産にあたり、該動物に１つのプロテアーゼ阻害剤または複数の異なるプロテアーゼ阻害剤を投与してもよい。例としては、セリン、システインまたはアスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤、ならびに、アミノペプチダーゼの阻害剤が挙げられる。動物にプロテアーゼ阻害剤を投与することにより、動物から単離される機能的タンパク質の収率を高めることができる。プロテアーゼ阻害剤は、核酸を動物に投与する前、投与中、または投与後のいずれに投与してもよい。
【００３５】
タンパク質が動物内で生産されると、タンパク質を含む生物試料を動物から採取することができる。流体力学に基づくトランスフェクション法（例えば、プロテアーゼ阻害剤のｉｎ ｖｉｖｏ投与と同時に行われるとして）について上述したように、核酸の投与後約８〜２４時間以内に相当な量のタンパク質が生産される。採取する試料の性質によっては動物を屠殺する必要があるかもしれない。例えば、タンパク質は血液中、あるいは、限定はされないが肝臓、腎臓、脾臓、心臓、および／または肺を含む固体の臓器内に見出すことができる。固体の臓器の採取後には、タンパク質の単離とプロセシングを容易にするために、随意で組織溶解物を調製してもよい。いくつかの実施形態において、動物から採取した生物試料は、少なくとも５μｇ、２５μｇ、５０μｇ、２００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、またはそれ以上のタンパク質を含んでいる。
【００３６】
（融合タンパク質の精製）
融合タンパク質を含む生物試料を動物から採取した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの手法を実施して融合タンパク質を精製することができる。本発明に記載したように、融合タンパク質は特異的結合対の第１のメンバーを含む。生物試料を特異的結合対の第２のメンバーと接触させると、試料中に含まれる融合タンパク質は第２のメンバーに結合される。生物試料中に含まれる未結合の物質は、洗浄により除去することができる。特異的結合対のメンバー間の相互作用を用いてタンパク質を固定化する方法は、当業者によって周知である。本発明に記載のように、特異的結合対の第２のメンバーとしては、抗体などのタンパク質、ならびに、ニッケルなどの非タンパク質アフィニティ試薬（ポリヒスチジンタグを含むタンパク質の精製時に使用）などが挙げられる。
【００３７】
一例において、固相表面上にコーティングした抗体（融合タンパク質の第２のアミノ酸配列に特異的）を用いることにより融合タンパク質を捕捉することができる。第２のアミノ酸配列に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体（一般に、免疫化のために用いたものと同じ動物種に由来するもの）を、当業者によって知られる様々な方法によって適切な固相表面上に固定化することができる。本発明の好ましい実施形態においては、ヒト免疫グロブリンＦｃ定常γ−１（Ｃｒ１）特異抗体を用いる。固相表面としては、何らかの特定の形態に限定されることはなく、プラスチックチューブ、マイクロタイタープレート、セルロースビーズやアガロースビーズなどのビーズ類、ラテックス粒子、磁性粒子、紙、ディップスティック等が挙げられる。抗体の固定化方法としては、受動吸着、共有結合、物理的捕捉等が挙げられる。融合タンパク質は、融合タンパク質を含有する生物試料（例えば、血清または組織溶解物）を、予め固相表面に固定化した第２のアミノ酸配列特異抗体とともにインキュベートすることにより、該表面上に捕捉することができる。未結合の材料は、洗浄によって除去することができる。
【００３８】
固定化融合タンパク質を精製して、動物を免疫化して抗体を生成させるために用いることができる（免疫化の方法は、次の項で詳細に説明する）。融合タンパク質またはその一部を、固定化工程と洗浄工程の後に、随意で均一になるまで精製することができる。本発明に記載するように、融合タンパク質は、例えば第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間に位置する配列など、融合タンパク質の切断を可能にし、第１のアミノ酸を単離し、動物を免疫化して抗体を生成させるために使用することを可能にする配列を随意で含んでいてもよい。
【００３９】
あるいは、融合タンパク質を、第１の動物から採取して、該タンパク質が含まれている生物試料から精製せずに第２の動物を免疫化するために用いることもできる。
融合タンパク質を随意で、抗体の生成に用いられる同一の動物種（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）内で生産することができる。本方法の各段階で用いられる動物は遺伝的に同一であるので、第１の動物において生産される融合タンパク質を、第２の動物における免疫化処置に利用可能とするために精製する（または均一になるまで精製する）必要はない。第１の動物由来の生物試料中に含まれるあらゆる混入タンパク質は免疫化した動物中で自己抗原として扱われるので、前記核酸によってコードされる融合タンパク質のみが体液の免疫応答を誘導することになる。
【００４０】
（抗体の生成）
免疫化工程のために、本発明のタンパク質を動物、例えば、マウス、ラット、ヤギ、ウサギまたはヒトなどの哺乳動物に投与する。タンパク質、例えば融合タンパク質は、部分的に精製してもよいし、均一になるまで精製してもよいし、あるいは、該融合タンパク質が含まれる生物試料から精製せずに免疫化に用いてもよい。上記のようにして生産される融合タンパク質に加えて、融合タンパク質の一部（例えば、融合タンパク質を切断して生産される）を代替として免疫化のために用いてもよい。
【００４１】
動物にタンパク質を投与することにより、該タンパク質のアミノ酸配列に対する免疫応答が動物内で生み出される。この免疫応答を、例えば融合タンパク質の第１のアミノ酸配列などのアミノ酸配列を認識するポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの抗体を調製するために活用することができる。タンパク質を、体液性免疫応答を誘導するのに十分な経路および用量で送達する。例えば、タンパク質を、腹腔内、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、鼻腔内または皮下に投与することができる。
【００４２】
次に本明細書に記載のタンパク質を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体を調製する方法の説明的実施形態を示す。タンパク質、例えば融合タンパク質を、タンパク質含有血清または組織溶解物から単離し、完全フロイントアジュバントまたは水酸化アルミニウムと１：１の割合で混合し、マウス一匹あたり少なくとも１マイクログラムのタンパク質の用量でマウスに注射する。同一の投与量かつ同一の経路にて９日目と１８日目に追加免疫注射を実施する。ポリクローナル血清の力価は、本発明に記載のアッセイを用いて決定することができる。２５日目にポリクローナル血清の力価が十分であれば、第３回目の追加免疫を２６日目に実施し、その後に血清を回収するか、あるいは、ハイブリドーマを生産するための細胞融合を３１日目に実施することもできる。
【００４３】
例えば、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の周知の細胞融合法（（１９７６年）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第６巻、５１１〜５１９頁）を適用して、培養上清中に所望の抗体を分泌するハイブリドーマを生産することによって、モノクローナル抗体を生産することができる。通常は限界希釈クローニングによって、均一な細胞集団を得た後、ハイブリドーマを生産する抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養し、次いでモノクローナル抗体の特異性を解析することができる。
【００４４】
（抗体のスクリーニング）
上述のように、タンパク質、例えば融合タンパク質を、動物内で生産した後に特異的結合対のメンバー間の相互作用を介して固定化することができる。任意の目的とする配列（第１のアミノ酸配列）を含むタンパク質を生産かつ固定化する上記迅速かつ効率的な方法は、第１のアミノ酸配列に結合する、および／またはリガンドの第１のアミノ酸配列への結合能を阻害する抗体のスクリーニングに用いることができる。上記の方法は、融合タンパク質の第１のアミノ酸配列部分に特異的に結合する抗体のハイスループットスクリーニングに特によく適合している。スクリーニング系に加えて、あるいはその一部として、本発明の方法は、抗体の同定、定量、および／または精製を含む。
【００４５】
本発明の１つの方法において、組換え標的タンパク質抗原を用いて標的タンパク質特異抗体をスクリーニングする。動物内での抗体生産に続いて、試験血清を回収し、本発明に記載のようにスクリーニングすることができる。
【００４６】
スクリーニングアッセイは、様々な方法で実施することができる。例えば、このようなアッセイの一実施方法には、タンパク質を（特異的結合対のメンバーの結合によって）固相に繋留し、反応終了時に固相上に繋留されたタンパク質／抗体複合体を検出することが含まれる。そのような方法の１つの実施形態では、タンパク質を固体表面に繋留し、繋留されてない抗体を直接または間接的に標識する。
【００４７】
融合タンパク質の固定化について上述したように、多種多様な固相を固定化およびスクリーニング工程において用いることができる。例えば、マイクロタイタープレートを、固相として都合良く用いることができる。特異的結合対の第２のメンバー、例えばモノクローナル抗体を、非共有結合または共有結合によって固相に固定化することができる。非共有結合は特異的結合対の第２のメンバーを含有する溶液で固体表面を単純にコーティングすることによって実現することができる。表面を前もって準備し、保存しておいてもよい。
【００４８】
アッセイを実施するために、抗血清または抗体を含む培養上清を、タンパク質を含む表面に対して加える。反応完了後、形成されたすべての複合体が固体表面上に固定化されたままであるような条件下において、未結合の成分を（例えば洗浄によって）除去する。固体表面上に繋留された複合体の検出は、様々な方法で実行可能である。予め固定化されていない標的結合抗体が予め標識されていない場合には、例えば、予め固定化されていない標的結合抗体に対して特異的な標識抗体を用いる間接標識によって、表面上に繋留された複合体を検出するとよい（次に抗体を標識抗Ｉｇ抗体で直接的または間接的に標識してもよい）。
【００４９】
あるいは、反応を液層において実施し、結合した産物を未結合の成分から分離し、複合体を、例えば、溶液中に形成されるあらゆる複合体を繋留するためのタンパク質特異的な固定化抗体と、繋留された複合体を検出するための、形成される可能性のある複合体の標的結合抗体に特異的な標識抗体とを用いて検出するようにしてもよい。
【００５０】
上記の手順に対するインキュベーション時間と温度は、さほど重大ではない。例えば、インキュベーション時間は１０分から４８時間の範囲であってもよく、好ましくは１〜２時間で実施される。インキュベーション温度は、４℃〜３７℃の範囲とすることができる。好ましいインキュベーション温度は、２０℃〜３７℃である。
【００５１】
タンパク質含有血清または組織溶解物を、表面上に予め固定された特異抗体とともにインキュベートすることによって、タンパク質を回収する。未結合の非特異的物質を除去した後、試験抗体を固相とともにインキュベートし、シグナル発生マーカーで標識またはタグ付けした結合相手を用いて標的タンパク質特異抗体を定量的に検出する。例えば、試験血清がマウスに由来するものであれば、結合相手は、シグナル発生マーカーで標識したマウスＩｇＧ抗体特異抗体とすることができる。
【００５２】
本発明の上記１つの実施形態において、結合相手を様々なシグナル発生マーカーによって標識またはタグ付けすることができる。上記シグナル発生マーカーとしては、（限定はされないが）、酵素、化学発光化合物、蛍光標識、色素、放射性同位体標識、酵素補因子、およびビオチンがあげられる。この結合相手は、当業者に周知の様々な方法によって、シグナル発生マーカーに化学的に連結することができる。
【００５３】
次に本発明の実施例をあげるが、実施例は多少なりとも本発明の範囲を限定するものでないと解釈される。
【実施例１】
【００５４】
（ＥＧＦＰ−ｍｅｎ１−免疫グロブリンＦｃ定常領域融合タンパク質特異的抗体反応のＩｎ Ｖｉｖｏ生成）
ＥＧＦＰ−ｍｅｎ１をコードする核酸配列をヒト免疫グロブリンＦｃ定常領域γ１（Ｃｒ１）に融合させた。ＥＧＦＰ−ｍｅｎ１−Ｃｒ１融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物１０μｇを、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈し、ＢＡＬＢ／ｃｊマウス（メイン州バーハーバー所在のジャクソンラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））に１０秒間以内の間に静脈注射した。
【００５５】
ＤＮＡを注射してから２０時間後にマウスから肝臓を回収した。肝臓を回収する１時間前に、１００μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ），Ｐ８３４０）をマウスに静脈注射した。肝臓をホモジナイズし、溶解物中に含まれるＥＧＦＰ−ｍｅｎ１−Ｃｒ１融合タンパク質を、Ｃｒ１特異抗体で予めコーティングしたプロテインＡビーズ上で捕捉した。マウス抗Ｃｒ１抗体（捕捉抗体）は、２０μｇ／ｍＬ濃度の抗体を３０分間インキュベートすることにより、プロテインＡビーズに予めコーティングした。免疫沈降は、４℃で２時間行った。沈降物をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎバッファで２回洗浄し、融合タンパク質の量をウェスタンブロットによって調べた。次に単離融合タンパク質をＡｌ（ＯＨ）３とともに４℃で２時間インキュベートした（１ｍｇミョウバン（ａｌｕｍ）／１２５μｇタンパク質）。２００μＬのミョウバン／タンパク質混合物をＢＡＬＢ／ｃｊマウスに皮下注射した。１回目の免疫の８日後および２３日後に、同じ手順によりマウスを再度免疫化した。抗血清を回収し、融合タンパク質特異的抗体反応を検出した。
【００５６】
抗体検出のために、ＥＧＦＰ含有融合タンパク質（ＥＧＦＰ−ＴｎＩｆ）を上述のようにして製造した。溶解物中に含まれるＥＧＦＰ−ＴｎＩｆ融合タンパク質を、ＥＧＦＰ特異的ウサギ抗体（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．））で予めコーティングしたマイクロタイタープレート上に捕捉した。ウサギ抗ＥＧＦＰ抗体（層１；捕捉抗体）を、２μｇ／ｍＬの濃度で一晩インキュベートすることにより、マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標）プレート、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）Ｓｕｒｆａｃｅ）上に固定化した。
【００５７】
肝臓溶解物（１％ＢＳＡおよび１０％正常ヤギ血清を含むブロッキングバッファ中に希釈）を、マイクロタイタープレートのウェル中、室温で２時間インキュベートすることにより、ＥＧＦＰ−ＴｎＩｆ融合タンパク質（層２）を層１に結合させた。融合タンパク質を含まない正常な肝臓溶解物を、バックグラウンド減算のための対照として、別のウェル中で並行して用いた。４回洗浄して未結合の物質を除去した後、プレートをＥＧＦＰ−ｍｅｎ１−Ｃｒ１融合タンパク質特異的抗血清の系列希釈物とともにインキュベートした。ルシフェラーゼ−Ｃｒ１融合タンパク質で免疫化したマウス由来の血清を対照の抗血清として使用した。プレートに結合したＥＧＦＰ特異抗体（層３）の量を、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１／５０００）（層４）、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ酵素コンジュゲート（１／１００００）（層５）、および１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルホスフェート（酵素基質）を加えた後、４℃で１５時間インキュベートすることによって決定した。ストレプトアビジンとコンジュゲートしたアルカリホスファターゼを、酵素基質を添加した後に、ＯＤ４０５ｎｍの吸収を測定することによって検出した。
【００５８】
図１において、Ｘ軸は抗血清（層３）の希釈率を示し、Ｙ軸はΔＯＤ（融合タンパク質含有肝臓溶解物を用いて得たＯＤから、正常な肝臓溶解物を用いて得たＯＤを差し引いて算出）を示す。図１からは、アッセイによってマイクロタイタープレート上に標的タンパク質特異抗体の存在が検出されたこと、および、陽性の血清の各希釈についてのΔＯＤが、希釈率に対して線形相関を示すことが分かる。図中の各点は３つのウェルの平均であり、図面は少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。
【実施例２】
【００５９】
（ルシフェラーゼ−免疫グロブリンＦｃ定常領域融合タンパク質特異的抗体反応のＩｎ Ｖｉｖｏ生成）
ルシフェラーゼをコードする核酸配列を、ヒト免疫グロブリンＦｃ定常領域γ１（Ｃｒ１）に融合させた。ルシフェラーゼ−Ｃｒ１融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物１０μｇを、２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈し、マウスに１０秒間以内の間に静脈注射した。
【００６０】
ＤＮＡを注射してから２０時間後にマウスから肝臓を回収した。肝臓を回収する１時間前に、１００μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ、Ｐ８３４０）をマウスに静脈注射した。肝臓をホモジナイズし、溶解物中に含まれるルシフェラーゼ−Ｃｒ１融合タンパク質を、Ｃｒ１特異抗体で予めコーティングしたプロテインＡビーズ上で捕捉した。マウス抗Ｃｒ１抗体（捕捉抗体）を、２０μｇ／ｍＬの濃度で３０分間インキュベートすることにより、プロテインＡビーズに予めコーティングした。免疫沈降を、４℃で２時間行った。沈降物をＰＢＳ−ｔｗｅｅｎバッファで２回洗浄し、融合タンパク質の量をウェスタンブロットによって調べた。次に単離融合タンパク質をＡｌ（ＯＨ）３とともに４℃で２時間インキュベートした（１ｍｇミョウバン（ａｌｕｍ）／１２５μｇタンパク質）。２００μＬのミョウバン／タンパク質混合物をＢＡＬＢ／ｃｊマウスに皮下注射した。１回目の免疫の８日後および２３日後に、同じ手順によりマウスを再度免疫化した。抗血清を回収し、融合タンパク質特異的抗体反応を検出した。
【００６１】
ルシフェラーゼ特異抗体を検出するために、ルシフェラーゼ組換えタンパク質（シグマ（Ｓｉｇｍａ）；層２）をマイクロタイタープレートのウェルに室温で２時間コーティングした。無関係の組換えタンパク質であるリポタンパク質リパーゼを、バックグラウンド減算のための対照として、別のウェル中で並行して用いた。２回洗浄して未結合の物質を除去した後、１％ＢＳＡおよび１０％正常ヤギ血清を含むブロッキングバッファとともにプレートを２時間インキュベートした。４回洗浄後、プレートをルシフェラーゼ特異的抗血清の系列希釈物とともにインキュベートした。ＥＧＦＰ−ｍｅｎ１−Ｃｒ１融合タンパク質で免疫化したマウス由来の血清を対照抗血清として用いた。プレートに結合した抗体（層３）の量は、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（１／５０００）（層４）、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（１／１００００）（層５）、および１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルホスフェート（酵素基質）を加えた後、４℃で１５時間インキュベートすることによって決定した。ストレプトアビジンとコンジュゲートしたアルカリホスファターゼを、酵素基質を添加した後にＯＤ４０５ｎｍの吸収を測定することによって検出した。
【００６２】
図２において、Ｘ軸は試験血清（層３）の希釈率を示し、Ｙ軸はΔＯＤ（融合タンパク質含有肝臓溶解物を用いて得たＯＤから、正常な肝臓溶解物を用いて得たＯＤを差し引いて算出）を示す。図２からは、アッセイによってマイクロタイタープレート上に標的タンパク質特異抗体の存在が検出されたこと、および、陽性の血清の各希釈についてのΔＯＤが、希釈率に対して線形相関を示すことが分かる。図中の各点は３つのウェルの平均であり、図面は少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。
【００６３】
（他の実施形態）
本発明をその詳細な説明とともに記載してきたが、上記の記載は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定することは意図していない。本発明の他の態様、利点、および変更は、特許請求の範囲の範囲内に収まる
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】Ｃｒ１‐ＥＧＦＰ融合タンパク質をコードする核酸で免疫した動物からのＣｒ１‐ＥＧＦＰ融合タンパク質特異抗体の生成と検出を示す図。
【図２】Ｃｒ１‐ルシフェラーゼ融合タンパク質をコードする核酸で免疫した動物からのＣｒ１‐ルシフェラーゼ融合タンパク質特異抗体の生成と検出を示す図。
Claims (26)
- 抗体の生成方法であって、
第１の哺乳動物に融合タンパク質をコードする核酸を投与して、該第１の哺乳動物内で該融合タンパク質を発現させる工程であって、融合タンパク質は第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とを含み、第２のアミノ酸配列は特異的結合対の第１のメンバーを含むことを特徴とする工程と、
第１の哺乳動物から、融合タンパク質を含む生物試料を採取する工程と、
特異的結合対の第２のメンバーを、特異的結合対の第１のメンバーを介して融合タンパク質に結合させることにより、融合タンパク質を単離する工程と、
融合タンパク質を第２の哺乳動物に投与することにより、第２の哺乳動物において、融合タンパク質の第１のアミノ酸に対する抗体反応を生起させる工程とを含む方法。 - 第１のアミノ酸配列を第２のアミノ酸配列から切断する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
- 特異的結合対の第１のメンバーは、免疫グロブリンのＦｃドメインであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 生物試料は血清であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 生物試料の溶解物を作成する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
- 特異的結合対の第２のメンバーは抗体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 抗体はモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
- 特異的結合対の第２のメンバーは抗体であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
- 抗体はモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
- 融合タンパク質を固定化する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
- 融合タンパク質を固定化する工程をさらに含む請求項２に記載の方法。
- 融合タンパク質を固定化する工程をさらに含む請求項３に記載の方法。
- 特異的結合対の第１のメンバーは、少なくとも５アミノ酸長のペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 第１のアミノ酸配列は、天然に存在するあるヒトタンパク質の全体または一部と同一であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 融合タンパク質の第１のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を含む抗血清を第２の哺乳動物から単離する工程をさらに含み、抗体は融合タンパク質の投与後に第２の哺乳動物内で産生されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 第２の哺乳動物からＢリンパ球を採取して、該Ｂリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで第２の細胞と融合してハイブリドーマを作成する工程をさらに含み、ハイブリドーマは、融合タンパク質の第１のアミノ酸配列に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生することを
特徴とする請求項１に記載の方法。 - 特異的結合対の第２のメンバーに結合しない生物試料の成分を除去することにより、精製融合タンパク質を提供する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
- 抗体の生成方法であって、
第１の哺乳動物に、タンパク質をコードする単離核酸を投与して、該第１の哺乳動物内で該タンパク質を発現させる工程と、
第１の哺乳動物から、前記タンパク質を含む生物試料を採取する工程と、
前記タンパク質を第２の哺乳動物に投与することにより、第２の哺乳動物において前記タンパク質に対する抗体反応を生起させる工程とを含む方法。 - タンパク質は融合タンパク質であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
- 融合タンパク質は第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とを含むこと、および第２のアミノ酸配列は特異的結合対の第１のメンバーを含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
- 特異的結合対の第１のメンバーは、免疫グロブリンのＦｃドメインであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 特異的結合対の第１のメンバーは、少なくとも５アミノ酸長のペプチドであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- 生物試料は血清であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
- 生物試料の溶解物を作成する工程をさらに含む請求項１８に記載の方法。
- タンパク質に特異的に結合する抗体を含む抗血清を第２の哺乳動物から単離する工程をさらに含み、抗体はタンパク質の投与後に第２の哺乳動物内で産生されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
- 第２の哺乳動物からＢリンパ球を採取して、該Ｂリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで第２の細胞と融合してハイブリドーマを作成する工程をさらに含み、ハイブリドーマは前記タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
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