KR101143726B1 - 생체활성의 무손상 부갑상선 호르몬 (ｐｔｈ) 1-84에 대한 선택적 결합 특이성을 지니는 항체 및 이를 생성하기 위한 펩티드 항원 - Google Patents
생체활성의 무손상 부갑상선 호르몬 (ｐｔｈ) 1-84에 대한 선택적 결합 특이성을 지니는 항체 및 이를 생성하기 위한 펩티드 항원 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 부갑상선 호르몬 (PTH)의 아미노산 잔기 2-12, 1-12, 2-15 및 1-15에 해당하는 펩티드 항원, 이러한 펩티드 항원에 대해 친화성을 지니는 항체, 및 이를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이러한 항원, 항체 및 이를 생성하는 방법은 혈청, 혈장 및/또는 세포 배양액 중의 생체활성 무손상 PTH 수준을 결정하는데 유용하다. 이러한 항체는 고도의 종 교차반응성을 추가로 지니지만, 불완전 PTH 펩티드 단편에 대해서는 현저히 경감된 교차반응성을 지니고, PTH의 첫번째 아미노산 잔기를 거의 인지하지 못한다.
Description
발명의 배경
부갑상선 호르몬 (PTH) 및 혈중 칼슘 이온 농도 조절에서의 이의 중요성은 널리 공지되어 있다. 이와 관련하여, 이러한 호르몬은 부갑상샘에 의해 생성되며, 다른 인자와 협력하여 세포 및 주위 유체 둘 모두에서 혈중 칼슘 이온 수준을 안정된 농도로 유지시키기 위해 이를 조절하는 기능을 한다. 본질적으로, PTH는 혈청 칼슘 수준이 감소되는 경우에 체내에 저장된 칼슘을 방출하는 기능을 한다. 다른 한편으로, 이러한 분비는 혈청 칼슘 농도가 증가함에 따라 억제된다.
완전한 형태의 PTH는 84개의 아미노산으로 구성된 독특한 펩티드를 포함한다. 인간, 래트, 마우스, 소, 개, 돼지, 고양이 및 원숭이와 같은 다수의 종에 대해 제공된 PTH의 특정 서열이 도 1에 도시되어 있고, 상기 서열의 변이가 도 2에 도시되어 있으며, 이는 상기 확인된 종 사이에서 호르몬이 비교적 일치하는 구조를 유지하는 것을 나타낸다.
인간 뿐만 아니라 다양한 종에 대한 칼슘 물질대사에서 PTH를 정확하게 측정하는 것에 대한 중요성은 임상에서 매우 중요하다. 잘 기록되어 있는 바와 같이, 혈청 PTH 수준은 다수의 질병 중에서 고칼슘혈증, 원발성 부갑상성기능항진증, 골다공증과 같은 질병을 지니는 환자에 대한 중요한 파라미터로 작용한다. PTH는 또한 PTH 이상으로 인해 신장성 골형성장애로 발달할 수 있는 만성 신부전에 걸린 환자에서 임상적으로 매우 중요하다.
물질대사 및 임상적 중요성에서의 PTH의 중요한 역할에도 불구하고, 순환하는 생물학적 활성 PTH 수준의 결정과 관련된 실질적인 난점이 있으며, 이러한 난점이 지속되고 있다. 우선, PTH는 일반적으로 10 pg/ml 내지 65 pg/ml의 극도로 낮은 수준으로 존재한다는 것이 널리 공지되어 있다. 더욱이, PTH 펩티드는 다양한 순환 PTH 단편, 특히 (7-84) PTH 분자와 함께 크로마토그래피적으로 공동-이동되는 것으로 보이고, 통상적인 PTH 분석 측정을 현저하게 방해하는 것으로 공지된 거대 비-(1-84) 순환 PTH 단편으로 존재할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 게다가, 거대 비-(1-84) PTH 단편은 대다수의 현재 분석에 의해 측정되는 PTH의 약 반(1/2)에 해당할 수 있다. PTH의 정확한 측정의 현재의 결점의 예는 교시 내용이 참조로서 본원에 명백히 포함된 공개 특허 협력 조약 국제 출원 번호 PCT/USOO/00855 및 국제 공개 번호 WO/00/42437 (Methods for Differentiating and Monitoring Parathyroid and Bone Status Related Diseases, and Lepage, Raymond et al., A Non-(1-84) Circulating Parathyroid Hormone (PTH) Fragment Interferes With Intact PTH Commercial Assay Measurement In Uremic Samples, Clinical Chemistry 44:4, 1998 pages 805-809)에 기술되어 있다.
이러한 결점을 다루기 위한 시도로, 인간 PTH의 매우 말단의 N-말단 분획, 더욱 특히 N-말단의 처음 6개의 아미노산 잔기에 대해 결합 특이성을 지니는 추적자 항체가 포함된, PTH 수준을 검출하기 위한 신규한 분석법이 스캔티바디스 래보러토리사(Scantibodies Laboratory, Santee, California)에 의해 도입되었다. 곧 이해되는 바와 같이, 상기 분석은 거대 비-(1-84) PTH 단편과의 교차반응성을 최소화시키는 것을 나타낸다. 그러나, 이러한 항체를 유도하기 위해서는 항체의 정제에서 현저한 노력 및 비용을 필요로 한다. 더욱이, 상기 추적자 항체는 PTH의 첫번째 아미노산 잔기에 대해서만 최대로 인지하고, 후속하는 임의의 잔기에 대해서는 특이성이 현저하게 감소하므로, 첫번째 아미노산이 상이한 일부 기타 종에 대해서는 사용이 회피된다. 이러한 결점은 교시 내용이 참조로서 본원에 명백히 포함되는 문헌[John, M.R. et al., A Novel Immunoradiometric Assay Detects Full-Length Human PTH but not Amino-Terminally Truncated Fragments: Implications for PTH Measurements in Renal Failure, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, Vol. 84, No. 11, 1999, p. 4287-4290]에 논의되어 있다.
따라서, PTH 펩티드 단편에 대한 교차반응성을 감소시키면서 PTH 수준을 결정할 수 있는, 생체활성 무손상 PTH에 대해 특이적인 분석 결합 파트너 및 이를 생성하는 방법에 대한 당 업계의 필요가 오래 존재하였고, 지속되고 있다. 또한, 보다 경제적인 방식으로 PTH 수준을 측정할 수 있고, 면역분석 키트 등에 용이하게 포함될 수 있는 PTH에 대해 보다 큰 친화성을 지니는 개선된 PTH 결합 파트너에 대한 당 업계의 필요가 존재한다. 추가로, PTH에 대해 특이적이고, 광범위한 종에 걸쳐 PTH 수준을 검출하는데 사용될 수 있는, 결합을 인지하는 결합 파트너, 즉 항체에 대한 필요성이 존재한다. 최종적으로, 최소한의 정제를 필요로 하고, 무손상 PTH에 대한 보다 큰 결합 인지를 야기하고, 거대 비-(1-84) PTH 단편에 대해 최소의 교차반응성을 지니는, 통상적인 메커니즘을 이용하여 용이하게 유래될 수 있고, 종래의 결합 파트너 보다 높은 항체 수율을 생성시키는 방법을 이용하여 유래될 수 있는, PTH에 대한 높은 결합 친화성을 지니는 개선된 결합 파트너에 대한 당 분야의 필요성이 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 특히 당 분야에서 상기 확인된 결점을 다루고 경감시킨다. 이와 관련하여, 본 발명은 유체 샘플, 예를들어 혈청, 혈장 또는 세포 배양액 중의 생체활성 무손상 PTH 수준을 결정하는데 유용한 특정 항원, 항체 및 이를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항체 및 방법은 PTH에 대한 보다 높은 친화성을 지니는 특정 장점을 지니고, 특히 PTH의 N-말단의 첫번째 잔기로부터 연장된 처음 몇개의 아미노산 잔기를 인지하나 바람직하게는 PTH의 네번째 아미노산 잔기 이후는 인지하지 않는 신규한 인지를 지니도록 고안된다. 가장 바람직한 한 구체예에서, 항체는 PTH의 N-말단의 처음 세개의 아미노산 잔기에 대해 특이성을 지닐 것이다. 항체는 또한 PTH의 거대 비-(1-84) 분자 형태와는 교차반응성을 추가로 지니지 않는다. 더욱이, 본 발명의 항원, 항체 및 이를 생성하는 방법은 광범위한 종과의 현저한 교차반응성을 지니고, 인간 뿐만 아니라 래트, 마우스, 소, 개, 돼지, 고양이 및 원숭이의 PTH 수준을 검출하는데 사용될 수 있다.
한 바람직한 구체예에 따르면, 항원은 하기 식을 포함한다:
VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY
상기 식에서, X는 LEU [서열 목록 번호:1] 및 PHE [서열 목록 번호:2]로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 구체예와 관련하여, 상기 항원성 펩티드는 PTH의 아미노산 잔기 2-12로, 이의 여섯번째 아미노산 잔기는 LEU와 PHE 사이에서 선택적이고, LEU는 인간, 래트, 마우스 및 돼지의 PTH에서 발생하는 반면, PHE는 소 및 개의 PTH에서 발생한다. 더욱 바람직한 한 구체예에서, 항원은 하기의 식을 지니는 펩티드를 포함한다:
Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY
상기 식에서, X는 상기 논의된 바와 같이 LEU와 PHE 사이에서 선택된 아미노산 잔기이고, Y는 SER 또는 ALA [각각 서열 목록 번호:3, 서열 목록 번호:4, 서열 목록 번호:5 및 서열 목록 번호:6]로 구성된 아미노산 잔기이고, SER는 인간, 개 및 돼지에 존재하는 아미노산이고, ALA는 래트, 마우스 및 소의 PTH에 존재한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 항원은 하기 식을 포함한다:
VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU
상기 식에서, X는 LEU [서열 목록 번호:7] 또는 PHE [서열 목록 번호:8]로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 항원성 펩티드는 PTH의 아미노산 잔기 2-15로, 이의 여섯번째 아미노산 잔기는 LEU 또는 PHE이고, 이는 상기에 특정된 적절한 종에 존재하는 상응하는 아미노산 잔기이다. 또 다른 구체예에서, 항원성 펩티드는 PTH의 아미노산 잔기 1-15로, 하기 식을 포함한다:
Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU
상기 식에서, X는 아미노산 잔기 LEU 또는 PHE를 포함하고, Y는 SER 또는 ALA [각각 서열 목록 번호:9, 서열 목록 번호:10, 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12]로 구성된 아미노산 잔기이고, ALA는 상기 확인된 특정 종에 상응하도록 선택된다.
본 발명에 따른 항체 및 이를 생성하는 방법과 관련하여, 이는 전술한 항원에 대한 친화성 및 특이성을 지니는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 항체는 PTH의 아미노산 잔기 2-12, 1-12, 2-15 및 1-15 각각에 대해 특이적이다. 가장 바람직한 한 구체예에서, 항체는 PTH의 처음 세개의 아미노산에만 특이적이다. 이러한 항체는 바람직하게는 상술한 다양한 펩티드 항원을 단독으로 또는 담체 단백질과 조합하여 숙주 동물, 바람직하게는 염소에 투여하여 펩티드 항원에 대한 항체 생성물을 생성시키는 단계를 통해 생성된다. 한 바람직한 대안적 구체예에서, 항체 생성은 PTH의 보다 큰 펩티드 단편의 투여를 통해 유도된다. 바람직하게는, 이러한 PTH 단편은 임의로 항원성 또는 무손상 (1-84) PTH를 증가시키기 위해 공유적으로 연결되거나 융합된 담체 단백질을 추가로 포함할 수 있는 (1-34) PTH를 포함할 수 있다. 인간의 PTH를 검출하기 위해 유도되는 항체를 얻기 위해, 무손상 (1-84) PTH 분자는 바람직하게는 무손상 래트 PTH 또는 덜 바람직하게는 인간 PTH를 포함한다. 이후, 항원의 숙주 동물로의 투여에 의해 생성된 항체 역가가 모니터된다. 이후, 숙주 동물에서 생성된 항혈청이 분리된 후, PTH의 요망되는 항원 영역 (즉, PTH의 아미노산 잔기 2-12, 1-12, 2-15 및 1-15 각각)에 대해 특이성을 지니는 항체가 친화성 크로마토그래피에 의해 선택된다. 추가 단계에서, 분리된 항체는 추가로 정제되어, 원치 않는 항체를 보유하고, (1-3) 또는 (1-4) PTH에 대해서만 특이적인 항체를 통과시키는 (4-34) PTH 및/또는 (4-84) PTH 또는 (5-34) PTH 및/또는 (5-84) PTH에 해당하는 결합 항원을 이용함으로써 PTH의 네번째 또는 다섯번째 N-말단 아미노산 잔기 이후에 연장된 아미노산 잔기에 대한 친화성을 지니는 항체가 제거된다. 이후, 항체는 인간 또는 임의의 다양한 종에 대한 것일 수 있는 PTH의 검출에 사용하기 위해 라벨링되거나 임의의 다양한 통상적인 분석에 포함된다.
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, PTH의 아미노산 잔기 2-12, 1-12, 2-15 및 1-15 각각에 초점을 맞춤으로써 본 발명의 항원, 항체 및 방법은 N-말단 생물학적 활성을 지니는 PTH 분자의 일부에 초점을 맞춤으로써 이의 검출을 최대화한다. 더욱이, 더욱 바람직한 구체예와 관련하여, N-말단의 생물학적 활성 부위 이후에 연장된 기타 아미노산 (즉, PTH의 12번째 및 15번째 아미노산 잔기 이하)을 포함하는 항원, 항체 및 이를 생성하는 방법을 제공함으로써, 상기 항체의 특이성 및 친화성은 더욱 고도로 정련되고, 분석 등에 포함되는 경우 종래의 수용체 보다 큰 특이성 및 친화성으로 PTH 수준을 검출할 수 있다. 가장 바람직한 한 구체예에서, 항체는 PTH의 처음 3개의 아미노산 잔기 이하에 대해 특이성을 지니고, 이는 논의된 바와 같이 본 발명의 항원의 사용을 통해 생성된 항체가 (4-34) PTH 또는 (4-84) PTH에 대한 친화성을 지니는 항체에 대해 선택적으로 제거되는 제거 또는 "스크러빙(scrubbing)" 단계를 통해 달성된다. 결과적으로, 본 발명에 따라 생성된 항체 (및 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 기술된 방법 및 펩티드 항원)는 거대 비 (1-84) PTH 펩티드 단편에 대한 교차반응성이 실질적으로 제거되고, PTH의 첫번째 아미노산 잔기만을 최대로 인지하지 않으며, 추가로 본 발명의 방법으로부터 생성된 항체 수율이 종래의 방법 보다 큰 경우인 한에 있어서 비용 효율이 높은 방식으로 용이하게 유래될 수 있다.
대안적으로, 이러한 제거 또는 "스크러빙" 단계는 (5-34) PTH 또는 (5-84) PTH에 대한 친화성을 지니는 항체를 선택적으로 제거하기 위해 사용될 것이다. 이에 의해, 최종적으로 분리된 항체는 PTH의 N-말단의 처음 4개 이하의 아미노산 잔기에 대해 친화성을 지닐 것이다. 따라서, 본 발명의 목적은 1) 항체의 생성 및 분리를 위한 선택적 항원; 2) 거대 비 (1-84) PTH 펩티드 단편에 대한 경감된 교차반응성을 지니는, PTH에 대한 결합 친화성 및 특이성을 지니는 항체; 및 3) 이러한 항체를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 1) 항체의 생성을 위한 선택적 항원; 2) 종래의 결합 파트너보다 큰 PTH에 대한 친화성 및 특이성을 지니고, 추가로 본 발명에 따른 항원, 항체 및 이를 생성하는 방법이 다양한 종의 PTH의 검출에 용이하게 사용될 수 있도록 높은 정도의 종간 PTH 교차반응성을 지니는 항체; 및 3) 이러한 항체를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 1) 항체의 생성 및 분리를 위한 선택적 항원; 2) PTH의 보다 많은 생물학적 활성 N-말단 부분에 대한 결합 친화성 및 특이성을 지녀, 생체활성 무손상 PTH 수준을 결정하는 데 있어서 이와 관련된 종래의 결합 파트너 보다 유효하고 정확한 항체; 및 3) 이러한 항체를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 1) 항체의 생성 및 분리를 위한 선택적 항원; 2) PTH의 첫번째 N-말단 아미노산 잔기에 대해서만 최대 결합 친화성을 지니지 않는 항체; 및 3) 이러한 항체를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 1) 항체의 생성 및 분리를 위한 선택적 항원; 2) PTH의 N-말단에 대한 결합 친화성 및 특이성을 지니는 항체를 생성하기 위한 종래 방법 보다 높은 항체 수율로 생성하고 발생시키는 보다 경제적인 항체; 및 3) 이러한 항체를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 추가 목적은 1) 항체의 생성 및 분리를 위한 선택적 항원; 2) 임의의 다양한 시판되는 분석에 용이하게 포함될 수 있고, 임의의 다양한 면역분석 적용에 대해 요망되는 바와 같이 변형 (예를들어, 라벨링 등을 포함)될 수 있는 항체; 및 3) 이러한 항체를 용이하게 유도하는 항체 생성 방법을 제공하는 것이다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 상기 특징 및 기타 특징은 하기의 도면을 참조로 하여 더욱 명백해질 것이다:
도 1은 다양한 종, 즉 인간, 래트, 마우스, 소, 개, 돼지, 고양이 및 원숭이에 대한 PTH의 아미노산 서열을 도시하고, 이는 추가로 서열 목록 번호:1, 서열 목록 번호:2, 서열 목록 번호:3, 서열 목록 번호:4, 서열 목록 번호:5, 서열 목록 번호:6, 서열 목록 번호:7, 서열 목록 번호:8, 서열 목록 번호:9, 서열 목록 번호:10, 서열 목록 번호:11, 및 서열 목록 번호:12로 본원에서 확인된 아미노산 서열을 도시한다.
도 2는 상술한 종의 PTH의 1-84 아미노산 서열의 변이를 도시하지만, 서열 목록 번호:1-12의 아미노산 서열이 비교적 일정하게 존재하는 PTH의 보존된 N-말단을 도시하는, 도 1의 대안적 예시이다.
도 3은 인간 PTH의 N-말단 부분의 도표적 개관이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 항체를 생성하기 위한 단계를 도시하는 순서도이다.
발명의 상세한 설명
하기 기술되는 상세한 설명은 본 발명의 현재 바람직한 구체예의 기재로서, 본 발명이 구성되거나 사용될 수 있는 유일한 형태를 나타내는 것은 아니다. 이러한 기재는 본 발명을 구성하고 수행하기 위한 단계의 작용 및 순서를 기술한다. 그러나, 다양한 구체예에 의해 동일하거나 동등한 작용 및 순서가 달성될 수 있고, 이들이 또한 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이 이해되어야 한다.
본 발명은 PTH의 N-말단 영역에 위치한 PTH의 항원성 영역, 보다 상세하게는 도 1-3에 10으로 도시된 N-말단으로부터 연장되는 처음 15개의 아미노산 잔기에 특이적인 항원, 항체 및 이를 생성하는 방법을 포함한다. 가장 바람직한 한 구체예에서, 항체는 PTH의 처음 3개의 아미노산 잔기에 대해서만 특이적이다. 널리 공지되어 있는 바와 같이, PTH의 N-말단 영역은 PTH/PTHrp 수용체 결합에 필요한 것으로 인지되고, 또한 생물학적 유체 샘플, 예를들어 혈청, 혈장 또는 세포 배양액에서 발견될 수 있는 생체활성의 무손상 PTH 수준을 측정하기 위한 가장 바람직한 에피토프인 것으로 인지된다. PTH 및 이를 검출하는 방법에 대한 당 분야의 현태 상태는 교시내용이 참조로서 본원에 명백히 포함되어 있는 공개 특허 협력 조약 국제 출원 번호 PCT/US00/00855 및 국제 출원 번호 WO/00/42437 (Methods for Differentiating and Monitoring Parathyroid and Bone Status Related Diseases, and Lepage, Raymond et al., A Non-(1-84) Circulating Parathyroid Hormone (PTH) Fragment Interferes With Intact PTH Commercial Assay Measurement In Uremic Samples, Clinical Chemistry 44:4, 1998 pages 805-809)에 논의되어 있다.
한 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 항원성 펩티드는 도 1-3에서 12로서 집합적으로 확인되는, PTH의 아미노산 잔기 2-12에 해당하는 아미노산 잔기를 포함한다. 특히, 상기 항원성 펩티드는 하기의 식을 지닐 것이다:
VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY
상기 식에서, X는 LEU [서열 목록 번호:1] 또는 PHE [서열 목록 번호:2]로부터 선택된 아미노산 잔기이다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, PTH 펩티드 단편의 여섯번째 아미노산 잔기는 이러한 잔기가 인간, 래트, 마우스 및 돼지에서는 LEU를 포함하는 한편, 소 및 개 등에 대해서는 PHE를 포함하는 바와 같이 상기 언급된 종 사이에서 상이하다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 단일한 아미노산 잔기 차이에도 불구하고, 상기 항원성 펩티드는 상기 언급된 종 사이에서 일정한 채로 유지되고, 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 교차반응성으로 인해 상기 항체는 다양한 종에서 PTH 수준을 검출하는데 유용하게 제조되고 최종적으로 이용될 수 있다.
보다 바람직한 한 구체예에서, 펩티드 항원은 14로서 확인되는 PTH의 처음 12개의 아미노산 잔기이고, 하기 식을 포함한다:
Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY
상기 식에서, X는 LEU 또는 PHE로부터 선택된 아미노산 잔기이고, Y는 SER 또는 ALA [각각 서열 목록 번호:3, 서열 목록 번호:4, 서열 목록 번호:5 및 서열 목록 번호:6]로부터 선택된 아미노산 잔기이다. 첫번째 아미노산 잔기에서의 변이와 관련하여, 상기 아미노산이 인간, 개 및 돼지에서 발견되는 SER, 또는 래트, 마우스 및 소에서 발견되는 ALA를 포함하도록 상기 항원성 펩티드가 형성될 수 있음이 용이하게 인지될 것이다. 이와 관련하여, 특히 더욱 바람직한 구체예에서 본 발명의 항원성 펩티드에 대해 제공된 변이체는 상기 항원성 펩티드로부터 최종적으로 유래된 항체가 주어진 종에서 PTH를 검출하는 것이 요망되는 경우에 보다 높은 결합 친화성을 지니도록 형성될 수 있도록 하는 여지를 제공한다.
본 발명의 더욱 정밀한 구체예에서, 항원성 펩티드는 PTH의 아미노산 잔기 2-15 및 1-15 각각에 해당하는 서열을 포함한다. 도 1-3에서 16으로 확인되는 아미노산 잔기 2-15와 관련하여, 이러한 항원성 펩티드는 하기의 식을 지닐 것이다:
VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU
상기 식에서, X는 LEU [서열 목록 번호:7] 또는 PHE [서열 목록 번호:8]로부터 선택된 아미노산 잔기이다. 10으로 확인되는 PTH의 아미노산 잔기 1-15에 해당하는 후자의 구체예와 관련하여, 이러한 항원성 펩티드는 하기의 식을 지닐 것이다:
Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU
상기 식에서, X는 LEU 또는 PHE로부터 선택된 아미노산 잔기이고, Y는 SER 또는 ALA [각각 서열 목록 번호:9, 서열 목록 번호:10, 서열 목록 번호:11 및 서열 목록 번호:12]로부터 선택된 아미노산 잔기이다. 본원에 제공된 서면의 서열 목록과 동일한, 37 CFR 1.821-1.825의 조건에 준한 서열 목록 번호:1-12의 컴퓨터 판독가능한 형태를 제공하는 컴팩트 디스크가 상기 법령 요건에 부합하도록 제출되었다. 전술된 펩티드에 대한 전술한 식에도 불구하고, 펩티드는 이의 모든 모든 기능적 유도체를 포함할 것이며, 이는 특정 항-PTH 항체, 더욱 특히 PTH의 N-말단 아미노산 잔기에 특이적인 항체를 유도하는 유사한 능력을 지니는, 도 1-3의 서열에 나타낸 바와 같은 PTH의 동일한 영역으로부터 유래된 기능적으로 동등한 펩티드를 포함하는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 이러한 기능적 유도체는 유도가 PTH에 반응성인 항체를 유도하는 펩티드 항원의 능력을 변화시키지 않는 조건에서, 유사하게 위치된 펩티드 또는 상기 논의되고 도 1-3에 나타낸 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실을 지니는 서열로부터 유래된 펩티드일 수 있다.
본 발명의 펩티드 항원은 아미노산 서열이 도 1-3에 상기 논의된 펩티드의 몇개의 아미노산의 업스트림 또는 다운스트림 내에서 변경될 수 있는 펩티드, 및 아미노산의 치환, 첨가 또는 결실 또는 변화가 PTH의 처음 12개의 아미노산 잔기에 대해 높은 친화성 및 특이성을 지니면서 항체를 유도하는 펩티드 항원의 능력에 현저하게 영향을 주지 않는 보존성 아미노산 변화를 지니는 펩티드, 또는 이들의 임의의 아-구성요소(sub-component)를 포함하는 것이 추가로 인지되어야 한다.
항체 생성과 관련하여, 도 4에 항체를 생성하는 방법 20이 예시되어 있다. 최초로, 주어진 종의 PTH의 처음 12개 내지 15개의 아미노산의 전부 또는 일부에 해당하는 전술한 변형의 펩티드 22가 제공된다. 그러나, 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 항체 생성에 사용되는 항원성 펩티드는 보다 큰 PTH 단편, 예를들어 비제한적인 예로 (1-34) PTH 및 전체의 온전한 (1-84) PTH 펩티드를 포함할 것이다. 이에 따라, 최종적으로 생성된 항체는, 최소한 하기 논의되는 단계 24를 통해 항원 22를 준비한 후, 이를 투여하는 최초 단계와 관련하여, 본 발명의 방법으로 전술한 항원성 펩티드에 해당하는 아미노산 잔기 (즉, PTH의 아미노산 서열 2-12, 1-12, 2-15 및/또는 1-15)에 대한 특이성을 지닐 것이고, 전체의 PTH 펩티드 및 이의 임의의 N-말단 단편이 바람직하게는 PTH의 N-말단에서 PTH의 생물학적 활성 부분에 대해 이상적인 결합 친화성 및 특이성을 최종적으로 지니게 되는 항체의 생성을 유도하기 위한 적절한 항원성 펩티드로 작용할 수 있음이 인지될 것이다. 가장 바람직한 한 구체예에서, 준비되고 투여되는 항원성 펩티드는 담체 단백질에 커플링되거나 커플링되지 않을 수 있는 PTH의 아미노산 잔기 1-34에 해당하는 PTH 단편을 포함할 것이다. 이러한 펩티드 단편은 대안적으로 바람직하게는 도 1 및 2에서 확인되는 임의의 종의 형태를 취할 수 있는 전장 (1-84) PTH로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 인간 PTH에 특이적인 항체를 발달시키기 위해서는, (1-34) 래트 PTH 또는 전장 (1-84) 래트 PTH의 사용이 바람직하다.
이러한 항원성 펩티드는 통상적인 방법, 예를들어 고상 화학 합성, 또는 재조합 기술에 의한 합성을 포함하는 당 업계에 널리 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 추가로 인지되는 바와 같이, 합성 펩티드는 담체 단백질에 화학적으로 커플링되거나 커플링되지 않을 수 있거나, 대안적으로 재조합 펩티드는 항원성을 증가시키기 위해 융합 단백질로 생성될 수 있다. 당업자에 의해 추가로 인지되는 바와 같이, 이러한 항원성 펩티드는 항 PTH 항체를 유도하는 이들의 능력에 기초하여 스크리닝될 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 스크리닝 기술은 면역침전 또는 면역검정을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
일단 유래된 펩티드 항원은 이후 통상적인 기술을 이용하여 본 발명의 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 바람직하게는 애쥬번트와 조합된 펩티드 항원(들)이 숙주 동물 24, 바람직하게는 염소에 투여된다. 그러나, 기타 종, 예를들어 래빗, 마우스, 양, 닭 등이 숙주 동물로서 추가로 사용될 수 있음이 인지되어야 한다. 이와 관련하여, 이러한 항원의 투여는 피하 또는 근내 주사를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인지되는 바와 같이, 투여되는 펩티드 항원의 용량은 사용되는 특정 펩티드, 및 숙주 동물에 상응하게 다양할 것이다. 그러나, 주어진 종에 대하여 가능한 가장 높은 친화성 및 특이성을 지니는 항체를 수득하기 위해, 별도의 항체가 각각의 종으로부터의 적절한 동등한 펩티드에 대해 생성되어야 하는 것이 추가로 인지될 것이다.
투여된 후, 숙주 동물에서 생성된 항체 역가의 결과는 이후 모니터되고 26, 이는 단계 28에서 분리되는 항혈청 (예를들어, 원심분리를 통해 수득)과 함께 통상적인 채혈 등의 이용후, 결합 특이성을 지니는 항-펩티드 항체의 존재를 스크리닝하는 당 업계에 널리 공지된 임의의 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. 사실상 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있는, 본 발명의 항체를 유도하는 통상적인 면역학적 방법이 제공되는 것이 추가로 인지될 것이다. 통상적인 실시와 일치하게, 다수의 숙주 동물로부터 항혈청이 유래되는 것이 바람직하다.
숙주 동물로부터 유래된 생성된 항혈청은 본 발명의 항체를 유도하기 위해 친화성 정제될 수 있다. 당 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 항혈청은 통상적인 기술, 예를들어 고상 (예를들어, 비드 등)에 결합되는 PTH의 아미노산 잔기 서열 2-12, 1-12, 2-15 및/또는 1-15에 해당하는 전술된 항원성 펩티드를 분리 컬럼에 도입시킴으로써 정제될 수 있다. 이후, 항혈청은 항원성 펩티드 또는 펩티드에 대해 특이성을 지니지 않는 항체를 제거하기 위해 세척될 수 있고, 항원성 펩티드 또는 펩티드에 대해 특이적인 결합 항체가 잔류되고, 최종적으로 이는 컬럼으로부터 용리된다. 이후, 이러한 항체는 당업자에게 널리 공지된 통상적인 기술에 따라 저장될 수 있다.
추가 단계 29에서, 상기 분리 및 정제 과정을 통해 유도된 항체는 (4-34) 또는 (5-34) PTH 및/또는 (4-84) 또는 (5-84) PTH에 대한 친화성을 지니는 항혈청 내에 존재하는 임의의 항체가 선택적으로 제거되거나 "스크러빙(scrubbing)"되는 추가의 정제 공정으로 처리될 것이다. 이를 위해, 항혈청이 단계 28에서 분리된 후, 항혈청이, 아미노산 서열 (4-34) 또는 (5-34) PTH 또는 (4-84) (5-84) PTH에 해당하는 항원성 펩티드가 이에 적용되어 정제되는 항혈청과 함께 고상에 결합되는 분리 컬럼 또는 기타 공지된 통상적인 기술의 사용을 통해 본원에 상술된 임의의 종에 대한 (4-34) 또는 (5-34) PTH 및/또는 (4-84) 또는 (5-84) PTH에 대한 특이성을 지니는 임의의 항체를 제거하기 위해 정제된다. 특정 (4-34) 또는 (5-34) PTH 및/또는 (4-84) 또는 (5-84) PTH 펩티드에 대한 특이성을 지니는 임의의 항체는 결합된 채로 잔류할 것이며, (4-34) 또는 (5-34) PTH 또는 (4-84) 또는 (5-84) PTH 펩티드에 대해 특이성을 지니지 않는 잔류하는 항체는 이로부터 분리될 것이다. 유리하게는, 상기 공정은 많아야 PTH의 처음 3개 또는 4개 아미노 잔기에 대해 친화성을 지니는 항체만 분리할 것이고, 이에 따라 PTH의 N-말단의 다섯번째 아미노산 잔기의 임의의 아미노산 잔기이거나 또는 PTH의 N-말단의 다섯번째 아미노산 잔기 이하의 잔기이건지 간에 결합 활성을 지니지 않을 것이다. 따라서, 이러한 공정은 최종적으로 분리된 임의의 항체가 사실상 (1-84) PTH의 가장 끝의 N-말단에 대해 특이적이 될 것이고, 이에 따라 최소한 PTH의 처음 3개 또는 4개의 N-말단 아미노산 잔기를 포함하지 않는 PTH 단편의 임의의 타입에 대해서는 달리 결합하지 않는 것을 보장한다.
상기 항체는 PTH의 아미노산 잔기 서열 2-12 및 2-15 각각에 해당하는 항원성 펩티드를 이용하여 분리되므로, 종래의 방법으로 유도된 문제점이 있는 항체로 공지된 PTH의 첫번째 아미노산 잔기에 대해 결합 친화성, 더욱이 최대 결합 친화성을 반드시 획득할 필요가 없는 분리된 항체로 존재할 것이다. 이와 관련하여, PTH의 첫번째 아미노산 잔기에 대해 친화성을 지니는 항체의 제거 또는 실질적 억제가 또한 PTH의 1-12 및 1-15 각각에 해당하는 펩티드 서열을 이용함으로써 달성될 것이나, 단 이러한 서열은 최종적으로 유도되는 항체가 사용되는 종과 유사하지 않은 첫번째 아미노산 잔기를 지니는 종으로부터 선택된다. 예를들어, 인간 PTH의 첫번째 아미노산 잔기에 대해 특이성이 결핍된, 인간의 PTH를 검출하기에 적절한 항체를 유도하기 위해, 숙주 동물로부터 유도된 항-래트 PTH 혈청이 인간 PTH의 아미노산 잔기 서열 1-12 및 1-15에 해당하는 펩티드에 대해 정제될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 이해되는 바와 같이, 래트 PTH의 첫번째 N-말단 아미노산 잔기는 인간에서 발견되는 SER과는 반대로 ALA를 포함하므로, 최종적으로 분리되는 임의의 항체는 상기의 첫번째 아미노산 잔기 서열 이후 연장된 아미노산 잔기에 대해 결합 친화성을 필수적으로 함유할 것이다.
단계 30에서 유도된 후, 상기 항체는 주어진 샘플 (예를들어, 혈청 또는 혈장)에서 발견될 수 있는 생체활성의 무손상 PTH의 존재와 관련된 면역학적 기술에서 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 항체는 생체활성의 무손상 PTH의 존재를 결정하지만, 이롭게는 거대 비 (1-84) PTH 단편과의 교차반응성을 회피하도록 하여, 주어진 샘플을 스크리닝하는데 단독으로 또는 조합적으로 사용될 수 있다. 예를들어, 상기 항체는 면역학적 분석 키트에 통합될 수 있다. 이러한 적용의 예는 혈청, 혈장 또는 세포 배양액에서의 생체활성 무손상 PTH 수준의 정량적 결정을 위해 효소면역측정법 (ELISA)을 제공하는 이뮤토픽스, 인크사 (Immutopics, Inc., San Clemente, California)에 의해 판매되는 인간 생체활성 무손상 PTH 및 래트 생체활성 무손상 PTH ELISA 키트를 포함한다. 이와 관련하여, 다양한 종에 대한 PTH에 특이적인 항체를 유도하기 위한 전술한 적용이 주어지면, 예를들어 이뮤토픽스, 인크사에 의해 제공되는 것과 같은 면역학적 분석 키트가 상기 항체의 친화성 및 특이성이 광범위한 종에 적용되도록 특이적으로 고안될 수 있거나, 대안적으로 키트가 주어진 종에 대해 보다 한정되게 맞추어 지도록 주어진 종의 적절한 동등한 펩티드에 대해 생성될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
본 발명의 추가 변형 및 개선이 또한 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본원에 기술되고 예시된 특정 조합물의 일부는 단지 본 발명의 특정 구체예로 제시하고자 하는 것으로, 본 발명의 사상 및 범위 내의 대안적 장치를 제한하고자 하는 것은 아니다.
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Claims (9)
1-84 PTH로 명명된 생물학적으로 활성인 부갑상선 호르몬의 1-84 PTH N-말단 부분에 면역특이적으로 결합하는 항체를 생성시키는 방법으로서,
상기 N-말단 부분이, (ⅰ) 1-84 PTH의 3개의 N-말단 아미노산 잔기, 또는 (ⅱ) 1-84 PTH의 4개의 N-말단 아미노산 잔기로 구성되며,
상기 방법이,
a) 서열 목록 번호:3, 서열 목록 번호:4, 서열 목록 번호:5, 서열 목록 번호:6, 1-34 PTH 및 1-84 PTH로 구성된 군으로부터 선택된 제 1 펩티드 항원을 인간이 아닌 숙주 동물에 투여하여, 상기 숙주 동물에서 상기 제 1 펩티드 항원에 대한 항체 생성을 유도하는 단계;
b) 상기 숙주 동물에게 상기 제 1 펩티드 항원을 투여함으로써 생성된 항체 역가를 모니터하는 단계;
c) 상기 제 1 펩티드 항원의 투여에 의해 상기 숙주 동물에서 생성된 항혈청을 추출하는 단계;
d) 서열 목록 번호:3, 서열 목록 번호:4, 서열 목록 번호:5, 및 서열 목록 번호:6으로 구성된 군으로부터 선택된 제 2 펩티드 항원을 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 상기 단계 c)에서 추출된 상기 항혈청으로부터 하나 이상의 항체를 분리하고 선택하는 단계;
e) 4-34 PTH, 5-34 PTH, 4-84 PTH 및 5-84 PTH로 구성된 군으로부터 선택된 제 3 펩티드 항원을 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 4-34 PTH, 5-34 PTH, 4-84 PTH 및 5-84 PTH로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 항원에 대한 특이성을 갖는 상기 단계 d)에서 분리된 하나 이상의 상기 항체를 각각 제거하는 단계; 및
f) PTH의 N-말단 부분의 최대 처음 3개 또는 4개의 아미노산 잔기에 대한 결합 친화성을 갖는 단계 d) 및 e)의 상기 항체를 분리시키는 단계로서, 상기 분리된 항체가 단계 e)로부터 생성된 용출물을 수집함으로써 PTH의 N-말단의 다섯번째 아미노산 잔기 또는 다섯번째 이후의 아미노산 잔기 중 임의의 아미노산 잔기에 대해 결합 친화성을 갖지 않는 단계를 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 a)의 숙주 동물이 마우스 및 래빗으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 a)의 숙주 동물이 1마리 이상의 염소를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 a)의 1-34 PTH가 래트, 마우스, 소, 개, 돼지, 고양이 및 원숭이로 구성된 군으로부터 선택된 종으로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 a)의 제 1 펩티드 항원이 이에 커플링(coupling)된 담체 단백질을 지님을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 a)의 1-84 PTH가 래트, 마우스, 소, 개, 돼지, 고양이 및 원숭이로 구성된 군으로부터 선택된 종으로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
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