JPH0343078A - 新規ハイブリドーマ,モノクローナル抗体および用途 - Google Patents

新規ハイブリドーマ,モノクローナル抗体および用途

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JPH0343078A
JPH0343078A JP1179494A JP17949489A JPH0343078A JP H0343078 A JPH0343078 A JP H0343078A JP 1179494 A JP1179494 A JP 1179494A JP 17949489 A JP17949489 A JP 17949489A JP H0343078 A JPH0343078 A JP H0343078A
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波田 壽一
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Yoshiki Yasumuro
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り墓上斐肌里公号 本発明は新規ハイブリドーマ、モノクローナル抗体、お
よび該ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗
体の製造法、並びに該モノクローナル抗体を用いる肝癌
の診断法に関する。
従来の技術 ケーラーとミルンユタインにより開発され、近年盛んに
なってきたハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体
(以下MoAbと略称することがある)の製造法は、各
々の抗原決定基に対し、単一特異性を示す抗体が得られ
ることや、必要に応じて自由に多量にしかも常に均質な
標品を再現性よく得られることなど多くの利点がある。
このような意味から、ハイブリドーマによるM o A
 b取得の方法は多方面にわたってその有効性が高く評
価されている。またその利用法として単に抗原の検出だ
けてなく微量成分の精製や診断等への応用が展開されて
おり、さらに予防薬、治療薬への応用も考えられている
肝癌は、胃癌、肺癌等と同様、日本を含む各国で高い死
亡原因を占める悪性腫瘍である。今日、肝癌の治療は切
除術が大半を占めており、そのため肝癌と高い反応性を
示すMoAbの取得は肝癌の早期診断を可能にす−るば
かりか、予防、治療上においても極めて有効なものにな
ると考えられる。
これまで肝癌に対して反応性を示すマウスM。
Abについては、いくつかの報告が見られる〔インター
ナショナル ジャーナル オブ キャンサ−(Int、
 J、 Cancer)±1.309 (198g) 
;キャンサー イムノロジー イムノテラビイ−(Ca
ncerIsaunol、 Lamunother、 
) 21. 26 (198g) :プロシーディング
ス オブ ザ ナショナル アカデミイ オブ サイエ
ンセス(Proc、 Natl、 Acad。
Sci、)85 、 3140 (1988))。
通常、腫瘍に対するMoAbを取得するためには、目的
とする癌組織または目的とする癌の培養株化細胞、ある
いはまたは癌胎児性抗原等で動物を免疫し、目的とする
抗体産生細胞を細胞融合法で株化する方法がとられてい
る。肝癌に対するMoAbの場合にも、これまでこのよ
うな方法でMoAbが取得されている。癌の抗原性は多
様性に富むといわれ、このようにして得た抗体は、−船
釣に目的の癌、例えば肝癌抗体の場合、すべての肝癌と
反応する訳ではない。得られた抗体を診断あるいは治療
の目的に使用するためには、特にこの陽性率ができるだ
け高いか、これまでり抗体では検出できない癌組織と反
応する抗体であることが望ましい。そのためには、例え
ば膵癌、胆道系癌を認識するといわれるCA19−9 
(ツマティク セルジェネティクス(Soaat ic
  Cel l  Genet、 ) 5 +957(
1979))、CA30 (インターナショナルアチー
ブス オブ アレルギー アンド アプライド イムノ
ロジー(Int、 Arch、^llergyApp1
. Immunol、)71 、  l 78 (19
83)E等の抗体は大腸癌細胞を、NCC−3T−43
9抗体〔ガン(Gann)75. 540 (1984
)]は、胃低分化型腺癌をマウスに免疫するというよう
に、他種の癌細胞を免疫原として目的とする抗体を取得
されてきた。
発明が解決しようとする課題 公知の抗ヒト肝癌MoAbは、いずれも反応する肝癌が
限定され、また正常細胞あるいは他種の癌細胞と反応す
る場合も多く、肝癌の診断薬等として用いるのに充分と
はいえない。例えば、α−フェトプロティンは原発性肝
癌の有力な腫瘍マーカーであるが、肝癌の約50%を捕
捉するに過ぎず、また癌が相当進行してから陽性となる
場合が多い。
したがって、より優れた診断薬としてのMoAbが望ま
れている。
課題を解決するための手段 本発明者らはこれまでの抗ヒト肝癌MoAb取得法と異
なり、胃線癌細胞HuG−1を免疫原として動物を免疫
した後、細胞融合法により得たマウスMoAbがヒト肝
癌に反応するが、α−フェトプロティンとの相関がない
ことを認め、診断薬としての重要性が高いことを見出し
た。そこでさらに鋭意研究し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、(1)胃線癌細胞で免疫した哺乳
動物の抗体産生細胞とリンパ球様細胞株とを融合した、
ヒト肝癌患者血清に反応するモノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマ。
(2)請求項1記載のハイブリドーマが産生ずるヒト肝
癌患者血清に反応するモノクローナル抗体。
(3)クローン化された請求項1記載のハイブリドーマ
を培養し、ヒト肝癌患者血清に反応するモノクローナル
抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する該モノクローナル抗体の製造法、および(4)請求
項2記載のモノクローナル抗体を用い、免疫化学的に患
者由来の試料中に存在する該モノクローナル抗体と反応
する物質を検出・測定することを特徴とする肝癌の診断
法である。
上記免疫原とする胃線癌細胞は原発巣あるいは、他臓器
またはリンパ節に転移したものでもよく、またこれらの
組織からとり出され株化された細胞でもよい。
該胃線癌細胞の例としては、たとえば胃線癌細胞HuG
−1〔日本消化器病学会雑誌第85巻成時増刊号第12
8頁(1988年))、MKN−7,NKN−28,M
KN二45〔新潟医学全雑誌 第91巻第737頁(1
977年))、MKN−75[Motoyama池  
アクタ・メゾイカ・エト・バイオロジカ 第27巻 4
9頁(1979年)〕等が挙げられる。
免疫する哺乳動物として、例えばマウス、ラット、ハム
スターなど実験動物が有利に使用でき、とりわけマウス
が好ましい。抗体産生細胞は免疫した動物の牌細胞が有
利に使用される。株化されたヒト牌細胞株でもよい。
免疫される動物の細胞ならびに融合相手となるリンパ球
様細胞株として各種の組合わせが可能であるが、細胞融
合実験で最も実績があり、細胞融合効率その他において
条件のよいマウス細胞間の融合、すなわち抗原で過免疫
したマウスの抗体産生細胞と細胞融合効率、増殖性等の
すぐれたマウスミエローマ細胞とくにヒポキサンチン、
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株(H
GPRT−株)やチミジンキナーゼ欠損(T K −)
のようなマーカーをもった適切な同種または異種(好ま
しくは同種)のミエローマ〔例、P3−X63Ag・8
U I(市森 他 ジャーナル・オブ・イムノロジカル
・メンノド 80 55 (1985))。
P3−X63  Ag8−6.5.3(Shulman
、 M他ネイチャー 第276巻 269頁(197g
))。
マウスミエローマ系細胞SP210−Agl 4(SP
 2) (Nature、 276.269 (197
g)) )などが挙げられる。
また、ヒトのリンパ球様細胞でもよく、この場合は、ヒ
トからとり出され株化されたものが有利に用いられる。
本発明のハイブリドーマを得るためには、免疫原として
生細胞、細胞膜画分、細胞のホモジネートなどで免疫す
ることが可能であるが、例えば生細胞を生理食塩水等に
遊離させ接種する方法は、簡便で効率よい方法として好
都合に用いられる。
投与量、投与ルート、投与間隔等については可変度が高
く、種々の方法が可能であるが、−例として107個の
生細胞をマウス腹腔内に数ケ月内に複数回、好ましくは
2週間隔で3回以上の投与を行う方法が挙げられるが、
種々の変法が可能でありこの方法に限定されるものでは
ない。
最終免疫の後、約2〜10日好ましくは約3〜5日のリ
ンパ球、好ましくは肺臓リンパ球を採取し、リンパ球様
細胞株、好ましくはミエローマ細胞と細胞融合を行い、
例えばヒボキサンチン、アミ/プテリン、チミジンを含
む選択培地(HAT培地)を用いて融合細胞のみを選択
的に増殖させることができる。
細胞融合のためには、両細胞をセンダイウィルス、ポリ
エチレングリコール(pEc)(il[の例二1000
.4000.6000)等の融合剤を用いたり、電気刺
激等の方性で融合させることができるが、PEGを用い
る方法は最も操作が簡単で効率も高いので有利に用いら
れる。
細胞融合によって選択培地で増殖してきた各ハイブリド
ーマの上清について、まず免疫源として用いた胃線癌細
胞に対する反応性が陽性で正常組織に対する反応性が微
弱ないし陰性の細胞を選ぶ。
両線癌細抱に対する反応性の検索は、蛍光抗体法。
ラジオイムノアッセイ(RIA)法、酵素免疫測定法(
EIA)など各種の方法が可能であるが、細胞を用いた
EIISA法[cell  5urface  E L
 ISA、  ジャーナル オブ イムノロジカル メ
ソッド(J、  lsmunol、  Methods
)ヱ6 、 63 (1985))  は、細胞表面抗
原を認識する抗体の簡便で、感度のよい分法として有利
に用いられる。
このようにして選択された胃線癌細胞に対して反応性を
示すM o A b産生ハイブリドーマは、例えば限界
希釈法などによってクローン化することができる。クロ
ーン化された各細胞の産生ずる抗体の胃線癌細胞に対す
る反応性は上述したと同様に調へることができ、このよ
うにして胃線癌細胞反応性の代表的なりローンを得るこ
とができる。
得られたクローンの産生ずる抗体の各種癌患者および正
常人血清に対する反応性は、サンドインチE I Aで
非常に感度よく調べることができる。
本発明の胃線癌細胞にズ・1するモノクローナル抗体は
、例えば上記した本発明のハイブリドーマを用いて該M
oAbを生成、蓄積せしめ、これを採取することにより
製造することができる。
該MoAbの生成、蓄積は、本発明のハイブリドーマを
インキュベートすることにより行われる。
インキュベーションは、液体培地中または動物の腹腔内
(通常マウスの腹腔内)で行う。
培地としては、例えば動物細胞培養用基礎培地、例えば
RPMI−1640培地などに牛胎児血清を例えば約0
.1〜40%加えたものなどが使用できる。培養は通常
約5〜IO日間、約25℃〜45℃好ましくは37℃前
後で行うことにより、培養液から該MoAbを得ること
ができるが、この他にマウス等の適切な哺乳動物の腹腔
内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取することによ
り、細胞培養上清よりも遥かに高力価の抗体を、多量に
効率よく取得することができる。このためには、例えば
マウスの場合、ミネラルオイル等を前もって接種したB
 A L B/C等のマウスに約1×10’〜I X 
10’個、好ましくは約5X10’〜2X10@個のハ
イブリドーマを腹腔内等に接種し、約7〜20日後、好
ましくは約10−14日後に腹水液等を採取する。腹水
に生成蓄積した抗体は、例えばセファロースCL−6B
カラムクロマト(ファルマシア社製)等により、容易に
モノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離
することができる。
本発明により製造される胃線癌細胞に対するMoAbは
下記の性状を有する。
(1)ヒト胃腺癌細胞に対して反応性を有する。
(2)ヒト肝癌患者血清に高率に反応性を有する。
これらの血清中にはα−フェトプロティンが検出できな
いものも存在し、α−フェトプロティンとの相関性は認
められない。
(3)ヒト胃癌、大腸癌患者血清には反応せず、わずか
に肺癌患者血清に反応する。
(4)上記以外では、肝硬変、慢性肝炎患者血清と一部
反応性を示す。
(5)抗体のクラスはIgMである。
後述の検出・測定に抗体を用いる際の抗体分子としては
、フラクションでもよく、該フラクションとしてはたと
えば、F ab、  F ab’、  F (ab’)
F ab’が挙げられる。
本発明は免疫原として肝癌以外の組織である胃線癌細胞
HuG−1を用いることにより、意外にも結果的に肝癌
に対して従来の抗体とは反応性の異なるMoAbが得ら
れるとともに本抗体が有力な肝癌の診断薬になるという
新しい方広論を提供するものである。
本発明により製造され、肝癌患者血清に対し高率に反応
性を示すMoAbは、EIA法、EL、ISA法、RI
A法などを用いた系での肝癌の早期診断に大変有利であ
る。
上記の検出・測定に供せられる患者由来の試料としては
、たとえば血清、尿、脳をft1lIilI等の体液や
時には組織およびその抽出物などが挙げられる。
本発明の測定方法のEIAの例として、標識剤がペルオ
キシダーゼの場合について以下に具体的に説明するが、
ペルオキシダーゼに限定されるものではない。
まず、■担体に保持された抗体に、被検試料を加えて結
合反応を起こさせ、これに、ペルオキシダーゼを結合し
た抗体を加え反応させる。
■: ■で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基
質を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定
することにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。
■二 上記■〜■の操作を既知量の該抗体反応物質の標
準溶液に対してあらかじめ行い、反応物質と吸光度もし
くは蛍光強度との関係を標準曲線として作成しておく。
■: 未知量の分析対象物(被検試料)について得られ
た吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析
対象物中の当該モノクローナル抗体と反応する物質の量
を測定する。
本発明の測定方法のRIAの例として、標識剤が1!5
1の場合について以下に具体的に説明するが、+157
に限定されるものではない。
まず■担体に保持された抗体に測定すべき被検試薬を加
えて結合反応を起こさせ、これに+251は識抗体を加
え反応させる。
■ ■で得られた反応生成物のγ−放射活性を測定する
■ 上記■−■の操作を既知量の該抗体反応物質の標準
液に対してあらかじめ行い反応物質とγ放射活性の関係
をfi1曲線として作成しておく。
■ 未知量の分析対象物(肢検試f4)について得られ
たγ−放射活性を標準曲線にあてはめ分析対象物中の該
抗体反応物質の量を測定する。
以上の測定分法により得られた値が例えば正常人より得
られた値の平均値+23D以上の値を示すものを陽性と
して判断することが可能である。
後述の実施例で得られたハイブリドーマは、財団法人発
酵研究所(I FO)に寄託され、また、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所(FRI)にブダペスト
条約に基づく寄託として寄託されている。受託臼および
受託番号を第1表に示す。
実施例 以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1(ハイブリドーマの製造) 胃癌患者腹水より樹立された腺癌細胞HuG=1株〔日
本消化器病学会惟誌第85巻成時増刊号第128頁(1
988年)〕は、浮遊性増殖を示し、倍加時間は38時
間、平均染色体は60本、抗CEA、CA19−9.T
PA抗体により陽性に染色され、また培養上清中に、こ
れらのil!!瘍マーカマ−カーに検出されるが、CA
125.  α−フェトプロティンは継代中に産生され
なくなったという特徴を有する。本細胞lXl0’個を
0.5−のリン酸緩衝液−食塩水(PBS、pH7,2
)に浮遊し、2週間隔で3回B A L 13/cマウ
スの腹腔内に接種した。最終免疫の3日後、免疫マウス
のI!1!臓を採LT’2し、PEG4000を用いて
マウスミエローマ系細胞S P210−Agl 4(S
 P2)Cネイチャー(Nature)、  276.
 269 (1978))と細胞融合を行なった。得ら
れたハイブリドーマの培養上清のHuG−1細胞への反
応性は以下のように行なった。すなわちポリレリジン液
(100μg/g+  PBS)を96ウエルマイクF
プレートの各ウェルに50μQずつ分注し、1時間室温
で処理する。
あらかじめ37°Cに温めておいたPBSで洗浄したH
uG−1細胞をウェル当りlXl0’個入れ、室温で1
5分間放置した後、プレートを1001000rp分遠
心する。次にゲルタールアルデハイドi&を最終濃度が
0.025%になるように入れ、5分間室温に置く。ゲ
ルタールアルデハイド液を除き、PBSで3回洗浄した
後、0.1%タウン清アルブミン(BSA)、0.2%
ゼラチ100mMグリシン、0.05%アジ化ナトリウ
ムを含有するPBSを加え、室温で1〜2時間放置する
以上のように:A%したプレートにハイプリドーマ培養
上清■00μQを加え、24°Cで3時間反応させた。
反応後、0.05%Tween 20.  P BSて
よく洗浄し、ビオチン化したヤギ抗マウスイムノグロブ
リン抗体を各ウェルに100μQ加え、室温で3時間反
応させた。反応後、各ウェルを0.05%Tween 
20.  P B Sでよく洗浄し、ストレプトアビジ
ンHRPを100μa加え、室温で30分反応させた。
反応終了後、蒸留水5−にアミノアンチピリン2 、5
 mg、  フェノール(98%)87.5μQを加え
たものと、0.2MK、HPO4゜0.2KH,PO,
溶液(pH7,0)5v、H!o!3.3μQを合わせ
た酵素基質溶液100μeを各ウェルに加えて、酵素反
応を室温で30分行ない、イム/ IJ−f−N J−
2000(インターメツド社製)を用いて波長490r
vで発色色素量を測定し、抗体の活性を判定した。
その結果256ウエル中75ウエルにHuG −1細胞
に結合性を示す抗体の存在を認め、この中から正常血清
に対して結合性の弱い3ウエルを?U択し、HuG−1
細胞に強い結合性を示すl\イブリドーマを限界希釈法
によりクローニングを行ないハイブリドーマD、(IF
O50191,FERM  BP−2477)を得た。
実施例2(モノクローナル抗体の製造)クローニングに
よって得られたハイブリドーマD6細胞2X10’個を
、あらかじめ0.5−のミネラルオイルを腹腔内に投与
しておいたBALB/Cマウスの腹腔内に接種すること
により腹水化を行なった。ハイブリドーマを腹腔に投与
して10日後、腹水を採取した。得られた腹水5−11
からフィブリン様物質を10000回転15分間遠心操
作により除去した後、0.8μmのメンブランフィルタ
−を通して得られた腹水を50071のセファロースC
L−6Bカラムにかけ、0.5MNaC(5IIIME
DTA  O,02%NaNaを含有するl Qg+M
  Tris−HC(l溶液(pH7,4)で0.5−
7分の流出速度で溶離を行ない精製■gMモノクローナ
ル抗体D6を得た。
このようにして得られたモノクローナル抗体D6は、次
の性状を有する。
(1)ヒト胃腺癌細胞に対して反応性を有する。
(2)ヒト肝癌患者血清に反応性を有する。これらの血
清中にはα−フェトプロティンが検出できな。
いものも存在し、α−フェトプロティンとの相関性は認
められない。
(3)ヒト胃癌、大腸癌患者血清には反応せず、わずか
に肺癌患者血清に反応する。
(4)上記以外では、肝硬変、慢性肝炎患者血清と一部
反応性を示す。
(5)抗体のクラスはrgMである。
実施例3(肝癌の診断) モノクローナル抗体D6の肝癌患者血清に対する反応性
を以下のように行なった。実施例2記載の方法で得たモ
ノクローナル抗体を25μg/saの濃度になるよう5
QmM炭酸緩Ii液pH9,6に浮遊させ、96ウエル
マイクロプレートに100μeずつ分注し、4°Cで一
晩放置した。PBSで洗浄後、1%BSA、O川%アジ
化ナトリウム含有PBSを200μQ加え4°Cで一晩
放置した。
以上のように調製したプレートに種々の癌患者。
肝疾患患者等の血〆nを100μQ加え、37°Cで3
時間反応させた。反応後、各ウェルを0.05%Twe
en 2Q、  P B Sで洗浄し、ビオチン化した
D6抗体100μC加え、37°Cで3時間反応させた
後、PBSで洗浄し、ストレプトアビジンHRPを加え
て室温で30分間反応させた。反応終了後、0.05%
Tween 2Q、  P B Sでよく洗浄し、実施
例1記載と同様の方法で酵素反応を行ない抗体の活性を
判定した。結果を第1図に示す。
第1図に示すように、D、抗体は肝癌患者血清(第1図
の(4)に示す。)57検体中30検体、肝硬変患者血
清(第1図の(5)に示す。)29検体中13検体、慢
性肝炎患者血清(第1図の(6)に示す。)15検体中
6検体、肺癌患者血清(第1図の(3)に示す。)18
検体中2検体等に反応性を示し、胃癌患者血清(第1図
の(1)に示す。)、大腸癌患者血清(第1図の(2)
に示す。)、正常人血清(第1図の(8)に示す。)に
は反応性を示さなかった。なお、第1図の(7)は、癌
患者以外の患者血清の結果を示す。
次にD6抗体がα−フェトプロティン(AFP)と十目
関するかどうかを肝癌患者血清について倹素したが、相
関係数γ=−0,11で両者に相関がないことが判った
(第2図参照)。
以上の結果から、D6抗体を用いることにより、AFP
をマーカーとして検出されない肝癌の診断に極めて有効
に使用することができ、またAFPとの併用により、か
なりの高い確率で肝癌の診断が可能であることが判明し
た。
発明の効果 本発明によって製造されるMoAbは肝癌患者血清と高
率に反応するので、肝癌の診断薬などとして有利に使用
できる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、実施例2で得られた、各種癌患者血清と抗体
との反応性を示す。 第2図は、実施例2で得られた、肝癌患者血清と抗体と
の反応性を示す。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)胃線癌細胞で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と
    リンパ球様細胞株とを融合した、ヒト肝癌患者血清に反
    応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  2. (2)請求項1記載のハイブリドーマが産生するヒト肝
    癌患者血清に反応するモノクローナル抗体。
  3. (3)クローン化された請求項1記載のハイブリドーマ
    を培養し、ヒト肝癌患者血清に反応するモノクローナル
    抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
    する該モノクローナル抗体の製造法。
  4. (4)請求項2記載のモノクローナル抗体を用い、免疫
    化学的に患者由来の試料中に存在する該モノクローナル
    抗体と反応する物質を検出・測定することを特徴とする
    肝癌の診断法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US7883853B2 (en) 2002-05-23 2011-02-08 Sunnybrook Health Sciences Centre Diagnosis of hepatocellular carcinoma
US8579365B2 (en) 2009-06-25 2013-11-12 Toyota Shatai Kabushiki Kaisha Cowl louver support structure for automobile

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US7883853B2 (en) 2002-05-23 2011-02-08 Sunnybrook Health Sciences Centre Diagnosis of hepatocellular carcinoma
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