JPH0343078A - 新規ハイブリドーマ,モノクローナル抗体および用途 - Google Patents
新規ハイブリドーマ,モノクローナル抗体および用途Info
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- JPH0343078A JPH0343078A JP1179494A JP17949489A JPH0343078A JP H0343078 A JPH0343078 A JP H0343078A JP 1179494 A JP1179494 A JP 1179494A JP 17949489 A JP17949489 A JP 17949489A JP H0343078 A JPH0343078 A JP H0343078A
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
よび該ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗
体の製造法、並びに該モノクローナル抗体を用いる肝癌
の診断法に関する。
なってきたハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体
(以下MoAbと略称することがある)の製造法は、各
々の抗原決定基に対し、単一特異性を示す抗体が得られ
ることや、必要に応じて自由に多量にしかも常に均質な
標品を再現性よく得られることなど多くの利点がある。
b取得の方法は多方面にわたってその有効性が高く評
価されている。またその利用法として単に抗原の検出だ
けてなく微量成分の精製や診断等への応用が展開されて
おり、さらに予防薬、治療薬への応用も考えられている
。
亡原因を占める悪性腫瘍である。今日、肝癌の治療は切
除術が大半を占めており、そのため肝癌と高い反応性を
示すMoAbの取得は肝癌の早期診断を可能にす−るば
かりか、予防、治療上においても極めて有効なものにな
ると考えられる。
ナショナル ジャーナル オブ キャンサ−(Int、
J、 Cancer)±1.309 (198g)
;キャンサー イムノロジー イムノテラビイ−(Ca
ncerIsaunol、 Lamunother、
) 21. 26 (198g) :プロシーディング
ス オブ ザ ナショナル アカデミイ オブ サイエ
ンセス(Proc、 Natl、 Acad。
とする癌組織または目的とする癌の培養株化細胞、ある
いはまたは癌胎児性抗原等で動物を免疫し、目的とする
抗体産生細胞を細胞融合法で株化する方法がとられてい
る。肝癌に対するMoAbの場合にも、これまでこのよ
うな方法でMoAbが取得されている。癌の抗原性は多
様性に富むといわれ、このようにして得た抗体は、−船
釣に目的の癌、例えば肝癌抗体の場合、すべての肝癌と
反応する訳ではない。得られた抗体を診断あるいは治療
の目的に使用するためには、特にこの陽性率ができるだ
け高いか、これまでり抗体では検出できない癌組織と反
応する抗体であることが望ましい。そのためには、例え
ば膵癌、胆道系癌を認識するといわれるCA19−9
(ツマティク セルジェネティクス(Soaat ic
Cel l Genet、 ) 5 +957(
1979))、CA30 (インターナショナルアチー
ブス オブ アレルギー アンド アプライド イムノ
ロジー(Int、 Arch、^llergyApp1
. Immunol、)71 、 l 78 (19
83)E等の抗体は大腸癌細胞を、NCC−3T−43
9抗体〔ガン(Gann)75. 540 (1984
)]は、胃低分化型腺癌をマウスに免疫するというよう
に、他種の癌細胞を免疫原として目的とする抗体を取得
されてきた。
限定され、また正常細胞あるいは他種の癌細胞と反応す
る場合も多く、肝癌の診断薬等として用いるのに充分と
はいえない。例えば、α−フェトプロティンは原発性肝
癌の有力な腫瘍マーカーであるが、肝癌の約50%を捕
捉するに過ぎず、また癌が相当進行してから陽性となる
場合が多い。
れている。
なり、胃線癌細胞HuG−1を免疫原として動物を免疫
した後、細胞融合法により得たマウスMoAbがヒト肝
癌に反応するが、α−フェトプロティンとの相関がない
ことを認め、診断薬としての重要性が高いことを見出し
た。そこでさらに鋭意研究し、本発明を完成した。
動物の抗体産生細胞とリンパ球様細胞株とを融合した、
ヒト肝癌患者血清に反応するモノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマ。
癌患者血清に反応するモノクローナル抗体。
を培養し、ヒト肝癌患者血清に反応するモノクローナル
抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する該モノクローナル抗体の製造法、および(4)請求
項2記載のモノクローナル抗体を用い、免疫化学的に患
者由来の試料中に存在する該モノクローナル抗体と反応
する物質を検出・測定することを特徴とする肝癌の診断
法である。
またはリンパ節に転移したものでもよく、またこれらの
組織からとり出され株化された細胞でもよい。
−1〔日本消化器病学会雑誌第85巻成時増刊号第12
8頁(1988年))、MKN−7,NKN−28,M
KN二45〔新潟医学全雑誌 第91巻第737頁(1
977年))、MKN−75[Motoyama池
アクタ・メゾイカ・エト・バイオロジカ 第27巻 4
9頁(1979年)〕等が挙げられる。
スターなど実験動物が有利に使用でき、とりわけマウス
が好ましい。抗体産生細胞は免疫した動物の牌細胞が有
利に使用される。株化されたヒト牌細胞株でもよい。
様細胞株として各種の組合わせが可能であるが、細胞融
合実験で最も実績があり、細胞融合効率その他において
条件のよいマウス細胞間の融合、すなわち抗原で過免疫
したマウスの抗体産生細胞と細胞融合効率、増殖性等の
すぐれたマウスミエローマ細胞とくにヒポキサンチン、
グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株(H
GPRT−株)やチミジンキナーゼ欠損(T K −)
のようなマーカーをもった適切な同種または異種(好ま
しくは同種)のミエローマ〔例、P3−X63Ag・8
U I(市森 他 ジャーナル・オブ・イムノロジカル
・メンノド 80 55 (1985))。
、 M他ネイチャー 第276巻 269頁(197g
))。
2) (Nature、 276.269 (197
g)) )などが挙げられる。
トからとり出され株化されたものが有利に用いられる。
生細胞、細胞膜画分、細胞のホモジネートなどで免疫す
ることが可能であるが、例えば生細胞を生理食塩水等に
遊離させ接種する方法は、簡便で効率よい方法として好
都合に用いられる。
く、種々の方法が可能であるが、−例として107個の
生細胞をマウス腹腔内に数ケ月内に複数回、好ましくは
2週間隔で3回以上の投与を行う方法が挙げられるが、
種々の変法が可能でありこの方法に限定されるものでは
ない。
ンパ球、好ましくは肺臓リンパ球を採取し、リンパ球様
細胞株、好ましくはミエローマ細胞と細胞融合を行い、
例えばヒボキサンチン、アミ/プテリン、チミジンを含
む選択培地(HAT培地)を用いて融合細胞のみを選択
的に増殖させることができる。
エチレングリコール(pEc)(il[の例二1000
.4000.6000)等の融合剤を用いたり、電気刺
激等の方性で融合させることができるが、PEGを用い
る方法は最も操作が簡単で効率も高いので有利に用いら
れる。
ーマの上清について、まず免疫源として用いた胃線癌細
胞に対する反応性が陽性で正常組織に対する反応性が微
弱ないし陰性の細胞を選ぶ。
EIA)など各種の方法が可能であるが、細胞を用いた
EIISA法[cell 5urface E L
ISA、 ジャーナル オブ イムノロジカル メ
ソッド(J、 lsmunol、 Methods
)ヱ6 、 63 (1985)) は、細胞表面抗
原を認識する抗体の簡便で、感度のよい分法として有利
に用いられる。
示すM o A b産生ハイブリドーマは、例えば限界
希釈法などによってクローン化することができる。クロ
ーン化された各細胞の産生ずる抗体の胃線癌細胞に対す
る反応性は上述したと同様に調へることができ、このよ
うにして胃線癌細胞反応性の代表的なりローンを得るこ
とができる。
常人血清に対する反応性は、サンドインチE I Aで
非常に感度よく調べることができる。
、例えば上記した本発明のハイブリドーマを用いて該M
oAbを生成、蓄積せしめ、これを採取することにより
製造することができる。
インキュベートすることにより行われる。
(通常マウスの腹腔内)で行う。
RPMI−1640培地などに牛胎児血清を例えば約0
.1〜40%加えたものなどが使用できる。培養は通常
約5〜IO日間、約25℃〜45℃好ましくは37℃前
後で行うことにより、培養液から該MoAbを得ること
ができるが、この他にマウス等の適切な哺乳動物の腹腔
内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取することによ
り、細胞培養上清よりも遥かに高力価の抗体を、多量に
効率よく取得することができる。このためには、例えば
マウスの場合、ミネラルオイル等を前もって接種したB
A L B/C等のマウスに約1×10’〜I X
10’個、好ましくは約5X10’〜2X10@個のハ
イブリドーマを腹腔内等に接種し、約7〜20日後、好
ましくは約10−14日後に腹水液等を採取する。腹水
に生成蓄積した抗体は、例えばセファロースCL−6B
カラムクロマト(ファルマシア社製)等により、容易に
モノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離
することができる。
下記の性状を有する。
いものも存在し、α−フェトプロティンとの相関性は認
められない。
に肺癌患者血清に反応する。
反応性を示す。
、フラクションでもよく、該フラクションとしてはたと
えば、F ab、 F ab’、 F (ab’)
。
HuG−1を用いることにより、意外にも結果的に肝癌
に対して従来の抗体とは反応性の異なるMoAbが得ら
れるとともに本抗体が有力な肝癌の診断薬になるという
新しい方広論を提供するものである。
性を示すMoAbは、EIA法、EL、ISA法、RI
A法などを用いた系での肝癌の早期診断に大変有利であ
る。
、たとえば血清、尿、脳をft1lIilI等の体液や
時には組織およびその抽出物などが挙げられる。
キシダーゼの場合について以下に具体的に説明するが、
ペルオキシダーゼに限定されるものではない。
合反応を起こさせ、これに、ペルオキシダーゼを結合し
た抗体を加え反応させる。
質を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定
することにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。
準溶液に対してあらかじめ行い、反応物質と吸光度もし
くは蛍光強度との関係を標準曲線として作成しておく。
た吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析
対象物中の当該モノクローナル抗体と反応する物質の量
を測定する。
1の場合について以下に具体的に説明するが、+157
に限定されるものではない。
えて結合反応を起こさせ、これに+251は識抗体を加
え反応させる。
。
液に対してあらかじめ行い反応物質とγ放射活性の関係
をfi1曲線として作成しておく。
たγ−放射活性を標準曲線にあてはめ分析対象物中の該
抗体反応物質の量を測定する。
られた値の平均値+23D以上の値を示すものを陽性と
して判断することが可能である。
酵研究所(I FO)に寄託され、また、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所(FRI)にブダペスト
条約に基づく寄託として寄託されている。受託臼および
受託番号を第1表に示す。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
本消化器病学会惟誌第85巻成時増刊号第128頁(1
988年)〕は、浮遊性増殖を示し、倍加時間は38時
間、平均染色体は60本、抗CEA、CA19−9.T
PA抗体により陽性に染色され、また培養上清中に、こ
れらのil!!瘍マーカマ−カーに検出されるが、CA
125. α−フェトプロティンは継代中に産生され
なくなったという特徴を有する。本細胞lXl0’個を
0.5−のリン酸緩衝液−食塩水(PBS、pH7,2
)に浮遊し、2週間隔で3回B A L 13/cマウ
スの腹腔内に接種した。最終免疫の3日後、免疫マウス
のI!1!臓を採LT’2し、PEG4000を用いて
マウスミエローマ系細胞S P210−Agl 4(S
P2)Cネイチャー(Nature)、 276.
269 (1978))と細胞融合を行なった。得ら
れたハイブリドーマの培養上清のHuG−1細胞への反
応性は以下のように行なった。すなわちポリレリジン液
(100μg/g+ PBS)を96ウエルマイクF
プレートの各ウェルに50μQずつ分注し、1時間室温
で処理する。
uG−1細胞をウェル当りlXl0’個入れ、室温で1
5分間放置した後、プレートを1001000rp分遠
心する。次にゲルタールアルデハイドi&を最終濃度が
0.025%になるように入れ、5分間室温に置く。ゲ
ルタールアルデハイド液を除き、PBSで3回洗浄した
後、0.1%タウン清アルブミン(BSA)、0.2%
ゼラチ100mMグリシン、0.05%アジ化ナトリウ
ムを含有するPBSを加え、室温で1〜2時間放置する
。
上清■00μQを加え、24°Cで3時間反応させた。
よく洗浄し、ビオチン化したヤギ抗マウスイムノグロブ
リン抗体を各ウェルに100μQ加え、室温で3時間反
応させた。反応後、各ウェルを0.05%Tween
20. P B Sでよく洗浄し、ストレプトアビジ
ンHRPを100μa加え、室温で30分反応させた。
mg、 フェノール(98%)87.5μQを加え
たものと、0.2MK、HPO4゜0.2KH,PO,
溶液(pH7,0)5v、H!o!3.3μQを合わせ
た酵素基質溶液100μeを各ウェルに加えて、酵素反
応を室温で30分行ない、イム/ IJ−f−N J−
2000(インターメツド社製)を用いて波長490r
vで発色色素量を測定し、抗体の活性を判定した。
に結合性を示す抗体の存在を認め、この中から正常血清
に対して結合性の弱い3ウエルを?U択し、HuG−1
細胞に強い結合性を示すl\イブリドーマを限界希釈法
によりクローニングを行ないハイブリドーマD、(IF
O50191,FERM BP−2477)を得た。
よって得られたハイブリドーマD6細胞2X10’個を
、あらかじめ0.5−のミネラルオイルを腹腔内に投与
しておいたBALB/Cマウスの腹腔内に接種すること
により腹水化を行なった。ハイブリドーマを腹腔に投与
して10日後、腹水を採取した。得られた腹水5−11
からフィブリン様物質を10000回転15分間遠心操
作により除去した後、0.8μmのメンブランフィルタ
−を通して得られた腹水を50071のセファロースC
L−6Bカラムにかけ、0.5MNaC(5IIIME
DTA O,02%NaNaを含有するl Qg+M
Tris−HC(l溶液(pH7,4)で0.5−
7分の流出速度で溶離を行ない精製■gMモノクローナ
ル抗体D6を得た。
の性状を有する。
清中にはα−フェトプロティンが検出できな。
められない。
に肺癌患者血清に反応する。
反応性を示す。
を以下のように行なった。実施例2記載の方法で得たモ
ノクローナル抗体を25μg/saの濃度になるよう5
QmM炭酸緩Ii液pH9,6に浮遊させ、96ウエル
マイクロプレートに100μeずつ分注し、4°Cで一
晩放置した。PBSで洗浄後、1%BSA、O川%アジ
化ナトリウム含有PBSを200μQ加え4°Cで一晩
放置した。
時間反応させた。反応後、各ウェルを0.05%Twe
en 2Q、 P B Sで洗浄し、ビオチン化した
D6抗体100μC加え、37°Cで3時間反応させた
後、PBSで洗浄し、ストレプトアビジンHRPを加え
て室温で30分間反応させた。反応終了後、0.05%
Tween 2Q、 P B Sでよく洗浄し、実施
例1記載と同様の方法で酵素反応を行ない抗体の活性を
判定した。結果を第1図に示す。
の(4)に示す。)57検体中30検体、肝硬変患者血
清(第1図の(5)に示す。)29検体中13検体、慢
性肝炎患者血清(第1図の(6)に示す。)15検体中
6検体、肺癌患者血清(第1図の(3)に示す。)18
検体中2検体等に反応性を示し、胃癌患者血清(第1図
の(1)に示す。)、大腸癌患者血清(第1図の(2)
に示す。)、正常人血清(第1図の(8)に示す。)に
は反応性を示さなかった。なお、第1図の(7)は、癌
患者以外の患者血清の結果を示す。
関するかどうかを肝癌患者血清について倹素したが、相
関係数γ=−0,11で両者に相関がないことが判った
(第2図参照)。
をマーカーとして検出されない肝癌の診断に極めて有効
に使用することができ、またAFPとの併用により、か
なりの高い確率で肝癌の診断が可能であることが判明し
た。
率に反応するので、肝癌の診断薬などとして有利に使用
できる。
との反応性を示す。 第2図は、実施例2で得られた、肝癌患者血清と抗体と
の反応性を示す。
Claims (4)
- (1)胃線癌細胞で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と
リンパ球様細胞株とを融合した、ヒト肝癌患者血清に反
応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 - (2)請求項1記載のハイブリドーマが産生するヒト肝
癌患者血清に反応するモノクローナル抗体。 - (3)クローン化された請求項1記載のハイブリドーマ
を培養し、ヒト肝癌患者血清に反応するモノクローナル
抗体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する該モノクローナル抗体の製造法。 - (4)請求項2記載のモノクローナル抗体を用い、免疫
化学的に患者由来の試料中に存在する該モノクローナル
抗体と反応する物質を検出・測定することを特徴とする
肝癌の診断法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1179494A JP2946216B2 (ja) | 1989-07-12 | 1989-07-12 | 新規ハイブリドーマ,モノクローナル抗体および用途 |
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---|---|---|---|
JP1179494A JP2946216B2 (ja) | 1989-07-12 | 1989-07-12 | 新規ハイブリドーマ,モノクローナル抗体および用途 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0343078A true JPH0343078A (ja) | 1991-02-25 |
JP2946216B2 JP2946216B2 (ja) | 1999-09-06 |
Family
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---|---|
JP (1) | JP2946216B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7883853B2 (en) | 2002-05-23 | 2011-02-08 | Sunnybrook Health Sciences Centre | Diagnosis of hepatocellular carcinoma |
US8579365B2 (en) | 2009-06-25 | 2013-11-12 | Toyota Shatai Kabushiki Kaisha | Cowl louver support structure for automobile |
-
1989
- 1989-07-12 JP JP1179494A patent/JP2946216B2/ja not_active Expired - Lifetime
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US7883853B2 (en) | 2002-05-23 | 2011-02-08 | Sunnybrook Health Sciences Centre | Diagnosis of hepatocellular carcinoma |
US8579365B2 (en) | 2009-06-25 | 2013-11-12 | Toyota Shatai Kabushiki Kaisha | Cowl louver support structure for automobile |
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