JPH0568584A - モノクローナル抗体、これを用いた測定法、試薬キツト及び検索法 - Google Patents
モノクローナル抗体、これを用いた測定法、試薬キツト及び検索法Info
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- JPH0568584A JPH0568584A JP3180334A JP18033491A JPH0568584A JP H0568584 A JPH0568584 A JP H0568584A JP 3180334 A JP3180334 A JP 3180334A JP 18033491 A JP18033491 A JP 18033491A JP H0568584 A JPH0568584 A JP H0568584A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 オレアナン型５環性トリテルペンを認識し得
るモノクローナル抗体、及びこれを用いた測定法、試薬
キット及び検索法を提供する。 【構成】 オレアナン型５環性トリテルペンとキャリア
タンパク質との結合物を免疫原として用い、得られた脾
細胞とミエローマ細胞とを融合して作製されるハイブリ
ドーマにより、オレアナン型５環性トリテルペンを認識
し得るモノクローナル抗体を産生させ、これを免疫学的
方法による被検体中のオレアナン型５環性トリテルペン
を測定する方法において使用する。
るモノクローナル抗体、及びこれを用いた測定法、試薬
キット及び検索法を提供する。 【構成】 オレアナン型５環性トリテルペンとキャリア
タンパク質との結合物を免疫原として用い、得られた脾
細胞とミエローマ細胞とを融合して作製されるハイブリ
ドーマにより、オレアナン型５環性トリテルペンを認識
し得るモノクローナル抗体を産生させ、これを免疫学的
方法による被検体中のオレアナン型５環性トリテルペン
を測定する方法において使用する。
Description
【産業上の利用分野】本発明は、オレアナン型５環性ト
リテルペンを認識し得るモノクローナル抗体と、このモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
リテルペンを認識し得るモノクローナル抗体と、このモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【従来の技術】グリチルレチン酸(glycyrrhetic acid)
は、甘草の有効成分であるグリチルリチン(glycyrrhizi
n)を構成するオレアナン型５環性トリテルペンであり、
生体内ではグリチルリチンはグリチルレチン酸に代謝さ
れることが知られている。グリチルリチンは肝疾患患者
の治療に広く用いられている薬物であるが、大量、継続
的にこれを投与した場合、副作用として偽アルドステロ
ン症、低カリウム血症の発現の恐れがあるため、血液中
のグリチルレチン酸の濃度の正確かつ感度のよい定量が
望まれている。ところで、微量成分の定量には、高速液
体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等が用
いられているが、これらの方法により測定するには複雑
な前処理が必要であり、さらに正確なリテンションタイ
ム等定性的な知見が必要である。一方、抗体を使用する
免疫測定法が開発され、微量成分の定量に応用されるよ
うになり、更に抗原に結合した抗体量の測定に放射性物
質を使用しない酵素免疫測定法が開発され、特殊な施設
を使用しなくても、極めて正確かつ高感度の定量ができ
るようになった。免疫測定法を行うには、測定の対象物
に対する抗体が必要であるが、グリチルレチン酸のよう
な低分子のハプテンはそれ自体では抗原性をもたないた
めに、キャリアタンパク質を結合させたものを動物に免
疫することによって抗体を取得することが行われてい
る。グリチルレチン酸については、グリチルレチン酸に
キャリアタンパク質を結合したものをウサギに免疫して
抗血清を得、精製することによりグリチルレチン酸に対
する抗体を製造する方法が、金岡らによって報告されて
いる（ファームテックジャパン PHARM TECH JAPAN ４巻
913-920 1988）。
は、甘草の有効成分であるグリチルリチン(glycyrrhizi
n)を構成するオレアナン型５環性トリテルペンであり、
生体内ではグリチルリチンはグリチルレチン酸に代謝さ
れることが知られている。グリチルリチンは肝疾患患者
の治療に広く用いられている薬物であるが、大量、継続
的にこれを投与した場合、副作用として偽アルドステロ
ン症、低カリウム血症の発現の恐れがあるため、血液中
のグリチルレチン酸の濃度の正確かつ感度のよい定量が
望まれている。ところで、微量成分の定量には、高速液
体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等が用
いられているが、これらの方法により測定するには複雑
な前処理が必要であり、さらに正確なリテンションタイ
ム等定性的な知見が必要である。一方、抗体を使用する
免疫測定法が開発され、微量成分の定量に応用されるよ
うになり、更に抗原に結合した抗体量の測定に放射性物
質を使用しない酵素免疫測定法が開発され、特殊な施設
を使用しなくても、極めて正確かつ高感度の定量ができ
るようになった。免疫測定法を行うには、測定の対象物
に対する抗体が必要であるが、グリチルレチン酸のよう
な低分子のハプテンはそれ自体では抗原性をもたないた
めに、キャリアタンパク質を結合させたものを動物に免
疫することによって抗体を取得することが行われてい
る。グリチルレチン酸については、グリチルレチン酸に
キャリアタンパク質を結合したものをウサギに免疫して
抗血清を得、精製することによりグリチルレチン酸に対
する抗体を製造する方法が、金岡らによって報告されて
いる（ファームテックジャパン PHARM TECH JAPAN ４巻
913-920 1988）。
【発明が解決しようとする課題】しかし、ポリクローナ
ル抗体では、他の生体成分との交差反応性が少なからず
認められ、また得られる抗体の量に限りがある等の欠点
があり、モノクローナル抗体の供給が望まれている。本
発明は上記要望に答えるために、オレアナン型５環性ト
リテルペンを認識し得るモノクローナル抗体、及びこれ
を用いた測定法、試薬キット及び検索法を提供するもの
である。
ル抗体では、他の生体成分との交差反応性が少なからず
認められ、また得られる抗体の量に限りがある等の欠点
があり、モノクローナル抗体の供給が望まれている。本
発明は上記要望に答えるために、オレアナン型５環性ト
リテルペンを認識し得るモノクローナル抗体、及びこれ
を用いた測定法、試薬キット及び検索法を提供するもの
である。
【課題を解決するための手段】本発明は、オレアナン型
５環性トリテルペンを認識し得るモノクローナル抗体
を、オレアナン型５環性トリテルペンとキャリアタンパ
ク質との結合物を免疫原として用いて得られた脾細胞
と、ミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリドー
マにより産生させ、このモノクローナル抗体を免疫学的
方法による被検体中のオレアナン型５環性トリテルペン
を測定する方法において使用し、上記課題を解決しよう
とするものである。以下、本発明を詳細に説明する。 １．オレアナン型５環性トリテルペンとキャリアタンパ
ク質との結合 オレアナン型５環性トリテルペンのような低分子のハプ
テンはそれ自身では抗原性をもたず、キャリアタンパク
質を結合させたものを免疫原として使用することによ
り、オレアナン型５環性トリテルペンに対する抗体、す
なわちオレアナン型５環性トリテルペンを認識し結合す
る抗体を作製することができる。オレアナン型５環性ト
リテルペンとしてグリチルレチン酸を例として説明す
る。グリチルレチン酸とキャリアタンパク質を結合させ
るには架橋部の構築が必要であり、架橋部としてはグリ
シン、γ−アミノブチル酸、ε−アミノヘキサン酸など
を使用することができ、特にグリシンが好ましい。グリ
チルレチン酸にグリシンを結合させるには、以下のよう
に行う。グリシンのメチルエステルを有機溶媒中ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジフェニルホス
ホニルアジド（ＤＰＰＡ）またはジエチルホスホリルシ
アニド（ＤＥＰＣ）などの縮合剤を用い、グリチルレチ
ン酸とカップリングし、グリチルレチニルグリシンメチ
ルエステルを得る。次にこれを加水分解し、グリチルレ
チニルグリシンとする。グリチルレチン酸とグリシンが
結合したもの（以下、ＧＡ−Ｇｌｙと記す。）とキャリ
アとの結合は、縮合剤によりＧＡ−Ｇｌｙに活性基を導
入しＧＡ−Ｇｌｙを活性化したものとキャリアタンパク
質を反応させることにより行うことができる。縮合剤に
はカルボジイミド構造を有する化合物がよく、特に水溶
性カルボジイミド［１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド］が好ましい。活性基
はアミドエステルが好ましく、特にスクシンイミド基が
好適である。キャリアタンパク質には免疫原性の高いタ
ンパク質を用いることができ、キーホールリンペットヘ
モシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、あるいは卵白アルブミン（ＯＶＡ）が好ましい。
以下、グリチルレチン酸とキャリアタンパク質の結合方
法を具体的に説明する。ＧＡ−Ｇｌｙとキャリアタンパ
ク質（ＫＬＨまたはＢＳＡ）との結合は、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド法により行なう。すなわち、ＧＡ−Ｇ
ｌｙのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド［１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミド］で活性化し、ＧＡーＧｌｙのＮ−ヒドロキシス
クシンイミド活性エステル（ＧＡ−Ｇｌｙ−ＮＨＳと記
す）に誘導する。これに、ＫＬＨ又はＢＳＡ溶液を反応
させることによりＧＡ−ＧｌｙのＫＬＨまたはＢＳＡコ
ンジュゲートを得る。更に詳しくは、ＧＡ−Ｇｌｙを８
０％ジオキサンに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドおよび水溶性カルボジイミドを加え室温で２時間反応
させた後、酢酸エチルを用いた抽出により、ＧＡ−Ｇｌ
ｙのスクシンイミド活性エステル（ＧＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ
Ｓ）を得る。次にＧＡ−Ｇｌｙ−ＮＨＳを少量のジメチ
ルスルフォキシドに溶解した後、ＫＬＨ溶液あるいはＢ
ＳＡ溶液に添加し、４℃で２４時間反応させる。さらに
反応溶液を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
４、以下、ＰＢＳと記す）に対して透析した後に凍結乾
燥することにより、ＧＡ−ＧｌｙとＫＬＨの結合体（以
下、ＧＡ−ＫＬＨコンジュゲートと記す）、あるいはＧ
Ａ−Ｇｌｙとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の結合体
（以下、ＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートと記す）を得るこ
とができる。スクシンイミド活性エステルの生成は薄層
クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと記す。）により確
認することができる。また、コンジュゲートの生成は、
キャリアタンパク質の２８０ｎｍにおける紫外吸収スペ
クトルの極大が、グリチルレチン酸由来の２５２ｎｍに
シフトすることにより確認することができる。 ２．ＧＡ−キャリアタンパク質コンジュゲートによるマ
ウスの免疫 ＧＡ−キャリアタンパク質コンジュゲート溶液を等量の
フロイント完全アジュバントと混合する。次に完全に乳
化させたものをＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下及び腹腔内に
投与する。その後ＧＡ−キャリアタンパク質コンジュゲ
ート溶液と等量のフロイント不完全アジュバントとの混
合エマルジョンを腹腔内に２回投与し、追加免疫を行
う。通常、追加免疫は２週間間隔で行なえばよい。２回
目の追加免疫をしてから１０日後、ＧＡ−キャリアタン
パク質コンジュゲート溶液を静脈内投与する。ＧＡ−キ
ャリアタンパク質コンジュゲートは２００〜４００μｇ
／ｍｌ程度の濃度のものを使用し、皮下あるいは腹腔内
投与量は０．５ｍｌ、静脈内投与量は０．２ｍｌ程度で
よい。最終免疫の前に、酵素免疫測定法により血中抗体
価の上昇を確認するのが望ましい。 ３．ハイブリドーマの作製 最終免疫の３日後、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、
同系マウス由来のミエローマ細胞との細胞融合に用い
る。細胞融合は具体的には以下のように行う。凍結保存
されている骨髄腫細胞を洗浄後、培地に懸濁し、培養用
フラスコを用いて培養し、対数増殖期にある細胞を得
る。培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地に牛胎児血清を１
０％の割合で加えたもの（以下、ＦＣＳ−ＲＰＭＩと記
す。）等が使用できる。ＲＰＭＩ１６４０培地について
は、Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａ．Ｍ．
Ａ．，１９９；５１９（１９６７）等、参照。脾細胞と
骨髄腫細胞を遠心分離して集め、培地で数回洗浄し、脾
細胞と骨髄腫細胞をよく混合し、５０％ポリエチレング
リコール４０００を０．５ｍｌ添加し、細胞融合を行
う。融合細胞は培地で洗浄した後に、再度ＦＣＳ−ＲＰ
ＭＩ培地に懸濁し、９６穴マイクロタイタープレートに
分注し、炭酸ガスインキュベーター中で培養する。融合
細胞の選択はＨＡＴ選択により行った。ＨＡＴ選択の方
法は、サイエンス１４５巻７０９頁、１９６４年に記載
されているが、その選択の原理は以下の通りである。細
胞融合に用いるミエローマは、ヒポキサンチン−グアニ
ン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）
を欠損しており、核酸合成はｄｅ ｎｏｖｏ合成経路に
依存している。このようなミエローマ細胞と、正常リン
パ球の融合細胞では、ＨＡＴ培地中で、アミノプテリン
によりｄｅ ｎｏｖｏの合成経路が阻害されても、チミ
ジン、ヒポキサンチンが存在しているので、リンパ球由
来のサルベージ回路により核酸合成でき、ＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培
地）中でも増殖が可能である。この時、ミエローマ細胞
は、アミノプテリンによりｄｅ ｎｏｖｏ合成経路も阻
害されるため、核酸合成できずに死滅する。また、リン
パ球は、正常細胞であるので、長期培養は不可能であ
り、結果的に、ＨＡＴ培地中で増殖できるのは、ミエロ
ーマ細胞とリンパ球の融合により生成したハイブリドー
マのみであるので、非融合細胞から融合細胞を選択する
ことができる。得られたハイブリドーマの抗体産生能
は、以下に示す酵素免疫測定法により調べることができ
る。 ４．免疫測定法（直接ＥＬＩＳＡ、阻害ＥＬＩＳＡ） ハイブリドーマの抗体産生能および抗体の力価の検定
は、ＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートを抗原とした直接ＥＬ
ＩＳＡ法により行ない、抗体の交差反応性および各種試
料中の抗原量の測定は、グリチルレチン酸を標準物質と
した阻害ＥＬＩＳＡ法によりな行う。直接ＥＬＩＳＡ法
は、抗原すなわちＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートを固相化
したものを、抗体溶液、マウス以外の動物で作製した抗
マウスイムノグロブリンＧ（抗ＩｇＧ）を酵素標識した
ものの溶液と順次インキュベートし、抗原に抗体を介し
て結合した酵素活性を測定することにより、抗体を定量
する。阻害ＥＬＩＳＡ法は、ＧＡ−ＢＳＡコンジュゲー
トを固相化したものと、グリチルレチン酸またはサンプ
ルを抗体とともにインキュベートし、次に酵素標識した
抗マウスＩｇＧを結合させ、酵素活性を測定する。抗体
がサンプルに含まれる抗原に結合すると、固相化した抗
原に結合できないために結合する酵素量が減少するの
で、酵素活性を測定することにより、サンプルに含まれ
ているグリチルレチン酸を定量することができる。ま
た、グリチルリチンを酸加水分解し、生成するグリチル
レチン酸を定量することによりグリチルリチンの量を測
定することができる。抗原の固相化には、アガロース、
ラテックス粒子、マイクロタイタープレートのウェル等
が使用できるが、マイクロタイタープレートのウェルが
好ましい。ＥＬＩＳＡ法一例を示す。抗原溶液（例えば
ＧＡ−ＢＳＡ）を９６穴マイクロタイタープレートのウ
ェルに分注し４℃で一夜静置する。抗原液を除いた後
に、ブロッキング溶液、例えば１％ＢＳＡを含むＰＢＳ
を分注し、３７℃で静置することによりブロッキングを
行う。次に直接ＥＬＩＳＡ法では抗体溶液を、阻害ＥＬ
ＩＳＡ法ではグリチルレチン酸またはサンプル溶液を抗
体溶液とともに各ウェルに分注する。室温で静置した
後、洗浄し、酵素で標識した抗マウスＩｇＧ溶液を分注
し、室温で静置する。標識酵素はアルカリフォスファタ
ーゼが好適であり、アルカリフォスファターゼ標識した
ヤギ抗マウスＩｇＧは、タゴ社から購入することができ
る。各ウェルを再び洗浄した後、酵素反応により発色す
る色素の溶液を分注し、反応させる。反応終了後、各ウ
ェルの４０５ｎｍにおける吸光度をイムノリーダーによ
り測定する。結果を既知の抗原量で得られる値と比較す
ることにより、グリチルレチン酸の定量が可能となる。
色素は、アルカリフォスファターゼ標識した抗マウスＩ
ｇＧを使用した場合にはｐ−ニトロフェニルフォスフェ
ートを使用する。抗マウスＩｇＧを標識する酵素は、ホ
ースラディッシュパーオキシダーゼでもよく、その場合
には基質はｐ−ニトロフェニルフォスフェートのかわり
にＡＢＴＳ［2-2'-adino-di-(3-ethylbenzothyazolin-s
ulfonate)］，ＴＭＢＺ（tetra-methyl benzidine），
ＯＰＤ（O-phenylene diamine）などが使用できる。上
述した方法で、グリチルレチン酸あるいはグリチルリチ
ンを定量することができるが、モノクローナル抗体、酵
素標識した二次抗体等の定量に必要な試薬をキットにす
ることにより、簡便かつ迅速な検査が可能となる。キッ
トの一例として、マイクロタイタープレート、ＢＳＡ、
ＧＡ−ＢＳＡ、モノクローナル抗体、洗浄用緩衝液、ア
ルカリフォスファターゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ、
ｐ−ニトロフェニルフォスフェート、定量の対照に用い
る既知量のグリチルリチン酸からなるキットを挙げるこ
とができる。マイクロタイタープレートは予めＧＡ−Ｂ
ＳＡを固定化し、ＢＳＡでブロッキングしたものが好ま
しい。 抗体類、ＢＳＡ、ＧＡ−ＢＳＡあるいは色素は
凍結乾燥品として、またはこれらを安定して保存できる
溶媒に溶解してキットを出荷することが望ましい。溶液
として出荷する場合は静菌剤等を添加しておくことも可
能であるが、酵素反応を阻害しないものであることが好
ましい。 ５．本発明によるモノクローナル抗体のイメージング診
断への応用 本発明によるオレアナン型５環性トリテルペンを認識す
るモノクローナル抗体を、放射性物質、常磁性物質ある
いは蛍光物質等により標識し、イメージング診断に使用
することができる。モノクローナル抗体の標識は、例え
ば、放射性物質においては、125Ｉなどの場合はクロラ
ミンＴ法により行うことができる。常磁性物質、蛍光物
質等は、ＳＰＤＰ、ＧＭＢＳなどのヘテロバイファンク
ショナルな架橋剤を用いてモノクローナル抗体分子に結
合させる方法を挙げることができる。
５環性トリテルペンを認識し得るモノクローナル抗体
を、オレアナン型５環性トリテルペンとキャリアタンパ
ク質との結合物を免疫原として用いて得られた脾細胞
と、ミエローマ細胞とを融合して得られるハイブリドー
マにより産生させ、このモノクローナル抗体を免疫学的
方法による被検体中のオレアナン型５環性トリテルペン
を測定する方法において使用し、上記課題を解決しよう
とするものである。以下、本発明を詳細に説明する。 １．オレアナン型５環性トリテルペンとキャリアタンパ
ク質との結合 オレアナン型５環性トリテルペンのような低分子のハプ
テンはそれ自身では抗原性をもたず、キャリアタンパク
質を結合させたものを免疫原として使用することによ
り、オレアナン型５環性トリテルペンに対する抗体、す
なわちオレアナン型５環性トリテルペンを認識し結合す
る抗体を作製することができる。オレアナン型５環性ト
リテルペンとしてグリチルレチン酸を例として説明す
る。グリチルレチン酸とキャリアタンパク質を結合させ
るには架橋部の構築が必要であり、架橋部としてはグリ
シン、γ−アミノブチル酸、ε−アミノヘキサン酸など
を使用することができ、特にグリシンが好ましい。グリ
チルレチン酸にグリシンを結合させるには、以下のよう
に行う。グリシンのメチルエステルを有機溶媒中ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジフェニルホス
ホニルアジド（ＤＰＰＡ）またはジエチルホスホリルシ
アニド（ＤＥＰＣ）などの縮合剤を用い、グリチルレチ
ン酸とカップリングし、グリチルレチニルグリシンメチ
ルエステルを得る。次にこれを加水分解し、グリチルレ
チニルグリシンとする。グリチルレチン酸とグリシンが
結合したもの（以下、ＧＡ−Ｇｌｙと記す。）とキャリ
アとの結合は、縮合剤によりＧＡ−Ｇｌｙに活性基を導
入しＧＡ−Ｇｌｙを活性化したものとキャリアタンパク
質を反応させることにより行うことができる。縮合剤に
はカルボジイミド構造を有する化合物がよく、特に水溶
性カルボジイミド［１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド］が好ましい。活性基
はアミドエステルが好ましく、特にスクシンイミド基が
好適である。キャリアタンパク質には免疫原性の高いタ
ンパク質を用いることができ、キーホールリンペットヘ
モシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、あるいは卵白アルブミン（ＯＶＡ）が好ましい。
以下、グリチルレチン酸とキャリアタンパク質の結合方
法を具体的に説明する。ＧＡ−Ｇｌｙとキャリアタンパ
ク質（ＫＬＨまたはＢＳＡ）との結合は、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド法により行なう。すなわち、ＧＡ−Ｇ
ｌｙのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド［１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミド］で活性化し、ＧＡーＧｌｙのＮ−ヒドロキシス
クシンイミド活性エステル（ＧＡ−Ｇｌｙ−ＮＨＳと記
す）に誘導する。これに、ＫＬＨ又はＢＳＡ溶液を反応
させることによりＧＡ−ＧｌｙのＫＬＨまたはＢＳＡコ
ンジュゲートを得る。更に詳しくは、ＧＡ−Ｇｌｙを８
０％ジオキサンに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドおよび水溶性カルボジイミドを加え室温で２時間反応
させた後、酢酸エチルを用いた抽出により、ＧＡ−Ｇｌ
ｙのスクシンイミド活性エステル（ＧＡ−Ｇｌｙ−ＮＨ
Ｓ）を得る。次にＧＡ−Ｇｌｙ−ＮＨＳを少量のジメチ
ルスルフォキシドに溶解した後、ＫＬＨ溶液あるいはＢ
ＳＡ溶液に添加し、４℃で２４時間反応させる。さらに
反応溶液を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
４、以下、ＰＢＳと記す）に対して透析した後に凍結乾
燥することにより、ＧＡ−ＧｌｙとＫＬＨの結合体（以
下、ＧＡ−ＫＬＨコンジュゲートと記す）、あるいはＧ
Ａ−Ｇｌｙとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の結合体
（以下、ＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートと記す）を得るこ
とができる。スクシンイミド活性エステルの生成は薄層
クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと記す。）により確
認することができる。また、コンジュゲートの生成は、
キャリアタンパク質の２８０ｎｍにおける紫外吸収スペ
クトルの極大が、グリチルレチン酸由来の２５２ｎｍに
シフトすることにより確認することができる。 ２．ＧＡ−キャリアタンパク質コンジュゲートによるマ
ウスの免疫 ＧＡ−キャリアタンパク質コンジュゲート溶液を等量の
フロイント完全アジュバントと混合する。次に完全に乳
化させたものをＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下及び腹腔内に
投与する。その後ＧＡ−キャリアタンパク質コンジュゲ
ート溶液と等量のフロイント不完全アジュバントとの混
合エマルジョンを腹腔内に２回投与し、追加免疫を行
う。通常、追加免疫は２週間間隔で行なえばよい。２回
目の追加免疫をしてから１０日後、ＧＡ−キャリアタン
パク質コンジュゲート溶液を静脈内投与する。ＧＡ−キ
ャリアタンパク質コンジュゲートは２００〜４００μｇ
／ｍｌ程度の濃度のものを使用し、皮下あるいは腹腔内
投与量は０．５ｍｌ、静脈内投与量は０．２ｍｌ程度で
よい。最終免疫の前に、酵素免疫測定法により血中抗体
価の上昇を確認するのが望ましい。 ３．ハイブリドーマの作製 最終免疫の３日後、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、
同系マウス由来のミエローマ細胞との細胞融合に用い
る。細胞融合は具体的には以下のように行う。凍結保存
されている骨髄腫細胞を洗浄後、培地に懸濁し、培養用
フラスコを用いて培養し、対数増殖期にある細胞を得
る。培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地に牛胎児血清を１
０％の割合で加えたもの（以下、ＦＣＳ−ＲＰＭＩと記
す。）等が使用できる。ＲＰＭＩ１６４０培地について
は、Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａ．Ｍ．
Ａ．，１９９；５１９（１９６７）等、参照。脾細胞と
骨髄腫細胞を遠心分離して集め、培地で数回洗浄し、脾
細胞と骨髄腫細胞をよく混合し、５０％ポリエチレング
リコール４０００を０．５ｍｌ添加し、細胞融合を行
う。融合細胞は培地で洗浄した後に、再度ＦＣＳ−ＲＰ
ＭＩ培地に懸濁し、９６穴マイクロタイタープレートに
分注し、炭酸ガスインキュベーター中で培養する。融合
細胞の選択はＨＡＴ選択により行った。ＨＡＴ選択の方
法は、サイエンス１４５巻７０９頁、１９６４年に記載
されているが、その選択の原理は以下の通りである。細
胞融合に用いるミエローマは、ヒポキサンチン−グアニ
ン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）
を欠損しており、核酸合成はｄｅ ｎｏｖｏ合成経路に
依存している。このようなミエローマ細胞と、正常リン
パ球の融合細胞では、ＨＡＴ培地中で、アミノプテリン
によりｄｅ ｎｏｖｏの合成経路が阻害されても、チミ
ジン、ヒポキサンチンが存在しているので、リンパ球由
来のサルベージ回路により核酸合成でき、ＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培
地）中でも増殖が可能である。この時、ミエローマ細胞
は、アミノプテリンによりｄｅ ｎｏｖｏ合成経路も阻
害されるため、核酸合成できずに死滅する。また、リン
パ球は、正常細胞であるので、長期培養は不可能であ
り、結果的に、ＨＡＴ培地中で増殖できるのは、ミエロ
ーマ細胞とリンパ球の融合により生成したハイブリドー
マのみであるので、非融合細胞から融合細胞を選択する
ことができる。得られたハイブリドーマの抗体産生能
は、以下に示す酵素免疫測定法により調べることができ
る。 ４．免疫測定法（直接ＥＬＩＳＡ、阻害ＥＬＩＳＡ） ハイブリドーマの抗体産生能および抗体の力価の検定
は、ＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートを抗原とした直接ＥＬ
ＩＳＡ法により行ない、抗体の交差反応性および各種試
料中の抗原量の測定は、グリチルレチン酸を標準物質と
した阻害ＥＬＩＳＡ法によりな行う。直接ＥＬＩＳＡ法
は、抗原すなわちＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートを固相化
したものを、抗体溶液、マウス以外の動物で作製した抗
マウスイムノグロブリンＧ（抗ＩｇＧ）を酵素標識した
ものの溶液と順次インキュベートし、抗原に抗体を介し
て結合した酵素活性を測定することにより、抗体を定量
する。阻害ＥＬＩＳＡ法は、ＧＡ−ＢＳＡコンジュゲー
トを固相化したものと、グリチルレチン酸またはサンプ
ルを抗体とともにインキュベートし、次に酵素標識した
抗マウスＩｇＧを結合させ、酵素活性を測定する。抗体
がサンプルに含まれる抗原に結合すると、固相化した抗
原に結合できないために結合する酵素量が減少するの
で、酵素活性を測定することにより、サンプルに含まれ
ているグリチルレチン酸を定量することができる。ま
た、グリチルリチンを酸加水分解し、生成するグリチル
レチン酸を定量することによりグリチルリチンの量を測
定することができる。抗原の固相化には、アガロース、
ラテックス粒子、マイクロタイタープレートのウェル等
が使用できるが、マイクロタイタープレートのウェルが
好ましい。ＥＬＩＳＡ法一例を示す。抗原溶液（例えば
ＧＡ−ＢＳＡ）を９６穴マイクロタイタープレートのウ
ェルに分注し４℃で一夜静置する。抗原液を除いた後
に、ブロッキング溶液、例えば１％ＢＳＡを含むＰＢＳ
を分注し、３７℃で静置することによりブロッキングを
行う。次に直接ＥＬＩＳＡ法では抗体溶液を、阻害ＥＬ
ＩＳＡ法ではグリチルレチン酸またはサンプル溶液を抗
体溶液とともに各ウェルに分注する。室温で静置した
後、洗浄し、酵素で標識した抗マウスＩｇＧ溶液を分注
し、室温で静置する。標識酵素はアルカリフォスファタ
ーゼが好適であり、アルカリフォスファターゼ標識した
ヤギ抗マウスＩｇＧは、タゴ社から購入することができ
る。各ウェルを再び洗浄した後、酵素反応により発色す
る色素の溶液を分注し、反応させる。反応終了後、各ウ
ェルの４０５ｎｍにおける吸光度をイムノリーダーによ
り測定する。結果を既知の抗原量で得られる値と比較す
ることにより、グリチルレチン酸の定量が可能となる。
色素は、アルカリフォスファターゼ標識した抗マウスＩ
ｇＧを使用した場合にはｐ−ニトロフェニルフォスフェ
ートを使用する。抗マウスＩｇＧを標識する酵素は、ホ
ースラディッシュパーオキシダーゼでもよく、その場合
には基質はｐ−ニトロフェニルフォスフェートのかわり
にＡＢＴＳ［2-2'-adino-di-(3-ethylbenzothyazolin-s
ulfonate)］，ＴＭＢＺ（tetra-methyl benzidine），
ＯＰＤ（O-phenylene diamine）などが使用できる。上
述した方法で、グリチルレチン酸あるいはグリチルリチ
ンを定量することができるが、モノクローナル抗体、酵
素標識した二次抗体等の定量に必要な試薬をキットにす
ることにより、簡便かつ迅速な検査が可能となる。キッ
トの一例として、マイクロタイタープレート、ＢＳＡ、
ＧＡ−ＢＳＡ、モノクローナル抗体、洗浄用緩衝液、ア
ルカリフォスファターゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ、
ｐ−ニトロフェニルフォスフェート、定量の対照に用い
る既知量のグリチルリチン酸からなるキットを挙げるこ
とができる。マイクロタイタープレートは予めＧＡ−Ｂ
ＳＡを固定化し、ＢＳＡでブロッキングしたものが好ま
しい。 抗体類、ＢＳＡ、ＧＡ−ＢＳＡあるいは色素は
凍結乾燥品として、またはこれらを安定して保存できる
溶媒に溶解してキットを出荷することが望ましい。溶液
として出荷する場合は静菌剤等を添加しておくことも可
能であるが、酵素反応を阻害しないものであることが好
ましい。 ５．本発明によるモノクローナル抗体のイメージング診
断への応用 本発明によるオレアナン型５環性トリテルペンを認識す
るモノクローナル抗体を、放射性物質、常磁性物質ある
いは蛍光物質等により標識し、イメージング診断に使用
することができる。モノクローナル抗体の標識は、例え
ば、放射性物質においては、125Ｉなどの場合はクロラ
ミンＴ法により行うことができる。常磁性物質、蛍光物
質等は、ＳＰＤＰ、ＧＭＢＳなどのヘテロバイファンク
ショナルな架橋剤を用いてモノクローナル抗体分子に結
合させる方法を挙げることができる。
【実施例】本発明を実施例によりさらに詳細に説明す
る。 １．グリチルレチン酸とキャリアタンパク質との結合 ＧＡ−Ｇｌｙ１０ｍｇ（１９μｍｏｌ）を０．２ｍｌの
８０％ジオキサン−２０％Ｈ2Ｏに溶解し、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド２．１ｍｇ（１８μｍｏｌ）および
水溶性カルボジイミド５．６ｍｇ（２９μｍｏｌ）を加
え、室温で２時間反応させた。ＧＡ−Ｇｌｙのスクシン
イミド活性エステル（ＧＡ−Ｇｌｙ−ＮＨＳ）の生成を
以下の方法で確認した。順層シリカゲル薄層板に、原
料、反応生成物及びその混合物をスポットし、クロロホ
ルム−メタノール（３：１）で展開した。リンモリブデ
ン酸を用いて発色させ、Ｒｆ０．９付近に反応生成物を
確認した。次に、反応液に脱イオン水８ｍｌを加え、次
に酢酸エチル８ｍｌを加え、分液ロートを用い反応物を
抽出した。酢酸エチル層を脱イオン水で３回水洗したの
ち、硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を留去して、
ＧＡ−Ｇｌｙのスクシンイミド活性エステル（ＧＡ−Ｇ
ｌｙ−ＮＨＳ）を得た。上記のようにして得られたＧＡ
−Ｇｌｙ−ＮＨＳを０．３ｍｌのジメチルスルフォキシ
ドに溶解した後、ＫＬＨ溶液あるいはＢＳＡ溶液（１０
ｍｇ／２ｍｌＰＢＳ）に添加し、４℃で２４時間反応さ
せた。さらに反応溶液をＰＢＳに対して透析した後に凍
結乾燥することにより、ＧＡ−ＫＬＨコンジュゲート，
あるいはＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートを得た。コンジュ
ゲートの生成は、キャリアタンパク質の２８０ｎｍにお
ける紫外吸収スペクトルの極大が、グリチルレチン酸由
来の２５２ｎｍにシフトすることにより確認した（図
１、図２）。 ２．マウスのＧＡ−ＫＬＨコンジュゲートによる免疫 ＧＡ−ＫＬＨコンジュゲート溶液（２００μｇ／ｍｌＰ
ＢＳ）を等量のフロイント完全アジュバントと混合し、
完全に乳化させたものをＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週
令）の皮下及び腹腔内に０．５ｍｌ投与した。その後１
４日間隔で、ＧＡ−ＫＬＨコンジュゲート溶液（２００
μｇ／ｍｌＰＢＳ）と等量のフロイント不完全アジュバ
ントとの混合エマルジョンを０．５ｍｌずつ腹腔内に２
回投与した。３回目の投与から７日後に血中抗体価の上
昇を直接ＥＬＩＳＡ法により確認した。その３日後、Ｇ
Ａ−ＫＬＨコンジュゲート溶液（４００μｇ／ｍｌ）を
０．２ｍｌ静脈内投与した。 ３．ハイブリドーマの作製 最終免疫の３日後、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、
ＲＰＭＩ１６４０培地中でほぐして懸濁し、同系マウス
由来のミエローマ細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４−Ｋ１３と
の細胞融合に用いた。該ミエローマ細胞は東北大学医学
部細菌学教室の多田孝太郎博士より供与された。凍結保
存されている骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４−Ｋ１３
を洗浄後、ＦＣＳ−ＲＰＭＩに懸濁し（５×１０4個／
ｍｌ）、培養用フラスコで培養し、対数増殖期にある細
胞を得た。脾細胞６×１０7個と骨髄腫細胞１．２５×
１０7個を遠心分離して集め、ＲＰＭＩ１６４０培地で
３回洗浄し、脾細胞と骨髄腫細胞をよく混合し、５０％
ポリエチレングリコール４０００（平均分子量３００
０、販売元メルク）を０．５ｍｌ添加し、細胞融合を行
った。融合細胞はＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した
後に、ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地に懸濁し、９６穴マイクロ
タイタープレートに０．１ｍｌずつ分注し、炭酸ガスイ
ンキュベーター中で培養した。 ４．抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング ハイブリドーマを、培養用フラスコに、５×１０4個／
ｍｌで移植し、３７°Ｃ炭酸ガスインキュベータで、３
〜４日培養し、その培養上清を回収した。各培養液をＧ
Ａ−ＢＳＡを抗原とした直接ＥＬＩＳＡ法およびグリチ
ルレチン酸を標準物質とした阻害ＥＬＩＳＡ法によりア
ッセイした。具体的には、後述の手順と同様に行った。
その結果、３株のハイブリドーマでグリチルレチン酸に
対する特異的抗体の産生が認められたので、これらを限
界希釈法によりクローニングした。マウス胸腺細胞を１
×１０6個／ウェルでまいた９６ウェルマイクロタイタ
ープレートに、ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地を用いて１０個／
ｍｌに調整したハイブリドーマ細胞浮遊液を、１００μ
ｌずつアプライし、３７°Ｃ炭酸ガスインキュベータで
培養した。７〜１０日後に、ハイブリドーマコロニーが
確認でき、１ウェルにつき、１コロニーの形成が認めら
れたウェルを選択した。最終的にＧＡ２−２０−１、Ｇ
Ａ２−２０−３、ＧＡ２−２０−６の３株のハイブリド
ーマの樹立に成功した。これらのうちＧＡ２−２０−６
については、工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３３８９の登録番号により寄託した。次に、
これらの株の生産するモノクローナル抗体の力価を、直
接ＥＬＩＳＡ法により決定した。ＧＡ−ＢＳＡ溶液（１
０μｇ／ｍｌＰＢＳ）をポリビニルクロリド製９６穴マ
イクロタイタープレート（スミトモベークライト、ＭＳ
−７１９６Ｆ）のウェルに１００μｌずつ分注し、４℃
で一夜静置した。抗原液を除いた後に、１％ＢＳＡを含
むＰＢＳ（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１００μｌずつ分注し、
３７℃１時間静置した。なお、ここではキャリアプロテ
イン（ＫＬＨ）に対する抗体を除くために、ＫＬＨと交
差反応性を有しないＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートを抗原
として使用した。次にハイブリドーマ培養上清をＰＢＳ
を用いて順次２倍希釈し、１０２４倍までの希釈列を作
成し、１００μｌずつ各ウェルに分注した。室温で３０
分静置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート）を含むＰＢＳで３
回、ＰＢＳで２回洗浄し、アルカリフォスファターゼで
標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（タゴ社、６５４２）の５
０００倍希釈液（ＰＢＳ）を１００μｌずつ分注し、室
温で３０分静置した。各ウェルを先の手順と同様に洗浄
した後、ｐ−ニトロフェニルフォスフェートを１ｍｇ／
ｍｌの濃度で含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
９．８）を１００μｌずつ分注し、３７℃で３０分反応
させた。反応終了後、２Ｍ水酸化ナトリウム液を加え、
各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度をイムノリーダー
（バイオラッド社製、モデル２５５０）により測定し
た。結果を図４〜図５に示す。吸光度で約１．０を与え
る希釈倍率を抗体価としたとき、いずれの抗体の場合で
も約１００倍希釈で吸光度１．０を与えており、これを
抗体価とした。阻害ＥＬＩＳＡでは各抗体の５０倍希釈
液を使用することとした。マウスモノクローナル抗体ア
イソタイピングキット（アマーシャム社製、ＲＰＮ２
９）を用いて、これらのモノクローナル抗体のクラスを
検討した結果、いずれもＩｇＧ１・κであった。 ５．モノクローナル抗体の交差反応性についての検討 以下の各化合物に対する交差反応性を阻害ＥＬＩＳＡ法
により検討した。 (1)１８α Ｈ−オレアン−１１−オキソ−１２エン−３
０−オイック酸 (2)オレアン−１２エン−３，１１−ジオキソ−３０−
オイック酸 (3)オレアン−１２エン−３α−ハイドロキシ−１１−
オキソ−３０−オイック酸 (4)オレアン−１２エン−１１−オキソ−３β，３０−
ジオール (5)コール酸 (6)デオキシコール酸 (7)グリチルレチン酸(GA) (8)グリチルリチン(GL) これらは以下、化合物(1),(2),...(6),(GA),(GL)として
引用する。ＧＡ−ＢＳＡ溶液（１０μｇ／ｍｌ）を９６
穴マイクロタイタープレートのウェルに１００μｌずつ
分注し４℃で一夜静置した。抗原液を除いた後に、ＢＳ
Ａ−ＰＢＳを１００μｌずつ分注し、３７℃１時間静置
した。次に５０倍希釈した抗体、各化合物を１０ｎｇ／
ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌに調製し
たものを、各々５０μｌずつ各ウェルに分注した。室温
で３０分静置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで３回、ＰＢＳで２回洗浄し、アルカリフォスフ
ァターゼで標識したヤギ抗マウスＩｇＧの５０００倍希
釈液を１００μｌずつ分注し、室温で３０分静置した。
各ウェルを先の手順と同様に洗浄した後、ｐ−ニトロフ
ェニルフォスフェートを１ｍｇ／ｍｌの濃度で含む１Ｍ
ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）を１００μｌ
ずつ分注し、３７℃で３０分反応させた。反応終了後、
２Ｍ水酸化ナトリウムを加え、各ウェルの４０５ｎｍに
おける吸光度をイムノリーダーにより測定した。結果を
図６、図７、図８、図９、図１０及び図１１に示す。得
られた阻害曲線より各化合物の５０％阻害濃度（ＩＣ50
値）を求めた結果、３株のうちではＧＡ２−２０−１株
の生産する抗体が最も高い特異性を示した。表１に各抗
体に対するＩＣ50値を示したが、このＩＣ50値は、各阻
害剤を用いた時に得られる阻害曲線より、５０％阻害の
阻害濃度を求めて得られたものである。 （本頁、以下余白） 以上の結果より、抗体の認識部位はグリチルレチン酸の
立体構造も含めた上で、３位の水酸基を中心とした環境
であることが示唆された。また、各種ステロイド化合物
との交差反応性についてもあわせて検討した結果、いず
れの化合物とも半応しないことを確認した。 ６．モノクローナル抗体によるグリチルレチン酸の検出
感度およびグリチルレチン酸への変換によるグリチルリ
チンの検出 グリチルレチン酸のエタノール溶液（１ｍｇ／ｍｌ）
を、ＰＢＳで希釈して１０μｇ／ｍｌ溶液を調製した。
これを順次１０倍に希釈し１０ｐｇ／ｍｌ溶液までを作
製して、阻害ＥＬＩＳＡ法を上述と同様に行い、グリチ
ルレチン酸の検出限界を調べた。グリチルリチンの検出
は、酸加水分解によりグリチルレチン酸に変換したのち
阻害ＥＬＩＳＡ法により行った。すなわちグリチルリチ
ン（４００μｇ／ｍｌＰＢＳ）２００μｌに４Ｎ塩酸を
２００μｌ添加したのち、沸騰水浴上で３０分加熱し
た。室温まで冷却したのち２Ｎ水酸化ナトリウム液を４
００μｌ加えて中和した（グリチルリチンとして、最終
濃度１００μｇ／ｍｌ）。該中和溶液を上述したグリチ
ルレチン酸の場合と同様に希釈列を作製し、阻害ＥＬＩ
ＳＡにより検出感度を調べた。同時に、酸加水分解を行
わなかったグリチルリチンを陰性対象として用いた。以
上の結果を図１２、図１３及び図１４に示す。グリチル
レチン酸の検出感度は、いずれのハイブリドーマ株が生
産する抗体を用いた場合でも約１０ｐｇ／ｍｌであり、
１０ｐｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまでの範囲でグリチル
レチン酸の定量が可能であることが示された。またグリ
チルリチンを酸加水分解し、グリチルレチン酸として定
量することが可能であることがわかった。生体試料を測
定する場合、無処理の試料を測定することにより、グリ
チルレチン酸の定量が可能であり、酸加水分解した試料
の測定値から処理前の測定値を差し引くことによりグリ
チルリチンの定量が可能である。
る。 １．グリチルレチン酸とキャリアタンパク質との結合 ＧＡ−Ｇｌｙ１０ｍｇ（１９μｍｏｌ）を０．２ｍｌの
８０％ジオキサン−２０％Ｈ2Ｏに溶解し、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド２．１ｍｇ（１８μｍｏｌ）および
水溶性カルボジイミド５．６ｍｇ（２９μｍｏｌ）を加
え、室温で２時間反応させた。ＧＡ−Ｇｌｙのスクシン
イミド活性エステル（ＧＡ−Ｇｌｙ−ＮＨＳ）の生成を
以下の方法で確認した。順層シリカゲル薄層板に、原
料、反応生成物及びその混合物をスポットし、クロロホ
ルム−メタノール（３：１）で展開した。リンモリブデ
ン酸を用いて発色させ、Ｒｆ０．９付近に反応生成物を
確認した。次に、反応液に脱イオン水８ｍｌを加え、次
に酢酸エチル８ｍｌを加え、分液ロートを用い反応物を
抽出した。酢酸エチル層を脱イオン水で３回水洗したの
ち、硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を留去して、
ＧＡ−Ｇｌｙのスクシンイミド活性エステル（ＧＡ−Ｇ
ｌｙ−ＮＨＳ）を得た。上記のようにして得られたＧＡ
−Ｇｌｙ−ＮＨＳを０．３ｍｌのジメチルスルフォキシ
ドに溶解した後、ＫＬＨ溶液あるいはＢＳＡ溶液（１０
ｍｇ／２ｍｌＰＢＳ）に添加し、４℃で２４時間反応さ
せた。さらに反応溶液をＰＢＳに対して透析した後に凍
結乾燥することにより、ＧＡ−ＫＬＨコンジュゲート，
あるいはＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートを得た。コンジュ
ゲートの生成は、キャリアタンパク質の２８０ｎｍにお
ける紫外吸収スペクトルの極大が、グリチルレチン酸由
来の２５２ｎｍにシフトすることにより確認した（図
１、図２）。 ２．マウスのＧＡ−ＫＬＨコンジュゲートによる免疫 ＧＡ−ＫＬＨコンジュゲート溶液（２００μｇ／ｍｌＰ
ＢＳ）を等量のフロイント完全アジュバントと混合し、
完全に乳化させたものをＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週
令）の皮下及び腹腔内に０．５ｍｌ投与した。その後１
４日間隔で、ＧＡ−ＫＬＨコンジュゲート溶液（２００
μｇ／ｍｌＰＢＳ）と等量のフロイント不完全アジュバ
ントとの混合エマルジョンを０．５ｍｌずつ腹腔内に２
回投与した。３回目の投与から７日後に血中抗体価の上
昇を直接ＥＬＩＳＡ法により確認した。その３日後、Ｇ
Ａ−ＫＬＨコンジュゲート溶液（４００μｇ／ｍｌ）を
０．２ｍｌ静脈内投与した。 ３．ハイブリドーマの作製 最終免疫の３日後、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、
ＲＰＭＩ１６４０培地中でほぐして懸濁し、同系マウス
由来のミエローマ細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４−Ｋ１３と
の細胞融合に用いた。該ミエローマ細胞は東北大学医学
部細菌学教室の多田孝太郎博士より供与された。凍結保
存されている骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４−Ｋ１３
を洗浄後、ＦＣＳ−ＲＰＭＩに懸濁し（５×１０4個／
ｍｌ）、培養用フラスコで培養し、対数増殖期にある細
胞を得た。脾細胞６×１０7個と骨髄腫細胞１．２５×
１０7個を遠心分離して集め、ＲＰＭＩ１６４０培地で
３回洗浄し、脾細胞と骨髄腫細胞をよく混合し、５０％
ポリエチレングリコール４０００（平均分子量３００
０、販売元メルク）を０．５ｍｌ添加し、細胞融合を行
った。融合細胞はＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した
後に、ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地に懸濁し、９６穴マイクロ
タイタープレートに０．１ｍｌずつ分注し、炭酸ガスイ
ンキュベーター中で培養した。 ４．抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング ハイブリドーマを、培養用フラスコに、５×１０4個／
ｍｌで移植し、３７°Ｃ炭酸ガスインキュベータで、３
〜４日培養し、その培養上清を回収した。各培養液をＧ
Ａ−ＢＳＡを抗原とした直接ＥＬＩＳＡ法およびグリチ
ルレチン酸を標準物質とした阻害ＥＬＩＳＡ法によりア
ッセイした。具体的には、後述の手順と同様に行った。
その結果、３株のハイブリドーマでグリチルレチン酸に
対する特異的抗体の産生が認められたので、これらを限
界希釈法によりクローニングした。マウス胸腺細胞を１
×１０6個／ウェルでまいた９６ウェルマイクロタイタ
ープレートに、ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地を用いて１０個／
ｍｌに調整したハイブリドーマ細胞浮遊液を、１００μ
ｌずつアプライし、３７°Ｃ炭酸ガスインキュベータで
培養した。７〜１０日後に、ハイブリドーマコロニーが
確認でき、１ウェルにつき、１コロニーの形成が認めら
れたウェルを選択した。最終的にＧＡ２−２０−１、Ｇ
Ａ２−２０−３、ＧＡ２−２０−６の３株のハイブリド
ーマの樹立に成功した。これらのうちＧＡ２−２０−６
については、工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３３８９の登録番号により寄託した。次に、
これらの株の生産するモノクローナル抗体の力価を、直
接ＥＬＩＳＡ法により決定した。ＧＡ−ＢＳＡ溶液（１
０μｇ／ｍｌＰＢＳ）をポリビニルクロリド製９６穴マ
イクロタイタープレート（スミトモベークライト、ＭＳ
−７１９６Ｆ）のウェルに１００μｌずつ分注し、４℃
で一夜静置した。抗原液を除いた後に、１％ＢＳＡを含
むＰＢＳ（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１００μｌずつ分注し、
３７℃１時間静置した。なお、ここではキャリアプロテ
イン（ＫＬＨ）に対する抗体を除くために、ＫＬＨと交
差反応性を有しないＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートを抗原
として使用した。次にハイブリドーマ培養上清をＰＢＳ
を用いて順次２倍希釈し、１０２４倍までの希釈列を作
成し、１００μｌずつ各ウェルに分注した。室温で３０
分静置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート）を含むＰＢＳで３
回、ＰＢＳで２回洗浄し、アルカリフォスファターゼで
標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（タゴ社、６５４２）の５
０００倍希釈液（ＰＢＳ）を１００μｌずつ分注し、室
温で３０分静置した。各ウェルを先の手順と同様に洗浄
した後、ｐ−ニトロフェニルフォスフェートを１ｍｇ／
ｍｌの濃度で含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
９．８）を１００μｌずつ分注し、３７℃で３０分反応
させた。反応終了後、２Ｍ水酸化ナトリウム液を加え、
各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度をイムノリーダー
（バイオラッド社製、モデル２５５０）により測定し
た。結果を図４〜図５に示す。吸光度で約１．０を与え
る希釈倍率を抗体価としたとき、いずれの抗体の場合で
も約１００倍希釈で吸光度１．０を与えており、これを
抗体価とした。阻害ＥＬＩＳＡでは各抗体の５０倍希釈
液を使用することとした。マウスモノクローナル抗体ア
イソタイピングキット（アマーシャム社製、ＲＰＮ２
９）を用いて、これらのモノクローナル抗体のクラスを
検討した結果、いずれもＩｇＧ１・κであった。 ５．モノクローナル抗体の交差反応性についての検討 以下の各化合物に対する交差反応性を阻害ＥＬＩＳＡ法
により検討した。 (1)１８α Ｈ−オレアン−１１−オキソ−１２エン−３
０−オイック酸 (2)オレアン−１２エン−３，１１−ジオキソ−３０−
オイック酸 (3)オレアン−１２エン−３α−ハイドロキシ−１１−
オキソ−３０−オイック酸 (4)オレアン−１２エン−１１−オキソ−３β，３０−
ジオール (5)コール酸 (6)デオキシコール酸 (7)グリチルレチン酸(GA) (8)グリチルリチン(GL) これらは以下、化合物(1),(2),...(6),(GA),(GL)として
引用する。ＧＡ−ＢＳＡ溶液（１０μｇ／ｍｌ）を９６
穴マイクロタイタープレートのウェルに１００μｌずつ
分注し４℃で一夜静置した。抗原液を除いた後に、ＢＳ
Ａ−ＰＢＳを１００μｌずつ分注し、３７℃１時間静置
した。次に５０倍希釈した抗体、各化合物を１０ｎｇ／
ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌに調製し
たものを、各々５０μｌずつ各ウェルに分注した。室温
で３０分静置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
ＰＢＳで３回、ＰＢＳで２回洗浄し、アルカリフォスフ
ァターゼで標識したヤギ抗マウスＩｇＧの５０００倍希
釈液を１００μｌずつ分注し、室温で３０分静置した。
各ウェルを先の手順と同様に洗浄した後、ｐ−ニトロフ
ェニルフォスフェートを１ｍｇ／ｍｌの濃度で含む１Ｍ
ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）を１００μｌ
ずつ分注し、３７℃で３０分反応させた。反応終了後、
２Ｍ水酸化ナトリウムを加え、各ウェルの４０５ｎｍに
おける吸光度をイムノリーダーにより測定した。結果を
図６、図７、図８、図９、図１０及び図１１に示す。得
られた阻害曲線より各化合物の５０％阻害濃度（ＩＣ50
値）を求めた結果、３株のうちではＧＡ２−２０−１株
の生産する抗体が最も高い特異性を示した。表１に各抗
体に対するＩＣ50値を示したが、このＩＣ50値は、各阻
害剤を用いた時に得られる阻害曲線より、５０％阻害の
阻害濃度を求めて得られたものである。 （本頁、以下余白） 以上の結果より、抗体の認識部位はグリチルレチン酸の
立体構造も含めた上で、３位の水酸基を中心とした環境
であることが示唆された。また、各種ステロイド化合物
との交差反応性についてもあわせて検討した結果、いず
れの化合物とも半応しないことを確認した。 ６．モノクローナル抗体によるグリチルレチン酸の検出
感度およびグリチルレチン酸への変換によるグリチルリ
チンの検出 グリチルレチン酸のエタノール溶液（１ｍｇ／ｍｌ）
を、ＰＢＳで希釈して１０μｇ／ｍｌ溶液を調製した。
これを順次１０倍に希釈し１０ｐｇ／ｍｌ溶液までを作
製して、阻害ＥＬＩＳＡ法を上述と同様に行い、グリチ
ルレチン酸の検出限界を調べた。グリチルリチンの検出
は、酸加水分解によりグリチルレチン酸に変換したのち
阻害ＥＬＩＳＡ法により行った。すなわちグリチルリチ
ン（４００μｇ／ｍｌＰＢＳ）２００μｌに４Ｎ塩酸を
２００μｌ添加したのち、沸騰水浴上で３０分加熱し
た。室温まで冷却したのち２Ｎ水酸化ナトリウム液を４
００μｌ加えて中和した（グリチルリチンとして、最終
濃度１００μｇ／ｍｌ）。該中和溶液を上述したグリチ
ルレチン酸の場合と同様に希釈列を作製し、阻害ＥＬＩ
ＳＡにより検出感度を調べた。同時に、酸加水分解を行
わなかったグリチルリチンを陰性対象として用いた。以
上の結果を図１２、図１３及び図１４に示す。グリチル
レチン酸の検出感度は、いずれのハイブリドーマ株が生
産する抗体を用いた場合でも約１０ｐｇ／ｍｌであり、
１０ｐｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまでの範囲でグリチル
レチン酸の定量が可能であることが示された。またグリ
チルリチンを酸加水分解し、グリチルレチン酸として定
量することが可能であることがわかった。生体試料を測
定する場合、無処理の試料を測定することにより、グリ
チルレチン酸の定量が可能であり、酸加水分解した試料
の測定値から処理前の測定値を差し引くことによりグリ
チルリチンの定量が可能である。
【発明の効果】本発明により、オレアナン型５環性トリ
テルペンに特異的なモノクローナル抗体を作製すること
ができた。本抗体を使用して、グリチルリチンおよびグ
リチルレチン酸等を高感度で定量することが可能であ
る。
テルペンに特異的なモノクローナル抗体を作製すること
ができた。本抗体を使用して、グリチルリチンおよびグ
リチルレチン酸等を高感度で定量することが可能であ
る。
【図１】ＧＡ−ＫＬＨコンジュゲートの紫外吸収スペク
トル図
トル図
【図２】ＧＡ−ＢＳＡコンジュゲートの紫外吸収スペク
トル図
トル図
【図３】ＧＡ２−２０−１株の生産するモノクローナル
抗体の力価の測定図で、縦軸は吸光度、横軸は希釈倍率
を示す（図４、５も同じ）
抗体の力価の測定図で、縦軸は吸光度、横軸は希釈倍率
を示す（図４、５も同じ）
【図４】ＧＡ２−２０−３株の生産するモノクローナル
抗体の力価の測定図
抗体の力価の測定図
【図５】ＧＡ２−２０−６株の生産するモノクローナル
抗体の力価の測定図
抗体の力価の測定図
【図６】ＧＡ２−２０−１株の生産するモノクローナル
抗体と化合物(1),(2),(3),(4),(GA),(GL)との交差反応
性示すの交差反応性を示す図、縦軸は阻害率、横軸は阻
害剤の濃度（図７、８、９も同じ）
抗体と化合物(1),(2),(3),(4),(GA),(GL)との交差反応
性示すの交差反応性を示す図、縦軸は阻害率、横軸は阻
害剤の濃度（図７、８、９も同じ）
【図７】ＧＡ２−２０−１株の生産するモノクローナル
抗体と化合物(5),(6)との交差反応性を示す図
抗体と化合物(5),(6)との交差反応性を示す図
【図８】ＧＡ２−２０−３株の生産するモノクローナル
抗体と、化合物(1),(2),(3),(4),(GA),(GL)との交差反
応性示す図
抗体と、化合物(1),(2),(3),(4),(GA),(GL)との交差反
応性示す図
【図９】ＧＡ２−２０−３株の生産するモノクローナル
抗体と化合物(5),(6)との交差反応性を示す図
抗体と化合物(5),(6)との交差反応性を示す図
【図１０】ＧＡ２−２０−６株の生産するモノクローナ
ル抗体と、化合物(1),(2),(3),(4),(GA),(GL)との交差
反応性示す図
ル抗体と、化合物(1),(2),(3),(4),(GA),(GL)との交差
反応性示す図
【図１１】ＧＡ２−２０−６株の生産するモノクローナ
ル抗体と化合物(5),(6)との交差反応性を示す図
ル抗体と化合物(5),(6)との交差反応性を示す図
【図１２】ＧＡ２−２０−１株の生産するモノクローナ
ル抗体によるグリチルレチン酸及びグリチルリチンの定
量を示す図
ル抗体によるグリチルレチン酸及びグリチルリチンの定
量を示す図
【図１３】ＧＡ２−２０−３株の生産するモノクローナ
ル抗体によるグリチルレチン酸及びグリチルリチンの定
量を示す図
ル抗体によるグリチルレチン酸及びグリチルリチンの定
量を示す図
【図１４】ＧＡ２−２０−６株の生産するモノクローナ
ル抗体によるグリチルレチン酸及びグリチルリチンの定
量を示す図
ル抗体によるグリチルレチン酸及びグリチルリチンの定
量を示す図
Claims (14)
- 【請求項１】オレアナン型５環性トリテルペンを認識し
得るモノクローナル抗体。 - 【請求項２】前記オレアナン型５環性トリテルペンがグ
リチルレチン酸誘導体である請求項１に記載のモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項３】前記オレアナン型５環性トリテルペンがグ
リチルレチン酸である請求項１に記載のモノクローナル
抗体。 - 【請求項４】前記オレアナン型５環性トリテルペンが生
体試料中のものである請求項１に記載のモノクローナル
抗体。 - 【請求項５】オレアナン型５環性トリテルペンとキャリ
アタンパク質との結合物を免疫原として用いて得られた
脾細胞と、ミエローマ細胞とを融合して得られるハイブ
リドーマが産生する請求項１に記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項６】前記脾細胞が、マウス脾細胞であり、該ミ
エローマ細胞がマウス由来ミエローマ細胞である請求項
５に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項７】抗体のクラスがＩｇＧである請求項１に記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項８】前記ＩｇＧがＩｇＧ1である請求項１に記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項９】放射性物質、常磁性物質及び蛍光物質の群
から選ばれる少なくとも一種で標識化されたイメージン
グ診断用の請求項１のモノクローナル抗体。 - 【請求項１０】オレアナン型５環性トリテルペンとキャ
リアタンパク質との結合物を免疫原として用いて得られ
たオレアナン型５環性トリテルペンを認識し得る抗体の
産生能を有する脾細胞と、ミエローマ細胞とを融合して
得られるハイブリドーマ。 - 【請求項１１】前記キャリアタンパク質がキーホールリ
ンペットヘモシアニンである前項記載のハイブリドー
マ。 - 【請求項１２】免疫学的方法による被検体中のオレアナ
ン型５環性トリテルペンを測定する方法において、オレ
アナン型５環性トリテルペンを認識し得るモノクローナ
ル抗体を用いることを特徴とする測定法。 - 【請求項１３】免疫学的方法により被検体中のオレアナ
ン型５環性トリテルペンを測定するための試薬キットで
あって、オレアナン型５環性トリテルペンを認識し得る
モノクローナル抗体と、オレアナン型５環性トリテルペ
ンとキャリアタンパク質との結合物を含むことを特徴と
する試薬キット。 - 【請求項１４】前記キャリアタンパク質がウシ血清アル
ブミンである前項記載の試薬キット。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3180334A JPH0568584A (ja) | 1991-06-25 | 1991-06-25 | モノクローナル抗体、これを用いた測定法、試薬キツト及び検索法 |
| EP19920301763 EP0520604A3 (en) | 1991-06-25 | 1992-03-02 | Monoclonal antibody against pentacyclic oleanan-type triterpene and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3180334A JPH0568584A (ja) | 1991-06-25 | 1991-06-25 | モノクローナル抗体、これを用いた測定法、試薬キツト及び検索法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0568584A true JPH0568584A (ja) | 1993-03-23 |
Family
ID=16081408
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3180334A Pending JPH0568584A (ja) | 1991-06-25 | 1991-06-25 | モノクローナル抗体、これを用いた測定法、試薬キツト及び検索法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0520604A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0568584A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000074916A (ja) * | 1998-08-31 | 2000-03-14 | Yukihiro Masayama | 抗体及びその製造方法並びに抗体を用いた抗原の定量方法及び免疫染色方法 |
| JP2018108943A (ja) * | 2016-12-28 | 2018-07-12 | 学校法人 名城大学 | 抗グリチルレチン酸抗体及びその利用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108196054B (zh) * | 2017-07-27 | 2023-07-11 | 河北省中药材质量检验检测研究中心有限公司 | 一种检测甘草酸的试纸条及其制备方法和应用 |
-
1991
- 1991-06-25 JP JP3180334A patent/JPH0568584A/ja active Pending
-
1992
- 1992-03-02 EP EP19920301763 patent/EP0520604A3/en not_active Withdrawn
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000074916A (ja) * | 1998-08-31 | 2000-03-14 | Yukihiro Masayama | 抗体及びその製造方法並びに抗体を用いた抗原の定量方法及び免疫染色方法 |
| JP2018108943A (ja) * | 2016-12-28 | 2018-07-12 | 学校法人 名城大学 | 抗グリチルレチン酸抗体及びその利用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0520604A2 (en) | 1992-12-30 |
| EP0520604A3 (en) | 1993-07-21 |
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