JPH08245689A - 新規なベンゾジアゼピン−タンパク質結合体 - Google Patents
新規なベンゾジアゼピン−タンパク質結合体Info
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- JPH08245689A JPH08245689A JP8015004A JP1500496A JPH08245689A JP H08245689 A JPH08245689 A JP H08245689A JP 8015004 A JP8015004 A JP 8015004A JP 1500496 A JP1500496 A JP 1500496A JP H08245689 A JPH08245689 A JP H08245689A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 様々なベンゾジアゼピン類、特に尿中のベン
ゾジアゼピン代謝産物、に対して高い交差反応性を有す
る抗体を生成しうるベンゾジアゼピン−タンパク質結合
体の形の免疫原を提供する。 【解決手段】 式Ｉ： 【化１】 〔式中、Ｒ1 は水素、メチルまたはＲ基であり、Ｒ2 は
水素、ヒドロキシルまたはＯＲ基であり、その際Ｒ1 か
Ｒ2 のどちらかがＲ基を含み、Ｒ3 はハロゲン、ＮＯ2
またはＮＨ2 であり、Ｘは水素またはハロゲンであり、
Ｒは式II： 【化２】 （式中、Ｚは免疫原として活性な巨大分子の担体物質で
あり、ｎは２または３である）の基である〕で表される
ベンゾジアゼピン−タンパク質結合体はベンゾジアゼピ
ンに対する抗体を得るための免疫原として使用できる。
ゾジアゼピン代謝産物、に対して高い交差反応性を有す
る抗体を生成しうるベンゾジアゼピン−タンパク質結合
体の形の免疫原を提供する。 【解決手段】 式Ｉ： 【化１】 〔式中、Ｒ1 は水素、メチルまたはＲ基であり、Ｒ2 は
水素、ヒドロキシルまたはＯＲ基であり、その際Ｒ1 か
Ｒ2 のどちらかがＲ基を含み、Ｒ3 はハロゲン、ＮＯ2
またはＮＨ2 であり、Ｘは水素またはハロゲンであり、
Ｒは式II： 【化２】 （式中、Ｚは免疫原として活性な巨大分子の担体物質で
あり、ｎは２または３である）の基である〕で表される
ベンゾジアゼピン−タンパク質結合体はベンゾジアゼピ
ンに対する抗体を得るための免疫原として使用できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ベンゾジアゼピン
−タンパク質結合体、その製造方法、免疫原としてのそ
の使用、ベンゾジアゼピンに対する抗体の調製方法、並
びにこれらの抗体を用いてベンゾジアゼピンを検出する
ためのイムノアッセイに関するものである。本発明の更
なる主題は、新規なベンゾジアゼピン−リンカー連結
体、その製造方法および新規な上記結合体を製造するた
めのその使用に関するものである。
−タンパク質結合体、その製造方法、免疫原としてのそ
の使用、ベンゾジアゼピンに対する抗体の調製方法、並
びにこれらの抗体を用いてベンゾジアゼピンを検出する
ためのイムノアッセイに関するものである。本発明の更
なる主題は、新規なベンゾジアゼピン−リンカー連結
体、その製造方法および新規な上記結合体を製造するた
めのその使用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ベンゾジアゼピンクラスの化合物類の分
析的検出はこの１年半の間に次第に重要性を増しつつあ
る。ベンゾジアゼピン類は重要な薬品、特にトランキラ
イザー（精神神経安定剤）であるが、薬としてまたは習
慣性の強い薬(hard drug) の代替品として乱用されるこ
とがある。それらは中毒、特に中毒と自殺が混在してい
る場合に重要な役割を果たす。それらの検出は交通に関
連した医学的質問において大いに問題とされる。
析的検出はこの１年半の間に次第に重要性を増しつつあ
る。ベンゾジアゼピン類は重要な薬品、特にトランキラ
イザー（精神神経安定剤）であるが、薬としてまたは習
慣性の強い薬(hard drug) の代替品として乱用されるこ
とがある。それらは中毒、特に中毒と自殺が混在してい
る場合に重要な役割を果たす。それらの検出は交通に関
連した医学的質問において大いに問題とされる。
【０００３】それゆえ、体液中のベンゾジアゼピンの迅
速な定性的および定量的検出のための免疫学的検出方法
が次第に関心をもたれつつある。イムノアッセイはベン
ゾジアゼピン−タンパク質結合体（ハプテン−タンパク
質結合体）の合成のためにカップリング能のあるベンゾ
ジアゼピン−リンカー化合物（ハプテン−リンカー連結
体）を必要とする。一方で、ベンゾジアゼピン−タンパ
ク質結合体はベンゾジアゼピンに対する抗体を生成させ
るための免疫原として用いられ、他方で、ベンゾジアゼ
ピン−酵素結合体はイムノアッセイにおいて酵素標識抗
原またはポリハプテンとして使用することも可能であ
る。
速な定性的および定量的検出のための免疫学的検出方法
が次第に関心をもたれつつある。イムノアッセイはベン
ゾジアゼピン−タンパク質結合体（ハプテン−タンパク
質結合体）の合成のためにカップリング能のあるベンゾ
ジアゼピン−リンカー化合物（ハプテン−リンカー連結
体）を必要とする。一方で、ベンゾジアゼピン−タンパ
ク質結合体はベンゾジアゼピンに対する抗体を生成させ
るための免疫原として用いられ、他方で、ベンゾジアゼ
ピン−酵素結合体はイムノアッセイにおいて酵素標識抗
原またはポリハプテンとして使用することも可能であ
る。
【０００４】ベンゾジアゼピン−リンカー化合物および
ベンゾジアゼピン−タンパク質結合体は既知である。例
えば、EP-A-0 264 797、J. Pharm. Sci. 66, 235 (197
7) 、Biochem. Pharm. Exp. Therapeutics 186, 167 (1
973) 、J. Imm. 4, 135 (1983) 、US-P-4,243,654、US-
P-4,046,636、US-P-4,777,169、US-P-4,043,989およびU
S-P-4,083,948を参照のこと。そのように生成された抗
体は血清試験において用いられている。
ベンゾジアゼピン−タンパク質結合体は既知である。例
えば、EP-A-0 264 797、J. Pharm. Sci. 66, 235 (197
7) 、Biochem. Pharm. Exp. Therapeutics 186, 167 (1
973) 、J. Imm. 4, 135 (1983) 、US-P-4,243,654、US-
P-4,046,636、US-P-4,777,169、US-P-4,043,989およびU
S-P-4,083,948を参照のこと。そのように生成された抗
体は血清試験において用いられている。
【０００５】ベンゾジアゼピン検出のためのイムノアッ
セイの特色は、それらがある種のベンゾジアゼピン化合
物を認識するだけでなく、多くの様々な関連したベンゾ
ジアゼピン類もまた認識する（高い交差反応性を有す
る）抗体を必要とする点である。ベンゾジアゼピン検出
に伴う別の問題は、尿サンプル中のかかる物質の検出で
ある。この種のサンプルはベンゾジアゼピンの代謝産物
(Clarke's Isolation and Identification of Drugs,
第２版, The Pharmaceutical Press, London 1986; R.
C. Baselt, Disposition of Toxic Drugs and Chemical
s in Man,第３版,Year Book Medical Publishers Inc.,
1989)、特にアミン、グルクロニド、ベンゾフェノンを
含んでおり、これらもイムノアッセイに用いる抗体によ
って検出されるべきである。
セイの特色は、それらがある種のベンゾジアゼピン化合
物を認識するだけでなく、多くの様々な関連したベンゾ
ジアゼピン類もまた認識する（高い交差反応性を有す
る）抗体を必要とする点である。ベンゾジアゼピン検出
に伴う別の問題は、尿サンプル中のかかる物質の検出で
ある。この種のサンプルはベンゾジアゼピンの代謝産物
(Clarke's Isolation and Identification of Drugs,
第２版, The Pharmaceutical Press, London 1986; R.
C. Baselt, Disposition of Toxic Drugs and Chemical
s in Man,第３版,Year Book Medical Publishers Inc.,
1989)、特にアミン、グルクロニド、ベンゾフェノンを
含んでおり、これらもイムノアッセイに用いる抗体によ
って検出されるべきである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】かくして、本発明の課
題は、関連するベンゾジアゼピン類、特に尿中のベンゾ
ジアゼピン代謝産物、に対して最高の交差反応性を有す
る抗体を免疫反応の結果として生成するベンゾジアゼピ
ン−タンパク質結合体の形の免疫原を提供することであ
る。さらに、本発明は、抗体の結合能が該結合体のリン
カー構造にはほんの少ししか向けられない抗体を生成す
るための、ベンゾジアゼピン−タンパク質結合体の形の
免疫原を提供することを意図している。
題は、関連するベンゾジアゼピン類、特に尿中のベンゾ
ジアゼピン代謝産物、に対して最高の交差反応性を有す
る抗体を免疫反応の結果として生成するベンゾジアゼピ
ン−タンパク質結合体の形の免疫原を提供することであ
る。さらに、本発明は、抗体の結合能が該結合体のリン
カー構造にはほんの少ししか向けられない抗体を生成す
るための、ベンゾジアゼピン−タンパク質結合体の形の
免疫原を提供することを意図している。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この目的は特許請求の範
囲に規定される本発明によって達成できる。本発明の主
題は、式Ｉ：
囲に規定される本発明によって達成できる。本発明の主
題は、式Ｉ：
【化１２】 〔式中、Ｒ1 は水素、メチルまたはＲ基であり、Ｒ2 は
水素、ヒドロキシルまたはＯＲ基であり、その際Ｒ1 か
Ｒ2 のどちらかがＲ基を含み、Ｒ3 はハロゲン、ＮＯ2
またはＮＨ2 であり、Ｘは水素またはハロゲンであり、
Ｒは式II：
水素、ヒドロキシルまたはＯＲ基であり、その際Ｒ1 か
Ｒ2 のどちらかがＲ基を含み、Ｒ3 はハロゲン、ＮＯ2
またはＮＨ2 であり、Ｘは水素またはハロゲンであり、
Ｒは式II：
【化１３】 （式中、Ｚは免疫原として活性な巨大分子の担体物質で
あり、ｎは２または３である）の基である〕で表される
新規なベンゾジアゼピン−タンパク質結合体である。
あり、ｎは２または３である）の基である〕で表される
新規なベンゾジアゼピン−タンパク質結合体である。
【０００８】好ましい実施態様において、ｎは２であ
る。巨大分子の担体物質はポリペプチドであることが好
ましく、例えばＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシア
ニン）、エデスチンまたはウシ血清アルブミンである。
β−ガラクトシダーゼのような酵素も適している。ハロ
ゲンはフッ素、塩素、臭素またはヨウ素である。Ｘは塩
素であることが好ましい。好ましいＲ3 はハロゲン、特
に塩素である。
る。巨大分子の担体物質はポリペプチドであることが好
ましく、例えばＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシア
ニン）、エデスチンまたはウシ血清アルブミンである。
β−ガラクトシダーゼのような酵素も適している。ハロ
ゲンはフッ素、塩素、臭素またはヨウ素である。Ｘは塩
素であることが好ましい。好ましいＲ3 はハロゲン、特
に塩素である。
【０００９】特に好ましい式Ｉの化合物は式Ｉａおよび
Ｉｂ：
Ｉｂ：
【化１４】 で表される化合物である。
【００１０】本発明による結合体は、ベンゾジアゼピン
に対する抗体を作るための免疫原として用いられる。本
発明の主題は、本発明による結合体を免疫原として用い
ることを特徴とする、哺乳動物を免疫化し、生産された
抗体を公知の方法により、例えば血清または脾臓から、
回収することによる、ベンゾジアゼピンに対する抗体の
調製方法である。抗血清は公知の方法にしたがって、好
ましくはマウスまたはヒツジから得られる。こうした免
疫化の手順は、B. Dunkar, J. Agric. Food Chem. 38
(1990), 433-437および N.H. Ogodrow, J. Agric. Food
Chem. 38 (1990), 940-946に記述されている。
に対する抗体を作るための免疫原として用いられる。本
発明の主題は、本発明による結合体を免疫原として用い
ることを特徴とする、哺乳動物を免疫化し、生産された
抗体を公知の方法により、例えば血清または脾臓から、
回収することによる、ベンゾジアゼピンに対する抗体の
調製方法である。抗血清は公知の方法にしたがって、好
ましくはマウスまたはヒツジから得られる。こうした免
疫化の手順は、B. Dunkar, J. Agric. Food Chem. 38
(1990), 433-437および N.H. Ogodrow, J. Agric. Food
Chem. 38 (1990), 940-946に記述されている。
【００１１】本発明のもう１つの主題は、本発明による
ベンゾジアゼピン−タンパク質結合体を用いた免疫化の
結果として得られる抗体である。これらの抗体はモノク
ローナルまたは好ましくはポリクローナル抗体である。
抗体の調製は実験動物を免疫原で免疫化することにより
行われる。本発明の方法のこの段階は当業者に知られて
いる従来の方法を使って行うことができる。免疫原をア
ジュバントと共に実験動物に投与することが好適であ
る。百日咳菌と組み合わせた水酸化アルミニウムまたは
フロイントアジュバントが特に好ましいものである。免
疫化は好ましくは７ヵ月間にわたって４〜６週おきに少
なくとも４回実施する。免疫原は腹腔内に注射すること
が好ましい。
ベンゾジアゼピン−タンパク質結合体を用いた免疫化の
結果として得られる抗体である。これらの抗体はモノク
ローナルまたは好ましくはポリクローナル抗体である。
抗体の調製は実験動物を免疫原で免疫化することにより
行われる。本発明の方法のこの段階は当業者に知られて
いる従来の方法を使って行うことができる。免疫原をア
ジュバントと共に実験動物に投与することが好適であ
る。百日咳菌と組み合わせた水酸化アルミニウムまたは
フロイントアジュバントが特に好ましいものである。免
疫化は好ましくは７ヵ月間にわたって４〜６週おきに少
なくとも４回実施する。免疫原は腹腔内に注射すること
が好ましい。
【００１２】永久的なミエローマ細胞系と融合されるＢ
リンパ球は、このように免疫化した動物から得られる。
融合はKohlerとMilsteinにより記述された方法 (Nature
256, 1975, 495-497)にしたがって行う。形成されたハ
イブリッド細胞の初代培養物は通常の方法で、例えば市
販のセルソーターまたは限界希釈法を用いて、クローニ
ングされる。適当な試験方法、例えばエンザイムイムノ
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）でベンゾジアゼピンとポジティ
ブに反応する培養物はさらに処理される。
リンパ球は、このように免疫化した動物から得られる。
融合はKohlerとMilsteinにより記述された方法 (Nature
256, 1975, 495-497)にしたがって行う。形成されたハ
イブリッド細胞の初代培養物は通常の方法で、例えば市
販のセルソーターまたは限界希釈法を用いて、クローニ
ングされる。適当な試験方法、例えばエンザイムイムノ
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）でベンゾジアゼピンとポジティ
ブに反応する培養物はさらに処理される。
【００１３】抗体はテマゼパム(temazepam) 、オキサゼ
パム(oxazepam)、ロラゼパム(lorazepam) 、ブロマゼパ
ム(bromazepam)、アルプラゾラム(alprazolam)に対し
て、さらにテマゼパムグルクロニドまたはベンゾフェノ
ン、オキサゼパムグルクロニドおよびアミノ−フルニト
ラゼパム(amino-flunitrazepam) のような代謝産物に対
して高い交差反応性を示すものである。しかし、それら
はリンカー橋に対してはほとんど交差反応性を示さない
ものである。
パム(oxazepam)、ロラゼパム(lorazepam) 、ブロマゼパ
ム(bromazepam)、アルプラゾラム(alprazolam)に対し
て、さらにテマゼパムグルクロニドまたはベンゾフェノ
ン、オキサゼパムグルクロニドおよびアミノ−フルニト
ラゼパム(amino-flunitrazepam) のような代謝産物に対
して高い交差反応性を示すものである。しかし、それら
はリンカー橋に対してはほとんど交差反応性を示さない
ものである。
【００１４】本発明の別の主題は、このように得られた
抗体のイムノアッセイでの使用に関する。抗体は特に標
識（例えば、酵素、放射能標識、またはラテックスや金
属ゾルのような粒子）、別の結合相手（例えば、ストレ
プトアビジン）または固相に結合される。
抗体のイムノアッセイでの使用に関する。抗体は特に標
識（例えば、酵素、放射能標識、またはラテックスや金
属ゾルのような粒子）、別の結合相手（例えば、ストレ
プトアビジン）または固相に結合される。
【００１５】本発明の抗体を用いてベンゾジアゼピンま
たはベンゾジアゼピン代謝産物の存在を検出する方法は
次のように実施される。すなわち、ベンゾジアゼピンに
ついて試験すべきサンプル（好ましくは、尿）を、標識
し得るまたは固相に結合し得るまたは他の結合相手を介
して固相に結合し得る本発明の少なくとも１つの抗体と
接触させ、適当な方法で（例えば、標識により）抗体−
ベンゾジアゼピン複合体の形成を測定する。イムノアッ
セイは好ましくは不均一イムノアッセイとして実施さ
れ、特にドイツ特許出願公開 DE-OS 44 39 429またはDE
-OS 40 24 919 （図１参照）に記載されるようなクロマ
トグラフィー試験片の上で行うことが好適である。
たはベンゾジアゼピン代謝産物の存在を検出する方法は
次のように実施される。すなわち、ベンゾジアゼピンに
ついて試験すべきサンプル（好ましくは、尿）を、標識
し得るまたは固相に結合し得るまたは他の結合相手を介
して固相に結合し得る本発明の少なくとも１つの抗体と
接触させ、適当な方法で（例えば、標識により）抗体−
ベンゾジアゼピン複合体の形成を測定する。イムノアッ
セイは好ましくは不均一イムノアッセイとして実施さ
れ、特にドイツ特許出願公開 DE-OS 44 39 429またはDE
-OS 40 24 919 （図１参照）に記載されるようなクロマ
トグラフィー試験片の上で行うことが好適である。
【００１６】このような試験片は１枚の担体フォイル上
に連続して配置された吸収ゾーンを含むことが好まし
く、すなわち、それらはアナライト添加ゾーン（１）；
標識した結合相手と、場合により特異的結合部位（例え
ば捕捉ゾーンのためにビオチン）を有する結合相手、を
保持する結合体ゾーン（２）；アナライトもしくはアナ
ライト−抗体のための捕捉試薬または結合相手の特異的
結合部位のための特異的捕捉試薬（例えばストレプトア
ビジン）を保持する捕捉ゾーン（３）；および非捕捉標
識が測定される標的ゾーン（４）である。
に連続して配置された吸収ゾーンを含むことが好まし
く、すなわち、それらはアナライト添加ゾーン（１）；
標識した結合相手と、場合により特異的結合部位（例え
ば捕捉ゾーンのためにビオチン）を有する結合相手、を
保持する結合体ゾーン（２）；アナライトもしくはアナ
ライト−抗体のための捕捉試薬または結合相手の特異的
結合部位のための特異的捕捉試薬（例えばストレプトア
ビジン）を保持する捕捉ゾーン（３）；および非捕捉標
識が測定される標的ゾーン（４）である。
【００１７】採用するイムノアッセイがサンドイッチ原
理に基づくものである場合は、添加ゾーン上のアナライ
トが結合体ゾーンに接触すると、アナライトと標識抗体
との複合体が形成され、該複合体は、固相に結合されて
いるかまたは固相ゾーンに固定化され得る（この場合
は、ビオチン−ストレプトアビジンのごとき特異的結合
対により結合される）別の抗体と結合することができ
る。競合試験を採用する場合は、アナライトと標識アナ
ライト類似体が、捕捉ゾーンの固相に結合されているか
または特異的結合対により固相に結合される抗体につい
て競合する。
理に基づくものである場合は、添加ゾーン上のアナライ
トが結合体ゾーンに接触すると、アナライトと標識抗体
との複合体が形成され、該複合体は、固相に結合されて
いるかまたは固相ゾーンに固定化され得る（この場合
は、ビオチン−ストレプトアビジンのごとき特異的結合
対により結合される）別の抗体と結合することができ
る。競合試験を採用する場合は、アナライトと標識アナ
ライト類似体が、捕捉ゾーンの固相に結合されているか
または特異的結合対により固相に結合される抗体につい
て競合する。
【００１８】ＩＥＭＡ類似体試験原理に基づくイムノア
ッセイを採用することは好ましいことである。この試験
では、結合体ゾーンがアナライトに対して過剰の標識抗
体を保持している。過剰の標識抗体はアナライト類似体
によって捕捉ゾーンで捕捉され、一方、アナライト−標
識抗体複合体は標的ゾーンにおいて検出される。用いる
ことのできる標識は従来の標識であって、例えば酵素標
識、蛍光および色素標識、特に直接標識、中でも金属標
識があり、金標識が特に好ましいものである。このイム
ノアッセイはベンゾジアゼピンの代謝産物をも検出しう
る迅速で正確な結果を提供する。
ッセイを採用することは好ましいことである。この試験
では、結合体ゾーンがアナライトに対して過剰の標識抗
体を保持している。過剰の標識抗体はアナライト類似体
によって捕捉ゾーンで捕捉され、一方、アナライト−標
識抗体複合体は標的ゾーンにおいて検出される。用いる
ことのできる標識は従来の標識であって、例えば酵素標
識、蛍光および色素標識、特に直接標識、中でも金属標
識があり、金標識が特に好ましいものである。このイム
ノアッセイはベンゾジアゼピンの代謝産物をも検出しう
る迅速で正確な結果を提供する。
【００１９】本発明の別の主題は、本発明によるベンゾ
ジアゼピン−タンパク質結合体の製造方法である。この
方法は、式III ：
ジアゼピン−タンパク質結合体の製造方法である。この
方法は、式III ：
【化１５】 のベンゾジアゼピン−リンカー化合物を少なくとも１個
のチオール基を含む担体物質化合物、好ましくはポリペ
プチド化合物と反応させて式Ｉの化合物を製造する点に
特徴がある。ポリペプチド化合物それ自体がＳＨ基を含
むこともできる。しかし、当業者に知られた方法により
ポリペプチド化合物にＳＨ基を合成的に組み入れること
も可能である。式III 中の基Ｒ3 、Ｘおよびｎは式Ｉに
おいて定義された意味を有し、Ｒ1'は水素、メチルまた
はＲ' であり、Ｒ2'は水素、ＯＨまたはＯＲ' であり、
その際Ｒ1'かＲ2'のどちらかがＲ' 基を含み、Ｒ' は式
IV：
のチオール基を含む担体物質化合物、好ましくはポリペ
プチド化合物と反応させて式Ｉの化合物を製造する点に
特徴がある。ポリペプチド化合物それ自体がＳＨ基を含
むこともできる。しかし、当業者に知られた方法により
ポリペプチド化合物にＳＨ基を合成的に組み入れること
も可能である。式III 中の基Ｒ3 、Ｘおよびｎは式Ｉに
おいて定義された意味を有し、Ｒ1'は水素、メチルまた
はＲ' であり、Ｒ2'は水素、ＯＨまたはＯＲ' であり、
その際Ｒ1'かＲ2'のどちらかがＲ' 基を含み、Ｒ' は式
IV：
【化１６】 の基である。
【００２０】式III のベンゾジアゼピン−リンカー化合
物は新規化合物である。それゆえ、本発明の他の主題
は、これらの化合物ならびに本発明によるベンゾジアゼ
ピン−タンパク質結合体を製造するためのその使用に関
する。本発明の別の主題は、式III のベンゾジアゼピン
−リンカー化合物の製造方法である。
物は新規化合物である。それゆえ、本発明の他の主題
は、これらの化合物ならびに本発明によるベンゾジアゼ
ピン−タンパク質結合体を製造するためのその使用に関
する。本発明の別の主題は、式III のベンゾジアゼピン
−リンカー化合物の製造方法である。
【００２１】式III において、Ｒ2'がＯＲ' 基であり、
そしてＲ1'が水素またはメチル基であるとき、該化合物
は次の反応式にしたがって製造される。
そしてＲ1'が水素またはメチル基であるとき、該化合物
は次の反応式にしたがって製造される。
【化１７】
【００２２】式Ｖのベンゾジアゼピンは、例えば、ｍ−
クロロ過安息香酸により式VIの化合物に酸化され、そし
て構造的転位を起こして無水酢酸によりアシル化される
（式VII の化合物）。この種の化合物は米国特許第4,08
3,948 号に記述されている。続いて、酸触媒の存在下に
Ｎ−保護エタノールアミンまたはプロパノールアミンを
用いて反応を行う（式VIIIおよびIXの化合物）。その
後、例えばエトキシカルボニルマレイミドを反応に用い
ると、式III （Ｒ2'＝ＯＲ' ）のベンゾジアゼピン−３
−オキシエチルマレイミドおよび／またはオキシプロピ
ルマレイミドが得られる。
クロロ過安息香酸により式VIの化合物に酸化され、そし
て構造的転位を起こして無水酢酸によりアシル化される
（式VII の化合物）。この種の化合物は米国特許第4,08
3,948 号に記述されている。続いて、酸触媒の存在下に
Ｎ−保護エタノールアミンまたはプロパノールアミンを
用いて反応を行う（式VIIIおよびIXの化合物）。その
後、例えばエトキシカルボニルマレイミドを反応に用い
ると、式III （Ｒ2'＝ＯＲ' ）のベンゾジアゼピン−３
−オキシエチルマレイミドおよび／またはオキシプロピ
ルマレイミドが得られる。
【００２３】式III において、Ｒ1'がＲ' に等しいとき
は、式Ｘのベンゾジアゼピン化合物をＮ−保護ブロモエ
チルアミンでアルキル化し、アミド基を加水分解切断し
てアミン（式XIの化合物）を得る。その後、例えばエト
キシカルボニルマレイミドとの反応により、式III の１
−エチルマレイミドが得られる。
は、式Ｘのベンゾジアゼピン化合物をＮ−保護ブロモエ
チルアミンでアルキル化し、アミド基を加水分解切断し
てアミン（式XIの化合物）を得る。その後、例えばエト
キシカルボニルマレイミドとの反応により、式III の１
−エチルマレイミドが得られる。
【化１８】
【００２４】
【発明の実施の形態】実施例１ 免疫化および抗血清の試験 ５匹のヒツジを、フロイントアジュバント中の実施例３
または４の免疫原により免疫化した。各動物に投与した
量は500 μg であった。免疫化の手順は４週おきに６ヵ
月またはそれ以上にわたって繰り返した。各動物から抗
血清を１ヵ月に１回採取し、ベンゾジアゼピン抗体の存
在を調べた。この測定方法については実施例２に記述す
る。その後の試験のために、１：10000 またはそれ以上
の希釈率で十分に高い測定シグナル（30〜60分の発色後
に少なくとも100 mA）を与える抗血清を選択した。免疫
化を開始してから３ヵ月後に、すべての動物の血清が十
分に高いシグナルを示した。
または４の免疫原により免疫化した。各動物に投与した
量は500 μg であった。免疫化の手順は４週おきに６ヵ
月またはそれ以上にわたって繰り返した。各動物から抗
血清を１ヵ月に１回採取し、ベンゾジアゼピン抗体の存
在を調べた。この測定方法については実施例２に記述す
る。その後の試験のために、１：10000 またはそれ以上
の希釈率で十分に高い測定シグナル（30〜60分の発色後
に少なくとも100 mA）を与える抗血清を選択した。免疫
化を開始してから３ヵ月後に、すべての動物の血清が十
分に高いシグナルを示した。
【００２５】実施例２ 異なるベンゾジアゼピンの検出 使用した溶液 コーティング緩衝液：50 mM 重炭酸ナトリウム、0.09 %
アジ化ナトリウム、pH 9.6 インキュベート緩衝液：10 mM リン酸ナトリウム、0.1
% Tween 20 (Brenntag製、カタログ番号 460761)、0.9
% NaCl、1 % Crotein C (CRODA GmbH 製、カタログ番号
38241422)、pH 7.4 洗浄溶液：0.9 % NaCl、0.1 % Tween 20 基質溶液：Enzymun-Test基質溶液 (Boehringer Mannhei
m GmbH、カタログ番号85742)は 2 mg/mlのバニリンを含
むリン酸クエン酸緩衝液 pH 4.4中に1.9 mM ABTS およ
び 3.2 mM 過ホウ酸ナトリウムを含む。
アジ化ナトリウム、pH 9.6 インキュベート緩衝液：10 mM リン酸ナトリウム、0.1
% Tween 20 (Brenntag製、カタログ番号 460761)、0.9
% NaCl、1 % Crotein C (CRODA GmbH 製、カタログ番号
38241422)、pH 7.4 洗浄溶液：0.9 % NaCl、0.1 % Tween 20 基質溶液：Enzymun-Test基質溶液 (Boehringer Mannhei
m GmbH、カタログ番号85742)は 2 mg/mlのバニリンを含
むリン酸クエン酸緩衝液 pH 4.4中に1.9 mM ABTS およ
び 3.2 mM 過ホウ酸ナトリウムを含む。
【００２６】手順 コーティング ：コーティング緩衝液中に 5μg/mlタンパ
ク質の濃度で溶解したストレプトアビジン (Boehringer
Mannheim GmbH、カタログ番号 976539)をマイクロタイ
タープレート (Maxisorp F96、Nunc製、カタログ番号 4
-42404) にコーティングするにあたって、この溶液 100
μl をマイクロタイタープレートの各ウェルに分注し
た。室温で１時間インキュベートした後、溶液を揺すっ
て捨て、プレートを洗浄溶液で３回洗った。
ク質の濃度で溶解したストレプトアビジン (Boehringer
Mannheim GmbH、カタログ番号 976539)をマイクロタイ
タープレート (Maxisorp F96、Nunc製、カタログ番号 4
-42404) にコーティングするにあたって、この溶液 100
μl をマイクロタイタープレートの各ウェルに分注し
た。室温で１時間インキュベートした後、溶液を揺すっ
て捨て、プレートを洗浄溶液で３回洗った。
【００２７】デロラゼパム(delorazepam) −ビオチン結
合体（３）の合成：下記化合物（２）のトリフルオロ酢
酸塩 92.4 mg (0.2 mmol) をＴＨＦ 10 mlに溶解し、Ｄ
ＭＦ 5 ml に溶解したビオチン−ＤＤＳ (PCT/EP 94/00
195 により製造) 150.6 mg (0.24 mmol)の溶液を加え
た。この反応混合物にトリエチルアミン 50 μl を加
え、その後20℃で16時間攪拌した。続いて、溶媒をロー
タリーエバポレーターでオイルポンプ減圧下に蒸発さ
せ、残留物をクロロホルム 20 ml中に取り上げた。この
混合物を飽和NaHCO3 20 mlで２回洗い、次いでロータリ
ーエバポレーターでクロロホルムを除去した。固体の生
成物（３）は酢酸エチル約 5ml で温浸(digest)し、取
り出して、乾燥器内で一晩乾燥させた。 収量：21 mg （理論量の12 %）、無色の微結晶質粉末 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル／メタノール 1/1(v/
v);Ｒf ＝0.48 デロラゼパム−１−ＤＤＳ−ビオチン結合体（３）を10
ng/mlの濃度でインキュベート緩衝液中に溶解した。こ
の溶液 100μl を用いてマイクロタイタープレートの各
ウェルにコーティングし、その後上記のようにインキュ
ベートし、洗浄した。
合体（３）の合成：下記化合物（２）のトリフルオロ酢
酸塩 92.4 mg (0.2 mmol) をＴＨＦ 10 mlに溶解し、Ｄ
ＭＦ 5 ml に溶解したビオチン−ＤＤＳ (PCT/EP 94/00
195 により製造) 150.6 mg (0.24 mmol)の溶液を加え
た。この反応混合物にトリエチルアミン 50 μl を加
え、その後20℃で16時間攪拌した。続いて、溶媒をロー
タリーエバポレーターでオイルポンプ減圧下に蒸発さ
せ、残留物をクロロホルム 20 ml中に取り上げた。この
混合物を飽和NaHCO3 20 mlで２回洗い、次いでロータリ
ーエバポレーターでクロロホルムを除去した。固体の生
成物（３）は酢酸エチル約 5ml で温浸(digest)し、取
り出して、乾燥器内で一晩乾燥させた。 収量：21 mg （理論量の12 %）、無色の微結晶質粉末 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル／メタノール 1/1(v/
v);Ｒf ＝0.48 デロラゼパム−１−ＤＤＳ−ビオチン結合体（３）を10
ng/mlの濃度でインキュベート緩衝液中に溶解した。こ
の溶液 100μl を用いてマイクロタイタープレートの各
ウェルにコーティングし、その後上記のようにインキュ
ベートし、洗浄した。
【００２８】
【化１９】
【００２９】抗体とハプテンとの反応：試験すべき各ベ
ンゾジアゼピン化合物から希釈系列をインキュベート緩
衝液中に調製した。この系列は最高濃度から出発して希
釈段階１：３で希釈し、合計１０の異なる濃度を含んで
いた。最高濃度はテマゼパム、オキサゼパム、ロラゼパ
ム、ブロマゼパム、アルプラゾラム、ヒドロキシ−アル
プラゾラム、ヒドロキシ−トリアゾラムおよびアミノ−
フルニトラゼパムの場合が１μg/mlであった。そして、
テマゼパム−グルクロニド、2-アミノ-4- クロロベンゾ
フェノン、オキサゼパムグルクロニド、ロラゼパムグル
クロニドおよび2-アミノ-2',4-ジクロロベンゾフェノン
の場合の最高濃度は10μg/mlとした。比較対照としてハ
プテンを含まないインキュベート緩衝液を使用した。こ
れらの溶液 50 μl はプレートのウェル内で調製した。
抗血清はインキュベート緩衝液を用いて少なくとも１：
10000 の関係で希釈した。この希釈血清 50 μl をハプ
テン含有ウェルに加え、混合した。従って、ハプテンと
試験抗体の最終濃度は用いた溶液の１／２の濃度となっ
た。インキュベーション（60分）および洗浄は上記のと
おりに行った。
ンゾジアゼピン化合物から希釈系列をインキュベート緩
衝液中に調製した。この系列は最高濃度から出発して希
釈段階１：３で希釈し、合計１０の異なる濃度を含んで
いた。最高濃度はテマゼパム、オキサゼパム、ロラゼパ
ム、ブロマゼパム、アルプラゾラム、ヒドロキシ−アル
プラゾラム、ヒドロキシ−トリアゾラムおよびアミノ−
フルニトラゼパムの場合が１μg/mlであった。そして、
テマゼパム−グルクロニド、2-アミノ-4- クロロベンゾ
フェノン、オキサゼパムグルクロニド、ロラゼパムグル
クロニドおよび2-アミノ-2',4-ジクロロベンゾフェノン
の場合の最高濃度は10μg/mlとした。比較対照としてハ
プテンを含まないインキュベート緩衝液を使用した。こ
れらの溶液 50 μl はプレートのウェル内で調製した。
抗血清はインキュベート緩衝液を用いて少なくとも１：
10000 の関係で希釈した。この希釈血清 50 μl をハプ
テン含有ウェルに加え、混合した。従って、ハプテンと
試験抗体の最終濃度は用いた溶液の１／２の濃度となっ
た。インキュベーション（60分）および洗浄は上記のと
おりに行った。
【００３０】検出用の結合体との反応：ハプテン−ビオ
チン結合体により固相に結合された抗体を検出するため
に、西洋ワサビペルオキシダーゼとヒツジＩｇＧに対す
るウサギ抗体との結合体を用いた。この検出用結合体は
インキュベート緩衝液を用いて 20/min/unit/ml のペル
オキシダーゼ活性へと希釈し、この溶液をウェルに分配
した（100 μl/ウェル）。インキュベーション（60分）
および洗浄は上記のとおりに行った。
チン結合体により固相に結合された抗体を検出するため
に、西洋ワサビペルオキシダーゼとヒツジＩｇＧに対す
るウサギ抗体との結合体を用いた。この検出用結合体は
インキュベート緩衝液を用いて 20/min/unit/ml のペル
オキシダーゼ活性へと希釈し、この溶液をウェルに分配
した（100 μl/ウェル）。インキュベーション（60分）
および洗浄は上記のとおりに行った。
【００３１】基質の反応：すべてのウェルに基質溶液 1
00μl を注入し、ハプテンを含まないサンプルの発色が
十分と思えるまで振とうしながらインキュベートした。
その後、ウェルの吸光度を405/492 nmの波長で示差測定
として測定した。
00μl を注入し、ハプテンを含まないサンプルの発色が
十分と思えるまで振とうしながらインキュベートした。
その後、ウェルの吸光度を405/492 nmの波長で示差測定
として測定した。
【００３２】評価 ハプテンを含まないブランク値に対して測定シグナルの
少なくとも２０％減少を陽性の結果（用いたベンゾジア
ゼピンの明白な検出）と見なした。このシグナル値（カ
ットオフ値）に正確に一致するベンゾジアゼピン濃度
は、試験した化合物のそれぞれのハプテン系列の隣接標
準間への直線的内挿法により決定した。
少なくとも２０％減少を陽性の結果（用いたベンゾジア
ゼピンの明白な検出）と見なした。このシグナル値（カ
ットオフ値）に正確に一致するベンゾジアゼピン濃度
は、試験した化合物のそれぞれのハプテン系列の隣接標
準間への直線的内挿法により決定した。
【００３３】結果 表１は、各種ベンゾジアゼピン薬剤とその代謝産物誘導
体のカットオフ値を示す。これらの例は３または５匹の
ヒツジの抗血清を示す。血清サンプルは免疫化の開始か
ら１２ヵ月後に採取したものである。これらの数字は、
完全に異なる構造を有する広範なベンゾジアゼピン類
が、３種すべての抗血清を用いて非常に良い感度から十
分な感度で検出され得ることを明らかに示している。表１ ベンゾジアゼピンの検出 この表は、競合ＥＬＩＳＡ試験において、ハプテンの存
在しないブランク値に対してシグナルの２０％減少をも
たらしたベンゾジアゼピン濃度 (ng/ml)を示す。
体のカットオフ値を示す。これらの例は３または５匹の
ヒツジの抗血清を示す。血清サンプルは免疫化の開始か
ら１２ヵ月後に採取したものである。これらの数字は、
完全に異なる構造を有する広範なベンゾジアゼピン類
が、３種すべての抗血清を用いて非常に良い感度から十
分な感度で検出され得ることを明らかに示している。表１ ベンゾジアゼピンの検出 この表は、競合ＥＬＩＳＡ試験において、ハプテンの存
在しないブランク値に対してシグナルの２０％減少をも
たらしたベンゾジアゼピン濃度 (ng/ml)を示す。
【００３４】
【表１】 動物番号 （採用した血清希釈率） ベンゾジアゼピン １ ２ ３ (1:14000) (1:16500) (1:11500) テマゼパム 0.13 0.24 0.35 2-アミノ-4- クロロベンゾフェノン 64 68 69 テマゼパム- グルクロニド 2.1 測定せず 測定せず オキサゼパム 0.29 0.26 0.41 オキサゼパム- グルクロニド 7.5 8.7 11.0 ロラゼパム 1.7 1.3 2.0 ロラゼパム- グルクロニド 80 7.3 49 2-アミノ-2',4-ジクロロベンゾフェノン 270 160 130 ブロマゼパム 5.5 150 25 アルプラゾラム 0.09 0.54 0.10 ヒドロキシ- アルプラゾラム 0.47 5.0 0.34 ヒドロキシ- トリアゾラム 3.0 15 9.1 アミノ- フルニトラゼパム 6.0 0.42 4.1
【００３５】実施例３ 7-クロロ-3-[2-(N- マレインイミド) エチル] オキシ-1
- メチル-5- フェニル-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-2(3H)
オン(IIIa)の合成 １．7-クロロ-1- メチル-5- フェニル-1H-1,4-ベンゾジ
アゼピン-2(3H)オン-4- オキシド(VI) 7-クロロ-1- メチル-5- フェニル-1H-1,4-ベンゾジアゼ
ピン-2(3H)オン（Sigma 社製、No. T 8275）5.70 g(20
mmol) をジクロロメタン150 ml中に溶解し、20℃で攪拌
しながら3-クロロ- ペルオキシ安息香酸（Aldrich 社
製、No. 27,303-1）13.8 g(40 mmol) を加えた。溶液の
攪拌を20℃で１時間半続けた。その後、反応混合物を最
初は 5% NH3 200 mlで、その後は 0.1N NaOH 200μl で
洗った。溶媒をロータリーエバポレーターで除き、油状
残留物を40〜45℃に加熱しながらイソプロパノール25 m
l に溶解した。次いで、室温へ徐々に冷やしながら生成
物を結晶化させた。結晶化開始の２時間後に、固体の生
成物（２）を取り出し、イソプロパノール 50 mlとジイ
ソプロピルエーテル 50 mlで洗った。次に生成物を乾燥
器内でパラフィン上にて一晩乾燥させた。 収量：3.30 g (理論量の55%)、無色の結晶 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル／石油エーテル 2/1
(v/v); Ｒf ＝0.41
- メチル-5- フェニル-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-2(3H)
オン(IIIa)の合成 １．7-クロロ-1- メチル-5- フェニル-1H-1,4-ベンゾジ
アゼピン-2(3H)オン-4- オキシド(VI) 7-クロロ-1- メチル-5- フェニル-1H-1,4-ベンゾジアゼ
ピン-2(3H)オン（Sigma 社製、No. T 8275）5.70 g(20
mmol) をジクロロメタン150 ml中に溶解し、20℃で攪拌
しながら3-クロロ- ペルオキシ安息香酸（Aldrich 社
製、No. 27,303-1）13.8 g(40 mmol) を加えた。溶液の
攪拌を20℃で１時間半続けた。その後、反応混合物を最
初は 5% NH3 200 mlで、その後は 0.1N NaOH 200μl で
洗った。溶媒をロータリーエバポレーターで除き、油状
残留物を40〜45℃に加熱しながらイソプロパノール25 m
l に溶解した。次いで、室温へ徐々に冷やしながら生成
物を結晶化させた。結晶化開始の２時間後に、固体の生
成物（２）を取り出し、イソプロパノール 50 mlとジイ
ソプロピルエーテル 50 mlで洗った。次に生成物を乾燥
器内でパラフィン上にて一晩乾燥させた。 収量：3.30 g (理論量の55%)、無色の結晶 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル／石油エーテル 2/1
(v/v); Ｒf ＝0.41
【００３６】２．3-アセトキシ-7- クロロ-1- メチル-5
- フェニル-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-2(3H)オン(VII) 化合物VI 3.0 g(10 mmol) を THF 30 ml＋無水酢酸 60
ml中で５時間加熱した。次に、この溶液をロータリーエ
バポレーターで濃縮し、結晶質残留物をイソプロピルエ
ーテル 50 mlで温浸した。生成物を取り出して、高減圧
下に50℃で32時間乾燥させた。 収量：3.27 g (理論量の99%)、無色の結晶 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル／石油エーテル 2/1
(v/v); Ｒf ＝0.50
- フェニル-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-2(3H)オン(VII) 化合物VI 3.0 g(10 mmol) を THF 30 ml＋無水酢酸 60
ml中で５時間加熱した。次に、この溶液をロータリーエ
バポレーターで濃縮し、結晶質残留物をイソプロピルエ
ーテル 50 mlで温浸した。生成物を取り出して、高減圧
下に50℃で32時間乾燥させた。 収量：3.27 g (理論量の99%)、無色の結晶 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル／石油エーテル 2/1
(v/v); Ｒf ＝0.50
【００３７】３．N-(t- ブトキシカルボニル) エタノー
ルアミン エタノールアミン (Fluka 社製、No. 02400) 30.5 g(0.
5 mol)をジオキサン／水 1/1(v/v) 300 mlに溶解し、氷
上で冷やしながらジオキサン 150 ml に溶解したジ-t-
ブチルジカーボネート (Fluka 社製、No. 34659) 109 g
(0.5 mol) の溶液を滴下した。氷冷を止めて、この溶液
を攪拌しながら室温へ至らせた。さらに18時間後、溶液
をロータリーエバポレーターで濃縮し、油状残留物を酢
酸エチル250 ml に溶解し、硫酸ナトリウム約20 gにて
乾燥させた。濾過後、この溶液を再濃縮し、油状残留物
を高減圧下に３時間乾燥させた。 収量：80.2 g (理論量の99%)、無色の油 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル／メタノール 1/1 (v/
v)；ニンヒドリン溶液の噴霧により検出；Ｒf ＝0.74
ルアミン エタノールアミン (Fluka 社製、No. 02400) 30.5 g(0.
5 mol)をジオキサン／水 1/1(v/v) 300 mlに溶解し、氷
上で冷やしながらジオキサン 150 ml に溶解したジ-t-
ブチルジカーボネート (Fluka 社製、No. 34659) 109 g
(0.5 mol) の溶液を滴下した。氷冷を止めて、この溶液
を攪拌しながら室温へ至らせた。さらに18時間後、溶液
をロータリーエバポレーターで濃縮し、油状残留物を酢
酸エチル250 ml に溶解し、硫酸ナトリウム約20 gにて
乾燥させた。濾過後、この溶液を再濃縮し、油状残留物
を高減圧下に３時間乾燥させた。 収量：80.2 g (理論量の99%)、無色の油 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル／メタノール 1/1 (v/
v)；ニンヒドリン溶液の噴霧により検出；Ｒf ＝0.74
【００３８】４．3-[2-(t-ブトキシカルボニルアミノ)
エチル] オキシ-7- クロロ-1- メチル-5-フェニル-1H-
1,4-ベンゾジアゼピン-2(3H)オン(VIII) 化合物VII 1.5 g(5 mmol) をクロロホルム（酸化アルミ
ニウムにて乾燥）50 ml 中に溶解した。20℃で激しく攪
拌しながら、HCl ガスを一定の流速（約40〜50cm3/mi
n）で毛細管から溶液の中に10分間送り込んだ。次い
で、混合物を20℃で18時間攪拌した。その後、反応溶液
をロータリーエバポレーターで濃縮し、乾燥させた。固
体残留物をクロロホルム（酸化アルミニウムにて乾燥）
20 ml 中に溶解し、同一溶媒 10 mlに溶解したN-(t- ブ
トキシカルボニル) エタノールアミン960 mg(6 mmol)を
加えた。nafion-NR 50 (Aldrich 社製、No. 30,938-9)
500 mgを加え、20℃で１時間攪拌した。その後、溶液を
濾過し、水 50 μl ずつで２回洗い、無水硫酸ナトリウ
ム約 5 gにて乾燥させた。溶媒をロータリーエバポレー
ターで除去した。その後、粗生成物を最低容量の酢酸エ
チル／石油エーテル 2/1(v/v) に少しだけ加温しながら
溶解し、シリカゲル（カラム：４×68 cm 、溶離剤：酢
酸エチル／石油エーテル 2/1(v/v) ）を用いたカラムク
ロマトグラフィーにより精製した。対応する画分を集
め、溶媒をロータリーエバポレーターで除き、結晶質生
成物を高減圧下に50℃で２時間乾燥させた。 収量：1.22 g (理論量の55%)、無色の油 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル／石油エーテル 2/1
(v/v); Ｒf ＝0.44
エチル] オキシ-7- クロロ-1- メチル-5-フェニル-1H-
1,4-ベンゾジアゼピン-2(3H)オン(VIII) 化合物VII 1.5 g(5 mmol) をクロロホルム（酸化アルミ
ニウムにて乾燥）50 ml 中に溶解した。20℃で激しく攪
拌しながら、HCl ガスを一定の流速（約40〜50cm3/mi
n）で毛細管から溶液の中に10分間送り込んだ。次い
で、混合物を20℃で18時間攪拌した。その後、反応溶液
をロータリーエバポレーターで濃縮し、乾燥させた。固
体残留物をクロロホルム（酸化アルミニウムにて乾燥）
20 ml 中に溶解し、同一溶媒 10 mlに溶解したN-(t- ブ
トキシカルボニル) エタノールアミン960 mg(6 mmol)を
加えた。nafion-NR 50 (Aldrich 社製、No. 30,938-9)
500 mgを加え、20℃で１時間攪拌した。その後、溶液を
濾過し、水 50 μl ずつで２回洗い、無水硫酸ナトリウ
ム約 5 gにて乾燥させた。溶媒をロータリーエバポレー
ターで除去した。その後、粗生成物を最低容量の酢酸エ
チル／石油エーテル 2/1(v/v) に少しだけ加温しながら
溶解し、シリカゲル（カラム：４×68 cm 、溶離剤：酢
酸エチル／石油エーテル 2/1(v/v) ）を用いたカラムク
ロマトグラフィーにより精製した。対応する画分を集
め、溶媒をロータリーエバポレーターで除き、結晶質生
成物を高減圧下に50℃で２時間乾燥させた。 収量：1.22 g (理論量の55%)、無色の油 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル／石油エーテル 2/1
(v/v); Ｒf ＝0.44
【００３９】５．3-(2- アミノエチル) オキシ-7- クロ
ロ-1- メチル-5- フェニル-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-2
(3H)オン塩酸塩(IX) 化合物VIII 1.11 g(2.5 mmol) を 2 M HClジオキサン溶
液 10 mlに溶解したところ、2,3 分以内に油状析出物が
生じた。この懸濁液を20℃で30分間放置し、溶媒をデカ
ントし、残留物を酢酸エチル 20 mlで温浸したところ、
生成物が固化した。この懸濁液を20℃で１時間攪拌し、
塩酸塩を取り出して高減圧下に40℃で４時間乾燥させ
た。 収量：910 mg (理論量の96%)、無色の微結晶質粉末 ＴＬＣ：シリカゲル、n-ブタノール／氷酢酸／水 50/15
/25 (v/v/v);Ｒf ＝0.64
ロ-1- メチル-5- フェニル-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-2
(3H)オン塩酸塩(IX) 化合物VIII 1.11 g(2.5 mmol) を 2 M HClジオキサン溶
液 10 mlに溶解したところ、2,3 分以内に油状析出物が
生じた。この懸濁液を20℃で30分間放置し、溶媒をデカ
ントし、残留物を酢酸エチル 20 mlで温浸したところ、
生成物が固化した。この懸濁液を20℃で１時間攪拌し、
塩酸塩を取り出して高減圧下に40℃で４時間乾燥させ
た。 収量：910 mg (理論量の96%)、無色の微結晶質粉末 ＴＬＣ：シリカゲル、n-ブタノール／氷酢酸／水 50/15
/25 (v/v/v);Ｒf ＝0.64
【００４０】６．7-クロロ-3-[2-(N- マレインイミド)
エチル] オキシ-1- メチル-5- フェニル-1H-1,4-ベンゾ
ジアゼピン-2(3H)オン(IIIa) 化合物IX 760 mg(2 mmol) を飽和重炭酸ナトリウム溶液
10 ml中に20℃で懸濁し、攪拌しながらN-メトキシカル
ボニルマレインイミド (Fluka 社製、No. 64940) 340 m
g(2 mmol) を加えた。約2,3 分後、油状の析出物が生じ
た。さらに10分後、テトラヒドロフラン 15 mlを加え、
20℃でさらに45分攪拌した。その後、濃塩酸を使って反
応混合物のpHを6.0 に調整し、次いでこれを酢酸エチル
50 mlで抽出し、抽出物を水２×50 ml で洗った。有機
溶液を硫酸ナトリウム約 5 gで乾燥させ、ロータリーエ
バポレーターで濃縮し、残留する粗生成物をシリカゲル
（カラム：2.5 ×50 cm 、溶離剤：酢酸エチル）を用い
たカラムクロマトグラフィーにより精製した。対応する
画分を集め、溶媒をロータリーエバポレーターで除き、
残留する結晶質マレインイミドを高減圧下に40℃で３時
間乾燥させた。 収量：315 mg (理論量の37%)、無色の微結晶質固体 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル；Ｒf ＝0.491 H-NMR(CDCl3): d(ppm)=3.37 (s,3H;-CH3), 3.91/4.14
(m,4H;-CH2-CH2-), 4.87(s,1H;-C3H-), 6.69 (s,2H;-CH
=CH-), 7.48 (m,8H; 芳香族H)
エチル] オキシ-1- メチル-5- フェニル-1H-1,4-ベンゾ
ジアゼピン-2(3H)オン(IIIa) 化合物IX 760 mg(2 mmol) を飽和重炭酸ナトリウム溶液
10 ml中に20℃で懸濁し、攪拌しながらN-メトキシカル
ボニルマレインイミド (Fluka 社製、No. 64940) 340 m
g(2 mmol) を加えた。約2,3 分後、油状の析出物が生じ
た。さらに10分後、テトラヒドロフラン 15 mlを加え、
20℃でさらに45分攪拌した。その後、濃塩酸を使って反
応混合物のpHを6.0 に調整し、次いでこれを酢酸エチル
50 mlで抽出し、抽出物を水２×50 ml で洗った。有機
溶液を硫酸ナトリウム約 5 gで乾燥させ、ロータリーエ
バポレーターで濃縮し、残留する粗生成物をシリカゲル
（カラム：2.5 ×50 cm 、溶離剤：酢酸エチル）を用い
たカラムクロマトグラフィーにより精製した。対応する
画分を集め、溶媒をロータリーエバポレーターで除き、
残留する結晶質マレインイミドを高減圧下に40℃で３時
間乾燥させた。 収量：315 mg (理論量の37%)、無色の微結晶質固体 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル；Ｒf ＝0.491 H-NMR(CDCl3): d(ppm)=3.37 (s,3H;-CH3), 3.91/4.14
(m,4H;-CH2-CH2-), 4.87(s,1H;-C3H-), 6.69 (s,2H;-CH
=CH-), 7.48 (m,8H; 芳香族H)
【００４１】実施例４ 7-クロロ-5-(2-クロロフェニル)-1-[2-(N-マレインイミ
ド) エチル] -1H-1,4-ベンゾジアゼピン-2(3H)オン(III
b)の合成 １．N-(t- ブトキシカルボニル)-2-ブロモエチルアミン 2-ブロモエチルアミン臭化水素酸塩 (Aldrich 社製、N
o. B6,570-5) 10.2 g(50 mmol) をジオキサン／水 1/1
(v/v) 100 ml中に溶解し、トリエチルアミン 15g (20.6
ml) を加えた。この混合物を０℃に冷し、ジオキサン
15 mlに溶解したジ-t- ブチルジカーボネート 10.9 g(5
0 mmol)の溶液を攪拌しながら滴下した。この反応混合
物を徐々に室温へ至らしめ、攪拌を18時間続けた。溶媒
をロータリーエバポレーターで除き、残留物を酢酸エチ
ル 200 ml に取り上げた。これを飽和重炭酸ナトリウム
溶液 100 ml ずつで３回、次に水 100 ml ずつで２回洗
った。有機溶液を硫酸ナトリウム約 20 g で乾燥させ、
溶媒をロータリーエバポレーターで除き、油状生成物を
高減圧下に40℃で３時間乾燥させた。 収量：12.0 g (理論量の98%)、わずかに褐色がかった粘
性の油 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル；Ｒf ＝0.90
ド) エチル] -1H-1,4-ベンゾジアゼピン-2(3H)オン(III
b)の合成 １．N-(t- ブトキシカルボニル)-2-ブロモエチルアミン 2-ブロモエチルアミン臭化水素酸塩 (Aldrich 社製、N
o. B6,570-5) 10.2 g(50 mmol) をジオキサン／水 1/1
(v/v) 100 ml中に溶解し、トリエチルアミン 15g (20.6
ml) を加えた。この混合物を０℃に冷し、ジオキサン
15 mlに溶解したジ-t- ブチルジカーボネート 10.9 g(5
0 mmol)の溶液を攪拌しながら滴下した。この反応混合
物を徐々に室温へ至らしめ、攪拌を18時間続けた。溶媒
をロータリーエバポレーターで除き、残留物を酢酸エチ
ル 200 ml に取り上げた。これを飽和重炭酸ナトリウム
溶液 100 ml ずつで３回、次に水 100 ml ずつで２回洗
った。有機溶液を硫酸ナトリウム約 20 g で乾燥させ、
溶媒をロータリーエバポレーターで除き、油状生成物を
高減圧下に40℃で３時間乾燥させた。 収量：12.0 g (理論量の98%)、わずかに褐色がかった粘
性の油 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル；Ｒf ＝0.90
【００４２】２．7-クロロ-1-[2-(t- ブトキシカルボニ
ルアミノ) エチル]-5-(2- クロロフェニル)-1H-1,4- ベ
ンゾジアゼピン-2(3H)オン 7-クロロ-5-(2-クロロフェニル)-1H-1,4- ベンゾジアゼ
ピン-2(3H)オン (Sigma 社製、No. D 7662) 3.05 g(10
mmol) をジメチルホルムアミド 20 ml中に溶解し、空気
を排除して（窒素雰囲気下）０℃に冷却した。水素化ナ
トリウム（パラフィン油に懸濁したもの、Merck 社製、
No. 818023) 480 mg(20 mmol) をわずかに黄色の溶液に
添加し、その後０℃で10分間攪拌した。この反応混合物
の色が橙褐色に変化した。続いて、この溶液にN-(t- ブ
トキシカルボニル)-2-ブロモエチルアミン 2.69 g(12 m
mol)を加え、徐々に室温へ至らしめた。この溶液を20℃
で18時間攪拌した後、混合物を氷上に注ぎ、生成物をシ
リカゲル（カラム：４×68cm 、溶離剤：酢酸エチル）
を用いた分離用カラムクロマトグラフィーにより精製し
た。対応する画分を集め、溶媒をロータリーエバポレー
ターで除き、残留する固体を高減圧下に40℃で１時間乾
燥させた。 収量：2.66 g (理論量の59%)、無色の微結晶質粉末 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル；Ｒf ＝0.6
ルアミノ) エチル]-5-(2- クロロフェニル)-1H-1,4- ベ
ンゾジアゼピン-2(3H)オン 7-クロロ-5-(2-クロロフェニル)-1H-1,4- ベンゾジアゼ
ピン-2(3H)オン (Sigma 社製、No. D 7662) 3.05 g(10
mmol) をジメチルホルムアミド 20 ml中に溶解し、空気
を排除して（窒素雰囲気下）０℃に冷却した。水素化ナ
トリウム（パラフィン油に懸濁したもの、Merck 社製、
No. 818023) 480 mg(20 mmol) をわずかに黄色の溶液に
添加し、その後０℃で10分間攪拌した。この反応混合物
の色が橙褐色に変化した。続いて、この溶液にN-(t- ブ
トキシカルボニル)-2-ブロモエチルアミン 2.69 g(12 m
mol)を加え、徐々に室温へ至らしめた。この溶液を20℃
で18時間攪拌した後、混合物を氷上に注ぎ、生成物をシ
リカゲル（カラム：４×68cm 、溶離剤：酢酸エチル）
を用いた分離用カラムクロマトグラフィーにより精製し
た。対応する画分を集め、溶媒をロータリーエバポレー
ターで除き、残留する固体を高減圧下に40℃で１時間乾
燥させた。 収量：2.66 g (理論量の59%)、無色の微結晶質粉末 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル；Ｒf ＝0.6
【００４３】３．1-[2- アミノエチル]-7-クロロ-5-(2-
クロロフェニル)-1H-1,4- ベンゾジアゼピン-2(3H)オン
・トリフルオロ酢酸塩(XI) 上記２の化合物 2.24 g(5 mmol) を酢酸エチル 50 mlに
溶解し、０℃に冷却した。トリフルオロ酢酸 10 mlを攪
拌しながら滴下し、攪拌をさらに30分続けた。その後、
酸と溶媒をロータリーエバポレーターで除き、生成物XI
を高減圧下に40℃で５時間乾燥させた。 収量：2.32 g (理論量の100%) 、わずかに黄色がかった
微結晶質粉末 ＴＬＣ：シリカゲル、n-ブタノール／氷酢酸／水 50/15
/25 (v/v/v);Ｒf ＝0.74
クロロフェニル)-1H-1,4- ベンゾジアゼピン-2(3H)オン
・トリフルオロ酢酸塩(XI) 上記２の化合物 2.24 g(5 mmol) を酢酸エチル 50 mlに
溶解し、０℃に冷却した。トリフルオロ酢酸 10 mlを攪
拌しながら滴下し、攪拌をさらに30分続けた。その後、
酸と溶媒をロータリーエバポレーターで除き、生成物XI
を高減圧下に40℃で５時間乾燥させた。 収量：2.32 g (理論量の100%) 、わずかに黄色がかった
微結晶質粉末 ＴＬＣ：シリカゲル、n-ブタノール／氷酢酸／水 50/15
/25 (v/v/v);Ｒf ＝0.74
【００４４】４．7-クロロ-5-(2-クロロフェニル)-1-[2
-(N-マレインイミド) エチル] -1H-1,4-ベンゾジアゼピ
ン-2(3H)オン(IIIb) トリフルオロ酢酸塩XI 1.16 g(2.6 mmol) を20℃の飽和
重炭酸ナトリウム溶液15 mlに懸濁し、テトラヒドロフ
ラン 20 ml中のN-メトキシカルボニルマレインイミド 4
25 mg (2.5 mmol)を攪拌しながら加えた。攪拌を20℃で
１時間続けた。その後、濃塩酸を使って反応混合物のpH
を6.0 に調整し、次いでこれを酢酸 50mlで抽出し、抽
出物を水２×50 ml で洗った。有機溶液を硫酸ナトリウ
ム約 5 gで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮
し、残留する粗生成物をシリカゲル（カラム：2.5 ×50
cm 、溶離剤：酢酸エチル）を用いたカラムクロマトグ
ラフィーにより精製した。対応する画分を集め、溶媒を
ロータリーエバポレーターで除き、残留する結晶質マレ
インイミドIIIbを高減圧下に40℃で３時間乾燥させた。 収量：330 mg (理論量の31%)、無色の微結晶質固体 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル；Ｒf ＝0.601 H-NMR(CDCl3): d(ppm)=3.86/4.10 (m,4H;-CH2-CH2-),
3.80/4.86(ABシグナル,J=12Hz,2H;-C3H2-), 6.70 (s,2
H;-CH=CH-), 7.32 (m,7H;芳香族H)
-(N-マレインイミド) エチル] -1H-1,4-ベンゾジアゼピ
ン-2(3H)オン(IIIb) トリフルオロ酢酸塩XI 1.16 g(2.6 mmol) を20℃の飽和
重炭酸ナトリウム溶液15 mlに懸濁し、テトラヒドロフ
ラン 20 ml中のN-メトキシカルボニルマレインイミド 4
25 mg (2.5 mmol)を攪拌しながら加えた。攪拌を20℃で
１時間続けた。その後、濃塩酸を使って反応混合物のpH
を6.0 に調整し、次いでこれを酢酸 50mlで抽出し、抽
出物を水２×50 ml で洗った。有機溶液を硫酸ナトリウ
ム約 5 gで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮
し、残留する粗生成物をシリカゲル（カラム：2.5 ×50
cm 、溶離剤：酢酸エチル）を用いたカラムクロマトグ
ラフィーにより精製した。対応する画分を集め、溶媒を
ロータリーエバポレーターで除き、残留する結晶質マレ
インイミドIIIbを高減圧下に40℃で３時間乾燥させた。 収量：330 mg (理論量の31%)、無色の微結晶質固体 ＴＬＣ：シリカゲル、酢酸エチル；Ｒf ＝0.601 H-NMR(CDCl3): d(ppm)=3.86/4.10 (m,4H;-CH2-CH2-),
3.80/4.86(ABシグナル,J=12Hz,2H;-C3H2-), 6.70 (s,2
H;-CH=CH-), 7.32 (m,7H;芳香族H)
【図１】不均一イムノアッセイを実施するのに適したク
ロマトグラフィー試験片を示した説明図である。
ロマトグラフィー試験片を示した説明図である。
１ アナライト添加ゾーン ２ 結合体ゾーン ３ 捕捉ゾーン ４ 標的ゾーン ５ 担体フォイル
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/113 Ｃ０７Ｋ 1/113 14/76 14/76 16/44 16/44 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ 33/531 33/531 Ａ (72)発明者 ハンス−ペーター ヨセル ドイツ連邦共和国 ディー−82362 ヴァ イルハイム，プララテンヴェーク ７番地 (72)発明者 ブルーノ ツィンク ドイツ連邦共和国 ディー−82449 ウフ ィング，シーブリックシュトラーセ ４番 地
Claims (10)
- 【請求項１】 式Ｉ： 【化１】 〔式中、Ｒ1 は水素、メチルまたはＲ基であり、Ｒ2 は
水素、ヒドロキシルまたはＯＲ基であり、その際Ｒ1 か
Ｒ2 のどちらかがＲ基を含み、Ｒ3 はハロゲン、ＮＯ2
またはＮＨ2 であり、Ｘは水素またはハロゲンであり、
Ｒは式II： 【化２】 （式中、Ｚは免疫原として活性な巨大分子の担体物質で
あり、ｎは２または３である）の基である〕で表される
ベンゾジアゼピン−タンパク質結合体。 - 【請求項２】 式ＩａまたはＩｂ： 【化３】 で表される請求項１に記載のベンゾジアゼピン−タンパ
ク質結合体。 - 【請求項３】 哺乳動物を請求項１または２に記載の結
合体で免疫化し、生産された抗体を既知の方法で回収す
ることを特徴とする、ベンゾジアゼピンに対する抗体の
調製方法。 - 【請求項４】 請求項３に記載の方法により調製された
抗体。 - 【請求項５】 ベンゾジアゼピンについて試験すべきサ
ンプルを請求項４に記載の抗体と接触させ、そして抗体
−ベンゾジアゼピン複合体を適当な方法で測定すること
を特徴とする、サンプル中のベンゾジアゼピンまたはベ
ンゾジアゼピン代謝産物の存在の免疫学的測定方法。 - 【請求項６】 ベンゾジアゼピンに対する抗体を調製す
るための免疫原としての請求項１または２に記載の結合
体の使用。 - 【請求項７】 イムノアッセイにおける請求項４に記載
の抗体の使用。 - 【請求項８】 請求項１または２に記載のベンゾジアゼ
ピン−タンパク質結合体の製造方法であって、式III ： 【化４】 〔式中、Ｒ1'は水素、メチルまたはＲ' であり、Ｒ2'は
水素、ＯＨまたはＯＲ'であり、その際Ｒ1'かＲ2'のど
ちらかがＲ' 基を含み、Ｒ' は式IV： 【化５】 の基であり、Ｒ3 はハロゲン、ＮＯ2 またはＮＨ2 であ
り、そしてＸは水素またはハロゲンである〕のベンゾジ
アゼピンリンカー化合物を、少なくとも１個のチオール
基を含むポリアミノ化合物と反応させることを特徴とす
る方法。 - 【請求項９】 請求項８に記載の式III で表されるベン
ゾジアゼピン−リンカー化合物。 - 【請求項１０】 請求項９に記載の式III のベンゾジア
ゼピンリンカー化合物の製造方法であって、 ａ）Ｒ2'がＯＲ' 基であるとき、式Ｖ： 【化６】 の化合物を式VI： 【化７】 の化合物に酸化し、これらをアシル化して式VII ： 【化８】 の化合物を生成し、そしてＮ−保護アルキルアミンおよ
びアルコキシカルボニルマレイミドと反応させて式III
： 【化９】 の化合物を得る、または ｂ）Ｒ1'がＲ' 基であるとき、式Ｘ： 【化１０】 のベンゾジアゼピンをＮ−保護ハロゲンアルキルアミン
でアルキル化し、保護基を除去し、そしてアルコキシカ
ルボニルマレイミドと反応させて式III ： 【化１１】 の化合物を得る、ことを特徴とする方法。
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|---|---|---|---|
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| DE19503320A DE19503320A1 (de) | 1995-02-02 | 1995-02-02 | Neue Benzodiazepinkonjugate |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| JPS63246666A (ja) * | 1986-10-24 | 1988-10-13 | アボット・ラボラトリーズ | ベンゾジアゼピン類の検査法、そのトレーサー、抗原および抗体 |
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