CN116179496B

CN116179496B - 一株分泌抗苯巴比妥单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Info

Publication number: CN116179496B
Application number: CN202211586645.9A
Authority: CN
Inventors: 匡华; 严婕妤; 胥传来; 徐丽广; 孙茂忠; 吴晓玲; 刘丽强; 马伟; 郝昌龙; 宋珊珊; 郭玲玲; 胥欣欣; 倪萍
Original assignee: Wuxi Determine Bio Tech Co ltd; Jiangnan University
Current assignee: Wuxi Determine Bio Tech Co ltd; Jiangnan University
Priority date: 2022-12-09
Filing date: 2022-12-09
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2042-12-09
Also published as: CN116179496A

Abstract

本发明提供了一株分泌抗苯巴比妥单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明将苯巴比妥完全抗原与福氏试剂混合乳化注射免疫BALB/c小鼠，将高效价和高抑制的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，通过培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法筛选细胞，并进行多次亚克隆，得到分泌抗苯巴比妥单克隆抗体的杂交瘤细胞株。此细胞株分泌产生的抗苯巴比妥单克隆抗体对苯巴比妥类药物具有较好亲和力和较高灵敏度，对苯巴比妥的50%抑制浓度（IC₅₀）为14.29ng/mL，可用于制备苯巴比妥类药物的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，为保健食品中苯巴比妥类药物的残留检测提供有力的检测方法及手段。

Description

一株分泌抗苯巴比妥单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测技术领域，尤其是指一株分泌抗苯巴比妥单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

巴比妥类药物是一种具有麻醉和镇静作用的中枢神经系统抑制剂，用于治疗脑外伤后患者的癫痫、头痛、焦虑和镇静。根据剂量的不同，巴比妥酸盐可产生广泛的影响。例如，它们在相对较低的剂量下可以引起放松和困倦，但在高剂量时却会抑制呼吸系统。此外，他们有潜在的身体和心理成瘾的风险，并可能导致严重的不良影响。由于其成瘾性，巴比妥酸盐作为镇静/催眠药的使用。如今，此类药物的广泛滥用引起了公众的广泛关注。因此，生物标本中巴比妥酸盐的测定不仅是治疗性药物监测和中毒调查的必要手段，而且在新制剂开发和法医学中也具有重要意义。1911年合成的第2种巴比妥酸类化合物-苯巴比妥，于1912年作为镇静催眠药开始投入使用，检测样本通常为硬胶囊、软胶囊、丸剂、片剂、散剂及口服液等保健食品，或者检测人体血浆，唾液，头发等。

苯巴比妥的常规检测方法包括高效液相色谱串联质谱，超高效液相色谱，超高效液相色谱-串联质谱和气相色谱串联质谱等人。这些方法在不同程度上存在一些缺陷：耗时，昂贵的仪器和大量的样品预处理程序等。因此，这些方法不适合现场进行高通量分析苯巴比妥的检测。此外，也已报道了用表面增强拉曼光谱测定苯巴比妥的含量。但是纳米技术具有很高的灵敏度和可靠性，高度依赖精确的数据采集，因此需要分析系统，这意味着这些方法在现场分析中的应用受到限制。因此，有必要进一步开发一种满足政府监管和企业自检要求的快速检测方法。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一株分泌抗苯巴比妥单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

本发明的第一个目的在于提供一株分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.45123，保藏日期2022年03月03，分类命名单克隆细胞株。抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体，其是由保藏编号CGMCC No.45123杂交瘤细胞株分泌产生。

本发明的第二个目的在于提供所述分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备苯巴比妥完全抗原：以苯巴比妥的结构类似物苯巴比妥-1-丁酸即半抗原为原料，通过活化酯法蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子苯巴比妥半抗原，苯巴比妥完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；

(2)小鼠的免疫：选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。将步骤(1)所得苯巴比妥完全抗原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫小鼠。首次免疫使用苯巴比妥完全抗原与福氏完全佐剂乳化得到的免疫原1进行注射，加强免疫使用苯巴比妥完全抗原与福氏不完全佐剂乳化得到的免疫原2进行注射，冲刺免疫时使用腹腔注射。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制，选择抑制最好的小鼠，在第五次免疫后进行冲刺免疫；

(3)细胞融合与杂交瘤细胞株建立：将步骤(2)中冲刺免疫后的小鼠，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株；

(4)杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC₅₀值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述苯巴比妥半抗原的分子式：

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述苯巴比妥完全抗原的分子式：

在本发明的一个实施例中，所述苯巴比妥完全抗原通过以下方法制备得到：将半抗原(苯巴比妥-1-丁酸)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于有机溶剂中，搅拌活化，得到活化液；另取牛血清蛋白(BSA)溶解于的碳酸盐缓冲溶液(CB)溶液中；将上述活化液加入BSA溶液中，搅拌反应，得到所述苯巴比妥完全抗原。

在本发明的一个实施例中，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。

在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述首次免疫的剂量为100μL/只；所述冲刺免疫的剂量为前一次免疫剂量的一半，为25μL/只，与生理盐水混匀注射。

在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，共包括6次免疫，前5次免疫的间隔时间为3周，冲刺免疫与加强免疫的间隔为18天。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述细胞融合是在冲刺免疫3天后进行。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述细胞融合是通过聚乙二醇(PEG 2000)法进行的。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，亚克隆的次数为3次。

本发明的第三个目的在于提供所述杂交瘤细胞株在制备抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体中的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体，所述抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体是由保藏编号为CGMCC No.45123的杂交瘤细胞株分泌所得。

在本发明的一个实施例中，所述苯巴比妥类药物为苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥中的一种或多种。

本发明提供了上述一种分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株或上述一种分泌抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的杂交瘤细胞株的制备方法在制备抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体方面的应用。

本发明提供了上述一种抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的制备方法，所述方法为取BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡油，再腹腔注射保藏编号为CGMCC No.45123的杂交瘤细胞，注射后收集腹水，将腹水纯化，将获得的单克隆多残抗体低温保存。

在本发明的一个实施例中，所述方法为，取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的抗体置于-20℃保存。

本发明的第五个目的在于提供所述抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体在检测苯巴比妥类药物中的应用。

本发明的第六个目的在于提供一种组合物，所述组合物包括所述的抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体。

本发明的第七个目的在于提供所述组合物在检测苯巴比妥类药物中的应用。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明获得的抗苯巴比妥单克隆抗体，对苯巴比妥类药物有较好的检测灵敏度和亲和力，可用来建立苯巴比妥酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法；

(2)本发明提供了一种新的合成苯巴比妥完全抗原的方法，合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法；

(3)本发明所述抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的应用，可用于保健食品中苯巴比妥类药物残留的检测。

(4)本发明提供了一种对苯巴比妥类药物具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆多残抗体杂交瘤细胞株的制备方法，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明实施例2中的抗体对苯巴比妥的标准抑制曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中涉及的试剂如下：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，3.62gNa₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05％Tween20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。

实施例1：抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体杂交瘤细胞株的制备

1、完全抗原的合成：取3.7mg的半抗原(苯巴比妥-1-丁酸)，再加入5.0mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和3.7mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，使用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，室温搅拌，活化6h后得到活化液；另取15mg BSA(牛血清蛋白)溶解于3mL、0.05M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲溶液)溶液中；将上述活化液逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出完全抗原经PBS透析3天，-20℃分装保存。

2、动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取苯巴比妥完全抗原(1mg/mL)与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在第五次免疫后18天冲刺免疫，准备融合。

3、细胞融合：在冲刺免疫3天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为2000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

(1)无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

(2)收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

(3)将脾细胞和SP2/0细胞按照2～10：1的计数比例混合，离心后用PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

4、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用苯巴比妥为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对苯巴比妥有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株。

实施例2：抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的制备与鉴定

取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的抗体置于-20℃保存。

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2a型，具体如表1所示。

表1抗苯巴比妥单克隆多残抗体的亚型鉴定

抗体亚型亚类	OD值
		IgA	0.105
IgG1	0.312
		IgG2a	2.245
IgG2b	0.212
		IgG3	0.187
IgM	0.021

使用间接竞争ELISA法，测定抗体对苯巴比妥的IC₅₀为14.29ng/mL，并验证了其对苯巴比妥等的IC₅₀及交叉反应率，具体如表2所示。

表2抗苯巴比妥单克隆多残抗体对苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、巴比妥的IC₅₀及交叉反应率

该抗苯巴比妥单克隆多残抗体对苯巴比妥的交叉反应率为100％，其中对司可巴比妥交叉反应率为47.6％，对异戊巴比妥交叉反应率为14.3％。说明本发明所得单克隆多残抗体对苯巴比妥有较高灵敏度，IC₅₀值为14.29ng/mL；也可以检测司可巴比妥、异戊巴比妥，IC₅₀为30ng/mL、100ng/mL，说明该单克隆多残抗体具有高灵敏度和特异性。

实施例3：抗苯巴比妥类药物单克隆多残抗体的应用

将杂交瘤细胞株通过体内腹水制备的单克隆多残抗体应用于苯巴比妥ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

(1)用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的0.1μg/mL的苯巴比妥包被作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2μg/L的苯巴比妥标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1：16000稀释的抗苯巴比妥单克隆多残抗体，37℃反应半小时后，洗板拍干；

(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS1：3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应半小时后，洗板拍干；

(5)每孔加入100μLTMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL2M H₂SO₄终止液，450nm测吸光值；

(6)添加回收及样品前处理：取新鲜或回温(冷藏保存)的牛奶5g，添加三个不同剂量的苯巴比妥标准品，分别为50ng、100ng、200ng。将其置于50mL离心管中，缓慢滴入50％氢氧化钾溶液1mL，在旋涡混合器上充分振荡，缓慢滴入乙酸乙酯20mL，在旋涡混合器上振荡10min，然后放入离心器中以3000r/min离心5min。移取4mL上清液于另一支离心管中，氮气吹干，加入1mL含有10％甲醇的PBS复溶，取50μL用于检测。采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为91.2％、101.5％、95.6％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一株分泌抗苯巴比妥单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.45123，保藏日期为2022年03月03日，分类命名为单克隆细胞株。

2.权利要求1中所述杂交瘤细胞株在制备抗苯巴比妥单克隆抗体中的应用。

3.一种抗苯巴比妥单克隆抗体，其特征在于，所述抗苯巴比妥单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No. 45123的杂交瘤细胞株分泌所得。

4.权利要求3所述抗苯巴比妥单克隆抗体在检测苯巴比妥类药物中的应用，所述苯巴比妥类药物选自苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用于保健食品中苯巴比妥类药物残留的检测。

6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求3所述抗苯巴比妥单克隆抗体。

7.如权利要求6所述的组合物在检测苯巴比妥类药物中的应用，所述苯巴比妥类药物选自苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥中的一种或多种。