JP3031636B2 - ピペリジン類似体とプロカインアミド及びｎａｐａの結合体 - Google Patents
ピペリジン類似体とプロカインアミド及びｎａｐａの結合体Info
- Publication number
- JP3031636B2 JP3031636B2 JP07520245A JP52024595A JP3031636B2 JP 3031636 B2 JP3031636 B2 JP 3031636B2 JP 07520245 A JP07520245 A JP 07520245A JP 52024595 A JP52024595 A JP 52024595A JP 3031636 B2 JP3031636 B2 JP 3031636B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- antibody
- procainamide
- compound
- acetyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
- C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
- C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
- C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D211/06—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D211/36—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D211/60—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
- C07D211/62—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals attached in position 4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9453—Cardioregulators, e.g. antihypotensives, antiarrhythmics
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 背景 本発明は、プロカインアミドとＮ−アセチルプロカイ
ンアミド（NAPA）の新規な誘導体に関する。これらの誘
導体には、プロカインアミドとNAPAを検出するためのイ
ムノアッセイに有用な抗体産性を刺激するのに用いられ
る免疫原及びポリペプチド結合体（conjugate）が含ま
れる。それらの免疫原及びポリペプチド結合体の合成に
おけるハプテン中間体も提供される。
ンアミド（NAPA）の新規な誘導体に関する。これらの誘
導体には、プロカインアミドとNAPAを検出するためのイ
ムノアッセイに有用な抗体産性を刺激するのに用いられ
る免疫原及びポリペプチド結合体（conjugate）が含ま
れる。それらの免疫原及びポリペプチド結合体の合成に
おけるハプテン中間体も提供される。
心抑制薬プロカインアミド及びＮ−アセチルプロカイ
ンアミドは、心臓不整脈を治療又は予防するために臨床
的に用いられる。Ｎ−アセチルプロカインアミド（NAPA
という略称が付されておりアセカイニド（acecainide）
としても知られている）は、ヒトにおけるプロカインア
ミドの主要な代謝産物である。プロカインアミドを投与
されている患者の血漿中におけるこの代謝産物の濃度
は、しばしばその親薬物自体の濃度を越える。代謝はin
vivoアセチル化によるものであって、個々の患者がこ
の薬物をその代謝産物に転換する速度には、遺伝に基づ
く大きな相違が認められている。この現象は、NAPAに付
随する副作用の発生率がより低くなるのでこの薬物の臨
床的使用において重要なものである。これらの薬物の治
療的有用性及び毒性の両方は、それらの用量よりもそれ
らの血液レベルにより大きな相関性を有している。投与
される薬物の量とその血液レベルとの関係は、非常に変
動し易いものである。それは、吸収の完全さ、分布特性
及び代謝と排泄の速度に影響される。
ンアミドは、心臓不整脈を治療又は予防するために臨床
的に用いられる。Ｎ−アセチルプロカインアミド（NAPA
という略称が付されておりアセカイニド（acecainide）
としても知られている）は、ヒトにおけるプロカインア
ミドの主要な代謝産物である。プロカインアミドを投与
されている患者の血漿中におけるこの代謝産物の濃度
は、しばしばその親薬物自体の濃度を越える。代謝はin
vivoアセチル化によるものであって、個々の患者がこ
の薬物をその代謝産物に転換する速度には、遺伝に基づ
く大きな相違が認められている。この現象は、NAPAに付
随する副作用の発生率がより低くなるのでこの薬物の臨
床的使用において重要なものである。これらの薬物の治
療的有用性及び毒性の両方は、それらの用量よりもそれ
らの血液レベルにより大きな相関性を有している。投与
される薬物の量とその血液レベルとの関係は、非常に変
動し易いものである。それは、吸収の完全さ、分布特性
及び代謝と排泄の速度に影響される。
これらの理由から、これらの薬物の血液レベルを測定
するための数多くの分析方法が開発され、それらには、
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、定量的薄層クロ
マトグラフィー（TLC）、及び酵素イムノアッセイ及び
蛍光技術を用いるイムノアッセイを含むイムノアッセイ
が含まれる。競合的結合イムノアッセイが特に有利であ
ることが分かっている。そのようなアッセイでは、生体
サンプル中の分析物（analyte）は、その分析物及び分
析物類似体に特異的な抗体上の限定された数の受容体結
合部位に対して、標識された試薬、又は分析物類似体、
又はトレーサーと競合する。酵素、蛍光分子、及び放射
性化合物は、トレーサーとして使われる一般的な標識物
質である。サンプル中の分析物の濃度が、その抗体に結
合する分析物類似体の量を決める。結合することになる
分析物類似体の量は、サンプル中の分析物の濃度に反比
例する。というのは、分析物と分析物類似体の各々は、
それらのそれぞれの濃度に比例して抗体に結合するから
である。次いで、フリーの又は結合した分析物類似体の
量を、用いた特定の標識に適切な方法により測定するこ
とができる。
するための数多くの分析方法が開発され、それらには、
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、定量的薄層クロ
マトグラフィー（TLC）、及び酵素イムノアッセイ及び
蛍光技術を用いるイムノアッセイを含むイムノアッセイ
が含まれる。競合的結合イムノアッセイが特に有利であ
ることが分かっている。そのようなアッセイでは、生体
サンプル中の分析物（analyte）は、その分析物及び分
析物類似体に特異的な抗体上の限定された数の受容体結
合部位に対して、標識された試薬、又は分析物類似体、
又はトレーサーと競合する。酵素、蛍光分子、及び放射
性化合物は、トレーサーとして使われる一般的な標識物
質である。サンプル中の分析物の濃度が、その抗体に結
合する分析物類似体の量を決める。結合することになる
分析物類似体の量は、サンプル中の分析物の濃度に反比
例する。というのは、分析物と分析物類似体の各々は、
それらのそれぞれの濃度に比例して抗体に結合するから
である。次いで、フリーの又は結合した分析物類似体の
量を、用いた特定の標識に適切な方法により測定するこ
とができる。
競合的結合イムノアッセイの１タイプは、サンプル中
に存在する分析物の量を測定するのに利用される検出可
能な信号を発生させる段階として、ポリペプチド断片を
再結合させて活性な酵素を形成させることを基礎とす
る。クローン化酵素（ドナーイムノアッセイ（cloned e
nzyme donor immunoassay,CEDIA）として知られるこの
タイプのアッセイは、米国特許第4,708,929号に記載さ
れている。なお、その内容は参照によりここに組み入れ
られるものとする。特に、β−ガラクトシダーゼ酵素ド
ナーポリペプチドをβ−ガラクトシダーゼ酵素アクセプ
ターポリペプチドと結合させて活性なβ−ガラクトシダ
ーゼ酵素を形成させる。ハプテン、又は小さな分析物又
は分析物類似体がその酵素ドナーポリペプチドに一定の
部位で結合しても、相補反応（complementation reacti
on）によりβ−ガラクトシダーゼを形成する能力に影響
しないので、β−ガラクトシダーゼについての基質の存
在下でもβ−ガラクトシダーゼ活性の速度に影響しな
い。しかしながら、酵素ドナー−ハプテン結合体に抗分
析物抗体が結合すると、相補速度が減じられることによ
り初期段階の酵素触媒反応速度が低下する。酵素触媒反
応速度のこの低下をモニターすることができ、反応混合
液中に存在する酵素ドナー−分析物結合体とサンプル中
に存在する分析物が酵素アクセプターの付加の前に抗分
析物抗体について競合するという競合的阻害の原理で、
複数の分析物の測定を定量化するために用いられてき
た。β−ガラクトシダーゼ形成の相補速度、従って酵素
触媒反応速度は、サンプル中に存在する分析物の量が増
加するにつれて増加する。
に存在する分析物の量を測定するのに利用される検出可
能な信号を発生させる段階として、ポリペプチド断片を
再結合させて活性な酵素を形成させることを基礎とす
る。クローン化酵素（ドナーイムノアッセイ（cloned e
nzyme donor immunoassay,CEDIA）として知られるこの
タイプのアッセイは、米国特許第4,708,929号に記載さ
れている。なお、その内容は参照によりここに組み入れ
られるものとする。特に、β−ガラクトシダーゼ酵素ド
ナーポリペプチドをβ−ガラクトシダーゼ酵素アクセプ
ターポリペプチドと結合させて活性なβ−ガラクトシダ
ーゼ酵素を形成させる。ハプテン、又は小さな分析物又
は分析物類似体がその酵素ドナーポリペプチドに一定の
部位で結合しても、相補反応（complementation reacti
on）によりβ−ガラクトシダーゼを形成する能力に影響
しないので、β−ガラクトシダーゼについての基質の存
在下でもβ−ガラクトシダーゼ活性の速度に影響しな
い。しかしながら、酵素ドナー−ハプテン結合体に抗分
析物抗体が結合すると、相補速度が減じられることによ
り初期段階の酵素触媒反応速度が低下する。酵素触媒反
応速度のこの低下をモニターすることができ、反応混合
液中に存在する酵素ドナー−分析物結合体とサンプル中
に存在する分析物が酵素アクセプターの付加の前に抗分
析物抗体について競合するという競合的阻害の原理で、
複数の分析物の測定を定量化するために用いられてき
た。β−ガラクトシダーゼ形成の相補速度、従って酵素
触媒反応速度は、サンプル中に存在する分析物の量が増
加するにつれて増加する。
一般に認められている臨床的慣用手段では、プロカイ
ンアミドとNAPAは別々に分析される。従って、NAPAとプ
ロカインアミドについてのイムノアッセイでは、この代
謝産物又はこの薬物のそれぞれについて高い度合いの特
異性を有する抗体が必要になる。この代謝産物とこの薬
物はアセチル基の存在又は不存在によってのみ相違して
いるので、それらの特異性抗体を生じさせるのは特に興
味をそそる問題である。しかしながら、驚いたことに、
本発明の免疫原がこの目的に特に有用であることが分か
った。
ンアミドとNAPAは別々に分析される。従って、NAPAとプ
ロカインアミドについてのイムノアッセイでは、この代
謝産物又はこの薬物のそれぞれについて高い度合いの特
異性を有する抗体が必要になる。この代謝産物とこの薬
物はアセチル基の存在又は不存在によってのみ相違して
いるので、それらの特異性抗体を生じさせるのは特に興
味をそそる問題である。しかしながら、驚いたことに、
本発明の免疫原がこの目的に特に有用であることが分か
った。
プロカインアミド及びNAPAを測定するイムノアッセイ
に用いるためのそれらの薬物に対する抗体の調製は、先
行技術においては、本質的に異なる３種のアプローチに
より行われてきた。１つのアプローチでは、プロカイン
アミドをジアゾ化してから縮合させることによりそのベ
ンゼン環アミノ基を介してアルブミンキャリヤーにカッ
プリングさせている［A.S.Russelら,Clin.Exp.immunol.
3:901（1968）及びMojaverianら,J.Pharm.Sci.69:721
（1980）］。しかしながら、得られる抗体はNAPAと高い
度合いの交差反応性を示すので、一方又は他方の薬物に
特異的なイムノアッセイに用いるには適していない。
に用いるためのそれらの薬物に対する抗体の調製は、先
行技術においては、本質的に異なる３種のアプローチに
より行われてきた。１つのアプローチでは、プロカイン
アミドをジアゾ化してから縮合させることによりそのベ
ンゼン環アミノ基を介してアルブミンキャリヤーにカッ
プリングさせている［A.S.Russelら,Clin.Exp.immunol.
3:901（1968）及びMojaverianら,J.Pharm.Sci.69:721
（1980）］。しかしながら、得られる抗体はNAPAと高い
度合いの交差反応性を示すので、一方又は他方の薬物に
特異的なイムノアッセイに用いるには適していない。
第２のアプローチは、これらの薬物をそれらの構造の
反対の末端において、つまりＮ−ジエチルアミノ基にお
いて、それらのエチル置換基の一方を抗原性キャリヤー
との後のカップリングのために修飾することにより、カ
ップリングさせることを包含する。結果として、抗体
は、そのキャリヤーにカップリングさせるために薬物の
主要な官能基が修飾された免疫原に対して生じる。この
アプローチの例は、Singhらに発行された米国特許第4,2
35,969号に記載されている。そこでは、Ｎ−アルキル基
の一方が非オキソカルボニル−アルキル置換基で置き換
えられている。この非オキソカルボニル官能基はカルボ
ニル基又はアミノ基を含有する連結基であるが、これは
抗原及び酵素との結合に用いられる。同じく、ヨーロッ
パ特許出願第86103161.2号（Heimanら）は、末端ジエチ
ルアミノ基において修飾されたプロカインアミド類似体
の抗原性結合体及び酵素結合体を開示している。特有の
連結基がポリ（アミノ酸）又はフルオレセイントレーサ
ーに付けられている。
反対の末端において、つまりＮ−ジエチルアミノ基にお
いて、それらのエチル置換基の一方を抗原性キャリヤー
との後のカップリングのために修飾することにより、カ
ップリングさせることを包含する。結果として、抗体
は、そのキャリヤーにカップリングさせるために薬物の
主要な官能基が修飾された免疫原に対して生じる。この
アプローチの例は、Singhらに発行された米国特許第4,2
35,969号に記載されている。そこでは、Ｎ−アルキル基
の一方が非オキソカルボニル−アルキル置換基で置き換
えられている。この非オキソカルボニル官能基はカルボ
ニル基又はアミノ基を含有する連結基であるが、これは
抗原及び酵素との結合に用いられる。同じく、ヨーロッ
パ特許出願第86103161.2号（Heimanら）は、末端ジエチ
ルアミノ基において修飾されたプロカインアミド類似体
の抗原性結合体及び酵素結合体を開示している。特有の
連結基がポリ（アミノ酸）又はフルオレセイントレーサ
ーに付けられている。
第３のアプローチでは、Bucklerら，米国特許第4,67
3,763号が、アミド側鎖のα位において免疫原性キャリ
ヤー物質又は標識にカップリングしたプロカインアミド
又はNAPAの誘導体を記載している。
3,763号が、アミド側鎖のα位において免疫原性キャリ
ヤー物質又は標識にカップリングしたプロカインアミド
又はNAPAの誘導体を記載している。
本発明は、非環状ジエチルアミノ基を環状ピペリジン
カルボン酸基で置換した点で先行技術と相違している。
次いで、抗原及び酵素への結合をこのカルボキシル基を
介して直接に又はクロスリンカーを用いて行う。本発明
の結合体においては、好ましくは、ピペリジンカルボン
酸修飾ハプテンをアミノアルキル−マレイミドクロスリ
ンカーと反応させて、ピペリジンカルボン酸ハプテンの
マレイミド付加物を得る。この誘導体は、キャリヤータ
ンパク質、酵素又は酵素ドナーポリペプチド上のスルフ
ヒドリル基と反応して、チオエーテル連結ハプテン結合
体を生成する。マレイミド／スルフヒドリルの化学［M.
Brinkley,Bioconjugate Chem.3:5（1992）］は、アミド
結合の縮合よりも容易に制御できるので、規定した目標
置換度やその結合体の機能的効力に非常に重要である特
徴を有する免疫原及び酵素又は酵素ドナー結合体の調製
が可能になる。マレイミド誘導体及びプロカインアミド
とNAPAの結合体のもう１つの例は、1993年12月17日に出
願された係属中の米国特許出願第08/169,851号に記載さ
れており、その内容は参照によりここに組み入れられる
ものとする。
カルボン酸基で置換した点で先行技術と相違している。
次いで、抗原及び酵素への結合をこのカルボキシル基を
介して直接に又はクロスリンカーを用いて行う。本発明
の結合体においては、好ましくは、ピペリジンカルボン
酸修飾ハプテンをアミノアルキル−マレイミドクロスリ
ンカーと反応させて、ピペリジンカルボン酸ハプテンの
マレイミド付加物を得る。この誘導体は、キャリヤータ
ンパク質、酵素又は酵素ドナーポリペプチド上のスルフ
ヒドリル基と反応して、チオエーテル連結ハプテン結合
体を生成する。マレイミド／スルフヒドリルの化学［M.
Brinkley,Bioconjugate Chem.3:5（1992）］は、アミド
結合の縮合よりも容易に制御できるので、規定した目標
置換度やその結合体の機能的効力に非常に重要である特
徴を有する免疫原及び酵素又は酵素ドナー結合体の調製
が可能になる。マレイミド誘導体及びプロカインアミド
とNAPAの結合体のもう１つの例は、1993年12月17日に出
願された係属中の米国特許出願第08/169,851号に記載さ
れており、その内容は参照によりここに組み入れられる
ものとする。
発明の要旨 本発明は、下式の新規なハプテン誘導体を提供する。
〔式中、 Ｘ＝水素又はアセチル、そして Ｒ１＝ヒドロキシル又は （式中、Ｒ２＝２〜10の炭素原子を有するアルキル、シ
クロアルキル又はアリール基、好ましくは（CH2)2）〕 本発明は、更に、下式の新規なハプテン結合体を提供す
る。
クロアルキル又はアリール基、好ましくは（CH2)2）〕 本発明は、更に、下式の新規なハプテン結合体を提供す
る。
〔式中、 Ｘ＝水素又はアセチル； ｎ＝１〜ｐ（ｐ＝ＺのMW/1000）； Ｚ＝ポリ（アミノ酸）、酵素ドナーポリペプチド、標識
基又は多糖類；そして Ｒ３＝結合又は （式中、Ｒ２＝２〜10の炭素原子を有するアルキル、シ
クロアルキル又はアリール基、好ましくは（CH2)2）〕 本発明は、ポリ（アミノ酸）上のスルフヒドリル基を
介するマレイミド修飾活性化ハプテン前駆体化合物への
カップリング又は該化合物の誘導体化を包含する、プロ
カインアミド及びNAPAのイムノアッセイに用いるための
試薬を提供する。マレイミド部分とスルフヒドリル架橋
を介して共有結合で免疫原性キャリヤー物質に連結した
ハプテン性薬物を含む本発明の免疫原は、それらのそれ
ぞれの薬物に対する抗体の産生を刺激するのに用いられ
る。
基又は多糖類；そして Ｒ３＝結合又は （式中、Ｒ２＝２〜10の炭素原子を有するアルキル、シ
クロアルキル又はアリール基、好ましくは（CH2)2）〕 本発明は、ポリ（アミノ酸）上のスルフヒドリル基を
介するマレイミド修飾活性化ハプテン前駆体化合物への
カップリング又は該化合物の誘導体化を包含する、プロ
カインアミド及びNAPAのイムノアッセイに用いるための
試薬を提供する。マレイミド部分とスルフヒドリル架橋
を介して共有結合で免疫原性キャリヤー物質に連結した
ハプテン性薬物を含む本発明の免疫原は、それらのそれ
ぞれの薬物に対する抗体の産生を刺激するのに用いられ
る。
本発明は、更に、ポリ（アミノ酸）へのアミド結合を
介するピペリジンカルボン酸ハプテン前駆体化合物への
カップリング又は該化合物の誘導体化を包含する、プロ
カインアミド及びNAPAのイムノアッセイに用いるための
試薬を提供する。免疫原性キャリヤー物質上のアミノ基
との直接の縮合を介して共有結合で連結したハプテン性
薬物を含む本発明のこれらの免疫原は、それらのそれぞ
れの薬物に対する抗体の産生を刺激するのに用いられ
る。
介するピペリジンカルボン酸ハプテン前駆体化合物への
カップリング又は該化合物の誘導体化を包含する、プロ
カインアミド及びNAPAのイムノアッセイに用いるための
試薬を提供する。免疫原性キャリヤー物質上のアミノ基
との直接の縮合を介して共有結合で連結したハプテン性
薬物を含む本発明のこれらの免疫原は、それらのそれぞ
れの薬物に対する抗体の産生を刺激するのに用いられ
る。
他の側面においては、本発明は、新規な抗体を用いる
NAPA及びプロカインアミドの測定のためのイムノアッセ
イ法及び試薬を提供する。本発明は、それらのアッセイ
法の特定の好ましい態様のための新規なハプテン−酵素
又はハプテン−酵素ドナー結合体も提供する。これらの
新規な結合体は、活性化カルボキシルピペリジン類似体
又はピペリジンハプテンのマレイミド付加物のいずれか
から調製される。
NAPA及びプロカインアミドの測定のためのイムノアッセ
イ法及び試薬を提供する。本発明は、それらのアッセイ
法の特定の好ましい態様のための新規なハプテン−酵素
又はハプテン−酵素ドナー結合体も提供する。これらの
新規な結合体は、活性化カルボキシルピペリジン類似体
又はピペリジンハプテンのマレイミド付加物のいずれか
から調製される。
図面の簡単な説明 本明細書の一部を形成する図面と組み合わせて考えれ
ば、本発明の以下の詳細な説明を参照することにより、
本発明をより深く理解できるであろう。
ば、本発明の以下の詳細な説明を参照することにより、
本発明をより深く理解できるであろう。
図１は、NAPAピペリジンカルボン酸類似体ハプテン誘
導体を調製するための特定の合成スキームを示す。
導体を調製するための特定の合成スキームを示す。
図２は、プロカインアミドピペリジンカルボン酸類似
体ハプテン誘導体を調製するための特定の合成スキーム
を示す。
体ハプテン誘導体を調製するための特定の合成スキーム
を示す。
図３は、抗原性キャリヤー物質（Ａ）のNAPAピペリジ
ンカルボン酸類似体結合体を調製するための特定の合成
スキームを示す。
ンカルボン酸類似体結合体を調製するための特定の合成
スキームを示す。
図４は、抗原性キャリヤー物質（Ａ）のプロカインア
ミドピペリジンカルボン酸類似体結合体を調製するため
の特定の合成スキームを示す。
ミドピペリジンカルボン酸類似体結合体を調製するため
の特定の合成スキームを示す。
図５は、β−ガラクトシダーゼの酵素ドナー断片（E
D）のNAPAピペリジンカルボン酸類似体結合体を調製す
るための特定の合成スキームを示す。
D）のNAPAピペリジンカルボン酸類似体結合体を調製す
るための特定の合成スキームを示す。
図６は、プロカインアミドピペリジンカルボン酸類似
体ハプテン誘導体及びβ−ガラクトシダーゼの酵素ドナ
ー断片（ED）とのその結合体を調製するための特定の合
成スキームを示す。
体ハプテン誘導体及びβ−ガラクトシダーゼの酵素ドナ
ー断片（ED）とのその結合体を調製するための特定の合
成スキームを示す。
図７は、CEDIAアッセイにおいて本発明の酵素ドナー
結合体と抗体とを用いる、NAPAのレベルを変動させた用
量応答曲線を示すグラフである。
結合体と抗体とを用いる、NAPAのレベルを変動させた用
量応答曲線を示すグラフである。
好ましい態様の説明 本発明では、その相互に関係のある全ての態様におい
て、NAPA及びプロカインアミドのピペリジンカルボン酸
類似体の調製が焦点となっており、それらの類似体は、
その誘導体を従来の抗原性ポリ（アミノ酸）又は他のキ
ャリヤー物質にカップリングさせることにより免疫原を
形成させるために用いることができそして続いて抗体を
得るために用いることができ、またそれらの誘導体は、
それらの薬物についてのイムノアッセイにおける検出試
薬として有用である酵素、酵素ドナー又は標識結合体を
形成させるために用いることもできる。
て、NAPA及びプロカインアミドのピペリジンカルボン酸
類似体の調製が焦点となっており、それらの類似体は、
その誘導体を従来の抗原性ポリ（アミノ酸）又は他のキ
ャリヤー物質にカップリングさせることにより免疫原を
形成させるために用いることができそして続いて抗体を
得るために用いることができ、またそれらの誘導体は、
それらの薬物についてのイムノアッセイにおける検出試
薬として有用である酵素、酵素ドナー又は標識結合体を
形成させるために用いることもできる。
NAPA及びプロカインアミドの化学構造は、下式により
表される。
表される。
〔式中、Ｘはプロカインアミドについては水素でありNA
PAについてはアセチルである。〕 本発明の好ましい態様においては、NAPAピペリジンカ
ルボン酸類似体は図１に示したスキームに従って合成さ
れる。４−カルボキシピペリジン（Ｉ）をメタノール中
で塩化水素で処理してメチルエステルIIを得る。E.Katc
halskiとD.B.Ishai［J.Org.Chem.15:1067（1950）］の
方法により調製されるカルボベンゾキシブロモエチルア
ミンをジイソプロピルエチルアミンと炭酸カリウムの存
在下でIIと反応させて、カルボベンゾキシ−アミノエチ
ル誘導体IIIを得る。接触水素化によりカルボベンゾキ
シ基を除去して、アミンIVを得る。この中間体をジイソ
プロピルエチルアミンと炭酸カリウムの存在下でｐ−ニ
トロベンゾイル化して、ｐ−ニトロベンズアミド−エチ
ル中間体Ｖを得る。Ｖを水素化して、ｐ−アミノベンズ
アミド−エチル中間体VIを得る。VIをアセチル化する
と、ｐ−アセトアミドベンズアミド−エチル中間体VII
が生成する。最後にVIIを鹸化すると、NAPAピペリジン
カルボン酸誘導体VIIIが生成する。
PAについてはアセチルである。〕 本発明の好ましい態様においては、NAPAピペリジンカ
ルボン酸類似体は図１に示したスキームに従って合成さ
れる。４−カルボキシピペリジン（Ｉ）をメタノール中
で塩化水素で処理してメチルエステルIIを得る。E.Katc
halskiとD.B.Ishai［J.Org.Chem.15:1067（1950）］の
方法により調製されるカルボベンゾキシブロモエチルア
ミンをジイソプロピルエチルアミンと炭酸カリウムの存
在下でIIと反応させて、カルボベンゾキシ−アミノエチ
ル誘導体IIIを得る。接触水素化によりカルボベンゾキ
シ基を除去して、アミンIVを得る。この中間体をジイソ
プロピルエチルアミンと炭酸カリウムの存在下でｐ−ニ
トロベンゾイル化して、ｐ−ニトロベンズアミド−エチ
ル中間体Ｖを得る。Ｖを水素化して、ｐ−アミノベンズ
アミド−エチル中間体VIを得る。VIをアセチル化する
と、ｐ−アセトアミドベンズアミド−エチル中間体VII
が生成する。最後にVIIを鹸化すると、NAPAピペリジン
カルボン酸誘導体VIIIが生成する。
他の好ましい態様においては、プロカインアミドピペ
リジンカルボン酸類似体は図２に示したスキームに従っ
て合成される。上記のｐ−ニトロベンズアミド−エチル
中間体Ｖを鹸化してカルボン酸XIIを得る。接触水素化
によりニトロ基を還元するとプロカインアミドピペリジ
ンカルボン酸類似体XIIIが生成する。
リジンカルボン酸類似体は図２に示したスキームに従っ
て合成される。上記のｐ−ニトロベンズアミド−エチル
中間体Ｖを鹸化してカルボン酸XIIを得る。接触水素化
によりニトロ基を還元するとプロカインアミドピペリジ
ンカルボン酸類似体XIIIが生成する。
このカルボン酸類似体をカルボジイミドの存在下での
縮合反応によりポリ（アミノ酸）免疫原、酵素、又は酵
素断片上のアミノ基と直接に縮合させて、NAPAピペリジ
ンカルボン酸類似体VIIIについて図３に示したアミド結
合結合体XIを生成させることができる。また、そのカル
ボン酸をまず活性エステルに転化してから、その後の反
応においてポリ（アミノ酸）上のアミノ基と縮合させ
て、同じアミド結合結合体を生成させる。プロカインア
ミドピペリジンカルボン酸類似体XIIIについて図４に示
す最も好ましい態様においては、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルXIIIaをまずそのカルボン酸とN,N−ジ
スクシンイミジル−カーボネート（DSC）との反応によ
り生成させる。次いで、その活性エステルXIIIaをポリ
（アミノ酸）と反応させてアミド結合結合体XVIIを生成
させる。
縮合反応によりポリ（アミノ酸）免疫原、酵素、又は酵
素断片上のアミノ基と直接に縮合させて、NAPAピペリジ
ンカルボン酸類似体VIIIについて図３に示したアミド結
合結合体XIを生成させることができる。また、そのカル
ボン酸をまず活性エステルに転化してから、その後の反
応においてポリ（アミノ酸）上のアミノ基と縮合させ
て、同じアミド結合結合体を生成させる。プロカインア
ミドピペリジンカルボン酸類似体XIIIについて図４に示
す最も好ましい態様においては、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルXIIIaをまずそのカルボン酸とN,N−ジ
スクシンイミジル−カーボネート（DSC）との反応によ
り生成させる。次いで、その活性エステルXIIIaをポリ
（アミノ酸）と反応させてアミド結合結合体XVIIを生成
させる。
本発明のなお他の好ましい態様においては、これらの
類似体の免疫原、酵素、又は酵素ドナー結合体を調製す
るに際して、まずアミノアルキル−マレイミド誘導体で
マレイミド付加物を生成させる。これらのアミノアルキ
ル−マレイミド誘導体は、PCT出願第PCT/EP90/00957号
に記載されたHuberらの方法により合成される。なお、
その内容は参照によりここに組み入れられるものとす
る。マレイミド付加物を免疫原、酵素、又は酵素ドナー
上のチオール基と反応させて、チオエーテル連結結合体
を得る。NAPAピペリジンカルボン酸誘導体VIII酵素ドナ
ー結合体について図５に示すように、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド及びカルボジイミド、好ましくは１−エチ
ル−３−（３′−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミド（EDAC）でのカルボン酸の予備活性化後のマレイ
ミドエチルアミンとの縮合により、マレイミド付加物IX
を得る。システインチオール基を含有する酵素ドナーと
過剰のこのマレイミド付加物との反応で、結合体Ｘが得
られる。完全な反応を確保するためには、このハプテン
の酵素ドナーチオールに対するモル比は好ましくは10を
上回る。
類似体の免疫原、酵素、又は酵素ドナー結合体を調製す
るに際して、まずアミノアルキル−マレイミド誘導体で
マレイミド付加物を生成させる。これらのアミノアルキ
ル−マレイミド誘導体は、PCT出願第PCT/EP90/00957号
に記載されたHuberらの方法により合成される。なお、
その内容は参照によりここに組み入れられるものとす
る。マレイミド付加物を免疫原、酵素、又は酵素ドナー
上のチオール基と反応させて、チオエーテル連結結合体
を得る。NAPAピペリジンカルボン酸誘導体VIII酵素ドナ
ー結合体について図５に示すように、Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド及びカルボジイミド、好ましくは１−エチ
ル−３−（３′−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミド（EDAC）でのカルボン酸の予備活性化後のマレイ
ミドエチルアミンとの縮合により、マレイミド付加物IX
を得る。システインチオール基を含有する酵素ドナーと
過剰のこのマレイミド付加物との反応で、結合体Ｘが得
られる。完全な反応を確保するためには、このハプテン
の酵素ドナーチオールに対するモル比は好ましくは10を
上回る。
図６に示すプロカインアミドピペリジンカルボン酸類
似体XIIIのマレイミド付加物の調製については、そのア
ミノ基をまずｔ−ブチルオキシカルボニル（BOC）誘導
体XIVとして保護する。次いで、上のNAPA類似体での場
合のように、このBOC中間体をマレイミドエチルアミン
と縮合させて付加物XVを得る。過剰のマレイミド付加物
XVを酵素ドナーチオール基と反応させてBOC結合体XVaを
得る。最後に、BOC保護を酸で除去して結合体XVIを得
る。
似体XIIIのマレイミド付加物の調製については、そのア
ミノ基をまずｔ−ブチルオキシカルボニル（BOC）誘導
体XIVとして保護する。次いで、上のNAPA類似体での場
合のように、このBOC中間体をマレイミドエチルアミン
と縮合させて付加物XVを得る。過剰のマレイミド付加物
XVを酵素ドナーチオール基と反応させてBOC結合体XVaを
得る。最後に、BOC保護を酸で除去して結合体XVIを得
る。
上のスキームは、NAPA及びプロカインアミドピペリジ
ン−４−カルボン酸類似体について示されているが、異
性体のペリジン２−及び３−カルボン酸類似体がそれぞ
れのカルボキシピペリジン類で出発する同じ方法により
合成され得ることは、当業者にとって自明であろう。
ン−４−カルボン酸類似体について示されているが、異
性体のペリジン２−及び３−カルボン酸類似体がそれぞ
れのカルボキシピペリジン類で出発する同じ方法により
合成され得ることは、当業者にとって自明であろう。
好ましい態様によれば、本発明の免疫原を調製するに
際して、免疫原性を有するチオール含有キャリヤータン
パク質又は他の物質をマレイミドハプテンとカップリン
グさせる。チオール化されたキーホールリンペットヘモ
シアニン（KLH）が特に好ましい抗原性ポリ（アミノ
酸）又はキャリヤータンパク質であるが、アルブミン、
血清タンパク質、例えば、グロブリン、眼球レンズ（oc
ular lens）タンパク質、リポタンパク質などを含む種
々のタンパク質キャリヤーを用いることができることが
理解されるだろう。例示的なタンパク質キャリヤーに
は、ウシ血清アルブミン、卵オバルブミン、ウシガンマ
グロブリン、チロキシン結合性グロブリン等が含まれ
る。また、システインの如き十分な数の利用できるスル
フヒドリル基を有する合成ポリ（アミノ酸）を用いるこ
とができ、反応性官能基を有する他の合成又は天然ポリ
マー性物質も用いることができる。特に、炭水化物、酵
母、又は多糖類をこのハプテンに結合させて免疫原を作
ることができる。
際して、免疫原性を有するチオール含有キャリヤータン
パク質又は他の物質をマレイミドハプテンとカップリン
グさせる。チオール化されたキーホールリンペットヘモ
シアニン（KLH）が特に好ましい抗原性ポリ（アミノ
酸）又はキャリヤータンパク質であるが、アルブミン、
血清タンパク質、例えば、グロブリン、眼球レンズ（oc
ular lens）タンパク質、リポタンパク質などを含む種
々のタンパク質キャリヤーを用いることができることが
理解されるだろう。例示的なタンパク質キャリヤーに
は、ウシ血清アルブミン、卵オバルブミン、ウシガンマ
グロブリン、チロキシン結合性グロブリン等が含まれ
る。また、システインの如き十分な数の利用できるスル
フヒドリル基を有する合成ポリ（アミノ酸）を用いるこ
とができ、反応性官能基を有する他の合成又は天然ポリ
マー性物質も用いることができる。特に、炭水化物、酵
母、又は多糖類をこのハプテンに結合させて免疫原を作
ることができる。
活性化されたハプテンと、酵素、蛍光性を有する物
質、又は放射性標識の如き標識基との結合体も調製する
ことができ、そしてイムノアッセイにおける試薬として
用いることができる。免疫原及び酵素ドナー結合体の場
合と同じく、用いられる標識は、本発明のマレイミドリ
ンカー態様による結合に適する利用可能なチオール含有
基を持たなければならない。これらのチオール基は、天
然に存在するものであっても、Ｎ−スクシンイミジル−
３−（アセチルチオ）プロピオネート（SATP）の如きチ
オール化剤を用いて人工的に導入されてもよい。
質、又は放射性標識の如き標識基との結合体も調製する
ことができ、そしてイムノアッセイにおける試薬として
用いることができる。免疫原及び酵素ドナー結合体の場
合と同じく、用いられる標識は、本発明のマレイミドリ
ンカー態様による結合に適する利用可能なチオール含有
基を持たなければならない。これらのチオール基は、天
然に存在するものであっても、Ｎ−スクシンイミジル−
３−（アセチルチオ）プロピオネート（SATP）の如きチ
オール化剤を用いて人工的に導入されてもよい。
抗体を生じさせるには、凍結乾燥した免疫原を再水和
して免疫原の溶液又は懸濁液を生成させることにより宿
主動物内に注射できるように免疫原を慣用的に調製す
る。次いで、この免疫原溶液をフロイントアジュバント
の如きアジュバントと組み合わせる。免疫原を種々の部
位に数回、つまり１回又は２回以上、幾週にもわたって
投与することができる。
して免疫原の溶液又は懸濁液を生成させることにより宿
主動物内に注射できるように免疫原を慣用的に調製す
る。次いで、この免疫原溶液をフロイントアジュバント
の如きアジュバントと組み合わせる。免疫原を種々の部
位に数回、つまり１回又は２回以上、幾週にもわたって
投与することができる。
この免疫原を用いるポリクローナル抗体の調製は、当
業者に既知のあらゆる慣用的技術に従うことができる。
一般には、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、又はウ
マの如き宿主動物にこの免疫原混合物を注射する。最適
な力価に達したことが確認されるまで抗体力価について
血清を評価しながら、更に注射を行う。次いで、宿主動
物から血を抜いて適する容量の特異性抗血清を得る。望
ましい場合には、抗血清がアッセイの実行に用いるのに
適当と考えられる前に精製工程を行って、非特異性抗体
の如き望ましくない物質を取り除いてもよい。
業者に既知のあらゆる慣用的技術に従うことができる。
一般には、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモット、又はウ
マの如き宿主動物にこの免疫原混合物を注射する。最適
な力価に達したことが確認されるまで抗体力価について
血清を評価しながら、更に注射を行う。次いで、宿主動
物から血を抜いて適する容量の特異性抗血清を得る。望
ましい場合には、抗血清がアッセイの実行に用いるのに
適当と考えられる前に精製工程を行って、非特異性抗体
の如き望ましくない物質を取り除いてもよい。
Methods in Enzymology,vol.73（Part B）,pp.3−46
（1981）に記載された技術の如きポリエチレングリコー
ル法を用いて、上記の通り免疫感作されたマウスリンパ
球と骨髄腫細胞をハイブリダイズさせることによりモノ
クローナル抗体を得ることができる。
（1981）に記載された技術の如きポリエチレングリコー
ル法を用いて、上記の通り免疫感作されたマウスリンパ
球と骨髄腫細胞をハイブリダイズさせることによりモノ
クローナル抗体を得ることができる。
実施例１ Ｎ−１−（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリ
ジンｐ−アセトアミドベンズアミド（VIII）の合成 ピペリジン−４−カルボン酸（Ｉ）12.9gを200mlのメ
タノール中に懸濁させ、氷浴中で冷却しながら塩化水素
ガスをその懸濁液中にバブリングさせた。30分後、得ら
れた溶液を室温まで温めて24時間放置した。ロータリー
エバポレーターでその溶液を濃縮してから残渣をメタノ
ール／ジエチルエーテルから結晶化させて14.8gのメチ
ル４−カルボキシピペリジン・塩酸塩（II）を得た。
ジンｐ−アセトアミドベンズアミド（VIII）の合成 ピペリジン−４−カルボン酸（Ｉ）12.9gを200mlのメ
タノール中に懸濁させ、氷浴中で冷却しながら塩化水素
ガスをその懸濁液中にバブリングさせた。30分後、得ら
れた溶液を室温まで温めて24時間放置した。ロータリー
エバポレーターでその溶液を濃縮してから残渣をメタノ
ール／ジエチルエーテルから結晶化させて14.8gのメチ
ル４−カルボキシピペリジン・塩酸塩（II）を得た。
この中間体3.59gを68mlのN,N−ジメチルホルムアミド
（DMF）中に懸濁させ、6.95mlのジイソプロピルエチル
アミン（DIEA）で処理してフリー塩基を生成させた。32
mlのDMFに溶かしたカルボベンゾキシ−２−ブロモエチ
ルアミン［H.KatchalskiとD.B.Ishai,J.Org.Chem.15:10
67（1950）の方法により合成したもの］5.16gの溶液を
加えてから、4.3gの無水炭酸カリウムを加えた。室温で
19時間撹拌した後、10mlのDMFに溶かした0.35mlのDIEA
の溶液と一緒に追加のIIを0.36g加えた。室温で３時間
以上経過した後、反応混合液を濾過し、45℃でロータリ
ーエバポレーターで濃縮して固体残渣を得た。この残渣
を150mlのクロロホルム中に溶かして1M重炭酸ナトリウ
ム水溶液及び飽和塩化ナトリウム水溶液で続けて洗浄し
た。そのクロロホルム溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、濾過し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮し
て、未反応のカルボベンゾキシ−２−ブロモエチルアミ
ンを含有する油状の粗生成物を得た。クロロホルム15ml
中に再溶解させて80mlずつの0.1N塩酸で３回抽出するこ
とにより精製を行った。抽出液を合わせ、クロロホルム
100mlの存在下で1N水酸化ナトリウムでpHを約10にし
て、生成物のフリー塩基を抽出し戻した。分液しそして
水相を追加のクロロホルム２×50mlで洗浄した後、クロ
ロホルム抽出液を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾
過し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮して油状
物を得た。これは冷蔵で結晶化した。この結晶を集めて
石油エーテルで洗浄し、3.11gのメチルＮ−１−（Ｎ′
−カルボベンゾキシ−２−アミノエチル）−４−カルボ
キシピペリジン（III）を得た。m.p.37〜39℃。この化
合物3.08gを19mlの1N塩酸と25mlのメタノールの混合液
中に溶かした。パラジウム炭触媒（５％Pd）0.44gを加
え、その混合液をParr反応器で48psi（3.4kg/cm２）で
2.5時間水素化した。この懸濁液をセライトで濾過し、
その濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して油状物
を得た。この油状物を無水エタノールからの再濃縮によ
り乾燥した後、メタノール／ジエチルエーテルから結晶
化させて、2.30gのメチルＮ−１−（２−アミノエチ
ル）−４−カルボキシピペリジン・ジ塩酸塩（IV）を得
た。このアミン塩1.65gを33mlDMF中に懸濁させて、DIEA
1.75mlを加えてフリー塩基を生じさせた。次いで、無水
炭酸カリウム1.40gを撹拌しながら加えた後、10mlのDMF
に溶かした1.05gの塩化ｐ−ニトロベンゾイルの溶液を
滴下した。室温で1.5時間経過した後、反応混合液を濾
過しそして40℃でロータリーエバポレーターで濃縮して
油状物を得た。この油状物を80mlクロロホルム中に再溶
解してその溶液を３×20mlの1M重炭酸ナトリウムで続け
て洗浄してから飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。
このクロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過
し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮して、半固
体残渣を得た。これは、石油エーテルで磨り潰すと結晶
化した。結晶を集めて乾燥し、1.45gのメチルＮ−１−
（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリジンｐ−
ニトロベンズアミド（Ｖ）を得た。m.p.134〜７℃ このｐ−ニトロベンズアミド1.25gを75mlのメタノー
ル中に溶かして0.43gの５％パラジウム炭触媒を加え
た。この混合液をParr反応器で50psi（3.5kg/cm２）で4
5分間水素化した。セライトを用いて触媒を濾去し、濾
液をロータリーエバポレーターで濃縮して油状物を得
た。この油状物をジエチルエーテルで磨り潰して、1.01
gの結晶性メチルＮ−１−（２−アミノエチル）−４−
カルボキシピペリジンｐ−アミノベンズアミド（VI）を
得た。m.p.118〜21℃。この中間体0.85gを0.5mlのDIEA
を含有する20mlのDMF中に溶かした。塩化アセチル0.3ml
を加えてその混合物を室温で10分間撹拌した。ロータリ
ーエバポレーターで濃縮して油状物を得た。この油状物
を60mlのクロロホルム中に再溶解し、1M重炭酸ナトリウ
ムで洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾
過してロータリーエバポレーターで10mlの容量にまで濃
縮した後、結晶化が始まるまで石油エーテルを加えた。
この初期生成物をクロロホルム／石油エーテルから２回
再結晶して、0.43gの精製メチルＮ−１−（２−アミノ
エチル）−４−カルボキシピペリジンｐ−アセトアミド
ベンズアミド（VII）を得た。m.p.186〜８℃。最後に、
400mgのこの物質を10mlのメタノール中に溶かして1N水
酸化ナトリウム2.3mlで室温で5.5時間処理した。ロータ
リーエバポーレーターで濃縮して濃厚水溶液を得た。こ
れを1N塩酸でpH7に中和し、ロータリーエバポレーター
で濃縮乾固した。残渣を無水エタノールから再濃縮する
ことによって乾燥した。その残渣を新たなエタノールで
処理して塩化ナトリウムを懸濁させて濾過した。濾液を
濃縮して粗生成物を得た。エタノールから結晶化させて
0.252gのＮ−１−（２−アミノエチル）−４−カルボキ
シピペリジンｐ−アセトアミドベンズアミド（VIII）を
得た。m.p.230〜50℃（分解）。この生成物は、酢酸エ
チル／ピリジン／酢酸／水（5:5:1:3）の系でのシリカ
ゲルTLCにより１スポットのUV吸収を示した。DMSO−D6
での1H−NMRで目的構造を確認した（即ち、ピペリジンC
Hについての1.5、1.8、2.0、2.2及び2.8ppmにおける多
重線；アセチルCH３についての2.1ppmにおける一重線;C
H２−Ｎ＜ピペリジンについての2.4ppmにおける三重線;
CONH−CH２についての3.3ppmにおける四重線；フェニル
環CHについての7.6及び7.8ppmにおける二重線；ベンズ
アミドNHについての8.3ppmにおける三重線；アセトアミ
ドNHについての10.3ppmにおける一重線）。
（DMF）中に懸濁させ、6.95mlのジイソプロピルエチル
アミン（DIEA）で処理してフリー塩基を生成させた。32
mlのDMFに溶かしたカルボベンゾキシ−２−ブロモエチ
ルアミン［H.KatchalskiとD.B.Ishai,J.Org.Chem.15:10
67（1950）の方法により合成したもの］5.16gの溶液を
加えてから、4.3gの無水炭酸カリウムを加えた。室温で
19時間撹拌した後、10mlのDMFに溶かした0.35mlのDIEA
の溶液と一緒に追加のIIを0.36g加えた。室温で３時間
以上経過した後、反応混合液を濾過し、45℃でロータリ
ーエバポレーターで濃縮して固体残渣を得た。この残渣
を150mlのクロロホルム中に溶かして1M重炭酸ナトリウ
ム水溶液及び飽和塩化ナトリウム水溶液で続けて洗浄し
た。そのクロロホルム溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、濾過し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮し
て、未反応のカルボベンゾキシ−２−ブロモエチルアミ
ンを含有する油状の粗生成物を得た。クロロホルム15ml
中に再溶解させて80mlずつの0.1N塩酸で３回抽出するこ
とにより精製を行った。抽出液を合わせ、クロロホルム
100mlの存在下で1N水酸化ナトリウムでpHを約10にし
て、生成物のフリー塩基を抽出し戻した。分液しそして
水相を追加のクロロホルム２×50mlで洗浄した後、クロ
ロホルム抽出液を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾
過し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮して油状
物を得た。これは冷蔵で結晶化した。この結晶を集めて
石油エーテルで洗浄し、3.11gのメチルＮ−１−（Ｎ′
−カルボベンゾキシ−２−アミノエチル）−４−カルボ
キシピペリジン（III）を得た。m.p.37〜39℃。この化
合物3.08gを19mlの1N塩酸と25mlのメタノールの混合液
中に溶かした。パラジウム炭触媒（５％Pd）0.44gを加
え、その混合液をParr反応器で48psi（3.4kg/cm２）で
2.5時間水素化した。この懸濁液をセライトで濾過し、
その濾液をロータリーエバポレーターで濃縮して油状物
を得た。この油状物を無水エタノールからの再濃縮によ
り乾燥した後、メタノール／ジエチルエーテルから結晶
化させて、2.30gのメチルＮ−１−（２−アミノエチ
ル）−４−カルボキシピペリジン・ジ塩酸塩（IV）を得
た。このアミン塩1.65gを33mlDMF中に懸濁させて、DIEA
1.75mlを加えてフリー塩基を生じさせた。次いで、無水
炭酸カリウム1.40gを撹拌しながら加えた後、10mlのDMF
に溶かした1.05gの塩化ｐ−ニトロベンゾイルの溶液を
滴下した。室温で1.5時間経過した後、反応混合液を濾
過しそして40℃でロータリーエバポレーターで濃縮して
油状物を得た。この油状物を80mlクロロホルム中に再溶
解してその溶液を３×20mlの1M重炭酸ナトリウムで続け
て洗浄してから飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。
このクロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過
し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮して、半固
体残渣を得た。これは、石油エーテルで磨り潰すと結晶
化した。結晶を集めて乾燥し、1.45gのメチルＮ−１−
（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリジンｐ−
ニトロベンズアミド（Ｖ）を得た。m.p.134〜７℃ このｐ−ニトロベンズアミド1.25gを75mlのメタノー
ル中に溶かして0.43gの５％パラジウム炭触媒を加え
た。この混合液をParr反応器で50psi（3.5kg/cm２）で4
5分間水素化した。セライトを用いて触媒を濾去し、濾
液をロータリーエバポレーターで濃縮して油状物を得
た。この油状物をジエチルエーテルで磨り潰して、1.01
gの結晶性メチルＮ−１−（２−アミノエチル）−４−
カルボキシピペリジンｐ−アミノベンズアミド（VI）を
得た。m.p.118〜21℃。この中間体0.85gを0.5mlのDIEA
を含有する20mlのDMF中に溶かした。塩化アセチル0.3ml
を加えてその混合物を室温で10分間撹拌した。ロータリ
ーエバポレーターで濃縮して油状物を得た。この油状物
を60mlのクロロホルム中に再溶解し、1M重炭酸ナトリウ
ムで洗浄してから、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾
過してロータリーエバポレーターで10mlの容量にまで濃
縮した後、結晶化が始まるまで石油エーテルを加えた。
この初期生成物をクロロホルム／石油エーテルから２回
再結晶して、0.43gの精製メチルＮ−１−（２−アミノ
エチル）−４−カルボキシピペリジンｐ−アセトアミド
ベンズアミド（VII）を得た。m.p.186〜８℃。最後に、
400mgのこの物質を10mlのメタノール中に溶かして1N水
酸化ナトリウム2.3mlで室温で5.5時間処理した。ロータ
リーエバポーレーターで濃縮して濃厚水溶液を得た。こ
れを1N塩酸でpH7に中和し、ロータリーエバポレーター
で濃縮乾固した。残渣を無水エタノールから再濃縮する
ことによって乾燥した。その残渣を新たなエタノールで
処理して塩化ナトリウムを懸濁させて濾過した。濾液を
濃縮して粗生成物を得た。エタノールから結晶化させて
0.252gのＮ−１−（２−アミノエチル）−４−カルボキ
シピペリジンｐ−アセトアミドベンズアミド（VIII）を
得た。m.p.230〜50℃（分解）。この生成物は、酢酸エ
チル／ピリジン／酢酸／水（5:5:1:3）の系でのシリカ
ゲルTLCにより１スポットのUV吸収を示した。DMSO−D6
での1H−NMRで目的構造を確認した（即ち、ピペリジンC
Hについての1.5、1.8、2.0、2.2及び2.8ppmにおける多
重線；アセチルCH３についての2.1ppmにおける一重線;C
H２−Ｎ＜ピペリジンについての2.4ppmにおける三重線;
CONH−CH２についての3.3ppmにおける四重線；フェニル
環CHについての7.6及び7.8ppmにおける二重線；ベンズ
アミドNHについての8.3ppmにおける三重線；アセトアミ
ドNHについての10.3ppmにおける一重線）。
実施例２ Ｎ−１−（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリ
ジンｐ−アミノベンズアミド（XIII）の合成 上の実施例１に記載した通りに合成したメチルＮ−１
−（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリジンｐ
−ニトロベンズアミド（Ｖ）1.57gを約50℃に温めるこ
とにより50mlのメタノール中に溶かした。この溶液を室
温まで冷却し、5mlの1N水酸化ナトリウム水溶液で室温
で１時間処理した。次いで、追加の5mlの1N水酸化ナト
リウムを加えて反応を室温で２時間続けた。３時間後、
この溶液をロータリーエバポレーターで濃縮して約３分
の１のメタノールを留去し、室温で３時間以上放置して
から４〜６℃の冷蔵庫内で一晩保存した。次いで、この
反応溶液をロータリーエバポレーターで濃縮して残りの
メタノールを留去し、得られた水性懸濁液を10mlの水で
希釈して溶液を得た。この溶液を1N塩酸10mlで酸性にし
て生成物の沈殿を得た。その生成物を濾取して各20mlの
冷水、ジエチルエーテル、及びアセトンで洗浄した。乾
燥して1.49gのＮ−１−（２−アミノエチル）−４−カ
ルボキシピペリジンｐ−ニトロベンズアミド（XII）を
得た。この中間体1.4gを30mlのメタノールと4.4mlの1N
塩酸の混合液中に溶かした。パラジウム炭触媒（５％P
d）419mgを加えてこの溶液をParr反応器で50psi（3.5kg
/cm２）で1.75時間水素化した。その触媒懸濁液をセラ
イトで濾過し、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮
して油状物を得た。その油状残渣を20mlの水中に溶かし
て1N水酸化ナトリウムでpHを6.4に調節した。この溶液
をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。残渣を20
mlのエタノール中に懸濁させて再濃縮し、残留水を留去
した。残渣を20mlの新たなエタノールで処理してその懸
濁液を約50℃に加熱した。その懸濁液を濾過して不溶性
の塩を除去した。濾液を４〜６℃で一晩冷蔵保存して生
成物の結晶を得た。結晶を集めて乾燥し、0.95gのＮ−
１−（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリジン
ｐ−アミノベンズアミド（XIII）を得た。m.p.148〜58
℃（分解）。この生成物は、酢酸エチル／ピリジン／酢
酸／水（5:5:1:3）の系でのシリカゲルTLCにより１スポ
ットのUV吸収を示した。DMSO−D6での1H−NMRで目的構
造を確認した（即ち、ピペリジンCHについての1.55、1.
75、2.1、2.2、及び2.85ppmにおける多重線；CH2 −Ｎ＜
ピペリジンについての2.45ppmにおける三重線;CONH−CH
2 についての3.35ppmにおける多重線;NH２についての5.6
ppmにおける幅広い一重線；フェニル環CHについての6.5
5及び7.55ppmにおける二重線;CONHについての7.95ppmに
おける三重線）。
ジンｐ−アミノベンズアミド（XIII）の合成 上の実施例１に記載した通りに合成したメチルＮ−１
−（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリジンｐ
−ニトロベンズアミド（Ｖ）1.57gを約50℃に温めるこ
とにより50mlのメタノール中に溶かした。この溶液を室
温まで冷却し、5mlの1N水酸化ナトリウム水溶液で室温
で１時間処理した。次いで、追加の5mlの1N水酸化ナト
リウムを加えて反応を室温で２時間続けた。３時間後、
この溶液をロータリーエバポレーターで濃縮して約３分
の１のメタノールを留去し、室温で３時間以上放置して
から４〜６℃の冷蔵庫内で一晩保存した。次いで、この
反応溶液をロータリーエバポレーターで濃縮して残りの
メタノールを留去し、得られた水性懸濁液を10mlの水で
希釈して溶液を得た。この溶液を1N塩酸10mlで酸性にし
て生成物の沈殿を得た。その生成物を濾取して各20mlの
冷水、ジエチルエーテル、及びアセトンで洗浄した。乾
燥して1.49gのＮ−１−（２−アミノエチル）−４−カ
ルボキシピペリジンｐ−ニトロベンズアミド（XII）を
得た。この中間体1.4gを30mlのメタノールと4.4mlの1N
塩酸の混合液中に溶かした。パラジウム炭触媒（５％P
d）419mgを加えてこの溶液をParr反応器で50psi（3.5kg
/cm２）で1.75時間水素化した。その触媒懸濁液をセラ
イトで濾過し、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮
して油状物を得た。その油状残渣を20mlの水中に溶かし
て1N水酸化ナトリウムでpHを6.4に調節した。この溶液
をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。残渣を20
mlのエタノール中に懸濁させて再濃縮し、残留水を留去
した。残渣を20mlの新たなエタノールで処理してその懸
濁液を約50℃に加熱した。その懸濁液を濾過して不溶性
の塩を除去した。濾液を４〜６℃で一晩冷蔵保存して生
成物の結晶を得た。結晶を集めて乾燥し、0.95gのＮ−
１−（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリジン
ｐ−アミノベンズアミド（XIII）を得た。m.p.148〜58
℃（分解）。この生成物は、酢酸エチル／ピリジン／酢
酸／水（5:5:1:3）の系でのシリカゲルTLCにより１スポ
ットのUV吸収を示した。DMSO−D6での1H−NMRで目的構
造を確認した（即ち、ピペリジンCHについての1.55、1.
75、2.1、2.2、及び2.85ppmにおける多重線；CH2 −Ｎ＜
ピペリジンについての2.45ppmにおける三重線;CONH−CH
2 についての3.35ppmにおける多重線;NH２についての5.6
ppmにおける幅広い一重線；フェニル環CHについての6.5
5及び7.55ppmにおける二重線;CONHについての7.95ppmに
おける三重線）。
実施例３ Ｎ−１−（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリ
ジンｐ−（Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル）−アミノ
ベンズアミド（XIV）の合成 実施例２からの化合物XIII291mgを1.1mlの1N水酸化ナ
トリウム＋1ml水に溶かした。この溶液を1mlのジオキサ
ンで希釈した。ジ−ｔ−ブチルジカーボネート242mgを1
mlのジオキサン中に別個に溶かしてXIIIの溶液に撹拌し
ながら加えた。5.5時間後、0.8mlのジオキサンに溶かし
た追加の102mgのジ−ｔ−ブチルジカーボネートの溶液
をこの反応液に加えた。３日後、0.5mlのジオキサンに
溶かした３回目の122mgのジ−ｔ−ブチルジカーボネー
トの溶液をこの反応液に加えて室温で１日撹拌を続け
た。次いで、1.1mlの1N塩酸を加えることによりこの反
応混合液をpH6に中和した。少量の生成物が析出したの
で濾取し29mgを得た。濾液をBio−BeadsSM−２樹脂（Bi
o−Rad）のカラム1.5×7cmに通した。カラムを40mlの水
で洗浄してから、50mlの10％アセトニトリル／水（v/
v）、次いで40mlの20％アセトニトリル／水（v/v）で溶
離して複数の10ml画分を集めた。１−ブタノール／酢酸
／水（3:1:1）の系での各画分のシリカゲルTLCにより、
UV、ニンヒドリン試薬及びヨード染色により可視化して
生成物の位置を特定した。生成物だけを含有する画分を
プールしてロータリーエバポレーターで濃縮し、固体残
渣を得た。その固体をジエチルエーテルで洗浄して乾燥
し、98mgの生成物XIVを得た。m.p.200〜５℃。1H−NMR
は、ｔ−ブチルCH３に特徴的な1.5ppmの一重線の存在を
示した。
ジンｐ−（Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル）−アミノ
ベンズアミド（XIV）の合成 実施例２からの化合物XIII291mgを1.1mlの1N水酸化ナ
トリウム＋1ml水に溶かした。この溶液を1mlのジオキサ
ンで希釈した。ジ−ｔ−ブチルジカーボネート242mgを1
mlのジオキサン中に別個に溶かしてXIIIの溶液に撹拌し
ながら加えた。5.5時間後、0.8mlのジオキサンに溶かし
た追加の102mgのジ−ｔ−ブチルジカーボネートの溶液
をこの反応液に加えた。３日後、0.5mlのジオキサンに
溶かした３回目の122mgのジ−ｔ−ブチルジカーボネー
トの溶液をこの反応液に加えて室温で１日撹拌を続け
た。次いで、1.1mlの1N塩酸を加えることによりこの反
応混合液をpH6に中和した。少量の生成物が析出したの
で濾取し29mgを得た。濾液をBio−BeadsSM−２樹脂（Bi
o−Rad）のカラム1.5×7cmに通した。カラムを40mlの水
で洗浄してから、50mlの10％アセトニトリル／水（v/
v）、次いで40mlの20％アセトニトリル／水（v/v）で溶
離して複数の10ml画分を集めた。１−ブタノール／酢酸
／水（3:1:1）の系での各画分のシリカゲルTLCにより、
UV、ニンヒドリン試薬及びヨード染色により可視化して
生成物の位置を特定した。生成物だけを含有する画分を
プールしてロータリーエバポレーターで濃縮し、固体残
渣を得た。その固体をジエチルエーテルで洗浄して乾燥
し、98mgの生成物XIVを得た。m.p.200〜５℃。1H−NMR
は、ｔ−ブチルCH３に特徴的な1.5ppmの一重線の存在を
示した。
実施例４ Ｎ−１−（２−アミノエチル）−４−（２−マレイミド
エチルアミドカルボニル）−ピペリジンｐ−〔（Ｎ−ｔ
−ブチルオキシカルボニル）アミノ〕ベンズアミド（X
V）の合成 まず、Huberら（前記文献）の方法によりマレイミド
エチルアミン・塩酸塩（MEA・HCl）を合成した。Ｎ−１
−（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリジンｐ
−〔Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ〕ベンズ
アミドXIV3.22mgを0.5mlのDMF中に溶かした。Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド3.05mgを加えてから、4.68mgの１
−エチル−３−（３′−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミド（EDAC）を加えた。得られた溶液を室温で
５時間放置してから、−70℃の冷凍室内に３日間保存し
た。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを含有
するこの反応混合液を室温まで温めて0.5mlのDMFに溶か
した4.36mgのMEA・HClの溶液を加えた。次いで、トリエ
チルアミン3.43μｌを加えてその混合液を室温で90分間
撹拌した。マレイミドエチルアミド生成物を、水に溶か
した0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）の溶液で平衡にした
半分取C18逆相カラム（Vydac）でのHPLCにより単離し
た。生成物を、アセトニトリル中25〜35％勾配の0.1％T
FAにより、20分間かけて280又は260nmに吸収をもつ混合
液中のUV吸収主ピークとして溶離した。この生成物を集
めて凍結乾燥し、267nmの極大値におけるUV吸光度に基
づき全部で6.65μモル又は3.4mgを得た。なお、この吸
光係数は出発物質、つまり化合物XIVについて0.1％TFA/
水中で出したものであるが、XV中のこの新たなマレイミ
ドエチル基のこの波長における吸光度への増加的寄与は
無視できるので化合物XVに用いた。DMSO−D6での化合物
XVの1H−NMRは、マレイミドについての7.0ppmの新たな
共鳴の存在を示した。
エチルアミドカルボニル）−ピペリジンｐ−〔（Ｎ−ｔ
−ブチルオキシカルボニル）アミノ〕ベンズアミド（X
V）の合成 まず、Huberら（前記文献）の方法によりマレイミド
エチルアミン・塩酸塩（MEA・HCl）を合成した。Ｎ−１
−（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリジンｐ
−〔Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ〕ベンズ
アミドXIV3.22mgを0.5mlのDMF中に溶かした。Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド3.05mgを加えてから、4.68mgの１
−エチル−３−（３′−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミド（EDAC）を加えた。得られた溶液を室温で
５時間放置してから、−70℃の冷凍室内に３日間保存し
た。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを含有
するこの反応混合液を室温まで温めて0.5mlのDMFに溶か
した4.36mgのMEA・HClの溶液を加えた。次いで、トリエ
チルアミン3.43μｌを加えてその混合液を室温で90分間
撹拌した。マレイミドエチルアミド生成物を、水に溶か
した0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）の溶液で平衡にした
半分取C18逆相カラム（Vydac）でのHPLCにより単離し
た。生成物を、アセトニトリル中25〜35％勾配の0.1％T
FAにより、20分間かけて280又は260nmに吸収をもつ混合
液中のUV吸収主ピークとして溶離した。この生成物を集
めて凍結乾燥し、267nmの極大値におけるUV吸光度に基
づき全部で6.65μモル又は3.4mgを得た。なお、この吸
光係数は出発物質、つまり化合物XIVについて0.1％TFA/
水中で出したものであるが、XV中のこの新たなマレイミ
ドエチル基のこの波長における吸光度への増加的寄与は
無視できるので化合物XVに用いた。DMSO−D6での化合物
XVの1H−NMRは、マレイミドについての7.0ppmの新たな
共鳴の存在を示した。
実施例５ Ｎ−１−（２−アミノエチル）−４−（２−マレイミド
エチルアミドカルボニル）−ピペリジンｐ−アセトアミ
ドベンズアミド（IX）の合成 実施例４と同じように、Ｎ−１−（２−アミノエチ
ル）−４−カルボキシピペリジンｐ−アセトアミドベン
ズアミド（VIII）3.4mgを0.5mlのDMF中に溶かした。Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド4.18mg及びEDAC6.07mgを加
え、その溶液を室温で７時間撹拌した。0.5mlのDMFに溶
かしたMEA・HCl5.41mgの溶液を加えてからトリエチルア
ミン4.26μｌを加えた。この混合液を室温で１時間撹拌
した。勾配範囲を10〜20％に変えた以外は実施例４にお
ける通りにHPLCにより精製を行った。出発物質VIIIにつ
いて出した吸光係数を用いて、268nmのUV吸収に基づき
全部で2.1mgが得られた。DMSO−D6での1H−NMRは、7.0p
pmにおける一重線としてマレイミドの存在を示した。
エチルアミドカルボニル）−ピペリジンｐ−アセトアミ
ドベンズアミド（IX）の合成 実施例４と同じように、Ｎ−１−（２−アミノエチ
ル）−４−カルボキシピペリジンｐ−アセトアミドベン
ズアミド（VIII）3.4mgを0.5mlのDMF中に溶かした。Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド4.18mg及びEDAC6.07mgを加
え、その溶液を室温で７時間撹拌した。0.5mlのDMFに溶
かしたMEA・HCl5.41mgの溶液を加えてからトリエチルア
ミン4.26μｌを加えた。この混合液を室温で１時間撹拌
した。勾配範囲を10〜20％に変えた以外は実施例４にお
ける通りにHPLCにより精製を行った。出発物質VIIIにつ
いて出した吸光係数を用いて、268nmのUV吸収に基づき
全部で2.1mgが得られた。DMSO−D6での1H−NMRは、7.0p
pmにおける一重線としてマレイミドの存在を示した。
実施例６ Ｎ−１−（２−アミノエチル）−４−（２−マレイミド
エチルアミドカルボニル）−ピペリジンｐ−〔（Ｎ−ｔ
−ブチルオキシカルボニル）アミノ〕ベンズアミド（X
V）のβ−ガラクトシダーゼのペプチド断片への結合 この実施例で用いたペプチド断片（ED28）は、１位及
び46位にシステインを有するβ−ガラクトシダーゼアミ
ノ酸１〜46からなる。この化合物の保存緩衝液に用いら
れた還元試薬を除くために、3.6mgのED28をNAP5（商
標）脱塩カラム（Pharmacia）で1mlの50mMリン酸ナトリ
ウム/1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（pH7.0）中
に脱塩した。１μモルの化合物XV（0.44mg）を200μｌ
のジメチルホルムアミド（DMF）中に溶かした。脱塩し
たED28をゆっくり撹拌しながら１μモルの化合物XVに滴
下した。これを室温で１時間インキュベートした。HPLC
精製用のサンプルを調製するために、この結合体混合液
を水、0.1％TFAで平衡にしたNAP5カラムで脱塩して過剰
のハプテンを除去した。この結合体をC4半分取HPLCカラ
ム（Vydac）で4ml/分で、水/0.1％TFAである溶媒Ａ及び
アセトニトリル/0.1％TFAである溶媒Ｂの25〜40％勾配
を15分間にわたって用いて精製し、主ピークを集めてSp
in Vacでの２時間の減圧遠心分離により濃縮乾固した。
乾燥した結合体を100％TFA中に再溶解してBOC保護基を
除去し、500mlの蒸留水に対して透析して、最終TFA濃度
を0.1％にした。一晩透析した後、この物質をC4半分取H
PLCカラム（Vydac）で4ml/分で、水/0.1％TFAである溶
媒Ａ及びアセトニトリル/0.1％TFAである溶媒Ｂの25〜4
0％勾配を15分間にわたって用いて精製し、主ピークを
集めた。この操作において、２モルの化合物XVを各モル
のED28にこのペプチド上の２つのチオールを介してカッ
プリングさせた。
エチルアミドカルボニル）−ピペリジンｐ−〔（Ｎ−ｔ
−ブチルオキシカルボニル）アミノ〕ベンズアミド（X
V）のβ−ガラクトシダーゼのペプチド断片への結合 この実施例で用いたペプチド断片（ED28）は、１位及
び46位にシステインを有するβ−ガラクトシダーゼアミ
ノ酸１〜46からなる。この化合物の保存緩衝液に用いら
れた還元試薬を除くために、3.6mgのED28をNAP5（商
標）脱塩カラム（Pharmacia）で1mlの50mMリン酸ナトリ
ウム/1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（pH7.0）中
に脱塩した。１μモルの化合物XV（0.44mg）を200μｌ
のジメチルホルムアミド（DMF）中に溶かした。脱塩し
たED28をゆっくり撹拌しながら１μモルの化合物XVに滴
下した。これを室温で１時間インキュベートした。HPLC
精製用のサンプルを調製するために、この結合体混合液
を水、0.1％TFAで平衡にしたNAP5カラムで脱塩して過剰
のハプテンを除去した。この結合体をC4半分取HPLCカラ
ム（Vydac）で4ml/分で、水/0.1％TFAである溶媒Ａ及び
アセトニトリル/0.1％TFAである溶媒Ｂの25〜40％勾配
を15分間にわたって用いて精製し、主ピークを集めてSp
in Vacでの２時間の減圧遠心分離により濃縮乾固した。
乾燥した結合体を100％TFA中に再溶解してBOC保護基を
除去し、500mlの蒸留水に対して透析して、最終TFA濃度
を0.1％にした。一晩透析した後、この物質をC4半分取H
PLCカラム（Vydac）で4ml/分で、水/0.1％TFAである溶
媒Ａ及びアセトニトリル/0.1％TFAである溶媒Ｂの25〜4
0％勾配を15分間にわたって用いて精製し、主ピークを
集めた。この操作において、２モルの化合物XVを各モル
のED28にこのペプチド上の２つのチオールを介してカッ
プリングさせた。
実施例７ Ｎ−１−（２−アミノエチル）−４−（２−マレイミド
エチルアミドカルボニル）−ピペリジンｐ−アセトアミ
ドベンズアミド（IX）のβ−ガラクトシダーゼのペプチ
ド断片への結合 この実施例で用いたペプチド断片（ED28）は、１位及
び46位にシステインを有するβ−ガラクトシダーゼアミ
ノ酸１〜46からなる。この化合物の保存緩衝液に用いら
れた還元試薬を除くために、3.6mgのED28をNAP5脱塩カ
ラムで1mlの50mMリン酸ナトリウム/1mMエチレンジアミ
ン四酢酸（EDTA）（pH7.0）中に脱塩した。１μモルの
化合物IXを200μｌのジメチルホルムアミド（DMF）中に
溶かした。500マイクログラムのED28をゆっくり撹拌し
ながら１μモルの化合物IXに滴下した。これを室温で40
分間インキュベートした。HPLC精製用のサンプルを調製
するために、この結合体混合液を水、0.1％トリフルオ
ロ酢酸（TFA）で平衡にしたNAP5カラムで脱塩して過剰
のハプテンを除去した。この結合体をC4半分取HPLCカラ
ム（Vydac）で4ml/分で、水/0.1％TFAである溶媒Ａ及び
アセトニトリル/0.1％TFAである溶媒Ｂの25〜40％勾配
を15分間にわって用いて精製し、主ピークを集めた。こ
の操作において、２モルの化合物IXを各モルのED28にこ
のペプチド上の２つのチオールを介してカップリングさ
せた。
エチルアミドカルボニル）−ピペリジンｐ−アセトアミ
ドベンズアミド（IX）のβ−ガラクトシダーゼのペプチ
ド断片への結合 この実施例で用いたペプチド断片（ED28）は、１位及
び46位にシステインを有するβ−ガラクトシダーゼアミ
ノ酸１〜46からなる。この化合物の保存緩衝液に用いら
れた還元試薬を除くために、3.6mgのED28をNAP5脱塩カ
ラムで1mlの50mMリン酸ナトリウム/1mMエチレンジアミ
ン四酢酸（EDTA）（pH7.0）中に脱塩した。１μモルの
化合物IXを200μｌのジメチルホルムアミド（DMF）中に
溶かした。500マイクログラムのED28をゆっくり撹拌し
ながら１μモルの化合物IXに滴下した。これを室温で40
分間インキュベートした。HPLC精製用のサンプルを調製
するために、この結合体混合液を水、0.1％トリフルオ
ロ酢酸（TFA）で平衡にしたNAP5カラムで脱塩して過剰
のハプテンを除去した。この結合体をC4半分取HPLCカラ
ム（Vydac）で4ml/分で、水/0.1％TFAである溶媒Ａ及び
アセトニトリル/0.1％TFAである溶媒Ｂの25〜40％勾配
を15分間にわって用いて精製し、主ピークを集めた。こ
の操作において、２モルの化合物IXを各モルのED28にこ
のペプチド上の２つのチオールを介してカップリングさ
せた。
実施例８ Ｎ−１−（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリ
ジンｐ−アミノベンズアミド（XIII）のKLH及びBSAへの
結合 N,N′−ジスクシンイミジルカーボネート（DSC）での化
合物XIIIの活性化 15mgのDSCを1mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶
かした。化合物XIIIを活性化するために、105μｌのDSC
溶液（6.18×10-3ミリモル）を1.5mgの化合物XIII（5.1
5×10-3ミリモル）に撹拌しながら加え、２μｌのトリ
エチルアミン（TEA）を加え、そしてその混合液を室温
で１時間インキュベートした。
ジンｐ−アミノベンズアミド（XIII）のKLH及びBSAへの
結合 N,N′−ジスクシンイミジルカーボネート（DSC）での化
合物XIIIの活性化 15mgのDSCを1mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶
かした。化合物XIIIを活性化するために、105μｌのDSC
溶液（6.18×10-3ミリモル）を1.5mgの化合物XIII（5.1
5×10-3ミリモル）に撹拌しながら加え、２μｌのトリ
エチルアミン（TEA）を加え、そしてその混合液を室温
で１時間インキュベートした。
化合物XIIIのキャリヤータンパク質KLH及びBSAへのカッ
プリング 10mgのウシ血清アルブミン（BSA）を1mlの150mM炭酸
ナトリウム（pH8.1）中に溶かした。別の試験管で、10m
gのKLHを1mlの150mM炭酸ナトリウム（pH8.1）中に溶か
して、室温での穏やかな超音波処理と撹拌により溶解を
促進した。20モル過剰のDSC活性化化合物XIIIをこれら
のキャリヤータンパク質と反応させた。つまり、61.5μ
ｌの化合物XIIIをこのBSA溶液に加え、そして40.7μｌ
の化合物XIIIをこのKLH溶液に加えた。これらの反応混
合液を４℃で16時間インキュベートした。これらの反応
混合液を12,000〜14,000分子量カットオフSpectrapore
（商標）（Spectrum）チュービングに移して蒸留水4Lに
対して２回透析した。サンプルをバイアルに小分け（1m
g/バイアル）し、−70℃に凍結して凍結乾燥した。次い
で、これらの凍結乾燥サンプルを後で免疫原として用い
るために−20℃で保存した。
プリング 10mgのウシ血清アルブミン（BSA）を1mlの150mM炭酸
ナトリウム（pH8.1）中に溶かした。別の試験管で、10m
gのKLHを1mlの150mM炭酸ナトリウム（pH8.1）中に溶か
して、室温での穏やかな超音波処理と撹拌により溶解を
促進した。20モル過剰のDSC活性化化合物XIIIをこれら
のキャリヤータンパク質と反応させた。つまり、61.5μ
ｌの化合物XIIIをこのBSA溶液に加え、そして40.7μｌ
の化合物XIIIをこのKLH溶液に加えた。これらの反応混
合液を４℃で16時間インキュベートした。これらの反応
混合液を12,000〜14,000分子量カットオフSpectrapore
（商標）（Spectrum）チュービングに移して蒸留水4Lに
対して２回透析した。サンプルをバイアルに小分け（1m
g/バイアル）し、−70℃に凍結して凍結乾燥した。次い
で、これらの凍結乾燥サンプルを後で免疫原として用い
るために−20℃で保存した。
実施例９ Ｎ−１−（２−アミノエチル）−４−カルボキシピペリ
ジンｐ−アセトアミドベンズアミド（VIII）のKLH及びB
SAへの結合 N,N′−ジスクシンイミジルカーボネート（DSC）での化
合物VIIIの活性化 2mgの化合物VIIIを1.2モル過剰のDSCを用いて活性化
してそのカルボン酸基を修飾した。1.0mlのジメチルス
ルホキシド（DMSO）に、1.9mgのDSCを溶かした。次い
で、2mgの化合物VIIIをこのDSC溶液に撹拌しながら加え
て完全に溶解するまで混合した。この時点で、２μｌの
トリエチルアミン（TEA）を加えてその反応液を室温で
１時間インキュベートした。
ジンｐ−アセトアミドベンズアミド（VIII）のKLH及びB
SAへの結合 N,N′−ジスクシンイミジルカーボネート（DSC）での化
合物VIIIの活性化 2mgの化合物VIIIを1.2モル過剰のDSCを用いて活性化
してそのカルボン酸基を修飾した。1.0mlのジメチルス
ルホキシド（DMSO）に、1.9mgのDSCを溶かした。次い
で、2mgの化合物VIIIをこのDSC溶液に撹拌しながら加え
て完全に溶解するまで混合した。この時点で、２μｌの
トリエチルアミン（TEA）を加えてその反応液を室温で
１時間インキュベートした。
化合物VIIIのキャリヤータンパク質KLH及びBSAへのカッ
プリング 10mgのBSAを1mlの150mM炭酸ナトリウム（pH8.1）中に
溶かした。1mlの150mM炭酸ナトリウム（pH8.1）中に10m
gを溶かることによりKLHを溶解させて、室温での穏やか
な超音波処理と撹拌により溶解を促進した。24倍モル過
剰のこのDSC活性化化合物をこのKLH及びBSAと反応させ
た。つまり、379μｌの上の反応混合液を撹拌下でKLH溶
液に加え、そして536μｌの反応混合液をBSA溶液に加え
て、４℃で16時間インキュベートした。この反応混合液
を12,000〜14,000分子量カットオフSpectrapore（商
標）チュービングに移して蒸留水4Lに対して３回透析し
た。サンプルをバイアルに小分け（1mg/バイアル）し、
−70℃に凍結して凍結乾燥した。次いで、これらの凍結
乾燥サンプルを後で免疫原として用いるために−20℃で
保存した。
プリング 10mgのBSAを1mlの150mM炭酸ナトリウム（pH8.1）中に
溶かした。1mlの150mM炭酸ナトリウム（pH8.1）中に10m
gを溶かることによりKLHを溶解させて、室温での穏やか
な超音波処理と撹拌により溶解を促進した。24倍モル過
剰のこのDSC活性化化合物をこのKLH及びBSAと反応させ
た。つまり、379μｌの上の反応混合液を撹拌下でKLH溶
液に加え、そして536μｌの反応混合液をBSA溶液に加え
て、４℃で16時間インキュベートした。この反応混合液
を12,000〜14,000分子量カットオフSpectrapore（商
標）チュービングに移して蒸留水4Lに対して３回透析し
た。サンプルをバイアルに小分け（1mg/バイアル）し、
−70℃に凍結して凍結乾燥した。次いで、これらの凍結
乾燥サンプルを後で免疫原として用いるために−20℃で
保存した。
実施例10 抗体の調製 宿主の免疫感作 免疫原の調製及び宿主の免疫感作を当業者にとて既知
であろう技術を用いて行う。免疫原は、凍結乾燥免疫原
をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に再水和することに
より、宿主動物内への注射用に調製することができる。
次いで、その抗原溶液を等容量のフロイントアジュバン
トと組み合わせてエマルジョンを形成させる。最初の免
疫感作は、フロイント完全アジュバントで完了すること
ができ、そして全ての続く免疫感作は、フロイント不完
全アジュバントで完了することができる。免疫原を種々
の部位に数回、つまり１回又は２回以上、幾週にもわた
って投与することができる。
であろう技術を用いて行う。免疫原は、凍結乾燥免疫原
をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に再水和することに
より、宿主動物内への注射用に調製することができる。
次いで、その抗原溶液を等容量のフロイントアジュバン
トと組み合わせてエマルジョンを形成させる。最初の免
疫感作は、フロイント完全アジュバントで完了すること
ができ、そして全ての続く免疫感作は、フロイント不完
全アジュバントで完了することができる。免疫原を種々
の部位に数回、つまり１回又は２回以上、幾週にもわた
って投与することができる。
抗体の選択 この実施例では、CEDIA相同性アッセイを用いて、96
ウェル培養プレートから上澄み液を選択した。先に記載
したように、CEDIAアッセイは、遺伝子工学で作られた
酵素的に不活性なβ−ガラクトシダーゼの断片を用い
る。酵素ドナーと名付けられる小さめのポリペプチドを
大きめの断片、つまり酵素アクセプターと、相補と呼ば
れる方法で自発的に再結合させて、活性なβ−ガラクト
シダーゼを形成させることができる。このリガンドに特
異的な抗体が酵素ドナー結合体に付着すると、相補が阻
害される。この系にフリーのリガンドを加えると、相補
の阻害がモジュレートされることになる。このアッセイ
の原理を用いて、96ウェルフォーマット中の融合産物を
スクリーニングした。
ウェル培養プレートから上澄み液を選択した。先に記載
したように、CEDIAアッセイは、遺伝子工学で作られた
酵素的に不活性なβ−ガラクトシダーゼの断片を用い
る。酵素ドナーと名付けられる小さめのポリペプチドを
大きめの断片、つまり酵素アクセプターと、相補と呼ば
れる方法で自発的に再結合させて、活性なβ−ガラクト
シダーゼを形成させることができる。このリガンドに特
異的な抗体が酵素ドナー結合体に付着すると、相補が阻
害される。この系にフリーのリガンドを加えると、相補
の阻害がモジュレートされることになる。このアッセイ
の原理を用いて、96ウェルフォーマット中の融合産物を
スクリーニングした。
まず実施例６及び７で調製した酵素ドナー結合体に結
合して相補を阻害する抗体の能力を評価するために、融
合産物の一次スクリーニングを行った。次いで、フリー
の薬物がモジュレートするか又はその抗体について酵素
ドナー結合体と競合するかを確認する二次スクリーニン
グアッセイを行うことにより阻害陽性クローンの数を更
に絞った。このモジュレーションアッセイは、交差反応
する分析物に対してスクリーニングすると特異性クロー
ンも同定した。次いで、この特定の分析物でモジュレー
トされる選り抜きのクローンを更なる検討のために増殖
させた。モノクローナル抗体を含有するその培養上澄み
液を集めてHITACHI 717自動分析装置（Boehringer Mann
heim Corp.,インディアナポリス，インディアナ州）で
以下の実施例11の通りに評価した。
合して相補を阻害する抗体の能力を評価するために、融
合産物の一次スクリーニングを行った。次いで、フリー
の薬物がモジュレートするか又はその抗体について酵素
ドナー結合体と競合するかを確認する二次スクリーニン
グアッセイを行うことにより阻害陽性クローンの数を更
に絞った。このモジュレーションアッセイは、交差反応
する分析物に対してスクリーニングすると特異性クロー
ンも同定した。次いで、この特定の分析物でモジュレー
トされる選り抜きのクローンを更なる検討のために増殖
させた。モノクローナル抗体を含有するその培養上澄み
液を集めてHITACHI 717自動分析装置（Boehringer Mann
heim Corp.,インディアナポリス，インディアナ州）で
以下の実施例11の通りに評価した。
実施例11 プロカインアミド及びNAPAについてのアッセイ プロカインアミド及びNAPAについてのCEDIAアッセイ
を実施例６及び７で調製した酵素ドナー結合体及び実施
例10に従って産生させた抗体を用いて行った。次の試薬
を調製した。
を実施例６及び７で調製した酵素ドナー結合体及び実施
例10に従って産生させた抗体を用いて行った。次の試薬
を調製した。
ドナー試薬： 酵素ドナー結合体 0.5nM 抗体 1:10〜1:100 CPRG（クロルフェニルレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド） 1mg/mL Nacl 500mM K2HPO4 30mM EGTA 10mM EDTA,ジナトリウム 0.6mM Naアジド 20mM TWEEN−20 0.02％ pH 6.80 ポリオキシエチレンソルビタンについてのICI Americ
as,Inc.の登録商標 アクセプター試薬： 酵素アクセプター 220U/ml 酢酸マグネシウム 5mM NaCl 500mM K2HPO4 30mM EGTA 10mM Ｌ−メチオニン 10mM Naアジド 20mM TWEEN−20 0.02％ pH 6.80 アッセイはHITACHI 717自動分析装置を用いて行っ
た。この装置は、NAPA又はプロカインアミドを含有する
３μｌのサンプルをキャベットの中に分与し、そして20
0μｌのドナー試薬を加えた。この混合液を37℃で５分
間インキュベートした後、150μｌのアクセプター試薬
を加えた。アクセプター試薬を加えた後243.4〜302.75
秒の時間にわたって吸収速度を測定した。用いた一次波
長は570nmで、二次波長として660nmを用いた。570nmに
おける吸収速度をプロカインアミド又はNAPA濃度に対し
てプロットして、用量応答曲線を作成した。実施例９の
免疫原に対して生じたNAPA特異性モノクローナル抗体で
得られた曲線を図７に示す。
シド） 1mg/mL Nacl 500mM K2HPO4 30mM EGTA 10mM EDTA,ジナトリウム 0.6mM Naアジド 20mM TWEEN−20 0.02％ pH 6.80 ポリオキシエチレンソルビタンについてのICI Americ
as,Inc.の登録商標 アクセプター試薬： 酵素アクセプター 220U/ml 酢酸マグネシウム 5mM NaCl 500mM K2HPO4 30mM EGTA 10mM Ｌ−メチオニン 10mM Naアジド 20mM TWEEN−20 0.02％ pH 6.80 アッセイはHITACHI 717自動分析装置を用いて行っ
た。この装置は、NAPA又はプロカインアミドを含有する
３μｌのサンプルをキャベットの中に分与し、そして20
0μｌのドナー試薬を加えた。この混合液を37℃で５分
間インキュベートした後、150μｌのアクセプター試薬
を加えた。アクセプター試薬を加えた後243.4〜302.75
秒の時間にわたって吸収速度を測定した。用いた一次波
長は570nmで、二次波長として660nmを用いた。570nmに
おける吸収速度をプロカインアミド又はNAPA濃度に対し
てプロットして、用量応答曲線を作成した。実施例９の
免疫原に対して生じたNAPA特異性モノクローナル抗体で
得られた曲線を図７に示す。
実施例12 プロカインアミド（PA）に対する抗血清の評価 この実施例では、BSA及びKLHに結合したＮ−１−（２
−アミノエチル）−４−カルボキシピペリジンｐ−アミ
ノベンズアミド（XIII）（実施例８）で免疫感作したマ
ウスからの血清を実施例11に記載した操作を用いて評価
した。次の結果が得られた。
−アミノエチル）−４−カルボキシピペリジンｐ−アミ
ノベンズアミド（XIII）（実施例８）で免疫感作したマ
ウスからの血清を実施例11に記載した操作を用いて評価
した。次の結果が得られた。
モジュレーション＊ 抗原 希釈度 阻害率（％） NAPA PA BSA結合体 1:400 50 １ 30 KLH結合体 1:400 66 ５ 60 ＊ 50μg/mlで 本明細書及び実施例は説明のためのものであって本発
明を限定するためのものではなく、当業者は本発明の精
神及び範囲内に入る他の態様を考えつくことが理解され
るであろう。
明を限定するためのものではなく、当業者は本発明の精
神及び範囲内に入る他の態様を考えつくことが理解され
るであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/96 Ｃ１２Ｎ 9/96 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ Ｊ 33/531 33/531 Ａ 33/542 33/542 Ｂ 33/577 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/385 Ａ６１Ｋ 39/385 (72)発明者 ウォルター，チャールズ エフ. アメリカ合衆国 46032 インディアナ 州 カーメル，ウォルター ドライヴ 210番地 (72)発明者 グランシー，トッド アメリカ合衆国 46928 インディアナ 州 フェアマウント，4240 イースト 1050 サウス (72)発明者 クライン，フランク イー. アメリカ合衆国 21921 メリーランド 州 エルクトン，メドー クリーク レ ーン 201番地，アパートメント ３ (72)発明者 フーバー，エラスムス ドイツ連邦共和国 ディー−86923 フ ィニング，エステー．ヴィリバルト 10 番地 (56)参考文献 特開 昭59−130848（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−227660（ＪＰ，Ａ) 米国特許4235969（ＵＳ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａ ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ, 69（６），721−４（1980) Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈｒｍａ ｃ．，15（８），887−97（1993) Ｃｌｉｎ．ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．，1968，901−９（1968) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (17)
- 【請求項１】下記式： 〔式中、 Ｘ＝水素又はアセチル、そして Ｒ１＝ヒドロキシル又は （式中、Ｒ２＝２〜10の炭素原子を有するアルキル、シ
クロアルキル又はアリール基）〕 で示される化合物。 - 【請求項２】下記式： 〔式中、 Ｘ＝水素又はアセチル； ｎ＝１〜ｐ（ｐ＝ＺのMW/1000）； Ｚ＝ポリ（アミノ酸）、酵素ドナーポリペプチド、標識
基又は多糖類；そして Ｒ３＝結合又は （式中、Ｒ２＝２〜10の炭素原子を有するアルキル、シ
クロアルキル又はアリール基）〕 で示される化合物。 - 【請求項３】Ｚが免疫原性ポリ（アミノ酸）又は多糖類
である、請求項２に記載の化合物。 - 【請求項４】Ｚが酵素又は酵素ドナーポリペプチドであ
る、請求項２に記載の化合物。 - 【請求項５】Ｚがキーホールリンペットヘモシアニンで
ある、請求項２に記載の化合物。 - 【請求項６】Ｚがβ−ガラクトシダーゼの酵素ドナーポ
リペプチドである、請求項２に記載の化合物。 - 【請求項７】Ｚが酵素、蛍光性物質又は放射性標識から
なる群から選択される標識である、請求項２に記載の化
合物。 - 【請求項８】Ｒ２が２の炭素原子を有するアルキル基で
ある、請求項１に記載の化合物。 - 【請求項９】Ｒ２が(CH2)2である、請求項２に記載の化
合物。 - 【請求項１０】下記式： 〔式中、 Ｘ＝水素又はアセチル、そして Ｒ１＝ヒドロキシル又は （式中、Ｒ２＝２〜10の炭素原子を有するアルキル、シ
クロアルキル又はアリール基）〕 で示される前駆体化合物を免疫原性ポリ（アミノ酸）又
は多糖類とカップリングさせる段階を含む免疫原を製造
する方法。 - 【請求項１１】前記免疫原性ポリ（アミノ酸）がキーホ
ールリンペットヘモシアニンである、請求項10に記載の
方法。 - 【請求項１２】下記式： 〔式中、 Ｘ＝水素又はアセチル、そして Ｒ１＝ヒドロキシル又は （式中、Ｒ２＝２〜10の炭素原子を有するアルキル、シ
クロアルキル又はアリール基）〕 で示される前駆体化合物を酵素ドナーポリペプチドとカ
ップリングさせる段階を含むハプテン−酵素ドナー結合
体を製造する方法。 - 【請求項１３】前記酵素ドナーポリペプチドがβ−ガラ
クトシダーゼの酵素ドナーポリペプチドである、請求項
12に記載の方法。 - 【請求項１４】サンプル中のプロカインアミドを測定す
る方法であって、 （ａ）前記サンプルを （ｉ）Ｘが水素であり、Ｚがβ−ガラクトシダーゼの酵
素ドナーポリペプチドである請求項２に記載の化合物の
酵素ドナーポリペプチド結合体； （ii）前記酵素ドナーポリペプチド結合体とともに、プ
ロカインアミドに対する抗体の不存在下でβ−ガラクト
シダーゼ活性を有する活性な酵素複合体を形成すること
により特徴付けられる酵素アクセプターポリペプチド； （iii）プロカインアミドに特異的な抗体であって、前
記酵素ドナー結合体が前記抗体に競合的に結合すること
により、活性な酵素複合体の形成を阻害することができ
る抗体； （iv）前記活性な酵素複合体と反応することができる基
質であって、前記活性な酵素複合体による前記基質の転
化速度をモニターすることができる基質；と接触させ、
そして （ｂ）前記活性な酵素複合体による前記基質の転化速度
を測定する ことを含む測定方法。 - 【請求項１５】プロカインアミドに対する前記抗体が、
下記式： 〔式中、 Ｘ＝水素又はアセチル； ｎ＝１〜ｐ（ｐ＝ＺのMW/1000）； Ｚ＝抗原性ポリ（アミノ酸）又は多糖類；そして Ｒ３＝結合又は （式中、Ｒ２＝２〜10の炭素原子を有するアルキル、シ
クロアルキル又はアリール基）〕 で示される化合物に対する免疫学的応答において調製さ
れる、請求項14に記載の方法。 - 【請求項１６】サンプル中のNAPAを測定する方法であっ
て、 （ａ）前記サンプルを （ｉ）Ｘがアセチルであり、Ｚがβ−ガラクトシダーゼ
の酵素ドナーポリペプチドである請求項２に記載の化合
物の酵素ドナーポリペプチド結合体； （ii）前記酵素ドナーポリペプチド結合体とともに、NA
PAに対する抗体の不存在下でβ−ガラクトシダーゼ活性
を有する活性な酵素複合体を形成することにより特徴付
けられる酵素アクセプターポリペプチド； （iii）NAPAに特異的な抗体であって、前記酵素ドナー
結合体が前記抗体に競合的に結合することにより、活性
な酵素複合体の形成を阻害することができる抗体； （iv）前記活性な酵素複合体と反応することができる基
質であって、前記活性な酵素複合体による前記基質の転
化速度をモニターすることができる基質；と接触させ、
そして （ｂ）前記活性な酵素複合体による前記基質の転化速度
を測定する ことを含む測定方法。 - 【請求項１７】NAPAに対する前記抗体が下記式： 〔式中、 Ｘ＝水素又はアセチル； ｎ＝１〜ｐ（ｐ＝ＺのMW/1000）； Ｚ＝抗原性ポリ（アミノ酸）又は多糖類；そして Ｒ３＝結合又は （式中、Ｒ２＝２〜10の炭素原子を有するアルキル、シ
クロアルキル又はアリール基）〕 で示される化合物に対する免疫学的応答において調製さ
れる、請求項16に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/190,348 | 1994-01-31 | ||
| US190348 | 1994-01-31 | ||
| US08/190,348 US5525474A (en) | 1994-01-31 | 1994-01-31 | Piperidine analogs and conjugates of procainamide and NAPA |
| PCT/US1995/001249 WO1995020763A1 (en) | 1994-01-31 | 1995-01-31 | Piperidine analogs and conjugates of procainamide and napa |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09508393A JPH09508393A (ja) | 1997-08-26 |
| JP3031636B2 true JP3031636B2 (ja) | 2000-04-10 |
Family
ID=22700969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07520245A Expired - Fee Related JP3031636B2 (ja) | 1994-01-31 | 1995-01-31 | ピペリジン類似体とプロカインアミド及びｎａｐａの結合体 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5525474A (ja) |
| EP (1) | EP0742903B1 (ja) |
| JP (1) | JP3031636B2 (ja) |
| AU (1) | AU682931B2 (ja) |
| CA (1) | CA2181898A1 (ja) |
| DE (1) | DE69525038T2 (ja) |
| ES (1) | ES2171183T3 (ja) |
| WO (1) | WO1995020763A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5439798A (en) * | 1993-12-17 | 1995-08-08 | Boehringer Mannheim Corporation | Maleimide adduct conjugates of procainamide and NAPA |
| ES2229341T3 (es) * | 1997-05-27 | 2005-04-16 | Microgenics Corporation | Conjugados e inmunoensayos especificos para el metabolito de la metadona 2-etilidina-1,5-dimetil-3,3-difenil-pirrolidina. |
| US6262265B1 (en) | 1999-06-18 | 2001-07-17 | Microgenics Corporation | Non-hydrolyzable analogs of heroin metabolites suitable for use in immunoassay |
| US7279340B2 (en) * | 2004-04-07 | 2007-10-09 | Dade Behring Inc. | Synthesis and application of procainamide analogs for use in an immunoassay |
| EP2849790B1 (en) * | 2012-05-15 | 2019-04-10 | Concortis Biosystems, Corp | Drug-conjugates, conjugation methods, and uses thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4235969A (en) * | 1978-05-08 | 1980-11-25 | Syva Company | Procainamide antigen conjugates and antibodies |
| IL69997A0 (en) * | 1983-01-03 | 1984-01-31 | Miles Lab | Procainamide and n-acetylprocainamide immunogens,antibodies prepared therefrom,labeled conjugates,and the use of such antibodies and labeled conjugates in immunoassays |
| US4673763A (en) * | 1983-01-03 | 1987-06-16 | Miles Laboratories, Inc. | Alpha-functionalized derivatives and labeled conjugates of procainamide and NAPA |
| EP0199042A1 (en) * | 1985-03-26 | 1986-10-29 | Abbott Laboratories | Procainamide assay, tracers, immunogens and antibodies |
| US5439798A (en) * | 1993-12-17 | 1995-08-08 | Boehringer Mannheim Corporation | Maleimide adduct conjugates of procainamide and NAPA |
-
1994
- 1994-01-31 US US08/190,348 patent/US5525474A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-01-31 WO PCT/US1995/001249 patent/WO1995020763A1/en active IP Right Grant
- 1995-01-31 DE DE69525038T patent/DE69525038T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-01-31 ES ES95908752T patent/ES2171183T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 CA CA002181898A patent/CA2181898A1/en not_active Abandoned
- 1995-01-31 EP EP95908752A patent/EP0742903B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-01-31 JP JP07520245A patent/JP3031636B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-01-31 AU AU16970/95A patent/AU682931B2/en not_active Ceased
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｃｌｉｎ．ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９６８，９０１−９（１９６８） |
| Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈｒｍａｃ．，１５（８），８８７−９７（１９９３） |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６９（６），７２１−４（１９８０） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5525474A (en) | 1996-06-11 |
| JPH09508393A (ja) | 1997-08-26 |
| EP0742903A1 (en) | 1996-11-20 |
| EP0742903B1 (en) | 2002-01-16 |
| DE69525038D1 (de) | 2002-02-21 |
| AU682931B2 (en) | 1997-10-23 |
| EP0742903A4 (en) | 2000-04-05 |
| ES2171183T3 (es) | 2002-09-01 |
| WO1995020763A1 (en) | 1995-08-03 |
| CA2181898A1 (en) | 1995-08-03 |
| DE69525038T2 (de) | 2002-08-29 |
| AU1697095A (en) | 1995-08-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5031585B2 (ja) | ５−フルオロ−ウラシル免疫測定法 | |
| AU2011224719B2 (en) | Lenalidomide and thalidomide immunoassays | |
| JP4896959B2 (ja) | ドキソルビシン免疫測定法 | |
| JP5695049B2 (ja) | イマチニブ免疫アッセイ | |
| US5439798A (en) | Maleimide adduct conjugates of procainamide and NAPA | |
| JP3031636B2 (ja) | ピペリジン類似体とプロカインアミド及びｎａｐａの結合体 | |
| EP0931062A1 (en) | Conjugates and specific immunoassays for the methadone metabolite 2-ethylidine-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine | |
| JP2732825B2 (ja) | 新規なベンゾジアゼピン−タンパク質結合体 | |
| JP4486994B2 (ja) | ブスルファンイムノアッセイ | |
| JP2014519036A (ja) | ゲムシタビンイムノアッセイ | |
| JPH0317300B2 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |