JP2014519036A - ゲムシタビンイムノアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
− 臓器機能
− 遺伝的調節
− 病態
− 年齢
− サンプリングの時期
− 薬物投与方法
− 技法関連投与
このような多様性の結果として、以下に例示されるように(Hon,YY及びWE Evans、Clin Chem、44、2、388〜400、1998)、異なる個体間で同一薬物を同一量投与しても臨床成果が劇的に異なり得る。同量のゲムシタビン投与の効果は、個体の薬物代謝及び患者における最終的な血清薬物濃度に基づいて有意に変化する。治療薬物管理によって臨床医は、経口及び静脈内薬物投与の両方における患者間の差について識見をもち得る。治療薬物管理によって、薬物投与量を患者それぞれに個別配慮することが可能となり、好ましくない副作用は起こさずに、効果的ながん治療の機会が大いに高まり得る(Nieto,Y、Curr Drug Metab、2、1、53〜66、2001)。
(式中、Bは、−CH2−又は
であり、
Yは、有機スペーシング基であり、
Xは、前記アミノ基又はチオール基を介して前記担体に結合することができる官能基であり、
pは、0又は1の整数である)
の5−置換ゲムシタビン化合物又はその塩とのコンジュゲートである免疫原を使用することにより、ゲムシタビンに特異的であり、薬学的に不活性な代謝物2’,2’−ジフルオロ−2’−デオキシウリジン並びにテトラヒドロウリジンとは実質的に反応しない又は結合しない抗体が作製されることを見出した。ゲムシタビンと実質的に選択的に反応し、2’,2’−ジフルオロ−2’−デオキシウリジン及びテトラヒドロウリジンとは交差反応しないこれらの抗体を提供することによって、ゲムシタビンによる治療中の患者の体液試料中のゲムシタビンを特異的に検出しモニターすることができるイムノアッセイの作製が可能となる。また本発明には、前記イムノアッセイのための試薬及びキットが含まれる。
式中、X’は、−CH2−又は官能性連結基であり、Y、B、及びpは上述の通りである。
定義
イムノアッセイを構築する際、ゲムシタビンのコンジュゲートは、抗体の結合部位で試料中のゲムシタビンと競合するように構築される。本発明のイムノアッセイにおいて、試薬は、式IVの化合物の5’置換ゲムシタビン誘導体と、前述の必須の特性を有する抗体とのコンジュゲートである。式IV−Bの化合物において、リンカースペーサー(linker spacer)はこの分子の−B−(Y)p−X’部を構成する。コンジュゲート及び免疫原を調製する際の、これらのリンカーにおけるX’及びスペーサー−B−(Y)p−X’は、従来のものである。イムノアッセイのためのコンジュゲート及び免疫原を調製するために利用される、従来のあらゆるスペーサー連結基は、式IV−Bの化合物において利用され得る。このような従来のリンカー及びスペーサーは、米国特許第5,501,987号及び米国特許第5,101,015号に開示される。
(式中、n及びoは0から6までの整数であり、mは1から6までの整数である)、とりわけ好ましいスペーシング基はアルキレンである。Yで表されるスペーシング基の前述の構造に関して、官能基Xは、本構造の右側の末端部すなわち(CH2)m及び(CH2)oが位置するところに連結される。
であることが好ましく、式中、R3は水素であるか又はそれが結合している酸素原子と一緒になって反応性エステルを形成し、R4は酸素又は硫黄である。
基は、イソシアネート又はイソチオシアネートであり得る。−OR3によって形成される活性エステルは、N−ヒドロキシスクシンアミドなどのイミドエステル、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、及びp−ニトロフェニルエステルを含む。しかしながら、アミン又はチオール基と反応することができるあらゆる活性エステルが使用できる。
本化合物は、免疫原を含む重合体又はタンパク質担体に存在し得るチオール(又はSH)基と反応することが好ましい。Xがマレイミド基である場合、式IVの化合物は以下の構造を有する。
式中、R15はチオール保護基であり、
R3は上述の通りであり、
vは1から4までの整数である。
(式中、R4は前述の通りである)であり、ポリアミン系担体又は免疫原性ポリペプチドのアミノ基と官能的に接続する。
(式中、R10は、加水分解性ヒドロキシ保護基であり、R11は、加水分解性アミノ保護基である)
の化合物を作製する際の5’位の遊離ヒドロキシ基に影響を与える。
halo−CH2−(Y)p−X VIII−B
(式中、p、Y、及びXは前述の通りである)
のハロゲン化物とゲムシタビンの5’−ヒドロキシ基を反応させることにより形成される。
である、式IVの5’−置換化合物は、式
NH2−CH2−(Y)p−X IX
(式中、X、Y、及びpは前述の通りである)
のアミノ化合物とゲムシタビンの5’−ヒドロキシ基を反応させることにより作製される。
に最初に変換した後
ヒドロキシ基をクロロホルメート基に変換するあらゆる従来の方法が使用できる。クロロホルメートの形成後、クロロホルメートのハロゲン基を、式IXの化合物のアミン基と縮合する。この反応に先立って、ゲムシタビン及び/又は式IXの化合物の反応基は、従来の保護基を用いて前述の通り保護される。これまでにここで記載されたような従来の方法によって、このハロゲン化物縮合の後、これらの保護基を取り除くことができる。
本発明はまた、前述の免疫原を利用することにより作製される、ゲムシタビンに対するモノクローナル抗体を含む新規な抗体に関する。本発明によれば、本発明によって作製されたこれらの抗体は、ゲムシタビンと選択的に反応し、薬学的に不活性な代謝物及びゲムシタビンのイムノアッセイを妨害する可能性のあるその他の化合物とは反応しないことが見出されてきた。これらのゲムシタビン代謝物で最も問題となるのは、2’,2’−ジフルオロ−2’−デオキシウリジンであり、最も問題となる保存剤はテトラヒドロウリジンである。これらの不活性な代謝物及びこの保存剤とは反応しない本発明の抗体の能力によって、これらの抗体はゲムシタビンのイムノアッセイを実現することにおいて特に役立つ。
本発明によれば、IVの化合物又はその塩の免疫原から生成された抗体及びコンジュゲートを、患者試料中のゲムシタビンを決定するための試薬として利用することができる。この決定はイムノアッセイによって実施される。IVの化合物又はその塩から形成される試薬コンジュゲートが、本発明に従って生成した抗体の結合部位に試料中のゲムシタビンと競合する、あらゆるイムノアッセイが患者試料中のゲムシタビンの存在を決定するために利用できる。ゲムシタビンを含有する疑いのある試料中のゲムシタビンに対するこのようなアッセイを行う方法は、(a)水系溶媒試料(b)本発明に従って生成したゲムシタビンに対する抗体、及び(c)式IVの化合物又はその塩から形成されるコンジュゲートを組み合わせることを含む。試料中のゲムシタビン量は、試料と抗体の混合物に添加された既知量のコンジュゲートの、特異的抗体への結合の阻害を測定することにより決定することができる。未知の試料による、既知量のコンジュゲートとのこのような結合の阻害の結果は、既知のゲムシタビン標準溶液を利用することによって、同じアッセイで得られた結果と比較される。
EtOAc 酢酸エチル
Na2CO3 炭酸水素ナトリウム
Boc2O 二炭酸ジ−tert−ブチル
CDI 1,1’−カルボニルジイミダゾール
Na2SO4 硫酸ナトリウム
CH2Cl2 ジクロロメタン
THF テトラヒドロフラン
N2 窒素ガス
THF テトラヒドロフラン
TFA トリフルオロ酢酸
DNSO ジメチルスルホキシド
s−NHS スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド
EDC 1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩
KLH キーホールリンペットヘモシアニン
BSA ウシ血清アルブミン
PBS リン酸緩衝生理食塩水
NaCl 塩化ナトリウム
HRP 西洋ワサビペルオキシダーゼ
ANS 8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸
TMB 3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン
TRIS トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩
di−H2O 脱イオン水
15.4mM 第二リン酸ナトリウム(Na2HPO4)
4.6mM 第一リン酸ナトリウム(NaH2PO4)
pH=7.2±0.10
5’−O−N−カルボニル(ゲムシタビン)−6’−アミノカプロエート[7]の調製(スキーム1)
化合物[1](1.2g、4.0mmol)及びBoc2O(0.88g、4.0mmol)をジオキサン(60mL)中で撹拌し、Na2CO3(2.12g、20.0mmol)水溶液(15mL)を添加した。この反応混合物を25℃で48時間撹拌すると、混合物中に[2]を得た。水(40mL)を反応混合物に添加し、産物[2]をEtOAcで抽出した。EtOAcの有機相を塩水で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、蒸発させて白色固体を得、次に10%CH2Cl2/ヘキサンで粉砕して化合物[2]を得た(1.26g、87%)。
5’−O−N−カルボニル−(ゲムシタビン)−6’−メチルカルバモイル安息香酸[12]の調製(スキーム2)
化合物[4](0.60g、1.08mmol)及び化合物[10](0.38g、1.19mmol)をTHF(20mL)中で混合し、還流下で24時間加熱した。反応混合物をEtOAcで希釈し、連続して水及び塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、その後蒸発させて白色固体を得た。この物質を10から90%のEtOAc/ヘキサンを用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製し、化合物[11]を得た(0.47g、54%)。
s−NHS活性化薬物誘導体を対応する酸[7]及び[12]から調製する一般的方法
例3a及び例3bにおいて、ゲムシタビン酸誘導体[7]及び[12]は、EDC及びs−NHSで活性化され、タンパク質への最終コンジュゲーションとしてのゲムシタビンのs−NHS活性化エステル[8]及び[13]を生成した(例4及び例5)。
s−NHS活性化エステル5’−O−N−カルボニル(ゲムシタビン)−6’−アミノカプロエート[8]の調製
例1、スキーム1の化合物[7](101.3mg)を、s−NHS(121.7mg)及びEDC(107.1mg)を添加した10mLのDMSOに溶解した。反応混合物を窒素雰囲気下の周囲温度で20時間撹拌し、化合物[8]を生成した。この反応混合物を例4及び例5aにおいて直接使用した。
s−NHS活性化エステル5’−O−N−カルボニル−(ゲムシタビン)−6’−メチルカルバモイル安息香酸[13]の調製
例2、スキーム2の化合物[12](22.7mg)を、2.2mLのDMSOに溶解し、s−NHS(19.2mg)及びEDC(21.9mg)を添加した。反応混合物を窒素雰囲気下の周囲温度で20時間撹拌し、化合物[13]を生成した。この反応混合物を例5bにおいて直接使用した。
ゲムシタビン−KLHコンジュゲート[9]の調製
KLHのタンパク質溶液は、15mLのリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に300mgのKLHを溶解することにより調製し、その後に例3aで調製した化合物[8]4.74mLを添加した。KLH及び化合物[8]の反応混合物を室温で20時間撹拌しておくと、ゲムシタビンKLHコンジュゲート[9]が生成した。次に、このゲムシタビンKLHコンジュゲート[9]を、30%DMSOを含むリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に対する透析により室温で精製した。その後、DMSOの割合を、20%、10%、そして0%と段階的に減少させた。最終の透析は、4℃のリン酸緩衝液に対して行った。ゲムシタビンKLHコンジュゲート[9]は、紫外可視分光法によって特徴付けた。本コンジュゲートを、最終濃度が2mg/mLとなるようにリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に希釈した。
活性化ハプテン、ゲムシタビン[8]を有するBSAコンジュゲート[9]の調製
BSAのタンパク質溶液は、最終濃度が50mg/mLとなるようにリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に1gのBSAを溶解して調製した。このタンパク質溶液に、例3aで調製した0.83mLのs−NHS活性化ゲムシタビン誘導体[8]を添加した。BSAのタンパク質溶液に添加されるs−NHS活性化ゲムシタビン誘導体[8]の量は、ゲムシタビンの誘導体[8]とBSAを1:1モル比として算出した。BSAと活性化ゲムシタビン誘導体[8]の混合物を室温で18時間撹拌しておくと、活性化ゲムシタビンエステル[8]とBSAのコンジュゲートが生成した。次に、このコンジュゲートを、20%DMSOを含むリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に対する透析により室温で精製した。その後、DMSOの割合を、10%、0%と段階的に減少させた。最終の透析は、4℃のリン酸緩衝液に対して行った。精製したゲムシタビン[9]−BSAコンジュゲートは、UV/VIS分光法によって特徴付けた。
活性化ハプテンゲムシタビン−[13]を有するBSAコンジュゲート[9]の調製
BSAのタンパク質溶液は、最終濃度が50mg/mLとなるようにリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に1gのBSAを溶解して調製した。10.0mLのBSAのタンパク質溶液に、氷上で撹拌しながら、例3bで調製した0.620mLのs−NHS活性化ゲムシタビン誘導体[13]を添加した。BSAのタンパク質溶液に添加されるs−NHS活性化ゲムシタビン誘導体[13]の量は、ゲムシタビンの誘導体[13]とBSAを1:1モル比として算出した。BSAと活性化ゲムシタビン誘導体[13]の混合物を室温で18時間撹拌しておくと、活性化ゲムシタビンエステル[13]とBSAのコンジュゲートが生成した。次に、このコンジュゲートを、15%DMSOを含むリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に対する透析により室温で精製した。その後、DMSOの割合を、10%、5%、そして0%と段階的に減少させた。最終の透析は、4℃のリン酸緩衝液に対して行った。精製したゲムシタビン−BSAコンジュゲート[14]は、UV/VIS分光法によって特徴付けた。
ゲムシタビン−KLH[9]に対するポリクローナル抗体の調製
例4で調製したゲムシタビン−KLH免疫原[9]を完全フロイントアジュバント(Complete Freund’s adjuvant)に乳化して、雌BALB/cマウス10匹に一個体あたり100μgを腹腔内投与して免疫化した。本マウスは、不完全フロイントアジュバント(Incomplete Freund’s Adjuvant)に乳化した同じ免疫原を一個体あたり100μg用いて、最初の注入から4週後に一度追加免疫した。追加免疫より20日後に、それぞれのマウスから、ポリクローナル抗体を含有するものとして眼窩採血によって検査採血した。ゲムシタビン抗体を含有する、これらの検査採血から得た抗血清を例8及び例9で評価した。
ゲムシタビン−BSAコンジュゲート[9]を用いたマイクロタイタープレート増感法
ゲムシタビン濃度を測定するELISA法は、タンパク質結合を最適化した、1プレートあたり96ウエル含むポリスチレンマイクロタイタープレート(Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules)で実施した。各ウエルは、0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6中10μg/mLのゲムシタビン−BSAコンジュゲート[9]を300μL添加して、室温で3時間インキュベートすることによって、(例5aのように調製された)ゲムシタビン−BSAコンジュゲート[9]で被覆した。ウエルを0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6で洗浄し、その後、375μLの5%ショ糖、0.2%カゼイン酸ナトリウム溶液で、30分間、室温でブロックした。被覆後溶液を取り除いた後、プレートを37℃で一晩乾燥した。
ゲムシタビン−BSAコンジュゲート[14]を用いたマイクロタイタープレート増感法
ゲムシタビン濃度を測定するELISA法は、タンパク質結合を最適化した、1プレートあたり96ウエル含むポリスチレンマイクロタイタープレート(Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules)で実施した。各ウエルは、0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6中10μg/mLのゲムシタビン−BSAコンジュゲート[14]を300μL添加して、室温で3時間インキュベートすることによって、(例5bのように調製された)ゲムシタビン−BSAコンジュゲート[14]で被覆した。ウエルを0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6で洗浄し、その後、375μLの5%ショ糖、0.2%カゼインナトリウム溶液で、30分間、室温でブロックした。被覆後溶液を取り除いた後、プレートを37℃で一晩乾燥した。
抗体スクリーニング法−力価
本方法は、例9のような置換における、検査抗体の希釈度を見出すことである。例7a及び例7bで調製されたゲムシタビン−BSAコンジュゲートで感作されたマイクロタイタープレートを用いて、(例6で作製された)ゲムシタビン抗体をスクリーニングするELISA法を実施した。この抗体スクリーニングアッセイは、0.1%BSA及び0.01%チメロサール含有リン酸緩衝生理食塩水中で、ポリクローナルゲムシタビン抗体を含有する(例6のような)検査採血由来のマウス血清を、1:10、1:100、1:1000、及び1:10,000(容積/容積)にまで希釈して実施した。(例7a及び例7bで調製された)ゲムシタビン−BSA感作ウエルの各ウエルに、0.1%BSA及び0.01%チメロサール含有リン酸緩衝生理食塩水50μLと、50μLの希釈抗体を添加し、振とうしながら室温で10分間インキュベートした。このインキュベート中に、抗体が、ウエルに受動的に吸収されたゲムシタビン−BSAコンジュゲート(例7a及び例7b)に結合する。本プレートのウエルを、0.02MのTRIS、0.9%のNaCl、0.5%のTween−80、及び0.001%のチメロサール、pH7.8で3回洗浄して未結合の抗体を取り除いた。ウエル中のゲムシタビン−BSAコンジュゲートに結合しているゲムシタビン抗体の量を検出するため、マウスイムノグロブリンと特異的に結合し、且つ、基質、本例中ではTMB、とインキュベートすると着色産物を生成することができる、0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%チメロサール含有PBS中で特定の活性(約1/3000)にまで希釈した100μLのヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲート(Jackson Immunoresearch)を、各ウエルに添加した。振とうしながら室温で10分間インキュベートし、その間にヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートはウエル中のゲムシタビン抗体に結合するが、その後、本プレートを再度3回洗浄して未結合のヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートを取り除いた。ウエル中の測定可能な色を発現させるため、洗浄した後、100μLのTMB(TMB基質、BioFx)、HRPに対する基質を添加して、室温で10分間振とうしながら発色させた。発色のためのインキュベーションに続いて、650nmの吸光度を測定した(Molecular Devices Plate Reader)。ウエル中の抗体量は測定した吸光度に比例し、希釈度(力価)として示され、吸光度1.5という結果となった。測定した抗体の抗体希釈度(x軸)と650nmの吸光度(y軸)をグラフ化し、吸光度1.5での力価を内挿することによって力価を決定した。吸光度1.5を示す力価によって、例9で記述される間接競合型マイクロタイタープレートアッセイで使用される抗体の濃度(希釈度)を決定した。
ゲムシタビンに対する抗体のIC50及び交差反応性を決定する、間接競合型マイクロタイタープレートイムノアッセイ法
IC50値及び交差反応性を決定するELISA法を、例7a及び例7bで記述したゲムシタビン−BSAコンジュゲートで感作されたマイクロタイタープレートを用いて実施した。被検体を以下の通り希釈した。ゲムシタビンは、ゲムシタビン[9]−BSAマイクロタイタープレート及びゲムシタビン[14]−BSAマイクロタイタープレートに対して、0.1から500ng/mLまでの濃度範囲にわたって、0.1%BSA及び0.01%チメロサール含有リン酸緩衝生理食塩水中に希釈した。2’,2’−ジフルオロ−2’−デオキシウリジン及びテトラヒドロウリジンは、ゲムシタビン[9]−BSAマイクロタイタープレート及びゲムシタビン[14]−BSAマイクロタイタープレートに対して、0.02から0.1μg/mLまでの濃度範囲にわたって、0.1%BSA及び0.01%チメロサール含有リン酸緩衝生理食塩水中に希釈した。それぞれのアッセイは、50μLの被検体溶液を、50μLの、例4の免疫原を用いて例6において作製されたポリクローナル抗体から選択された抗体の一つとインキュベートすることにより実施した。本アッセイはすべて、各ウエルにおける抗体の濃度を、例8で決定した力価まで希釈することにより実施した。(室温で振とうしながら)10分間のインキュベーションの間に、(例7a及び例7bで作製した)ウエル中のゲムシタビン−BSAコンジュゲートに対して結合する抗体と溶液中の被検体とに競合がおこる。インキュベーションの後、本プレートのウエルを、0.02MのTRIS、0.9%のNaCl、0.5%のTween−80、及び0.001%のチメロサール、pH7.8で3回洗浄して、未結合のあらゆる物質を取り除いた。(例7a及び例7bで作製した)ウエル中のゲムシタビン−BSAコンジュゲートに結合しているゲムシタビン抗体の量を検出するため、マウスイムノグロブリンと特異的に結合し、且つ、基質、本例中ではTMB、とインキュベートすると着色産物を生成することができる、0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%チメロサール含有PBS中で、あらかじめ設定された特定の活性(約1/3000)にまで希釈した100μLのヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲート(Jackson Immunoresearch)を、各ウエルに添加した。振とうしながら室温で10分間インキュベートし、その間にヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートはウエル中のゲムシタビン抗体に結合するが、その後、本プレートを再度3回洗浄して未結合の二次コンジュゲートを取り除いた。ウエル中の測定可能な色を発現させるため、洗浄した後、100μLのTMB(TMB基質、BioFx)、HRPに対する基質を添加し、室温で振とうしながら10分間インキュベーションして発色させた。発色のためのインキュベーションに続いて、50μLの停止溶液(di−H2O中の1.5%フッ化ナトリウム)を各ウエルに添加して発色を止め、20秒間振とうした後、650nmの吸光度を測定した(Molecular Devices Plate Reader)。ウエル中の抗体量は、測定した吸光度に比例し、試料中のゲムシタビン量に逆比例した。ゲムシタビン及び2’,2’−ジフルオロ−2’−デオキシウリジンのIC50値は、ウエル中の被検体濃度に対して作図したウエル中の吸光度を用いた容量反応曲線を作成して決定した。被検体を含有するウエル中の着色の吸光度を、被検体を含まない場合と比較して標準曲線を作成した。所与の被検体におけるIC50値とは、被検体を含有しないウエルの50%の吸光度を示すために必要な被検体濃度と定義した。交差反応性は、2’,2’−ジフルオロ−2’−デオキシウリジンのIC50値に対するゲムシタビンのIC50の比として算出し、パーセントで表した。この方法を用いてモノクローナル抗体のライブラリーをスクリーニングした後、モノクローナル抗体を選択した。選択したこれらの抗体を、そのプレートとウエル番号によって、5H8−24、12A5−24、2F12−24、14G3−15、13B12−10、16D6−p−10、及び10G1−11のように分類した。これらの抗体を用いて測定すると、2’,2’−ジフルオロ−2’−デオキシウリジン(dFdU)に対するゲムシタビンについての、これらの抗体の交差反応性パーセントは0.1〜0.8%であり、3,4,5,6−テトラヒドロウリジン(THU)に対するゲムシタビンについての、これらの抗体の交差反応性パーセントは0.0058〜0.028%であった。ゲムシタビンモノクローナル抗体における結果を、以下の表I及び表IIに示す。
Claims (40)
- 試料中のゲムシタビンを検出するイムノアッセイであって、
a)試料と、
b)ゲムシタビンと選択的に反応するが、2’,2’−ジフルオロ−2’−デオキシウリジン及びテトラヒドロウリジンとは実質的に交差反応しない抗体と、
c)反応性チオール基又はアミノ基のいずれかを有する担体と、式
(式中、Bは、−CH2−又は
であり、
Yは、有機スペーシング基であり、
Xは、前記アミノ基又はチオール基を介して前記担体に結合することができる官能基であり、
pは、0又は1の整数である)
の化合物又はその塩とのコンジュゲートと
の混合物を用意し、
前記試料中のゲムシタビン及び前記混合物中の前記コンジュゲートを前記抗体と結合させ、その後、前記試料中のゲムシタビンの存在を決定することができるように、前記抗体と結合する又は結合しない前記混合物中の前記コンジュゲートの量を測定することを含む、上記イムノアッセイ。 - 前記試料がヒト試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記担体がチオール基を含有し、免疫原性ポリマーに連結する化合物のXが前記チオールと反応することができる官能基である、請求項3に記載のイムノアッセイ。
- Yが低級アルキレンである、請求項5に記載のイムノアッセイ。
- 前記抗体が固相担体に付着している、請求項2に記載のイムノアッセイ。
- 前記固相担体がマイクロタイタープレートである、請求項8に記載のイムノアッセイ。
- 前記固相担体がナノ粒子である、請求項9に記載のイムノアッセイ。
- ゲムシタビンに選択的に結合し、2’,2’−ジフルオロ−2’−デオキシウリジン及びテトラヒドロウリジンに実質的に交差反応性を有しない抗体。
- ゲムシタビンと前記抗体の反応性に基づいて、2’,2’−ジフルオロ−2’−デオキシウリジン及びテトラヒドロウリジンに関する交差反応性が20%未満である、請求項11に記載の抗体。
- 前記交差反応性が10%未満である、請求項12に記載の抗体。
- マウス、ヒツジ、ウサギ、又はラット由来である、請求項11に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項14に記載の抗体。
- 前記担体がチオール基を含有し、免疫原性ポリマーにコンジュゲートした化合物のXが前記チオールと反応することができる官能基である、請求項16に記載の抗体。
- 前記化合物のYが低級アルキレンである、請求項18に記載の抗体。
- 前記抗体が、マウス、ヒツジ、ウサギ、又はラット由来である、請求項20に記載の抗体。
- pが0である、請求項22に記載の化合物。
- 形成される前記エステルが低級アルキルエステル、イミドエステル、又はアミドエステルである、請求項26に記載の化合物。
- pが1である、請求項22に記載の化合物。
- pが0である、請求項31に記載のコンジュゲート。
- pが1である、請求項32に記載のコンジュゲート。
- 前記コンジュゲートが、前記第一の容器に所定量存在する、請求項36に記載のキット。
- 前記試料中のゲムシタビンの量を決定するために使用される、請求項37に記載のキット。
- 前記担体が、反応性末端官能性チオール基を有し、Xが前記チオール基に結合することができる末端官能基である、請求項38に記載のキット。
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