PL195985B1 - Przeciwciało monoklonalne, jego zastosowanie, linia komórek hybrydom, zestaw diagnostyczny i sposóbdiagnostyczny in vitro - Google Patents
Przeciwciało monoklonalne, jego zastosowanie, linia komórek hybrydom, zestaw diagnostyczny i sposóbdiagnostyczny in vitroInfo
- Publication number
- PL195985B1 PL195985B1 PL98340465A PL34046598A PL195985B1 PL 195985 B1 PL195985 B1 PL 195985B1 PL 98340465 A PL98340465 A PL 98340465A PL 34046598 A PL34046598 A PL 34046598A PL 195985 B1 PL195985 B1 PL 195985B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- vasp
- antibody
- phosphoserine
- phosphorylation
- serine
- Prior art date
Links
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 title description 4
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 title description 2
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 title description 2
- 108010054220 vasodilator-stimulated phosphoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 165
- 102000049398 Vasodilator-stimulated phosphoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 160
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims abstract description 69
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 69
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 53
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 32
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 claims abstract description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 25
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 48
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims description 37
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 34
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 19
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 15
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 claims 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical group 0.000 description 23
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 13
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 230000008753 endothelial function Effects 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 206010048554 Endothelial dysfunction Diseases 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 230000008694 endothelial dysfunction Effects 0.000 description 9
- KAQKFAOMNZTLHT-OZUDYXHBSA-N prostaglandin I2 Chemical compound O1\C(=C/CCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H](O)C[C@@H]21 KAQKFAOMNZTLHT-OZUDYXHBSA-N 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004654 Cyclic GMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 7
- 108010003591 Cyclic GMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- XEYBHCRIKKKOSS-UHFFFAOYSA-N disodium;azanylidyneoxidanium;iron(2+);pentacyanide Chemical compound [Na+].[Na+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].[O+]#N XEYBHCRIKKKOSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940083618 sodium nitroprusside Drugs 0.000 description 7
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 229960001123 epoprostenol Drugs 0.000 description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 4
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 4
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 4
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 101000862089 Clarkia lewisii Glucose-6-phosphate isomerase, cytosolic 1A Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 3
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GMVPRGQOIOIIMI-UHFFFAOYSA-N (8R,11R,12R,13E,15S)-11,15-Dihydroxy-9-oxo-13-prostenoic acid Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDJHIEHUVPCEDK-IDTAVKCVSA-N 8-(4-chlorophenylthio)-cGMP Chemical compound N1([C@H]2[C@@H]([C@@H]3OP(O)(=O)OC[C@H]3O2)O)C=2NC(N)=NC(=O)C=2N=C1SC1=CC=C(Cl)C=C1 ZDJHIEHUVPCEDK-IDTAVKCVSA-N 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 229960000711 alprostadil Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- -1 guanyline Chemical compound 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N prostaglandin E1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N 0.000 description 2
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NKUZQMZWTZAPSN-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-bromoacetate Chemical compound BrCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O NKUZQMZWTZAPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZTKZVJMSCONAK-INIZCTEOSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 JZTKZVJMSCONAK-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000195955 Equisetum hyemale Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 108010012088 Fibrinogen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108020001621 Natriuretic Peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000004571 Natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010001441 Phosphopeptides Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010010336 Platelet Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000015795 Platelet Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108050001408 Profilin Proteins 0.000 description 1
- 102000011195 Profilin Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088675 Proline-rich peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- 102000003970 Vinculin Human genes 0.000 description 1
- 108090000384 Vinculin Proteins 0.000 description 1
- 108010023249 Zyxin Proteins 0.000 description 1
- 102000011177 Zyxin Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000011496 cAMP-mediated signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N ethyl formate Chemical compound CCOC=O WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 210000001650 focal adhesion Anatomy 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000008011 inorganic excipient Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960004903 invert sugar Drugs 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000692 natriuretic peptide Substances 0.000 description 1
- 230000004703 negative regulation of smooth muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002840 nitric oxide donor Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000008012 organic excipient Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002227 vasoactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 230000000304 vasodilatating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5064—Endothelial cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
Abstract
1. Przeciwcialo monoklonalne 16C2, wytwarzane przez linie komórek hybrydom o numerze dostepu DSM ACC 2330, lub jego fragment, zdolne do wiazania fosfoproteiny stymulowanej czynni- kami rozszerzajacymi naczynia (VASP) tylko wtedy, gdy VASP wystepuje w postaci fosforylowanej w pozycji seryny 239 (VASP z fosfoseryna w pozycji 239). 2. Zastosowanie przeciwciala 16C2 lub jego fragmentu, zdefiniowanego w zastrz. 1, jako srod- ka diagnostycznego. 10. Linia komórek hybrydom DSM ACC 2330, wytwarzajaca przeciwcialo monoklonalne 16C2. 11. Zestaw diagnostyczny, znamienny tym, ze zawiera przeciwcialo 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane w zastrz. 1. 12. Sposób diagnostyczny in vitro, znamienny tym, ze stosuje sie przeciwcialo 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane w zastrz. 1, do okreslania stanu fosforylacji VASP z fosfoseryna w pozycji 239 i/lub interakcji VASP z bialkami wmateriale biologicznym, albo do wplywania na stan fosforylacji VASP z fosfoseryna w pozycji 239 i/lub interakcje VASP z bialkami w materiale biologicznym. PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku są przeciwciało monoklonalne, jego zastosowanie, linia komórek hybrydom, zestaw diagnostyczny i sposób diagnostyczny in vitro.
Choroby układu naczyniowego są odpowiedzialne za wiele chorób przewlekłych i zagrażających życiu, takich jak zawał mięśnia sercowego, udar, zamykanie światła tętnic i wiele postaci niewydolności nerek.
Komórki śródbłonkowe, które, między innymi, kontrolują układ krzepnięcia krwi, funkcjonalny stan trombocytów oraz migrację komórek nacieku zapalnego i nowotworowych do ścian naczyń, stan skurczu i wzrost komórek mięśni gładkich, awięc również ciśnienie krwi i strukturę ścian naczyń, a także nowe unaczynianie, są szczególnie ważne dla regulacji układu naczyniowego. Wiele ztych funkcji ścian naczyń ulega zakłóceniu w ciężkich chorobach naczyniowych, ataka sytuacja może w końcu prowadzić do zawału mięśnia sercowego, udaru i wielu postaci niewydolności nerek.
Śródbłonek wytwarza ważne substancje prostacyklinę (PGI2) i tlenek azotu (NO), który jest również znany jako śródbłonkowy czynnik rozluźniający (EDRF), hamujące zarówno trombocyty, jak i komórki mięśni naczyń. Te czynniki śródbłonkowe, jak prostacyklina (PGI2) lub EDRF, np. NO, kontrolują funkcje śródbłonka.
Zatem wcelu leczenia chorób, które są związane z zaburzeniami czynności śródbłonka w specyficzny sposób, konieczne jest ustalenie parametrów biochemicznych, które umożliwiają diagnozowanie i kontrolowanie przebiegu zaburzeń czynności śródbłonka.
Pożądane jest, aby było możliwe jak najwcześniejsze rozpoznawanie zaburzeń czynności śródbłonka, to jest na etapie, na którym nie ujawniło się jeszcze samo nieodwracalne uszkodzenie, takie jak zmiany miażdżycowe, spowodowane przez zaburzenia czynności śródbłonka.
Identyfikacja zaburzeń czynności śródbłonka na wczesnym etapie umożliwia opracowanie nowych podejść terapeutycznych, które mogą spowodować zwrot w leczeniu zaburzeń czynności śródbłonka.
Metodami, które są znane do określania czynności śródbłonka in vivo są inwazyjne metody detekcji, takie jak angiografia ilościowa, albo nieinwazyjne metody obrazowania. Do wad tych metod należy to, że badania te prowadzi się bezpośrednio w organizmie pacjenta oraz to, że są one trudne do ilościowej oceny i bardzo kosztowne.
Dlatego też istnieje zapotrzebowanie na dostępne metody biochemiczne/immunobiologiczne, umożliwiające szybkie i proste określanie czynności śródbłonka w materiale biologicznym ex vivo, np. w próbkach komórek lub próbkach krwi, za pomocą rutynowych badań w laboratorium.
Czynnościami śródbłonka są te czynności, które mogą być regulowane przez czynniki śródbłonkowe, takie jak prostacyklina (PGI2) lub EDRF, np. NO.
Ostatnio odkryto, wyizolowano i scharakteryzowano z punktu widzenia genetyki molekularnej ludzką VASP (fosfoproteinę stymulowaną czynnikami rozszerzającymi naczynia), która podlega fosforylacji w trombocytach i komórek ścian naczyń w odpowiedzi na hormony i leki hipotensyjne (rozszerzające naczynia) (Haffner i in., EMBO J. 14, 19-27, 1995).
VASP jest ważnym składnikiem szlaku przekazywania sygnałów ANF/NO/cGMP/kinaza białkowa zależna od cGMP, bardzo istotnym pod względem fizjologicznym, patofizjologicznym i farmakologicznym, a także składnikiem szlaku przekazywania sygnałów cAMP/kinaza białkowa zależna od cAMP (U. Walter, Blick 1/97 Wϋrzburg University, str. 79-81, 1997). VASP jest eksprymowanawprawie wszystkich komórkach ludzkich i zwierzęcych, a szczególnie wysokie stężenie stwierdzonowtrombocytach, komórkach naczyń mięśni gładkich oraz fibroblastach. Whodowanych komórkach VASP jest związana zkontaktami ogniskowymi (miejscami kontaktu komórka/macierz), kontaktami komórka/komórka, mikrowłókienkami idynamicznymi regionami błonowymi (np. krawędzi wiodącej) (Walteriin., Agents and Actions 455, 255-268, 1995).
Fosforylacja VASPwukładzie naczyniowym jest skorelowanazhamowaniem adhezji/agregacji trombocytów, hamowaniem skurczu/migracji mięśni gładkich oraz zhamowaniem parakomórkowej przepuszczalności śródbłonka.
VASP ulega fosforylacji idefosforylacji wtrzech różnych miejscach (seryna 157, seryna 239 itreonina 278, patrz Horstrupiin.,Eur. J. Biochem. 225, 21-27 (1994)). Serynę 239 niekiedy oznacza
PL 195 985 B1 się również jako serynę 238, zwłaszcza wtedy, gdy w numeracji nie uwzględnia się pierwszej reszty metioniny VASP.
Seryna 239 VASP ulega fosforylacji w nienaruszonych ludzkich komórkach naczyniowych (trombocytach, komórkach śródbłonkowych i komórkach mięśni gładkich) w odpowiedzi na fizjologiczne i farmakologiczne donory NO oraz inhibitory trombocytów i czynniki rozszerzające naczynia.
Fosforylacja seryny 239 VASP przebiega w szczególności z udziałem zależnych od cGMP kinaz białkowych, które są aktywowane za pośrednictwem cGMP przez ważne hormony, takie jak peptydy natriuretyczne lub substancje i leki uwalniające NO. Fosforylacja seryny 239 VASP przebiega ponadto z udziałem zależnych od cAMP kinaz białkowych, które są aktywowane przez hormony i leki podwyższające poziom cAMP.
Podczas gdy kinazy białkowe zależne od cAMP zasadniczo fosforylują serynę w pozycji 157, fosforylują one również serynę w pozycji 239 VASP. Stwierdzono również, że fosforylacja VASP w pozycji seryny 157 jest ściśle skorelowana z hamowaniem wiązania fibrynogenu z glikoproteiną IIb-IIIa ludzkich płytek krwi (Hostrup i in., Eur. J. Biochem. 225, 21-27 (1994)).
Określenie stopnia, w jakim VASP została sfosforylowana w materiale biologicznym, np. w ekstraktach tkanek lub komórek, a zwłaszcza określenie stopnia fosforylacji VASP w pozycji 239 i/lub pozycji 157, byłoby ważnym parametrem biochemicznym, którego pomiar powinien umożliwić opracowanie układu diagnostycznego do wykrywania hormonów lub leków zwiększających poziom cGMP i/lub zwiększających poziom cAMP, takich jak przedsionkowy czynnik natriuretyczny (ANF), guanylina, substancje ileki uwalniających NO, a ponadto umożliwiać wyciąganie wniosków dotyczących czynności śródbłonka in vivo.
Przeciwciała, które specyficznie wiążą się z odwracalnie fosforylowanymi białkami, opisano w opisie patentowym US nr 5599681, publikacji WO 93/21230 oraz w publikacji U. Walter, Blick 1/97
Wiirzburg University, str. 79-81, 1997.
W szczególności istniała potrzeba opracowania reagentów do ocenianiaimodulowania czynności śródbłonka, a zwłaszcza przeciwciał przeciw VASP (fosfoproteinie stymulowanej czynnikami rozszerzającymi naczynia), które wiążą się z VASP tylko wtedy, gdy VASP jest fosforylowana, oraz komórek hybrydom, które są przydatne do wytwarzania takich przeciwciał.
Wynalazek dotyczy przeciwciała monoklonalnego 16C2, wytwarzanego przez linię komórek hybrydom o numerze dostępu DSM ACC 2330, lub jego fragmentu, zdolnych do wiązania fosfoproteiny stymulowanej czynnikami rozszerzającymi naczynia (VASP) tylko wtedy, gdy VASP występuje w postaci fosforylowanej w pozycji seryny 239 (VASP z fosfoseryną w pozycji 239).
Wynalazek dotyczy również zastosowania przeciwciała 16C2 lub jego fragmentu, zdefiniowanego powyżej, jako środka diagnostycznego.
Korzystnie jakościowo i/lub ilościowo oznacza się VASP z fosfoseryną wpozycji 239 wmateriale biologicznym.
Wszczególnościmateriałbiologicznystanowiąludzkietrombocytylubludzkakrew.
VASP z fosfoseryną w pozycji 239 zazwyczaj oznacza się metodąWestern blotting albometodą cytometrii przepływowej.
Przeciwciało 16C2 lub jego fragment jest przydatne szczególnie gdy wykrywa się substancje, które wpływają na poziom cGMP i/lub cAMP wmateriale biologicznym, określa się aktywność czyn n ików śródbłonka in vivo, albo wykrywa zaburzenia czynności śródbłonka.
Wynalazek dotyczy także linii komórek hybrydom DSM ACC 2330, wytwarzającej przeciwciało monoklonalne16C2.
Wynalazek dotyczy ponadto zestawu diagnostycznego, charakteryzującego się tym, że zawiera przeciwciało 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane powyżej.
Wynalazek dotyczy też sposobu diag nostyczn ego in vitro, polegającego na tym, że stosuje się przeciwciało 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane powyżej, do określania stanu fosforylacji VASP z fosfoseryną w pozycji 239 i/lub interakcji VASP z białkami wmateriale biologicznym, albo do wpływania na stan fosforylacji VASP zfosfoseryną w pozycji 239 i/lub interakcję VASP z białkami wmateriale biologicznym.
W sposobach diagnostycznych można stosować przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalneifragmenty przeciwciał. Wszczególności użyteczne jest przeciwciało monoklonalne wytwarzane przez linię komórek hybrydom 1 6C2, a zwłaszcza Mab 16C2.
PL 195 985 B1
Dla oceny czynności śródbłonka przydatny jest sposób określania stanu fosforylacji VASP, zgodnie z którym materiał biologiczny kontaktuje się z przeciwciałem przeciw VASP (fosfoproteinie stymulowanej czynnikami rozszerzającymi naczynia), które wiąże się z VASP jako antygenem tylko wtedy, gdy VASP jest fosforylowana.
W jakościowym sposobie oznaczania przeciwciała przeciw VASP ponadto określa się ilość przeciwciała przeciw VASP, które wiąże się z materiałem biologicznym. Konkretnie stosuje się metodę Western blotting, polegającą na rozdzielaniu VASP przez elektroforezę i kontaktowanie VASP z przeciwciałem przeciw VASP, które wiąże się z VASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana. Stosuje się również metodę cytometrii przepływowej, polegającą na kontaktowaniu próbki z przeciwciałem przeciw VASP, które wiąże się z VASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana.
Przeciwciała przeciw VASP są użyteczne w sposobach diagnozy, polegających przykładowo na kontaktowaniu próbki z przeciwciałem przeciw VASP, które wiąże się z VASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana, oraz ocenie stanu fosforylacji VASP. W sposobie tym jakościowo określa się fosforylację VASP w próbce, szczególnie gdy przeciwciało wiąże się zVASP z fosfoseryną w pozycji 239 lub VASP z fosfoseryną w pozycji 157. Próbkę mogą stanowić ludzkie trombocyty lub ludzka pełna krew.
Przeciwciała przeciw VASP są użyteczne w sposobach wykrywania markerów czynności śródbłonka. W tym celu przydatny jest sposób wykrywania substancji, które wpływają na poziom cGMP i/lub cAMP, polegający na testowaniu próbki pochodzącej od pacjenta, któremu podano substancję wpływającą na poziomy cGMP i/lub cAMP, kontaktowaniu próbki z przeciwciałem przeciw VASP, które wiąże się zVASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana, oraz ocenie stanu fosforylacji VASP w stosunku do próbki kontrolnej.
Przeciwciała przeciw VASP stosuje się w sposobie wykrywania zaburzeń czynności śródbłonka, polegającym na kontaktowaniu próbki pochodzącej od pacjenta z przeciwciałem przeciw VASP, które wiąże się zVASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana, oraz ocenie stanu fosforylacji VASP w stosunku do próbki kontrolnej.
Do realizacji opisanych sposobów diagnostycznych przydatny jest zestaw diagnostyczny, który zawiera przeciwciało przeciw VASP, które wiąże się z VASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana.
Wynalazek umożliwia realizację sposobów leczenia pacjentów cierpiących na zaburzenia czynności śródbłonka, w których pacjentowi podaje się terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała przeciw VASP, które wiąże się z VASP tylko wtedy, gdy jest ona fosforylowana.
Wynalazek pozwala na opracowanie sposobów biochemicznych/immunobiologicznych, umożliwiających jakościowe i/lub ilościowe określanie stanu fosforylacji VASP wmateriale biologicznym, w szybki i prosty sposób.
W opisie przeciwciała oznaczają zarówno przeciwciała poliklonalne, jak i przeciwciała monoklonalne (Mab) oraz ich fragmenty, a także fragmenty SCFV, albo inne syntetyczne lub zrekombinowane domeny białkowe, które specyficznie rozpoznają fosforylowane regiony w VASP.
Fragmenty przeciwciał obejmują jakąkolwiek część przeciwciała, która jest zdolna do wiązania docelowego antygenu, w tym przypadku VASP, lub jego określonej części. Fragmenty przeciwciał obejmują w szczególności fragmenty F(ab')2, Fab, Fab' iFv. Można je wytwarzać z przeciwciała z jakiejkolwiek grupy, ale zazwyczaj wytwarza się je z IgG lub IgM. Można je wytwarzać zwykłymi technikami rekombinacji DNA, albo stosując klasyczną metodę, przez trawienie proteolityczne papainą lub pepsyną. Patrz Current Protocols in Immunology, rozdział 2, red. Coligan i in. (John Wiley & Sons 1991-1992).
Masa cząsteczkowa fragmentów F(ab')2 zazwyczaj wynosi około 110 kDa (IgG) lub około 150 kDa (IgM) i zawierają one dwa regiony wiążące antygen, połączone w regionie zawiasowym mostkiem(ami) disulfidowym(ymi). We fragmentach tych nieobecna jest prawie cała, jeśli nie cała, część Fc. Masa cząsteczkowa fragmentów Fab' wynosi zazwyczaj około 55 kDa (IgG) lub około 75kDa (IgM) i można je otrzymać np. przez zredukowanie mostka(ów) disulfidowego(ych) fragmentu F(ab')2. Otrzymaną(e) wolną grupę(y) sulfhydrylową(e) można stosować do dogodnego sprzęgania fragmentów Fab' z innymi cząsteczkami, takimi jak reagenty umożliwiające detekcję (np. enzymy). Fragmenty Fab są jednowartościowe i zazwyczaj ich masa cząsteczkowa wynosi około 50 kDa (z każdego źródła). Fragmenty Fab zawierają regiony zmienne (VL i VH) oraz stałe (CL i CH) wiążącej antygen części przeciwciała z odpowiednio łańcucha lekkiego (L) i ciężkiego (H). Części H i L połączone są wewnątrzcząsteczkowym mostkiem disulfidowym.
PL 195 985 B1
Masa cząsteczkowa fragmentów Fv zazwyczaj wynosi około 25 kDa (bez względu na źródło) i zawierają one regiony zmienne obu łańcuchów, lekkiego i ciężkiego (odpowiednio VL i VH). Zazwyczaj łańcuchy VL iVH są utrzymywane razem tylko przez oddziaływania niekowalencyjne, z więc łatwo ulegają dysocjacji. Ich zaletami są jednakże niewielkie rozmiary, oraz to, że zachowują one takie same właściwości wiążące jak większe fragmenty Fab. Zatem opracowano sposoby sieciowania łańcuchów VL i VH, z użyciem np. aldehydu glutarowego (lub innych chemicznych środków sieciujących), międzycząsteczkowych wiązań disulfidowych (poprzez wprowadzenie cystein) i łączników peptydowych. Otrzymany FV jest jednołańcuchowy (to jest SCFV).
Jeden korzystny sposób polega na tworzeniu SCFV metodami rekombinacyjnymi, które umożliwiają wytwarzanie FV o nowych specyficznościach poprzez mieszanie i dopasowywanie łańcuchów zmiennych z różnych źródeł przeciwciał. W typowym sposobie należy dostarczyć zrekombinowany wektor, który zawiera odpowiednie elementy regulujące, kierujące ekspresją regionu kasety. Region kasety powinien zawierać DNA kodujący łącznik peptydowy, z dogodnymi miejscami do tworzenia białek fuzyjnych zarówno na końcu 5', jak i 3' łącznika. DNA kodujący region(y) zmienny(e), będący(e) przedmiotem zainteresowania, można sklonować w wektorze z wytworzeniem białek fuzyjnych z łącznikiem, w ten sposób tworząc SCFV.
W przykładowym podejściu alternatywnym, DNA kodujące dwa FV można zligować z DNA kodującym łącznik, a uzyskaną trójskładnikową fuzję można bezpośrednio zligować ze znanym wektorem ekspresyjnym. DNA SCFV, wytworzone którąkolwiek ztych metod, mogą być eksprymowane w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych, w zależności od wybranego wektora.
Korzystne są przeciwciała monoklonalne i ich fragmenty, które wiążą się z VASP jako antygenem tylko wtedy, gdy VASP występuje w postaci fosforylowanej.
Szczególnie korzystne są ponadto przeciwciała monoklonalne i ich fragmenty, które wiążą się z VASP, bądź peptydami obejmującymi sekwencję peptydową wokół seryny 239 VASP, jako antygenem, tylko wtedy, gdy seryna w pozycji 239 jest fosforylowana (VASP z fosfoseryną w pozycji 239).
W opisie określenie VASP należy również rozumieć jako oznaczające pochodne VASP, to jest funkcjonalnie równoważne reszty, mutanty, fragmenty lub warianty VASP, np. VASP z fosfoseryną w pozycji 239, która jest dodatkowo fosforylowana w pozycji seryny 157 i/lub treoniny 278, a także np. mutanty glikozylacyjne i inne produkty modyfikacji kowalencyjnych i elementy strukturalne, które są ważne dla interakcji białko/białko.Wopisie określenie VASP obejmuje zarówno VASP ludzką, jak i VASP z innych gatunków, a zwłaszcza ssaków, takich jak szczur, mysz, królik, pies, świnia lub małpa.
Przeciwciała można wytwarzać znanymi sposobami, np. zgodnie z techniką opisaną przez Kohlera i Milsteina (Kohler i Milstein, Nature 256, 495, 1975). Zazwyczaj, jeśli pożądana jest specyficzność opartana stanie fosforylowania, indukuje się powstawanie przeciwciał przeciw fosforylowanym postaciom VASP. Wyizolowane przeciwciała można przeszukiwać stosując zwykłe metody sprawdzania specyficzności. Korzystnie indukuje się powstawanie przeciwciał przeciw peptydowym fragmentom VASP, które zawierają serynę 157, serynę 239 i/lub treoninę 278.
Długość antygenowego peptydu VASP nie jest ważna, pod warunkiem, że jest on zdolny do wywoływania odpowiedzi humoralnej. Typowe peptydy antygenowe mają długość mniejszą niż około aminokwasów. Pewne korzystne peptydy mają długość mniejszą niż około 20 aminokwasów. Naj239 korzystniejsze peptydy mają długość około 6-12 aminokwasów. Korzystne peptydy to KLRKVS239KQ
239 lub RKVS239KQE. Korzystnie peptyd jest fosforylowany w pozycji seryny 157, seryny 239 i/lub treoniny278. Peptydy można otrzymywać rekombinacyjnie. Zazwyczaj wytwarza się je drogą rozkładu proteolitycznego VASP, albo syntezy in vitro, oraz fosforylacji.
Korzystnesąponadtoprzeciwciałamonoklonalne,którewykazują wymienione powyżej właściwości iktóre można stosować wcytometrii przepływowej. Wymaga to, aby specyficzność nowych przeciwciał była zachowywana nawet wtedy, gdy antygen poddaje się warunkom, które mogą zmieniać jego konformację, czego należy oczekiwać na etapach utrwalania, które zazwyczaj stosuje się wcytometrii przepływowej. Nowe przeciwciała można np. badać pod względem ich przydatności do stosowania w cytometrii przepływowej po prostu przez ich sprawdzenie.
Szczególniekorzystnejestprzeciwciałomonoklonalne 16C2.
Nowe przeciwciała można wytwarzać stosując metody, które są znane fachowcom.
W szczególności odnośnie wytwarzania przeciwciał monoklonalnych można wymienić wytwarzanie komórek hybrydom z zastosowaniem techniki opisanej przez Kohlera iMilsteina (Kohler iMilstein,
Nature 256, 495, 1975). Specyficzność oczyszczonych przeciwciał można sprawdzać np. stosując poniższe metody testowe.
PL 195 985 B1
a) Western blotting z użyciem zrekombinowanej VASP, którą w różnym stopniu fosforylowano kinazą białkową zależną od cAMP lub zależną od cGMP, w związku z czym musi być tylko możliwe obserwowanie dodatniego sygnału pochodzącego od fosforylowanej VASP.
b) Western blotting z użyciem ekstraktów komórek, np. komórek Pkt2, które stransfekowano ludzką VASP, bądź VASP, którą mutowano w różny sposób i w której w każdym przypadku zmutowano i wten sposób wyeliminowano jedno z trzech miejsc fosforylacji (S157A) VASP, (S239A) VASP i (T278A) VASP, oraz, w każdym przypadku, ludzką kinazą białkową zależną od cGMP. Odpowiednie są te przeciwciała, w których dodatnie sygnały na błotach Western zostały wyeliminowane przez mutację S239A, ale nie przez pozostałe dwie mutacje.
c) Western blotting z użyciem ludzkich trombocytów, które poddano działaniu różnych czynników rozszerzających naczynia (np. prostacykliny lub donorów NO), bądź aktywatorów kinazy białkowej zależnej od cAMP lub kinazy białkowej zależnej od cGMP. Przeciwciało jest wtedy odpowiednie, jeśli w ekstrakcie wykrywa się tylko specyficzny prążek fosforylowanej VASP. Przeciwciała można również przeszukiwać w analogiczny sposób stosując fibroblasty ludzkie, a także trombocyty szczurze i mysie.
d) Badania immunofluorescencyjne z użyciem utrwalonych ludzkich trombocytów i komórek śródbłonkowych. Dodatni sygnał obserwuje się, gdy VASP występuje w postaci fosfoproteiny.
Uzyskano linię komórek hybrydom, które wytwarzają nowe przeciwciała monoklonalne, w szczególności linię komórek hybrydom 16C2 wytwarzających przeciwciało monoklonalne 16C2, które jest szczególnie korzystne.
Linię komórek hybrydom 16C2 wytwarzających przeciwciało monoklonalne 16C2, zdeponowano 6 listopada 1997 r. w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (niemiecka kolekcja mikroorganizmów i hodowli komórkowych), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Niemcy, na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego pod następującym numerem: DSM ACC2330.
Nowe przeciwciała są odpowiednie do jakościowego i/lub ilościowego, korzystnie ilościowego, określania zarówno fosforylacji VASP, która zachodzi w warunkach in vitro, jak i tej, która zachodzi w warunkach in vivo, korzystnie do określania fosforylacji seryny 239 i/lub seryny 157 VASP, a zwłaszcza do określania fosforylacji seryny 239 VASP.
Ilościowe metody z zastosowaniem przeciwciał są dobrze znane i można je znaleźć, np. wCurrent Protocols in Immunology, powyżej. Należą do nich testy immunoenzymatyczne (ELISA), testy radioimmunologiczne (RIA) i podobne.
Nowe przeciwciała są ponadto odpowiednie do jakościowego i/lub ilościowego, korzystnie ilościowego, oznaczania w materiale biologicznym fosforylowanej VASP, korzystnie VASP z fosfoseryną w pozycji 239 i VASP z fosfoseryną w pozycji 157, szczególnie korzystnie VASP z fosfoseryną w pozycji 239.
Materiał biologiczny oznacza np. ekstrakty komórkowe, ekstrakty tkankowe, skrawki komórkowe, komórki tkanek i komórki, takie jak trombocyty, leukocyty, komórki śródbłonkowe, komórki mięśni gładkich i fibroblasty. Materiał biologiczny może pochodzić od ludzi albo od innych ssaków, takich jak szczur, mysz, królik, pies, świnia lub małpa. Korzystny jest materiał biologiczny pochodzenia ludzkiego.
Nowe przeciwciała można stosować do ilościowego oznaczania w materiale biologicznym fosforylowanej VASP, w szczególności VASP z fosfoseryną w pozycji 157 i/lub VASP z fosfoseryną w pozycji 239, poprzez ilościowe oszacowanie autoradiogramów blotów Western zgodnie z metodami znanymi fachowcom, np. z zastosowaniem programu NIH gel blotting Image 1.6, albo metodą immunofluorescencji.
Z uwagi na korelację, która istnieje pomiędzy fosforylacją seryny 239 i seryny 157 VASP a aktywnością kinaz białkowych zależnych od cGMP i/lub zależnych od cAMP, nowe przeciwciała są również odpowiednie do stosowania jako środki do diagnozowania szlaków sygnałów cGMP i szlaków sygnałów cAMP, w szczególności do diagnozowania szlaków sygnałów cGMP.
Zastosowanie nowych przeciwciał do oznaczania VASP z fosfoseryną w pozycji 239 w materiale biologicznym metodami Western blotting i immunofluorescencji umożliwia również opracowanie metod diagnostycznych do wykrywania substancji, hormonów lub leków zwiększających poziom cGMP. Przykładami, które można wymienić, są ANF, guanylina, substancje lub leki uwalniające NO. Przykładowo można monitorować przebieg choroby i terapię donorami NO, co, między innymi, dostarcza informacje dotyczące mogącego się rozwinąć zjawiska tolerancji na azotany.
PL 195 985 B1
Z uwagi na korelację, jaka istnieje pomiędzy fosforylacją seryny 157 VASP a aktywnością kinaz białkowych zależnych od cAMP, nowe przeciwciała można również stosować jako środki do diagnozowania substancji, hormonów i leków zwiększających poziom cAMP.
Można zatem również stosować nowe przeciwciała lub ich fragmenty w diagnostyce i/lub terapii.
Nowe sposoby diagnostyczne są sposobami, które można stosować w laboratorium, poza organizmem człowieka (ex vivo).
Nowe przeciwciała można stosować do określania stopnia fosforylacji VASP w materiale biologicznym, który pochodzi z różnych gatunków. Przykładowo można wymienić człowieka, szczura, mysz, królika, psa, świnię lub małpę. Korzystnie stosuje się nowe przeciwciała do oznaczania fosforylowanej VASP w materiale biologicznym pochodzącym od człowieka, szczura, myszy lub psa. Szczególnie korzystnie stosuje się nowe przeciwciała do oznaczania fosforylowanej VASP w materiale biologicznym pochodzącym od człowieka.
Nowe przeciwciała lub ich fragmenty można również stosować w czujnikach biologicznych. Czujniki biologiczne są znane fachowcom. Szczególnie korzystny jest sposób, w którym stosuje się drugi składnik pary ulegającej specyficznemu wiązaniu, taki jak przeciwciało, lektyna lub receptor. Wtym przypadku, wcelu wykrywania i oceny ilościowej, jeden ze składników pary ulegającej specyficznemu wiązaniu może zawierać wykrywalny znacznik. Znaczniki te znane są fachowcom imogą nimi być, np. chromofor, luminofor, fluorofor, enzym, izotop promieniotwórczy lub barwna bądź bezbarwna cząstka. Korzystny jest sposób, w którym nieznakowany składnik pary ulegającej specyficznemu wiązaniu sprzęga się bezpośrednio lub pośrednio, np. poprzez inne przeciwciało lub mostek biotyna/awidyna, z fazą stałą, metodami znanymi fachowcom.
Nowe przeciwciała lub ich fragmenty można również znakować promieniotwórczo metodami znanymi fachowcom, tak że można je stosować do immunoscyntygrafii albo do immunoterapii. Ponadto te przeciwciała monoklonalne można stosować jako nośniki związków aktywnych i wykorzystywać do leczenia chorób, które są wywoływane zaburzeniami czynności śródbłonka.
Po analizie całej sekwencji nukleotydowej genów V przeciwciała monoklonalnego 16C2, technicznie możliwe jest również wytworzenie konstruktów przeciwciała przez np. wstawienie regionów hiperzmiennych do szkieletu ludzkiego przeciwciała monoklonalnego (Jones i in., Nature 321, 522-525, 1986; Verhoyen i in., Science 239, 1534-1536, 1988).
Korzystne jest ilościowe oznaczanie związanego z antygenem przeciwciała w płytkach krwi metodą cytometrii przepływowej, np. prowadzonej z użyciem próbek pełnej krwi, które zostały, jeśli to było właściwe, utrwalone z zastosowaniem metod znanych fachowcom. Metody cytometrii przepływowej są znane fachowcom i można je przeprowadzać w sposób opisany np. wG. Otten i M.W. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current Protocols in Immunology, 5.4.1-5.4.19.
Określanie fosforylacji VASP metodą cytometrii przepływowej, w szczególności fosforylacji seryny 239 VASP, z użyciem nowych przeciwciał, nie ogranicza się do trombocytów ludzkich, i można ją również określać w przypadku innych rodzajów komórek, takich jak limfocyty, monocyty, leukocyty, komórki śródbłonkowe i komórki mięśni gładkich.
Zastosowanie cytometrii przepływowej do określania za pomocą nowych przeciwciał fosforylacji VASP, w szczególności VASP z fosfoseryną w pozycji 239, w świeżo pobranych ludzkich trombocytach, umożliwia oznaczanie ex vivo aktywności in vivo czynników śródbłonkowych, takich jak NO i prostacyklina, a zatem ocenę czynności śródbłonka lub zaburzeń czynności śródbłonka w zaburzeniach sercowo-naczyniowych, jakie występują np. w miażdżycy, nadciśnieniu, cukrzycy, niewydolności serca i niewydolności nerek.
Określanie za pomocą nowych przeciwciał fosforylacji VASP, w szczególności fosforylacji seryny 239 VASP, umożliwia kontrolowanie leczenia wymienionych powyżej chorób. Można również określać powstawanie oporności na leczenie, takiej jak tolerancja na azotany.
Nowe przeciwciała można również stosować jako środki terapeutyczne, ponieważ wpływają one wmaterialebiologicznym na stan fosforylacji VASP i/lub jej interakcję z białkami.
Można również stosować preparaty farmaceutyczne, zawierające co najmniej jedno z nowych przeciwciał.
Nowe preparaty można stosować dojelitowo (doustnie), pozajelitowo (dożylnie), doodbytniczo lub lokalnie (miejscowo). Można je podawać w postaci roztworów, proszków (tabletek lub kapsułek, wtym mikrokapsułek), preparatów liposomowych, kompleksów z lipidami, zawiesin koloidalnych, roztworów do iniekcji lub czopków. Substancjami pomocniczymi odpowiednimi do postaci tego rodzaju są
PL 195 985 B1 zwykle stosowanewfarmacji ciekłe lub stałe wypełniacze i rozcieńczalniki, rozpuszczalniki, emulgatory, środki poślizgowe, środki korygujące smak, barwniki i/lub substancje buforujące. Jako odpowiednią dawkę podaje się 0,1-100 mg/kg masy ciała. Podajesię je korzystnie wjednostkowych postaciach dawkowanych, zawierających co najmniej skuteczną dzienną ilość nowych przeciwciał, np.
30-3000 mg.
Dawka dzienna, którą się będzie podawać, zależy od masy i ciała, wieku, płci i stanu osobnika będącego ssakiem. Jednakże mogą być również wymagane wyższe lub niższe dawki dzienne. Dawkę dzienną można podawać albo jednorazowo w postaci pojedynczej jednostkowej postaci dawkowanej, albo w postaci kilku mniejszych jednostkowych postaciach dawkowanych, bądź kilkakrotnie, we wcześniej określonych odstępach, w postaci podzielonych dawek.
W celu wytwarzania preparatów farmaceutycznych, nowe przeciwciała można wprowadzać do terapeutycznie obojętnych zaróbek organicznych lub nieorganicznych. Przykładami takich zaróbek dla tabletek, powlekanych tabletek itwardych kapsułek żelatynowych są laktoza, skrobia kukurydziana ijej pochodne, łójikwas stearynowy lub jego sole. Zaróbkami odpowiednimi do wytwarzania roztworów są woda, poliole, sacharoza, cukier inwertowany i glukoza. Zaróbkami odpowiednimi do roztworów do iniekcji są woda, alkohole, poliole, gliceryna ioleje roślinne. Zaróbkami odpowiednimi do czopków są oleje roślinneioleje utwardzone, woski, tłuszcze i półstałe poliole. Preparaty farmaceutyczne mogą również zawierać środki konserwujące, rozpuszczalniki, środki stabilizujące, środki zwilżające, emulgatory, środki słodzące, barwniki, środki smakowo-zapachowe, sole do zmiany ciśnienia osmotycznego, bufory, środki powlekające, przeciwutleniacze i, jeśli jest to właściwe, inne związki terapeutycznie czynne.
Środki farmaceutyczne wytwarza się sposobem, w którym co najmniej jednemuznowych przeciwciał nadaje się postać odpowiednią do podawania razem z farmaceutycznie odpowiednią ifizjologicznie tolerowaną zaróbką oraz, jeśli jest to właściwe, innymi odpowiednimi związkami aktywnymi, dodatkamiisubstancjami pomocniczymi.
Diagnostyczny sposób określania fosforylacji VASP,korzystnie fosforylacji seryny 239 VASP, można realizować zużyciem innych specyficznych sond, takich jak przeciwciała poliklonalne, fragmenty SCFV lub inne syntetyczne lub zrekombinowane domeny białkowe, które specyficznie rozpoznają fosforylowane sekwencje w VASP, w szczególności w VASP z fosfoseryną w pozycji 239.
Ponadto diagnostyczny sposób określania fosforylacji seryny 157 i/lub fosforylacji treoniny 278 VASP, można realizować zużyciem specyficznych sond, takich jak przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, fragmenty SCFV lub inne syntetyczne lub zrekombinowane domeny białkowe, które specyficznie rozpoznają sekwencje wVASP zawierające fosforylowaną serynę 157 i/lub treoninę278.
Poprzez wiązanie z peptydami bogatymi wprolinę, takimi jak zyksyna lub winkulina, ijednoczesne wiązanie jej własnej domeny bogatejwaminokwas prolinę, z profiliną, VASP umożliwia tworzenie włókienkowej aktyny, przy czym VASP działa jako cząsteczka adaptorowa. Zakłócenie tej interakcji białko/białko może prowadzić do wadliwej agregacji trombocytów lub skurczu naczyń. Tak więc tworzenie mostków aktyna/miozyna jest warunkiem wstępnym, wymaganym dla skurczu np. mięśni gładkich. Stwierdzono, że fosforylacja VASP w pozycji seryny 157 skorelowana jest zhamowaniem receptora fibrynogenu, glikoproteiny Ilb/Illa (Horstrupiin., Eur. J. Biochem., 225, 21-27, 1994). Określanie fosforylacji VASPwpozycji seryny 157 umożliwia więc systematyczne poszukiwania substancji lub leków, które wpływają na oddziaływania VASP zjej wewnątrzkomórkowymi składnikami wiążącymiisą np. odpowiednie do leczenia chorób układu sercowo-naczyniowego związanychzuszkodzeniem naczyń.
Szczególnie korzystne są rozwiązania opisane w przykładach realizacji.
Poniższeprzykładysłużądoobjaśnieniawynalazku.
Przykład 1
Izolowanie przeciwciała monoklonalnego przeciw VASP z fosfoseryną w pozycji 239
Peptyd fosforylowany ipeptyd niefosforylowany, zktórych oba obejmują sekwencję peptydu KLRKVS239KQ lubRKVS239KQE wokół seryny 239, syntetyzuje sięzużyciem syntezatora peptydów Applied Biosystems (model 431A) zgodnie z metodą chemiczną wykorzystującą Fmoc, która jest znana fachowcom.
Fosfoserynę wfosforylowanym peptydzie wprowadza się podczas syntezy peptydu stosując Fmoc-serynę [PO(Obzl)OH-OH] z Calbiochem. Peptydyobudowie potwierdzonej metodą spektrometrii
PL 195 985 B1 masowej oczyszcza się stosując chromatografię z odwróconymi fazami i kolumnę VYDAC 218TP (czystość > 98%).
Po aktywacji kwasem bromooctowym i estrem N-hydroksysukcynimidowym kwasu bromooctowego (Sigma), przygotowane wten sposób peptydy sprzęga się z tiolowaną KLH (hemocyjaniną skrzypłocza, nanoTools). Samice myszy Balb/c (6 tygodniowe) immunizuje się podskórnie 4 razy w odstępach 14 dni KLH-fosfopeptydem (10 mg/mysz) zawierającym kompletny adiuwant Freunda w pierwszej iniekcji i niekompletny adiuwant w3 kolejnych iniekcjach. Następnie (2 tygodnie później) myszy otrzymują iniekcje przypominające 10 mg immunogenu wPBS (soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanami) w trzech kolejnych dniach. W 1 dzień po ostatniej iniekcji przypominającej myszy uśmierca się i usuwa się śledzionę. Komórki śledziony izoluje się i poddaje fuzji z nie wytwarzającymi przeciwciał komórkami szpiczaka (np. PAI-Zellen, J.W. Stocker i in. (1982) Res. Disclosure, 21713) stosując ustaloną metodologię Kohlera/Milsteina.
Do testowania komórek hybrydom pod względem ich zdolności do wydzielania przeciwciał przeciw VASP zfosfoseryną w pozycji 239 stosuje się różne metody przeszukiwania z użyciem fosforylowanego/niefosforylowanego peptydu, jak również fosforylowanej/niefosforylowanej zrekombinowanej ludzkiej VASP.
Do testu z użyciem fosforylowanego/nieufosforylowanego peptydu, peptydy te sprzęga się kowalencyjniez płytkami DNA-BIND-ELISA (z Costar) i supernatanty hybrydom przeszukuje się stosując metodę ELISA.
Supernatanty, które rozpoznają fosfopeptyd, dodatkowo sprawdza się pod względem ich zdolności do rozpoznawania w pełni fosforylowanej, zrekombinowanej (układ E. coli) ludzkiej VASP, ale nie odpowiedniej zdefosforylowanej VASP.
Przeciwciała monoklonalne z supernatantów komórek hybrydom, które zidentyfikowano opisanymi powyżej metodami jako dodatnie, można korzystnie oczyszczać zwolnych od surowicy hodowli komórekhybrydom metodątiofilowej chromatografii adsorpcyjnej (POROS 50-OH, nanoTools).
Stosując różne metody sprawdzania, można było zidentyfikować i scharakteryzować jedno z wyizolowanych przeciwciał (klon 16C2) jako mysie przeciwciało monoklonalne klasy IgG1k, które rozpoznaje VASP tylko, gdy białko to fosforylowane jest w pozycji seryny 239. W warunkach tych przeciwciało 16C2 nie rozpoznaje innych białek i innych miejsc fosforylacji VASP.
Przeciwciała monoklonalne, które specyficznie rozpoznają VASP z fosfoseryną w pozycji 157 lub VASPzfosfotreoninąwpozycji 278, można izolować sposobem analogicznym do opisanego powyżej, jako antygen zużyciem fosforylowanych peptydów, które obejmują odpowiednio znane sekwencje peptydowe wokół seryny 157 lub treoniny 278 białka VASP.
Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych rozpoznających VASP fosforylowaną wpozycji Ser239opisanorównieżwSmolenskii i n . , J . Bi o l . Ch e m . , 237, 32, 20029-20035 (1998) .
Przykład 2
Określanie fosforylacji seryny 239 VASP metodą cytometrii przepływowej
Określanie fosforylacji seryny 239 VASPwprzemywanych trombocytach ludzkich
Przygotowuje się trombocyty ludzkie i stymuluje się fosforylację VASP przez inkubację z substancjami naczyniowe czynnymi wopisany sposób (Eigenthaler i in., Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992). Reakcję przerywa się przez utrwalanie formaldehydem ostężeniu końcowym około 3,5% wtemperaturze pokojowej wciągu 10 minut. Po (ewentualnej) procedurze przemywania, komórki permeabilizuje się z użyciem Tritonu X-100, a następnie przemywa. Wybarwianie osiąga się przez inkubację z odpowiednim przeciwciałem, które jest albo bezpośrednio znakowane fluorescencyjnie, albo wybarwione z użyciem drugiego przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie. Dogodnie wtym celu używa się 0,5-5 mg, korzystnie 1-2 mg na ml pierwszego przeciwciała. Przykładowo gdy jako pierwsze przeciwciało stosuje się przeciwciało monoklonalne 16C2, odpowiednie jest stężenie 1,7 mg/ml. Następnie określa się wiązanie przeciwciała 16C2 i analizuje wcytometrze przepływowym w sposób opisany np. wG. Otten i W.M. Yokoyama (1992) Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan, Current ProtocolsinImmunology,5.4.1-5.4.19.
Przykład 3
Zastosowanie metody Western blotting do oznaczania fosforylacji seryny 239 VASP w ekstraktach komórkowych
Równolegle z cytometrią przepływową (przykład 2) stosuje się Western blotting do określania fosforylacji VASP w ekstraktach komórkowych metodami znanymi fachowcom i opisanymi np. wEigenthaler i in. (Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992). Wskazane stężenie stosowanego
PL 195 985 B1 przeciwciała wynosi 0,1 - 5, korzystnie 0,5 - 1,0 mg/ml, zależnie od ilości VASP wbadanej próbce. Przykładowo dla trombocytów ludzkichitrombocytów szczurzych korzystne jest stosowanie 0,5 mg przeciwciała/ml, podczas gdy dla komórek śródbłonka ludzkiej pępowiny korzystne jest stosowanie 1,0 mg przeciwciała/ml. Wzasadzie analiza wcelu określania fosforylacji seryny 239 VASP wekstraktach komórkowych metodą Western blotting oraz metodą cytometrii przepływowej zużyciem utrwalonych komórek daje identyczne wyniki.
Przykład 4
Określanie fosforylacji seryny 239 VASPwpełnej krwi lub osoczu bogatymwpłytki krwi (PRP)
Pełną krew lub PRP inkubuje się z substancjami naczyniowo czynnymi i inkubację przerywa się przez utrwalanie formaldehydem o stężeniu końcowym około 3,5% w temperaturze pokojowej w ciągu minut. PRP przygotowuje się z pełnej krwi w sposób opisany wEigenthaler i in. (Eur. J. Biochem., 205, 471-481, 1992). Trombocyty wPRP osadza się przez odwirowanie i ponownie przeprowadza w stan zawiesiny w buforze fizjologicznym (Eigenthaler i in., 1 992, patrz powyżej). Trombocyty permeabilizuje się, a następnie wybarwia w sposób opisany powyżej dla przemywanych trombocytów.
Przykład 5
Przebieg czasowy stymulacji fosforylacji seryny 239 VASP w przemywanych trombocytach ludzkich po podziałaniu nitroprusydkiem sodu (SNP)
Trombocyty ludzkie poddano działaniu 100 mM SNP. Pobierano próbki komórek w czasie 0, 1, 3 i5 minut. Przeciwciało 16C2 zastosowano do określania fosforylacji seryny 239 równolegle drogą analizy ekstraktów pobranych próbek komórek metodą Western blotting oraz metodą cytometrii przepływowej przeprowadzonej zużyciem trombocytów ludzkich, które utrwalono i permeabilizowano wsposób opisany powyżej. Autoradiogramy blotów Western analizowano ilościowo z zastosowaniem programu NIH gel-blotting image 1.6.
Wzrost wiązania przeciwciało 1 6C2/VASP z fosfoseryną w pozycji 239 (% wzrost (wartość dla 5minuty = maksymalny wpływ = 100%))przedstawionowtabeli 1.
Tabela 1
| t (min) Wzrost (%) | Trombocyty Cytometria | Ekstrakty komórkowe Western blotting |
| 0 | 0 | 0 |
| 1 | 62,5 | 83,5 |
| 3 | 89,3 | 95,2 |
| 5 | 100,0 | 100,0 |
Przykład 6
Zastosowanie przeciwciała 16C2 do określania fosforylacji zrekombinowanej VASP przez kinazę białkową zależną od cAMP lub kinazę białkową zależną od cGMP
Oczyszczoną, zrekombinowaną VASP znakowaną heksahistydyną (25 mg/ml) sfosforylowano katalityczną podjednostką (11 mg/ml) kinazy białkowej zależnej od cAMP (cAPK) lub oczyszczoną kinazą białkową zależną od cGMP (cGPK; 24 mg/ml).
W określonym czasie pobierano próbki zmieszaniny reakcyjnej, natychmiast mieszano je zzawierającym SDS roztworem przerywającym reakcję, gotowano i frakcjonowano z zastosowaniem SDS-PAGE. Fosforylację VASP określano przez wybarwianie błękitem Coomassiego oraz metodą Western blotting z użyciem poliklonalnego przeciwciała przeciw VASP (M4, Halbrilgge M. i in., J. Biol. Chem. 265, 3088-3093 (1990), które można otrzymać z Alexis Corporation, Alte Hauensteinsh^e 4, CH-4448 Laufelfingen, Szwajcaria), albo monoklonalnego przeciwciała 16C2 przeciw VASP. Prążek poniżej prążka VASP przy wybarwianiu błękitem Coomassiego to cAPK, podczas gdy ten powyżej prążka VASP to cGMP-PK. Analiza metodą SDS-PAGE wykazała zmianę pod względem migracji VASPz46 do 50 kDAwwyniku fosforylacji seryny 157, którą preferencyjnie prowadzi cAPK. Fosforylację seryny 239 (wykrywaną przez przeciwciało 16C2)preferencyjnieprowadzicGMP-PK.
PL 195 985 B1
Przykład 7
Określanie fosforylacji transfekowanej VASP, zawierającej różne mutacje miejsc fosforylacji, w komórkach Ptk2
Fosforylację transfekowanej ludzkiej VASPimutantów VASP badanowkomórkach Ptk2. VASP typu dzikiegoimutantami VASP,zktórych każdy zawierał zmutowane (zinaktywowane) miejsca fosforylacji (zmiana seryny 157, seryny 238 lub treoniny 277), wraz z ludzką kinazą zależną od cGMP 1β, stransfekowano komórki Ptk2 i prowadzono ekspresję pod kontrolą promotora CMV. Komórki Ptk2 posiadały bardzo mało endogennego VASPikinazy białkowej zależnej od cGMP.Wdwa dni po transfekcji komórki inkubowanowciągu 30 minutz30 mM 8pCPT-cGMP,anastępnie wyizolowano ekstrakty komórkowe. Fosforylację VASP wtych ekstraktach komórkowych badano następnie na błotach Western z użyciem przeciwciała poliklonalnego M4 i przeciwciała monoklonalnego 16C2. Zależna od fosforylacji zmiana VASPz46 kDa na 50 kDa nie występowała, gdy zinaktywowano serynę 157(mutacja S157A). Sygnał rozpoznawany przez przeciwciało 16C2 nie występował, gdy zinaktywowano serynę 239 (S239A). W tych analizach VASP zawierająca mutację w pozycji treoniny 277 zachowywała się jak VASP typu dzikiego.
Przykład 8
Określanie fosforylacji VASPwtrombocytach ludzkich po stymulacji różnymi środkami rozszerzającymi naczyniaianalogami cAMP/cGMP
Przemytetrombocytyludzkie(0,7x109 komórek/ml) inkubowano z 1 mMPg-l2 (prostacykliną), 0,5 mM 5,6-DCl-cBIMPS (przenikającym przez błony analogiem cAMP), 10 mM SNP (nitroprusydkiem sodu) lub 1 mM8pCPTcGMP(przenikającymprzezbłonyanalogiemcGMP).Pookreślonym czasie pobierano próbki (2,8 x 107 komórek), mieszano je zroztworem przerywającym z SDS i gotowano, a następnie badano pod względem fosforylacji VASP metodą Western blotting. AnalizyprzeprowadzonozużyciemprzeciwciałapoliklonalnegoM4lubprzeciwciałamonoklonalnego16C2.Fosforylacjęseryny157określonoilościowona podstawieprzesunięciaprążkaVASPz46 do 50 kDa, podczas gdy fosforylację seryny 239 określono ilościowo na podstawie sygnału dawanegoprzezprzeciwciało16C2.
Przykład 9
FosforylacjaVASPwtrombocytachszczura
Trombocyty szczura (0,7 x 109 komórek/ml) inkubowanowciągu 5 minutz100 mM nitroprusydkiem sodu (SNP), z10 mM prostaglandyną E1 (PgE1) albo bez żadnegoztych dodatków. Ekstrakty tych trombocytów szczura analizowano metodą Western blotting. Blot wykazał, że zależne od fosforylacji przesunięcie VASP z46 kDa do 50 kDa (fosforylacja seryny 157) oraz zależny od fosforylacji sygnał, jaki daje przeciwciało 16C2 (fosforylacja seryny 239) miały także miejsce wtrombocytach szczura. Podobne wyniki uzyskano również z użyciem trombocytów myszy.
Przykład 10
Immunofluorescencyjne badania VASP ifosfo-VASP przeprowadzone z użyciem trombocytów ludzkich
Trombocyty ludzkie (w osoczu bogatym w płytki krwi, PRP) osadzono na szkiełku przedmiotowymiumożliwiono im przyłączanie i rozprzestrzenienie w ciągu 45 minut. Trombocyty te inkubowano następnie na szkiełku przedmiotowymwciągu 15 minut bez (AiC) lubz100 mM 8pCPTcGMP (BiD). Następnie komórki natychmiast utrwalono 4% paraformaldehydemipermabilizowanozużyciem 0,2% Tritonu X-100. Inkubowano je następniezprzeciwciałem poliklonalnym M4 (1:1000) lub przeciwciałem monoklonalnym 16C2,anastępnie zwykłymi drugimi przeciwciałami. Fotografie wykazują pojawianie się zależnego od fosforylacji sygnału, gdy stosuje się przeciwciało 16C2, podczas gdy sygnał dla przeciwciała poliklonalnego M4 (w immunofluorescencji suma VASP 46 kDai50 kDa, ponieważ nie występuje frakcjonowanie) jest niezależny od fosforylacji.
Claims (12)
1. Przeciwciało monoklonalne 16C2, wytwarzane przez linię komórek hybrydom o numerze dostępu DSM ACC 2330, lub jego fragment, zdolne do wiązania fosfoproteiny stymulowanej czynnikami rozszerzającymi naczynia (VASP) tylko wtedy, gdy VASP występuje w postaci fosforylowanej w pozycji seryny 239 (VASP z fosfoseryną w pozycji 239).
2. Zastosowanie przeciwciała 16C2 lub jego fragmentu, zdefiniowanego w zastrz. 1, jako środka diagnostycznego.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że jakościowo i/lub ilościowo oznacza się VASP z fosfoseryną w pozycji 239 w materiale biologicznym.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że materiał biologiczny stanowią ludzkie trombocyty lub ludzka krew.
5. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, znamienne tym, że VASP z fosfoseryną w pozycji 239 oznacza się metodą Western blotting.
6. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, znamienne tym, że VASP z fosfoseryną w pozycji 239 oznacza się metodą cytometrii przepływowej.
7. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że wykrywa się substancje, które wpływają na poziom cGMP i/lub cAMP w materiale biologicznym.
8. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że określa się aktywność czynników śródbłonka in vivo.
9. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że wykrywa się zaburzenia czynności śródbłonka.
10. Linia komórek hybrydom DSM ACC 2330, wytwarzająca przeciwciało monoklonalne 16C2.
11. Zestaw diagnostyczny, znamienny tym, że zawiera przeciwciało 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane w zastrz. 1.
12. Sposób diagnostyczny in vitro, znamienny tym, że stosuje się przeciwciało 16C2 lub jego fragment, zdefiniowane w zastrz. 1, do określania stanu fosforylacji VASP z fosfoseryną w pozycji 239 i/lub interakcji VASP z białkami w materiale biologicznym, albo do wpływania na stan fosforylacji VASP z fosfoseryną w pozycji 239 i/lub interakcję VASPz białkami w materiale biologicznym.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19749091A DE19749091C1 (de) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | Antikörper gegen phosphoryliertes VASP (Vasodilator-Stimuliertes Phosphoprotein), Hybridomzellen zu dessen Herstellung sowie dessen Anwendung |
| US7937598P | 1998-03-26 | 1998-03-26 | |
| PCT/EP1998/007103 WO1999024473A1 (en) | 1997-11-07 | 1998-11-06 | Antibodies against phosphorylated vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL340465A1 PL340465A1 (en) | 2001-02-12 |
| PL195985B1 true PL195985B1 (pl) | 2007-11-30 |
Family
ID=26041380
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL98340465A PL195985B1 (pl) | 1997-11-07 | 1998-11-06 | Przeciwciało monoklonalne, jego zastosowanie, linia komórek hybrydom, zestaw diagnostyczny i sposóbdiagnostyczny in vitro |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6649421B1 (pl) |
| EP (1) | EP1042368B1 (pl) |
| JP (1) | JP5031140B2 (pl) |
| KR (1) | KR100513418B1 (pl) |
| CN (1) | CN1188426C (pl) |
| AT (1) | ATE248189T1 (pl) |
| AU (1) | AU753557B2 (pl) |
| BR (1) | BR9813988A (pl) |
| CA (1) | CA2308604C (pl) |
| CZ (1) | CZ299889B6 (pl) |
| ES (1) | ES2205593T3 (pl) |
| HU (1) | HU222411B1 (pl) |
| PL (1) | PL195985B1 (pl) |
| RU (1) | RU2218178C2 (pl) |
| TR (1) | TR200001265T2 (pl) |
| WO (1) | WO1999024473A1 (pl) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10029210A1 (de) * | 2000-06-14 | 2002-01-31 | Vasopharm Biotech Gmbh & Co Kg | Testsystem sowie dessen Verwendung |
| US7176037B2 (en) * | 2000-07-13 | 2007-02-13 | The Scripps Research Institute | Labeled peptides, proteins and antibodies and processes and intermediates useful for their preparation |
| US6951947B2 (en) * | 2000-07-13 | 2005-10-04 | The Scripps Research Institute | Labeled peptides, proteins and antibodies and processes and intermediates useful for their preparation |
| EP1182263A1 (en) * | 2000-08-11 | 2002-02-27 | Evotec OAI AG | Process for detecting threonine/serine kinase activity |
| US20030162230A1 (en) * | 2000-09-27 | 2003-08-28 | Reagan Kevin J. | Method for quantifying phosphokinase activity on proteins |
| WO2002050121A1 (fr) * | 2000-12-13 | 2002-06-27 | Taisho Pharmaceutical Co.,Ltd. | Nouvel anticorps |
| EP1735453A2 (en) * | 2004-03-12 | 2006-12-27 | The Scripps Research Institute | Fluorescent signal emitting live cell biosensor molecules and dyes for detection and quantification of protein activities |
| CN103102411A (zh) * | 2009-06-11 | 2013-05-15 | 北京华大蛋白质研发中心有限公司 | 一种制备针对糖基化修饰蛋白质的单克隆抗体杂交瘤的方法 |
| FR2946756A1 (fr) | 2009-06-12 | 2010-12-17 | Biocytex | Dosage en sang total d'un biomarqueur intracellulaire appartenant a une voie de signalisation cellulaire- utilisation pour mesurer l'activation d'une population cellulaire determinee |
| WO2018049071A1 (en) | 2016-09-07 | 2018-03-15 | Vanderbilt University | Vasoactive polypeptides for smooth muscle relaxation |
| CN112730826A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-04-30 | 中南大学湘雅三医院 | 一种人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其检测方法和应用 |
| CN113238062B (zh) * | 2021-07-13 | 2021-09-28 | 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 | 一种用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法 |
| CN114002440B (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-01 | 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 | 一种用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU4281393A (en) | 1992-04-10 | 1993-11-18 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Activation-state-specific phosphoprotein immunodetection |
-
1998
- 1998-11-06 RU RU2000114841/14A patent/RU2218178C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-11-06 AU AU18712/99A patent/AU753557B2/en not_active Ceased
- 1998-11-06 CN CNB988114542A patent/CN1188426C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-06 EP EP98963419A patent/EP1042368B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-06 CA CA002308604A patent/CA2308604C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-06 US US09/530,864 patent/US6649421B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-06 PL PL98340465A patent/PL195985B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-11-06 HU HU0004099A patent/HU222411B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-11-06 BR BR9813988-6A patent/BR9813988A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-11-06 CZ CZ20001684A patent/CZ299889B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-11-06 TR TR2000/01265T patent/TR200001265T2/xx unknown
- 1998-11-06 AT AT98963419T patent/ATE248189T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-11-06 WO PCT/EP1998/007103 patent/WO1999024473A1/en active IP Right Grant
- 1998-11-06 ES ES98963419T patent/ES2205593T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-06 KR KR10-2000-7004901A patent/KR100513418B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-11-06 JP JP2000520481A patent/JP5031140B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-09-22 US US10/664,970 patent/US20040063914A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20010031830A (ko) | 2001-04-16 |
| JP2001522865A (ja) | 2001-11-20 |
| HU222411B1 (hu) | 2003-06-28 |
| ES2205593T3 (es) | 2004-05-01 |
| PL340465A1 (en) | 2001-02-12 |
| CA2308604C (en) | 2009-12-15 |
| CZ20001684A3 (cs) | 2000-11-15 |
| TR200001265T2 (tr) | 2000-09-21 |
| BR9813988A (pt) | 2000-09-26 |
| JP5031140B2 (ja) | 2012-09-19 |
| AU753557B2 (en) | 2002-10-24 |
| CN1188426C (zh) | 2005-02-09 |
| EP1042368A1 (en) | 2000-10-11 |
| CN1279691A (zh) | 2001-01-10 |
| HUP0004099A1 (en) | 2001-03-28 |
| US6649421B1 (en) | 2003-11-18 |
| US20040063914A1 (en) | 2004-04-01 |
| AU1871299A (en) | 1999-05-31 |
| ATE248189T1 (de) | 2003-09-15 |
| KR100513418B1 (ko) | 2005-09-09 |
| CA2308604A1 (en) | 1999-05-20 |
| EP1042368B1 (en) | 2003-08-27 |
| RU2218178C2 (ru) | 2003-12-10 |
| CZ299889B6 (cs) | 2008-12-29 |
| HUP0004099A3 (en) | 2002-01-28 |
| WO1999024473A1 (en) | 1999-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0267611B1 (en) | Antibody against interleukin-1 | |
| US6649421B1 (en) | Antibodies against phoshorylated VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use | |
| EP0673389A1 (en) | Antibodies for gm-csf receptor and uses thereof | |
| EP0739488A1 (en) | Antagonists to insulin receptor tyrosine kinase inhibitor | |
| EP0913405A1 (en) | Monoclonal antibody specific for prostaglandin d synthetase | |
| US5425942A (en) | Polyfunctinal protease | |
| KR940010021B1 (ko) | 인체 심방의 나트륨 이뇨성 펩티드에 대한 모노클론 항체 | |
| AU4286000A (en) | Use of heparin-binding antagonists in the inhibition of bradykinin release | |
| DK174151B1 (da) | Monoklonalt antistof, hybridoma og reagens til immunoanalyse af alfa-hANP | |
| EP1388543A2 (en) | Antibodies against phosphorylated VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use | |
| Johnson et al. | Identification of an antigenic epitope and receptor binding domain of human C5a. | |
| MXPA00004331A (en) | Antibodies against phosphorylated vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use | |
| US5516643A (en) | Immunochemical assays for cancer-associated SCM-recognition factor | |
| JP2925479B2 (ja) | 肺小細胞癌検出薬及びその使用 | |
| DE69817616T2 (de) | Antikörper gegen vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridomzellen für deren gewinnung, und deren verwendung | |
| US20080279856A1 (en) | Inhibition of Bradykinin Release | |
| US20030166568A1 (en) | Organic compounds | |
| JPH06153981A (ja) | Ｌａｃｉの免疫学的測定方法、それに用いるキット並びにモノクローナル抗体 | |
| Oh et al. | Quantitative differentiation of the haptoglobin-related gene product from haptoglobin in human plasma: a possible test for tumor-associated antigen | |
| JPH08313524A (ja) | トロンビンレセプター発現量または活性化量の測定方法 | |
| EP1674110A1 (en) | Inhibition of bradykinin release |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification | ||
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20101106 |