HU222411B1 - Foszforilált VASP elleni antitestek, hibridóma sejtek előállításukra és az antitestek alkalmazása - Google Patents

Foszforilált VASP elleni antitestek, hibridóma sejtek előállításukra és az antitestek alkalmazása Download PDF

Info

Publication number
HU222411B1
HU222411B1 HU0004099A HUP0004099A HU222411B1 HU 222411 B1 HU222411 B1 HU 222411B1 HU 0004099 A HU0004099 A HU 0004099A HU P0004099 A HUP0004099 A HU P0004099A HU 222411 B1 HU222411 B1 HU 222411B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
vasp
antibody
phosphorylation
phosphorylated
antibodies
Prior art date
Application number
HU0004099A
Other languages
English (en)
Inventor
Martin Eigenthaler
Heinz Hoschützky
Ulrich Walter
Original Assignee
Vasopharm Biotech Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19749091A external-priority patent/DE19749091C1/de
Application filed by Vasopharm Biotech Gmbh filed Critical Vasopharm Biotech Gmbh
Publication of HUP0004099A1 publication Critical patent/HUP0004099A1/hu
Publication of HUP0004099A3 publication Critical patent/HUP0004099A3/hu
Publication of HU222411B1 publication Critical patent/HU222411B1/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5064—Endothelial cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát olyan, a VASP (vasodilator által serkentettfoszfoprotein, „vasodilator-stimulated phosphopro- tein") elleniantitestek képezik, melyek csak abban az esetben kötik a VASP-ot, haaz foszforilálva van a 157-es sze- rin aminosavon, azaz 157-esfoszfoszerint tartalmazó VASP. Továbbá, a találmány tárgyát képezik a157-es foszfo- szerint tartalmazó VASP elleni antitestek előállításáraszolgáló hibridómasejtek, az antitesteket vagy antitestfrag-mentumokat tartalmazó diagnosztikai reagenskészletek, valamintalkalmazásuk diagnosztikai és/vagy gyógyászati célra. A találmányszerinti megoldás alkalmas az endothelium működésének vizsgálatára, exvivo biológiai anyagból (pél- dául sejt- vagy vérminta), szokásoslaboratóriumi eljárásokkal, miáltal az endothelium hibás működéseáltal okozott károsodás visszafordítható. ŕ

Description

A találmány tárgyát olyan, a VASP (vasodilator által serkentett foszfoprotein, „ vasodilator-stimulated phosphoprotein) elleni antitestek képezik, melyek csak abban az esetben kötik a VASP-ot, ha az foszforilálva van a 157-es szerin aminosavon, azaz 157-es foszfoszerint tartalmazó VASP. Továbbá, a találmány tárgyát képezik a 157-es foszfoszerint tartalmazó VASP elleni antitestek előállítására szolgáló hibridómasejtek, az antitesteket vagy antitestfragmentumokat tartalmazó diagnosztikai reagenskészletek, valamint alkalmazásuk diagnosztikai és/vagy gyógyászati célra.
A találmány szerinti megoldás lehetővé teszi az endothelium működésének gyors és egyszerű vizsgálatát, ex vivő biológiai mintából (például sejt- vagy vérminta), szokásos laboratóriumi eljárásokkal.
Az érrendszer elváltozásai számos krónikus és életveszélyes betegség, mint például szívinfarktus, szívroham („stroke”), érelmeszesedés és a vesebetegségek számtalan formája, kialakulásáért felelősek.
Az endothelsejtek - melyek többek között szabályozzák a véralvadási rendszert, a trombociták működési állapotát, a gyulladásban lévő és a rákos sejtek vándorlását az érfalba, a simaizom-sejtek kontrakciós állapotát és növekedését, és ennek megfelelően a vérnyomást és az érfal szerkezetét, illetve az erek képződését - az érrendszer működésének szabályozásában különösen fontos szerepet töltenek be. A súlyos érrendszeri megbetegedések során az érfalnak ezek a funkciói olyan mérvű károsodást szenvednek, mely végül szívinfarktushoz, szívrohamhoz („sírodé), illetve a számtalan vesebetegség valamelyikének kialakulásához vezethet.
Az endothelium termeli az igen fontos szerepet betöltő prostaciklint (PG12) és a nitrogén-monoxidot (NO), mely utóbbit az endotheliumeredetű relaxációs faktorok (EDRF) közé sorolják. A PGL2 és az NO gátolja mind a trombocitákat, mind pedig az érfal izmait. Az endothelium működését az említett endothelialis eredetű faktorok - mint a prostaciklin (PG12) vagy EDRF, például NO - szabályozzák.
Tehát, az endothelium hibás működésével kapcsolatos betegségek meghatározott módon történő kezeléséhez szükség van olyan biológiai jellemzők meghatározására, amelyek lehetővé teszik az endothelium hibás működésének diagnosztizálását és a szükséges korrekciót.
Kívánatos az endothelium hibás működésének felismerése a lehető legkorábban, azaz abban a stádiumban, amikor az endothelium hibás működése által okozott visszafordíthatatlan károsodás - mint amilyen az atherosclerosis - még nem fejlődött ki.
Az endothelium hibás működésének korai stádiumban történő felismerése lehetővé teszi olyan új gyógyászati eljárások kifejlesztését, amelyek által az endothelium hibás működése okozta károsodás visszafordíthatóvá válik.
Az endothelium működésének meghatározására szolgáló ismert eljárások lehetnek behatoló „invasive” eljárások, mint például a kvantitatív angiográfía, vagy nem behatoló „non-invasive eljárások, mint például a leképező „image-providing” eljárások. Ezeknek az eljárásoknak hátrányai azok, hogy a vizsgálatok közvetlenül a vizsgálandó személyen történnek, mennyiségi meghatározásuk pedig nehézkes és nagyon költségesek.
Ennek megfelelően olyan biokémiai/immunológiai eljárások kifejlesztése szükséges, amelyek az endothelium működésének gyors és egyszerű vizsgálatát, ex vivő biológiai mintából (például sejt- vagy vérminta), szokásos laboratóriumi eljárásokkal lehetővé teszik.
Az endothelium működése azokból a folyamatokból áll, amelyeket az endotheliumeredetű faktorok, így a prostaciklin (PGI2) vagy EDRF, például NO, szabályozhatnak.
A találmány célja reagensek biztosítása az endothelium működésének értékelésére és szabályozására. E szerint és a találmány egyéb céljainak megfelelően a találmány tárgyát olyan, a VASP („ vasodilator-stimulated phosphoprotein ) elleni antitest képezi, melyek a VASP-ot csak abban az esetben kötik, ha az foszforilált formában van jelen.
A találmány szerinti megoldás egyik szempontja szerint egy olyan antitestet tárunk fel, amely a VASPot csak abban az esetben köti, ha a VASP a 157-es szerin aminosavon foszforilálva van (157-es foszfoszerint tartalmazó VASP, röviden: „foszfoszerin 157 VASP).
A találmány különböző megvalósítási módjai magukban foglalják a poliklonális antitesteket, a monoklonális antitesteket és az antitestfragmentumokat. Más megvalósítási módok magukban foglalják a 16C2 - és különösen a Mab 16C2 - hibridóma-sejtvonal által termelt monoklonális antitestet.
A találmány további célja a találmány szerinti antitest előállítására alkalmas hibridómasejtek előállítása. Ezen célnak megfelelően a találmány további tárgya egy hibridóma-sejtvonal, mely termeli azt az antitestet, amely a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi a 16C2 hibridóma-sejtvonal (ACC2330).
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során az volt a további célunk, hogy az endothelium működésének kiértékelésére alkalmas eljárást fejlesszünk ki. Ezzel összhangban a találmány tárgyát képezik a VASP foszforiláltsági állapotának meghatározására szolgáló eljárások. A találmány szerinti megoldás egyik szempontja szerint biológiai anyagot olyan, a VASP („vasodilator-stimulated phosphoprotein) elleni antitesttel hozunk kapcsolatba, amely a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van.
A találmány szerinti megoldás egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy mennyiségi eljárás, amely magában foglalja a biológiai anyaghoz kötött VASP-antitest mennyiségi meghatározását is. A találmány egy speciális megvalósítási módja például egy Westem-blot-eljárás, mely a VASP elektroforetikus elválasztásából, és a VASP és annak a VASP elleni antitestnek a reakciójából áll, mely antitest a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van. A találmány egy másik megvalósítási módja egy áramlási citometriás („flow cytometry”) eljárás, amelyben a mintát olyan, a VASP elleni antitesttel hozzuk
HU 222 411 BI kapcsolatba, amely a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van.
A találmány szerinti megoldás másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy diagnosztikai eljárás. Egy tipikus eljárás szerint a mintát olyan, a VASP elleni antitesttel hozzuk kapcsolatba, amely a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van, és kiértékeljük a VASP foszforiláltsági állapotát. A találmány egy megvalósítási módja szerint ez az eljárás magában foglalja a mintában található VASP foszforiláltságának mennyiségei meghatározását. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint olyan eljárásokat dolgozunk ki, amelyekben az antitest a foszfoszerin 157 VASP-hoz kötődik. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a minta humán trombocita vagy humán teljes vérminta.
A találmány szerinti megoldás további célja az endothelium működését jellemző markerek azonosítására irányuló eljárások biztosítása. A találmány tárgya egy szempont szerint eljárás a cGMP- és/vagy a cAMP-szinteket befolyásoló anyagok azonosítására. Az eljárás szerint a cGMP- és/vagy cAMP-szinteket befolyásoló anyagokkal kezelt betegekből származó mintákat használunk. A mintákat olyan, a VASP elleni antitesttel hozzuk kapcsolatba, amely a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van, és a kontrollmintával összehasonlítva kiértékeljük a VASP foszforiláltsági állapotát.
Részletesen leírunk továbbá egy, az endothelium hibás működésének megállapítására szolgáló eljárást, amely során egy betegből származó mintát és egy olyan, a VASP elleni antitestet érintkeztetünk, amely antitest a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van, majd az egészséges (normális) mintával összehasonlítva kiértékeljük a VASP foszforiláltsági állapotát.
A találmány szerinti megoldás további célja egy olyan reagenskészlet előállítása, amely alkalmas az itt leírt diagnosztikai eljárás megvalósítására. Továbbá, a találmány tárgyát képezi egy reagenskészlet, amely egy olyan antitestet tartalmaz, amely antitest a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van.
A találmány szerinti megoldás további célja az endothelium hibás működésétől szenvedő betegek kezelését szolgáló eljárások megalkotása. E szerint és a találmány szerinti megoldás más céljai szerint feltárunk egy kezelési eljárást, amelynek során a beteget gyógyászatilag hatásos mennyiségű olyan antitesttel kezelünk, amely antitest a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van.
A hormonok és hatóanyagok hatására a trombociták és az érfal sejtjeiben foszforilálódó humán VASP-ot („ vasodilator-stimulated phosphoprotein ”) nemrég azonosították, izolálták és jellemezték molekuláris genetikai szempontból [Haffner és munkatársai, EMBO J. 14, 19-27 (1995)].
A VASP az ANF/NO/cGMP/cGMP proteinkináz szignálútvonal fontos komponense, mely útvonal élettani, kórélettani és gyógyászati szempontból, illetve a cAMP/cAMP proteinkináz szignálútvonalban rendkívül fontos szerepet tölt be [U. Walter, Blick 1/97 Würzburg University, 79-81 (1997)]. A VASP-ot csaknem minden humán és állati sejt expresszálja, azonban a trombocitákban, az erek sima izomzatában és a fibroblasztban különösen magas koncentrációban találták meg. Sejtkultúrákban a VASP a felületek találkozási gócaihoz (sejt/mátrix érintkezési felületei), sejt/sejt érintkezési pontjaihoz, mikrofilamentumokhoz és dinamikus membránterületekhez (például vezetőéi, „leading edge”) kapcsolódik [Walter és munkatársai, Agents and Actions 45S, 255-268 (1995)].
Az érrendszerben a VASP foszforilációja a trombociták adhéziójával/aggregációjának gátlásával, a simaizom-összehúzódás/vándorlás gátlásával és a paracelluláris endothelium áteresztőképesség-gátlásával függ össze.
A VASP három különböző helyen foszforilálódik, illetve defoszforilálódik [157-es szerin, 239-es szerin és 278-as treonin, [ld. Horstrup és munkatársai, Eur. J. Biochem. 225, 21-27 (1994)]}. A 239-es szerin aminosavat esetenként 238-as szerűinek nevezik, különösen akkor, ha a VASP aminosavsorrendjének számozásakor az első metionint nem veszik figyelembe.
A VASP 239-es szerinte az egészséges humán keringési rendszer sejtjeiben (trombociták, endotheliumsejtek és simaizom-sejtek) élettani és gyógyászati NOdonorok, trombocitainhibitorok és értágítók hatására foszforilálódik.
A VASP 239-es szerinyét cGMP-fiiggő proteinkinázok foszforilálják. A cGMP-fiiggő proteinkinázokat - a cGMP-η keresztül - fontos hormonok, mint például nátrium vizeletürítését serkentő (natriureticus) peptidek, vagy NO-ot felszabadító anyagok és hatóanyagok aktiválják. A VASP 239-es szeriújét - emellett - a cAMP-szintet növelő hormonok és hatóanyagok által aktivált cAMP-fiiggő proteinkinázok is foszforilálják.
Bár a cAMP-függő proteinkinázok főként a 157-es helyen található szerin aminosavat foszforilálják, a VASP aminosavsorrendjében a 239-es helyen található szerint is foszforilálják. Egyes megfigyelések szerint az emberi trombocitákban a VASP 157-es szerűijének foszforilációja szoros kapcsolatban van a fibrinogén és Ilb-IIIa glikoprotein kapcsolatának gátlásával [Horstrup és munkatársai, Eur. J. Biochem. 225, 21-27 (1994)].
Biológiai mintákból, például szövetek és sejtek kivonatából, a VASP, különösen a VASP 239-es és/vagy 157-es szerinte, foszforilációs mértékének meghatározása egy igen jelentős biokémiai paraméter lehet. E biokémiai paraméter lehetővé teszi olyan diagnosztikai rendszer kifejlesztését, mellyel meg lehet határozni azokat a hormonokat vagy hatóanyagokat, melyek a cGMP- és/vagy a cAMP-szinteket növelik [például pitvari („atrial”) nátriumürítő faktor (ANF), guanilin, NO-ot felszabadító anyagok és hatóanyagok], továbbá melynek segítségével következtetéseket vonhatunk le az endothelium in vivő működéseivel kapcsolatban.
A foszforilált fehérjéket reverzibilisen kötő antitesteket már leírtak az 5,599681 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban, WO 93/21230 számú
HU 222 411 Β1 nemzetközi közzétételi iratban, illetve leírt U. Walter [Blick 1/97 Würzburg University, 79-81 (1997)].
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célunk az volt, hogy olyan biokémiai/immunológiai eljárást fejlesszünk ki, amely biológiai mintában lehetővé teszi a VASP foszforilációs állapotának gyorsan és egyszerűen történő minőségi és/vagy mennyiségi meghatározását.
Ezt a célt egy olyan antitest előállításával értük el, amely antitest a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van.
Ezáltal a találmány tárgyát képezi - teljesen általánosan elfogadott módon - egy antitest, amely antitest a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van.
A találmány szerinti antitesten értünk olyan poliklonális, monoklonális antitesteket (Mabs) és ezek fragmentumait, illetve az SCFV fragmentumokat vagy más szintetikus vagy rekombináns fehéijedoménokat, melyek a VASP foszforilálódott szakaszait specifikusan felismerik.
Az antitestfragmentumok magukban foglalják az antitest bármely részét, amely képes a célantigént - ez esetben a VASP-hoz vagy annak egy specifikus részéhez megkötni. Az antitestfragmentumok különösen az F(ab’)2, Fab, Fab’ és Fv fragmentumokat jelentik. Ezeket a fragmentumokat bármelyik antitestosztályból elő lehet állítani, de ezek jellemzően IgG-ból vagy IgM-ből készülnek. Ezeket a fragmentumokat elő lehet állítani a hagyományos rekombináns DNS-technikák alkalmazásával, vagy a klasszikus úton papainnal vagy pepszinnel végzett proteolitikus emésztéssel. [Lásd „Current protocols in immunology”, II. fejezet, szerk.: Coligan és munkatársai, John Wiley and Sons (1991-1992)].
Az F(ab’)2 fragmentumok jellemzően körülbelül 110 kDa (IgG), illetve 150 kDa (IgM) méretűek és két antigénkötő részt tartalmaznak. Az antigénkötő régiók diszulfidhíddal (hidakkal) kapcsolódnak egymáshoz. Ezekből a fragmentumokból gyakorlatilag majdnem az összes, ha nem az összes Fc hiányzik. A Fab’ fragmentumok jellemzően körülbelül 55 kDa (IgG), illetve 75 kDa (IgM). A Fab’ fragmentumokat egy F(ab’)2 fragmentumból, a diszulfidkötés(ek) redukálásával lehet előállítani. A redukciót követően keletkezett szabad szulfhidrilcsoport(ok) felhasználásával a Fab’ fragmentumokat könnyen lehet más molekulákkal, például az azonosításra alkalmas reagensekkel (például enzimekkel) konjugálni. A monovalens Fab fragmentumok általában, eredettől függetlenül körülbelül 50 kDa méretűek. A Fab fragmentumok magukban foglalják a könnyű („light) és a nehéz („heavy) láncokat, illetve az antitest antigénkötő részének változékony („variable) (VL és VH) és állandó (CL és Ch,) régióit. A H és L részek intramolekuláris diszulfidhíddal kapcsolódnak.
Az Fv fragmentumok - eredetüktől függetlenül jellemzően körülbelül 25 kDa méretűek, és tartalmazzák mind a könnyű (VL) és a nehéz (VH) láncokat. Általában a VL és a VH láncokat nem kovalens kötések tartják össze, így könnyen disszociálódnak. A nagyobb Fab fragmentumokkal azonos kötési tulajdonságokkal rendelkeznek, azonban a méretük előnyösen kicsi. Eszerint, a VL és a VH láncok keresztkötésére különböző, például glutáraldehid (illetve más kémiai keresztkötés létrehozására alkalmas vegyületek) alkalmazásán, intramolekuláris diszulfidhíd kiépítésén (ciszteinek beépítése) vagy peptidlinkerek használatán alapuló eljárásokat fejlesztettek ki. Az így kapott Fv egy láncból áll (azaz SCFv; „single chain Fv”).
Egy előnyös eljárás magában foglalja az SCFv-k előállítását rekombináns eljárások alkalmazásával. Az eljárás lehetővé teszi, hogy különböző antitestekből származó változékony láncokat keverve és illesztve, új tulajdonságokkal rendelkező Fv fragmentumokat állítsunk elő. Egy jellemző eljárás során olyan rekombináns vektort készíthetünk, mely egy megfelelő szabályozóelemekkel hajtott expressziós kazettát tartalmaz. A kazettarégió tartalmazhat egy, a fúziós fehérjék létrehozására alkalmas peptid-linkerszekvenciát kódoló, az 5’ és 3’ végein kényelmesen használható klónozóhelyeket tartalmazó DNS-szakaszt. Linkerrel ellátott fúziós fehérje készítése céljából a kívánt változékony régiót(kat) kódoló DNS-szakaszt a vektorba klónozva egy SCFv-t állíthatunk elő.
Egy példaképpen ismertetett alternatív megközelítés szerint, két Fv-t kódoló DNS-t a linkért tartalmazó DNS-hez ligáljuk, és a kapott tripla fúziós konstrukciót közvetlenül egy hagyományos expressziós vektorba ligáljuk. Ezen eljárások bármelyike szerint előállított DNS-t - a választott vektortól függően - eukarióta-, illetve prokariótasejtekben fejezhetjük ki.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint olyan monoklonális antitesteket alkalmazunk, amely antitest a VASP-ot csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van.
A találmányi leírásban használt értelemben a VASP kifejezésen a VASP-származékokat is értjük. Ilyenek például a funkcionálisan azonos részt tartalmazó származékok, a mutánsok, a VASP-ffagmentumok és -változatok, például foszfoszerin 239 VASP, amely emellett a 157-es szerinen és/vagy 278-as treoninoa foszforilálva van, ezenkivül például a glikozilációs mutánsok és egyéb kovalens változtatások, illetve az olyan strukturális elemek, melyek a fehérje/fehérje kölcsönhatás szempontjából jelentősek. A leírásban a VASP kifejezésen mind humán, mind pedig más fajokból, konkrétan emlősökből (például patkány, egér, nyúl, kutya, sertés és majom) származó VASP-ot értjük.
Az antitestek bármilyen hagyományos eljárással előállíthatók. Ilyen például a Köhler és Milstein által leírt eljárás [Köhler és Milstein, Natúré 256, 495 (1975)]. Amennyiben az antitest szelektivitásának a foszforilációs állapottól kell fiiggenie, az antitestet foszforilált VASP ellen termeljük. Az izolált antitesteket hagyományos módon, egy meghatározott szelektivitásra nézve válogatjuk. Az antitesteket előnyösen a VASP 157-es szerint, 239-es szerint és/vagy 278-as treonint tartalmazó fragmentuma ellen termeljük.
A VASP-antigén hosszúsága mindaddig jelentéktelen, amíg képes humorális választ kiváltani. A jellemző peptidek 50 aminosavnál rövidebbek. Néhány előnyös
HU 222 411 Β1 peptid körülbelül 20 aminosavnál rövidebb. A legelőnyösebb peptidek hosszúsága körülbelül 6 és körülbelül 12 aminosav közötti. Az előnyös peptidek magukban foglalják a KLRKVS239KQ és a RKVS239KQE szakaszt. A peptid előnyösen foszforilált a 15-ös szerinen, a 239-es szerinen és/vagy a 278-as treoninon. A peptidek lehetnek rekombináns eredetűek. A peptideket jellemzően a VASP proteolitikus lebontásával vagy in vitro szintézissel és foszforilációval állítják elő.
Előnyösek továbbá azok a monoklonális antitestek, melyek a fent említett tulajdonságokat mutatják, és melyeket az áramlási citometriában alkalmazni lehet. Ehhez az új antitestnek meg kell őriznie specificitását abban az esetben is, amikor az antitestet olyan körülményeknek tesszük ki, amely az antitest konformációjának megváltozását okozhatja. Ilyen körülmény lehet például az áramlási citometriában alkalmazott rögzítési lépésben. Ezért az új antitestet tesztelhetjük például az áramlási citometriára való alkalmasság oldaláról is.
A 16C2 jelzésű monoklonális antitest különösen előnyös.
Az új antitesteket a szakember által önmagában ismert eljárásokkal készíthetjük el. A monoklonális antitestek termeléséhez a hibridómasejtek előállítására előnyösen alkalmazható a Köhler és Milstein által leírt technika [Köhler és Milstein, Natúré 256, 495 (1975)]. A tisztított antitestek specificitását az alábbi teszteljárásokkal vizsgálhatjuk:
a) Westem-blot-eljárás cAMP- vagy cGMP-függő proteinkinázokkal különböző mértékben foszforilált rekombináns VASP felhasználásával, azzal az asszociációval, hogy csak foszforilált VASP esetében szabad pozitív jelet kapnunk.
b) Westem-blot-eljárás olyan sejtextraktumok, például Pkt2 sejtek kivonatai felhasználásával, melyeket humán cGMP proteinkinázzal, humán VASP-pal vagy különböző úton létrehozott VASP-mutánsokkal transzfektáltunk. A mutánsok mindegyikében a mutáció a három foszforilációs hely valamelyikében történt, és a mutáció - (S157A) VASP, (S239A) VASP és (T278A) VASP - a foszforilációs hely törlését eredményezte. Alkalmasak azok az antitestek, melyek felhasználásával kapott pozitív jelet az S239A mutáció törölte, de a másik két mutáció nem.
c) Westem-blot-eljárás különböző értágító szerekkel (például prostaciklin vagy NO-donorok), vagy cAMP-, illetve cGMP proteinkináz-aktivátorokkal kezelt humán trombociták felhasználásával. Alkalmas az az antitest, amivel az extraktumban csak foszforilált VASP esetében azonosítható egy specifikus sáv. Hasonló módon, humán fibroblaszt, illetve patkány- és egértrombocita felhasználásával is lehet az antitesteket szűrni.
d) Immunfluoreszcens vizsgálat rögzített humán trombociták és endotheliumsejtek felhasználásával. Pozitív jelet akkor kapunk, ha a VASP foszfoprotein formában van jelen.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy hibridómasejtvonal, mely az új, monoklonális antitestet termeli. Különösen előnyös a 16C2 jelű monoklonális antitestet termelő 16C2 jelű hibridóma-sejtvonal.
A 16C2 jelű monoklonális antitestet termelő 16C2 jelű hibridóma-sejtvonalat, az 1997. november 6-án, a Budapesti Egyezmény szabályai szerint, DSM ACC2330 azonosítási számon letétbe helyeztük a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen intézményben (A mikroorganizmusok és sejtkultúrák németországi gyűjteménye), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Németország.
Az új antitest alkalmas a VASP in vivő és in vitro foszforilációjának minőségi és/vagy mennyiségi - előnyösen mennyiségi - meghatározására, előnyösen a VASP 239-es szerinjén és/vagy a 157-es szerinjén bekövetkező foszforiláció meghatározására, különösen előnyösen a VASP 239-es szerinje foszforilációjának meghatározására.
Az antitestek felhasználásán alapuló kvantitatív eljárások a technika állása szerint jól ismertek. Ilyen eljárások találhatók például a „Current protocols in immunology [II. fejezet, szerk.: Coligan és munkatársai, John Wiley and Sons (1991-1992)] c. kiadványban. Ezek az eljárások az enzimhez kapcsolt immunoszorbens esszéket (Enzyme-linked Immunosorbant Assay, ELISA), radioimmunoesszéket (Radioimmunoassay, RIA) és hasonlókat foglalják magukban.
Az új antitestek emellett alkalmasak biológiai anyagban a VASP foszforilációjának minőségi és/vagy mennyiségi, előnyösen mennyiségi meghatározására, előnyösen a VASP 239-es szerinjén és/vagy a 157-es szerinjén bekövetkező foszforiláció meghatározására, különösen előnyösen a VASP 239-es szerinje foszforilációjának meghatározására.
A biológiai anyag kifejezésen például a következőket értjük: sejtkivonatok, szövetkivonatok, sejtmetszetek, sejtszövet és sejt, például trombocita, leukocita, endotheliumsejt, simaizom-sejt és fibroblaszt. A biológiai anyag lehet humán vagy más emlős-, például patkány-, egér-, nyúl-, kutya-, sertés- és majomeredetű. Előnyös a humán eredetű biológiai anyag.
Az új antitestek alkalmasak biológiai anyagban a foszforilált VASP, különösen a foszfoszerin 157 VASP és/vagy a foszfoszerin 239 VASP mennyiségi meghatározására a Westem-blot során kapott autoradiogramok, a szakember számára ismert eljárásokkal történő - például a NIH gél blotting image 1.6. szofver, vagy más, immunfluoreszcencián alapuló - kvantitatív kiértékelésével.
A VASP 239-es és 157-es szerinjén történő foszforiláció és a cGMP- és/vagy cAMP-függő proteinkinázok aktivitása közötti összefüggés miatt az új antitestek reagensként alkalmazhatók a cGMP szignálútvonalak és a cAMP szignálútvonalak, különösen a cGMP szignálútvonalak diagnosztizálására.
Az új antitestek felhasználása a foszfoszerin 239 VASP biológiai anyagokból, Westem-blot-technikával és immunofluoreszcenciával történő meghatározására lehetővé teszi a cGMP-szintet növelő anyagok, hormonok és gyógyszerek azonosítására szolgáló diagnosztikai eljárások kifejlesztését. Ilyen anyagok például a következők lehetnek: ANF, guanilin, NO-felszabadító anyagok vagy gyógyszerek. Például a NO-dono5
HU 222 41 IBI rok terápiájának és annak lefolyásának szabályzását nyomon lehet követni, amely - többek között - az esetleg kifejlődő nitráttoleranciára jellemző tünetekkel kapcsolatban adatokat szolgáltat.
A VASP 157-es szerinjén történő foszforiláció és a cAMP-függő proteinkinázok aktivitása közötti összefüggésből következik, hogy az új antitestek reagensként alkalmasak lehetnek a cAMP-szintet növelő anyagok, hormonok és gyógyszerek diagnosztizálására.
Következésképpen a találmány tárgyát képezi a diagnózis vagy terápia, mely az új antitesteket vagy annak fragmentumait hasznosítja.
Az új eljárások olyan eljárások, melyeket laboratóriumban, az emberi testen kívül (ex vivő) lehet végrehajtani.
Az új antitesteket a VASP foszforilációs fokozatának megállapítására lehet felhasználni különböző fajokból származó biológiai anyagokban. Ilyen fajok például a következők lehetnek: ember, patkány, egér, nyúl, kutya, sertés vagy majom. Előnyös az új antitest felhasználása a foszforilált VASP meghatározására emberi, patkány-, egér- vagy kutyaeredetű biológiai anyagokban. Különösen előnyös új antitest felhasználása a foszforilált VASP meghatározására emberi eredetű biológiai anyagokban.
Az új antitestek vagy annak fragmentumai bioszenzorként is felhasználhatók. A bioszenzorok ismertek a szakember számára. Különösen előnyös az az eljárás, mely egy specifikus másodlagos kötőtársat - egy antitestet, egy lektint vagy egy receptort - alkalmaz. Ebben az esetben az azonosításhoz és a mennyiségi meghatározáshoz szükséges azonosítható jelzést a specifikus kötőtárs hordozza. A jelzések a szakember számára önmagukban ismertek. Jelzés lehet például egy kromofór-, egy luminofór-, egy fluorofórcsoport, egy enzim, egy radioaktív izotóp, vagy egy színtelen vagy színes részecske. Előnyös az olyan eljárás, melyben a jelöletlen specifikus kötőtársat közvetlenül vagy közvetve - például egy másik antitest vagy avidin/biotin híd segítségével - a szakember számára önmagában ismert eljárásokkal szilárd fázishoz rögzítik.
Az új antitestet vagy annak fragmentumait a szakember számára ismert eljárások használatával radioaktív jelzéssel el lehet látni. A jelzett új antitestet vagy annak fragmentumait immunoszcintigráfiában, illetve immunterápiás célokra fel lehet használni. Emellett az endothelium hibás működésének következtében kialakult betegségek gyógyításában ezeket a monoklonális antitesteket hatóanyag-szállítóként is lehet alkalmazni.
A Mab 16C2 „V” gén teljes nukleotidsorrendjének meghatározását követően, technikailag szintén lehetséges olyan antitestkonstrukciók előállítása, melyekben a humán Mab-vázba hipervariábilis régiókat inzertálunk [Jones és munkatársai, Natúré 321, 522-525 (1986); Verhoyen és munkatársai, Science 239, 1534-1536 (1988)].
Előnyös az antigén által megkötött antitest mennyiségi meghatározása trombocitákban áramlásicitometria-eljárással, például a teljes vérminta megfelelő részének, a szakember számára ismert eljárásokkal rögzítését követően. A szakember számára ismert áramlásicitometria-eljárásokat például G. Otten és W. M. Yokohama leírása szerint [G. Otten és W. M. Yokohama, „Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan. Current protocols in immunology, 5.4.1-5.4.19 (1992)] használják.
Az új antitestek alkalmazásával a VASP foszforilációjának, különösen a VASP 239-es szerinje foszforilációjának, áramlási citometriás vizsgálata nem korlátozódik a humán trombocitákra. A vizsgálatot más sejttípusokon, például limfocitákon, monocitákon, leukocitákon, endotheliumsejteken és simaizom-sejteken is végre lehet hajtani.
Az új antitestek segítségével, a frissen gyűjtött humán trombocitákban a VASP foszforilációjának, különösen a foszfoszerin 239 VASP foszforilációjának, áramlási citometriás vizsgálata lehetővé teszi, hogy endotheliumeredetű faktorok - például NO és prostaciklin - aktivitását meghatározzuk, következésképpen meg tudjuk állapítani az endothelium működésének, illetve hibás működésének szerepét például az arteriosclerosis, a magas vérnyomás, a cukorbetegség, szívműködési elégtelenség és veseelégtelenség során tapasztalt szív- és érkeringési rendellenességekben.
Az új antitestek segítségével, a VASP foszforilációjának, különösen a VASP 239-es szerinje foszforilációjának meghatározása lehetővé teszi a fent említett betegségek gyógyításának szabályozását. A terápia során kialakuló rezisztencia - mint például a nitráttolerancia - szintén meghatározható.
Az új antitesteket alkalmazni lehet gyógyszerhatóanyagokként is. Biológiai anyagokban hatóanyagként befolyásolják a VASP foszforiláltsági állapotát és/vagy a kapcsolatát fehérjékkel.
Következésképp a találmány tárgyát képezik azok a gyógyszerkészítmények, melyek legalább egy új antitestet tartalmaznak.
Az új készítmények felhasználhatók belsőleg (orálisan), a szülőket kezelve (intravénásán), a végbélnyíláson keresztül vagy helyileg (topikálisan). Adagolni lehet ezeket a készítményeket oldat, por (tabletták vagy kapszulák, a mikrokapszulákat is beleértve), liposzómakészítmények, lipidkomplexek, kolloid diszperziók, injekciós oldatok vagy kúpok formájában. A szokásos gyógyszerészeti oldatok vagy szilárd adalék anyagok és kiegészítők, oldatok, emulgeálók, „glidant”-ok, ízkiegészítők, színezékek és/vagy pufferként használt anyagok az ilyen természetű kiszerelésekhez alkalmas anyagok. Testtömegkilogrammonként 0,1-100 mg adagolása célszerű. Ezeket olyan dózisegységekben célszerű adagolni, melyek az új antitesteket legalább a napi effektív mennyiségben - például 30-3000 mg - tartalmazzák.
A napi adagolható dózis a testtömegtől, a kortól, a nemtől és az emlősalany állapotától függ. Azonban magasabb vagy alacsonyabb napi dózisok is alkalmazhatók. A napi dózist lehet egy alkalommal egy dózisegységben vagy több kisebb dózisegységben, illetve több alkalommal - előre meghatározott időközökben - felosztott dózisokban adagolni.
HU 222 411 Bl
Gyógyszerkészítmények előállítása esetén az új antitesteket gyógyszerészetileg inaktív szerves vagy szervetlen adalék anyagokkal dolgozzák el. A tabletták, bevont tabletták és keményzselatin-kapszulák elkészítéséhez alkalmas adalékanyagok például a laktóz, a kukoricakeményítő vagy ennek származékai, faggyú és sztearinsav (és palmitinsav), illetve ennek sói. Az oldatok készítéséhez alkalmas adalékanyagok a víz, többértékű alkoholok, szacharóz, inverz cukor és glükóz. Az injekciók készítéséhez alkalmas adalékanyagok a víz, többértékű alkoholok, glicerin és zöldségolajok. A kúpok készítéséhez alkalmas adalékanyagok a zöldségolajok és a keményített olajok, viaszok, zsírok és félig szilárd többértékű alkoholok. A gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak tartósítószereket, oldatokat, stabilizálókat, nedvesítőanyagokat, emulgeálókat, édesítőket, színezékeket, ízesítőanyagokat, az ozmotikus nyomás megváltoztatására alkalmas sókat, puffereket, bevonóanyagokat, antioxidánsokat, és ahol szükséges, más gyógyászatilag aktív vegyületeket.
A találmány tárgyát képezi az új gyógyszer előállítási folyamata, mely során gyógyászatilag alkalmas - és fiziológiailag tolerálható adalék anyagokkal, illetve ahol szükséges, más alkalmas aktív vegyületekkel, adalékokkal vagy kiegészítő anyagokkal, legalább egy új antitestet adagolásra alkalmas formulációba visznek.
A találmány tárgyát képezi, eléggé általánosan, egy diagnosztikai eljárás, mely alkalmas a VASP foszforilációjának, előnyösen a VASP 239-es szerbije foszforilációjának meghatározására, más specifikus szondák, például monoklonális antitestek, poliklonális antitestek, SCFV fragmentumok vagy más szintetikus vagy rekombináns fehéijedoménok, melyek specifikusan azonosítják a VASP, különösen a foszfoszerin 239 VASP foszforilált szekvenciáit.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy diagnosztikai eljárás, mely alkalmas a VASP 157-es szerinje és/vagy a 278-as treoninja foszforilációjának meghatározására, más specifikus szondák, például monoklonális antitestek, poliklonális antitestek, SCFv fragmentumok vagy más szintetikus vagy rekombináns fehéijedoménok, melyek specifikusan azonosítják a VASP azon szekvenciáit, melyek a foszforilált 157-es szerint és/vagy a -treonint tartalmazzák.
A prolingazdag fehérjékhez, például zyxin és vinculin, és egyidejűleg a saját prolingazdag doménjének profilinhez való kötődésének révén a VASP lehetővé teszi aktinszálak kialakulását, melyekben a VASP adapter molekulaként vesz részt. E fehéije/fehétje kapcsolat zavara gyakran hibás trombocitaaggregációhoz vagy -izom-összehúzódáshoz vezet. így például a sima izmok összehúzódásának előfeltétele az aktin/miozin hidak létrejötte. A VASP 157-es szerijének foszforilációja és a fibrinogén receptor glikoprotein Ilb/IIIa gátlása között összefüggést tapasztaltak [Horstrup és munkatársai, Eur. J. Biochem., 225, 21-27 (1994)]. A VASP 157-es szerinje foszforiláltságának meghatározása tehát lehetővé teszi az olyan anyagok vagy gyógyszerek szisztematikus keresését, melyek a VASP és a VASP intracelluláris kötőtársa közötti kapcsolatra hatást gyakorolnak, és
- például - alkalmasak a keringés károsodásával kapcsolatos szív- és érkeringési betegségek gyógyítására.
A találmány előnyös megvalósítási módjait az alábbi, leírást kiegészítő példákban írjuk le.
A következő példák - anélkül, hogy bármennyire is korlátoznák azt — a találmány szerinti megoldás világosabb megértését szolgálják.
Példák
1. példa
A foszfoszerin 239 VASP elleni monoklonális antitest izolálása
Egy foszforilált és egy nem foszforilált, a 239-es szerin környezetében található KLRKVS239KQ-t és a RKVS239KQE peptidszekvencia-szakaszt tartalmazó peptidet szintetizáltunk egy Applied Biosystems peptidszintetizátor segítségével a szakember számára ismeretes Fmoc-reakció szerint.
A foszforilált peptidbe a foszfoszerint a peptidszintézis közben Fmoc-szerin [PO(Obzl)OH-OH] (Calbiochem) segítségével építettük be. A tömegspektrométerrel igazolt peptideket fordított fázisú oszlopkromatográfiával (RPC), Vydac 218TP oszlopon, >98% tisztaságig tisztítottuk.
A bróm-ecetsavval vagy bróm-ecetsav-N-hidroxiszukcimid észterrel (Sigma) aktivált peptideket tiolált KLH-val (Keyhole limpet hemocyanin, nanoTools) kapcsoltuk össze. Nőstény Balb/c egereket (6 hetes) 4 alkalommal, 14 naponként KLH-foszfopeptiddel (10 pg/egyed) szubkután immunizáltunk. Az első injekció esetében a foszfopeptidet komplett, a további három injekciónál inkomplett Freund-féle adjuvánssal kevertük el. Az utolsó injekciót követő második hét elteltével az egerek PBS-ben (foszfátpufferelt sóoldat „Phosphate Buffered Saline”) feloldott, 10 pg immunogént tartalmazó „megerősítő” injekciót kaptak három napon keresztül naponta. A legutolsó „booster” injekciót követő napon az egereket elöltük és a lépet eltávolítottuk. A lépsejteket elkülönítettük és nem termelő mielomasejtekkel fuzionáltattuk [például: PAI-Zellen, J. W. Stocker és munkatársai (1982) Rés. Disclosure, 21713] a Köhler/Milstein által megalapozott módszertan szerint.
A foszfoszerin 239 VASP elleni antitesteket termelni képes hibridóma sejteket megkülönböztető szkrínelési eljárásokban foszforilált/nem foszforilált peptideket és foszforilált/nem foszforilált rekombináns emberi VASP-ot is használtunk.
Foszforilált/nem foszforilált peptidekkel folytatott tesztekben a peptideket kovalensen DNA-BIND-ELISA lemezekhez (Costar) kötöttük, és a hibridóma-felülúszókat ELISA-eljárással szűrtük.
Azokat a felülúszókat, melyek a foszfopeptidet azonosítani tudták, megvizsgáltuk, hogy képesek-e a teljesen foszforilált, E. coli-rendszerben előállított, rekombináns VASP és a megfelelő defoszforilált VASP között különbséget tenni.
A fent említett eljárásban pozitívnak talált hibridómasejtek felülúszójából azonosított monoklonális an7
HU 222 41 IBI titesteket, előnyösen tiofiladszorpciós kromatográfiával (POROS 50-OH, nanoTools) szérummentes hibridóma-felülúszóból lehet tisztítani.
Különböző teszteljárásokkal sikerült azonosítani és karakterizálni az egyik izolált antitestet (16C2 klón), mint olyan, az IgGlK osztályba tartozó monoklonális antitestet, mely csak akkor ismeri fel a VASP-ot, ha e fehérje a 239-es szerinje foszforilálva van. Az alkalmazott körülmények mellett, a 16C2 antitest más fehérjét és más VASP-foszforilációs helyet nem ismer fel.
Az olyan monoklonális antitesteket, melyek specifikusan felismerik a foszfoszerin 157 VASP-ot vagy a foszfotreonin 278 VASP-ot, kifejleszthetek a fent említett eljárás analógiájára. Ez esetben antigénként a VASP 157-es szerinje vagy 278-as treoninja környékén található ismert peptidszakaszt tartalmazó, foszforilált peptideket alkalmazunk.
A 239-es helyen foszforilált VASP-ot felismerő monoklonális antitestek előállítását Smolenski és munkatársai közleményükben [J. Bioi. Chem. 237, 20029-20035 (1998)] is leírták.
2. példa
A VASP 239-es szentije foszforilációjának áramlási citometriás vizsgálata
A VASP 239-es szerinje foszforilációjának vizsgálata mosott emberi trombocitában
Eigenthaler és munkatársai által leírtak [Eur. J. Biochem., 205, 471-481 (1992)] szerint emberi trombocitákat preparáltunk, illetve a VASP foszforilációját a keringési rendszerre ható anyagokkal serkentettük. A reakciót formaldehiddel (végkoncentráció körülbelül 3,5%) történt rögzítéssel (10 perc, szobahőmérsékleten) állítottuk le. A választható mosást követően a sejteket Triton X-100-zal permeabilizáltuk, majd mostuk. A festést a megfelelő antitesttel (amely vagy közvetlenül volt fluoreszcens jelzéssel ellátva, vagy pedig egy szekunder antitestet láttunk el fluoreszcens jelzéssel) történt inkubálással végeztük. E célra a primer antitest koncentrációja célszerűen 0,5-5 pg/ml, előnyösen 1-2 pg/ml. Például, a Mab 16C2 primer antitestet 1,7 pg/ml koncentrációban használjuk. A 16C2 antitest kötődését azután, például G. Otten és W. M. Yokohama [Flow cytometry analysis using the Becton Dickinson FACScan. Current protocols in immunology, 5.4.1-5.4.19 (1992)] által leírtak szerinti eljárással, áramlási citométerben meghatározzuk és tanulmányozzuk.
3. példa
A Western-blot használata a VASP 239-es szerinje foszforilációjának meghatározásában, sejtkivonatokban
Sejtkivonatokban a VASP foszforilációjának meghatározására az áramlási citometriás mérésekkel (2. példa) párhuzamosan a szakember számára ismert, például Eigenthaler és munkatársai [Eur. J. Biochem., 205, 471-481 (1992)] által leírt, Westem-blot-eljárást alkalmazzák. Az alkalmazott antitestkoncentráció, a mintában meghatározandó VASP-tartalom függvényében, célszerűen 0,1 és 5 pg/ml, előnyösen 0,5-1,0 pg/ml közötti. Például amíg humán, illetve patkánytrombociták vizsgálatára előnyös a 0,5 pg/ml koncentráció, addig humán köldökzsinórból származó endotheliumsejtek vizsgálatára az 1,0 pg/ml antitestkoncentráció az előnyös. Elvben, a VASP 239-es szerinje foszforilációjának meghatározásakor a sejtkivonatokkal végzett Westem-blot-vizsgálat és a rögzített sejtekkel történt áramlási citometriás analízis azonos eredménnyel végződött.
4. példa
VASP 239-es szerinje foszforilációjának meghatározása teljes vérmintában vagy trombocitában gazdag plazmában (PRP)
Teljes vérmintát, illetve PRP-t keringési rendszerre ható anyagokkal inkubáltuk. A reakciót formaldehiddel (végkoncentráció körülbelül 3,5%) történt rögzítéssel (10 perc, szobahőmérsékleten) állítottuk le. A PRP-t teljes vérből, Eigenthaler és munkatársai [Eur. J. Biochem., 205, 471-481 (1992)] által leírtak szerint állítottuk elő. A PRP-ból a trombocitákat centrifugálással ülepítettük le, majd fiziológiás pufferben felszuszpendáltuk [Eigenthaler és munkatársai, (1992) lásd fent]. A trombocitákat permeabilizáltuk, majd a mosott trombocitáknál leírtak szerint festettük.
5. példa
Mosott emberi trombocitákban a VASP 239-es szerinje foszforilációjának időfüggése nitroprusszid-nátriummal (SNP) történt serkentést követően
Emberi trombocitákat kezeltünk 100 μΜ SNP-mal. A sejtekből mintát vettünk 0., 1., 3. és 5. percben. A VASP 239-es szerinje foszforilációjának meghatározásához a 16C2-es antitestet használtuk. A méréseket egyrészt gyűjtött sejtkivonatokból Westem-blot-analízissel, másrészt ezzel párhuzamosan, a fent említettek szerint rögzített és permeabilizált emberi trombocitákon, áramlási citometriás eljárással végeztük. A Westem-blot-eljárás során kapott autoradiogramokat NIH gel-blotting image 1.6 szoftverrel mennyiségi szempontból elemeztük. Az 16C2 antitest és a foszfoszerin 239 VASP kötődésének növekedését [%-ban kifejezett növekedés (5 min érték=maximális hatás=100%)] az
1. táblázat tartalmazza.
1. táblázat
t(min) %-os növekedés
trombocitán sejtkivonaton
citomctria Westem-blot
0. 0 0
1. 62,5 83,5
3. 89,3 95,2
5. 100,0 100,0
HU 222 411 Bl
6. példa
A 16C2 antitest felhasználása a rekombináns VASP c-AMP-fuggőproteinkinázok és a c-GMP-függőproteinkinázok által végzett foszforilációjának analízisére pg/ml tisztított, rekombináns, hexahisztidinnel jelzett VASP-ot 11 pg/ml cAMP proteinkináz tisztított katalitikus alegységével (cAPK), illetve 24 pg/ml tisztított cGMP proteinkinázzal (cGPK) foszforiláltuk. A reakcióelegyből meghatározott időpontokban mintát vettünk, SDS-t tartalmazó stopoldattal azonnal összekevertük, felforraltuk és SDS-PAGE-sel frakcionáltuk A VASP foszforilációját Coomassie Blue-val történt festéssel és Westem-blottal analizáltuk. A Westem-blothoz M4 poliklonális VASP-antitestet [Halbrüge M. és munkatársai, J. Bioi. Chem. 265, 3088-3093 (1990)] (beszerezhető az Alexis Corporationtöl, Alté Hauensteinstrasse 4, CH-4448 Láufelfingen, Svájc), illetve 16C2 monoklonális VASP-antitestet használtunk. A Coomassie Blue-val festett gélben a VASP alatti sáv a cAPK, míg a VASP fölötti sáv a cGMP-PK. Az SDS-PAGE-vizsgálat kimutatta, hogy a cAPK által előnyben részesített 157-es szerin foszforilációját követően, a VASP migrációjában változás (46 kDA-ról 50 kDA-ra) következett be. Foszforilálás során a cGMP-PK előnyben részesíti a 239-es szerin aminosavat (amit a 16C2 antitesttel lehet kimutatni).
7. példa
A foszforiláciő analízise különbözőfoszforilációs mutációkat tartalmazó VASP-pal transzfektált Ptk2 sejtekben
Transzfektált humán VASP és VASP-mutánsok foszforilációját vizsgáltuk Ptk2 sejtekben. Vad típusú és mutáns (inaktivált) foszforilációs helyeket (módosított 157-es szerin, 238-as szerin, illetve 277-es treonin) tartalmazó VASP-pal és a CMV promoter szabályozásával kifejezett emberi cGMP proteinkináz Ιβ-val együtt Ptk2 sejteket transzfektáltunk. A Ptk2 sejtek igen kevés belső eredetű, kötött VASP-ot és cGMP proteinkinázt tartalmaznak. A transzfekciót követő 2 nap múlva a sejteket 30 percig 30 μΜ 8pCPT-cGMP-vel inkubáltuk és elkülönítettük a sejtkivonatokat. Ezután a sejtkivonatokban a VASP foszforilációját vizsgáltuk Westem-blottal. A Westem-blothoz M4 poliklonális és 16C2 monoklonális antitesteket használtunk. A 157-es szerin inaktiválása (SÍ 57A mutáció) esetén a 46kDAról 50 kDA-ra történő, foszforilációfüggő változás nem volt jelen. A 16C2 antitest által felismert jel a 239-es szerin inaktiválását (S239A) követően nem volt jelen. E vizsgálatok során a 277-es treonin mutánsai vad típusú VASP-ként viselkedtek.
8. példa
A VASP foszforilációjának analízise különböző értágítókkal és cAMP/cGMP analógokkal történt serkentést követően emberi trombocitákban
Mosott humán trombocitákat (0,7 χ 109 sejt/ml) 1 μΜ Pg-I2-vel (prostaciklin), 0,5 mM 5,6-DCIcBIMPS-sel (sejtmembránon átjutni képes cAMP-analóg), 10 μΜ SNP-mal (nitroprusszid-nátrium) vagy 1 mM 8pCPTcGMP-vel (sejtmembránon átjutni képes cGMP-analóg) inkubáltunk. Adott időpontokban mintákat (2,8 χ 107 sejt) vettünk. Az SDS stopoldattal összekevert és felforralt mintákban Westem-blot-eljárással a VASP foszforilációját vizsgáltuk. A vizsgálatban M4 poliklonális és 16C2 monoklonális antitesteket használtunk. A 157-es szerin foszforilációjának mennyiségi értékelése a VASP-ot tartalmazó sáv 46 kDA-ról 50 kDA-ra tolódásával, míg a 239-es szerin foszforilációjának mennyiségi értékelése a 16C2 antitest által adott jelzés segítségével történt.
9. példa
A VASPfoszforilációja patkánytrombocitákban
Patkánytrombocitákat (0,7 xlO8 9 sejt/ml) 100 μΜ SNP-mal (nitroprusszid-nátrium) vagy 10 μΜ prostaglandin El-gyel (PGE1), illetve ezek nélkül 5 percig inkubáltunk. E trombociták kivonatait Westem-blottal analizáltuk. A biot kimutatta, hogy a VASP sáv 46kDA-ról 50 kDA-ra történő, foszforilációfüggő (157-es szerin foszforilációja) eltolódása és a 16C2 antitest által adott jel a patkánytrombocitákban szintén jelen van. Egértrombociták használatakor hasonló eredményt kaptunk.
10. példa
Humán trombocitákon végzett immunfluoreszcens VASP- ésfoszfo-VASP-vizsgálatok
Humán trombocitákat (trombocitában gazdag plazma, PRP) üveg mikroszkóplemezre helyeztünk, és 45 percig kötődni és szélesztődni hagytuk. Az üveglemezen levő trombocitákat 15 percig inkubáltuk 100 μΜ 8pCPTcGMP hiányában (A és C), illetve jelenlétében (B és D). A sejteket ezután 4%-os paraformaldehiddel rögzítettük és 0,2% Triton Χ-100-zal permeabilizáltuk. A lemezeket előbb M4 poliklonális antitesttel (1:1000) vagy 16C2 monoklonális antitesttel, majd a szokásos második antitesttel inkubáltuk. A fényképeken látható a 16C2 antitest használatakor tapasztalható foszforilációfüggő szignál megjelenése. Az M4 antitesttel kapható jel (az immunfluoreszcenciás vizsgálatok során, mivel nincs elválasztás, a 46 kDA és az 50 kDA összegződik) a foszforilációtól független.

Claims (12)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. VASP elleni antitest vagy annak ffagmense, amely a VASP-ot antigénként csak abban az esetben köti, ha a VASP foszforilálva van a 157-es szerin aminosavon, azaz 157-es foszfoszerint tartalmazó VASP.
  2. 2. Az 1. igénypont szerint meghatározott antitest vagy antitestfragmens in vitro történő alkalmazása diagnosztikai anyagként.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás 157-es foszfoszerint tartalmazó VASP minőségi vagy mennyiségi meghatározására biológiai mintában.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a biológiai mintát emberi trombociták vagy teljes vér alkotják.
  5. 5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a 157-es foszfoszerin meghatározása Westem-blotmódszerrel történik.
    HU 222 41 IBI
  6. 6. A 3. vagy 4. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a 157-es foszfoszerin meghatározása áramlási citometriával történik.
  7. 7. A 2-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás biológiai mintában cGMP- és/vagy cAMP-szintjét 5 befolyásoló anyagok kimutatására.
  8. 8. A 2-6. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás endothelialis faktorok in vivő aktivitásának meghatározására.
  9. 9. A 2-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalma- 10 zás endothelium hibás működésének kimutatására.
  10. 10. Hibridóma-sejtvonal, amely az 1. igénypont szerinti meghatározott antitestet termel.
  11. 11. Az 1. igénypont szerint meghatározott antitestet vagy antitestfragmenst tartalmazó diagnosztikai reagenskészlet.
  12. 12. In vitro diagnosztikai eljárás, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerint meghatározott antitestet vagy antitestfragmenst alkalmazzuk VASP 157-es foszfoszerinje foszforilációs állapotának és/vagy VASP fehéqekölcsönhatásainak meghatározására vagy befolyásolására biológiai anyagban.
HU0004099A 1997-11-07 1998-11-06 Foszforilált VASP elleni antitestek, hibridóma sejtek előállításukra és az antitestek alkalmazása HU222411B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19749091A DE19749091C1 (de) 1997-11-07 1997-11-07 Antikörper gegen phosphoryliertes VASP (Vasodilator-Stimuliertes Phosphoprotein), Hybridomzellen zu dessen Herstellung sowie dessen Anwendung
US7937598P 1998-03-26 1998-03-26
PCT/EP1998/007103 WO1999024473A1 (en) 1997-11-07 1998-11-06 Antibodies against phosphorylated vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0004099A1 HUP0004099A1 (en) 2001-03-28
HUP0004099A3 HUP0004099A3 (en) 2002-01-28
HU222411B1 true HU222411B1 (hu) 2003-06-28

Family

ID=26041380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0004099A HU222411B1 (hu) 1997-11-07 1998-11-06 Foszforilált VASP elleni antitestek, hibridóma sejtek előállításukra és az antitestek alkalmazása

Country Status (16)

Country Link
US (2) US6649421B1 (hu)
EP (1) EP1042368B1 (hu)
JP (1) JP5031140B2 (hu)
KR (1) KR100513418B1 (hu)
CN (1) CN1188426C (hu)
AT (1) ATE248189T1 (hu)
AU (1) AU753557B2 (hu)
BR (1) BR9813988A (hu)
CA (1) CA2308604C (hu)
CZ (1) CZ299889B6 (hu)
ES (1) ES2205593T3 (hu)
HU (1) HU222411B1 (hu)
PL (1) PL195985B1 (hu)
RU (1) RU2218178C2 (hu)
TR (1) TR200001265T2 (hu)
WO (1) WO1999024473A1 (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10029210A1 (de) * 2000-06-14 2002-01-31 Vasopharm Biotech Gmbh & Co Kg Testsystem sowie dessen Verwendung
US6951947B2 (en) * 2000-07-13 2005-10-04 The Scripps Research Institute Labeled peptides, proteins and antibodies and processes and intermediates useful for their preparation
US7176037B2 (en) * 2000-07-13 2007-02-13 The Scripps Research Institute Labeled peptides, proteins and antibodies and processes and intermediates useful for their preparation
EP1182263A1 (en) * 2000-08-11 2002-02-27 Evotec OAI AG Process for detecting threonine/serine kinase activity
US20030162230A1 (en) 2000-09-27 2003-08-28 Reagan Kevin J. Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
JP4055579B2 (ja) * 2000-12-13 2008-03-05 大正製薬株式会社 新規抗体
WO2005088308A2 (en) * 2004-03-12 2005-09-22 The Scripps Research Institute Fluorescent signal emitting live cell biosensor molecules and dyes for detection and quantification of protein activities
CN103102411A (zh) * 2009-06-11 2013-05-15 北京华大蛋白质研发中心有限公司 一种制备针对糖基化修饰蛋白质的单克隆抗体杂交瘤的方法
FR2946756A1 (fr) 2009-06-12 2010-12-17 Biocytex Dosage en sang total d'un biomarqueur intracellulaire appartenant a une voie de signalisation cellulaire- utilisation pour mesurer l'activation d'une population cellulaire determinee
US11149064B2 (en) 2016-09-07 2021-10-19 Vanderbilt University Vasoactive polypeptides for smooth muscle relaxation
CN112730826A (zh) * 2020-12-23 2021-04-30 中南大学湘雅三医院 一种人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其检测方法和应用
CN113238062B (zh) * 2021-07-13 2021-09-28 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 一种用于人磷酸化血管扩张刺激磷蛋白光激化学发光均相免疫检测试剂盒及其检测方法
CN114002440B (zh) * 2021-12-30 2022-04-01 湖南菲思特精准医疗科技有限公司 一种用于人磷酸化血管扩张刺激蛋白的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993021230A1 (en) 1992-04-10 1993-10-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Activation-state-specific phosphoprotein immunodetection

Also Published As

Publication number Publication date
RU2218178C2 (ru) 2003-12-10
CZ20001684A3 (cs) 2000-11-15
ES2205593T3 (es) 2004-05-01
PL340465A1 (en) 2001-02-12
KR100513418B1 (ko) 2005-09-09
AU753557B2 (en) 2002-10-24
EP1042368A1 (en) 2000-10-11
JP2001522865A (ja) 2001-11-20
PL195985B1 (pl) 2007-11-30
US20040063914A1 (en) 2004-04-01
US6649421B1 (en) 2003-11-18
EP1042368B1 (en) 2003-08-27
CZ299889B6 (cs) 2008-12-29
JP5031140B2 (ja) 2012-09-19
TR200001265T2 (tr) 2000-09-21
CN1188426C (zh) 2005-02-09
AU1871299A (en) 1999-05-31
CN1279691A (zh) 2001-01-10
ATE248189T1 (de) 2003-09-15
CA2308604C (en) 2009-12-15
KR20010031830A (ko) 2001-04-16
BR9813988A (pt) 2000-09-26
HUP0004099A3 (en) 2002-01-28
WO1999024473A1 (en) 1999-05-20
HUP0004099A1 (en) 2001-03-28
CA2308604A1 (en) 1999-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7264939B2 (en) Method of detecting native proBNP
US7728115B2 (en) Compositions and methods useful for the diagnosis and treatment of heparin induced thrombocytopenia/thrombosis
US7459156B2 (en) Antibodies that mimic actions of neurotrophins
MXPA05007964A (es) Oligomeros ¦-(1,42) amiloides, derivados de los mismos y anticuerpos de estos, metodos para la preparacion de los mismos y el uso de los mismos.
HUE028331T2 (hu) N-11-csonkolt ß-amiloid elleni monoklonális ellenanyag, készítmény, eljárás és alkalmazás
JP2013078319A (ja) フォンビルブランド因子特異的切断酵素を主成分とする診断薬および医薬品
HU222411B1 (hu) Foszforilált VASP elleni antitestek, hibridóma sejtek előállításukra és az antitestek alkalmazása
JPH09507578A (ja) インスリン受容体チロシンキナーゼインヒビターに対するアンタゴニスト
US5582998A (en) Monoclonal antibodies against human TNF-binding protein I (TNF-BP I) and immunoassays therefor
DE69331585T2 (de) Monoklonaler antikörper spezifisch für das fk-506-bindende protein, methode zur bestimmung des gehaltes an fk-506-bindendem protein in einer probe und reagenzsatz dafür
US7822474B2 (en) Methods for the prediction of arrhythmias and prevention of sudden cardiac death
KR20070042994A (ko) 항시노비올린 항체
WO1999024835A2 (en) An immunoassay for procollagen-iii-c-terminal propeptide
EP1388543A2 (en) Antibodies against phosphorylated VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use
JPH04252954A (ja) タンパクの測定方法、試薬及びキット
US5516643A (en) Immunochemical assays for cancer-associated SCM-recognition factor
MXPA00004331A (en) Antibodies against phosphorylated vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridoma cells for their preparation, and their use
DE69817616T2 (de) Antikörper gegen vasp (vasodilator-stimulated phosphoprotein), hybridomzellen für deren gewinnung, und deren verwendung
US20030166568A1 (en) Organic compounds
KR900008014B1 (ko) 펩타이드 항체의 제조방법
JPH08313524A (ja) トロンビンレセプター発現量または活性化量の測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20030512

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees