CN1279691A - 抗磷酸化vasp(血管舒张剂刺激磷蛋白)的抗体,用于它们的制备的杂交瘤细胞和它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及当VASP(血管舒张剂刺激磷蛋白)以磷酸化形式存在时,只结合作为抗原的VASP的抗VASP的抗体,涉及用于它们的制备的杂交瘤细胞,并且涉及抗体或抗体片段作为诊断剂和/或治疗剂的用途。

Description

抗磷酸化VASP(血管舒张剂刺激磷蛋白)的抗体， 用于它们的制备的杂交瘤细胞和它们的用途
本发明涉及当VASP以磷酸化形式存在时只结合作为抗原的VASP的抗VASP(血管舒张剂刺激磷蛋白)的抗体，用于它们的制备的杂交瘤细胞，和抗体或抗体片段作为诊断剂和／或治疗剂的用途。
血管系统的疾病是许多慢性的和威胁生命的疾病，如心肌梗塞，中风，动脉阻塞疾病和许多形式的肾衰竭。
对于除了别的以外，控制血液凝固系统，血小板的功能状态，炎症和肿瘤细胞迁移进入血管壁，平滑肌细胞的收缩和生长状态，和随后的血压和血管壁结构和新血管形成的内皮细胞对于调节血管系统是特别重要的。这些血管壁功能中有许多在严重的血管疾病中失调，即，一种最后会导致慢性梗塞，中风和许多形式的肾衰竭的情况。
内皮形成了也被称为内皮细胞舒血管因子(EDRF)的重要物质前列环素(PGI2)和一氧化氮(NO)，这些物质抑制血小板和血管肌肉细胞。所述的内皮因子如前列环素(PGI2)或EDRF，如NO控制了内皮的功能。
因此，为了以特异的方法治疗与内皮功能异常相关的疾病，必须开发使内皮功能异常得到诊断和使其病程得到控制的生化参数。
令人满意的是能够尽早识别内皮功能异常，在此阶段由内皮功能异常引起的不可逆的损伤如动脉粥样损害还尚未发生。
在早期阶段内皮功能异常的鉴定使得开发可以导致可逆地治疗内皮功能异常的新治疗途径成为可能。
已知用于确定体内内皮功能的方法是侵入性检测方法如定量的血管造影术，或非侵入性的提供图象的方法。这些方法的缺点是直接对病人进行这些研究，难于定量和非常昂贵。
所以，使通过实验室的常规研究，在来自体内的生物材料，例如在细胞样品或血液样品中快速和简单地确定内皮功能成为可能的有效的生化／免疫生物学方法也是令人满意的。
内皮功能是那些可以由内皮因子如前列环素(PGI2)或EDRF，如NO调节的功能。
本发明的目的是提供评估和调节内皮功能的药剂。根据本发明的这一和其它目的，提供了涉及VASP(血管舒张剂刺激磷蛋白)和仅当VASP磷酸化时结合VASP的抗体。
在本发明的一个方面，公开了仅当VASP在239丝氨酸位置磷酸化(磷酸丝氨酸239VASP)时结合VASP的抗体。在另一方面，提供了仅当VASP在157丝氨酸位置磷酸化(磷酸丝氨酸157VASP)时结合VASP的抗体。
本发明的不同实施方案包括多克隆抗体，单克隆抗体和抗体片段。其它实施方案包括杂交瘤细胞系16C2，特别是Mab 16C2产生的单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供可用于制造本发明的抗体的杂交瘤细胞。本发明的这一目的另外也提供了生产仅当VASP磷酸化时结合VASP的抗VASP的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。在一个实施方案中，提供了杂交瘤细胞系16C2(DSM ACC2330)。
本发明的再一个目的是提供评估内皮功能的方法。根据本发明的这一目的，提供了确定VASP的磷酸化状态的方法。在本发明的一个方面，使生物材料与只当VASP磷酸化时结合作为抗原的VASP的抗VASP(血管舒张剂刺激磷蛋白)的抗体接触。
在本发明的另一方面，提供进一步包括定量测定结合生物材料的VASP抗体的量的定量方法。具体的实施方案包括Western印迹方法，该方法需要通过电泳分辨VASP并且使VASP与只当VASP磷酸化时结合VASP的抗VASP的抗体接触。另一个实施方案是流式细胞术方法，包括使样品与只当VASP磷酸化时结合VASP的抗VASP抗体接触。
在本发明的再一个方面，提供了诊断的方法。代表性的方法需要使样品与只当VASP磷酸化时结合VASP的抗VASP抗体接触，并且评估VASP的磷酸化状态。在一个实施方案中，这一方法包括定量确定样品中VASP的磷酸化。在另一个实施方案中，叙述的方法中抗体结合磷酸丝氨酸239VASP或磷酸丝氨酸157VASP。在再一个实施方案中，样品是人血小板或人全血。
本发明的另一个目的是提供检测内皮功能的标记的方法。在一个方面，提供了检测影响cGMP和／或cAMP的水平的物质的方法，包括测试来自已经与影响cGMP和／或cAMP水平的物质接触的病人的样品，使样品与只当VASP磷酸化时结合VASP的抗VASP的抗体接触，并且评估相对于对照样品的VASP的磷酸化状态。
在另外一个方面中，详细叙述了检测内皮功能异常的方法，包括将来自病人的样品与只当VASP磷酸化时结合VASP的抗VASP的抗体接触，并且评估相对于正常对照样品的VASP的磷酸化状态。
本发明的另一目的是提供完成本文公开的诊断方法的方便剂盒。另外，这一目的也是提供含有只当VASP磷酸化时结合VASP的抗VASP的抗体的诊断剂盒。
本发明的再一个目的是提供治疗患有内皮功能异常的病人的方法。根据本发明的这一和其它治疗目的，公开了治疗的方法，其中给需要治疗的病人施用治疗有效量的只当VASP磷酸化时结合VASP的抗VASP的抗体。
最近从分子遗传学的观点出发发现，分离和鉴定了应答低血压(血管舒张)激素和药物的血小板和血管壁细胞中磷酸化的人VASP(血管舒张剂刺激磷蛋白)(Haffner等人，EMBO J．14，19-27，1995)。
VASP是ANF／NO／cGMP／cGMP蛋白激酶信号途径的重要成分，该成分在生理学，病理学和药理学上非常重要，VASP同时也是cAMP／cAMP蛋白激酶信号途径的重要成分(U．Walter，Blick 1／97 Wurzburg大学，79-81，1997)。在差不多所有的人和动物细胞中都表达VASP，在血小板，血管平滑肌细胞和成纤维细胞中发现浓度特别高。在培养的细胞中，VASP与粘着斑(细胞／基质接触位点)，细胞／细胞接触，微丝和动态膜区域(例如前沿)相关(Walter等人，剂和作用45S，255，268，1995)。
在血管系统中VASP的磷酸化与血小板粘连／凝聚的抑制，平滑肌收缩／迁移的抑制和旁细胞内皮渗透性的抑制相关。
在三个不同位点(丝氨酸157，丝氨酸239和苏氨酸278，参见Horstrup等人，欧洲生物化学杂志，225，21-27(1994))磷酸化和去磷酸化VASP。特别是当VASP的第一个甲硫氨酸不计数在内时，丝氨酸239偶然也被称为丝氨酸238。
VASP丝氨酸239是在完整的人血管细胞(血小板，内皮细胞和平滑肌细胞)中磷酸化的以应答生理和药理NO供体和血小板抑制剂和血管舒张剂。
特别是由cGMP，重要的激素如利尿钠肽或NO释放物质和药物活化的依赖cGMP的蛋白激酶可介导VASP丝氨酸239的磷酸化。另外通过增加cAMP的激素和药物活化的依赖cAMP的蛋白激酶也可介导VASP丝氨酸239的磷酸化。
尽管依赖cAMP的蛋白质激酶主要磷酸化157位置的丝氨酸，但它们也磷酸化VASP的丝氨酸239位置。同时已经观察到在丝氨酸157位置VASP的磷酸化与在人血液血小板中纤维蛋白原与糖蛋白Ⅱb-Ⅲa的结合的抑制紧密相关(Horstrup等人，欧洲生物化学杂志225，21-27(1994))。
VASP在生物材料例如在组织和细胞的提取物中磷酸化的程度的确定，特别是VASP在位置239和／或位置157的磷酸化的确定将是重要的生物化学参数，该参数的测定将使开发检测所有增加cGMP和／或增加cAMP的激素或药物，如心钠素(ANF)，鸟苷蛋白，NO释放物质和药物的诊断系统成为可能，另外也能够得出关于体内内皮功能的结论。
在US 5，599，681，WO93／21230和U．Walter，Blick 1／97 Wurzburg大学，79-81，1997已经叙述了特异地结合可逆磷酸化蛋白质的抗体。
本发明的目的是开发能够以快速简单的方法定性和／或定量地确定生物材料中VASP的磷酸化状态的生物化学／免疫生物学方法。
这一目的是通过提供当VASP以磷酸化形式存在时，只结合作为抗原的VASP的抗体达到的。
因此，本发明非常全面地论述了当VASP以磷酸化形式存在时只结合作为抗原的VASP的抗体。
在本发明的意义范围内，应当将抗体理解为特异地识别VASP中的磷酸化区域的多克隆抗体和单克隆抗体(Mabs)和它们的片段，和SCFV片段或其它合成或重组蛋白质区域。
抗体的片段包括能够结合靶抗原的抗体的任何部分，在本案中是VASP或它的特异性部分。抗体片段具体包括F(ab’)2，Fab，Fab’和Fv片段。这些抗体片段可以从任何抗体类别产生，但通常是从IgG或IgM产生的。可以通过常规的DNA重组技术，或利用经典的方法，或通过用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化蛋白质制备它们。参见免疫学当前方法，第2章，Coligan等人编辑，(John Wiley  & Sons 1991-92)。
F(ab’)2片段通常约为110千道尔顿(IgG)或约为150千道尔顿(IgM)并且含有在铰合部由二硫键连接的两个抗原结合区。实际上在这些片段中缺乏实质上所有(即使并非所有)的Fc。Fab’片段通常约为55千道尔顿(IgG)或约为75千道尔顿(IdM)并且可以例如通过还原F(ab’)2片段的二硫键形成。得到的自由巯基基团可用于方便地使Fab’片段与其它分子如检测剂(例如酶)缀合。Fab片段是单价的并且通常约为50千道尔顿(来自任何来源)。Fab片段包括抗体的抗原结合部分的轻(L)和重(H)链，可变(分别是VL和VH)和恒定(分别是CL和CH)区。H和L部分是分子内二硫键连接的。
通常FV片段约为25千道尔顿(与来源无关)并且含有轻和重链(分别为VL和VH)的可变区。通常，VL和VH链只通过非共价相互作用连接在一起，所以它们容易分解。但是，它们确实具有尺寸小的优点，并且它们保留了与较大的Fab片段同样的结合特性。因此，开发了各种交联VL和VH链的方法，例如使用戊二醛(或其它化学交联物)，分子内二硫键(掺入半胱氨酸)和肽接头。得到的FV现在是单链(即，SCFv)。
一个优选的方法包括通过重组的方法生产SCFVS，该方法允许通过混合和匹配来自不同抗体来源的可变链生产具有新特异性的FVS。在典型的方法中，将提供含有驱动盒区的表达的适当的调节元件的重组载体。盒区将含有编码肽接头的DNA，便于生成融合蛋白的位点在接头的5’和3’末端。在载体中可以克隆编码需要的可变区的DNA，以便形成具有接头的融合蛋白，从而生成SCFV。
在作例证的替代方法中，编码两个FVS的DNA可以连接到编码接头的DNA上，并且得到的三部分融合物可以直接连接成常规表达载体。根据选择的载体，可以在原核或真核细胞中表达这些方法产生的SCFV DNA。
优选的是当VASP以磷酸化形式存在时只结合作为抗原的VASP的单克隆抗体和它们的片段。
另外，特别优选的是当239位置的丝氨酸被磷酸化(磷酸丝氨酸239VASP)时，只结合作为抗原的VASP或在VASP的丝氨酸239周围包括肽序列的单克隆抗体和它们的片段。
在本发明的意义范围内，应当将术语VASP也理解为VASP的衍生物，即VASP的功能等同成分，突变体，片段或变异体，例如另外在丝氨酸157位置和／或苏氨酸278位置磷酸化的磷酸丝氨酸239VASP，和同样例如糖基化突变体和其它共价修饰，和蛋白质／蛋白质相互作用的重要结构元件。在本发明的意义范围内，术语VASP包括人VASP和来自其它物种的VASP，特别是来自哺乳动物，如大鼠，小鼠，兔，狗，猪或猴子的VASP。
通过常规方法，例如根据Kohler和Milstein叙述的技术可以生产抗体(Kohler和Milstein，自然256，495，1975)。通常，需要基于磷酸化状态的选择性时，产生针对VASP的磷酸化形式的抗体。利用常规方法可以筛选分离的抗体以便确定选择性。优选地，产生针对含有丝氨酸157，丝氨酸239和／或苏氨酸278的VASP的肽片段的抗体。
抗原VASP肽的长度并不重要，只要它能够引发体液应答。典型的抗原肽小于约50个氨基酸长。一些优选的肽长度小于约20个氨基酸。最优选的肽的长度在约6至约12个氨基酸之间。优选的肽包括KLRKVS239KQ或RKVS239KQE。肽优选地在丝氨酸157，丝氨酸239和／或苏氨酸278磷酸化。通过重组方法可以获得肽。通常，通过VASP的蛋白质降解或体外合成和磷酸化可以生产它们。
另外，优选的是显示上面提到的特性，可以用于流式细胞术的单克隆抗体。这需要新抗体的特异性甚至当抗原处于如习惯上用于流式细胞术的固定步骤中预期的可以改变抗原构象的条件下时仍得以保持。简单地通过测试它们，可以例如检测新抗体对用于流式细胞术的适宜性。
单克隆抗体16C2是特别优选的。
利用本领域技术人员已知的方法可以制备新抗体。对于制备单克隆抗体可以特别提到利用Kohler和Milstein叙述的技术制备杂交瘤细胞(Kohler和Milstein，自然，256，495，1975)。例如利用下面的测试方法可以检测纯化的抗体的特异性：
a)利用由依赖cAMP或依赖cGMP的蛋白激酶在不同程度上磷酸化的重组VASP的Western印迹，与此相关只可能利用磷酸化VASP观察阳性信号。
b)利用细胞，例如Ptk2细胞的提取物的Western印迹，这些细胞已经用人VASP或用已经以不同方式发生突变的VASP转染。并且其中在每种情况下三个磷酸化位点之一已经突变，因此被删除((S157A)VASP，(S239A)VASP和(T278A)VASP和在每种情况下都使用的人cGMP蛋白激酶。这些抗体是适合的，其中通过S239A突变而不是其它两个突变消除了Western印迹中的阳性信号。
c)利用已经用不同的血管舒张剂(例如前列环素或NO供体)或cAMP蛋白激酶或cGMP蛋白激酶的活化剂处理的人血小板的Western印迹。所以当在只含有磷酸化的VASP的提取物中检测特异的带时抗体适合的。也可以利用人成纤维细胞以及大鼠和小鼠血小板以类似的方法筛选抗体。
d)利用固定的人血小板和内皮细胞的免疫荧光研究。当VASP作为磷蛋白存在时观察到阳性信号。
本发明另外涉及了生产新的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，生产单克隆抗体16C2的杂交瘤细胞系16C2是特别优选的。
根据布达佩斯条约，在1997年11月6日，以下面的号：DSMACC2330，已经将生产单克隆抗体16C2的杂交瘤细胞系16C2保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(德国微生物和细胞培养物保藏中心)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德国。
新抗体适用于定性和／或定量，优选地定量确定发生在体外条件下和发生在体内条件下的VASP的磷酸化，优选地确定VASP的丝氨酸239和／或丝氨酸157的磷酸化，特别优选地确定VASP的丝氨酸239的磷酸化。
利用抗体的定量方法是本领域已知的，并且可以例如在免疫学当前方法，出处同上中找到。这些方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIAs)和诸如此类。
新抗体还适用于定性和／或定量，优选地定量确定生物材料中的磷酸化的VASP，优选地磷酸丝氨酸239VASP和／或磷酸丝氨酸157VASP，特别优选地磷酸丝氨酸239VASP。
生物材料例如可以理解为：细胞提取物，组织提取物，细胞切片，细胞组织和细胞如血小板，白细胞，内皮细胞，平滑肌细胞和成纤维细胞。生物材料可以从人或其它哺乳动物如大鼠，小鼠，兔，狗，猪或猴子衍生。人起源的生物材料是优选的。
根据技术人员已知的方法，例如利用NIH凝胶印迹成象1．6软件，或通过免疫荧光，新抗体可以通过定量评估Western印迹的放射自显影，在生物材料中定量确定磷酸化的VASP，特别是磷酸丝氨酸157VASP和／或磷酸丝氨酸239VASP。
由于在VASP的丝氨酸239和丝氨酸157的磷酸化和依赖cGMP和／或依赖cAMP的蛋白激酶之间存在的相互关系，新抗体也适用于作为诊断cGMP信号途径和cAMP信号途径，特别是诊断cGMP信号途径的药剂。
利用Western印迹技术和免疫荧光新抗体在生物材料中确定磷酸丝氨酸239VASP的用途也使开发检测增加cGMP的物质，激素或药物的诊断方法成为可能。可以提到的例子有：ANF，鸟苷蛋白，NO释放物质或药物。例如，可以监测病程的控制和NO供体的治疗，它特别提供了可能发展的任何硝酸盐耐性现象的信息。
由于VASP的丝氨酸157的磷酸化和依赖cAMP的蛋白激酶的活性之间存在的相互关系，新抗体也可以用作诊断增加cAMP的物质，激素或药物的药剂。
因而，本发明也涉及在诊断和／或治疗中利用新抗体或其片段。
新的诊断方法是可以在实验室，人体外(来自体内)进行的方法。
新抗体可以用于确定在来源于不同物种的生物材料中VASP的磷酸化的程度。可以提到的例子有：人，大鼠，小鼠，兔，狗，猪或猴子。优选的是利用新抗体在来自人，大鼠，小鼠或狗的生物材料中确定磷酸化的VASP。特别优选的是利用新抗体确定人生物材料中磷酸化的VASP。
在生物传感器中也可以利用新抗体或其片段。生物传感器本身是技术人员已知的。特别优选的是利用第二个特异的结合伙伴，如抗体，凝集素或受体的方法。为了在这种情况下检测和定量，特异的结合伙伴之一可以携带可检测标记。这些标记本身是技术人员已知的，并且例如可以是发色团，发光团，荧光团，酶，放射性同位素，或有色或无色的颗粒。优选的是利用技术人员已知的方法，将未标记的，特异的结合伙伴通过另一抗体或生物素／抗生物素蛋白桥直接或间接与固体相偶联。
新抗体或它们的片段也可以用技术人员已知的方法进行放射性标记，以便它们可以用于免疫闪烁照相术或免疫治疗。另外，这些单克隆抗体可以用作活性化合物载体并且用于内皮功能异常引起的疾病的治疗。
在分析Mab 16C2的V基因的完整核苷酸序列后，通过例如在人Mab骨架中插入超变区生产抗体构建体在技术上是可能的(Jones等人，自然321，522-525，1986；Verhoyen等人，科学，239，1534-1536，1988)。
优选的是通过例如对已经利用技术人员已知的方法适当固定的全血样品进行的流式细胞术，在血液血小板中定量测定抗原结合抗体。流式细胞术是技术人员已知的方法，并且可以如在G．Otten和W．M．Yokoyama(1992)利用Becton Dickinsin FACScan的流式细胞术分析，免疫学当前方案，5．4．1-5．4．19中所述进行。
利用新抗体的VASP磷酸化，特别是VASP丝氨酸239磷酸化的流式细胞术的分析并不限制于人血小板，并且也可以对其它细胞类型如淋巴细胞，单核细胞，白细胞，内皮细胞和平滑肌细胞进行。
借助于新抗体，在新抽取的人血小板中利用流式细胞术确定VASP的磷酸化，特别是磷酸丝氨酸239VASP的磷酸化使在体外确定内皮因子如NO和前列环素的体内活性，并且因而评价如在动脉粥样硬化，高血压，糖尿病，心机能不全和肾机能不全中发现的在心血管病中的内皮功能或内皮功能异常成为可能。
借助于新抗体确定VASP磷酸化特别是VASP丝氨酸239磷酸化也使控制上面提到的疾病的治疗成为可能。也可以确定对治疗的抗性如硝酸盐耐性的发展。
新抗体也可以用作治疗剂，因为它们影响生物材料中VASP的磷酸化状态，和／或它与蛋白质的相互作用。
因而，本发明也涉及含有至少一种新抗体的药物制剂。
新制剂可以经肠地(口服)，不经肠地(静脉内)，直肠地或局部地(体表)利用。它们可以以溶液，粉末(片剂或包括微胶囊的胶囊)，脂质体制剂，脂复合物，胶体分散液，注射溶液或栓剂的形式给药。对于这一特性的配方，药物上常用的液体或固体填充剂和扩展剂，溶剂，乳化剂，滑移剂，矫味剂，染料和／或缓冲物质是适合的辅助物质。每公斤体重给药0．1-100毫克是有利的剂量。它们以至少含有例如30-3000毫克的新抗体的日有效量的剂量单位方便地给药。
将要给药的日剂量取决于哺乳动物治疗对象的体重，年龄，性别和状况。但是，也可能需要更高或更低的日剂量。日剂量可以以单个剂量单位的形式或几个更小剂量单位的形式一次给药，或以预定的时间间隔以分开的剂量形式分几次给药。
为了生产药物制剂，可以将新抗体加入治疗惰性的有机和无机赋形剂中。半乳糖，玉米淀粉或其衍生物，牛脂，硬脂酸或其盐是这种用于片剂，包衣片剂和硬明胶胶囊的赋形剂的例子。水，多元醇，蔗糖，转化糖和葡萄糖是用于制备溶液的适当的赋形剂。植物油和硬化油，石蜡，脂肪和半固体多元醇是用于栓剂的适当的赋形剂。药物制剂也可以含有防腐剂，溶剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，甜味剂，染料，调味剂，用于改变渗透压的盐，缓冲剂，包衣剂，抗氧化剂，和如果适当，其它治疗活性化合物。
本发明也涉及制备新药物的方法，其中将至少一种新抗体与药物上适当的和生理上耐受的赋形剂和如果适当，其它适当的活性化合物，添加剂或辅助物质一起制成适当的给药形式。
通常，本发明还涉及借助于其它特异的探针如多克隆抗体，SCFV片段特异地识别VASP，特别是磷酸丝氨酸239VASP中的磷酸化序列的其它合成或重组蛋白质区域，确定VASP的磷酸化，优选的是VASP的丝氨酸239磷酸化的诊断方法。
本发明另外也涉及借助于特异的探针如单克隆抗体，多克隆抗体，SCFV片段或特异地识别含有磷酸化丝氨酸157和／或苏氨酸278的VASP中的序列的其它合成或重组蛋白质区域，确定VASP的丝氨酸157磷酸化和／或苏氨酸278磷酸化的诊断方法。
通过结合富脯氨酸的肽如斑联蛋白和粘着斑蛋白，并且在同时将它本身的富脯氨酸的氨基酸区与抑制蛋白结合，VASP使形成丝状肌动蛋白成为可能，VASP的功能是衔接分子。这一蛋白质／蛋白质相互作用的扰乱可以导致有错误的血小板凝聚或血管收缩。所以，肌动蛋白／肌球蛋白桥的形成是平滑肌细胞收缩的先决条件。已经发现VASP在丝氨酸157位置的磷酸化与纤维蛋白原受体糖蛋白Ⅱb／Ⅲa的抑制作用相关(Horstrup等人，欧洲生物化学杂志，225，21-27，1994)。结果是，VASP在丝氨酸157位置的磷酸化的确定使系统地寻找影响VASP与它的细胞内结合伙伴的相互作用并且例如适用于与血管损伤相关的心血管疾病的治疗的物质或药物成为可能。
实施例中所描述的实施方案也是特别优选的。
下面的实施例的作用是澄清本发明并不以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1分离抗磷酸丝氨酸239VASP的单克隆抗体
根据技术人员熟悉的Fmoc化学利用Applied Biosystems肽合成仪(431A型)合成磷酸化肽和非磷酸化肽，其中每种肽都在丝氨酸239周围包括肽序列KLRKVS239KQ或RKVS239KQE。
利用来自Calbiochem的Fmoc-丝氨酸[PO(Obzl)OH-OH]在肽合成过程中掺入磷酸化肽中的磷酸丝氨酸。利用RPC和VYDAC 218TP柱纯化MS确认的肽(纯度＞98％)。
经过用溴乙酸或溴乙酸-N-羟基琥铂酰胺酯(西格玛)活化后，将以这种方法制备的肽与巯基化KLH(钥孔血蓝蛋白，nano Tools)缀合。在第一次注射中利用含有弗氏完全佐剂的KLH磷肽，在接着的3次注射中利用含有不完全佐剂的KLH磷肽(10微克／小鼠)，以14天的间隔皮下免疫雌性Balb／c小鼠(6周龄)4次。然后(2星期后)，连续3天给予小鼠10微克PBS(磷酸盐缓冲盐水)中的免疫原加强注射。在最后一次加强注射后1天，杀死小鼠，移取脾。利用确定的Kohler／Milstein方法分离脾细胞并与非生产性的骨髓瘤细胞融合(例如，PAI-Zellen，J．W．Stocker等人(1982)Res．Disclosure，21713)。
利用磷酸化／非磷酸化肽以及磷酸化／非磷酸化重组人VASP的差别筛选方法测试骨髓瘤细胞分泌抗磷酸丝氨酸239VASP抗体的能力。
对于利用磷酸化／非磷酸化肽的试验，将这些肽与DNA-BIND-ELISA平板(来自Costar)共价偶联并用ELISA方法筛选杂交瘤上清液。
另外检查可识别磷酸肽的上清液以测定它们识别完全磷酸化的重组(大肠杆菌系统)人VASP而非相应地去磷酸化的VASP的能力。
优选地可以通过亲硫吸附层析(POROS 50-OH，nano ToolS)从无血清杂交瘤细胞培养物中纯化通过上面叙述的方法已经鉴定为阳性的杂交瘤细胞的上清液中的单克隆抗体。
利用不同的试验方法，鉴定和表征分离的抗体之一(克隆16C2)为只当VASP在丝氨酸239位置磷酸化时识别这一蛋白质的小鼠IgGlk类的单克隆抗体是可能的。在所用的条件下抗体16C2不识别其它蛋白质和其它VASP磷酸化位点。
在类似于上面叙述的方法中，利用在VASP蛋白质的丝氨酸157或苏氨酸278的周围包括已知肽序列的磷酸化肽作为抗原可以分离磷酸丝氨酸157VASP或磷酸苏氨酸278VASP。
在Smolenski等人，生物化学杂志，237，32，20029-20035(1998)中也叙述了识别在丝氨酸239位置磷酸化的VASP的单克隆抗体的产生。
实施例2
VASP丝氨酸239磷酸化的流式细胞术分析
在洗涤的人血小板中分析VASP丝氨酸239磷酸化
如上所述制备人血小板，通过与血管活性物质一起温育刺激VASP磷酸化(Eigenthaler等人，欧洲生物化学杂志，205，471～481，1992)。用甲醛以约3．5％的终浓度，在室温下固定10分钟终止反应。在洗涤操作(选择性的)后，将细胞用Triton X-100进行渗透，然后洗涤。与直接荧光标记的或利用荧光标记的第二个抗体着色的适当抗体一起温育进行染色。对于这一目的，方便地，每毫升使用0．5-5微克，优选地1-2微克初级抗体。当将Mab16C2用作初级抗体时，例如，1．7微克／毫升是适合的。然后，在例如，在G．Otten和W．M．Yokoyama(1992)，利用Becton Dickinson FACScan的流式细胞术分析，免疫学的当前方法，5．4．1-5．4．19中所述，在流式细胞仪中确定和分析抗体16C2的结合。
实施例3
在细胞提取物中确定VASP丝氨酸239磷酸化的Western印迹的利用
与流式细胞术(实施例2)平行，通过技术人员熟悉并且例如在Eigenthaler等人(欧洲生物化学杂志，205，471-481，1992)中叙述的方法，利用Western印迹确定细胞提取物中VASP的磷酸化。根据待测定的样品的VASP的含量，所用的抗体浓度方使的是在0．1至5之间，优选地在0．5到1．0微克／毫升。例如，对于人血小板和大鼠血小板，利用0．5微克抗体／毫升是有利的，而对于人脐带内皮细胞，利用1．0微克抗体／毫升是有利的。原则上，通过Western印迹分析，在细胞提取物中和通过流式细胞术在固定的细胞上分析VASP丝氨酸239磷酸化产生了相同的结果。
实施例4
在全血或富血小板的血浆(PRP)中VASP丝氨酸239磷酸化的分析
将全血或PRP与血管活性物质一起温育，并且通过在室温下用甲醛约3．5％的终浓度固定10分钟终止温育。如在Eigenthaler等人(欧洲生物化学杂志，205，471-481，1992)中所述从全血制备PRP。通过离心沉淀PRP中的血小板并且在生理缓冲液中再悬浮(Eigenthaler等人，1992，参见上面)。将血小板渗透化，然后如上所述对洗涤的血小板进行染色。
实施例5
在用硝普酸钠(SNP)处理后，在洗涤的人血小板中刺激VASP丝氨酸239的磷酸化的时间进程
用100微摩尔SNP处理人血小板。在0，1，3和5分钟的时间抽取细胞样品。平行地通过Western印迹分析已经抽取的细胞样品的提取物，和通过对如上所述已经固定和渗透化的人血小板进行的流式细胞术测定利用抗体16C2确定VASP丝氨酸239的磷酸化。利用NIH凝胶印迹成象1．6软件定量分析Western印迹的放射自显影。在表1中记录了在抗体16C2／磷酸丝氨酸239 VASP的结合的增强(％增强(5分钟值=最大效果=100％)。表1时间(分钟)    ％增强    血小板    细胞提取物
                   细胞计量术  Western印迹0                         0            01                         62．5        83．53                         89．3        95．25                         100．0       100．0
实施例6
利用抗体16C2分析通过依赖cAMP的蛋白激酶或依赖cGMP的蛋白激酶的重组VASP的磷酸化
通过纯化的cAMP蛋白激酶(cAPK)的催化亚单位(11微克／毫升)或通过纯化的cGMP蛋白激酶(cGPK；24微克／毫升)磷酸化纯化的重组六组氨酸标记的VASP(25微克／毫升)。在给定的时间从反应混合物中移取等分试样，与含有SDS的终止溶液立即混合，煮沸，通过SDS-PAGE分级分离。通过考马斯蓝染色，和通过利用多克隆VASP抗体(M4，Halbrugge M．等人，生物化学杂志265，3088-3093(1990)，从Alexis公司，Alte Hauensteinstraβe 4，CH-4448Laufelfingen，瑞士得到)或单克隆VASP抗体16C2分析VASP的磷酸化。由于cAPK优选的丝氨酸157的磷酸化，进行的SDS-PAGE证实了VASP从46到50千道尔顿的迁移行为的变化。
实施例7
在Ptk2胞中，含有各种磷酸化突变的转染的VASP的磷酸化的分析
在Ptk2细胞中研究转染的人VASP和VASP突变体的磷酸化。将各自含有突变的(失活的)磷酸化位点(丝氨酸157，丝氨酸238或苏氨酸277的改变)的野生型VASP和VASP突变体与人cGMP蛋白激酶1β一起转染进入Ptk2细胞并且在CMV启动子的控制下表达。Ptk2细胞含有非常少的内源性VASP和cGMP蛋白激酶。转染后2天，将细胞与30微摩尔8pCPT-cGMP一起温育30分钟，然后分离细胞提取物。然后，利用多克隆抗体M4和单克隆抗体16C2在Western印迹中研究这些细胞提取物中的VASP的磷酸化。当丝氨酸157失活(突变S157A)时，从46千道尔顿到50千道尔顿的VASP的依赖磷酸化的变化不再存在。当丝氨酸239失活(S239A)时，抗体16C2所识别的信号不再存在。在这些分析中，苏氨酸277的突变行为象野生型VASP。
实施例8
在用各种血管舒张剂和cAMP／cGMP类似物刺激后，在人血小板中VASP的磷酸化的分析
将洗涤的人血小板(0．7×109细胞／毫升)与1微摩尔Pg-I2(前列环素)，0．5毫摩尔5，6-DCI-cBIMPS(细胞膜可渗透的cAMP类似物)，10微摩尔SNP(硝普酸钠)或1毫摩尔8pCPTcGMP(细胞膜可渗透的cGMP类似物)一起温育。在给定的时间后移取等分试样(2．8×107细胞)，与SDS终止溶液混合，并且煮沸，然后利用Western印迹方法研究VASP磷酸化。利用多克隆抗体M4或单克隆抗体16C2进行分析。通过46到50千道尔顿的VASP的移动定量测定丝氨酸157的磷酸化，而丝氨酸239的磷酸化是通过16C2抗体所发出的信号定量测定的。
实施例9
在大鼠血小板中VASP的磷酸化
将大鼠血小板(0．7×109细胞／毫升)与100微摩尔硝普酸钠(SNP)，以及10微摩尔前列腺素E1(PgE1)一起或没有这些物质加入时温育。通过Western印迹分析这些大鼠血小板的提取物。印迹证明在大鼠血小板中也发生了46千道尔顿到50千道尔顿的VASP的依赖磷酸化的移动(丝氨酸157的磷酸化)和16C2抗体所发出的依赖磷酸化的信号(丝氨酸239磷酸化)。用小鼠血小板也获得了相似的结果。
实施例10
对人血小板进行的VASP和磷酸VASP的免疫荧光研究
将人血小板(在富血小板的血浆，PRP中)沉积在载玻片上，并且允许附着和涂布45分钟。然后，在载玻片上在没有(A和C)或有100微摩尔8pCPTcGMP(B和D)的情况下温育这些血小板。然后，用4％低聚甲醛立即固定并且用0．2％曲通X-100渗透这些细胞。然后，将它们与多克隆抗体M4(1∶1000)或单克隆抗体16C2，接着常用的次级抗体一起温育。当利用16C2抗体时，照片显示出现依赖磷酸化的信号，而以多克隆M4抗体产生的信号(在免疫荧光中，因为没有分级分离，所以为46千道尔顿和50千道尔顿VASP之和)是不依赖于磷酸化的。

Claims (24)

1．当VASP以磷酸化形式存在时只结合作为抗原的VASP的抗VASP(刺激血管舒张素的磷蛋白)的抗体。
2．根据权利要求1所述的抗体，该抗体可以用于确定生物材料中VASP的磷酸化状态。
3．根据权利要求1和／或2所述的抗体，该抗体能够使VASP在生物材料中的磷酸化得到定量测定。
4．根据权利要求1-3的一个或多个所述的抗体，其中当VASP在位置丝氨酸239磷酸化VASP时，VASP只作为抗原结合(磷酸丝氨酸239VASP)。
5．根据权利要求1-3的一个或多个所述的抗体，其中当VASP在位置丝氨酸157磷酸化VASP时，VASP只作为抗原结合(磷酸丝氨酸157VASP)。
6．根据权利要求1-5的一个或多个所述的抗体，该抗体可以用于Western印迹技术。
7．根据权利要求1-5的一个或多个所述的抗体，该抗体可以用于流式细胞术。
8．根据权利要求1-7的一个或多个所述的抗体，该抗体是多克隆抗体。
9．根据权利要求1-7的一个或多个所述的抗体，该抗体是单克隆抗体(Mab)或它的片段。
10．根据权利要求9所述的单克隆抗体，该抗体是由杂交瘤细胞系16C2产生的。
11．根据权利要求9和／或10所述的单克隆抗体，该抗体是Mab16C2。
12．生产如权利要求9-11的一个或多个所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
13．生产单克隆抗体16C2的杂交瘤细胞系16C2(DSM ACC2330)。
14．根据权利要求1-11的一个或多个所述的抗体用作治疗剂的用途。
15．根据权利要求1-11的一个或多个所述的抗体作为诊断剂的用途。
16．根据权利要求15所述的抗体定量和／或定性确定生物材料中VASP的磷酸化的用途。
17．根据权利要求15所述的抗体定性和／或定量确定生物材料中239VASP或磷酸丝氨酸157VASP的用途。
18．根据权利要求15-17的一个或多个所述的抗体的用途，其中生物材料是人血小板或人全血。
19．根据权利要求15-18的一个或多个所述的抗体用于检测影响生物材料中cGMP和／或cAMP的水平的物质的用途。
20．根据权利要求15-19的一个或多个所述的抗体用于确定内皮因子的体内活性的用途。
21．根据权利要求15-20的一个或多个所述的抗体用于检测内皮功能异常的用途。
22．一种诊断或治疗方法，该方法包括利用多克隆或单克隆抗体或它们的片段确定或影响生物材料中VASP的磷酸化状态和／或它的蛋白质相互作用。
23．一种定性和／或定量检测在生物材料中至少在丝氨酸157，丝氨酸239和苏氨酸278的一个位置上磷酸化的VASP的诊断方法，该方法包括使用如权利要求1-11的一个或多个所述的抗体。
24．根据权利要求23所述的诊断方法，其中在位置丝氨酸239磷酸化VASP(磷酸丝氨酸239VASP)。
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