JPH0795945B2 - 白血球の活性化を監視するためのモノクローナル抗体 - Google Patents
白血球の活性化を監視するためのモノクローナル抗体Info
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- JPH0795945B2 JPH0795945B2 JP1013005A JP1300589A JPH0795945B2 JP H0795945 B2 JPH0795945 B2 JP H0795945B2 JP 1013005 A JP1013005 A JP 1013005A JP 1300589 A JP1300589 A JP 1300589A JP H0795945 B2 JPH0795945 B2 JP H0795945B2
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- JP
- Japan
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- cells
- leu23
- lymphocytes
- activated
- antigen
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、白血球の活性化の監視に有益なモノクローナ
ル抗体（MAb）に関し、更に詳細には、インターロイキ
ン−２（IL−２）により活性化された直後のナチュラル
キラー（NK）細胞上、低浮遊密度（LBD）Ｔリンパ球の
サブセット上及びＴ細胞抗原レセプター複合体の刺激後
ある種のＴリンパ球上に出現する抗原、即ちLeu23と結
合するモノクローナル抗体に関する。
ル抗体（MAb）に関し、更に詳細には、インターロイキ
ン−２（IL−２）により活性化された直後のナチュラル
キラー（NK）細胞上、低浮遊密度（LBD）Ｔリンパ球の
サブセット上及びＴ細胞抗原レセプター複合体の刺激後
ある種のＴリンパ球上に出現する抗原、即ちLeu23と結
合するモノクローナル抗体に関する。
（従来の技術） IL−２は、Ｔリンパ球及びNK細胞の両方の増殖を可能に
し且つ細胞障害機能を発揮させる。IL−２（もしくは組
み換えIL−２）にさらすと、末梢血から単離された休止
状態のNK細胞は活性化後４時間以内に強化された細胞障
害活性を示す。この細胞障害活性は18時間後に最大にな
る。
し且つ細胞障害機能を発揮させる。IL−２（もしくは組
み換えIL−２）にさらすと、末梢血から単離された休止
状態のNK細胞は活性化後４時間以内に強化された細胞障
害活性を示す。この細胞障害活性は18時間後に最大にな
る。
これとは対照的に、殆どの抹消血の白血球は単独のIL−
２に対しては応答しない。増殖を誘導するためには更に
IL−１又はプロテインキナーゼＣのようなシグナルが要
求される。しかしながら、LBD Ｔ細胞のサブセットは
単独のIL−２にたいして応答し、そしてそれにより“感
作された”状態のように見える。
２に対しては応答しない。増殖を誘導するためには更に
IL−１又はプロテインキナーゼＣのようなシグナルが要
求される。しかしながら、LBD Ｔ細胞のサブセットは
単独のIL−２にたいして応答し、そしてそれにより“感
作された”状態のように見える。
一旦活性化されると、白血球は種々の新しい表面抗原を
発現する。例えば、IL−２による活性化後のNK細胞は、
トランスフェリンレセプター、HLA−DR及びCD25 IL−
２レセプターを発現する。しかし、これらの抗原は、NK
細胞が最も細胞障害性である４〜18時間目の期間経過後
しばらくまで大多数の細胞上には発現されない。従っ
て、NK活性化及び細胞障害性機能とこれらの抗原の発現
との間には直接的な相関関係はない。結論としては、活
性化の効果を測定する手段は最大細胞障害性が終わるま
でないことになる。
発現する。例えば、IL−２による活性化後のNK細胞は、
トランスフェリンレセプター、HLA−DR及びCD25 IL−
２レセプターを発現する。しかし、これらの抗原は、NK
細胞が最も細胞障害性である４〜18時間目の期間経過後
しばらくまで大多数の細胞上には発現されない。従っ
て、NK活性化及び細胞障害性機能とこれらの抗原の発現
との間には直接的な相関関係はない。結論としては、活
性化の効果を測定する手段は最大細胞障害性が終わるま
でないことになる。
NK細胞の活性化の効果を測定すること及びその後の細胞
障害剤としてのそれらの効果は、例えば、ある種の病気
の治療において重要である。最近、ローセンベルグ（Ro
senberg）らは、エヌ・エング・ジェイ・メド（N.Eng.
J.Med.）164:814（1985）及びローセンベルグの米国特
許第4,690,915号において、インビボ（in vivo）でのIL
−２の使用とインビトロ（in vitro）でIL−２で活性化
された患者の自己由来リンパ球の投与との組み合わせを
含む癌治療の方法を提案している。投与の前に最大の治
療効果を保証するためにリンパ球の活性化を測定するこ
とは有益である。
障害剤としてのそれらの効果は、例えば、ある種の病気
の治療において重要である。最近、ローセンベルグ（Ro
senberg）らは、エヌ・エング・ジェイ・メド（N.Eng.
J.Med.）164:814（1985）及びローセンベルグの米国特
許第4,690,915号において、インビボ（in vivo）でのIL
−２の使用とインビトロ（in vitro）でIL−２で活性化
された患者の自己由来リンパ球の投与との組み合わせを
含む癌治療の方法を提案している。投与の前に最大の治
療効果を保証するためにリンパ球の活性化を測定するこ
とは有益である。
IL−２による白血球の活性化に加えて、Ｔ細胞を、例え
ばそのＴ細胞抗原レセプター複合体との相互作用により
刺激することが可能であり、その複合体は抗原レセプタ
ー中のアルファー及びベーター鎖からなっており、そし
て出現しCD3+複合体と命名されている数種の他の蛋白質
と複合体を形成する。そのＴ細胞抗原レセプターは外来
抗原（例えば、アロ抗原及びウイルス）の認識を行って
おり、更に活性化Ｔ細胞に免疫応答を生じさせることが
できるある種のトランスフォーメションを行わせる。ま
た、Ｔ細胞抗原レセプター複合体を介して刺激された細
胞を同定するためのマーカーがあれば更に有益である。
ばそのＴ細胞抗原レセプター複合体との相互作用により
刺激することが可能であり、その複合体は抗原レセプタ
ー中のアルファー及びベーター鎖からなっており、そし
て出現しCD3+複合体と命名されている数種の他の蛋白質
と複合体を形成する。そのＴ細胞抗原レセプターは外来
抗原（例えば、アロ抗原及びウイルス）の認識を行って
おり、更に活性化Ｔ細胞に免疫応答を生じさせることが
できるある種のトランスフォーメションを行わせる。ま
た、Ｔ細胞抗原レセプター複合体を介して刺激された細
胞を同定するためのマーカーがあれば更に有益である。
ハラ（Hara）ら（ヒトＴ細胞活性化:III、12−０−テト
ラデカノイル ホルボール−13−アセテート、マイトジ
ェンおよび抗原によるリン酸化28kD/32kDジスルフィド
結合初期活性化抗原（EA−１）の迅速誘導、ジェイ・エ
クスプ・メド（J.Exp.Med.）164:1988（1986）及びコス
リチ（Cosulich）ら（Ｔ細胞活性化の初期段階において
含まれる抗原（MLR3）の機能的特徴、プナス（PNAS）、
84:4205（1987））は、最近活性化後短時間の内にＴ細
胞上に発現される表面抗原について述べている。これら
の抗原、EA−１及びMLR3は夫々28kD及び32kDの主成分を
有する糖タンパク質である。EA−１及びMLR3はHLAクラ
スII抗原ではなく、そしてMLR3MAbはIL−１結合をブロ
ックする。これらの抗原は活性化後18時間以内にＴ細胞
上に出現し、そして48時間目でも存在している。
ラデカノイル ホルボール−13−アセテート、マイトジ
ェンおよび抗原によるリン酸化28kD/32kDジスルフィド
結合初期活性化抗原（EA−１）の迅速誘導、ジェイ・エ
クスプ・メド（J.Exp.Med.）164:1988（1986）及びコス
リチ（Cosulich）ら（Ｔ細胞活性化の初期段階において
含まれる抗原（MLR3）の機能的特徴、プナス（PNAS）、
84:4205（1987））は、最近活性化後短時間の内にＴ細
胞上に発現される表面抗原について述べている。これら
の抗原、EA−１及びMLR3は夫々28kD及び32kDの主成分を
有する糖タンパク質である。EA−１及びMLR3はHLAクラ
スII抗原ではなく、そしてMLR3MAbはIL−１結合をブロ
ックする。これらの抗原は活性化後18時間以内にＴ細胞
上に出現し、そして48時間目でも存在している。
これらの抗原は活性化を検出において有益であるが、本
発明は白血球、及び特にNK細胞及びＴ細胞のサブセット
の活性化を検出する別の手段を提供する。
発明は白血球、及び特にNK細胞及びＴ細胞のサブセット
の活性化を検出する別の手段を提供する。
（課題を解決するための手段） L78は、CD8+アロ抗原−誘導化細胞障害性Ｔリンパ球（C
TL）細胞株によって免疫されたBalb/cマウスの膝窩リン
パ節由来の細胞とげっ歯類の骨髄腫細胞株SP2/0 Ag 14
とで形成されるマウスのハイブリドーマである。融合細
胞を培養し、そしてアザセリン−ヒポキサンチン培地で
選択した。クローンLR3−8H3が選択され、そしてそれを
L78と再命名した。L78はブタペスト条約の規定に従って
国際寄託としてATCCに寄託番号HB−9627として寄託され
ている。
TL）細胞株によって免疫されたBalb/cマウスの膝窩リン
パ節由来の細胞とげっ歯類の骨髄腫細胞株SP2/0 Ag 14
とで形成されるマウスのハイブリドーマである。融合細
胞を培養し、そしてアザセリン−ヒポキサンチン培地で
選択した。クローンLR3−8H3が選択され、そしてそれを
L78と再命名した。L78はブタペスト条約の規定に従って
国際寄託としてATCCに寄託番号HB−9627として寄託され
ている。
L184は、rIL−２活性化NK細胞で免疫されたBalb/cマウ
スからの脾細胞とネズミの骨髄腫細胞株SP2/0 Ag 14と
で形成されるマウスのハイブリドーマである。クローン
E14/A97が単離され、そしてそれをL184と再命名した。L
184はジョー・フィリップス（Joe Phillips）博士の研
究室（ベクテン・ディキンソン・イムノサイトメトリー
・システムズ（Beckton Dickinson Immunocytometory S
ysytems））に保管されている。L78及びL184によって生
産されるモノクローナル抗体はAnti−Leu23として命名
され、それらはIgG1イソタイプを有している。
スからの脾細胞とネズミの骨髄腫細胞株SP2/0 Ag 14と
で形成されるマウスのハイブリドーマである。クローン
E14/A97が単離され、そしてそれをL184と再命名した。L
184はジョー・フィリップス（Joe Phillips）博士の研
究室（ベクテン・ディキンソン・イムノサイトメトリー
・システムズ（Beckton Dickinson Immunocytometory S
ysytems））に保管されている。L78及びL184によって生
産されるモノクローナル抗体はAnti−Leu23として命名
され、それらはIgG1イソタイプを有している。
Anti−Leu23は、活性化及び抗原刺激された白血球上の
細胞表面抗原を認識する。rIL−２活性化NK細胞上に、
活性化後４時間以内にその抗原、Leu23が発現し、活性
化後72時間は発現され続ける。Leu23は、少なくとも２
個のＮ−結合炭水化物を伴う24kDのサブユニットからな
るジスルフィド−結合ホモダイマーである。Leu23はIL
−２に依存する過程によって誘導され且つリン酸化され
る。
細胞表面抗原を認識する。rIL−２活性化NK細胞上に、
活性化後４時間以内にその抗原、Leu23が発現し、活性
化後72時間は発現され続ける。Leu23は、少なくとも２
個のＮ−結合炭水化物を伴う24kDのサブユニットからな
るジスルフィド−結合ホモダイマーである。Leu23はIL
−２に依存する過程によって誘導され且つリン酸化され
る。
NK細胞上のLeu23の出現は細胞障害性の発達と関連して
いること及びある種のＴ細胞上のLeu23の出現はそのＴ
細胞抗原レセプター複合体の刺激に関連していることか
ら、Anti−Leu23は白血球の活性化又は刺激を監視する
ことにおいて有益である。
いること及びある種のＴ細胞上のLeu23の出現はそのＴ
細胞抗原レセプター複合体の刺激に関連していることか
ら、Anti−Leu23は白血球の活性化又は刺激を監視する
ことにおいて有益である。
第１図Ａは、５％ 2−メルカプトエタノール（２−ME）
を含む若しくは含まない2.3％ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）中での125I−標識されたrIL−２活性化NK細胞、
胸腺細胞及び抹消血Ｔリンパ球のAnti−Leu23と免疫沈
澱物を、10％ポリアクリルアミドを用いたポリアクリル
アミドゲル電気泳動（PAGE）で分離したオートラジオグ
ラフである。
を含む若しくは含まない2.3％ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）中での125I−標識されたrIL−２活性化NK細胞、
胸腺細胞及び抹消血Ｔリンパ球のAnti−Leu23と免疫沈
澱物を、10％ポリアクリルアミドを用いたポリアクリル
アミドゲル電気泳動（PAGE）で分離したオートラジオグ
ラフである。
第１図Ｂは、第１次元においては非還元状態で7.5％ポ
リアクリルアミドで電気泳動し、第２次元においては還
元状態で10％ポリアクリルアミドで電気泳動するSDS−P
AGE分析によって２次元に分離された第１図Ａで得られ
た125I−認識されたIL−２活性化胸腺細胞とAnti−Leu2
3との免疫沈澱物のオートラジオグラフである。
リアクリルアミドで電気泳動し、第２次元においては還
元状態で10％ポリアクリルアミドで電気泳動するSDS−P
AGE分析によって２次元に分離された第１図Ａで得られ
た125I−認識されたIL−２活性化胸腺細胞とAnti−Leu2
3との免疫沈澱物のオートラジオグラフである。
第２図は、免疫沈澱物をエンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼＦ（エンドＦ）を用いて脱糖鎖し、10％
ポリアクリルアミドでSDS−PAGE分析により分離された
第１図Ａで得られた125I−標識されたIL−２活性化胸腺
細胞とAnti−Leu23との免疫沈澱物のオートラジオグラ
フである。
コサミニダーゼＦ（エンドＦ）を用いて脱糖鎖し、10％
ポリアクリルアミドでSDS−PAGE分析により分離された
第１図Ａで得られた125I−標識されたIL−２活性化胸腺
細胞とAnti−Leu23との免疫沈澱物のオートラジオグラ
フである。
第３図は、500U/mlのrIL−２で活性化されたLBD、HBD及
びNK細胞について活性化後０、２、６及び18時間後にフ
ローサイトメトリーにより測定された蛍光のヒストグラ
ムであって、活性化細胞は、対照としてフルオレセイン
イソチオシアネート（FITC）結合IgG及びフィコエリト
リン（PE）結合抗−IgG;NK細胞（CD16+）についてのAnt
i−Leu11（FITC）及びAnti−Leu23（PE）；及びLBD及び
HBD（CD3+）についてのAnti−Leu4（FITC）及びAnti−L
eu23（PE）；で標識されている。
びNK細胞について活性化後０、２、６及び18時間後にフ
ローサイトメトリーにより測定された蛍光のヒストグラ
ムであって、活性化細胞は、対照としてフルオレセイン
イソチオシアネート（FITC）結合IgG及びフィコエリト
リン（PE）結合抗−IgG;NK細胞（CD16+）についてのAnt
i−Leu11（FITC）及びAnti−Leu23（PE）；及びLBD及び
HBD（CD3+）についてのAnti−Leu4（FITC）及びAnti−L
eu23（PE）；で標識されている。
第４図は、500U/mlのrIL−２中で培養されたLBD細胞に
ついてのヒストグラムであって、18時間後に、対照は第
３図と同じ;CD16抗原についてのAnti−Leu23（FITC）及
びAnti−Leu11（PE）;HLA−DR抗原についてのAnti−Leu
11（FITC）及び抗−HLA−DR（PE）；及びIL−２レセプ
ター抗原についてのAnti−Leu11（FITC）及び抗−IL−2
R（PE）で標識されている。
ついてのヒストグラムであって、18時間後に、対照は第
３図と同じ;CD16抗原についてのAnti−Leu23（FITC）及
びAnti−Leu11（PE）;HLA−DR抗原についてのAnti−Leu
11（FITC）及び抗−HLA−DR（PE）；及びIL−２レセプ
ター抗原についてのAnti−Leu11（FITC）及び抗−IL−2
R（PE）で標識されている。
第５図は、種々の濃度のIL−２中で培養されたLBD細胞
についてのヒストグラムであって、18時間後に第３図の
対照及びAnti−Leu11（FITC）及びAnti−Leu23（PE）で
標識されている。
についてのヒストグラムであって、18時間後に第３図の
対照及びAnti−Leu11（FITC）及びAnti−Leu23（PE）で
標識されている。
第６図Ａは、6U/ml又は12U/mlのrIL−２中で培養された
LBD細胞についてヒストグラムであって、18時間後にAnt
i−Leu23（FITC）及びAnti−Leu11（PE）で標識されて
いる。
LBD細胞についてヒストグラムであって、18時間後にAnt
i−Leu23（FITC）及びAnti−Leu11（PE）で標識されて
いる。
第６図Ｂは、51Cr−標識Colo−205癌標的細胞に対する
試験における、未分類のLBD、FACS440TMフローサイトメ
トリー装置により第６図Ａから分類され単離されたCD16
+/Leu23-及びCD16+/Leu23+細胞についてのエフェクター
と標的細胞の比率に対する細胞障害性のパーセント比率
のプロットである。
試験における、未分類のLBD、FACS440TMフローサイトメ
トリー装置により第６図Ａから分類され単離されたCD16
+/Leu23-及びCD16+/Leu23+細胞についてのエフェクター
と標的細胞の比率に対する細胞障害性のパーセント比率
のプロットである。
第７図は、第１図Ｂで述べられた10％ポリアクリルアミ
ドによる２次元SDS−PAGEによる分析された［32P］−オ
ルトリン酸で標識されたIL−２活性化LBD細胞のLeu23及
び対照免疫沈澱物のオートラジオグラフである。
ドによる２次元SDS−PAGEによる分析された［32P］−オ
ルトリン酸で標識されたIL−２活性化LBD細胞のLeu23及
び対照免疫沈澱物のオートラジオグラフである。
第８図は、（ａ）Leu23と反応しない対照Mab又は（ｂ）
抗−CD3抗体（Anti−Leu4）によって一晩刺激され、Ant
i−Leu23（FITC）又はLeu23と反応しない対照Mabで標識
された白血病細胞株（Jurkat）についての蛍光のヒスト
グラムである。
抗−CD3抗体（Anti−Leu4）によって一晩刺激され、Ant
i−Leu23（FITC）又はLeu23と反応しない対照Mabで標識
された白血病細胞株（Jurkat）についての蛍光のヒスト
グラムである。
L78ハイブリドーマ及びそれにより生産されるAnti−Leu
23MAbは次のようにして調製された。５×105個のCD8+ア
ロ抗原−誘導化細胞障害性リンパ球細胞株（ElxPGF/J
Y、ベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリー・
システムズのベティ・エバンス（Betty Evans）博士か
ら入手）をBalb/cマウスの足蹠に０、４、７、11、14及
び18日目に注射した。
23MAbは次のようにして調製された。５×105個のCD8+ア
ロ抗原−誘導化細胞障害性リンパ球細胞株（ElxPGF/J
Y、ベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリー・
システムズのベティ・エバンス（Betty Evans）博士か
ら入手）をBalb/cマウスの足蹠に０、４、７、11、14及
び18日目に注射した。
19日目、マウスを殺しその膝窩リンパ節を切り取った。
そして、細胞を不滅形質細胞腫融合パートナーSP2/0 Ag
14（シュルマン（Shulman）ら、ネイチャー（Natur
e）、276:269（1978））と35％ポリエチレングリコール
中で融合させた。同様の方法及び脾細胞の調製及び融合
が米国特許第4,172,124号及び第4,196,265号に開示され
ており、ここに参照により本明細書に含められる。
そして、細胞を不滅形質細胞腫融合パートナーSP2/0 Ag
14（シュルマン（Shulman）ら、ネイチャー（Natur
e）、276:269（1978））と35％ポリエチレングリコール
中で融合させた。同様の方法及び脾細胞の調製及び融合
が米国特許第4,172,124号及び第4,196,265号に開示され
ており、ここに参照により本明細書に含められる。
融合によって得られる生細胞を、20％牛胎児血清（KCバ
イオロジカルス（KC Biologicals））を含むヅルベッコ
（Dulbecco）の修飾イーグル培地（DMEM,ギブコ（GIBC
O））の入った96穴マイクロカルチャープレートに撒い
た。15mMのHEPES（ギブコ）溶液及びアザセリン−ヒポ
キサンチン（それぞれ２μg/ml及び10-4Mの最終濃度と
なるように）をブック（Buck）らの方法（プレヌム・パ
ブリシング・コープ（Plenum Publishing Corp.）のケ
ッネット（Kennett）ら編集の“モノクロナール抗体及
び機能的細胞株”（1984）の中の、ヒトモノクローナル
抗体の生産）に従って選択培地として各穴（ウエル）に
添加した。この培地の中で増殖したハイブリドーマは、
融合後直ぐに死滅する融合していない骨髄腫細胞及び脾
細胞から分離された。インキュベーションは目視できる
コロニーが出現するまで７〜10日間続けられた。
イオロジカルス（KC Biologicals））を含むヅルベッコ
（Dulbecco）の修飾イーグル培地（DMEM,ギブコ（GIBC
O））の入った96穴マイクロカルチャープレートに撒い
た。15mMのHEPES（ギブコ）溶液及びアザセリン−ヒポ
キサンチン（それぞれ２μg/ml及び10-4Mの最終濃度と
なるように）をブック（Buck）らの方法（プレヌム・パ
ブリシング・コープ（Plenum Publishing Corp.）のケ
ッネット（Kennett）ら編集の“モノクロナール抗体及
び機能的細胞株”（1984）の中の、ヒトモノクローナル
抗体の生産）に従って選択培地として各穴（ウエル）に
添加した。この培地の中で増殖したハイブリドーマは、
融合後直ぐに死滅する融合していない骨髄腫細胞及び脾
細胞から分離された。インキュベーションは目視できる
コロニーが出現するまで７〜10日間続けられた。
細胞が増殖した各穴から得られた上清液は、最初に陽性
選択としてCTLを用いたパンデックス免疫アッセイ（パ
ンデックス・ラボラトリーズ・インク（Pandex Laborat
ories Inc.））によってスクリーニングした。５×105
個のCTLを96穴パンデックスプレートの各穴に添加し
た。各穴には25〜50μの上清液を添加した。30分後、
細胞を0.15Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。
そして、フルオレセインイソチオシアネートと結合した
ヤギ抗−マウスIg抗体を各穴に添加した。免疫アッセイ
で得られた結果はパンデックス装置を用いて読み取っ
た。
選択としてCTLを用いたパンデックス免疫アッセイ（パ
ンデックス・ラボラトリーズ・インク（Pandex Laborat
ories Inc.））によってスクリーニングした。５×105
個のCTLを96穴パンデックスプレートの各穴に添加し
た。各穴には25〜50μの上清液を添加した。30分後、
細胞を0.15Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。
そして、フルオレセインイソチオシアネートと結合した
ヤギ抗−マウスIg抗体を各穴に添加した。免疫アッセイ
で得られた結果はパンデックス装置を用いて読み取っ
た。
陽性を示した上清液の入った各穴からの細胞を24穴マイ
クロカルチャープレートに再び撒き、選択培地を含まな
いDMEM中で増殖させた。それらの穴の各々から得られた
上清液は、その上清液をrIL−２（シータス・コープ（C
etus Corp.））活性化Ｔリンパ球又は休止状態の末梢血
白血球のどちらかが入った穴に添加することによって再
びスクリーニングされた。ヤギ抗−マウスIg（FITC）を
各穴に添加した。これらの穴から得られた染色された細
胞はフローサイトメトリー装置（FACS440TM）による分
析に供される。
クロカルチャープレートに再び撒き、選択培地を含まな
いDMEM中で増殖させた。それらの穴の各々から得られた
上清液は、その上清液をrIL−２（シータス・コープ（C
etus Corp.））活性化Ｔリンパ球又は休止状態の末梢血
白血球のどちらかが入った穴に添加することによって再
びスクリーニングされた。ヤギ抗−マウスIg（FITC）を
各穴に添加した。これらの穴から得られた染色された細
胞はフローサイトメトリー装置（FACS440TM）による分
析に供される。
染色された細胞は前方及び直角方向の散乱及び蛍光につ
いて調べられた。そして、ゲートがリンパ球集団につい
て設定された。この分析から、クローンLR3−8H3が選択
された。それはブタペスト条約の規定に基づいて寄託番
号HB−9627としてATCCに寄託された。そのハイブリドー
マはL78と命名された。
いて調べられた。そして、ゲートがリンパ球集団につい
て設定された。この分析から、クローンLR3−8H3が選択
された。それはブタペスト条約の規定に基づいて寄託番
号HB−9627としてATCCに寄託された。そのハイブリドー
マはL78と命名された。
しかし、L78はLeu23と結合できるMAbを生産する唯一の
ハイブリドーマではない。ジョー・フィリップス（Joe
Philips）博士の研究室（ベクトン・ディキンソン・イ
ムノサイトメトリー・システムズ）に保管されているL1
84は、Anti−Leu23Mabを生産するハイブリドーマであ
る。
ハイブリドーマではない。ジョー・フィリップス（Joe
Philips）博士の研究室（ベクトン・ディキンソン・イ
ムノサイトメトリー・システムズ）に保管されているL1
84は、Anti−Leu23Mabを生産するハイブリドーマであ
る。
L184は、前もってrIL−２中で１週間活性化され、Leu11
+で分類されたNK細胞でBalb/cマウスを免疫することに
よって開発された。ここで免疫原として使用されるCTL
細胞株及びNK細胞は活性化リンパ球からなる。マウスは
以下のスケジュールに従って活性化NK細胞で免疫され
た:2×106個のNK細胞を腹腔内（I/P）に０、28、35、42
及び49日目；及び２×106個のNK細胞を静脈内（I/V）に
50、51、52及び53日目に免疫した。
+で分類されたNK細胞でBalb/cマウスを免疫することに
よって開発された。ここで免疫原として使用されるCTL
細胞株及びNK細胞は活性化リンパ球からなる。マウスは
以下のスケジュールに従って活性化NK細胞で免疫され
た:2×106個のNK細胞を腹腔内（I/P）に０、28、35、42
及び49日目；及び２×106個のNK細胞を静脈内（I/V）に
50、51、52及び53日目に免疫した。
54日目に、脾臓を切り取り、上記と同様に脾細胞をSP2/
0 Ag 14細胞株と融合した。選択方法は同様に行い、最
終的にE14/A97が選択された。クローンE14/A97はL184と
再命名された。
0 Ag 14細胞株と融合した。選択方法は同様に行い、最
終的にE14/A97が選択された。クローンE14/A97はL184と
再命名された。
L78及びL184によって生産されるモノクロナール抗体はA
nti−Leu23と命名された。それらはIgG1イソタイプを有
している。それらは、それらと反応する抗原によって更
に特徴ずけられている。
nti−Leu23と命名された。それらはIgG1イソタイプを有
している。それらは、それらと反応する抗原によって更
に特徴ずけられている。
Anti−Leu23は本質的には全てのIL−２活性化CD16+NK細
胞と反応する。同様に、Anti−Leu23は、IL−２依存性C
D8+CTL細胞株、CD4+破傷風特異性ヘルパーＴ細胞クロー
ン、IL−２依存胸腺細胞及びマイトジェン活性化Ｔリン
パ球と反応する。これら夫々の細胞種とAnti−Leu23の
結合は、FITC又はPE標識Anti−Leu23及び夫々他の細胞
種についての相捕的MAbを使用する直接又は間接免疫蛍
光によって評価された。これらのMAb（例えば、Anti−L
eu11（CD16）、Anti−Leu4（CD3）及びAnti−Leu12（CD
19））及びその他ここで記載されているものは特に断ら
ない限りベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリ
ー・システムズより市販されている。標識された細胞は
フローサイトメトリー、コンソート40データ分析システ
ムが組み込まれた装置FACS440TM（両方ともベクトン・
ディキンソン・イムノサイトメトリー・システムズより
市販されている）によって分析された。これらの分析か
ら得られた結果を表１に示した。
胞と反応する。同様に、Anti−Leu23は、IL−２依存性C
D8+CTL細胞株、CD4+破傷風特異性ヘルパーＴ細胞クロー
ン、IL−２依存胸腺細胞及びマイトジェン活性化Ｔリン
パ球と反応する。これら夫々の細胞種とAnti−Leu23の
結合は、FITC又はPE標識Anti−Leu23及び夫々他の細胞
種についての相捕的MAbを使用する直接又は間接免疫蛍
光によって評価された。これらのMAb（例えば、Anti−L
eu11（CD16）、Anti−Leu4（CD3）及びAnti−Leu12（CD
19））及びその他ここで記載されているものは特に断ら
ない限りベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリ
ー・システムズより市販されている。標識された細胞は
フローサイトメトリー、コンソート40データ分析システ
ムが組み込まれた装置FACS440TM（両方ともベクトン・
ディキンソン・イムノサイトメトリー・システムズより
市販されている）によって分析された。これらの分析か
ら得られた結果を表１に示した。
Leu23は活性化白血球においては優勢であるが、増殖し
ている細胞においては優先的に発現されない。複数の培
養されたＴ白血病細胞株（例えば、HPB−ALL、PEER及び
CEM）はLeu23を発現しない。同様に、EBVでトランスフ
ォームされたＢリンパ芽球様細胞株、CCRF−SBはLeu23
を発現しない。従って、Leu23は本質的には増殖につい
てのマーカーとはならないが、活性化白血球には分布し
ている。
ている細胞においては優先的に発現されない。複数の培
養されたＴ白血病細胞株（例えば、HPB−ALL、PEER及び
CEM）はLeu23を発現しない。同様に、EBVでトランスフ
ォームされたＢリンパ芽球様細胞株、CCRF−SBはLeu23
を発現しない。従って、Leu23は本質的には増殖につい
てのマーカーとはならないが、活性化白血球には分布し
ている。
Leu23抗原の生化学的分析を、異なった細胞種が同一の
抗原を発現することを示すために行った。単核細胞がフ
ィコール／ヒパクエ（Ficoll/Hypaque）（ファルマシア
（Pharmacia））を用いて正常末梢血から単離された。
プラスチックのペトリ血（Ｂ−Ｄファルコン（Falco
n））に固着させた後、単球及びＢリンパ球を夫々除去
するためにナイロン綿を通過させ、残った細胞をリンパ
酸緩衝生理食塩水（PBS）中で不連続パーコール（Perco
ll）（ファルマシア）勾配上での遠心分離により分画し
た。そのLBD画分はNK細胞（CD16+）及びＴリンパ球（CD
3+）を含んでいる。その高浮遊密度（HBD）画分には休
止状態のＴリンパ球を含んでいた。胸腺細胞は心臓外科
手術を受けている子供から得た。
抗原を発現することを示すために行った。単核細胞がフ
ィコール／ヒパクエ（Ficoll/Hypaque）（ファルマシア
（Pharmacia））を用いて正常末梢血から単離された。
プラスチックのペトリ血（Ｂ−Ｄファルコン（Falco
n））に固着させた後、単球及びＢリンパ球を夫々除去
するためにナイロン綿を通過させ、残った細胞をリンパ
酸緩衝生理食塩水（PBS）中で不連続パーコール（Perco
ll）（ファルマシア）勾配上での遠心分離により分画し
た。そのLBD画分はNK細胞（CD16+）及びＴリンパ球（CD
3+）を含んでいる。その高浮遊密度（HBD）画分には休
止状態のＴリンパ球を含んでいた。胸腺細胞は心臓外科
手術を受けている子供から得た。
胸腺細胞、Ｔリンパ球及びNK細胞をrIL−２を含んでい
る培地中で２週間培養した。培養されたNK細胞、Ｔ細胞
及び胸腺細胞はケスキーオジャ（Keski−Oja）らのグル
コースオキシダーゼ／ラクトパーオキシダーゼ法（バイ
オケム・バイオフィシ・レス・コム（Biochem.Biophys.
Res.Comm.）74:699（1977））によって125I（アマーシ
ャム・コープ（Amersham Corp.））で標識された。細胞
を5mMの３［３−コルアミドプロピル−ジメチルアンモ
ニオ］−１−プロパンスルフェート（CHAPS）界面活性
剤、20KIユニット/mlのアプロチニン（aprotinin）（シ
グマ（Siguma））及び1mMフェニルメタンスルホニルフ
ルオリド（PMSF）（シグマ）を含む溶解緩衝液（50mMト
リス塩酸、150mM Nacl、0.02％ナトリウムアザイド、pH
8.0）に溶かした。取り込まれなかった125Iをダウエク
ス（Dowex）1x8−400イオン交換樹脂（シグマ）を用い
て除去し、溶解物はウサギ抗−マウスIg血清（ペル−フ
レッツ・バイオロジカルス（Pel−Frez Biological
s））又はAnti−Leu23で被覆されたプロタインＡを持っ
ているホルマリンで固定されたスタフィロコッカス・ア
ウレウス（Staphylococcus aureus）によって予備精製
した。免疫複合体は、５％２−MEを含むか又は含まない
2.3％SDSを含んでいるサンプル緩衝液中で溶出された。
そして、１又は２次元電気泳動を行った。
る培地中で２週間培養した。培養されたNK細胞、Ｔ細胞
及び胸腺細胞はケスキーオジャ（Keski−Oja）らのグル
コースオキシダーゼ／ラクトパーオキシダーゼ法（バイ
オケム・バイオフィシ・レス・コム（Biochem.Biophys.
Res.Comm.）74:699（1977））によって125I（アマーシ
ャム・コープ（Amersham Corp.））で標識された。細胞
を5mMの３［３−コルアミドプロピル−ジメチルアンモ
ニオ］−１−プロパンスルフェート（CHAPS）界面活性
剤、20KIユニット/mlのアプロチニン（aprotinin）（シ
グマ（Siguma））及び1mMフェニルメタンスルホニルフ
ルオリド（PMSF）（シグマ）を含む溶解緩衝液（50mMト
リス塩酸、150mM Nacl、0.02％ナトリウムアザイド、pH
8.0）に溶かした。取り込まれなかった125Iをダウエク
ス（Dowex）1x8−400イオン交換樹脂（シグマ）を用い
て除去し、溶解物はウサギ抗−マウスIg血清（ペル−フ
レッツ・バイオロジカルス（Pel−Frez Biological
s））又はAnti−Leu23で被覆されたプロタインＡを持っ
ているホルマリンで固定されたスタフィロコッカス・ア
ウレウス（Staphylococcus aureus）によって予備精製
した。免疫複合体は、５％２−MEを含むか又は含まない
2.3％SDSを含んでいるサンプル緩衝液中で溶出された。
そして、１又は２次元電気泳動を行った。
第１図Ａに示されるように、本質的に同一の構造物がNK
細胞、Ｔリンパ球及び胸腺細胞のIL−２依存性細胞株か
ら免疫沈澱した。Anti−Leu23はジスルフィド結合した5
0〜60kDの糖タンパク質を免疫沈澱し、その糖タンパク
質は還元により32kD及び28kDのサブユニットに解離し
た。第１図Ｂにおいては、二次元“対角"SDS−PAGE分析
によりサブユニットのジスルフィド結合を確認し、その
対角分析でのサブユニットの相対移動度はこれらのタン
パク質が32kD＋32kD、32kD＋28kD及び28kD＋28kDタンパ
ク質の二量体を形成できることを示している。
細胞、Ｔリンパ球及び胸腺細胞のIL−２依存性細胞株か
ら免疫沈澱した。Anti−Leu23はジスルフィド結合した5
0〜60kDの糖タンパク質を免疫沈澱し、その糖タンパク
質は還元により32kD及び28kDのサブユニットに解離し
た。第１図Ｂにおいては、二次元“対角"SDS−PAGE分析
によりサブユニットのジスルフィド結合を確認し、その
対角分析でのサブユニットの相対移動度はこれらのタン
パク質が32kD＋32kD、32kD＋28kD及び28kD＋28kDタンパ
ク質の二量体を形成できることを示している。
より詳しい分析は糖鎖の状態を示している。Leu23は50m
M EDTA、１％２−ME及び１％SDSを含む20μのリン酸
緩衝液（0.1M、pH6.1）を添加することによって前述の
スタフィロコッカス・アウレウス／免疫複合体から溶出
した。20分間のインキュベーションの後、複合体を遠心
分離し、溶出物を除去し、そしてペレットを50mM EDTA
及び１％NP−40を含むリン酸緩衝液中で10倍に希釈し
た。その25μをミクロフーゲ（microfuge）管に入れ
た。エンドーＦ（ニュー・イングランド・ヌークレアー
（New England Nuclear））を最終濃度が23U/mlとなる
ように加えて、サンプルを37℃で16時間インキュベーシ
ョンした。そして10％２−MEを含む等しい体積の2Xサン
プル緩衝液を分解を止めるために添加して沸騰した湯浴
中に５分間浸けた。そして、SDS−PAGE分析を行った。
M EDTA、１％２−ME及び１％SDSを含む20μのリン酸
緩衝液（0.1M、pH6.1）を添加することによって前述の
スタフィロコッカス・アウレウス／免疫複合体から溶出
した。20分間のインキュベーションの後、複合体を遠心
分離し、溶出物を除去し、そしてペレットを50mM EDTA
及び１％NP−40を含むリン酸緩衝液中で10倍に希釈し
た。その25μをミクロフーゲ（microfuge）管に入れ
た。エンドーＦ（ニュー・イングランド・ヌークレアー
（New England Nuclear））を最終濃度が23U/mlとなる
ように加えて、サンプルを37℃で16時間インキュベーシ
ョンした。そして10％２−MEを含む等しい体積の2Xサン
プル緩衝液を分解を止めるために添加して沸騰した湯浴
中に５分間浸けた。そして、SDS−PAGE分析を行った。
予め決められた最適濃度のエンドＦ酵素による抗原の脱
糖鎖は24kDの単一のタンパクを示した。第２図を参照さ
れたい。部分的に脱糖鎖されたものは28kDの相対移動度
で観察された。エンドＦはペプチドにアスパラギンを介
して結合している炭水化物の高マンノース型及び複合型
の両方を切断するので、Leu23抗原は少なくとも２部位
のＮ−結合糖鎖を伴う24kDのタンパクであることが明ら
かである。変化していない及び脱糖鎖したLeu23抗原の
二次元NEPHGE分析は、32kD及び28kDのサブユニットは単
一のＮ−結合炭水化物の付加によって区別される同一の
ポリペプチドに相当しているようであることを示してい
る。糖鎖が取り除かれた24kDタンパク質は、エンドＦ処
理に対して抵抗性のあるアスパラギン結合オリゴ糖を加
水分解できる酵素であるＮ−グリカナーゼによる更なる
分解に対して抵抗性であた。糖鎖を除去された24kDタン
パク質中に観察される僅かな差異はNEPHGE分析中の尿素
によるタンパク質のカルバミル化によって生じたのか、
又は酵素抵抗性炭水化物若しくはＯ−結合オリゴ糖の存
在によるものであろう。
糖鎖は24kDの単一のタンパクを示した。第２図を参照さ
れたい。部分的に脱糖鎖されたものは28kDの相対移動度
で観察された。エンドＦはペプチドにアスパラギンを介
して結合している炭水化物の高マンノース型及び複合型
の両方を切断するので、Leu23抗原は少なくとも２部位
のＮ−結合糖鎖を伴う24kDのタンパクであることが明ら
かである。変化していない及び脱糖鎖したLeu23抗原の
二次元NEPHGE分析は、32kD及び28kDのサブユニットは単
一のＮ−結合炭水化物の付加によって区別される同一の
ポリペプチドに相当しているようであることを示してい
る。糖鎖が取り除かれた24kDタンパク質は、エンドＦ処
理に対して抵抗性のあるアスパラギン結合オリゴ糖を加
水分解できる酵素であるＮ−グリカナーゼによる更なる
分解に対して抵抗性であた。糖鎖を除去された24kDタン
パク質中に観察される僅かな差異はNEPHGE分析中の尿素
によるタンパク質のカルバミル化によって生じたのか、
又は酵素抵抗性炭水化物若しくはＯ−結合オリゴ糖の存
在によるものであろう。
Leu23の構造的特徴に加えて、その抗原は単一に制御さ
れているようであり、そして活性化又は刺激を監視／検
出するための方法を提供している。Leu23の発現に必要
な条件が決定された。
れているようであり、そして活性化又は刺激を監視／検
出するための方法を提供している。Leu23の発現に必要
な条件が決定された。
LBD及びHBDは前述のようにジェイ・エッチ・フィリップ
ス（J.H.Phillips）、エヌ・エル・ワーナー（N.L.Warn
er）及びエル・エル・ラニエル（L.L.Lanier）（ナット
・イミュン・セル・グロース・レグル（Nat.Immun.Cell
Growth Regul）3:73（1984））らの方法により単離し
た。リンパ球を500U/mlのrIL−２中で培養し、その一部
を２、６、及び18時間培養後に取り出した。細胞はPE−
結合Anti−Leu23及び、NK細胞を同定するためのFITC−
結合Anti−Leu11（CD16）又はＴリンパ球を同定するた
めのFITC結合Anti−Leu4（CD3）の２色免疫蛍光によっ
て染色した。
ス（J.H.Phillips）、エヌ・エル・ワーナー（N.L.Warn
er）及びエル・エル・ラニエル（L.L.Lanier）（ナット
・イミュン・セル・グロース・レグル（Nat.Immun.Cell
Growth Regul）3:73（1984））らの方法により単離し
た。リンパ球を500U/mlのrIL−２中で培養し、その一部
を２、６、及び18時間培養後に取り出した。細胞はPE−
結合Anti−Leu23及び、NK細胞を同定するためのFITC−
結合Anti−Leu11（CD16）又はＴリンパ球を同定するた
めのFITC結合Anti−Leu4（CD3）の２色免疫蛍光によっ
て染色した。
rIL−２による刺激の前には、Leu23はLBD（大きい）Ｔ
細胞又はHBD（小さい）Ｔ細胞上には検出されず、NK細
胞のうち少数のものに少量が存在した。第３図を参照さ
れたい。しかし、Leu23はrIL−２刺激後６時間までにNK
細胞の大多数及びLBD画分中のＴリンパ球のあるサブセ
ット上に検出された。18時間以内には、rIL−２で刺激
された実質的に全てのNK細胞がLeu23を発現した。これ
に反して、rIL−２で刺激されたNK細胞のうちほんの僅
かのものだけがトランスフェリンレセプターHLA−DR又
はCD25を発現した。第４図を参照されたい。全てのNK細
胞がrIL−２にさらしてから18時間以内にLeu23を発現し
たので、これは全てのNK細胞がIL−２応答性であること
を示している。rIL−２と共に培養液中に72時間維持さ
れたNK細胞は変わり無くLeu23陽性であり続けた。全て
のNK細胞がLeu23を得たにもかかわらず、rIL−２と共に
72時間の培養後でさえLBD画分においてはＴ細胞のある
サブセットのみがこの抗原を発現した。LBD画分の中の
Ｔリンパ球に対して、rIL−２は、72時間の培養後でさ
えHBD（第３図）中の小さな休止状態のＴリンパ休の検
出可能な程度の比率の細胞上にはLeu23の発現を誘導し
なかった。
細胞又はHBD（小さい）Ｔ細胞上には検出されず、NK細
胞のうち少数のものに少量が存在した。第３図を参照さ
れたい。しかし、Leu23はrIL−２刺激後６時間までにNK
細胞の大多数及びLBD画分中のＴリンパ球のあるサブセ
ット上に検出された。18時間以内には、rIL−２で刺激
された実質的に全てのNK細胞がLeu23を発現した。これ
に反して、rIL−２で刺激されたNK細胞のうちほんの僅
かのものだけがトランスフェリンレセプターHLA−DR又
はCD25を発現した。第４図を参照されたい。全てのNK細
胞がrIL−２にさらしてから18時間以内にLeu23を発現し
たので、これは全てのNK細胞がIL−２応答性であること
を示している。rIL−２と共に培養液中に72時間維持さ
れたNK細胞は変わり無くLeu23陽性であり続けた。全て
のNK細胞がLeu23を得たにもかかわらず、rIL−２と共に
72時間の培養後でさえLBD画分においてはＴ細胞のある
サブセットのみがこの抗原を発現した。LBD画分の中の
Ｔリンパ球に対して、rIL−２は、72時間の培養後でさ
えHBD（第３図）中の小さな休止状態のＴリンパ休の検
出可能な程度の比率の細胞上にはLeu23の発現を誘導し
なかった。
IL−２によるLeu23抗原の誘導は濃度に依存している。
第５図を参照すると、18時間の培養後、低いレベルのLe
u23抗原が3U/mlのrIL−２でNK細胞上に誘導され、そし
て100U/mlのrIL−２では殆どのNK細胞上に抗原を誘導す
るのに十分であった。IL−２はNK細胞上にLeu23の発現
を誘導するために必要にして十分であった。FACS440TM
細胞分類装置を用いてLBD画分からCD16+リンパ球を単離
することによって精製されたNK細胞は、rIL−２と共に1
8時間培養した後Leu23の発現を獲得した。Ｔリンパ球、
単球、又はその他の補助細胞はIL−２がNK細胞上のLeu2
3の発現を誘導するためには必要ではなかった。
第５図を参照すると、18時間の培養後、低いレベルのLe
u23抗原が3U/mlのrIL−２でNK細胞上に誘導され、そし
て100U/mlのrIL−２では殆どのNK細胞上に抗原を誘導す
るのに十分であった。IL−２はNK細胞上にLeu23の発現
を誘導するために必要にして十分であった。FACS440TM
細胞分類装置を用いてLBD画分からCD16+リンパ球を単離
することによって精製されたNK細胞は、rIL−２と共に1
8時間培養した後Leu23の発現を獲得した。Ｔリンパ球、
単球、又はその他の補助細胞はIL−２がNK細胞上のLeu2
3の発現を誘導するためには必要ではなかった。
IL−２強化細胞障害性とLeu23の発現の関連を測定する
ために更に研究を行った。LBD細胞を血清を含まない培
地中で100U/mlrIL−２と共に18時間、ウサギもしくはヤ
ギの中和用抗−IL−２血清の存在下又は不存在下で培養
した。
ために更に研究を行った。LBD細胞を血清を含まない培
地中で100U/mlrIL−２と共に18時間、ウサギもしくはヤ
ギの中和用抗−IL−２血清の存在下又は不存在下で培養
した。
ヤギ抗−IL−２は100U/mlのrIL−２を完全に中和できる
濃度で使用した。ウサギ抗−IL−２（ゲンチーム（Genz
yme））は100U/mlのrIL−２の50％を中和できる濃度で
使用した。18時間後、細胞を採取し、エフェクターと標
的細胞の比率が12:1の条件で51Cr標識（アマーシャム）
された標的細胞（即ち、Colo−205,ATCC No.CCL222）
に対する細胞障害性について４時間細胞を分析した。こ
れらの細胞はFITC−結合対照IgG又はAnti−Leu23（FIT
C）で染色して後フローサイトメトリーによって更に分
析された。
濃度で使用した。ウサギ抗−IL−２（ゲンチーム（Genz
yme））は100U/mlのrIL−２の50％を中和できる濃度で
使用した。18時間後、細胞を採取し、エフェクターと標
的細胞の比率が12:1の条件で51Cr標識（アマーシャム）
された標的細胞（即ち、Colo−205,ATCC No.CCL222）
に対する細胞障害性について４時間細胞を分析した。こ
れらの細胞はFITC−結合対照IgG又はAnti−Leu23（FIT
C）で染色して後フローサイトメトリーによって更に分
析された。
表２に示されるように、結腸癌細胞株に対するIL−２強
化細胞障害性及びNK細胞上のLeu23の誘導の両方とも中
和抗血清により同程度に阻害された。細胞障害性の阻害
とLeu23抗原誘導の阻害の間には定量的な関係が存在す
る。これらの結果は両方の現象がIL−２依存性であり、
そして同時に制御されている事象である可能性を示して
いる。
化細胞障害性及びNK細胞上のLeu23の誘導の両方とも中
和抗血清により同程度に阻害された。細胞障害性の阻害
とLeu23抗原誘導の阻害の間には定量的な関係が存在す
る。これらの結果は両方の現象がIL−２依存性であり、
そして同時に制御されている事象である可能性を示して
いる。
第６図Ａを参照すると、Leu23抗原発現のレベルが溶解
活性と関連しているかどうかを調べるために実験が行わ
れた。LBD細胞は6U/ml及び12U/mlのrIL−２と共に18時
間培養し、そしてFITC結合Anti−Leu11及びPE結合Anti
−Leu23で染色した。このような条件の下では低いレベ
ルのLeu23がCD16+NK細胞集団上に誘導された。明確な陰
性又は陽性のLeu23のサブセットは明らかではないが、
陰性または低いレベル（又は“暗い”）のLeu23抗原を
発現するCD16+NK細胞及び比較的高いレベル（又は“明
るい”）のLeu23抗原を発現するCD16+NK細胞を同定する
ことが可能であった。
活性と関連しているかどうかを調べるために実験が行わ
れた。LBD細胞は6U/ml及び12U/mlのrIL−２と共に18時
間培養し、そしてFITC結合Anti−Leu11及びPE結合Anti
−Leu23で染色した。このような条件の下では低いレベ
ルのLeu23がCD16+NK細胞集団上に誘導された。明確な陰
性又は陽性のLeu23のサブセットは明らかではないが、
陰性または低いレベル（又は“暗い”）のLeu23抗原を
発現するCD16+NK細胞及び比較的高いレベル（又は“明
るい”）のLeu23抗原を発現するCD16+NK細胞を同定する
ことが可能であった。
第６図Ｂを参照すると、誘導に6U/mlのrIL−２を使用す
ると、たとえ低いレベルのLeu23抗原がNK細胞集団で検
出されたとしても、NK−非感受性の結腸癌細胞株（Colo
−205）に対する細胞障害性の増大は観察されなかっ
た。これらの結果はLeu23抗原が細胞障害活性の検出よ
り前に発現され得ることを示している。誘導のために12
U/mlのrIL−２を用いると、細胞障害性はLeu23抗原の
“暗い”及び“明るい”の両方のレベルを発現したNK細
胞により媒介された。エフェクターと標的の種々の比率
において媒介される細胞障害性の比較は、高レベルのLe
u23抗原を発現しているNK細胞はLeu23を欠落しているか
又はこの抗原を低いレベルで発現しているNK細胞よりも
より溶菌性であることが示された。
ると、たとえ低いレベルのLeu23抗原がNK細胞集団で検
出されたとしても、NK−非感受性の結腸癌細胞株（Colo
−205）に対する細胞障害性の増大は観察されなかっ
た。これらの結果はLeu23抗原が細胞障害活性の検出よ
り前に発現され得ることを示している。誘導のために12
U/mlのrIL−２を用いると、細胞障害性はLeu23抗原の
“暗い”及び“明るい”の両方のレベルを発現したNK細
胞により媒介された。エフェクターと標的の種々の比率
において媒介される細胞障害性の比較は、高レベルのLe
u23抗原を発現しているNK細胞はLeu23を欠落しているか
又はこの抗原を低いレベルで発現しているNK細胞よりも
より溶菌性であることが示された。
IL−２による細胞活性化後何時間か以内に起こるLeu23
の発現と細胞障害性若しくは溶菌活性の相関性は、トラ
ンスフェリンもしくはIL−２レセプターの発現を待つこ
となく細胞障害性機能を監視するための手段を提供す
る。これは投与の前に細胞の活性化を確認する手段を臨
床医に提供し、その手段は改善された治療法を生むかも
しれない。
の発現と細胞障害性若しくは溶菌活性の相関性は、トラ
ンスフェリンもしくはIL−２レセプターの発現を待つこ
となく細胞障害性機能を監視するための手段を提供す
る。これは投与の前に細胞の活性化を確認する手段を臨
床医に提供し、その手段は改善された治療法を生むかも
しれない。
例えば、ローセンベルグ（Rosenberg）により提案され
ているLAK治療のための方法（米国特許第4,690,915号を
参照されたい、ここに参照により本明細書に取り込まれ
る）において、自己のLAK細胞を単離し静脈（I/V）投与
の前に３〜４日間rIL−２と混合した。細胞障害性活性
はNK−非感受性腫瘍細胞株を溶かすLAK細胞の活性によ
って測定された。
ているLAK治療のための方法（米国特許第4,690,915号を
参照されたい、ここに参照により本明細書に取り込まれ
る）において、自己のLAK細胞を単離し静脈（I/V）投与
の前に３〜４日間rIL−２と混合した。細胞障害性活性
はNK−非感受性腫瘍細胞株を溶かすLAK細胞の活性によ
って測定された。
この長い方法の別法として、rIL−２活性化細胞のサン
プルがAnti−Leu23と混合された。rIL−２活性化細胞の
染色は直接的蛍光（例えば、Anti−Leu23をFITC又はPE
のような蛍光色素やフィコビリンタンパクと結合させ
る）又は間接的な蛍光（例えば、FITC結合ヤギ抗−マウ
スIgを用いる）によって検出できる。いずれにしても、
活性化細胞の染色の程度は細胞障害性と相関している。
従って、サンプルが採取されている細胞は、その細胞が
効果的に活性化されていることを知ってから治療のため
に投与することができる。
プルがAnti−Leu23と混合された。rIL−２活性化細胞の
染色は直接的蛍光（例えば、Anti−Leu23をFITC又はPE
のような蛍光色素やフィコビリンタンパクと結合させ
る）又は間接的な蛍光（例えば、FITC結合ヤギ抗−マウ
スIgを用いる）によって検出できる。いずれにしても、
活性化細胞の染色の程度は細胞障害性と相関している。
従って、サンプルが採取されている細胞は、その細胞が
効果的に活性化されていることを知ってから治療のため
に投与することができる。
同様に、Ｔ細胞抗原レセプターのマイトジェン刺激とLe
u23の発現の相関は白血球の活性化を監視する別の手段
を提供する。第８図を参照すると、Ｔ白血球細胞株、ジ
ュルカット（Jurkat）はAnti−Leu4による一晩の刺激の
後Leu23を発現する。従って、Ｔ細胞抗原レセプターを
介して正常Ｔ細胞の特異的な抗原（例えば、アロ抗原、
ウイルス又は自己抗原）による生理学的刺激はLeu23の
発現を招くことができる。それゆえ、Anti−Leu23は、
例えばウイルス感染の兆候を示していると考えられるヒ
ト又は患者からの白血球と結合させることができる。An
ti−Leu23による直接もしくは間接的免疫蛍光を用いる
ことによって、Leu23は検出できる。治療を適切に処方
することができる。
u23の発現の相関は白血球の活性化を監視する別の手段
を提供する。第８図を参照すると、Ｔ白血球細胞株、ジ
ュルカット（Jurkat）はAnti−Leu4による一晩の刺激の
後Leu23を発現する。従って、Ｔ細胞抗原レセプターを
介して正常Ｔ細胞の特異的な抗原（例えば、アロ抗原、
ウイルス又は自己抗原）による生理学的刺激はLeu23の
発現を招くことができる。それゆえ、Anti−Leu23は、
例えばウイルス感染の兆候を示していると考えられるヒ
ト又は患者からの白血球と結合させることができる。An
ti−Leu23による直接もしくは間接的免疫蛍光を用いる
ことによって、Leu23は検出できる。治療を適切に処方
することができる。
結果的には、Leu23はIL−２刺激の結果として誘導され
且つリン酸化されることが分かった。LBD細胞を洗浄
し、1mMグルタミン（ギブコ（GIBCO））非−必須アミノ
酸、100μg/mlゲンタマイシン（ギブコ）及び２％熱不
活性化馬血清（KC バイオロジカルス（KC Biological
s））を補われた25mM HEPES（インビン・サイエンチフ
ィック（Irvin Scientific））と共にリン酸を含まない
緩衝液（MEM無リン酸エアーレの塩を修飾した）中で37
℃で１時間インキュベーションした。細胞は、1.25mCi/
ml［32P］−オルトリン酸（キャリアーを含まない、ア
マーシャム・コープ）及び800U/mlのrIL−２を含む無−
リン酸緩衝液中に再懸濁した。細胞を37℃で３時間イン
キュベーションし、そして0.1mM Na3VO4、0.4mM EDTA、
10mM Na4P2O7、10mM NaF及び0.1％NaN3を含む冷やされ
たPBS中で３回洗浄した。その後、細胞を溶解し、溶解
物及び溶出物を前述のように調製した。
且つリン酸化されることが分かった。LBD細胞を洗浄
し、1mMグルタミン（ギブコ（GIBCO））非−必須アミノ
酸、100μg/mlゲンタマイシン（ギブコ）及び２％熱不
活性化馬血清（KC バイオロジカルス（KC Biological
s））を補われた25mM HEPES（インビン・サイエンチフ
ィック（Irvin Scientific））と共にリン酸を含まない
緩衝液（MEM無リン酸エアーレの塩を修飾した）中で37
℃で１時間インキュベーションした。細胞は、1.25mCi/
ml［32P］−オルトリン酸（キャリアーを含まない、ア
マーシャム・コープ）及び800U/mlのrIL−２を含む無−
リン酸緩衝液中に再懸濁した。細胞を37℃で３時間イン
キュベーションし、そして0.1mM Na3VO4、0.4mM EDTA、
10mM Na4P2O7、10mM NaF及び0.1％NaN3を含む冷やされ
たPBS中で３回洗浄した。その後、細胞を溶解し、溶解
物及び溶出物を前述のように調製した。
第７図を参照すると、32kD及び28kDサブユニットからな
るジスルフィド結合した［32P］−標識タンパク質二量
体が検出された。これらのサブユニットは第１図Ｂに示
されたものと同一である。それゆえ、Leu23の誘導及び
リン酸化は、増殖因子レセプター、Ｔ細胞抗原レセプタ
ー複合体の成分及び膜に存在する他の糖タンパクをリン
酸化する細胞内プロタインキナーゼの活性化を招くリン
パ球刺激において観察される結果と類似している。
るジスルフィド結合した［32P］−標識タンパク質二量
体が検出された。これらのサブユニットは第１図Ｂに示
されたものと同一である。それゆえ、Leu23の誘導及び
リン酸化は、増殖因子レセプター、Ｔ細胞抗原レセプタ
ー複合体の成分及び膜に存在する他の糖タンパクをリン
酸化する細胞内プロタインキナーゼの活性化を招くリン
パ球刺激において観察される結果と類似している。
従って、Anti−Leu23は、外部からの共同因子もしくは
補助細胞が存在しない状態でIL−２にさらされた末梢血
NK細胞及びＴリンパ球のあるサブセット上に速やかに誘
導される抗原を同定する。NK細胞上にIL−２で誘導され
るLeu23の発現の反応機構は固体腫瘍標的に対する細胞
障害性機能の獲得と密接に関連しており、それによって
NK細胞の活性化についての有益なマーカーを提供でき
る。
補助細胞が存在しない状態でIL−２にさらされた末梢血
NK細胞及びＴリンパ球のあるサブセット上に速やかに誘
導される抗原を同定する。NK細胞上にIL−２で誘導され
るLeu23の発現の反応機構は固体腫瘍標的に対する細胞
障害性機能の獲得と密接に関連しており、それによって
NK細胞の活性化についての有益なマーカーを提供でき
る。
ここで開示された本発明の変更及び修飾は当業者にとっ
ては容易であろう。従って、これらの記載及び例を制限
的に把握するべきではない。
ては容易であろう。従って、これらの記載及び例を制限
的に把握するべきではない。
第１図Ａは、NK細胞、胸腺細胞及び抹消血Ｔリンパ球の
Anti−Leu23の免疫沈澱物のポリアクリルアミドゲル電
気泳動のオートラジオグラフである。 第１図Ｂは、SDS−PAGE分析によって２次元に分離され
た第１図Ａで得られた免疫沈澱物のオートラジオグラフ
である。 第２図は、SDS−PAGE分析により分離された第１図Ａで
得られた免疫沈澱物のオートラジオグラフである。 第３図は、rIL−２で活性化されたLBD、HBD及びNK細胞
についてフローサイトメトリーにより測定された蛍光の
ヒストグラムである。 第４図は、rIL−２中で培養されたLBL細胞についてのヒ
ストグラムである。 第５図は、IL−２中で培養されたLBD細胞についてのヒ
ストグラムである。 第６図Ａは、rIL−２中で培養されたLBD細胞についてヒ
ストグラムである。 第６図Ｂは、CD16+/Leu23-及びCD16+/Leu23+細胞につい
てのエフェクターと標的細胞の比率に対する細胞障害性
のパーセント比率のプロットである。 第７図は、２次元SDS−PAGEによる分析されたIL−２活
性化LBD細胞のLeu23及び対照との免疫沈澱物のオートラ
ジオグラフである。 第８図は、（ａ）Leu23と反応しない対照Mab又は（ｂ）
抗−CD3抗体（Anti−Leu4）によって一晩刺激され、Ant
i−Leu23（FITC）又はLeu23と反応しない対照Mabで標識
された白血病細胞株（Jurkat）についての蛍光のヒスト
グラムである。
Anti−Leu23の免疫沈澱物のポリアクリルアミドゲル電
気泳動のオートラジオグラフである。 第１図Ｂは、SDS−PAGE分析によって２次元に分離され
た第１図Ａで得られた免疫沈澱物のオートラジオグラフ
である。 第２図は、SDS−PAGE分析により分離された第１図Ａで
得られた免疫沈澱物のオートラジオグラフである。 第３図は、rIL−２で活性化されたLBD、HBD及びNK細胞
についてフローサイトメトリーにより測定された蛍光の
ヒストグラムである。 第４図は、rIL−２中で培養されたLBL細胞についてのヒ
ストグラムである。 第５図は、IL−２中で培養されたLBD細胞についてのヒ
ストグラムである。 第６図Ａは、rIL−２中で培養されたLBD細胞についてヒ
ストグラムである。 第６図Ｂは、CD16+/Leu23-及びCD16+/Leu23+細胞につい
てのエフェクターと標的細胞の比率に対する細胞障害性
のパーセント比率のプロットである。 第７図は、２次元SDS−PAGEによる分析されたIL−２活
性化LBD細胞のLeu23及び対照との免疫沈澱物のオートラ
ジオグラフである。 第８図は、（ａ）Leu23と反応しない対照Mab又は（ｂ）
抗−CD3抗体（Anti−Leu4）によって一晩刺激され、Ant
i−Leu23（FITC）又はLeu23と反応しない対照Mabで標識
された白血病細胞株（Jurkat）についての蛍光のヒスト
グラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ 33/577 Ｂ 33/58 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 アセナ・ヒュエイ―ジウアン・ディン アメリカ合衆国カリフォルニア州イース ト・パロ・アルト，ニューエル・コート ５ (72)発明者 エリザベス・エヴァンス アメリカ合衆国カリフォルニア州サラト ガ，メンデルソン 20040 (72)発明者 デービッド・ダブリュー・バック アメリカ合衆国カリフォルニア州・エル・ グラナダ，ピー・オー・ボックス 753 (72)発明者 ロリ・ローデス アメリカ合衆国カリフォルニア州・マウン テン・ビュー，ファーレー・ストリート 579
Claims (10)
- 【請求項１】IL−２により活性化された直後のNK細胞
上、低浮遊密度Ｔリンパ球のサブセット上、またはＴ細
胞抗原レセプター複合体の刺激後ある種のＴリンパ球上
に出現し、かつ、NK細胞、Ｔリンパ球または胸腺細胞の
IL−２依存性細胞株からプロテインＡを用いて精製され
る少なくとも２つのＮ−結合糖鎖を伴う24kDのサブユニ
ットのジスルフィド結合によるホモダイマーであること
を特徴とする抗原Leu23に対するモノクローナル抗体を
生産し、そして、 CD8+アロ抗原で誘導された細胞障害性Ｔリンパ球細胞で
免疫されたマウスの膝窩リンパ節とげっ歯類の骨髄腫細
胞との細胞融合により得られる、 ことを特徴とするATCC No.HB−9627のハイブリドー
マ。 - 【請求項２】IL−２により活性化された直後のNK細胞
上、低浮遊密度Ｔリンパ球のサブセット上、またはＴ細
胞抗原レセプター複合体の刺激後ある種のＴリンパ球上
に出現し、かつ、NK細胞、Ｔリンパ球または胸腺細胞の
IL−２依存性細胞株からプロテインＡを用いて精製され
る少なくとも２つのＮ−結合糖鎖を伴う24kDのサブユニ
ットがジスルフィド結合したホモダイマーであることを
特徴とする抗原Leu23に対するモノクローナル抗体であ
って、かつ、 CD8+アロ抗原で誘導された細胞障害性Ｔリンパ球細胞で
免疫されたマウスの膝窩リンパ節とげっ歯類の骨髄腫細
胞との細胞融合により得られるATCC No.HB−9627のハ
イブリドーマにより生産されることを特徴とする、モノ
クローナル抗体。 - 【請求項３】IL−２により活性化された直後のNK細胞
上、低浮遊密度Ｔリンパ球のサブセット上、またはＴ細
胞抗原レセプター複合体の刺激後ある種のＴリンパ球上
に出現し、かつ、NK細胞、Ｔリンパ球または胸腺細胞の
IL−２依存性細胞株からプロテインＡを用いて精製され
る少なくとも２つのＮ−結合糖鎖を伴う24kDのサブユニ
ットがジスルフィド結合したホモダイマーであることを
特徴とする抗原Leu23に対するモノクローナル抗体をサ
ンプルと混合し； 該モノクローナル抗体とサンプル中のLeu23との間の結
合物を直接的または間接的蛍光手段により標識し；そし
て、 フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡検査手段により
蛍光を検出する； 工程からなる、生化学サンプル中の白血球の活性化を監
視するための方法。 - 【請求項４】活性化白血球がＴリンパ球、Ｂリンパ球及
びNK細胞からなる群から選択される、請求項３記載の方
法。 - 【請求項５】活性化細胞がNK細胞である、請求項４記載
の方法。 - 【請求項６】活性化白血球がＴリンパ球である、請求項
４記載の方法。 - 【請求項７】モノクローナル抗体がAnti−Leu23であ
る、請求項４記載の方法。 - 【請求項８】活性化白血球とAnti−Leu23の結合を標識
するための手段が、Anti−Leu23を直接的に蛍光色素と
結合させることによる、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】蛍光色素がフルオレセインイソシアネート
及びフィコビリプロテインからなる群から選択される、
請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】白血球の活性化が、IL−２による活性化
であるか、または、外来の抗原、自己抗原、抗−Ｔ細胞
レセプター抗体もしくは抗−CD3抗体によるＴ細胞抗原
レセプターを介した活性化である、請求項３記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US146745 | 1980-05-05 | ||
| US14674588A | 1988-01-21 | 1988-01-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0216978A JPH0216978A (ja) | 1990-01-19 |
| JPH0795945B2 true JPH0795945B2 (ja) | 1995-10-18 |
Family
ID=22518821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1013005A Expired - Lifetime JPH0795945B2 (ja) | 1988-01-21 | 1989-01-21 | 白血球の活性化を監視するためのモノクローナル抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0325489B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0795945B2 (ja) |
| AT (1) | ATE100491T1 (ja) |
| DE (1) | DE68912353T2 (ja) |
| ES (1) | ES2061965T3 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1296622C (en) * | 1986-08-12 | 1992-03-03 | Jeffrey E. Anderson | Method and apparatus for automated assessment of the immunoregulatory status of the mononuclear leukocyte immune system |
| CA2011099A1 (en) * | 1989-04-19 | 1990-10-19 | Stephen C. Wardlaw | Determination of lymphocyte reactivity to specific antigens in blood |
| AU3081000A (en) * | 1998-12-24 | 2000-07-31 | Glaxowellcome B.V. | Detection of preactivated phagocytes |
| JP7198302B2 (ja) * | 2021-03-08 | 2022-12-28 | 一般財団法人 化学物質評価研究機構 | Ｐｄ－１を介した免疫チェックポイント阻害剤の生物活性試験法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4607007A (en) * | 1983-04-07 | 1986-08-19 | Becton, Dickinson And Company | Differentiation of natural killer cell subpopulations of cells |
| US4599304A (en) * | 1983-10-07 | 1986-07-08 | Becton, Dickinson And Company | Method for monitoring activated cell subpopulations |
| JPS60231699A (ja) * | 1983-11-09 | 1985-11-18 | Aichiken | 正常及び悪性ヒト造血器細胞に対するモノクローナル抗体 |
-
1989
- 1989-01-20 AT AT89300570T patent/ATE100491T1/de active
- 1989-01-20 EP EP89300570A patent/EP0325489B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-20 ES ES89300570T patent/ES2061965T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-20 DE DE68912353T patent/DE68912353T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-21 JP JP1013005A patent/JPH0795945B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2061965T3 (es) | 1994-12-16 |
| ATE100491T1 (de) | 1994-02-15 |
| JPH0216978A (ja) | 1990-01-19 |
| EP0325489B1 (en) | 1994-01-19 |
| EP0325489A1 (en) | 1989-07-26 |
| DE68912353T2 (de) | 1994-06-23 |
| DE68912353D1 (de) | 1994-03-03 |
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