JPH0795945B2 - 白血球の活性化を監視するためのモノクローナル抗体 - Google Patents

白血球の活性化を監視するためのモノクローナル抗体

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JPH0795945B2
JPH0795945B2 JP1013005A JP1300589A JPH0795945B2 JP H0795945 B2 JPH0795945 B2 JP H0795945B2 JP 1013005 A JP1013005 A JP 1013005A JP 1300589 A JP1300589 A JP 1300589A JP H0795945 B2 JPH0795945 B2 JP H0795945B2
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leu23
lymphocytes
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antigen
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エリザベス・エヴァンス
デービッド・ダブリュー・バック
ロリ・ローデス
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ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー
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Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、白血球の活性化の監視に有益なモノクローナ
ル抗体(MAb)に関し、更に詳細には、インターロイキ
ン−2(IL−2)により活性化された直後のナチュラル
キラー(NK)細胞上、低浮遊密度(LBD)Tリンパ球の
サブセット上及びT細胞抗原レセプター複合体の刺激後
ある種のTリンパ球上に出現する抗原、即ちLeu23と結
合するモノクローナル抗体に関する。
(従来の技術) IL−2は、Tリンパ球及びNK細胞の両方の増殖を可能に
し且つ細胞障害機能を発揮させる。IL−2(もしくは組
み換えIL−2)にさらすと、末梢血から単離された休止
状態のNK細胞は活性化後4時間以内に強化された細胞障
害活性を示す。この細胞障害活性は18時間後に最大にな
る。
これとは対照的に、殆どの抹消血の白血球は単独のIL−
2に対しては応答しない。増殖を誘導するためには更に
IL−1又はプロテインキナーゼCのようなシグナルが要
求される。しかしながら、LBD T細胞のサブセットは
単独のIL−2にたいして応答し、そしてそれにより“感
作された”状態のように見える。
一旦活性化されると、白血球は種々の新しい表面抗原を
発現する。例えば、IL−2による活性化後のNK細胞は、
トランスフェリンレセプター、HLA−DR及びCD25 IL−
2レセプターを発現する。しかし、これらの抗原は、NK
細胞が最も細胞障害性である4〜18時間目の期間経過後
しばらくまで大多数の細胞上には発現されない。従っ
て、NK活性化及び細胞障害性機能とこれらの抗原の発現
との間には直接的な相関関係はない。結論としては、活
性化の効果を測定する手段は最大細胞障害性が終わるま
でないことになる。
NK細胞の活性化の効果を測定すること及びその後の細胞
障害剤としてのそれらの効果は、例えば、ある種の病気
の治療において重要である。最近、ローセンベルグ(Ro
senberg)らは、エヌ・エング・ジェイ・メド(N.Eng.
J.Med.)164:814(1985)及びローセンベルグの米国特
許第4,690,915号において、インビボ(in vivo)でのIL
−2の使用とインビトロ(in vitro)でIL−2で活性化
された患者の自己由来リンパ球の投与との組み合わせを
含む癌治療の方法を提案している。投与の前に最大の治
療効果を保証するためにリンパ球の活性化を測定するこ
とは有益である。
IL−2による白血球の活性化に加えて、T細胞を、例え
ばそのT細胞抗原レセプター複合体との相互作用により
刺激することが可能であり、その複合体は抗原レセプタ
ー中のアルファー及びベーター鎖からなっており、そし
て出現しCD3+複合体と命名されている数種の他の蛋白質
と複合体を形成する。そのT細胞抗原レセプターは外来
抗原(例えば、アロ抗原及びウイルス)の認識を行って
おり、更に活性化T細胞に免疫応答を生じさせることが
できるある種のトランスフォーメションを行わせる。ま
た、T細胞抗原レセプター複合体を介して刺激された細
胞を同定するためのマーカーがあれば更に有益である。
ハラ(Hara)ら(ヒトT細胞活性化:III、12−0−テト
ラデカノイル ホルボール−13−アセテート、マイトジ
ェンおよび抗原によるリン酸化28kD/32kDジスルフィド
結合初期活性化抗原(EA−1)の迅速誘導、ジェイ・エ
クスプ・メド(J.Exp.Med.)164:1988(1986)及びコス
リチ(Cosulich)ら(T細胞活性化の初期段階において
含まれる抗原(MLR3)の機能的特徴、プナス(PNAS)、
84:4205(1987))は、最近活性化後短時間の内にT細
胞上に発現される表面抗原について述べている。これら
の抗原、EA−1及びMLR3は夫々28kD及び32kDの主成分を
有する糖タンパク質である。EA−1及びMLR3はHLAクラ
スII抗原ではなく、そしてMLR3MAbはIL−1結合をブロ
ックする。これらの抗原は活性化後18時間以内にT細胞
上に出現し、そして48時間目でも存在している。
これらの抗原は活性化を検出において有益であるが、本
発明は白血球、及び特にNK細胞及びT細胞のサブセット
の活性化を検出する別の手段を提供する。
(課題を解決するための手段) L78は、CD8+アロ抗原−誘導化細胞障害性Tリンパ球(C
TL)細胞株によって免疫されたBalb/cマウスの膝窩リン
パ節由来の細胞とげっ歯類の骨髄腫細胞株SP2/0 Ag 14
とで形成されるマウスのハイブリドーマである。融合細
胞を培養し、そしてアザセリン−ヒポキサンチン培地で
選択した。クローンLR3−8H3が選択され、そしてそれを
L78と再命名した。L78はブタペスト条約の規定に従って
国際寄託としてATCCに寄託番号HB−9627として寄託され
ている。
L184は、rIL−2活性化NK細胞で免疫されたBalb/cマウ
スからの脾細胞とネズミの骨髄腫細胞株SP2/0 Ag 14と
で形成されるマウスのハイブリドーマである。クローン
E14/A97が単離され、そしてそれをL184と再命名した。L
184はジョー・フィリップス(Joe Phillips)博士の研
究室(ベクテン・ディキンソン・イムノサイトメトリー
・システムズ(Beckton Dickinson Immunocytometory S
ysytems))に保管されている。L78及びL184によって生
産されるモノクローナル抗体はAnti−Leu23として命名
され、それらはIgG1イソタイプを有している。
Anti−Leu23は、活性化及び抗原刺激された白血球上の
細胞表面抗原を認識する。rIL−2活性化NK細胞上に、
活性化後4時間以内にその抗原、Leu23が発現し、活性
化後72時間は発現され続ける。Leu23は、少なくとも2
個のN−結合炭水化物を伴う24kDのサブユニットからな
るジスルフィド−結合ホモダイマーである。Leu23はIL
−2に依存する過程によって誘導され且つリン酸化され
る。
NK細胞上のLeu23の出現は細胞障害性の発達と関連して
いること及びある種のT細胞上のLeu23の出現はそのT
細胞抗原レセプター複合体の刺激に関連していることか
ら、Anti−Leu23は白血球の活性化又は刺激を監視する
ことにおいて有益である。
第1図Aは、5% 2−メルカプトエタノール(2−ME)
を含む若しくは含まない2.3%ドデシル硫酸ナトリウム
(SDS)中での125I−標識されたrIL−2活性化NK細胞、
胸腺細胞及び抹消血Tリンパ球のAnti−Leu23と免疫沈
澱物を、10%ポリアクリルアミドを用いたポリアクリル
アミドゲル電気泳動(PAGE)で分離したオートラジオグ
ラフである。
第1図Bは、第1次元においては非還元状態で7.5%ポ
リアクリルアミドで電気泳動し、第2次元においては還
元状態で10%ポリアクリルアミドで電気泳動するSDS−P
AGE分析によって2次元に分離された第1図Aで得られ
125I−認識されたIL−2活性化胸腺細胞とAnti−Leu2
3との免疫沈澱物のオートラジオグラフである。
第2図は、免疫沈澱物をエンド−B−N−アセチルグル
コサミニダーゼF(エンドF)を用いて脱糖鎖し、10%
ポリアクリルアミドでSDS−PAGE分析により分離された
第1図Aで得られた125I−標識されたIL−2活性化胸腺
細胞とAnti−Leu23との免疫沈澱物のオートラジオグラ
フである。
第3図は、500U/mlのrIL−2で活性化されたLBD、HBD及
びNK細胞について活性化後0、2、6及び18時間後にフ
ローサイトメトリーにより測定された蛍光のヒストグラ
ムであって、活性化細胞は、対照としてフルオレセイン
イソチオシアネート(FITC)結合IgG及びフィコエリト
リン(PE)結合抗−IgG;NK細胞(CD16+)についてのAnt
i−Leu11(FITC)及びAnti−Leu23(PE);及びLBD及び
HBD(CD3+)についてのAnti−Leu4(FITC)及びAnti−L
eu23(PE);で標識されている。
第4図は、500U/mlのrIL−2中で培養されたLBD細胞に
ついてのヒストグラムであって、18時間後に、対照は第
3図と同じ;CD16抗原についてのAnti−Leu23(FITC)及
びAnti−Leu11(PE);HLA−DR抗原についてのAnti−Leu
11(FITC)及び抗−HLA−DR(PE);及びIL−2レセプ
ター抗原についてのAnti−Leu11(FITC)及び抗−IL−2
R(PE)で標識されている。
第5図は、種々の濃度のIL−2中で培養されたLBD細胞
についてのヒストグラムであって、18時間後に第3図の
対照及びAnti−Leu11(FITC)及びAnti−Leu23(PE)で
標識されている。
第6図Aは、6U/ml又は12U/mlのrIL−2中で培養された
LBD細胞についてヒストグラムであって、18時間後にAnt
i−Leu23(FITC)及びAnti−Leu11(PE)で標識されて
いる。
第6図Bは、51Cr−標識Colo−205癌標的細胞に対する
試験における、未分類のLBD、FACS440TMフローサイトメ
トリー装置により第6図Aから分類され単離されたCD16
+/Leu23-及びCD16+/Leu23+細胞についてのエフェクター
と標的細胞の比率に対する細胞障害性のパーセント比率
のプロットである。
第7図は、第1図Bで述べられた10%ポリアクリルアミ
ドによる2次元SDS−PAGEによる分析された[32P]−オ
ルトリン酸で標識されたIL−2活性化LBD細胞のLeu23及
び対照免疫沈澱物のオートラジオグラフである。
第8図は、(a)Leu23と反応しない対照Mab又は(b)
抗−CD3抗体(Anti−Leu4)によって一晩刺激され、Ant
i−Leu23(FITC)又はLeu23と反応しない対照Mabで標識
された白血病細胞株(Jurkat)についての蛍光のヒスト
グラムである。
L78ハイブリドーマ及びそれにより生産されるAnti−Leu
23MAbは次のようにして調製された。5×105個のCD8+
ロ抗原−誘導化細胞障害性リンパ球細胞株(ElxPGF/J
Y、ベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリー・
システムズのベティ・エバンス(Betty Evans)博士か
ら入手)をBalb/cマウスの足蹠に0、4、7、11、14及
び18日目に注射した。
19日目、マウスを殺しその膝窩リンパ節を切り取った。
そして、細胞を不滅形質細胞腫融合パートナーSP2/0 Ag
14(シュルマン(Shulman)ら、ネイチャー(Natur
e)、276:269(1978))と35%ポリエチレングリコール
中で融合させた。同様の方法及び脾細胞の調製及び融合
が米国特許第4,172,124号及び第4,196,265号に開示され
ており、ここに参照により本明細書に含められる。
融合によって得られる生細胞を、20%牛胎児血清(KCバ
イオロジカルス(KC Biologicals))を含むヅルベッコ
(Dulbecco)の修飾イーグル培地(DMEM,ギブコ(GIBC
O))の入った96穴マイクロカルチャープレートに撒い
た。15mMのHEPES(ギブコ)溶液及びアザセリン−ヒポ
キサンチン(それぞれ2μg/ml及び10-4Mの最終濃度と
なるように)をブック(Buck)らの方法(プレヌム・パ
ブリシング・コープ(Plenum Publishing Corp.)のケ
ッネット(Kennett)ら編集の“モノクロナール抗体及
び機能的細胞株”(1984)の中の、ヒトモノクローナル
抗体の生産)に従って選択培地として各穴(ウエル)に
添加した。この培地の中で増殖したハイブリドーマは、
融合後直ぐに死滅する融合していない骨髄腫細胞及び脾
細胞から分離された。インキュベーションは目視できる
コロニーが出現するまで7〜10日間続けられた。
細胞が増殖した各穴から得られた上清液は、最初に陽性
選択としてCTLを用いたパンデックス免疫アッセイ(パ
ンデックス・ラボラトリーズ・インク(Pandex Laborat
ories Inc.))によってスクリーニングした。5×105
個のCTLを96穴パンデックスプレートの各穴に添加し
た。各穴には25〜50μの上清液を添加した。30分後、
細胞を0.15Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。
そして、フルオレセインイソチオシアネートと結合した
ヤギ抗−マウスIg抗体を各穴に添加した。免疫アッセイ
で得られた結果はパンデックス装置を用いて読み取っ
た。
陽性を示した上清液の入った各穴からの細胞を24穴マイ
クロカルチャープレートに再び撒き、選択培地を含まな
いDMEM中で増殖させた。それらの穴の各々から得られた
上清液は、その上清液をrIL−2(シータス・コープ(C
etus Corp.))活性化Tリンパ球又は休止状態の末梢血
白血球のどちらかが入った穴に添加することによって再
びスクリーニングされた。ヤギ抗−マウスIg(FITC)を
各穴に添加した。これらの穴から得られた染色された細
胞はフローサイトメトリー装置(FACS440TM)による分
析に供される。
染色された細胞は前方及び直角方向の散乱及び蛍光につ
いて調べられた。そして、ゲートがリンパ球集団につい
て設定された。この分析から、クローンLR3−8H3が選択
された。それはブタペスト条約の規定に基づいて寄託番
号HB−9627としてATCCに寄託された。そのハイブリドー
マはL78と命名された。
しかし、L78はLeu23と結合できるMAbを生産する唯一の
ハイブリドーマではない。ジョー・フィリップス(Joe
Philips)博士の研究室(ベクトン・ディキンソン・イ
ムノサイトメトリー・システムズ)に保管されているL1
84は、Anti−Leu23Mabを生産するハイブリドーマであ
る。
L184は、前もってrIL−2中で1週間活性化され、Leu11
+で分類されたNK細胞でBalb/cマウスを免疫することに
よって開発された。ここで免疫原として使用されるCTL
細胞株及びNK細胞は活性化リンパ球からなる。マウスは
以下のスケジュールに従って活性化NK細胞で免疫され
た:2×106個のNK細胞を腹腔内(I/P)に0、28、35、42
及び49日目;及び2×106個のNK細胞を静脈内(I/V)に
50、51、52及び53日目に免疫した。
54日目に、脾臓を切り取り、上記と同様に脾細胞をSP2/
0 Ag 14細胞株と融合した。選択方法は同様に行い、最
終的にE14/A97が選択された。クローンE14/A97はL184と
再命名された。
L78及びL184によって生産されるモノクロナール抗体はA
nti−Leu23と命名された。それらはIgG1イソタイプを有
している。それらは、それらと反応する抗原によって更
に特徴ずけられている。
Anti−Leu23は本質的には全てのIL−2活性化CD16+NK細
胞と反応する。同様に、Anti−Leu23は、IL−2依存性C
D8+CTL細胞株、CD4+破傷風特異性ヘルパーT細胞クロー
ン、IL−2依存胸腺細胞及びマイトジェン活性化Tリン
パ球と反応する。これら夫々の細胞種とAnti−Leu23の
結合は、FITC又はPE標識Anti−Leu23及び夫々他の細胞
種についての相捕的MAbを使用する直接又は間接免疫蛍
光によって評価された。これらのMAb(例えば、Anti−L
eu11(CD16)、Anti−Leu4(CD3)及びAnti−Leu12(CD
19))及びその他ここで記載されているものは特に断ら
ない限りベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリ
ー・システムズより市販されている。標識された細胞は
フローサイトメトリー、コンソート40データ分析システ
ムが組み込まれた装置FACS440TM(両方ともベクトン・
ディキンソン・イムノサイトメトリー・システムズより
市販されている)によって分析された。これらの分析か
ら得られた結果を表1に示した。
Leu23は活性化白血球においては優勢であるが、増殖し
ている細胞においては優先的に発現されない。複数の培
養されたT白血病細胞株(例えば、HPB−ALL、PEER及び
CEM)はLeu23を発現しない。同様に、EBVでトランスフ
ォームされたBリンパ芽球様細胞株、CCRF−SBはLeu23
を発現しない。従って、Leu23は本質的には増殖につい
てのマーカーとはならないが、活性化白血球には分布し
ている。
Leu23抗原の生化学的分析を、異なった細胞種が同一の
抗原を発現することを示すために行った。単核細胞がフ
ィコール/ヒパクエ(Ficoll/Hypaque)(ファルマシア
(Pharmacia))を用いて正常末梢血から単離された。
プラスチックのペトリ血(B−Dファルコン(Falco
n))に固着させた後、単球及びBリンパ球を夫々除去
するためにナイロン綿を通過させ、残った細胞をリンパ
酸緩衝生理食塩水(PBS)中で不連続パーコール(Perco
ll)(ファルマシア)勾配上での遠心分離により分画し
た。そのLBD画分はNK細胞(CD16+)及びTリンパ球(CD
3+)を含んでいる。その高浮遊密度(HBD)画分には休
止状態のTリンパ球を含んでいた。胸腺細胞は心臓外科
手術を受けている子供から得た。
胸腺細胞、Tリンパ球及びNK細胞をrIL−2を含んでい
る培地中で2週間培養した。培養されたNK細胞、T細胞
及び胸腺細胞はケスキーオジャ(Keski−Oja)らのグル
コースオキシダーゼ/ラクトパーオキシダーゼ法(バイ
オケム・バイオフィシ・レス・コム(Biochem.Biophys.
Res.Comm.)74:699(1977))によって125I(アマーシ
ャム・コープ(Amersham Corp.))で標識された。細胞
を5mMの3[3−コルアミドプロピル−ジメチルアンモ
ニオ]−1−プロパンスルフェート(CHAPS)界面活性
剤、20KIユニット/mlのアプロチニン(aprotinin)(シ
グマ(Siguma))及び1mMフェニルメタンスルホニルフ
ルオリド(PMSF)(シグマ)を含む溶解緩衝液(50mMト
リス塩酸、150mM Nacl、0.02%ナトリウムアザイド、pH
8.0)に溶かした。取り込まれなかった125Iをダウエク
ス(Dowex)1x8−400イオン交換樹脂(シグマ)を用い
て除去し、溶解物はウサギ抗−マウスIg血清(ペル−フ
レッツ・バイオロジカルス(Pel−Frez Biological
s))又はAnti−Leu23で被覆されたプロタインAを持っ
ているホルマリンで固定されたスタフィロコッカス・ア
ウレウス(Staphylococcus aureus)によって予備精製
した。免疫複合体は、5%2−MEを含むか又は含まない
2.3%SDSを含んでいるサンプル緩衝液中で溶出された。
そして、1又は2次元電気泳動を行った。
第1図Aに示されるように、本質的に同一の構造物がNK
細胞、Tリンパ球及び胸腺細胞のIL−2依存性細胞株か
ら免疫沈澱した。Anti−Leu23はジスルフィド結合した5
0〜60kDの糖タンパク質を免疫沈澱し、その糖タンパク
質は還元により32kD及び28kDのサブユニットに解離し
た。第1図Bにおいては、二次元“対角"SDS−PAGE分析
によりサブユニットのジスルフィド結合を確認し、その
対角分析でのサブユニットの相対移動度はこれらのタン
パク質が32kD+32kD、32kD+28kD及び28kD+28kDタンパ
ク質の二量体を形成できることを示している。
より詳しい分析は糖鎖の状態を示している。Leu23は50m
M EDTA、1%2−ME及び1%SDSを含む20μのリン酸
緩衝液(0.1M、pH6.1)を添加することによって前述の
スタフィロコッカス・アウレウス/免疫複合体から溶出
した。20分間のインキュベーションの後、複合体を遠心
分離し、溶出物を除去し、そしてペレットを50mM EDTA
及び1%NP−40を含むリン酸緩衝液中で10倍に希釈し
た。その25μをミクロフーゲ(microfuge)管に入れ
た。エンドーF(ニュー・イングランド・ヌークレアー
(New England Nuclear))を最終濃度が23U/mlとなる
ように加えて、サンプルを37℃で16時間インキュベーシ
ョンした。そして10%2−MEを含む等しい体積の2Xサン
プル緩衝液を分解を止めるために添加して沸騰した湯浴
中に5分間浸けた。そして、SDS−PAGE分析を行った。
予め決められた最適濃度のエンドF酵素による抗原の脱
糖鎖は24kDの単一のタンパクを示した。第2図を参照さ
れたい。部分的に脱糖鎖されたものは28kDの相対移動度
で観察された。エンドFはペプチドにアスパラギンを介
して結合している炭水化物の高マンノース型及び複合型
の両方を切断するので、Leu23抗原は少なくとも2部位
のN−結合糖鎖を伴う24kDのタンパクであることが明ら
かである。変化していない及び脱糖鎖したLeu23抗原の
二次元NEPHGE分析は、32kD及び28kDのサブユニットは単
一のN−結合炭水化物の付加によって区別される同一の
ポリペプチドに相当しているようであることを示してい
る。糖鎖が取り除かれた24kDタンパク質は、エンドF処
理に対して抵抗性のあるアスパラギン結合オリゴ糖を加
水分解できる酵素であるN−グリカナーゼによる更なる
分解に対して抵抗性であた。糖鎖を除去された24kDタン
パク質中に観察される僅かな差異はNEPHGE分析中の尿素
によるタンパク質のカルバミル化によって生じたのか、
又は酵素抵抗性炭水化物若しくはO−結合オリゴ糖の存
在によるものであろう。
Leu23の構造的特徴に加えて、その抗原は単一に制御さ
れているようであり、そして活性化又は刺激を監視/検
出するための方法を提供している。Leu23の発現に必要
な条件が決定された。
LBD及びHBDは前述のようにジェイ・エッチ・フィリップ
ス(J.H.Phillips)、エヌ・エル・ワーナー(N.L.Warn
er)及びエル・エル・ラニエル(L.L.Lanier)(ナット
・イミュン・セル・グロース・レグル(Nat.Immun.Cell
Growth Regul)3:73(1984))らの方法により単離し
た。リンパ球を500U/mlのrIL−2中で培養し、その一部
を2、6、及び18時間培養後に取り出した。細胞はPE−
結合Anti−Leu23及び、NK細胞を同定するためのFITC−
結合Anti−Leu11(CD16)又はTリンパ球を同定するた
めのFITC結合Anti−Leu4(CD3)の2色免疫蛍光によっ
て染色した。
rIL−2による刺激の前には、Leu23はLBD(大きい)T
細胞又はHBD(小さい)T細胞上には検出されず、NK細
胞のうち少数のものに少量が存在した。第3図を参照さ
れたい。しかし、Leu23はrIL−2刺激後6時間までにNK
細胞の大多数及びLBD画分中のTリンパ球のあるサブセ
ット上に検出された。18時間以内には、rIL−2で刺激
された実質的に全てのNK細胞がLeu23を発現した。これ
に反して、rIL−2で刺激されたNK細胞のうちほんの僅
かのものだけがトランスフェリンレセプターHLA−DR又
はCD25を発現した。第4図を参照されたい。全てのNK細
胞がrIL−2にさらしてから18時間以内にLeu23を発現し
たので、これは全てのNK細胞がIL−2応答性であること
を示している。rIL−2と共に培養液中に72時間維持さ
れたNK細胞は変わり無くLeu23陽性であり続けた。全て
のNK細胞がLeu23を得たにもかかわらず、rIL−2と共に
72時間の培養後でさえLBD画分においてはT細胞のある
サブセットのみがこの抗原を発現した。LBD画分の中の
Tリンパ球に対して、rIL−2は、72時間の培養後でさ
えHBD(第3図)中の小さな休止状態のTリンパ休の検
出可能な程度の比率の細胞上にはLeu23の発現を誘導し
なかった。
IL−2によるLeu23抗原の誘導は濃度に依存している。
第5図を参照すると、18時間の培養後、低いレベルのLe
u23抗原が3U/mlのrIL−2でNK細胞上に誘導され、そし
て100U/mlのrIL−2では殆どのNK細胞上に抗原を誘導す
るのに十分であった。IL−2はNK細胞上にLeu23の発現
を誘導するために必要にして十分であった。FACS440TM
細胞分類装置を用いてLBD画分からCD16+リンパ球を単離
することによって精製されたNK細胞は、rIL−2と共に1
8時間培養した後Leu23の発現を獲得した。Tリンパ球、
単球、又はその他の補助細胞はIL−2がNK細胞上のLeu2
3の発現を誘導するためには必要ではなかった。
IL−2強化細胞障害性とLeu23の発現の関連を測定する
ために更に研究を行った。LBD細胞を血清を含まない培
地中で100U/mlrIL−2と共に18時間、ウサギもしくはヤ
ギの中和用抗−IL−2血清の存在下又は不存在下で培養
した。
ヤギ抗−IL−2は100U/mlのrIL−2を完全に中和できる
濃度で使用した。ウサギ抗−IL−2(ゲンチーム(Genz
yme))は100U/mlのrIL−2の50%を中和できる濃度で
使用した。18時間後、細胞を採取し、エフェクターと標
的細胞の比率が12:1の条件で51Cr標識(アマーシャム)
された標的細胞(即ち、Colo−205,ATCC No.CCL222)
に対する細胞障害性について4時間細胞を分析した。こ
れらの細胞はFITC−結合対照IgG又はAnti−Leu23(FIT
C)で染色して後フローサイトメトリーによって更に分
析された。
表2に示されるように、結腸癌細胞株に対するIL−2強
化細胞障害性及びNK細胞上のLeu23の誘導の両方とも中
和抗血清により同程度に阻害された。細胞障害性の阻害
とLeu23抗原誘導の阻害の間には定量的な関係が存在す
る。これらの結果は両方の現象がIL−2依存性であり、
そして同時に制御されている事象である可能性を示して
いる。
第6図Aを参照すると、Leu23抗原発現のレベルが溶解
活性と関連しているかどうかを調べるために実験が行わ
れた。LBD細胞は6U/ml及び12U/mlのrIL−2と共に18時
間培養し、そしてFITC結合Anti−Leu11及びPE結合Anti
−Leu23で染色した。このような条件の下では低いレベ
ルのLeu23がCD16+NK細胞集団上に誘導された。明確な陰
性又は陽性のLeu23のサブセットは明らかではないが、
陰性または低いレベル(又は“暗い”)のLeu23抗原を
発現するCD16+NK細胞及び比較的高いレベル(又は“明
るい”)のLeu23抗原を発現するCD16+NK細胞を同定する
ことが可能であった。
第6図Bを参照すると、誘導に6U/mlのrIL−2を使用す
ると、たとえ低いレベルのLeu23抗原がNK細胞集団で検
出されたとしても、NK−非感受性の結腸癌細胞株(Colo
−205)に対する細胞障害性の増大は観察されなかっ
た。これらの結果はLeu23抗原が細胞障害活性の検出よ
り前に発現され得ることを示している。誘導のために12
U/mlのrIL−2を用いると、細胞障害性はLeu23抗原の
“暗い”及び“明るい”の両方のレベルを発現したNK細
胞により媒介された。エフェクターと標的の種々の比率
において媒介される細胞障害性の比較は、高レベルのLe
u23抗原を発現しているNK細胞はLeu23を欠落しているか
又はこの抗原を低いレベルで発現しているNK細胞よりも
より溶菌性であることが示された。
IL−2による細胞活性化後何時間か以内に起こるLeu23
の発現と細胞障害性若しくは溶菌活性の相関性は、トラ
ンスフェリンもしくはIL−2レセプターの発現を待つこ
となく細胞障害性機能を監視するための手段を提供す
る。これは投与の前に細胞の活性化を確認する手段を臨
床医に提供し、その手段は改善された治療法を生むかも
しれない。
例えば、ローセンベルグ(Rosenberg)により提案され
ているLAK治療のための方法(米国特許第4,690,915号を
参照されたい、ここに参照により本明細書に取り込まれ
る)において、自己のLAK細胞を単離し静脈(I/V)投与
の前に3〜4日間rIL−2と混合した。細胞障害性活性
はNK−非感受性腫瘍細胞株を溶かすLAK細胞の活性によ
って測定された。
この長い方法の別法として、rIL−2活性化細胞のサン
プルがAnti−Leu23と混合された。rIL−2活性化細胞の
染色は直接的蛍光(例えば、Anti−Leu23をFITC又はPE
のような蛍光色素やフィコビリンタンパクと結合させ
る)又は間接的な蛍光(例えば、FITC結合ヤギ抗−マウ
スIgを用いる)によって検出できる。いずれにしても、
活性化細胞の染色の程度は細胞障害性と相関している。
従って、サンプルが採取されている細胞は、その細胞が
効果的に活性化されていることを知ってから治療のため
に投与することができる。
同様に、T細胞抗原レセプターのマイトジェン刺激とLe
u23の発現の相関は白血球の活性化を監視する別の手段
を提供する。第8図を参照すると、T白血球細胞株、ジ
ュルカット(Jurkat)はAnti−Leu4による一晩の刺激の
後Leu23を発現する。従って、T細胞抗原レセプターを
介して正常T細胞の特異的な抗原(例えば、アロ抗原、
ウイルス又は自己抗原)による生理学的刺激はLeu23の
発現を招くことができる。それゆえ、Anti−Leu23は、
例えばウイルス感染の兆候を示していると考えられるヒ
ト又は患者からの白血球と結合させることができる。An
ti−Leu23による直接もしくは間接的免疫蛍光を用いる
ことによって、Leu23は検出できる。治療を適切に処方
することができる。
結果的には、Leu23はIL−2刺激の結果として誘導され
且つリン酸化されることが分かった。LBD細胞を洗浄
し、1mMグルタミン(ギブコ(GIBCO))非−必須アミノ
酸、100μg/mlゲンタマイシン(ギブコ)及び2%熱不
活性化馬血清(KC バイオロジカルス(KC Biological
s))を補われた25mM HEPES(インビン・サイエンチフ
ィック(Irvin Scientific))と共にリン酸を含まない
緩衝液(MEM無リン酸エアーレの塩を修飾した)中で37
℃で1時間インキュベーションした。細胞は、1.25mCi/
ml[32P]−オルトリン酸(キャリアーを含まない、ア
マーシャム・コープ)及び800U/mlのrIL−2を含む無−
リン酸緩衝液中に再懸濁した。細胞を37℃で3時間イン
キュベーションし、そして0.1mM Na3VO4、0.4mM EDTA、
10mM Na4P2O7、10mM NaF及び0.1%NaN3を含む冷やされ
たPBS中で3回洗浄した。その後、細胞を溶解し、溶解
物及び溶出物を前述のように調製した。
第7図を参照すると、32kD及び28kDサブユニットからな
るジスルフィド結合した[32P]−標識タンパク質二量
体が検出された。これらのサブユニットは第1図Bに示
されたものと同一である。それゆえ、Leu23の誘導及び
リン酸化は、増殖因子レセプター、T細胞抗原レセプタ
ー複合体の成分及び膜に存在する他の糖タンパクをリン
酸化する細胞内プロタインキナーゼの活性化を招くリン
パ球刺激において観察される結果と類似している。
従って、Anti−Leu23は、外部からの共同因子もしくは
補助細胞が存在しない状態でIL−2にさらされた末梢血
NK細胞及びTリンパ球のあるサブセット上に速やかに誘
導される抗原を同定する。NK細胞上にIL−2で誘導され
るLeu23の発現の反応機構は固体腫瘍標的に対する細胞
障害性機能の獲得と密接に関連しており、それによって
NK細胞の活性化についての有益なマーカーを提供でき
る。
ここで開示された本発明の変更及び修飾は当業者にとっ
ては容易であろう。従って、これらの記載及び例を制限
的に把握するべきではない。
【図面の簡単な説明】
第1図Aは、NK細胞、胸腺細胞及び抹消血Tリンパ球の
Anti−Leu23の免疫沈澱物のポリアクリルアミドゲル電
気泳動のオートラジオグラフである。 第1図Bは、SDS−PAGE分析によって2次元に分離され
た第1図Aで得られた免疫沈澱物のオートラジオグラフ
である。 第2図は、SDS−PAGE分析により分離された第1図Aで
得られた免疫沈澱物のオートラジオグラフである。 第3図は、rIL−2で活性化されたLBD、HBD及びNK細胞
についてフローサイトメトリーにより測定された蛍光の
ヒストグラムである。 第4図は、rIL−2中で培養されたLBL細胞についてのヒ
ストグラムである。 第5図は、IL−2中で培養されたLBD細胞についてのヒ
ストグラムである。 第6図Aは、rIL−2中で培養されたLBD細胞についてヒ
ストグラムである。 第6図Bは、CD16+/Leu23-及びCD16+/Leu23+細胞につい
てのエフェクターと標的細胞の比率に対する細胞障害性
のパーセント比率のプロットである。 第7図は、2次元SDS−PAGEによる分析されたIL−2活
性化LBD細胞のLeu23及び対照との免疫沈澱物のオートラ
ジオグラフである。 第8図は、(a)Leu23と反応しない対照Mab又は(b)
抗−CD3抗体(Anti−Leu4)によって一晩刺激され、Ant
i−Leu23(FITC)又はLeu23と反応しない対照Mabで標識
された白血病細胞株(Jurkat)についての蛍光のヒスト
グラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/53 K 33/577 B 33/58 Z // C12N 15/02 C12P 21/08 9161−4B (C12P 21/08 C12R 1:91) (72)発明者 アセナ・ヒュエイ―ジウアン・ディン アメリカ合衆国カリフォルニア州イース ト・パロ・アルト,ニューエル・コート 5 (72)発明者 エリザベス・エヴァンス アメリカ合衆国カリフォルニア州サラト ガ,メンデルソン 20040 (72)発明者 デービッド・ダブリュー・バック アメリカ合衆国カリフォルニア州・エル・ グラナダ,ピー・オー・ボックス 753 (72)発明者 ロリ・ローデス アメリカ合衆国カリフォルニア州・マウン テン・ビュー,ファーレー・ストリート 579

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】IL−2により活性化された直後のNK細胞
    上、低浮遊密度Tリンパ球のサブセット上、またはT細
    胞抗原レセプター複合体の刺激後ある種のTリンパ球上
    に出現し、かつ、NK細胞、Tリンパ球または胸腺細胞の
    IL−2依存性細胞株からプロテインAを用いて精製され
    る少なくとも2つのN−結合糖鎖を伴う24kDのサブユニ
    ットのジスルフィド結合によるホモダイマーであること
    を特徴とする抗原Leu23に対するモノクローナル抗体を
    生産し、そして、 CD8+アロ抗原で誘導された細胞障害性Tリンパ球細胞で
    免疫されたマウスの膝窩リンパ節とげっ歯類の骨髄腫細
    胞との細胞融合により得られる、 ことを特徴とするATCC No.HB−9627のハイブリドー
    マ。
  2. 【請求項2】IL−2により活性化された直後のNK細胞
    上、低浮遊密度Tリンパ球のサブセット上、またはT細
    胞抗原レセプター複合体の刺激後ある種のTリンパ球上
    に出現し、かつ、NK細胞、Tリンパ球または胸腺細胞の
    IL−2依存性細胞株からプロテインAを用いて精製され
    る少なくとも2つのN−結合糖鎖を伴う24kDのサブユニ
    ットがジスルフィド結合したホモダイマーであることを
    特徴とする抗原Leu23に対するモノクローナル抗体であ
    って、かつ、 CD8+アロ抗原で誘導された細胞障害性Tリンパ球細胞で
    免疫されたマウスの膝窩リンパ節とげっ歯類の骨髄腫細
    胞との細胞融合により得られるATCC No.HB−9627のハ
    イブリドーマにより生産されることを特徴とする、モノ
    クローナル抗体。
  3. 【請求項3】IL−2により活性化された直後のNK細胞
    上、低浮遊密度Tリンパ球のサブセット上、またはT細
    胞抗原レセプター複合体の刺激後ある種のTリンパ球上
    に出現し、かつ、NK細胞、Tリンパ球または胸腺細胞の
    IL−2依存性細胞株からプロテインAを用いて精製され
    る少なくとも2つのN−結合糖鎖を伴う24kDのサブユニ
    ットがジスルフィド結合したホモダイマーであることを
    特徴とする抗原Leu23に対するモノクローナル抗体をサ
    ンプルと混合し; 該モノクローナル抗体とサンプル中のLeu23との間の結
    合物を直接的または間接的蛍光手段により標識し;そし
    て、 フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡検査手段により
    蛍光を検出する; 工程からなる、生化学サンプル中の白血球の活性化を監
    視するための方法。
  4. 【請求項4】活性化白血球がTリンパ球、Bリンパ球及
    びNK細胞からなる群から選択される、請求項3記載の方
    法。
  5. 【請求項5】活性化細胞がNK細胞である、請求項4記載
    の方法。
  6. 【請求項6】活性化白血球がTリンパ球である、請求項
    4記載の方法。
  7. 【請求項7】モノクローナル抗体がAnti−Leu23であ
    る、請求項4記載の方法。
  8. 【請求項8】活性化白血球とAnti−Leu23の結合を標識
    するための手段が、Anti−Leu23を直接的に蛍光色素と
    結合させることによる、請求項7記載の方法。
  9. 【請求項9】蛍光色素がフルオレセインイソシアネート
    及びフィコビリプロテインからなる群から選択される、
    請求項8記載の方法。
  10. 【請求項10】白血球の活性化が、IL−2による活性化
    であるか、または、外来の抗原、自己抗原、抗−T細胞
    レセプター抗体もしくは抗−CD3抗体によるT細胞抗原
    レセプターを介した活性化である、請求項3記載の方
    法。
JP1013005A 1988-01-21 1989-01-21 白血球の活性化を監視するためのモノクローナル抗体 Expired - Lifetime JPH0795945B2 (ja)

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US14674588A 1988-01-21 1988-01-21

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ATE100491T1 (de) 1994-02-15
JPH0216978A (ja) 1990-01-19
EP0325489B1 (en) 1994-01-19
EP0325489A1 (en) 1989-07-26
DE68912353T2 (de) 1994-06-23
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