JP2002503094A - 活性化レセプタに会合される新しいポリペプチド及びその生物学的応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本出願は、免疫グロブリンタイプ又はレクチンタイプのＫＩＲレセプタ（キラー細胞阻害性レセプタ）の非阻害性対応物であるＫＡＲレセプタ（キラー細胞活性化レセプタ）の異常な又は望ましくない機能を診断し、予防し、矯正し、治療することを可能にする新しい手段に関する。本発明は特に、新しいポリペプチドＫＡＲＡＰ(ＫＡＲ会合タンパク質)、及びその生物学的応用に関する。本発明に従ったポリペプチドＫＡＲＡＰは、天然にはＫＡＲレセプタに会合され、このようなＫＡＲＡＰが、不存在である場合、このＫＡＲレセプタは天然には、検出可能な活性化シグナルを形質導入する能力をもたない。本出願は、同様に、かかるＫＡＲＡＰポリペプチドの獲得又は同定方法をも目的としている。

Description

【発明の詳細な説明】 活性化レセプタに会合される新しいポリペプチド及びその生物学的応用 本発明は、自律したレセプタとしてか又はコレセプタとして機能するクラスＩ のＭＨＣ（主要組織適合性遺伝子複合体）の分子に対する活性化レセプタ、及び 特にＫＡＲ（キラー細胞活性化レセプタ）に由来するシグナルを形質導入する能 力をもつ新しい特殊なポリペプチド。免疫原として役立つ前記ポリペプチドから 得られる抗体及び、前記ポリペプチドに対応する核酸に関する。 本発明は同様に、かかるポリペプチドの獲得方法及び前記ポリペプチド，抗体 及び核酸の生物学的応用、より特定的には予防、治療及び診断へのその応用に関 する。 生体の一貫性を維持し、無欠性を確保するためには、免疫系は、調整のとれた 細胞間連絡系を利用しなければならない。 これらの連絡には異なるタイプのレセプタが関与する。そのうちの３つ、すな わちＢリンパ球抗原に対するレセプタ(ＢＣＲ)，Ｔリンパ球抗原に対するレセプ タ（ＴＣＲ）及び抗体のＦｃ部分（ＲＦｃ）を認識するレセプタについて今や充 分に記述されており、それらの異なる構造は比較的良く知られている。 抗原に対するレセプタでも抗体に対するレセプタでもないその他のレセプタは 、記述されてきたものの、その構造及び作用メカニズムはまだよく知られていな い。 これらは、ＫＡＲ（キラー細胞活性化レセプタ）及びその阻害性対応物ＫＩＲ （キラー細胞阻害性レセプタ）のようなＭＨＣ（主要組織適合性遺伝子複合体） の分子に対するレセプタである。 ＫＡＲとＫＩＲは、ＮＫ細胞に制限されない：これらは同様に、Ｔ細胞により 天然に発現される。 ＫＡＲは、ＫＩＲと高い相同性をもつ（細胞質外レベルでのＫＡＲとＫＩＲの 間の相同性は最高９６％)。 しかしながら、ＫＡＲ及びＫＩＲは同じ機能を果たすものではない。すなわち 、ＫＩＲは、ＮＫ及びＴ細胞の活性化の負の制御（阻害作用）に関与するのに対 し、ＫＡＲはＮＫ及びＴ細胞の活性化の正の制御（刺激作用）に関与する。 細胞質内外及び細胞質内のドメインのレベルでの主たる差異は、活性化同型 化（ＫＡＲ）及び阻害性同型体（ＫＩＲ）の間で実証することができた。 実際、ＫＩＲとは異なり、ＫＡＲはその膜内外ドメイン内で荷電アミノ酸残 基（リシ ン）を発現し、その細胞質内ドメイン内にいかなるＩＴＩＭパターン（チロシン 残基に基づく免疫レセプタの阻害パターン）も含んでいない。しかし単量体レセ プタＫＡＲは、ＩＴＡＭ（チロシン残基に基づく免疫レセプタ活性化パターン） を含んでいない。 ＭＨＣの分子に対する活性化レセプタであり、ＩｇＳＦ（免疫グロブリンの上 科）すなわち、それ自体ＩＴＩＭもＩＴＡＭも有さず膜内外荷電アミノ酸（リシ ン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸）を有するＩＴＩＭ阻害性レセ プタの対応物である活性化レセプタの一員であるＫＡＲについて観察された状況 は、その他のタイプのレセプタについても観察することができる。かくして、（ レクチンタイプのものであり、かつその阻害性対応物がＮＫＧ２Ａ/Ｂである） ＮＫＧ２Ｃ/ＤのようなＭＨＣの分子についての活性化レセプタ（又は少なくと も非阻害性レセプタ）のみならず、そのリガンドがなおも未知である、造血細胞 及び非造血性細胞（ＳＩＲＰβ）についてか又はＢ細胞、マクロファージ及び樹 枝状細胞（ＩＬＴ１）について記述されたＳＩＲＰβ及びＩＬＴ１のようなその 他の非阻害性レセプタについても同様のことがいえる。 ＫＡＲは、特にクラスＩのＭＨＣの分子について、自律性レセプタとして機能 することができる。かくして、標的細胞の表面上で発現されたクラスＩのＭＨＣ の分子とＫＡＲの係合が、細胞質内Ｃａ２⁺の可動化及び標的細胞の溶解の誘発 から実証されたようにリンパ球活性化プログラムを開始することがわかっている 。 ＭＨＣ分子に対するその自律性レセプタの機能の他に、ＫＡＲは同様に、レセ プタＴＣＲ及びＲＦｃのためのコレセプタ機能をも果たすことができる(Mandelb olm O.et al.，１９９６，Science ２７４：２０９７；Cambiaggi A．et al.， １９９６，Blood ８７：２３６９)。 実際、ＣＤ１６（ＲＦｃγIII）のようなレセプタによる免疫グロブリンＧ（ ＩｇＧ）の定常フラグメント（Ｆｃ）の認識の際及びクラスＩ又はIIのＭＨＣの 分子により制限された複合体ＣＤ３/ＴＣＲによる抗原の認識の際には、ＫＡＲ はコレセプタの役目を果たし、かくして特に少量の抗原に直面して、細胞応答の 強度を増大し、経時的細胞応答を維持し、同様に細胞増殖の刺激のために共働す ることができる。 ＮＫ及びＴリンパ球下位母集団上で天然に発現されるＫＡＲの役目は、その固 有のリガンドすなわちクラスＩのＭＨＣの分子により制限されず、免疫系全般の 平衡にまで拡大されている。 かくして天然に発現されたＫＡＲの機能は、ＮＫ及びＴ細胞の増殖、かかる細 胞による サイトカインタイプの物質の産生、有害な、悪性の又はウイルス感染を受けた自 己由来細胞、同種異系細胞のような標的細胞の分解のみならず、或る種の抗原に 直面した免疫系の寛容に対し影響を及ぼす。 従って、ＫＡＲの全ての無機能又は機能不全は、全て免疫系の機能に関連する 、例えば免疫不全疾患、自己免疫疾患(例えば多発性硬化症)、腫瘍、ウイルス感 染、細菌感染、寄生虫感染、アレルギー、移植片拒絶のような、さまざまな疾病 又は望ましくない反応を導く可能性がある。例えば、ヒトがＫＡＲを発現するリ ンパ球を平均して１０％未満しか有していないとすると、ＬＤＧＬ（顆粒リンパ 球増殖病）にかかった患者のリンパ球のほぼ全てはＫＡＲを発現する。 本発明の目的は、ＫＡＲのようなクラスＩのＭＨＣの分子についての活性化レ セプタの異常な又は望ましくない機能を診断しその機能を制御することを可能に する手段を提供することにある。 かくして、本発明は、ＫＡＲに由来するシグナルの形質導入に必要な、以下Ｋ ＡＲＡＰ(ＫＡＲ会合タンパク質）と呼ばれる新しいポリペプチド，ならびに、 これらの新しいポリペプチドから得られた抗体及び核酸を目的とする。本発明は 同様に、前記新しいポリペプチドの獲得方法ならびにその生物学的応用をもその 目的とする。 「ＫＡＲレセプタ」というのは、本明細書においては、ＫＡＲｐ５０レセプタ （ＫＩＲIIＤＳ１〜ＫＩＲIIＤＳ５）のようなＫＩＲレセプタの非阻害性対応物 である免疫グロブリンタイプのヒトレセプタ、ＫＩＲIIIＤＳ１，ならびにこれ らのＫＡＲレセプタに類似する構造をもつ非阻害性のあらゆるレセプタ、特に（ ＮＫ細胞及びＴ細胞上で天然に発現されている）ＮＫＧ２Ｃ，ＮＫＧ２Ｄのよう なレクチンタイプのヒトレセプタ、（骨髄性細胞，Ｂ細胞上で天然に発現されて いる）pirＡのような免疫グロブリンタイプのマウスレセプタ、（マスト細胞上 で天然に発現されている）ｇｐ４９Ａ，（ＮＫ及びＴ細胞上で天然に発現されて いる）Ｌｙ４９Ｄ，Ｌｙ４９Ｈのようなレクチンタイプのマウスレセプタを意味 している。 従って、ＫＡＲＡＰポリペプチドというのは、それが無い状態では前記ＫＡＲ レセプタが天然に、検出可能な活性化シグナルを形質導入する能力をもたないよ うな、単離された全てのポリペプチド（ＫＡＲ以外）のことを意味している。こ れにより、決定されたＫＡＲＡＰポリペプチドが以上のようなＫＡＲレセプタの みならず、上述のようなＫＡＲの構造に近い構造をもつ活性化又は非阻害性のそ の他の単量体レセプタにも、そして特に、Ｉ ＬＴ１のようなＬＩＲ/ＭＩＲ/ＩＬＴ系統群の免疫グロブリンタイプのヒト活性 化レセプタにも会合（associate）されうるという事実が排除されることはない 。 本出願においては、「ポリペプチド」という語は、前記ポリペプチドのみなら ず、アミノ酸の保存的欠失、挿入、逆位又は置換によって得られるようなこのポ リペプチドの相同体及び、プロテアーゼを用いて前記ポリペプチドの加水分解に よって得られるようなこのポリペプチドのフラグメントをも含んでおり、これら の相同体又はフラグメントは、ＫＡＲに由来するシグナルを形質導入する能力を もつ。この「ポリペプチド」という語は、本出願において、ポリペプチドと同様 タンパク質をも網羅する。 本発明に従ったポリペプチドは、ＫＡＲレセプタにより受理されたシグナルの 形質導入に必要なものである：従って、これは、ＫＡＲ活性化不足の回復を可能 にする単離されたタンパク質である。一定の与えられた単離されたポリペプチド が、ＫＡＲ活性化不足の回復を可能にするか否かを決定するためには、当業者は 、このポリペプチドの不在下で適切な細胞によりそれが発現される場合でも、検 出可能な活性化シグナルを形質導入するには至らず、又は目的とされている利用 分野にとって満足のいく活性化シグナルを形質導入するには至らないＫＡＲレセ プタが存在することを示すことにより作業を進めることができる。この決定の１ 実施形態が、ＫＡＲｐ５０.２レセプタのみを発現するＲＢＬ−２Ｈ３細胞の活 性化能力（セロトニンの塩析）及びＫＡＲｐ５０.２レセプタとそのＫＡＲＡＰ ポリペプチドを同時に発現するＲＢＬ−２Ｈ３細胞の能力の間での比較により後 述の実施例３において提示されている。適切な細胞の例が、後の図５に示されて いる。 「回復されたＫＡＲ活性化不足(deficient)」というのは、有意な活性化シグ ナルの前記ＫＡＲによる細胞での形質導入が可能であるか場合によっては充分で あることを意味する。このことは、特に抗体による細胞刺激を用いてテストされ うる。 細胞レベルで、ＫＡＲに由来するシグナルが形質導入されているか否かを決定 するため、及び、かかるシグナルが刺激されているか又は阻害されているかを決 定するために、当業者は数多くの手段を利用することができる。のような手段の 例としては、リガンドによる前記ＫＡＲの刺激及び、分泌されたサイトカイン( 例えば、Cambiaggi et al.，１９９６，Blood ８７：２３６９参照)、細胞増殖( 例えばMandelboim et al.，１９９６年、Science ２７４：２０９７参照)、細胞 毒性(例えば後で記述する再誘導された細胞毒性テスト参照)、細胞質内カルシウ ム可動化（例えば、Blery et al.，１９９７，J．Biol.Chem.２７２，８９８９ −８９９６参照)、及び／又はリン酸化の誘発（例えばVivier et al.，１９９１.J．Immunol．１４６：２０６参照）の測定が含まれる。 本発明に従ったポリペプチドはさらに、ＫＡＲには会合するもののこのＫＡＲ の阻害性対応物には会合しないという能力をもつことを特徴とする。 １つのポリペプチドがＫＡＲに会合するもののこのＫＡＲの阻害性対応物には 会合しない（すなわち対応するＫＩＲレセプタに会合しない）能力をもつか否か の決定を可能にする方法は、当業者には周知のものである。かかる方法の一例に は、特に次の段階が含まれる： − 一方ではＫＡＲ⁺ＫＩＲ^-細胞に、そして他方ではＫＡＲ^-ＫＩＲ⁺細胞にこの ポリペプチドを発現させる段階； − 少なくとも抗ＫＡＲ及び１又は抗ＫＩＲ抗体を用いてこれらの細胞の溶解産 物から単数又は複数のポリペプチド分画を免疫沈降させる段階； − ＫＡＲ⁺ＫＩＲ^-細胞に由来する単数又は複数の分画内での前記ポリペプチド の存在及び、ＫＡＲ^-ＫＩＲ⁺細胞に由来する単数又は複数の分画内でのこの同じ ポリペプチドの不存在を観察する段階。抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体の例と しては、抗ＣＤ１５８固体、抗ｐ７０/ＮＫＢ１抗体、抗Ｐ１４０抗体そしてよ り特定的にはＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０モノクローナル抗体が含まれ る。細胞によりこのようなポリペプチドを発現させることを可能にする方法が、 後述の実施例３で示されている。 なお本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドは、 ｉ． 抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複 数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体，より特定的には、モノクローナル抗体Ｅ Ｂ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて活性化シグナルを形質導入する能力 をもつＫＡＲレセプタを発現する細胞溶解産物の単数又は複数のポリペプチド分 画の免疫沈降により得られ、 ii．各ポリペプチド分画は、任意には、これより以前に抗ＣＤ３ζ及び/又は抗 ＦｃεＲＩγを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇され得及び/又は新 たに抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複数 の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体、そしてより特定的にはモノクローナル抗体 ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて免疫沈降され得、 iii．その分子量に従った前記単数又は複数のポリペプチド分画のポリペプチド の分解及び約１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドの回収によってか 又は、 前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に 従って前 記単数又は複数のポリペプチド分画を分解し、約１２，１４及び/又は１６±２ ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収することによって も得られるものであることを特徴とする。 活性化シグナルを形質導入する能力をもつＫＡＲレセプタを発現する前記細胞 は、特に、ＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又は骨髄性細胞及び/又はＢ細胞及び/ 又はマスト細胞でありうる。ＫＡＲが、細胞においてシグナルを形質導入する能 力を有するか否かを決定する方法が以上で示された。 本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドはさらに、そのアミノ酸配列が、 − リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有し、 − 約１０±２から１６±２ｋＤａの間に含まれる分子質量（特に１０±２ｋＤ ａの実際の分子質量、リン酸化の程度に応じて１２±２〜１６±２ｋＤａの変性 条件下でのボリアクリルアミドゲル上の見かけの分子質量）を有することを特徴 とする。 さらにこのポリペプチドは、そのアミノ酸配列が細胞質内領域において少なく とも１つのＩＴＡＭ ＹｘｘＬ／Ｉｘ_6-8ＹｘｘＬ/Ｉパターンを有することを特 徴とする。 本発明の１態様に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列は、細胞質 外領域、膜内外領域及び/又は細胞質内領域を含む。特徴的には、この細胞質内 領域は、このポリペプチドの配列その他の領域との関係において大半を占めてい る。細胞質外、膜内外、細胞質内領域を同定するための手段は、当業者には既知 のものである(例えば、水治療法アルゴリズム、逆小胞形成)。 本発明のもう１つの態様に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列は 、細胞質外システインアミノ酸を少なくとも１つ有する。 本発明のさらにもう１つの態様に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸 配列は、少なくとも１つの膜内外荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を有する。 本発明に従ったポリペプチドは、少なくとも１つのチロシンのレベルでリン酸 化されてもよいし、或いは又リン酸化されなくてもよい。 本発明に従った一実施形態においては、前記ポリペプチドは、ジスルフィド架 橋により結合された２量体の形を有している。これらは、クラスＩのＭＨＣの分 子のための自律的レセプタとしてか又はＣＤ１６のようなＲＦｃ又はＴＣＲのコ レセプタとして機能するＫＡＲに対し、選択的かつ非共有結合的に会合させられ る。 本発明の有利な一形態に従うと、ＫＡＲＡＰポリペプチドは、ＺＡＰ−７０， Ｐ７２^{s YK} ，Ｐ５６^ICK，Ｐ５９^fyn，Ｐ６０^lyn，Ｇｒｂ−２，ＰＰ３６−３８（ｌａｔ ），ＰＬＣ−α１，Ｐ８５(ＰＩ−３キナーゼ)，ＳｈｃのようなドメインＳＨ２ をもつ分子、又はＳｈｃのようなドメインＰＴＢ（ホスホチロシン結合）をもつ 分子に結合される能力をもつ。かかる結合は、本発明のポリペプチドをドメイン ＳＨ２又はＰＴＢをもつ分子と共にインキュベートしプラズモン共鳴を測定する ことによって観察できる(Olcese et al.,１９９６，The Journal of Immunology １５６：４５３１〜４５３４)。 本発明に従った特定のＫＡＲＡＰポリペプチドは、基本的に配列番号２により 構成されたアミノ酸配列を有する。本発明は、同様に、その配列が基本的に配列 番号２の細胞質外部分つまり配列番号３によってか又は配列番号２の膜内外部分 つまり配列番号４，又は配列番号２の細胞質内部分つまり配列番号５によって構 成されているポリペプチドをも目的としている。本発明に従ったその他の特別な ＫＡＲＡＰポリペプチドは、基本的に配列番号１１，１２，１３，１４，１５， １７（マウスＣ５７Ｂ１/６のＫＡＲＡＰタンパク質のコンセンサス配列）又は 配列番号２８（ゲノミック配列から得られるマウス１２９のＫＡＲＡＰのタンパ ク質配列）によって構成されている。 かかるポリペプチドは同様に、配列決定の後、化学的合成又は組換え型ＤＮＡ 技術を用いて得ることもできる。 前記ＫＡＲＡＰポリペプチドは、細胞質内ＩＴＡＭもＩＴＩＭも有していない ものの膜内外アミノ酸残基を有する活性化レセプタＫＡＲに由来するシグナルの 形質導入に必要なものである。 有利な配置に従うと、本発明に従ったポリペプチドは、グリコシル化、リン酸 化、スルホン化、ビオチニル化、アシル化、エステル化；ホスホン酸塩のような リン酸塩基のものに近い分子形態をもつ実体の添加、置換又は抑制；ルシフェラ ーゼ、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）又はその類似体のような標識付け 試薬の添加；親和性リガンドのような精製用標的の添加；その可溶性を修正する 実体の添加；によって修飾される。特に有利な修飾としては、受理したシグナル を形質導入するその能力を阻止又は阻害するような形で前記ポリペプチドを修飾 するものが含まれる(負のトランス優性形質の戦略)。このように修飾された形を した本発明に従ったポリペプチドは、特に、一定の与えられた免疫応答特に望ま しくない又は異常な免疫応答（例えば自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶） を負に変調させる（阻害する）ことを目的とする全ての組成物又は方法において 利用される。このように適切な修飾としては、前記ポリペプチドのチロシン上で のリン酸化を 生物学的条件下で加水分解不能にする（例えばホスホン酸塩の添加により）よう な修飾が含まれる。この修飾には同様に、本発明に従ったポリペプチドの機能に とって重要なアミノ酸残基を非機能的にする修飾も含まれる。これは例えば特に ＩＴＡＭパターン内に含まれるチロシン残基のようなチロシン残基（Ｙ）をフェ ニルアラニン残基（Ｆ）に置換又は突然変異させることによる。これにより、こ うして修飾された前記ポリペプチドの、ドメインＳＨ２又はＰＴＢをもつタンパ ク質に対する結合が妨げられる。 もう１つの有利な措置に従うと、本発明のポリペプチド，そのフラグメント， 相同体又は修飾された形態は、細胞膜すなわち脂質２層を横断する能力をもつ。 本発明は同様に、本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドからの免疫誘発によ って得られる、又はかかるポリペプチドのフラグメント，相同体又は修飾された 形態から得られるような抗体特にモノクローナル抗体及びかかる抗体のフラグメ ント特にフラグメントＦｃ，Ｆｖ，Ｆab，F(ab)'₂，ＣＤＲをも目的としている 。 本発明の目的は特に、その配列が基本的に本発明に従ったかかるＫＡＲＡＰポ リペプチドの細胞質外、細胞質内又は膜内外部分によって構成されているポリペ プチドから免疫誘発によって得られるような、かかる抗体のフラグメント特にフ ラグメント，Ｆｃ，Ｆｖ，Ｆab，F(ab)'₂，ＣＤＲにある。本発明は特に、抗原 抗体タイプの反応に従って配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５， 配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配 列番号１７及び／又は配列番号２８を認識する能力をもつような抗体、ならびに そのフラグメントを目的とする。 かかる抗体は、基本的に電気泳動バンドの溶出、化学的合成又は可溶性融合タ ンパク質技術（ＧＳＴ）により得られ、任意には卵白アルブミンのような免疫原 に結合された、本発明に従ったポリペプチド，フラグメント，相同体又は修飾形 態に対して、ウサギ及びマウスのような動物を免疫化することによって得られる 。 このときモノクローナル抗体は、免疫脾細胞のハイブリドーマ融合、スクリー ニング及び培養上清の精製によって産生される(Kohler et Milstein，１９７５ ，Nature ２５６，４９５−４９７；抗体，その実験室マニュアル，１９８８，H arlow及びDavid Lane，Ed，Cold Spring Harbor laboratory)。 これらの抗体から、標準的な手順に従ってジ抗体を生成することができる。前 記フラグメントは、必要とあらばヒト化構造に挿入又は移植することができる。 本発明は同様に、本発明に従ったポリペプチド，フラグメント又は相同体のア ミノ酸配 列の世界遺伝子コードに従いこのコードの縮重を考慮に入れた読取り枠読取りに 対応する１つの配列ならびにかかる核酸と６０％以上の相同性を有しかつ上述の ようなＫＡＲに由来する活性化シグナルの形質導入分子についてコードすること のできる変異体をも目的としている。本発明は、特に、そのＤＮＡが基本的に配 列番号１(配列番号２の配列の成熟ＫＡＲＡＰタンパク質のｃＤＮＡ)，配列番号 ６，７，８，９，１０，１６(Ｃ５７Ｂ１/６マウスのＫＡＲＡＰのコンセンサス ｃＤＮＡ配列），配列番号２７（ゲノミック配列から得られた１２９マウスのＫ ＡＲＡＰのｃＤＮＡ)，配列番号１８(１２９マウスのＫＡＲＡＰのゲノミック配 列）、又は配列番号３１（ヒトＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ配列）によって、又はこれ らの配列の細胞質外、細胞質内及び/又は膜内外領域に対応するあらゆる部分、 又はこれらの配列のエキソン又はイントロンに対応するあらゆる部分によって構 成されているようなあらゆる核酸をも目的としている。 本発明は同様に、以下の段階を含む本発明に従ったポリペプチドの獲得方法を も目的としている： ｉ． 抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複 数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体，より特定的には、モノクローナル抗体Ｅ Ｂ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて機能的ＫＡＲレセプタを発現する細 胞（例えばＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又は骨髄性細胞及び/又はＢ細胞及び/ 又はマスト細胞）の溶解産物の単数又は複数のポリペプチド分画を免疫沈降する 段階、 ii. 各ポリペプチド分画は、任意には（場合によっては）、これより以前に抗 ＣＤ３及び/又は抗ＦｃεＲＩγを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇 され得及び/又は新たに抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のよ うな単数又は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体、そしてより特定的にはモ ノクローナル抗体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて免疫沈降され得 る、 iii. その分子量に従って前記単数又は複数のポリペプチド分画のポリペプチド を分離し約１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドの回収するか、又は 前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に 従って前記単数又は複数のポリペプチド分画を分離し、約１２，１４及び／又は １６±２ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収する段階 。 本出願は同様に、本発明に従った特殊なＫＡＲＡＰポリペプチド配列を得るた めの方法をも目的としている。後述の実施例２でその一例を記述する（生物情報 処理戦略）この方 法は、特に、ポリペプチド配列のうち以下の基準を満たすもののスクリーニング を含んで成る： − リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有する、 − ５から２５ｋＤａの間の分子質量を有する、 − 細胞質外領域、膜内外領域及び細胞質内領域を有する、 − その細胞質外領域内にシステインアミノ酸を少なくとも１つ有する。 − その膜内外領域内に荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を少なくとも１つ有す る、及び − その細胞質内領域内にＩＴＡＭ ＹｘｘＬ/ＩＸ_6-8ＹｘｘＬ/Ｉパターンを 少なくとも１つ有する、 − 選択された配列に対応するポリペプチドは、前述のように、ＫＡＲに会合 しかつ対応する阻害性対応物レセプタ（ＫＩＲ）には会合しないという能力をも たなくてはならない。 本出願は同様に、候補ポリペプチドが本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチド に対応するか否かを決定する又は制御するための方法をもその目的としている。 かかる方法の一例は、後述の実施例２に示されている。かかる方法は、この候補 ポリペプチドの特徴的部分（例えば少なくとも１つのＩＴＡＭパターン又は細胞 質外領域を含む細胞質内領域）に対する抗体を産生すること及び１つの細胞上で 機能的に発現された場合に前記抗体により抗原抗体タイプの反応に従って認識済 みの要素に会合された状態となっているＫＡＲレセプタが存在するか否かを確認 することから成る。 本発明に従ったこのＫＡＲＡＰポリペプチド同定方法は、かくして特に、 − 候補ポリペプチド，特にこの候補ポリペプチドの細胞質外領域及び/又は 少なくとも１つのＩＴＡＭパターンを含む領域に対して導かれたモノ又はポリク ローナル抗体（例えば、以上で同定された配列番号２のマウスＫＡＲＡＰタンパ ク質の場合には配列番号２の細胞質外部分（配列番号３）又は細胞質内部分（配 列番号５）の領域に対し導かれた抗体を産生すること、 − 抗原−抗体タイプの結合反応を可能にする穏やかな条件下で候補ポリペプ チドがＫＡＲＡＰを構成すると想定されている対象の活性化又は非阻害性レセプ タを、１つの機能的形態にて有する細胞の溶解産物と、この抗体を接触させるこ と、 − 場合によって形成される反応産物の中に、前記活性化又は非阻害性レセプ タのもの に近い見かけの分子質量（ＫＡＲｐ５０については約５０ｋＤａ）をもつ産物及 び候補ポリペプチドのものに近い見かけの分子質量（特に約１０〜１６ｋＤａの 間）をもつ産物が存在する場合に、本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドであ るものとしてその候補ポリペプチドを同定すること、 から成る。 本発明に従ったこの同定方法は特に、 − 上述の通りに前記抗体を接触させ、 − 分子複合体を保存する洗剤の穏やかな条件下で(例えば１％のジギトニン 、上述の実施例１参照)、場合によって形成された反応産物を沈降させ、 − 例えば、変性条件内でポリアクリルアミドゲル上の分子質量マーカーの存 在下での電気泳動遊走により、沈降された産物の分子質量を測定し、 − 上述のとおりの本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドであるものとして 候補ポリペプチドを同定することによって 実施することができる。 本発明は同様に、薬学的に受容可能なビヒクルと会合した（組み合わせた）形 で、本発明に従った少なくとも１つのポリペプチド，ＫＡＲＡＰ，フラグメント ，相同体又は修飾された形態、本発明に従った少なくとも１つの抗体又は抗体フ ラグメント又は、本発明に従った少なくとも１つの核酸又は核酸変異体を有効量 含んで成る薬学組成物にも関する。 本発明に従った薬学組成物は、経口投与、非経口投与、局所施用、膣内投与、 直腸内投与又は経口及び/又は経鼻吸入のため、固体、液体の形又は懸濁液の形 で製剤することができる。 本発明に従った前記薬学組成物は、ＫＡＲの活性を変調させることを目的とす る。ＫＡＲの活性を刺激するためには、前記薬学組成物は、例えば、脂質２層を 横断する能力をもつ本発明に従った変異体であるポリペプチド，フラグメント， 相同体又は核酸のような、前記ＫＡＲに由来するシグナルの形質導入を容易にす る作用物質を含むことになる。ＫＡＲの活性を阻害するため、前記薬学組成物は 、細胞のＫＡＲＡＰを遮断するような形で脂質２層を横断する能力をもつ本発明 に従った抗体フラグメント，又は、ＳＨ２(ＺＡＰ−７０，Ｐ７２^syk)又はＰＴ Ｂドメインをもつタンパク質又は前記ＫＡＲの活性化のあらゆるアダプタ又はエ フェクタ分子を遮断するような形で生物学的条件下で加水分解不能のリン酸など でリン酸化された又はされていない本発明に従った修飾済みポリペプチドのよ うなような、前記ＫＡＲ由来のシグナルの形質導入を遮断する作用物質を含むこ とになる。かかる修飾は、特にリン酸塩基の添加及び/又は少なくとも１つのチ ロシン残基（Ｙ）のフェニルアラニン残基（Ｆ）への突然変異を含む。 従って、本出願は、免疫反応に関与する細胞の異常な又は望ましくない機能の 予防、一時的緩和、及び/又は治療を目的とする組成物を目的とする。かかる組 成物は、有利には本発明に従ったポリペプチド又は場合によっては修飾済みポリ ペプチドを含んで成る。 細胞のレベルで、ＫＡＲに由来するシグナルが翻訳されたか否かを決定するた め及びかかるシグナルが刺激又は阻害されたか否かを決定するため、当業者は数 多くの手段を利用することができる。かかる手段の例が以上で示されてきた。 診断用作用物質としての前記ポリペプチド，抗体及び核酸の利用も又、本発明 の範囲内に入る(診断方法及びその利用を可能にする診断用キット)。 本発明は同様に、以下の段階を含む細胞の異常な又は望ましくない機能のイン ビトロ診断方法をも目的としている。 − 少なくとも１つの細胞又は細胞抽出物を、本発明に従った抗体又はそのフ ラグメント，又は本発明に従った核酸又はその変異体を接触させる段階、及び − 場合によって形成された反応産物の存在を明らかにする段階。 接触段階は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）のような抗原抗体タイプ の反応、又は核酸ハイブリダイゼーションタイプの反応及びＰＣＲ（ポリメラー ゼ連鎖増幅）の樹立を可能にする、特に接続時間、温度、緩衝液、場合によって はゲル網状化の条件の中で実施される。 場合によって形成される反応産物を明らかにするためには、螢光マーカー、酵 素マーカー、放射性マーカー、又は発光マーカーを利用することができる。 本発明に従った前記インビトロ診断方法は、免疫増殖疾患、ＨＩＶ疾患のよう な免疫不全疾患、顆粒リンパ球増殖疾患のようなガン、リウマチ様多発性関節炎 のような自己免疫疾患、マラリアのような感染性疾患、アレルギー応答、移植片 拒絶の形で現われうる異常な又は望ましくない細胞機能の診断を可能にする。 本発明は同様に、ＫＡＲの活性化のアダプタまたはエフェクタ分子の同定方法 及び、ＫＡＲの活性化の結果としての細胞活性を変調させる能力をもつ分子の同 定方法にも関する。 本発明に従ったＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子の前記同定方法 は、次の段階を含んで成る： ｉ．本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント又はその相同体）と候 補分子を接触させる段階、及び ii．前記ポリペプチド（又はそのフラグメント）に対する結合が観察される候補 分子を選択する段階。 ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子である可能性のある候補分子は 、例えばＳＨ２又はＰＴＢドメインをもつ分子の中から選択することができる。 これらの分子は、可溶性組換え型形態を有することができる。 接触段階は例えば、ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子である可能 性のある可溶性組換え型形態で得られた候補分子を、シンチレーション液の球の ような放射能測定を可能にする球にカップリングさせること及び前記球上にトリ チウム標識づけされた形の本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメント 又は相同体）を通過させることによって実施することができる。このとき、候補 分子のうち、放射能測定（ｃｐｍ）によって前記ポリペプチド，フラグメント又 は相同体に対するその結合が観察された候補分子が選定される。 接触段階は同様に、マイクロ支持体ＢＩＡ core(Pharmacia)のようなプラズモ ン共鳴の測定を可能にするマイクロ担体上の本発明に従ったポリペプチド（又は そのフラグメント又はその相同体）の不動化によって（例えば、Olcese et al., １９９６，The Journal of Immunology １５６：４５３１−４５３４；Vely et al.,Immunology Letters １９９６，vol.５４．ｐ１４５−１５０を参照のこと ）又はストレプタビジン球上でリン酸化及びビオチニル化された本発明に従った ポリペプチドの不動化（Vely et al.Eur.J.Immunol.１９９７，２７：１９９４ −２０００；Le Drean et al.Eur.J.Immunol.１９９８，２８：２６４−２７６ ）によって、及び前記マイクロ支持体上の、ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフ ェクタ分子である可能性のある候補分子の通過によっても実施可能である。この とき、プラズモン共鳴の測定（Resonance Unit）により、候補分子のうち、前記 ポリペプチド，フラグメント又は相同体に対するその結合が観察された候補分子 が選定される。 ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子のこの同定方法は、その実施様 式の如何に関わらず、本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果としてもたらされる 細胞活性を変調させる能力をもつ分子の同定方法の実施における基準として役立 つこともできる。 本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果として得られる細胞活性を変調させる能 力を有する分子のこの同定方法は、以下の段階を含んで成る： ｉ．上述の本発明に従った方法によって得られるようなＫＡＲの活性化のアダプ タ又はエフェクタ分子、及び本発明に従ったポリペプチド（又はそのフラグメン ト又は相同体）と、候補分子を接触させる段階、及び ii．候補分子のうち、かかる候補分子の不存在下で観察されるような前記ポリペ プチド（又はそのフラグメント又は相同体）と前記アダプタ又はエフェクタ分子 の間の結合に対し効果を及ぼす候補分子を選択する段階。 ＫＡＲの結果得られた細胞活性を変調する可能性のある候補分子は、天然又は 合成の化合物バンク、特に化学的又は組合せバンクの中から選択することができ る。前記候補分子は、（例えば本発明に従った抗体のような抗イディオタイプ抗 体の誘導体又はフラグメント，触媒抗体の誘導体又はフラグメントのような）タ ンパク質、炭素質、脂質又は核タイプのものでありうる。 本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果としての細胞活性を変調させる能力をも つ分子の同定方法の接触段階は、例えば、本発明に従ったポリペプチド（又はそ のフラグメント又は相同体）及び本発明に従った方法によって得られるようなＫ ＡＲの活性化のアダプタ又はエフェクタ分子を用いて前記候補分子を、例えば、 酵素特性、リン酸化又は自己リン酸化特性のような未結合状態の前記アダプタ又 はエフェクタ分子の化学特性に基づいて前記ＫＡＲの活性化のアダプタ又はエフ ェクタ分子と前記ポリペプチドの間の結合率を測定することを可能にするような 条件下でインキュベートさせることによって実施することができる。 本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果として得られる細胞活性を変調させる能 力をもつ分子の同定方法の接触段階は、同様に、それぞれ放射能又は候補分子の 不存在下又は存在下での前記アダプタ又はエフェクタ分子と前記ポリペプチドの 間の結合の結果として得られるプラズモン共鳴を測定することによる、上述のよ うなシンチレーション液球又はトリチウム標識づけされたポリペプチドタイプの 技術又はマイクロ支持体及びプラズモン共鳴の測定タイプの技術を利用すること によって実施可能である。このとき、候補分子のうち、これらの分子の不存在下 で前記アダプタ又はエフェクタ分子と前記ポリペプチドの間で測定されるコント ロール結合率を統計的に有意な形で増大又は減少させる候補分子が選定される。 本発明に従った方法により同定されるようなＫＡＲの活性化を変調させる能力 をもつ分子は、それらを生物学的条件下で加水分解不能にするような形で及び/ 又はそれらが細胞 脂質２層を横断しうるような形で、化学的に修飾されうる。 本発明に従った、ＫＡＲの活性化を変調させる能力をもつ分子は、有利には前 記ＫＡＲＡＰとその細胞エフェクタ又はアダプタの間の相互作用を修飾すること によって作用する。 このとき、本発明に従ったＫＡＲの活性化の結果としての細胞活性を変調させ る能力をもつ前記分子は、例えばリガンドとの接触によりそのＫＡＲが刺激され たリンパ球のようなインビトロで培養された細胞に対して適用することができる 。この適用は、例えば、脂質２層を超えることができるようにする化学的修飾又 は電気穿刺法による前記細胞内部への進入によって行なわれる。 本発明は、いかなる場合であっても制限的なものとみなされてはならない後述 の実施例によって例示されている。 ここでは、以下の２３の図が参考にされている： − 図１は、 Ａにおいて、Ｒ．Ｐ.，Ｄ．Ｆ.,及びＭＡＬと呼称されるＬＤＧＬ（顆粒リン パ球増殖性疾患）を患う患者に由来しＩＬ−２（インタロイキン２）上で培養さ れた細胞の間接的免疫蛍光検査法でのフラックス白球計算器（Becton-Dickinson の登録商標ＦＡＣＳ can）による分析を示し、 Ｂにおいて、異なる供与体に由来するＩＬ−２上で培養されたＮＫ細胞上で実 施された、異なるモノクローナル抗体を用いて再度導かれた細胞毒性試験の結果 を示している。 − 図２は、 Ａにおいて、抗ＣＤ３ζ/抗ＦｃＥＲＩγ抗体を用いてＦｃＥＲＩγ及びＣＤ ３ζの枯渇前後に、抗ＣＤ１５８ＥＢ６モノクローナル抗体を用いて免疫沈降さ れた、¹²⁵Ｉでの放射性標識づけ済みの供与体Ｒ．Ｐ.(ｐ５０．１⁺）のＮＫ細胞 から実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム及びゲル上電気泳動 によるタンパク質の分解）分析を示し、 Ｂにおいては、細胞Ｄ．Ｆ．の完全溶解産物及びかかる溶解産物の免疫沈降物 の抗ＣＤ３ζ抗体プローブを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。 − 図３は、 Ａにおいて、ＭＡＬ ＮＫ細胞の溶解産物の免疫沈降物が付されたインビトロ キナーゼ試験に由来するリン酸化されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示 し、 Ｂにおいて、図３Ａと同じタイプではあるものの、ＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０．２⁺ 細胞から実施されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。 Ｃにおいては、Ｒ．Ｐ.,ＮＫ細胞のそれぞれ抗ＣＤ−１５８及び抗ＣＤ１６免 疫沈降物について実施されたインビトロキナーゼ試験後に切除された、ＫＡＲＡ Ｐ及びＣＤ３ζバンドのリン酸化されたアミノ酸の薄層電気泳動（ＴＬＥ）によ る分析を示している。 − 図４は、キナーゼ試験を受けたＲ．Ｐ．ＮＫ細胞の溶解産物の抗ＣＤ１５ ８免疫沈降物の非変性/変性条件での２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、 − 図５は、免疫グロブリン上科又はレクチンタイプの活性化又は非阻害性レ セプタ及びそれらの阻害性対応物を示す。 − 図６は、ＫＩＲ（ｐ５８）及びＫＡＲ（ｐ５０）の概略的構造を表わす。 − 図７は、本発明に従ったマウスのＫＡＲＡＰポリペプチドのｃＤＮＡ配列 を表わす(配列番号１)。 − 図８は、本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドのアミノ酸配列（成熟タ ンパク質配列番号２）及びヌクレオチド配列（リーダ配列（これを除く）から停 止コドンまでに含まれたもの）を表わしている。 − 図９は、本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドのＩＴＡＭ及び複数のＩ ＴＡＭのアラインメントを表わしている。 − 図１０Ａ，１１Ａ，１２Ａ，１３Ａ及び１４Ａは、ＥＳＴのＡＡ２４２３ １５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２の ｃＤＮＡ配列（配列番号６〜配列番号１０）をそれぞれ例示する。 − 図１０Ｂ，１１Ｂ，１２Ｂ，１３Ｂ及び１４Ｂは、それぞれ、ＥＳＴＡＡ ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６及びＷ４１ １４２のタンパク質配列（配列番号１１〜配列番号１５）を例示する。 − 図１５は、ＥＳＴＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９， ＡＡ０９８５０６及びＷ４１１４２のｃＤＮＡ配列のアラインメント及び、結果 としてもたらされるコンセンサス配列(配列番号１６：コンセンサスＣ５７Ｂ１/ ６マウスのＫＡＲＡＰｃＤＮＡ)。 − 図１６は、ＥＳＴＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１９，Ａ Ａ０９８５０６及びＷ４１１４２のタンパク質配列のアラインメント及び結果と して得られるコンセンサス配列（配列番号１７：コンセンサスＣ５７Ｂ１/６マ ウスのＫＡＲＡＰタンパク質）を表わす。 − 図１７は、１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子配列（配列番号１８： ２８３８ ｐｂ）を表わす。 − 図１８は、１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰのゲノム組織を表わす。 − 図１９は、１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ配列（配列番号２ ７）及び対応するタンパク質配列（配列番号２８）を表わす。 − 図２０は、上から下に１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子のゲノム組 織、対応するタンパク質配列及びこのタンパク質の異なる領域の性質を表わして いる。 − 図２１は、ヒトＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ（配列番号３１）を表わす。 − 図２２は、ヒトｐ５０/ＫＡＲＡＰの２重トランスフェクションを受け横 座標に記された抗体（左側：抗体無し；中央：マウスＩｇＥ：ｍＩｇＥ １/５０ ０；右側：ＧＬ１８３ ５μｇ/ｍｌ）による刺激を受けたＲＢＬ−２Ｈ３細胞に よる、上清中で塩析されたセロトニンの百分率を表わす。 − 図２３は、ヒトＫＡＲＡＰ遺伝子の組織とマウスＫＡＲＡＰ遺伝子の組織 の間の相同性を例示する。実施例１ ： １．材料と方法 モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）及び試薬 以下のモノクローナル抗体が利用された： − ＪＴ３Ａ(Coulter Immunotech照会番号０１７８)，ＫＤ１（Coulter Immu notech照会番号０８１３）及びＴＡ１８１，Ｈ１２（Coulter Immunotech照会番 号１８４４）のようなイソタイプＩｇＧ１の抗ＣＤ３，抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ５ ６抗体、 − ＴＩＡ−２のような抗ＣＤ３ζ抗体(Coulter Immunotech ６６０４５Ｐ２ )、 − 抗ＣＤ１５８抗体、すなわちＥＢ６のような抗ｐ５８．１抗体(Coulter I mmunotech照会番号１８４７)、ＧＬ１８３のような抗ｐ５８.２抗体(Coulter Im munotech照会番号１８４６)、及びBottino et al.(Eur.J.Immunol.１９９６，２ ６，１８１６)内で記述されているＰＡＸ２５０のような抗ｐ５０．３抗体、 − Jouvin M.H.et al.,１９９４，J.Biol.Chem.，２６９，５９１８−５９２ ５中に記述された抗血清６６６のようなウサギ抗ＦｃＥＲＩγ抗血清、 − Bociano L.K.et al.，１９８６，J.Biol.Biochem．２６１，１１８２３− １１８３１の中で記述されている抗血清ＢＣ４のようなウサギ抗ＦｃεＲＩα抗 血清、 − サビペルオキシダーゼに複合されたヤギ抗マウス抗血清（Sigma Ａ−２３ ０ ４）及びワサビペルオキシダーゼに複合されたヤギ抗ウサギ抗血清(Sigma A-０ ５４５), − イソチオシアン酸フルオレセイン(Coulter Immunotech ０８１９Ｆ(ａｂ' )₂)に複合されたヤギ抗マウス免疫グロブリン(Coulter Immunotech ０８１９Ｆ( ａｂ'）₂), − ＧＬ１８３−フィコエリスリン（ＧＬ１８３−ＰＥ）(Coulter Immunotec h ２２７８)（ＥＢ６−フィコエリスリン（ＥＢ６−ＰＥ）モノクローナル抗体 （Coulter-Immunotech ２２７７）及びヤギ抗マウスフィコエリスリン免疫グロ ブリン（抗マウスＰＥ）(Coulter Immunotech ０８５５ Ｆ(ab')₂)。 溶解緩衝液は、ｐＨ７.５のトリス−ＨＣｌ ２５０ｍＭ；ＮａＣｌ １５０ ｍＭ；ジギトニン１％；オルトバナジン酸ナトリウム１００μＭ；ＮａＦ１０ｍ Ｍ；アプロチニン２μｇ/ｍｌ；ロイペプチン２μｇ/ｍｌを含有し、これらの物 質は全て、Sigma社（ＵＳＡ，ＭＯ，St Louis）から購入された。 キナーゼ緩衝液は、ｐＨ７.２のHepes ２０ｍＭ；ＮａＣｌ １００ｍＭ；Ｍ ｎＣｌ₂ ５ｍＭ；ＭｇＣｌ₂ ５ｍＭ；³²γＡＴＰ１０μＣｉ＝３７０ｋＢｑ（ Amersham,Buckinghamshire,UK）を含有していた。 薄層電気泳動緩衝液（ＴＬＥ）は、１０％の氷酢酸及び水中１％のピリジン； ｐＨ３.５を含んでいた。 細胞 ＬＤＧＬ患者由来のヒトＮＫ細胞又はＬＤＧＬ細胞 ヒトＮＫ細胞は、ＮＫ細胞系統ＣＤ５６⁺，ＣＤ１６⁺，ＣＤ３^-の顆粒リンパ 球増殖性疾患（ＬＤＧＬ，Lymphoproliferative Disease of Granular Lymphocy tes)を患う患者から、ヒトＮＫ細胞を得た。末梢血リンパ球(ＰＢＬ，Perlphera l Blood Lymphocyte)を、フィコール/ハイパーク勾配に従った遠心分離により、 ＬＤＧＬを患う患者の血液標本から単離した。次に、これらのＬＤＧＬ細胞を、 照射された異質遺伝子型栄養細胞及び10０Ｕ/ｍｌのｒＩＬ−２の存在下におい て、１０％ウシ胎児血清及び１０μｇ/ｍｌのペシリン−ストレプトマイシンに より、ＲＰＭＩ−１６４０培地上で１ｍｌにつき１０⁶個の細胞の濃度、３７℃ の温度で培養した。 トランスフェクションを受けた細胞ＲＴ II Ｂ．ｐ５０．２⁺の獲得 ＫＡＲ ｐ５０.２を発現するＲＢＬ−２Ｈ３細胞のトランスフェクタント（Am erican Type Culture Collection）(ＲＴ II B．５０.２⁺細胞)を、Blery et al .，１９９７．J. Biol.Chem.,２７２，８９８９−８９９６に記述された通りに実現した。図６は 、概略的に、ＫＩＲｐ５８レセプタ（免疫グロブリンタイプの阻害性ヒトレセプ タ）及びＫＡＲｐ５０（ＫＩＲｐ５８レセプタの非阻害性対応物）の構造を表わ している。 簡単に言うと、利用されているＲＴ II Ｂ細胞は、マウスＣＤ３の完全な細胞 質内ドメインに結びつけられたヒトＣＤ２５の完全な膜外及び膜内外ドメインを 含むキメラ分子ＣＤ２５/ＣＤ３及びマウスＦｃyＲ II ｂ２レセプタを発現する ような形でトランスフェクションを受けたＲＢＬ−２Ｈ３細胞であるものとして 従来記述されてきた細胞である。 これらのＲＴ II Ｂ細胞は、さらに、発現ベクターＲＳＶ−５ｇｐｔ上に支持 された（ｐ５０.２８３についてコードする）ｃＤＮＡ１８３．Ａｃｔ²の電気穿 刺法によるトランスフェクションを受けた。 安定したトランスフェクション済みのＲＴ II Ｂ．ｐ５０.２⁺細胞は、キサン チン(２５０μｇ/ｌ)，ハイボキサンチン（１３.６μｇ/ｌ）及びマイコフェノ ール酸（２μｇ/ｌ）の存在下での培養により樹立された。 細胞溶解試験 ＩＬ−２上で培養されたＬＤＧＬ細胞の細胞溶解活性は、抗ＣＤ１６，抗ＣＤ １５８及び抗ＣＤ５６ｍＡｂｓの不存在下又は存在下で、Ｐ８１５マウス細胞系 統（American Type Culture Collection）との関係において測定された。 簡単に言うと、⁵¹Ｃｒで標識づけされた５×１０³個の標的細胞を、４時間，^{5 1} Ｃｒの標準遊離試験の開始時点でハイブリドーマの上清モノクローナル抗体５ ０μｌの存在下でエフェクタ細胞の連続希釈液に添加した(Vivler E.et.al.，１ ９９１.J.Immunol．１４６：２０６)。 放射性ヨウ化 ＰＢＳ（リン酸ナトリウム緩衝液）の中で０.５％のホルムアルデヒドに細胞 （１０−５０×１０⁶）を固定し、その後、Anderson P.et al.，１９８９，J.Im munol．１４３：１８９９）によって記述されたようにラクトペルオキシダーゼ （¹²⁵Ｉ，NEN-Dupont Wilmington,DE,USA）を触媒としたヨウ化に先立って、Ｐ ＢＳ中で３０μｇ/ｍｌのジギトニンを用いて５分間、これに透過性を付与した 。 細胞を、ジギトニン入り溶解緩衝液中で４℃で３０分間、溶解させた。このと き、予め精製した核後上清を、Ｓ４Ｂ−セファローズ球（Pharmacia,Piscataway ,NJ.USA）を被覆する特異的抗体を用いて免疫沈降させた(Vivler E.et al.,１９ ９１，J.Immunol. １４６：２０６)。免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム 及びゲル上の電気泳動によるタンパク質の分解）及びオートラジオグラフィによ って分析した。 インビトロキナーゼ試験 １ｍｌの溶解緩衝液（試薬参照）の中に細胞（試料１個あたり１０×１０⁶個 ）を溶解させた。予備精製した核後上清を、ＣｎＢｒ(Pharmacia)により活性化 させたセファロース４Ｂに共有結合させたモノクローナル抗体を利用して２〜３ 時間免疫沈降させた。溶解緩衝液中で、免疫複合体を３回洗浄し、そのとき４０ μｌのキナーゼ緩衝液（試薬参照）を３７℃で１０分間、免疫沈降物に添加した 。試料−ＳＤＳ還元緩衝液を添加することによってキナーゼ反応を停止させた。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析及びオートラジオグラフィに先立ち、試料を沸とう させた。いくつかの実験において、試料を２次元非変性／変性対角線ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥにより分析した。 ＫＡＲＡＰのリン酸化の分析 インビトロでのキナーゼ試験及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の後、リン酸化 したタンパク質を乾燥したゲルから切除し、Centrilutor(Amicon)又はＰＢＳ（ リン酸ナトリウム緩衝液）中０.１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液 を利用して溶出させた。溶出したタンパク質を、９０分間１１０℃での２００μ ｌのＨＣｌ ５.７Ｍ中のインキュベーションに先立ち、２時間４℃で２０％のト リクロロ酢酸中で沈降させた。個々のアミノ酸を次に乾燥させ、標準レフェレン スとして標識づけされていないホスホチロシン、ホスホトレオニン、ホスホセリ ン(Sigma)の各々を５μｇを含むＴＬＥ緩衝液（試薬）５μｌ中で再び懸濁させ た。セルロースプレート（ＤＣ−セルロース１００−μｍ）上に試料を被着させ 、Multiphor II(pharmacia)上で４℃で４５分間１５００Ｖで遊走させた。アセ トン及び³²Ｐで標識づけされたアミノ酸の中で１％のニンヒドリンを用いて標準 レフェレンスを開発した。 免疫トランスファによる分析 免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解させ、ニトロセルロースフィルタ上 に移し、脱脂粉乳５％のＰＢＳ溶液中で希釈された抗ＣＤ３ζ又は抗ＦＣεＲＩ γ抗体プローブに対峙させた。ワサビペルオキシターゼ（それぞれSigma照会番 号Ａ−２３０４及びＡ−０５４５）に接合されたやぎ抗マウス又は抗ウサギ抗血 清及びAmersham(ＲＰＮ２２０９)によって市販されているＥＣＬ検出システムを 用いて免疫トランスファを明らかにした。 ２．結果 表面表現型 ＬＤＧＬ患者に由来し、ＩＬ−２（インタロイキン−２）上で培養されたＮＫ 細胞の表面表現型を間接的免疫螢光でのＦＡＣＳ can（螢光により活性化された 細胞の選別）により分析した。 以下で報告するのは、以下のＲ.Ｐ.,Ｄ.Ｆ.及びＭＡＬと呼称するこれらの患 者のうちの３名に関する研究の結果である。 前記結果は、ＬＤＧＬ（顆粒リンパ球増殖性疾患）細胞Ｒ.Ｐ.,Ｄ.Ｆ.又はＭ ＡＬの間接的免疫螢光ＦＡＣＳ canによる分析が示されている図１Ａによって例 示されている。イソチオシアン酸フルオレセインに接合されたヤギ抗マウス免疫 グロブリンが、第２段階の試薬として用いられた。各タイプのＬＤＧＬ（上部水 平バンド内に示された分析についてはＬＤＧＬ細胞Ｒ.Ｐ.,中央水平バンドの分 析についてはＬＤＧＬ細胞Ｄ.Ｆ.,下部水平バンドの分析についてはＬＤＧＬ細 胞ＭＡＬ）及び受けた治療の各々について(左側に示されたグラフについてはコ ントロール治療し、左から右へ抗ＣＤ３，抗ＣＤ１６，抗ＣＤ１５８ ＥＢ６， 抗ＣＤ１５８ ＧＬ１８３，抗ＣＤ１５８ ＰＡＸ２５０という表示されたモノク ローナル抗体による治療)、横座標には螢光強度が、又縦座標には、相対的細胞 数が報告されている。 以下のことが観察できる： − ＮＫ細胞Ｒ.Ｐ.,Ｄ.Ｆ.及びＭＡＬは全てＣＤ３^-及びＣＤ１６⁺である。 − ＮＫ細胞Ｒ.Ｐ.は、ｐ５０．１⁺，ｐ５０.２^-，ｐ５０.３^-である。これ らは、抗ＣＤ１５８ＥＢ６モノクローナル抗体によって認識され、抗ＣＤ１５８ ＧＬ１８３及びＰＡＸ２５０モノクローナル抗体によっては認識されない。 − ＮＫ細胞Ｄ.Ｆ.は、ｐ５０.１^-，ｐ５０.２⁺，ｐ５０．３^-である。これ らは、抗ＣＤ１５８ＧＬ１８３モノクローナル抗体によって認識され、抗ＣＤ１ ５８ＥＢ６及びＰＡＸ２５０モノクローナル抗体によって認識されない。 − ＮＫ細胞ＭＡＬは、ｐ５０．１^-，ｐ５０．２^-，ｐ５０．３⁺である。こ れらは抗ＣＤ１５８ ＰＡＸ２５０モノクローナル抗体によって認識され、抗Ｃ Ｄ１５８ＥＢ６及びＧＬ１８３モノクローナル抗体によっては認識されない。 従って、ＬＤＧＬを患う３人の患者は、それぞれ抗ＫＩＲ ｐ５８.１(ＥＢ６) ，抗ＫＩＲ ｐ５８.２（ＧＬ１８３）及び抗ＫＡＲ ｐ５０.３（ＰＡＸ２５０） という抗ＣＤ１ ５８抗体によって認識されるＮＫ細胞のリンパ球増殖を示した。かくして３つの ＮＫ細胞グループ、すなわちＬＤＧＬ Ｒ.Ｐ細胞、ＬＤＧＬ Ｄ.Ｆ細胞及びＬＤ ＧＬ ＭＡＬ細胞を定義づけすることができた。 細胞溶解試験 標的細胞ＦｃγＲ⁺としてＰ８１５を利用して再誘導される細胞毒性試験を、 ＮＫ細胞Ｒ.Ｐ.ｐ５０.１⁺，Ｄ.Ｆ.p５０.２⁺及びＭＡＬ．ｐ５０.３⁺について 実現した。 結果は、異なるモノクローナル抗体で再誘導された細胞毒性試験を示す図１Ｂ に例示されている：表示された供与体（左側のＲ.Ｐ.ｐ５０．１⁺，中央のＤ.Ｆ .ｐ５０.２⁺又は右側のＭＡＬ．ｐ５０.３⁺）に由来し、ＩＬ−２上で培養され たＮＫ細胞がエフェクタ細胞として利用された。試験は、抗体無し（白色円）で 、又は抗ＣＤ１６モノクローナル抗体(黒色三角形)、抗ＣＤ５６モノクローナル 抗体(白色三角形)、抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体（Ｒ.ＰについてはＥＢ６ ，Ｄ.ＦについてはＧＬ１８３，ＭＡＬについてはＰＡＸ２５０）(黒色円)の存 在下で実施された。横座標には、エフェクタ細胞と標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ比； ８：１；４：１；２：１；１：１；０.５：１；０.２５：１）が報告されており 、縦座標には、特異的溶解百分率（０〜１２０％の目盛）が報告されている。 再誘導された細胞毒性試験は、ＫＩＲレセプタの刺激の際に観察されたものと は対照的に、ＮＫ細胞に対する抗ＣＤ１５８抗体の添加が細胞Ｐ８１５の細胞溶 解を著しく増大させる（図１Ｂ）ということを示している。 コントロールとして、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体は、イソタイプに対合（ match）された抗ＣＤ５６モノクローナル抗体がいかなる効果ももたないのに対 し、抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体と類似の要領でＰ８１５の自発的細胞溶解 を増大させる。 従って、これらのＮＫ細胞は、その表面において、ＫＩＲの活性化イソタイプ の型タンパク質であるＫＡＲを発現する。さらにこれらの結果はｃＤＮＡＫＩＲ /ＫＡＲの逆転写酵素を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖増幅）分析により確認 された。 放射性ヨウ化及び免疫トランスファにより発現されたＫＡＲの分析：ＫＡＲＡ Ｐの同定 ＬＤＧＬ患者由来のＮＫ細胞上で発現されたＫＡＲレセプタを、内部放射性ヨ ウ化とそれに続く免疫沈降によって分析した。 結果は図２Ａに例示されており、この図では、¹²⁵Ｉで放射性標識づけされ抗 ＣＤ１５８ＥＢ６モノクローナル抗体を用いて免疫沈降され（トラック１）その 後抗ＣＤ３ζ／抗ＦｃＲεＩγモノクローナル抗体を用いて精製され（トラック ２〜７）、最後に抗ＣＤ１５８ ＥＢ６モノクローナル抗体を用いて再度免疫沈降された（トラック８）供与体Ｒ .Ｐ.ｐ５０．１⁺）のＮＫ細胞（１０×１０⁶細胞／トラック）から実施された、 変性条件下で１３％のゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が示されている。 同じプロフィールは、供与体Ｄ.Ｆ.(ｐ５０.２⁺)及びＭＡＬ.(ｐ５０.３⁺)を 用いて得られた(データ示さず)。 ＮＫ細胞の溶解産物から調製された抗ＣＤ１５８抗体の免疫沈降物が、≒５ー ｋＤａで観察されたＫＡＲに加えて、約１２±１ｋＤａで遊走するさらに小さい 分子質量のバンドを含有することを観察することができる。 ＫＩＲは、ヒトＮＫ細胞内でポリペプチドＣＤ３ζ及びＦｃεＲＩγと会合す ることが示された。抗ＣＤ３ζ及び抗ＦｃεＲＩγ抗体を利用した予備枯渇実験 により、ＫＡＲに会合した約１２ｋＤａのバンドがＣＤ３ζ又はＦｃεＲＩγで あるという可能性（図２Ａ）は無くなっていた。 この約１２±１ｋＤａのバンドに対応するタンパク質集合体を、ＫＡＲＡＰ（ ＫＡＲ−associated proteins，ＫＡＲに会合したタンパク質）と命名した。 これらの結果は、ＮＫ細胞溶解産物から調製した抗ＣＤ１５８ｍＡｂｓの免疫 沈降物中には、抗ＣＤ３ζ抗体の存在下で反応性あるバンドがことごとく存在し ていないことを明らかにした免疫トランスファ実験になって確認された。 抗ＣＤ３ζ抗体の存在下で得られたこれらの結果は、変性条件下での１５％の ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分解及び抗ＣＤ３ζモノクローナル抗体プローブ（右 側標識付け矢印）を用いたニトロセルロースフィルタのインキュベートによる、 Ｄ.Ｆ.細胞の完全溶解産物及びかかる溶解産物の免疫沈降物の分析を示す図２Ｂ によって例示されている。Ｄ.Ｆ.細胞の完全溶解産物（ＬＣＣ）を、トラック１ にトラックあたり５×１０⁶個の細胞の割合で被着させ、かかる溶解産物の免疫 沈降物をトラック２〜４にトラックあたり１５×１０⁶個の細胞の割合で被着さ せた。免疫沈降は、コントロールとしてトラック２で抗ＦｃεＲＩαＢＣ４モノ クローナル抗体を、トラック３で抗ＣＤ１６モノクローナル抗体を、そしてトラ ック４で抗ＣＤ１５８ＧＬ１８３モノクローナル抗体を利用して、Ｄ.Ｆ.細胞溶 解産物について実施された。 同じ結果は、抗ＣＤ３ζｍＡｂを用いて細胞Ｒ.Ｐ.及びＭＡＬについても得ら れた。 抗ＦｃεＲＩｙｍＡｂを用いて得た結果（データ図示せず）は、同じ確認事実 をもたらした。インビトロキナーゼ試験及び薄層電気泳動（ＴＬＥ）によるＫＡＲＡＰの分析 抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体の免疫沈降物について実施されたインビトロ キナーゼ試験は、ＫＡＲが、ＮＫ細胞内で約14±１ｋＤａで遊走する低分子量の 支配的なリンタンパク質に会合することを明らかにした。 結果は、図３Ａに例示されている：ＮＫ細胞ＭＡＬから調製された溶解産物を 、インビトロキナーゼ試験に先立ち、表示された抗体（トラック１では抗Ｆｃε ＲＩα，トラック２では抗ＣＤ１６，トラック３では抗ＣＤ１５８）で免疫沈降 させた。リン酸化されたタンパク質を、変性条件下で１５％のゲル上でＳＤＳ− ＰＡＧＥにより分離した。 これらの結果は、内部ヨウ化によって観察された１２ｋＤａのＫＡＲＡＰのリ ン酸化された形態について予想された分子質量の変化と一致している。その上、 ＮＫＫＡＲ＋細胞から調製された抗ＣＤ１５８ｍＡｂｓの免疫沈降物は、（図３ Ａに１４ｋＤａでのＫＡＲＡＰの矢印の両側の星印により示された）それぞれ１ ６±１ｋＤａ及び１２±１ｋＤａで遊走するその他の２つのホスホ−ＫＡＲＡＰ を含んでいる。 リン酸化されたＫＡＲＡＰの類似したグループとＫＡＲの会合は、ＮＫ細胞Ｋ ＡＲ⁺クローンのパネルでも観察され、ＮＫ ＫＩＲ⁺クローンでは見られなかっ た。１６，１４及び１２ｋＤａでのホスホ−ＫＡＲＡＰの相対的強度はＮＫ細胞 の由来に従って変動しうるということが観察された。 リン酸化されたアミノ酸の分析は、１４ｋＤａの主要ＫＡＲＡＰが主としてチ ロシン残基レベルでリン酸化されることを明らかにした。 結果は、図３Ｃにより例示されている：インビトロキナーゼ試験の後、ＫＡＲ ＡＰ（左）及びＣＤ３ζ（右）ＫＡＲＡＰバンドを切除し、薄層電気泳動による リン酸化アミノ酸分析に付した。この実験では、それぞれＮＫ細胞Ｒ.Ｐの溶解 産物から調製された抗ＣＤ１５８及び抗ＣＤ１６モノクローナル抗体の免疫沈降 物から、ＫＡＲＡＰ及びＣＤ３ζバンドを単離した。 それでも、トレオニン残基レベルではなくセリン残基レベルでのリン酸化も検 出することができる。コントロールとしてリン酸化アミノ酸分析は、チロシン残 基のレベルでのみＣＤ３ζのリン酸化を確認した。 ＫＡＲＡＰ及び活性化シグナルの形質導入（トランスフェクタントＫ⁺） ＫＩＲｐ５８.２とは対照的に、非リンパ球様の細胞系統ＲＢＬ−２Ｈ３のト ランスフェクタント内でのＫＡＲｐ５０.２の発現は、ＫＡＲｐ５０.２の活性化 機能の再構築を導 くものではない。実際、抗ＣＤ１５８抗体により誘発されるＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５ ０.２⁺細胞トランスフェクタントの刺激は、細胞質内Ｃａ²⁺の検出可能な可動化 もセロトニンの検出可能な遊離も全く導かない。驚くべきことに、ＲＢＬ−２Ｈ ３ｐ５０.２⁺細胞トランスフェクタントから調製された抗ＣＤ１５８モノクロー ナル抗体の免疫沈降物について実施されたインビトロキナーゼ試験は、検出可能 なＫＡＲＡＰを全く内含していなかった。 結果は、図３Ｂによって例示されている：ＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０．２⁺細胞か ら調製した溶解産物を、インビトロキナーゼ試験に先立ち、表示された抗体（ト ラック１では抗ＣＤ３ε，トラック２では抗ＦｃεＲＩα，トラック３では抗Ｃ Ｄ１５８）で免疫沈降させた。リン酸化タンパク質を、変性条件下で１５％のゲ ル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。 ＲＢＬ−２Ｈ３ｐ５０.２⁺細胞のトランスフェクタント内でのＫＡＲＡＰに対 するＫＡＲの会合の欠如は、内部ヨウ化によっても確認された(データ図示せず) 。 従ってＫＡＲＡＰは、選択的にＫＡＲに会合し、ＫＡＲＡＰに対するＫＡＲの 会合の欠如は、検出可能な任意の活性化シグナルを形質導入する能力をＫＡＲが もたないことと相関される。 ＫＡＲ−ＫＡＲＡＰ会合（対角線ゲル） 最終的に、抗ＣＤ１５８モノクローナル抗体の免疫沈降物の対角線２次元ゲル 上での分析が、対角線ゲルに沿って約１６，１４及び１２ｋＤａのホスホ−ＫＡ ＲＡＰが減少することを明らかにした。 結果は図４に例示されている：ＮＫＲ.Ｐ.細胞の溶解産物から調製された抗Ｃ Ｄ１５８モノクローナル抗体の免疫沈降物（ＩＰ）を、非変性/（水平方向）Ｉ 変性（垂直方向）条件での２次元１３％ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析 に先立ち、インビトロキナーゼ試験に付した。 かくしてこれらの結果は、ジスルフィド結合により結合されたＫＡＲＡＰ二量 体複合体に対しＮＫ細胞内でＫＡＲが会合させられるということを表わしている 。 ３．論述 特にクラスＩのＭＨＣの分子についての自律的活性化レセプタ又はＴＣＲ（Ｔ リンパ球レセプタ）又はＲＦｃ（免疫グロブリン定常フラグメントについてのレ セプタ）のコレセプタであるＫＡＲは、ＮＫ及びＴ細胞の活性化のための新しい １つの方法を表わしている。 本発明者は、ＫＡＲが実際ＮＫ細胞内で、ジスルフィド結合によって結合され た二量体 の形で会合されたＫＡＲＡＰを介入させる多量体複合体の形に集合させられてい ることを実証した。 放射性ヨウ化による分析が約１２±１ｋＤａのＫＡＲＡＰを立証したとすると 、キナーゼ試験による分析は、約１６，１４，及び１２±１ｋＤａの３つのホス ホ−ＫＡＲＡＰを立証した。 ＫＡＲＡＰに対するＫＡＲの会合と、ＫＡＲの活性化機能の間の相関は、ＫＡ ＲＡＰが多量体ＫＡＲ複合体の形質導入サブユニットとして作用することを示唆 している。 しかしながら、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞のトランスフェクタントについて観察され たようなＫＡＲＡＰに対するＫＡＲの会合の欠如は、ＩＴＡＭ（チロシン残基に 基づく免疫レセプタの活性化パターン）をもつポリペプチドを内含する抗原又は 抗体に対する多量体活性化レセプタについて観察されたこととは異なり、細胞表 面上のレセプタの発現を妨げるものではない。 免疫グロブリンの上科の活性化又は少なくとも非阻害性のその他のレセプタは 、ＫＡＲｐ５０（免疫グロブリンタイプのヒトＫＡＲ）すなわち：レクチンタイ プのヒトＫＡＲレセプタＮＫＧ２Ｃ/Ｄ，免疫グロブリンタイプのマウスＫＡＲ レセプタpir Ａ，ｇｐ４９Ａ，レクチンタイプのマウスＫＡＲレセプタＬｙ４９ Ｄ，Ｌｙ４９Ｈのみならず、ＩＬＴ１のようなＬＩＲ/ＭＩＲ/ＩＬＴ系統群のヒ ト活性化レセプタと驚くほどの類似性を示している。 これらの類似性は、免疫グロブリン上科（ＩｇＳＦ）又はレクチンタイプの活 性化又は非阻害性レセプタ又はそれらの阻害性対応物を示している図５によって 例示されている。各々のレセプタ対の名称（左から右へ、ｍＰＩＲ−Ｂ−ｍＰＩ Ｒ−Ａ，ＩＬＴ２−ＩＬＴ１，ＳＩＲＰα−ＳＩＲＰβ，ＫＩＲ−ＫＡＲ，Ｆｃ γＲIIＢ−ＦｃγＲIII，ＮＫＧ２Ａ/Ｂ−ＮＫＧ２Ｃ/Ｄ，ｍＬｙ４９Ａ/Ｂ/Ｃ/ Ｅ/Ｆ/Ｇ/I−mLｙ４９Ｄ/Ｈ）の下には、それらを天然に発現する細胞が表示さ れている。活性化又は非阻害性レセプタは、ＩＴＩＭ（チロシン残基に基づく免 疫レセプタ阻害パターン）もＩＴＡＭ（チロシン残基に基づく免疫レセプタ活性 化パターン）も有さず、それらの膜内外（ＴＭ）ドメイン内に荷電アミノ酸を有 する(Ｒ＝アルギニン、Ｋ＝リシン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸)。 阻害性対応物（各対の左側要素）は、その細胞質内（ＩＣ）部分内にＩＴＩＭパ ターンを有する。各々の活性化又は非阻害性レセプタは、細胞質外（ＥＣ）レベ ルで、その阻害性対応物との強い相同性を示す。実施例２： ＫＡＲＡＰ分子の生化学的特徴づけ（上述の実施例１参照）により、我々は、 特に以下のようなポリペプチドの主要な同定基準を明確にすることができた：す なわち − ジスルフィド結合の形成を可能にする、細胞質外システインアミノ酸を有 するポリペプチド（図４参照）； − 約１２〜１６ｋＤａの間に含まれるみかけの分子質量をもつポリペプチド ； − リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有するポリペプチド（ 図３Ｃ参照）。 １２，１４及び１６ｋＤａにおいて同定されたＫＡＲＡＰ分子の間に存在する 強い類似性のため、我々は、これら３つの分子形態が、１２ｋＤａを超えること のあり得ない分子量をもつ同じＫＡＲＡＰポリペプチドの異なるリン酸化度を表 わしているということを想定した。 さらに、ＫＡＲＡＰの主要な特性は、ＫＩＲとではなくＫＡＲとのその選択的 会合にある。ＫＩＲとは異なりＫＡＲは、ＫＡＲは膜内外荷電アミノ酸（リシン ：Ｋ）を有し、この特殊性は同じく複合体ＣＤ３/ＴＣＲ，ＢＣＲ，ＦｃεＲＩ 及びＦｃγＲIIIＡ（ＣＤＩ６）の中に存在するＩＴＡＭをもつポリペプチドの 会合に基づくものであることから、我々は、ＫＡＲＡＰがＩＴＡＭをもつ膜内外 ポリペプチドの系統群の新メンバであることを考慮して我々のＫＡＲＡＰ遺伝子 の同定戦略を方向づけした。これらのポリペプチドは、実際ＫＡＲＡＰと、同じ 特徴を分ち合っている：すなわち、 − ジスルフィド架橋の形成を可能にする細胞質外システインアミノ酸（Ｃ） を有するポリペプチド， − ２５ｋＤａを超えない低分子質量のポリペプチド， − ＹＸＸＬ/ＩＸ_6-8 ＹＸＸＬ/Ｉ，のようなＩＴＡＭパターン内に含まれ たリン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有するポリペプチド，及び − 膜内外荷電アミノ酸の存在。 かくして、我々は、ＥＳＴ，ＧＥＮＢＡＮＫ，ＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴ及びＥＭ ＢＬのような形で入手可能な公共のｃＤＮＡバンクから１つの遺伝子を同定する 生物学的情報処理戦略を作り上げた。我々は、次のような異なる２つのアプロー チを利用した： １） 我々は、５０〜２００個のアミノ酸（考慮対象の分子量は５．５〜２２ｋ Ｄａの間に含まれる）をもつペプチドのみをとり上げて、ＥＳＴの集合体を６つ の読取り段階に従 って翻訳した。このサブベースに対して、我々は次のような複数の基準を適用し た： − Argos方法（Rao & Argos,１９８６，Biochem,Biophys.Acta,８６９，１９ ７−２１４）に従って、アミノ酸３０の前に始まる、少なくとも１０個のアミノ 酸の予測された膜内外領域の存在。実際、ＣＤ３ζ及びＦｃεＲＩγのようなＩ ＴＡＭをもつポリペプチドとの相同性により、ＫＡＲＡＰ配列の主要な部分は、 細胞質内のものであると予測されている。 膜内外ゾーンのＣ末端位置におけるＩＴＡＭパターン（Ｙ−ｘ−ｘ−〔ＩＬ〕 −ｘ（６，８）−Ｙ−ｘ−ｘ〔ＩＬ］）の探索。 − 荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）の膜内外領域内における存在。 − 膜内外ゾーンのＣ末端位置におけるシステインアミノ酸（Ｃ）の存在。 ２） ＣＤ３Ｚ＿ＨＵＭＡＮ入力との配列相同性を有するＥＳＴ入力の探索(Ｅ ＭＢＬ，ＧＥＮ ＢＡＮＫ及びＳＷＩＳＳ ＰＲＯＴでも同様に行なわれる分析) 。利用されるプログラムは、ＴＢＬＡＳＴＮ（１，４，１１バージョン;Altschu l,Stephen F.,Warren Gish,Webb Miller,Eugene W.Myers,and David J.Lipman， １９９０，J.Mol.Biol.２１５，４０３−１０）又はＴＢＬＡＳＴＮ（２，０， ３バージョン；Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,J inghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman,１９９７，Nuclei c Acids Res.２５，３３８９−３４０２）である。これらの類似入力に対して、 我々は次に、第１のアプローチで利用した選択基準を適用した。 これら２つの生物学的情報処理アプローチを組合せることにより、疎水性プロ フィールを用いて連続的に(Genworksプログラム，ＤＮＡ Strider)，候補分子の リーダー領域、膜内外領域、細胞質内及び細胞質外領域を決定した後、我々は、 潜在的にＫＡＲＡＰのものに対応する配列を多数得た。これらの配列のうち、Ge nbank上でＡＡ２４２３１５の受入れ番号に対応する配列が、我々にはマウスの ＫＡＲＡＰ遺伝子の配列（Ｃ５７Ｂ１/６マウスｃＤＮＡ配列番号１）であるよ うに思われた。図７は、本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドのＤＮＡ配列（ ｃＤＮＡ配列番号１）を表わしている。この配列は、マウスのＫＡＲＡＰ遺伝子 の配列に対応する。実際、ヌクレオチド配列の翻訳は、３９６ヌクレオチドの読 取り枠（配列番号２）を与える。この結果は、リーダー配列（これを含まず）か ら停止コドンまでに含まれるＫＡＲＡＰ遺伝子のヌクレオチド配列の一部分（配 列番号１）を表わし、かつ同様にこのヌクレオチド配列の下に対応するアミノ酸 配列（１文 字コード）(配列番号２，３文字コード)，すなわち本発明に従った成熟マウスの ＫＡＲＡＰタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）をも表わしている図８によ って例示されている。この配列の標準的な分析は、８７個のアミノ酸の成熟タン パク質(９.６ｋＤａの分子質量)、１６アミノ酸の細胞質外部分(Ｑ１〜Ｇ１６) ，２４アミノ酸の膜内外部分（Ｖ１７−Ｇ４０）及び４７アミノ酸の細胞質内部 分（Ｒ４１〜Ｒ８７）を予測している。我々の探索戦略に従うと、細胞質外部分 は、少なくとも１つのシステインアミノ酸(実際には２つ、Ｃ８及びＣ１０)，膜 内外アミノ酸（Ｄ２５）及び細胞質内ＩＴＡＭ（Ｙ６５ＱＥＬＱＧＱＲＨＥＶＹ ７６ＳＤＬ）を含む。図９は、以前に記述されたＩＴＡＭを有するポリペプチド とＩＴＡＭパターン（単複）を有する本発明に従ったポリペプチドの間の配列の アラインメントによって行なうことのできる比較を例示し、その結果としてのコ ンセンサスＩＴＡＭ配列を示す。図９は、ＩＴＡＭをもつポリペプチドのＩＴＡ Ｍ（６個のＣＤ３，１個のＩｇα，１個のＩｇβ，ＦｃεＲＩγ及びＦｃεＲＩ β）及び（この図９に「ＫＡＲＡＰ」と表示された）本発明に従った以上で同定 されたマウスのＫＡＲＡＰポリペプチド（配列番号２）のＩＴＡＭパターンのア ラインメントを表わしている。以前に記されたＩＴＡＭ（図９）とのこの比較に 基づいて、我々には、（ＺＡＰ−７０及びｐ７２Ｓｙｋといったような）縦列Ｓ Ｈ２基をもつチロシンキナーゼタンパク質とリン酸化されたＫＡＲＡＰの会合を 考慮することが可能となった。ＺＡＰ−７０のＳＨ２基に対応する組換え型融合 タンパク質（Olcese L.,Lang P.,Vely F.,Cambiaggi A.,Marguet D.,Blery M.,H ippen K．L.,Biassonl R.,Moretta A.,Moretta L.,Cambier J．C.,Vivier E.１ ９９６，J.Immunol．１５６：４５３１−４５３４の中で記述された調製物）と ＫＡＲＡＰの会合はインビトロで確認された。これらの実験は、図３Ａ，トラッ ク３に記述されている通りに実施されたが、細胞溶解産物は、抗ＣＤ１５８抗体 ではなくＺＡＰ−７０のＳＨ２基に対応する組換え型融合タンパク質によって吸 着された。かくして、ＫＡＲＡＰは、ＫＡＲに会合され、リン酸化されたチロシ ンの形でＺＡＰ−７０に会合する新しいＩＴＡＭ入り膜内外分子である。従って ＫＡＲＡＰは、Ｔ及びＮＫリンパ球の新たな形質導入要素である。ＫＡＲＡＰ又 はＫＡＲＡＰ類似体が同様にＩＴＩＭ含有レセプタの活性化イソ型タンパク質に も会合し、これらの形質導入サブユニットの多分子複合体の中で、レセプタの係 合の際に発せられるシグナルとして役立つことも可能である。 配列がわかっている候補ポリペプチドが本発明に従ったＫＡＲＡＰタンパク質 に対応することを決定又は制御するために特に適した方法は、この候補ポリペプ チドの特徴的部分 （例えば少なくとも１つのＩＴＡＭパターン又は細胞質外領域を含む細胞質内領 域）に対する抗体を産生すること及び、この抗体が、機能的細胞上で、例えばそ の候補ポリペプチドがそのＫＡＲＡＰであると想定されているレセプタに会合し た状態にある標的である機能的ＫＡＲ⁺細胞を認識することを確認すること（す なわち、ＫＡＲ⁺細胞の場合、抗体が、ＫＡＲレセプタに会合した状熊にある標 的を認識することを確認すくこと）から成る。 本発明に従つたこのＫＡＲＡＰポリペプチドの同定方法は、かくして以下の段 階から成る。 − 候補ポリペプチド，特にこの候補ポリペプチドの少なくとも１つのＩＴＡ Ｍパターンを含む領域に対して導かれたモノ又はボリクローナル抗体（例えば、 以上で同定されたマウスＫＡＲＡＰタンパク質の場合には配列番号２の細胞質外 部分（配列番号３）又は細胞質内部分（配列番号５）の領域に対し導かれた抗体 ）を産生する段階； − 抗原−抗体タイプの結合反応を可能にする穏やかな条件下で候補ポリペプ チドがＫＡＲＡＰを構成すると想定されている対象の活性化又は非阻害性レセプ タを、１つの機能的形態にて有する細胞、例えばＮＫ又はＴ細胞のような機能的 ＫＡＲ⁺細胞の溶解産物と、この抗体を接触させる段階、 − 場合によって形成される反応産物の中に、ＫＡＲのものに近い見かけの分 子質量（約５０ｋＤａ）をもつ産物及び候補ポリペプチドのものに近い見かけの 分子質量（特に約１０〜１６ｋＤａの間）をもつ産物が存在する場合に、本発明 に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドであるものとしてその候補ポリペプチドを同定 する段階。 本発明に従ったこの同定方法は特に、 − 上述の通りに前記抗体を接触させ、 − 分子複合体を保存する洗剤の穏やかな条件下で(例えば１％のジギトニン， 上述の実施例１参照)，場合によって形成された反応産物を沈降させ、 − 例えば、変性条件内でポリアクリルアミドゲル上の分子質量マーカーの存在 下での電気泳動遊走により、沈降された産物の分子質量を測定し − 上述のとおりの本発明に従ったＫＡＲＡＰポリペプチドであるものとして候 補ポリペプチドを同定すること、 によって実施することができる。 実施例３ １．ＫＡＲＡＰに対応する複数のＥＳＴの同定 上述の実施例２に示されたような生物学的情報処理による我々のマウスＫＡＲ ＡＰクローニング戦略は、同様に、我々のＫＡＲＡＰの定義に対応する５ＥＳＴ （Expressed Tag Sequences：発現済みタグ配列）の存在をも明らかにする。つ まり、これは、ＥＳＴＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，Ａ Ａ０９８５０６及びＷ４１１４２である。図１０Ａ〜１４Ａは、それぞれ、ＥＳ Ｔ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，ＡＡ０９８５０６及 びＷ４１１４２のｃＤＮＡ配列を例示している(それぞれ配列番号６〜１０)。図 １０Ｂ〜１４Ｂは、それぞれこれらのＥＳＴに対応するタンパク質配列を例示す る(それぞれＥＳＴ ＡＡ２４２３１５，ＡＡ７３４７６９，Ｗ８８１５９，Ａ Ａ０９８５０６及びＷ４１１４２のタンパク質について配列番号１１〜１５)。 これらのＥＳＴは全てＣ５７Ｂ１/６マウス由来の組織から得られ、読取り枠に 対応するｃＤＮＡ配列を得るように整列させられたものである。このことは、Ｅ ＳＴ ＡＡ０９８５０６(配列番号９)、ＡＡ２４２３１５(配列番号６)、Ｗ８８ １５９(配列番号８)、ＡＡ７３４７６９（配列番号７）及びＷ４１１４２（配列 番号１０）の配列のアラインメントを表わし、結果として得られたコンセンサス 配列（コンセンサスマウスＫＡＲＡＰｃＤＮＡ：配列番号１６）を示す図１５に よって例示されている。 このことは同様に、ＥＳＴＡＡ２４２３１５(配列番号１１)，Ｗ８８１５９( 配列番号１３)，Ｗ４１１４２(配列番号１５)，ＡＡ０９８５０６（配列番号１ ４）及びＡＡ７３４７６９（配列番号１２）のタンパク質配列のアラインメント を表わし、かつ結果として得られるコンセンサス配列（コンセンサス配列ＫＡＲ ＡＰタンパク質，配列番号１７）を表わす図１６によっても例示されている。こ れらの図１５及び１６上で、記号「・」は、考慮対象のコンセンサス配列との同 一性を表わし、記号「−」は、配列決定データの欠如を表わす。 ２．マウスＫＡＲＡＰのゲノム配列 １２９マウス系統のマウスから単離したゲノミックＤＮＡのライブラリ（ラム ダファージ、ＥＭＢＬ３）を、従来の技術に従ってＥＳＴ ＡＡ７３４７６９の 配列に対応するｃＤＮＡを用いてスクリーニングした。１８ｋｂのフラグメント を含むファージを、陽性として同定した。一連の制限酵素での切断によりこのフ ァージのカルトグラフィを実施し、ファージから得た９ｋｂのEcoRＩ−EcoRＩフ ラグメントをpBlue−Scriptクローニングベクター内でクローニングした。これ には、マウスＫＡＲＡＰ遺伝子全体（初期Ａ ＴＧからＳＴＯＰ配列まで）が含まれている。このマウスＫＡＲＡＰ遺伝子の配 列は、図１７に示されている(配列番号１８；２８３８ｐｂ)。 その上、マウスＫＡＲＡＰのゲノム組織を得るべく、オリゴヌクレオチドプラ イマが生成された。利用されたプライマは以下の表１に示されている(配列番号 １９〜２６)。 マウスＫＡＲＡＰのゲノム組織は図１８に示されている。我々はこれらのデー タから、１２９系統のマウスのＫＡＲＡＰのｃＤＮＡ配列ひいてはタンパク質配 列を得た。このｃＤＮＡ配列（配列番号２７）及びこのタンパク質配列（配列番 号２８）は図1９に示されている。 かくして翻訳されたタンパク質配列は、以下のとおりである。 （配列） シグナル配列 （配列） 細胞質外ドメイン （配列） 膜内外ドメイン （配列） 細胞質内ドメイン ゲノミックカルトグラフィのこれらの結果全体は、マウスＫＡＲＡＰ遺伝子（ 初期ＡＴＧからＳＴＯＰ配列まで）が長さ約２.９ｋｂであり、５個のエキソン を含むことを示している。これらの結果は、上から下へ、１２９マウスのマウス ＫＡＲＡＰのゲノミックＤＮＡ(黒色：翻訳済みエキソン；水平ハッチング：未 翻訳エキソン、白色・イントロン)、対応するタンパク質配列（エキソン１〜エ キソン５までの配列番号２８）及びこのタンパク質の異なる領域の性質（ＳＳ＝ シグナル配列；ＥＣ＝細胞質外ドメイン；ＴＭ＝膜内外ドメイン；ＩＣ＝細胞質 内ドメイン）を表わす図２０によって例示されている。エキソン１は、シグナル 配列のＮ末端部分についてコードし、エキソン２はシグナル配列の残りの部分及 び細胞質外部分の最初の３つのアミノ酸についてコードし、エキソン３は、細胞 質外部分の残りの部分、膜内外部分及び細胞質内部分の最初の９つのアミノ酸に ついてコードし、エキソン４は、細胞質内部分の１４のアミノ酸についてコード し、エキソン５はタンパク質の残りの部分についてコードする。ＫＡＲＡＰとい ったようなＩＴＡＭを有するポリペプチドのゲノム組織に期待されるように、Ｉ ＴＡＭは、タイプ０のイントロンによって分離された２つのエキソン（エキソン ４及び５）によってコードされる。 ３．ＤＡＰ−１２ヒトＫＡＲＡＰによりＲＢＬ−２Ｈ３の中で発現されるＫＡＲ （ｐ５０.２）の機能的再構築 我々は、マウスＫＡＲＡＰの配列から演繹されるオリゴヌクレオチドプライマ を生成することによりＲＴ−ＰＣＲによってヒトＫＡＲＡＰについてコードする ｃＤＮＡを得た。利用されたプライマは、以下の表２に示されいる(配列番号２ ９及び３０)。 得られたｃＤＮＡ配列は図２１に示されている(配列番号３１：ヒトＫＡＲＡ ＰのｃＤＮＡ)。ＫＡＲ⁺ヒトＮＫクローンから抽出されたＲＮＡは、このｃＤＮ Ａの生成のベースとして役立った。このｃＤＮＡを、ｐＮＴ−^neo真核生物発現 ベクタ内でクローニングし、このヒトＫＡＲＡＰについて安定したトランスフェ クタントを、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞系統のＫＡＲ⁺（ｐ５０.２）トランスフェクタ ント内で生成した(Blery et al,J.Biol.Chem.，１９９７)。ｐ５０．２⁺及びＫ ＡＲＡＰ⁺というこのように２重にトランスフェクションを受けたＲＢＬ−２Ｈ ３細胞上で発現されたＫＡＲレセプタがもつ活性化シグナルを形質導入する能力 を、ｐ５０.２の細胞質外部分に対して導かれた抗体を用いての刺激によって、 又トリチウム標識づけされたセロトニンの塩析に従ってテストした。 このトリチウム標識づけされたセロトニンの塩析実験のために従ったプロトコ ルは以下のとおりである： これらの細胞を剥離させ、遠心分離に付し、１ｍｌにつき１×１０⁶個の細胞 という最終濃度でＲＰＭＩ−１０％ＳＶＦの中で再懸濁させる。このとき、細胞 を、１時間細胞１ｍｌあたり２μＣｉのトリチウム標識づけ済みセロトニンを用 いてインキュベートさせる。細胞を洗浄し、次に、細胞がその原液から余剰のセ ロトニンを塩析させるべく３７℃で１時間培地の中に戻す。その後、細胞をマウ スのＩｇＥ（２６８１−Ｉ）又は抗ｐ５０ＡＣ（ＧＬ１８３）と共に、９６ウェ ル付き平板（１ウェルあたり細胞２０００００個）の中に分布させる。細胞を１ 時間付着させその後洗浄する。細胞を１５分間３７℃に戻し、次にF(ab'）２Ｇ モノクローナル抗体（５０μｇ/ｍｌ）を用いて刺激する。３７℃で３０分間、 細胞を放置してそれらがそのセロトニンを遊離させることができるようにする。 低温ＨＢＳＳを添加し細胞を氷上に置くことによって反応を終結させる。このと き各ウェルの上清の半分を回収し、１ｍｌのシンチレーション液中に入れる。セ ロトニンが投入された未刺激の細胞から得られた同量の溶解産物から１００％の 脱顆粒化が得られる。このときβカウンタで試料を計数する。 得られた結果は、ヒトのｐ５０/ＫＡＲＡＰの２重トランスフェクションを受 け、横座標に示された抗体（左側：抗体無し；中央：マウスＩｇＥ：ｍＩｇＥ１ /５００，右側：ＧＬ１８３ ５μg/ｍｌ）による刺激を受けたＲＢＬ−２Ｈ３ 細胞により上清内で塩析されたセロトニンの％を示す図２２によって例示されて いる。この図２２に示されているように、ＫＡＲの細胞質外部分と反応する抗体 （モノクローナル抗体 ＧＬ１８３）によるＲＢＬ−２Ｈ３中のＫＡＲの係合が 細胞の活性化という形で現われないのに対し、ヒト のＫＡＲとＫＡＲＡＰを同時に発現する２重トランスフェクタントＲＢＬ−２Ｈ ３でのＧＬ１８３によるＫＡＲの係合は細胞活性化（ここでは細胞からのセロト ニンの遊離により表出される）という形で現われる。従ってこのことは、同定さ れたヒトＫＡＲＡＰ配列がＫＡＲの機能性を再構築するということの明確な証拠 である。 図２３は、ヒトＫＡＲＡＰ遺伝子の組織とマウスＫＡＲＡＰ遺伝子の組織の間 の相同性を例示する(Ｅ１〜Ｅ５：エキソン１〜エキソン５；Ｉ１〜１４：イン トロン１〜イントロン４)。ここには、ヒト及びマウスのＫＡＲＡＰ遺伝子の塩 基対の番号づけが表示されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年６月２１日（１９９９．６．２１） 【補正内容】 請求の範囲（補正） １．ＫＡＲ活性化不全の回復を可能にすること、ＫＡＲに会合しかつこのＫＡＲ を阻害する相対物には会合しない能力をもつこと、及び そのアミノ酸配列が、 − リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有し、 − 約１０±２から１６±２ｋＤａの間に含まれる分子質量を有し、 − 少なくとも１つのＩＴＡＭ ＹｘｘＬ/ＩＸ_6-8ＹｘｘＬ/Ｉパターンを有し 、 − 細胞質外領域、膜内外領域及び細胞質内領域を含み、 − 少なくとも１つの細胞質外システインアミノ酸を含んで成り、 − 少なくとも１つの膜内外荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を有することを 特徴とする単離されたポリペプチド、又はそのフラグメント又は相同体であって 、前記相同体又はフラグメントがＫＡＲに由来するシグナルを形質導入する能力 を有するもの。 ２．ｉ． 抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又 は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体，より特定的には、モノクローナル抗 体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて活性化シグナルを形質導入する 能力をもつＫＡＲレセプタを発現する細胞の溶解産物の単数又は複数のポリペプ チド分画を免疫沈降し、 ii． 各ポリペプチド分画は、場合によっては、これより以前に抗ＣＤ３及び/ 又は抗ＦｃεＲＩｙを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇され得及び/ 又は新たに抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又 は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体、そしてより特定的にはモノクローナ ル抗体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて免疫沈降され得る、 iii．その分子量に従った前記単数又は複数のポリペプチド分画のポリペプチド を分解し及び約１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドを回収するか又 は、 前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に 従って前記単数又は複数のポリペプチド分画を分解し、約１２，１４及び／又は １６±２ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収すること によっても得られる、ポリペプチド又はそのフラグメント又は相同体。 ３．前記細胞がＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又は骨髄性細胞及び/又はＢ細胞 及び/又はマスト細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリペプ チド。 ４．少なくとも１つのチロシン残基レベルでリン酸化されていることを特徴とす る請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。 ５．２量体の形を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の ポリペプチド。 ６．ＳＨ２又はＰＴＢドメインをもつ分子に結合されることを特徴とする請求項 １〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。 ７．そのアミノ酸配列が基本的に配列番号２，３，４又は５，１１，１２，１３ ，１４，１５，１７又は２８によって構成されていることを特徴とする請求項１ 〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。 ８．グリコシル化、リン酸化、スルホン化、ビオチニル化、アシル化、エステル 化；ホスホン酸塩のようなリン酸塩基のものに近い分子形態をもつ物質（entity ）の添加、置換又は抑制；ルシフェラーゼ、ＧＦＰ又はその類似体（Green Fluo rescence Protein）のような標識付け試薬の添加；親和性リガンドのような精製 用標的の添加；その可溶性を修正する物質の添加；によって修飾されることを特 徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。 ９．細胞膜を横断する能力を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１ 項に記載のポリペプチド。 10．シグナルを形質導入するその能力を阻害するように修飾されること、を特徴 とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。 11．特にホスホン酸塩基の添加により生物学的条件下で加水分解不能となるよう な形で修飾されること、を特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。 12．フェニルアラニン残基によるチロシン残基の置換により修飾されることを特 徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。 13．特に請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドから又はかかるポ リペプチドのフラグメントから免疫誘発によって得られるような抗体又はかかる 抗体のフラグメント特にフラグメント，Ｆｃ，ＦＶ，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ'）₂，Ｃ ＤＲ。 14．配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号１１，配列番 号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１７及び/又は 配列番号２８を認識する能力をもつことを特徴とする請求項１３に記載の抗体又 は抗体フラグメント。 15．国際遺伝子コードに従った請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプ チドの アミノ酸配列の読取り枠読取りに対応する配列を含んで成ることを特徴とする、 核酸又はその変異体。 16．前記核酸が、基本的に配列番号１，６，７，８，９，１０，１６，２７，３ １又は１８から成る配列を有することを特徴とする請求項15に記載の核酸又はそ の変異体。 17．請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチドの獲得方法において、 ｉ． 抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複 数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体，より特定的には、モノクローナル抗体Ｅ Ｂ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いてＫＡＲ細胞の細胞溶解産物の単数又 は複数のポリペプチド分画の免疫沈降する段階を含み、ここで ii． 各ポリペプチド分画は、任意には、さらに以前に抗ＣＤ３及び/又は抗Ｆ ｃεＲＩγを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇され得及び/又は新た に抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複数の 抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体、そしてより特定的にはモノクローナル抗体Ｅ Ｂ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて免疫沈降され得、 iii．その分子量に従って前記単数又は複数のポリペプチド分画のポリペプチド を分離し約１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドを回収するか又は、 前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に 従って前記単数又は複数のポリペプチド分画を分離し、約１２，１４及び／又は １６±２ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収する段階 をも含んで成ることを特徴とする方法。 18．前記細胞ＫＡＲ⁺がＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又骨髄性細胞及び/又はＢ 細胞及び/又はマスト細胞であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。 19．− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有し、 − ５から２５ｋＤａの間の分子質量を有し、 − 細胞質外領域、膜内外領域及び細胞質内領域を有し、 − その細胞質外領域内にシステインアミノ酸を少なくとも１つ有し、 − その膜内外領域内に荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を少なくとも１つ有 し、かつ − その細胞質内領域内にＩＴＡＭ ＹｘｘＬ/ＩＸ_6-8ＹｘｘＬ/Ｉパターンを 少なくとも１つ有するもののみを選択するため候補配列の間でのスクリーニング によって作業を行なうこと及び、選択された配列（単複）に対応するポリペプチ ド（単複）が、ＫＡＲを阻 害する対応物レセプタに会合することなくＫＡＲレセプタに会合する能力を有す ることを確保することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポ リペプチドの配列を獲得するための方法。 20．候補ポリペプチドが、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド に対応するか否かを決定するための方法において、 − 候補ポリペプチド，特にこの候補ポリペプチドの細胞質外領域及び/又は 少なくとも１つのＩＴＡＭパターンを含む領域に対して導かれたモノ又はポリク ローナル抗体を産する段階、 − 抗原−抗体タイプの結合反応を可能にする穏やかな条件下で候補ポリペプ チドがＫＡＲＡＰを構成すると想定されている対象の活性化又は非阻害性レセプ タを、１つの機能的形態にて有する細胞の溶解産物と、この抗体を接触させる段 階、 − 場合によって形成される反応産物の中に、前記活性化又は非阻害性レセプ タのものに近い見かけの分子質量をもつ産物及び候補ポリペプチドのものに近い 見かけの分子質量をもつ産物が存在する場合に、請求項１〜１２のいずれか１項 に記載のポリペプチドであるものとしてその候補ポリペプチドを同定する段階、 を含んで成ることを特徴とする方法。 21．薬学的に受容可能なビヒクルと会合した状態で、有効量の請求項１〜２６の いずれか１項に記載のポリペプチド又はそのフラグメント，又は有効量の請求項 １３又は１４に記載の抗体、又は有効量の請求項１５又は１６に記載の核酸又は その変異体を含んで成る薬学組成物。 22．１つの細胞の異常な又は望ましくない機能のインビトロ診断方法において、 − 少なくとも１つの細胞又は細胞抽出物を、請求項１３又は１４に記載の抗 体又はそのフラグメント，又は請求項１５又は１６に記載の核酸又はその変異体 を接触させる段階、及び − 場合によって形成された反応産物の存在を明らかにする段階、 を含んで成ることを特徴とする方法。 23．前記異常な又は望ましくない機能が、免疫増殖疾患、ＨＩＶ疾患のような免 疫不全疾患、顆粒リンパ球増殖疾患のようなガン、リウマチ様多発性関節炎のよ うな自己免疫疾患、マラリアのような感染性疾患、アレルギー応答、移植片拒絶 の形で現われることを特徴とする請求項２２に記載のインビトロ診断方法。 24．ＫＡＲの活性化のアダプタ分子又はエフェクタ分子の同定方法において、 ｉ．請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド（又はそのフラグメン ト）と候補分子を接触させる段階、及び ii．前記ポリペプチド（又はそのフラグメント）に対する結合が観察される候補 分子を選択する段階、 を含んで成ることを特徴とする方法。 25．ＫＡＲの活性化の結果として得られる細胞活性を変調させる能力を有する分 子の同定方法において ｉ．請求項２４に記載の方法によって得られるようなＫＡＲの活性化のアダプタ 又はエフェクタ分子、及び請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド （又はそのフラグメント）と、候補分子を接触させる段階；及び ii．候補分子のうち、かかる候補分子の不存在下で観察されるような前記ポリペ プチド（又はそのフラグメント）と前記アダプタ又はエフェクタ分子の間の結合 に対し効果を及ぼす候補分子を選択する段階、 を含むことを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/705 43/00 １１１ 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 16/28 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，Ｕ Ｓ (72)発明者 オルチェーセ ルチア イタリア国 ジェノヴァ 23―７ アー ヴィア パレストロ（番地なし) (72)発明者 ヴェリィ フレデリック フランス国 カシス レジダーンス デュ ヴァラ ラ ファランドール（番地な し) (72)発明者 トマセッロ エレナ フランス国 マルセイユ アレー デ パ ン 30

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＫＡＲ活性化不全の回復を可能にすることを特徴とする単離されたポリペプ チド、又はそのフラグメント又は相同体。 ２．ＫＡＲに会合しかつこのＫＡＲを阻害する相対物には会合しない能力をもつ ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド又はそのフラグメント又は相同 体。 ３．ｉ． 抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又 は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体，より特定的には、モノクローナル抗 体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて活性化シグナルを形質導入する 能力をもつＫＡＲレセプタを発現する細胞の溶解産物の単数又は複数のポリペプ チド分画を免疫沈降し、 ii． 各ポリペプチド分画は、場合によっては、これより以前に抗ＣＤ３及び/ 又は抗ＦｃεＲＩγを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇され得及び/ 又は新たに抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又 は複数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体、そしてより特定的にはモノクローナ ル抗体ＥＢ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて免疫沈降され得る、 iii．その分子量に従った前記単数又は複数のポリペプチド分画のポリペプチド を分解し及び約１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドを回収するか又 は、 前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に 従って前記単数又は複数のポリペプチド分画を分解し、約１２，１４及び/又は １６±２ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収すること によっても得られる、ポリペプチド又はそのフラグメント又は相同体。 ４．前記細胞がＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又は骨髄性細胞及び/又はＢ細胞 及び/又はマスト細胞であることを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。 ５．そのアミノ酸配列が、 − リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有し、 − 約１０±２から１６±２ｋＤａの間に含まれる分子質量を有すること を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。 ６．そのアミノ酸配列が少なくとも１つのＩＴＡＭ ＹｘｘＬ／Ｉx_6-8ＹｘｘＬ/ Ｉパターンを有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリ ペプチド。 ７．そのアミノ酸配列が、細胞質外領域、膜内外領域及び細胞質内領域を含むこ とを特徴 とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。 ８．そのアミノ酸配列が少なくとも１つの細胞質外システインアミノ酸を含んで 成ることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。 ９．そのアミノ酸配列が少なくとも１つの膜内外荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ ）を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド 。 10．少なくとも１つのチロシン残基レベルでリン酸化されていることを特徴とす る請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。 11．２量体の形を有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載 のポリペプチド。 12．ＳＨ２又はＰＴＢドメインをもつ分子に結合されることを特徴とする請求項 １〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。 13．そのアミノ酸配列が基本的に配列番号２，３，４又は５，１１，１２，１３ ，１４，１５，１７又は２８によって構成されていることを特徴とする請求項１ 〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。 14．グリコシル化、リン酸化、スルホン化、ビオチニル化、アシル化、エステル 化；ホスホン酸塩のようなリン酸塩基のものに近い分子形態をもつ物質(entity) の添加、置換又は抑制；ルシフェラーゼ、ＧＦＰ又はその類似体(Green Fluores cence Protein)のような標識付け試薬の添加；親和性リガンドのような精製用標 的の添加；その可溶性を修正する物質の添加；によって修飾されることを特徴と する請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。 15．細胞膜を横断する能力を有することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか １項に記載のポリペプチド。 16．シグナルを形質導入するその能力を阻害するように修飾されること、を特徴 とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。 17．特にホスホン酸塩基の添加により生物学的条件下で加水分解不能となるよう な形で修飾されること、を特徴とする請求項１７に記載のポリペプチド。 18．フェニルアラニン残基によるチロシン残基の置換により修飾されることを特 徴とする請求項１７に記載のポリペプチド。 19．特に請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチドから又はかかるポ リペプチドのフラグメントから免疫誘発によって得られるような抗体又はかかる 抗体のフラグメ ント特にフラグメント，Ｆｃ，ＦＶ，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，ＣＤＲ。 20．配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号１１，配列番 号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１７及び/又は 配列番号２８を認識する能力をもつことを特徴とする請求項２０に記載の抗体又 は抗体フラグメント。 21．国際遺伝子コードに従った請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプ チドのアミノ酸配列の読取り枠読取りに対応する配列を含んで成ることを特徴と する、核酸又はその変異体。 22．前記核酸が、基本的に配列番号２，６，７，８，９，１０，１６，２７，３ １又は１８から成る配列を有することを特徴とする請求項２２に記載の核酸又は その変異体。 23．請求項１〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチドの獲得方法において、 ｉ． 抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複 数の抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体，より特定的には、モノクローナル抗体Ｅ Ｂ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いてＫＡＲ細胞の細胞溶解産物の単数又 は複数のポリペプチド分画の免疫沈降する段階を含み、ここで ii． 各ポリペプチド分画は、任意には、さらに以前に抗ＣＤ３及び／又は抗Ｆ ｃεＲＩγを用いた免疫沈降された分画の除去により枯渇され得及び/又は新た に抗ＣＤ１５８，抗Ｐ７０/ＮＫＢ１，抗Ｐ１４０抗体のような単数又は複数の 抗ＫＩＲ及び/又は抗ＫＡＲ抗体、そしてより特定的にはモノクローナル抗体Ｅ Ｂ６，ＧＬ１８３又はＰＡＸ２５０を用いて免疫沈降され得、 iii．その分子量に従って前記単数又は複数のポリペプチド分画のポリペプチド を分離し約１２±２ｋＤａの分子量に対応するポリペプチドを回収するか又は、 前記単数又は複数のポリペプチド分画をキナーゼ試験に付した後その分子量に 従って前記単数又は複数のポリペプチド分画を分離し、約１２，１４及び／又は １６±２ｋＤａの分子量に対応するリン酸化されたポリペプチドを回収する段階 をも含んで成ることを特徴とする方法。 24．前記細胞ＫＡＲ⁺がＮＫ細胞及び/又はＴ細胞及び/又骨髄性細胞及び/又はＢ 細胞及び/又はマスト細胞であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。 25．− リン酸化可能なチロシンアミノ酸を少なくとも１つ有し、 − ５から２５ｋＤａの間の分子質量を有し、 − 細胞質外領域、膜内外領域及び細胞質内領域を有し、 − その細胞質外領域内にシステインアミノ酸を少なくとも１つ有し、 − その膜内外領域内に荷電アミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｄ，Ｅ）を少なくとも１つ有 し、かつ − その細胞質内領域内にＩＴＡＭ ＹｘｘＬ/Ｉｘ_6-8ＹｘｘＬ/Ｉパターンを 少なくとも１つ有するもののみを選択するため候補配列の間でのスクリーニング によって作業を行なうこと及び、選択された配列（単複）に対応するポリペプチ ド（単複）が、ＫＡＲを阻害する対応物レセプタに会合することなくＫＡＲレセ プタに会合する能力を有することを確保することを特徴とする、請求項１〜１８ のいずれか１項に記載のポリペプチドの配列を獲得するための方法。 26．候補ポリペプチドが、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド に対応するか否かを決定するための方法において、 − 候補ポリペプチド，特にこの候補ポリペプチドの細胞質外領域及び/又は 少なくとも１つのＩＴＡＭパターンを含む領域に対して導かれたモノ又はポリク ローナル抗体を産する段階、 − 抗原−抗体タイプの結合反応を可能にする穏やかな条件下で候補ポリペプ チドがＫＡＲＡＰを構成すると想定されている対象の活性化又は非阻害性レセプ タを、１つの機能的形態にて有する細胞の溶解産物と、この抗体を接触させる段 階、 − 場合によって形成される反応産物の中に、前記活性化又は非阻害性レセプ タのものに近い見かけの分子質量をもつ産物及び候補ポリペプチドのものに近い 見かけの分子質量をもつ産物が存在する場合に、請求項１〜１８のいずれか１項 に記載のポリペプチドであるものとしてその候補ポリペプチドを同定する段階、 を含んで成ることを特徴とする方法。 27．薬学的に受容可能なビヒクルと会合した状態で、有効量の請求項１〜２６の いずれか１項に記載のポリペプチド又はそのフラグメント，又は有効量の請求項 １９又は２０に記載の抗体、又は有効量の請求項２１又は２２に記載の核酸又は その変異体を含んで成る薬学組成物。 28．１つの細胞の異常な又は望ましくない機能のインビトロ診断方法において、 − 少なくとも１つの細胞又は細胞抽出物を、請求項２１又は２２に記載の抗 体又はそのフラグメント，又は請求項２１又は２２に記載の核酸又はその変異体 を接触させる段階、及び − 場合によって形成された反応産物の存在を明らかにする段階、 を含んで成ることを特徴とする方法。 29．前記異常な又は望ましくない機能が、免疫増殖疾患、ＨＩＶ疾患のような免 疫不全疾患、顆粒リンパ球増殖疾患のようなガン、リウマチ様多発性関節炎のよ うな自己免疫疾患、マラリアのような感染性疾患、アレルギー応答、移植片拒絶 の形で現われることを特徴とする請求項２８に記載のインビトロ診断方法。 30．ＫＡＲの活性化のアダプタ分子又はエフェクタ分子の同定方法において、 ｉ．請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド（又はそのフラグメン ト）と候補分子を接触させる段階、及び ii.前記ポリペプチド（又はそのフラグメント）に対する結合が観察される候補 分子を選択する段階、 を含んで成ることを特徴とする方法。 31．ＫＡＲの活性化の結果として得られる細胞活性を変調させる能力を有する分 子の同定方法において ｉ．請求項３０に記載の方法によって得られるようなＫＡＲの活性化のアダプタ 又はエフェクタ分子、及び請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド （又はそのフラグメント）と、候補分子を接触させる段階；及び ii.候補分子のうち、かかる候補分子の不存在下で観察されるような前記ポリペ プチド（又はそのフラグメント）と前記アダプタ又はエフェクタ分子の間の結合 に対し効果を及ぼす候補分子を選択する段階、 を含むことを特徴とする方法。