JP2023530238A - キメラ抗原発現免疫細胞のインビトロ腫瘍殺傷活性を決定するための細胞ベースのアッセイ - Google Patents

Abstract

本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を発現する免疫細胞の効力（例えば、細胞傷害性）を決定するためのインビトロ方法を提供する。試験試料において、ＣＡＲ発現免疫細胞は、ＣＡＲと相互作用する抗原を発現する標的細胞とともにインキュベートされる。対照試料において、ＣＡＲ発現免疫細胞は、標的細胞、及びＣＡＲと標的細胞との間の相互作用を防止する阻害分子とともにインキュベートされる。標的細胞死の量は、試験試料及び対照試料の両方において決定され、比較される。【選択図】図１

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年６月８日に出願された米国仮出願番号第６３／０３６，２４９号、及び２０２０年１２月１４日に出願された米国仮出願番号第６３／１２５，１７３号の利益を主張するものである。前述の出願の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みである、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年６月０４日に作成され、名称はＪＢＩ６３２９ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２８，７１０バイトである。

（発明の分野）
本発明は、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞の効力（例えば、細胞傷害性）を決定するための改善されたアッセイを提供する。改善されたアッセイは、免疫細胞のキメラ抗原受容体がアッセイ対照としてその標的細胞と相互作用するのを防止する阻害分子を代わりに使用することによって、モックトランスフェクト免疫細胞のアッセイ対照としての使用を回避することを可能にする。

キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の特異的インビトロ細胞傷害性を決定する現在の方法は、形質導入されていない増殖した自家Ｔ細胞（モック）をベースライン対照として使用することを伴う。これらの対照は、形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的細胞傷害性を計算するために使用される。しかしながら、形質導入されていない増殖した自家Ｔ細胞又は同種対照Ｔ細胞（モック細胞）の生成は、特にこれらの細胞が通常患者自身のＴ細胞から生成されるため、費用及び時間がかかる。加えて、モック細胞の生成は、産生失敗の傾向があり、これは、治療を遅延させ得るか、又は免疫療法中のＣＡＲ－Ｔ細胞の適切な投薬を妨げる可能性がある。

ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性を決定する方法は、形質導入されていない増殖した自家Ｔ細胞（モック）をベースライン対照として使用することを伴う。ベースライン対照を使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞に特異的な細胞傷害性の増加率（ＣＡＲ－Ｔ殺傷率）を計算する。自家モック細胞が利用可能でない場合、代わりに適格ロットのアレルゲン性モックが使用される。しかしながら、そのような適格ロットの使用は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の真の効力を反映しない可能性がある同種異系モックと比較した効力をもたらす。別法として、ベースライン対照を省略し、総細胞傷害活性が使用される。しかしながら、総細胞傷害活性は、ＣＡＲ－Ｔ細胞による免疫細胞／標的細胞相互作用の細胞傷害活性の何らかの増強があったかどうかを示すものではない。総細胞傷害活性は、製剤からの寄与、又は標的細胞自体の自発的死を区別しない。サイトカインＥＬＩＳＡなどの代替アッセイが、活性を測定するための代用として機能アッセイの代わりに使用されているが、これらの方法は、細胞傷害性の直接測定ではない。

したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞効力の正確性を保存しながら、かつモック細胞及び／又はモック細胞が利用可能でない場合は追加の代替アッセイを使用することに関連する関連高コスト及び複雑性を低減しながらＣＲＴ細胞の産生及び試験を簡素化するために、改善されたアッセイ対照が必要とされている。本出願を通して記載される主題は、対照としてのモック細胞の使用を必要としない新規なアッセイを提供することによって、この必要性を満たす。

一態様では、キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）分子を発現する免疫細胞の効力を決定するためのインビトロ方法であって、方法が、
ａ）試験試料において、ＣＡＲ発現免疫細胞を標的細胞と接触させることであって、標的細胞が、ＣＡＲと相互作用する抗原を発現する、ことと、
ｂ）第１の対照試料において、ＣＡＲ発現免疫細胞を標的細胞と接触させることであって、（ｉ）当該接触させることが阻害分子の存在下で行われるか、又は（ｉｉ）ＣＡＲ発現免疫細胞及び／若しくは標的細胞が当該接触させることの前に阻害分子とともにプレインキュベートされており、阻害分子がＣＡＲと標的細胞との間の相互作用を阻害する、ことと、
ｃ）試験試料中の標的細胞死の量を決定することと、
ｄ）第１の対照試料中の標的細胞死の量を決定することと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）において決定された標的細胞死の量を比較することに基づいて、ＣＡＲ発現免疫細胞の効力を決定することと、を含み、
試験試料及び第１の対照試料において、接触させる時間、ＣＡＲ発現免疫細胞の量及び標的細胞の量が、実質的に同じである、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、接触させるステップ（ａ）及び（ｂ）は、同時に実行される。いくつかの実施形態では、決定するステップ（ｃ）及び（ｄ）は、同時に実行される。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）（ｉ）において、ＣＡＲ発現免疫細胞及び／又は標的細胞は、接触させるステップの前に阻害分子とともにプレインキュベートされている。

いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）において決定された標的細胞死の量を、第２の対照試料において決定された標的細胞死の量と比較することを更に含み、標的細胞は、ＣＡＲ発現免疫細胞の非存在下でインキュベートされる。

いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）において決定された標的細胞死の量を、第３の対照試料において決定された標的細胞死の量と比較することを更に含み、標的細胞は、ＣＡＲ発現免疫細胞の非存在下であるが標的細胞死を引き起こす界面活性剤の存在下でインキュベートされる。特定の実施形態では、界面活性剤は、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００である。

様々な実施形態では、標的細胞は、当該標的細胞死の際に検出可能なレポーターシグナルを産生し、ステップ（ｃ）は、試験試料におけるレポーターシグナルを決定することを含み、ステップ（ｄ）は、第１の対照試料におけるレポーターシグナルを決定することを含み、ステップ（ｅ）は、ステップ（ｃ）及び（ｄ）において決定されたレポーターシグナルを比較することを含む。

いくつかの実施形態では、レポーターシグナルは、発光である。いくつかの実施形態では、レポーターシグナルは、蛍光である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、標的細胞が細胞死を経るときにシグナルを産生するレポータータンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、レポータータンパク質は、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、若しくは緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein、ＧＦＰ）、又はそれらのバリアンと若しくは誘導体である。いくつかの実施形態では、阻害分子は、標的細胞上の抗原に特異的に結合し、抗原がＣＡＲと相互作用する。

いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、阻害分子は、標的細胞上に発現される抗原に特異的に結合するＣＡＲ内の領域に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、阻害分子は、抗体又は抗体断片を含む。特定の実施形態では、抗体は、抗イディオタイプ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ若しくはＦｄ断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、線状抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインである。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ＣＡＲのｓｃＦｖドメイン内の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ＣＡＲのｓｃＦｖドメイン内のＣＤＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ＣＡＲのＶＨドメイン又はＶＬドメイン内の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ＣＡＲのＶＨドメイン又はＶＬドメイン内のＣＤＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲと相互作用する標的細胞上に発現される抗原の可溶性形態、又はその機能的断片若しくは誘導体である。

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、ｉＰＳＣ）、及びナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ細胞成熟抗原（B-Cell maturation Antigen、ＢＣＭＡ）受容体と相互作用し、標的細胞は、ＢＣＭＡ受容体を含み、阻害分子は、ＢＣＭＡの可溶性細胞質ドメインである。いくつかの実施形態では、標的細胞は、多発性骨髄腫細胞である。ある実施態様では、多発性骨髄腫細胞は、ＭＭ－１Ｒ細胞である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣグループ５メンバーＤ（G protein-coupled receptor, class C group5 member D、ＧＰＲＣ５Ｄ）と相互作用し、標的細胞は、ＧＰＲＣ５Ｄ受容体を含み、阻害分子は、ＣＡＲに対する抗イディオタイプ抗体又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）と相互作用し、標的細胞は、ＧＰＲＣ５Ｄ受容体を含み、阻害分子は、ＧＰＲＣ５Ｄ受容体に対する抗イディオタイプ抗体又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、多発性骨髄腫細胞である。ある実施態様では、多発性骨髄腫細胞は、ＭＭ－１Ｒ細胞である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、カリケリン（kallikerin）２（ＫＬＫ２）と相互作用し、標的細胞は、ＫＬＫ２を含み、阻害分子は、可溶性ＫＬＫ２タンパク質である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、前立腺がん細胞である。いくつかの実施形態では、前立腺がんは、ＬＮＣａＰ細胞である。

様々な実施形態では、本方法は、ハイスループット形式で行われる。

図１Ａは、ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面上の標識ＢＣＭＡタンパク質のＢＣＭＡ特異的競合を実証するフローサイトメトリーの結果を示す。試料１は、標識ＦＩＴＣ－ＢＣＭＡのみである。図１Ｂは、ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ ＣＡＲ－Ｔ細胞の表面上の標識ＢＣＭＡタンパク質のＢＣＭＡ特異的競合を実証するフローサイトメトリーの結果を示す。試料６ｓは、非標識ＢＣＭＡとのＦＩＴＣ－ＢＣＭＡ競合である。

本開示の方法は、本開示の一部を形成する、添付の図面に関連して解釈される以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本開示の方法は、本明細書に記載及び／又は示される特定の方法に限定されないこと、更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を例によって説明することのみを目的とし、請求項に記載の方法に限定することを意図しないことを理解されたい。

本明細書に引用する全ての特許公開された特許出願及び刊行物は、参照によってあたかもその全体が本明細書に記載されているように組み込まれる。

リストが提示される場合、特に指定しない限り、そのリストの各個々の要素及びそのリストの全ての組み合わせは別個の実施形態であることを、理解されたい。例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣ」として提示される実施形態のリストは、実施形態「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ又はＣ」、「Ｂ又はＣ」、又は「Ａ、Ｂ、又はＣ」を含むと解釈されるべきである。

定義
本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、単語「含む（comprising）」と併せて使用される場合、単語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。

特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されない限り、又は代替物が相互排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物及び「及び／又は」のみを指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２又はそれ以上を意味し得る。

「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるのか、すなわち、測定システムの制限に部分的に依存する。特定のアッセイ、結果又は実施形態の文脈において、実施例又は本明細書の他の箇所で別段明示的に述べられない限り、「約」は、値の１０％下から値の１０％上までの範囲内、例えば、値が１００である場合、９０～１１０を意味する。

本明細書中で使用される場合、核酸に関する用語「コードする」又は「コードしている」は、当業者が本発明を容易に理解できるようにするために使用されるが、しかしながら、これらの用語は、それぞれ「含む（comprise）」又は「含んでいる（comprising）」と互換的に使用され得る。

「抗原」は、免疫応答を媒介することができる抗原結合ドメイン又はＴ細胞受容体が結合することができる任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、これらの一部、又はこれらの組み合わせ）を指す。例示的な免疫応答には、抗体産生、及びＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞などの免疫細胞の活性化が含まれる。抗原は、組織試料、腫瘍試料、細胞、又は他の生物学的成分、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、殺傷若しくは不活性化された全細胞又は溶解物などの生体試料からの、遺伝子によって発現し得る、当該試料から合成され得る、又は当該試料から精製され得る。

「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性などの多特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された形態を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chain、ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えばＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。

「抗体断片」という用語は、親の完全長抗体の抗原結合特性を保持する、無傷の抗体又はその組換えバリアントの少なくとも１つの部分を指す。これは、例えば、認識及び結合（例えば、抗原などの標的に対する抗体断片の特異的結合）を付与するために十分である、抗原結合ドメイン（例えば、無傷の（インタクトな）抗体の抗原決定可変領域）を指す。「抗原結合断片」とは、免疫グロブリン分子の一部を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、線状抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（ＶＬ又はＶＨのいずれか）、ラクダＶＨＨドメイン、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

用語「対象」は、免疫応答が誘発され得る生体（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）を含むことが意図される。対象の例には、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多くの供給源から得ることができる。

本明細書で使用される、「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞表面受容体として定義され、全て天然では単一のタンパク質において一緒にみられることのない組み合わせである。これには、細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインが天然では単一の受容体タンパク質において一緒にみられることのない受容体が含まれる。ＣＡＲは、主に、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球での使用が意図される。

「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とは、抗原に結合する抗体の領域である。ＶＨには３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、ＶＬには３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲは、以下のものなどの様々な記述を用いて定義することができる：Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ１３２：２１１－５０、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ１９６：９０１－１７）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ２７：５５－７７）、及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ Ｊ Ｂｍｏｌ Ｂｉｏｌ２６３：８００－１５，１９９６）。様々な記述と可変領域の付番との対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ２７：５５－７７、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００１）３０９：６５７－７０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース、ウェブリソース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇを参照されたい）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを描写することができる。本明細書で使用する場合、用語「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」は、明細書で別途明示的に記載のない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。

用語「減少させる（decrease）」及び「低減する（reduce）」は、本明細書において互換的に使用され、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合に、低減された応答（すなわち下流効果）を媒介する試験分子の能力を指す。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺傷、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、増強されたＦｃγへの結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。減少は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８等を含む）の減少などの、測定された応答の減少であってもよい。

用語「増強する（enhance）」、「促進する（promote）」、「増加させる（increase）」、「拡大する（expand）」又は「改善する（improve）」とは、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合、試験分子がより大きな応答（すなわち下流効果）を媒介する能力をいう。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺傷、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、増強されたＦｃγへの結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。増強は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８等を含む）の増加などの、測定された応答の増加であってもよい。

「ｄＡｂ」又は「ｄＡｂ断片」は、ＶＨドメインで構成される抗体断片を指す（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４ ５４６（１９８９））。

「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ断片」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬドメインで構成される抗体断片を指す。

「Ｆ（ａｂ’）_２」又は「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、ヒンジ領域内のジスルフィド架橋によって接続された２つのＦａｂ断片を含有する抗体断片を指す。

「Ｆｄ」又は「Ｆｄ断片」は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指す。

「Ｆｖ」又は「Ｆｖ断片」は、抗体の単一のアーム由来のＶＨドメイン及びＶＬドメインで構成される抗体断片を指す。

「完全長抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続された、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）で構成される。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメインで構成され、重鎖定常ドメインは、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）で構成される。ＶＨ及びＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。

「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を意味する。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。

「細胞内シグナル伝達ドメイン」又は「細胞質シグナル伝達ドメイン」は、分子の細胞内部分を指す。これは、タンパク質の機能的部分であり、セカンドメッセンジャーを生成することにより定められたシグナル伝達経路を介して細胞活動を調節するために細胞内で情報を伝達することによって作用する、又はかかるメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することによって作用する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。

「単離／単離された」とは、組換え細胞などにおける分子が産生される系の他の成分から離して実質的に分離及び／又は精製された分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又はポリペプチド）、並びに少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離／単離された」とは、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された分子を包含する。

「モノクローナル抗体」とは、抗体分子の実質的に均質な母集団（すなわち、母集団を含む個別の抗体が、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去する、又は、アミノ酸異性化若しくはアミド分解、メチオニン酸化若しくはアスパラギン若しくはグルタミンアミド分解などの翻訳後修飾といった、可能な周知の変更を除いて同一である）から入手される抗体を意味する。モノクローナル抗体は、典型的には、１つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であってよく、又は、二重特異性などの多重特異性であってよく、一価、二価、又は多価であってもよい。

「ナチュラルキラー細胞」及び「ＮＫ細胞」は、本明細書では互換的かつ同義的に使用される。本明細書で使用するとき、ＮＫ細胞とは、ＣＤ１６^＋ＣＤ５６^＋及び／又はＣＤ５７^＋ＴＣＲ^－表現型を有する分化リンパ球を指す。ＮＫ細胞は、特定の細胞溶解性酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合し、殺傷する能力、腫瘍細胞又はＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する他の疾患細胞を殺傷する能力、及び免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。

本明細書では互換的に使用される「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、各々がペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸残基で構成されている１つ又は２つ以上のポリペプチドを含む分子を指す。タンパク質は、モノマーであってもよく、又は同一若しくは異なる２つ以上のサブユニットのタンパク質複合体であってもよい。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。タンパク質は、異種融合タンパク質、糖タンパク質、又はリン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、シトルリン化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ペグ化又はビオチン化などの翻訳後修飾によって修飾されたタンパク質であり得る。タンパク質は、組換え発現し得る。

「組換え体」とは、組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、ウイルス、及び他の巨大分子を指す。「組換え抗体」という用語は、例えば、バクテリオファージ又は酵母発現系によって発現される抗体などの組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成されている、このＤＮＡ分子が抗体タンパク質、又は抗体を特定するアミノ酸配列を発現する抗体を意味すると解釈されるべきであり、その場合、ＤＮＡ又はアミノ酸配列は、利用可能であり当該技術分野において既知である組換えＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を使用して得られる。

「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗体断片及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含む少なくとも１つの抗体断片を含む融合タンパク質であって、ＶＬ及びＶＨが、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができる、融合タンパク質を指す。特に指定しない限り、本明細書で使用するとき、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域をいずれの順序で有していてもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでいてもよく、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでいてもよい。

「特異的に結合する」、「特異的結合」、「特異的に結合している」、又は「結合する」とは、タンパク質性分子が、抗原又は当該抗原内のエピトープに、他の抗原に対する親和性よりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、タンパク質性分子は、約１×１０^－７Ｍ以下、例えば約５×１０^－８Ｍ以下、約１×１０^－８Ｍ以下、約１×１０^－９Ｍ以下、約１×１０^－１０Ｍ以下、約１×１０^－１１Ｍ以下、又は約１×１０^－１２Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）で抗原又は抗原内のエピトープに結合し、典型的には、Ｋ_Ｄは、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのＫ_Ｄよりも少なくとも１００倍小さい。

「Ｔ細胞」、「Ｔ－細胞」及び「Ｔリンパ球」は互換的であり、本明細書において同義的に使用される。Ｔ細胞には、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、記憶Ｔ細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（T helper、Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、又はＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。また、「ＮＫＴ細胞」も含まれ、これは、半不変αβＴ細胞受容体を発現するだけでなく、ＮＫ１．１などの典型的にはＮＫ細胞に関連する様々な分子マーカーも発現する、Ｔ細胞の特殊な集団を指す。ＮＫＴ細胞には、ＮＫ１．１^＋及びＮＫ１．１^－、並びにＣＤ４^＋、ＣＤ４^－、ＣＤ８^＋、及びＣＤ８^－細胞が含まれる。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉ様分子ＣＤ Ｉｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生する能力により、保護効果又は有害効果のいずれかを有し得る。また、「ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）」も含まれ、これは、それらの表面に異なるＴＣＲを有するＴ細胞の小さなサブセットの特殊な集団を指し、ＴＣＲがα及びβ－ＴＣＲ鎖と表記される２つの糖タンパク質鎖から構成されるＴ細胞の大部分とは異なり、γδＴ細胞におけるＴＣＲは、γ鎖及びδ鎖から構成される。γδＴ細胞は、免疫監視及び免疫調節において役割を果たすことができ、ＩＬ－１７の重要な供給源であること、及び強力なＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することが見出された。また、「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」も含まれ、これは、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容における役割を果たす、Ｔ細胞を指す。Ｔｒｅｇは、典型的には、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４^＋Ｔ細胞であり、かつ、ＩＬ－１０産生ＣＤ４^＋Ｔ細胞である転写因子Ｆｏｘｐ３陰性調節性Ｔ細胞も含み得る。

「腫瘍細胞」又は「がん細胞」とは、インビボ、エクスビボ、又は組織培養のいずれかにおいて、自然発生的な又は誘発された表現型の変化を有するがん性、前がん性、又は形質転換細胞を指す。これらの変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の組み込み、外因性核酸の取り込みにより発生させることもでき、自然発生的に又は発がん物質に曝露した後に発生し、それによって内因性の遺伝子が変異する場合もある。形質転換／がんは、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍の増殖などによって例示される。

「バリアント」、「変異体」又は「変化した」とは、１つ又は２つ以上の改変、例えば、１つ又は２つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。

本明細書で言及される細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の「効力」は、所望の機能を達成する際のその有効性又は潜在的有効性の指標又は尺度である。ＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、所望の機能は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）などの別の細胞を標的化するか又は殺傷することであり得る。効力は、その標的に対する細胞の効果（例えば、インビトロ又はインビボでの腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の効果）の決定によって直接評価することができる。あるいは、効力は、本発明の種々の方法におけるように、間接的に測定され得る。特に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の効力は、例えば、本明細書に記載されるアッセイにおいて、細胞の抗原特異的細胞傷害性のインビトロのレベルを（例えば、本明細書に記載される刺激されていないＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性と比較して）決定することによって評価することができる。次いで、この効力の尺度は、その標的を殺傷する際の細胞の有効性に関連し得る、本明細書に記載されるＰＫ／ＰＤパラメータ（例えば、ＣＭＡＸ、Ｔ ＡＸ、及びＡＵＣ）などの細胞のインビボ特性と関連付けることができ、したがって、その予測とみなすことができる。本明細書に更に記載されるように、効力は、関連するＣＡＲを発現する細胞の数に基づいて正規化され得る細胞傷害性指数に関して表され得る。

本明細書で使用される場合、「参照」又は「対照」は、比較が行われる基準又は対照を記載する。例えば、いくつかの実施形態では、目的の薬剤、動物、個体、集団、試料、配列又は値は、参照又は対照の薬剤、動物、個体、集団、試料、配列又は値と比較される。いくつかの実施形態では、参照又は対照は、目的の試験又は決定と実質的に同時に試験及び／又は決定される。典型的には、当業者によって理解されるように、参照又は対照は、評価下の条件又は環境に匹敵する条件又は環境下で決定又は特徴付けられる。当業者は、特定の可能な参照又は対照に対する信頼及び／又は比較を正当化するのに十分な類似性が存在する場合を理解するであろう。

「刺激分子」という用語は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの態様について刺激的な方法で免疫細胞の活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）によって発現される分子を指す。一態様では、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが負荷されたＭＨＣ分子との結合によって開始され、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答の媒介をもたらす一次シグナルである。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１ Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＡＲにおいて、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３－ζの一次シグナル伝達配列を含み得る。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の「発明を実施するための形態」から明らかになるであろう。しかし、発明を実施するための形態及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、本開示の趣旨及び範囲内にある様々な変更及び改良がこの発明を実施するための形態によって当業者にとって明らかになることから、例示としてのみ与えられていることを理解されたい。

キメラ抗原受容体
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、所望のキメラ抗原受容体を安定して発現するように遺伝子改変され得る。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫細胞、例えばＴ細胞シグナル伝達ドメインに結合した抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインを含む人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドである。ＣＡＲの特性としては、非ＭＨＣ制限的に選択された標的に向かってＴ細胞特異性及び反応性をリダイレクトし、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用する能力を挙げることができる。非ＭＨＣ制限抗原認識により、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識することができるため、腫瘍逃避の主要なメカニズムを迂回する。更に、Ｔ細胞において発現される場合、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖と有利には二量体化しない。

本明細書に記載のＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、以下に定義された刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞質シグナル伝達ドメイン」とも称される）とを含む、組換えポリペプチドコンストラクトを提供する。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、本明細書では、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はＣＡＲ修飾Ｔ細胞と称され、これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。細胞は、その表面上に抗体結合ドメインを安定して発現するように遺伝的に改変することができ、ＭＨＣ非依存性の新規抗原特異性を付与する。

場合によっては、Ｔ細胞は、特定の抗体の抗原認識ドメインとＣＤ３－ζ鎖又はＦｃγＲＩタンパク質の細胞内ドメインとを組み合わせて単一のキメラタンパク質にするＣＡＲを安定して発現させるように遺伝的に改変される。一実施形態では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するζ鎖である。

本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」又は「細胞質シグナル伝達ドメイン」は、分子の細胞内部分を指す。これは、タンパク質の機能的部分であり、セカンドメッセンジャーを生成することにより定められたシグナル伝達経路を介して細胞活動を調節するために細胞内で情報を伝達することによって作用する、又はかかるメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することによって作用する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えばＣＡＲ－Ｔ細胞における免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性及びヘルパー活性（サイトカインの分泌を含む）が挙げられる。

一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激又は抗原依存性シミュレーションに関与する分子に由来するものが挙げられる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、共刺激シグナル又は抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。例えば、ＣＡＲ－Ｔの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含み得、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体又は共刺激分子からの細胞質配列を含み得る。

一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＣＤ３－ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、並びにＣＤ６６ｄ ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

「ζ」又は代替的に「ζ鎖」、「ＣＤ３－ζ」又は「ＴＣＲ－ζ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、又は非ヒト種、例えば、ネズミ、ウサギ、霊長類、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価な残基として定義され、「ζ刺激ドメイン」又は代替的に「ＣＤ３－ζ刺激ドメイン」又は「ＴＣＲ－ζ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するために十分なζ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義される。一態様では、ζの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４、又はその機能的オルソログである、非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する等価な残基を含む。一態様では、「ζ刺激ドメイン」又は「ＣＤ３－ζ刺激ドメイン」は、以下の配列番号１０として提供される配列、又は配列番号１０と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である。

ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１０）

用語「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、Ｔ細胞による共刺激応答（例えば、限定するものではないが、増殖）を媒介するＴ細胞上の同種結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子としては、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌリガンド受容体、並びにＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられるが、これらに限定されない。

共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（signaling lymphocytic activation molecule、ＳＬＡＭタンパク質）、及び活性化ＮＫ細胞受容体で表すことができる。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。

細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、又は天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はそれらの機能的断片を含み得る。

用語「４－１ＢＢ」又は代替的に「ＣＤ１３７」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、又は非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価な残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４～２５５、又は非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、及び類人猿などからの等価な残基として定義される。一態様では、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」又は「ＣＤ１３７共刺激ドメイン」は、以下の配列番号１１として提供される配列、又は非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの同等の残基、又は配列番号１１と少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である。

ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１１）

一実施形態では、ＣＡＲ内のドメインの１つに自然に関連する膜貫通ドメインが使用される。別の実施形態では、膜貫通ドメインを、アミノ酸置換によって選択又は修飾し、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのかかるドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えることができる。一例の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインを含む。

いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、本明細書で定義される少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ又は２つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを更に含む。一実施形態では、共刺激分子は、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ３－ζ、及び／又はＣＤ２８から選択される。ＣＤ２８は、Ｔ細胞共刺激において重要なＴ細胞マーカーである。ＣＤ２７は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであり、共刺激免疫チェックポイント分子として機能する。４－１ＢＢは、Ｔ細胞に強力な共刺激シグナルを伝達し、分化を促進し、Ｔリンパ球の長期生存を増強する。ＣＤ３－ζは、ＴＣＲと会合してシグナルを生成し、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif、ＩＴＡＭ）を含有する。別の実施形態では、共刺激分子は、ＭｙＤ８８又はＣＤ４０である。

一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８を含む細胞内ヒンジドメインと、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３－ζを含む細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインと、を含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、細胞内ヒンジドメインと、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３－ζを含む細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとを含み、当該ヒンジドメインは、ＣＤ８、ＣＤ４、又はＣＤ２８の細胞外領域の全て又は一部、抗体定常領域の全て又は一部、ＦｃｙＲＩＩＩＡ受容体、ＩｇＧヒンジ、ＩｇＭヒンジ、ＩｇＡヒンジ、ＩｇＤヒンジ、ＩｇＥヒンジ、又はＩｇヒンジの全て又は一部を含む。ＩｇＧヒンジは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はこれらのキメラ由来であってもよい。

本明細書に記載のＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、例えば以下に定義される刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞質シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）とを含む組換えポリペプチド構築物を提供する。

一実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ融合タンパク質を含む。一実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ融合タンパク質を含む。一実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ又は２つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ融合タンパク質を含む。

ＣＡＲは、ＣＤ２８及び／若しくは４－１ＢＢシグナル伝達ドメインのみを含むように、又は本明細書に記載されるＣＡＲの状況において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わされるように設計してよい。一実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメインを更に含み得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインとしては、ＣＤ３－ζ、４－１ＢＢ、及びＣＤ２８シグナル伝達モジュール、並びにこれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、腫瘍抗原に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む。本明細書に記載するＣＡＲにより認識され得る腫瘍抗原の非限定的な例は、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ７９、ＫＬＫ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３及びＦＬＴ３が含まれる。

本開示は、本明細書に記載のＣＡＲ、核酸、ポリペプチド、及びタンパク質のバリアント（例えば機能的バリアント）を更に提供する。「バリアント」は、例えば、置換、挿入、又は欠失といった１つ又は２つ以上の改変によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドと異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用するとき、「機能的バリアント」という用語は、親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と実質的又は著しい配列同一性又は類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を指し、これらの機能的バリアントは、バリアントであるＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の生物活性を保持する。機能的バリアントは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質）のバリアントを包含し、これらは親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と同様の程度、同程度、又はより高い程度で標的細胞（腫瘍細胞）を認識する能力を保持する。親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に関して、機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に対して、アミノ酸配列が少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上同一であり得る。

機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態では、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物活性を抑制又は阻害することができない。非保存的アミノ酸置換により、機能的バリアントの生物活性を向上させることができ、その結果、機能的バリアントの生物活性は、親ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と比較して増加する。

本発明のＣＡＲのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野において既知であり、特定の物理的及び／又は化学的特性を有する１つのアミノ酸を、同じ又は類似の化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸と交換するアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、別の酸性アミノ酸で置換された酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）、非極性側鎖を有する別のアミノ酸で置換された非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌなど）、別の塩基性アミノ酸で置換された塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇなど）、極性側鎖を有する別のアミノ酸で置換された極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）などであり得る。

ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、特定のアミノ酸配列又は本明細書に記載の配列から本質的になり得、その結果、他の構成成分、例えば、他のアミノ酸は、機能的バリアントの生物活性を実質的に変化させない。

本開示の実施形態のＣＡＲ、ポリペプチド、及びタンパク質（機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、任意の長さであり得る、すなわち、任意の数のアミノ酸を含み得、但し、ＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（又は機能的部分若しくはその機能的バリアント）は、それらの生物活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、宿主内の疾患細胞（例えば、がん細胞）を検出する能力、又は宿主内の疾患を治療若しくは予防する能力などを保持する。例えば、ポリペプチドは、約５０～約５０００個のアミノ酸長、例えば、約５０、約７０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００又はそれ以上のアミノ酸長であり得る。本発明のポリペプチドには、オリゴペプチドも含まれる。

本明細書の態様及び実施形態で使用されるＣＡＲ、ポリペプチド、及びタンパク質（ＣＡＲの機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、１つ又は２つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことができる。かかる合成アミノ酸は、当該技術分野において既知であり、例としては、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－及びトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、α－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリンβ－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ｎ’，Ｎ’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、α－アミノシクロヘプタンカルボン酸、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、及びα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられる。

本明細書の態様及び実施形態で使用されるＣＡＲ、ポリペプチド、及びタンパク質（機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、翻訳後修飾を受けることができる。これらは、グリコシル化、エステル化、Ｎ－アシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、例えば、ジスルフィド架橋を介して環化することができ、又は酸付加塩に変換することができる。いくつかの実施形態では、これらは、二量体化若しくはポリマー化、又はコンジュゲートされている。

本明細書の態様及び実施形態で使用されるＣＡＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質（その機能的部分及び機能的バリアントを含む）は、当該技術分野において既知の方法によって得ることができる。ポリペプチド及びタンパク質をデノボ合成する好適な方法は、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２０００、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｒｅｉｄ，Ｒ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００、及びＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ，ｅｄ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００１などの参考文献に記載されている。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え方法を使用して本明細書に記載の核酸を使用して、組換えにより産生され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照されたい。更に、本明細書に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、及びタンパク質（その機能的部分及び機能的バリアントを含む）のいくつかは、植物、細菌、昆虫、哺乳動物などの供給源から単離及び／又は精製することができる。単離及び精製の方法は、当該技術分野において既知である。代替的に、本明細書に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質（機能的部分及びその機能的バリアントを含む）は、商業的に合成することができる。この点において、ＣＡＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、合成、組換え、単離、及び／又は精製することができる。

本明細書に記載のポリペプチドを産生するために利用される組換え核酸を生成するために使用することができる修飾ヌクレオチドの例としては、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ^６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルキューオシン、５″－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ^６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ^６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。

核酸は、ＣＡＲ、ポリペプチド若しくはタンパク質、又は機能的部分若しくはその機能的バリアントのいずれかをコードする、任意の単離又は精製されたヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ヌクレオチド配列は、配列のいずれかに縮重したヌクレオチド配列、又は縮重配列の組み合わせを含み得る。核酸は、組換え発現ベクターに組み込むことができる。１つ又は２つ以上の核酸を含む組換え発現ベクターが使用され得る。本明細書で使用するとき、「組換え発現ベクター」という用語は、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現を可能にする、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンストラクトを意味し、この場合、コンストラクトは、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターは、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させるのに十分な条件下で、細胞と接触させられる。本明細書に記載のベクターは、全体として天然には存在しない。しかしながら、ベクターの一部は、天然に存在し得る。記載される組換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖であり得、合成されるか、又は一部が天然の供給源から得られ得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含有し得る）を含むがこれらに限定されない、任意のタイプのヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間連結、若しくは天然に存在しないヌクレオチド間連結、又は両方のタイプの連結を含み得る。天然に存在しない又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間連結は、ベクターの転写又は複製を阻害しない。

組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであってよく、任意の好適な宿主を形質転換又はトランスフェクトするために使用することができる。好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルスなどの繁殖及び増殖のため、若しくは発現のため、又は両方のために設計されたベクターが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）からなる群から選択され得る。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのバクテリオファージベクターを使用することができる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであり得る。

組換え発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製される。環状又は線状である発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核の宿主細胞において機能する複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、２μプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどに由来していてよい。

組換え発現ベクターは、適宜、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主のタイプ（例えば、細菌、植物、真菌、又は動物）に特異的な、転写及び翻訳の開始及び終止コドンなどの調節配列を含み得る。

組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクションされた宿主の選択を可能にする１つ又は２つ以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性）、栄養要求性宿主における原栄養を提供するための補完などを含む。記載される発現ベクターに好適なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ヒスチジノールｘ耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。

組換え発現ベクターは、ＣＡＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質（機能的部分及びその機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列に、又はＣＡＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的であるか若しくはそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列に、作動可能に連結された天然の又は規範のプロモーターを含み得る。プロモーターの選択（例えば、強い、弱い、組織特異的、誘導性、及び発生特異的）は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることも当業者の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、又はネズミ幹細胞ウイルスの長い末端反復に見出されるプロモーターであり得る。

組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のためのいずれか、又はその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために作製され得る。

更に、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用するとき、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に対し薬剤（例えば、薬物）に対する感受性を付与し、細胞が薬剤と接触したとき又は薬剤に曝露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野において既知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（Herpes Simplex Virus、ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼが挙げられる。

阻害分子は、免疫細胞のＣＡＲのエピトープに結合する、例えば特異的に結合する、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、又はその抗原結合部分、又は可溶性抗原、又はその機能的部分若しくは機能的バリアントであり得る。抗体は、当該技術分野において既知の任意のタイプの免疫グロブリンであり得る。免疫グロブリンは、５つの主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４として更に細分類される。脊椎動物種の抗体軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）の２つのタイプの一方に割り当てられ得る。抗体は、任意のクラス又はアイソタイプのものであり得る。

本明細書に記載される方法で使用される抗体は、マウス、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、ポリクローナル、抗原結合断片、二重特異性又は多重特異性抗体、単量体、二量体、四量体又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに必要とされる特異性の抗原結合部位を含む任意の他の改変された立体配置の免疫グロブリン分子を含む、免疫グロブリン分子を含み得る。抗体は、天然に存在する抗体、例えば、哺乳動物（例えば、ネズミ、霊長類、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなど）から単離及び／又は精製された抗体であり得る。代替的に、抗体は、遺伝子操作された（例えば、遺伝的に操作された）抗体であり得る。

ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する抗原結合部位を有し、可変領域フレームワークは、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト起源の配列に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する。

また、抗体は、ＣＡＲの機能的部分に対して任意のレベルの親和性又は結合活性を有し得る。いくつかの実施形態では、抗体は、ある範囲の親和性（Ｋ_Ｄ）でｈＫ２抗原に結合し得る。様々な実施形態では、当業者により実施される表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって判定されるように、抗体は、高い親和性で、例えば、約１０^－７Ｍ以下のＫＤで、例えば、限定するものではないが、１～９．９（又は１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９などの、これに収まる任意の範囲若しくは値）×１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、１０^－１２Ｍ、１０^－１３Ｍ、１０^－１４Ｍ、１０^－１５Ｍ、又はこれに収まる任意の範囲若しくは値のＫＤで、ｈＫ２抗原に結合する。親和性の一例は、１×１０^－８Ｍ以下である。親和性の別の例は、１×１０^－９Ｍ以下である。

ＣＡＲの任意の機能的部分に結合する能力について抗体を試験する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の抗体－抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（radioimmunoassay、ＲＩＡ）、ウエスタンブロット、酵素連結免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、及び競合阻害アッセイなどが挙げられる。

抗体を作製する好適な方法は、当該技術分野において既知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，５１１－５１９（１９７６），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、及びＣ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００１））に記載されている。代替的に、他の方法、例えば、ＥＢＶ－ハイブリドーマ法（Ｈａｓｋａｒｄ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１－６７（１９８４），ａｎｄ Ｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１，１４０－６７（１９８６））、及びバクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５－８１（１９８９）を参照されたい）などが当該技術分野において既知である。更に、非ヒト動物において抗体を産生する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、及び同第５，７１４，３５２号、並びに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６（Ａ１））号に記載されている。

ファージディスプレイを使用して、本明細書に記載の方法のいずれかで使用される抗体を生成することもできる。これに関して、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリーは、標準的な分子生物学及び組換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい）。所望の特異性を有する可変領域をコードしているファージは、所望の抗原（すなわち、ｈＫ２）への特異的結合について選択され、選択された可変ドメインを含む完全又は部分的な抗体が再構成される。再構成された抗体をコードする核酸配列は、ハイブリドーマ産生に使用される骨髄腫細胞などの好適な細胞株に導入され、その結果、モノクローナル抗体の特性を有する抗体が細胞によって分泌される（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（上記）、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（上記）、及び米国特許第６，２６５，１５０号を参照されたい）。

抗体は、特定の重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックであるトランスジェニックマウスによって産生され得る。このような方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５６９，８２５号、並びにＪａｎｅｗａｙら、上記に記載されている。

ヒト化抗体を生成する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、上記、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、及び同第５，６９３，７６１号、欧州特許第０２３９４００（Ｂ１）号、並びに英国特許第２１８８６３８号に記載されている。ヒト化抗体はまた、米国特許第５，６３９，６４１号及びＰｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５，９５９－９７３（１９９４）に記載の抗体リサーフェシング技術を使用して生成することもできる。

抗体は、本明細書で利用されるとき、複数若しくは一本の鎖、又はインタクトな免疫グロブリンであってよく、天然源又は組換え源に由来していてよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。

本明細書に記載される抗体のいずれかの抗原結合部分もまた提供される。抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ダイアボディ、及びトリアボディなどの少なくとも１つの抗原結合部位を有する任意の部分であり得る。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、重鎖相補性決定領域（heavy chain complementarity determining region、ＨＣＤＲ）１、２、及び／若しくは３、軽鎖相補性決定領域（light chain complementarity determining region、ＬＣＤＲ）１、２、及び／若しくは３、重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びＦｖ断片、並びに１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインのいずれかを含む（例えば、それらからなる）ドメイン抗体（ｄＡｂ）である。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、リンカー、例えば、合成リンカーを介して一緒に連結され得る。

また、抗体又はその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate、ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（phycoerythrin、ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、及び元素粒子（例えば、金粒子）などの検出可能な標識を含むように修飾され得る。

本明細書に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（機能的部分及びその機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、本開示によって提供される。

抗体又はその抗体断片を含むＣＡＲの部分は、様々な形態で存在してもよく、その場合、抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ及びヒトキメラ抗体又はヒト化抗体を含む連続するポリペプチド鎖の一部として発現される（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６）。一態様では、ＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。一態様では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。

一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間にリンカーポリペプチドを含む。

組換え発現系にて、リンカーはペプチドリンカーであり、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。リンカーに含まれ得る例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＴｈｅである。リンカーは、ｈＫ２への結合などの所望の活性を保持するように、互いに対して正確な高次構造を形成するような方法でＶＨ及びＶＬを連結させるのに適切な長さを有している必要がある。

リンカーは、約５～５０個のアミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～４０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１５～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、４０個のアミノ酸長である。使用され得る例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、Ｇｌｙ及びＳｅｒ含有リンカー、Ｇｌｙ及びＡｌａ含有リンカー、Ａｌａ及びＳｅｒ含有リンカー、並びに他の柔軟なリンカーである。

一実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、シグナルポリペプチドを含む。シグナルポリペプチドは、ｈＫ２に結合する細胞外抗原結合ドメインのＮ末端に位置し得る。シグナルポリペプチドは、細胞プロセシング及びＣＡＲの細胞膜への局在化の間に、任意選択的に、細胞外抗原結合ドメインから切断され得る。当業者に公知の様々なシグナルポリペプチドのいずれかが、シグナルポリペプチドとして使用され得る。シグナルポリペプチドが由来し得るペプチドの非限定的な例としては、ＦｃεＲ、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）重鎖（ＨＣ）可変領域、ＣＤ８α、又はＴ細胞によって分泌される様々な他のタンパク質のいずれかが挙げられる。様々な実施形態では、シグナルポリペプチドは、Ｔ細胞の分泌経路に適合する。

一態様では、本開示は、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲを提供する。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（ＣＤ１３７）成分、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ζ鎖（ＣＤ３ｚ）成分、分化クラスタ（ＣＤ２７）成分、分化クラスタスーパーファミリーメンバー（例えば、ＣＤ２８又は誘導性Ｔ細胞共刺激因子（inducible T-cell co-stimulator、ＩＣＯＳ）など）成分、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチド成分を含む。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通領域（ＣＤ８Ａ－ＴＭ）ポリペプチドを含む。一実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β、又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、又はＣＤ１５４の（複数の）膜貫通領域を少なくとも含む。別の実施形態において、膜貫通ドメインは、少なくともζ、η、又はＦｃεＲ１γ及びβ、ＭＢ１（Ｉｇα）、Ｂ２９、若しくはＣＤ３－γ、ζ若しくはηの膜貫通ドメインを含む。別の実施形態では、膜貫通ドメインは、合成であり、例えば、ロイシン及びバリン、フェニルアラニンのトリプレット、又はトリプトファンなどの主に疎水性の残基を含む。

一実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに連結するヒンジ領域を更に含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８ａヒンジ領域である。

一態様では、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲを含む単離された免疫応答性細胞を提供する。いくつかの実施形態では、単離免疫応答性細胞は、ＣＡＲで形質導入され、例えば、ＣＡＲは、免疫応答性細胞の表面上に構成的に発現される。ある特定の実施形態では、単離免疫応答性細胞は、少なくとも１つの共刺激リガンドで更に形質導入され、免疫応答性細胞が少なくとも１つの共刺激リガンドを発現するようにする。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ１４、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、単離免疫応答性細胞は、少なくとも１つのサイトカインで更に形質導入され、免疫応答性細胞が少なくとも１つのサイトカインを分泌するようにする。ある特定の実施形態では、少なくともサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、単離された免疫応答性細胞は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞毒性Ｔリンパ球（cytotoxic T lymphocyte、ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ヒト胚性幹細胞、リンパ系前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、及びリンパ系細胞が分化する可能性のある多能性幹細胞からなる群から選択される。

一実施形態では、本開示のＣＡＲ Ｔ発現免疫細胞は、所望のＣＡＲ、例えば、抗ｈＫ２、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにヒト４－１ＢＢ及びＣＤ３－ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを含むレンチウイルスベクターを、細胞に導入することによって生成され得る。本発明のＣＡＲ Ｔ発現免疫細胞は、インビボで複製することができ、その結果、持続的な腫瘍制御につながる可能性のある長期持続性をもたらす。

ＣＡＲ及び阻害分子のいずれも、本明細書に記載の組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞において発現させることができる。本明細書で使用するとき、「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクターを含有し得る任意のタイプの細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、若しくは藻類、真菌であり得るか、又は、原核細胞、例えば、細菌若しくは原生動物であり得る。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞であり得る、すなわち、生物、例えば、ヒトから直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞又は浮遊細胞、すなわち、懸濁物中で増殖する細胞であり得る。好適な宿主細胞は、当該技術分野において公知であり、例えば、ＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。組換え発現ベクターを増幅又は複製する目的で、宿主細胞は、原核細胞、例えば、ＤＨ５α細胞であり得る。組換えＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を産生する目的で、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞はヒト細胞であり得る。宿主細胞は、任意の細胞タイプのものであり得、任意の組織タイプに由来し得、任意の発達段階のものであり得るが、宿主細胞は末梢血リンパ球（peripheral blood lymphocyte、ＰＢＬ）であり得る。宿主細胞はＴ細胞であり得る。

本明細書の目的のために、Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞（例えば、初代Ｔ細胞）、又は培養Ｔ細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など）からのＴ細胞、又は哺乳動物から得られたＴ細胞など、任意のＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、多数の供給源（骨髄、血液、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは体液を含むが、これらに限定されない）から得ることができる。Ｔ細胞はまた、濃縮又は精製され得る。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔｈ_１及びＴｈ_２細胞などのＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞などを含むが、これらに限定されない、任意のタイプのＴ細胞であってもよく、任意の発達段階のものであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞又はＣＤ４^＋Ｔ細胞であり得る。

本明細書に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞集団も提供される。細胞集団は、少なくとも１つの他の細胞、例えば、組換え発現ベクターのいずれも含まない宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、又はＴ細胞以外の細胞（例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、赤血球、好中球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋細胞、脳細胞など）に加えて、記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均質な集団であり得る。代替的に、細胞集団は、実質的に均質な集団であり得、この場合、その集団は、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、本質的にそれらからなる）。集団はまた、細胞のクローン集団であり得、この場合、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、そのため、集団の全ての細胞は組換え発現ベクターを含む。一実施形態では、細胞集団は、本明細書に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。

ＣＡＲに結合する阻害剤
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法において使用される阻害分子は、ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体であり得る。例えば、モノクローナル抗体は、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチド、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞上に発現されるＣＡＲポリペプチドの定常ドメインに特異的に結合することができる。あるいは、抗体は、ＣＡＲポリペプチド（例えば、ＣＤ－１９結合ＣＡＲポリペプチド）の抗原認識ドメインに結合することができる。抗体は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に結合する能力を妨害することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、抗体は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に結合するのを防ぐことができる。

様々な実施形態では、ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が使用される。いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲポリペプチドに結合し、多発性骨髄腫標的細胞、又はＢＣＭＡを発現する任意の他の細胞とのポリペプチドの結合について競合する。モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体であり得る。抗イディオタイプ抗体は、特異的抗体内のＣＤＲ配列に結合することができる特異的抗体である。モノクローナル抗体は、標的抗体の活性、すなわち、抗原に結合するその能力を阻害、破壊又は中和するような様式で標的抗体可変ドメインのＣＤＲに結合する１型抗イディオタイプ抗体であり得る。

阻害分子は、抗イディオタイプペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、抗イディオタイプペプチドは、１つ又は２つ以上の追加の細胞治療薬の抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞のｓｃＦｖ）に結合する。いくつかの実施形態では、抗イディオタイプペプチドは、抗原結合受容体の１つ又は２つ以上のＣＤＲの抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞のｓｃＦｖ）に結合する。様々な実施形態では、抗イディオタイプ抗体又はペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＢ細胞特異的マーカー抗原結合部分（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＲＯＲ１、又はＢＣＭＡに結合するＣＡＲ）に結合する。加えて、例えば、いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ抗体又は断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、抗ＣＤ１９抗体又は断片（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現される抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ））に結合する。

ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖可変領域の全部又は一部を含む阻害分子も提供される。そのような阻害分子はまた、ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合することができる。ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の全部又は一部を含む阻害分子も提供される。そのような阻害分子はまた、ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合することができる。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲポリペプチドに結合するモノクローナル抗体の可変軽鎖及び／又は可変重鎖由来の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む阻害分子も提供される。

特定の実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄ標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が使用される。いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄ特異的ＣＡＲポリペプチドに結合し、多発性骨髄腫標的細胞（例えば、多発性骨髄腫腫瘍細胞）、又はＧＰＲＣ５Ｄを発現する任意の他の細胞とのポリペプチドの結合について競合する。モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体であり得る。ＧＰＲＣ５Ｄ標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖可変領域の全部又は一部を含む阻害分子も提供される。そのような阻害分子はまた、ＧＰＲＣ５Ｄ標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合することができる。ＧＰＲＣ５Ｄ標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の全部又は一部を含む阻害分子も提供される。そのような阻害分子はまた、ＧＰＲＣ５Ｄ標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合することができる。ＧＰＲＣ５Ｄ特異的ＣＡＲポリペプチドに結合するモノクローナル抗体の可変軽鎖及び／又は可変重鎖由来の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む阻害分子も提供される。

特定の実施形態では、ＣＤ７９標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が使用される。いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、ＣＤ７９特異的ＣＡＲポリペプチドに結合し、多発性骨髄腫標的細胞、又はＣＤ７９を発現する任意の他の細胞とのポリペプチドの結合について競合する。モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体であり得る。ＣＤ７９標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖可変領域の全部又は一部を含む阻害分子も提供される。そのような阻害分子はまた、ＣＤ７９標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合することができる。ＣＤ７９標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の全部又は一部を含む阻害分子も提供される。そのような阻害分子はまた、ＣＤ７９標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合することができる。ＣＤ７９特異的ＣＡＲポリペプチドに結合するモノクローナル抗体の可変軽鎖及び／又は可変重鎖由来の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む阻害分子も提供される。

特定の実施形態では、ＫＬＫ２標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が使用される。いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、ＫＬＫ２特異的ＣＡＲポリペプチドに結合し、多発性骨髄腫標的細胞、又はＫＬＫ２を発現する任意の他の細胞とのポリペプチドの結合について競合する。モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体であり得る。ＫＬＫ２標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖可変領域の全部又は一部を含む阻害分子も提供される。そのような阻害分子はまた、ＫＬＫ２標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合することができる。ＫＬＫ２標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の全部又は一部を含む阻害分子も提供される。そのような阻害分子はまた、ＫＬＫ２標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合することができる。ＫＬＫ２特異的ＣＡＲポリペプチドに結合するモノクローナル抗体の可変軽鎖及び／又は可変重鎖由来の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む阻害分子も提供される。特定の実施形態では、ＣＤ１９標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が使用される。いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲポリペプチドに結合し、多発性骨髄腫標的細胞、又はＣＤ１９を発現する任意の他の細胞とのポリペプチドの結合について競合する。モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体であり得る。ＣＤ１９標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖可変領域の全部又は一部を含む阻害分子も提供される。そのような阻害分子はまた、ＣＤ１９標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合することができる。ＣＤ１９標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の全部又は一部を含む阻害分子も提供される。そのような阻害分子はまた、ＣＤ１９標的化ＣＡＲポリペプチドに特異的に結合することができる。ＣＤ１９特異的ＣＡＲポリペプチドに結合するモノクローナル抗体の可変軽鎖及び／又は可変重鎖由来の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む阻害分子も提供される。

様々な実施形態では、阻害分子、例えば、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、又はモノクローナル抗体の誘導体は、導入遺伝子特異的拡大が可能である。その抗原結合断片を含む抗イディオタイプ抗体は、抗体又はその抗原結合断片のイディオトープ、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの組換え受容体の抗原結合ドメインを特異的に認識し、特異的に標的とし、かつ／又は特異的に結合する。イディオトープは、抗体の可変部分内の任意の単一の抗原決定基又はエピトープである。抗イディオタイプ抗体又はその抗原結合断片は、アゴニストであってもよく、及び／又は特定の抗体を発現する細胞を刺激する特異的活性を示してもよく、その抗体又はその抗原結合断片を含有するコンジュゲート又は組換え受容体を含む（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００９６９０２号、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１号、米国特許出願公開第２０１４／０３２２１８３号、米国特許出願公開第２０１５／０１７５７１１号、米国特許出願公開第２０１５／２８３１７８号、米国特許第９，１０２，７６０号、Ｊｅｎａ ｅｔ ａｌ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ（２０１３）８（３）：ｅ５７８３８、Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１５）２１（６）：５８１－５９０、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ（２０１５）３８５（９９６７）：５１７－５２８、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ（２０１４）９（５）：ｅ９６６９７、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．（２０１５）７（１）：６６－７６を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲと相互作用する標的細胞上に発現される抗原の可溶性形態、又はその機能的断片若しくは誘導体である。例えば、可溶性抗原は、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ７９、ＫＬＫ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＦＬＴ３の可溶性形態、又はそれらの機能的断片若しくは誘導体であり得る。

ＣＡＲ－Ｔ細胞と阻害剤との接触
細胞を、ＣＡＲの抗原認識ドメインに結合するモノクローナル抗体又は可溶性抗原と接触させることによって、特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ＢＣＭＡ結合ＣＡＲを発現するＴ細胞）の能力を防止又は改変することを含む、様々な方法が本明細書に開示される。

一態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を発現する免疫細胞の細胞傷害性を決定するためのインビトロ方法であって、方法が、
ａ）試験試料において、ＣＡＲ発現免疫細胞を標的細胞（例えば、腫瘍細胞）とともにインキュベートすることであって、標的細胞が、ＣＡＲと相互作用する抗原を発現する、ことと、
ｂ）第１の対照試料において、ＣＡＲ発現免疫細胞を標的細胞とともにインキュベートすることであって、当該インキュベーションが阻害分子の存在下で行われ、阻害分子がＣＡＲと標的細胞との間の相互作用を低減、阻害、遮断、及び／又は防止する、ことと、
ｃ）試験試料における標的細胞死の量を決定することと、
ｄ）第１の対照試料における標的細胞死の量を決定することと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）において決定された標的細胞死の量を比較することに基づいて、ＣＡＲ発現免疫細胞の細胞傷害性を決定することと、を含み、
試験試料及び第１の対照試料において、インキュベーション時間、ＣＡＲ発現免疫細胞の量及び標的細胞の量が、実質的に同じである、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、試験試料のインキュベーション時間は、第１の対照試料のインキュベーション時間の８５～１１５％、９０％～１１０％、又は９５～１０５％である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現免疫細胞の量は、標的細胞の量の８５～１１５％、９０％～１１０％又は９５～１０５％である。

いくつかの実施形態では、インキュベーションステップ（ａ）及び（ｂ）は同時に実行される。同時実行は、これらのステップの開始時間と終了時間との間に、例えば、１時間、３０分、又は１５分などのいくらか差を許容することができる。ステップ（ａ）及び（ｂ）を同時に行うことにより、インキュベーション時間、ＣＡＲ発現免疫細胞の量及び標的細胞の量が実質的に同じである条件を提供することができる。いくつかの実施形態では、決定するステップ（ｃ）及び（ｄ）は、同時に実行される。同時実行は、これらのステップの開始時間と終了時間との間に、例えば、１時間、３０分、又は１５分などのいくらか差を許容することができる。ステップ（ｃ）及び（ｄ）を同時に行うことにより、インキュベーション時間、ＣＡＲ発現免疫細胞の量、及び標的細胞の量が実質的に同じである条件を提供することができる。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現免疫細胞及び／又は標的細胞は、当該接触させるステップの前に阻害分子とともにプレインキュベートされている。

いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）において決定された標的細胞（例えば、腫瘍細胞）死の量を、第２の対照試料において決定された標的細胞死の量と比較することを更に含み、標的細胞は、ＣＡＲ発現免疫細胞の非存在下でインキュベートされる。

いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）において決定された標的細胞死の量を、第３の対照試料において決定された標的細胞死の量と比較することを更に含み、標的細胞は、ＣＡＲ発現免疫細胞の非存在下であるが標的細胞死を引き起こす界面活性剤の存在下でインキュベートされる。特定の実施形態では、界面活性剤は、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００である。

様々な実施形態では、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）は、当該標的細胞死の際に検出可能なレポーターシグナルを産生し、ステップ（ｃ）は、試験試料中のレポーターシグナルを決定することを含み、ステップ（ｄ）は、第１の対照試料中のレポーターシグナルを決定することを含み、ステップ（ｅ）は、ステップ（ｃ）及び（ｄ）において決定されたレポーターシグナルを比較することを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、標的細胞が細胞死を経るときにシグナルを産生するレポータータンパク質を発現する。本開示の方法における使用に好適な例示的なレポータータンパク質としては、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescent Protein、ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescent Protein、ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescent Protein、ＢＦＰ）、及びそれらのバリアント又は誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、レポーターシグナルは、発光である。レポーターシグナル（例えば、発光）を生成することができるタンパク質は、細胞コンパートメントにおいて発現され得る。細胞死の際に、タンパク質は、細胞コンパートメントから培地中に放出され、タンパク質は、例えば、発光を生成するための薬剤に酵素的に作用することによって、発光シグナルを生成し得る。この様式で使用され得る例示的な細胞としては、ＫＩＬＲ（登録商標）標的細胞が挙げられる。標的細胞は、キメラ抗原受容体と相互作用する抗原を発現するように操作することができる。特定の実施形態では、ＫＩＬＲ（登録商標）ＭＭ－１Ｒ多発性骨髄腫標的細胞が使用される。標的細胞はまた、標識又は酵素でタグ付けされたタンパク質を安定に発現することもできる。標的細胞株が細胞傷害性アッセイにおいて使用され、その膜が細胞死に起因して損なわれる場合、標的細胞株は、タグ付きタンパク質を培地中に放出し得る。タグ付きタンパク質は、タンパク質上の酵素タグの基質である試薬を培地に添加することによって検出することができる。例えば、β－ガラクトシダーゼ酵素は基質を加水分解して化学発光出力を与えることができる。発光は、化学発光を測定することができるプレートリーダー上で定量化することができる。あるいは、タグ付きタンパク質は、標識を検出するためのアッセイを介して検出され得る。

いくつかの実施形態では、レポーターシグナルは、蛍光である。レポーターシグナル（例えば、蛍光）を生成することができるタンパク質は、細胞コンパートメントにおいて発現され得る。細胞死の際に、タンパク質は細胞コンパートメントから培地中に放出され、そこでタンパク質は蛍光シグナルを生成することができる。

いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲと相互作用する標的細胞上の抗原に特異的に結合する。理論に束縛されることを望むものではないが、抗原に結合する阻害分子の使用は、細胞傷害性アッセイ又は他の関連するＣＡＲ効力アッセイにおける好適な対照を提供でき、トランスフェクトされていない又はモックトランスフェクトされた免疫細胞を対照として使用する必要がなくなる。これにより、製剤と並行してモックＣＡＲ－Ｔ細胞を産生する必要性を排除することができる。モックＣＡＲ－Ｔ細胞の産生は、いくつかの点で製剤の生産に影響を及ぼし得る。モック細胞対照の使用を排除することで、製造プロセスを簡素化することができ、患者からの任意の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞のサンプリングを低減することによって患者投薬が達成され得ることを確実にすることができ、そうでなければ、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法におけるコストを低減することができる。本明細書で説明される方法はまた、モック細胞失敗による試験遅延を低減又は排除することができる。本方法はまた、より簡素化されたフォーマットの提供を通して、試験エラーを低減することができる。試験遅延及びエラーの低減はまた、生産遅延及び／又は患者投薬遅延の回避を提供することができる。

いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲと相互作用する標的細胞上に発現される抗原に特異的に結合するＣＡＲ内の領域に特異的に結合する。ＣＡＲ、特に、抗原に特異的に結合するＣＡＲ内の領域（例えば、１つ又は２つ以上のＣＤＲ配列又はその一部を含むエピトープ）に結合することによって、阻害分子は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞と相互作用するのを遮断することができる。そのような遮断により、ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞を殺傷することを防ぐことができる。したがって、モックトランスフェクト免疫細胞を使用する代わりに、患者自身のＣＡＲ－Ｔ細胞を、代わりに好適な対照として阻害分子を添加して使用することができる。

いくつかの実施形態では、阻害分子は、抗体である。特定の実施形態では、抗体は、抗イディオタイプ抗体である。抗イディオタイプ抗体は、キメラ抗原受容体への結合について、宿主細胞上の抗原と競合することができる。抗イディオタイプ抗体は、抗原といくつかの構造的特徴を共有し得る。

いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、キメラ抗原受容体のｓｃＦｖドメイン内の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ｓｃＦｖドメイン内のＣＤＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、キメラ抗原受容体のＦａｂドメイン内の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、Ｆａｂドメイン内のＣＤＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、キメラ抗原受容体のＶＨ又はＶＬドメイン内の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ＶＨドメイン又はＶＬドメイン内のＣＤＲに特異的に結合する。

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）受容体と相互作用し、標的細胞は、ＢＣＭＡ受容体を含み、阻害分子は、ＢＣＭＡの可溶性細胞質ドメインである。いくつかの実施形態では、標的細胞は、多発性骨髄腫細胞である。ある実施態様では、多発性骨髄腫細胞は、ＭＭ－１Ｒ細胞である。

様々な他の実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ７９、ＫＬＫ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＦＬＴ３を含むがこれらに限定されない腫瘍及び疾患抗原と相互作用する。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原ＧＰＲＣ５Ｄと相互作用する。いくつかの実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄ受容体は、標的細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲに対する抗イディオタイプ抗体又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＧＰＲＣ５Ｄ受容体に対する抗イディオタイプ抗体又は抗体断片である。非限定的な例として、標的細胞は、多発性骨髄腫細胞である。多発性骨髄腫細胞の非限定的な例は、ＭＭ－１Ｒ細胞である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原ＫＬＫ２と相互作用する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ２抗原は、標的細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、阻害分子は、可溶性ＫＬＫ２タンパク質である。非限定的な例として、標的細胞は、前立腺がん細胞である。前立腺細胞の非限定的な例は、ＬＮＣａＰ細胞である。

様々な実施形態では、本方法は、ハイスループット形式で行われる。

宿主細胞
本明細書に記載の阻害分子は、本明細書に記載するような核酸分子、ＣＡＲポリペプチド分子又はベクターを含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞集団）において発現させてもよい。免疫エフェクター細胞は、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり得る。阻害分子は、種々の哺乳動物細胞型（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）において発現させることができ、その後、本明細書に記載されるアッセイのいずれかにおいて使用する前に精製することができる。

本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ分子は、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞において発現させることができる。免疫エフェクター細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得ることができる。アフェレーシス産物は、一般に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含有する。アフェレーシスによって収集された細胞は、血漿画分を除去するために洗浄され得、次いで、細胞は、その後の処理ステップのために適切な緩衝液又は培地中に配置され得る。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）で洗浄してもよい。洗浄溶液は、カルシウムを欠いていてもよく、マグネシウムを欠いていてもよく、及び／又は全ての二価カチオンを欠いていてもよい。

本明細書に記載される方法は、例えば、本明細書に記載の、例えば、陰性選択技術を使用して、例えば、免疫エフェクター細胞の、例えばＴ細胞の特定の亜集団である、制御性Ｔ細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞の選択を含み得る。好ましくは、制御性Ｔ細胞枯渇細胞の集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。

効力アッセイ
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の効力を特徴付けるための方法が開示される。本方法は、（ａ）抗原特異的様式で（すなわち、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲを介して）ＣＡＲ－Ｔ細胞を刺激することと、（ｂ）刺激された細胞の抗原特異的細胞傷害性のレベルを決定することと、を含む。

一態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を発現する免疫細胞の効力を決定するためのインビトロ方法であって、方法が、
ａ）試験試料において、ＣＡＲ発現免疫細胞を標的細胞（例えば、腫瘍細胞）とともにインキュベートすることであって、標的細胞が、ＣＡＲと相互作用する抗原を発現する、ことと、
ｂ）第１の対照試料において、ＣＡＲ発現免疫細胞を標的細胞とともにインキュベートすることであって、当該インキュベーションが阻害分子の存在下で行われ、阻害分子がＣＡＲと標的細胞との間の相互作用を低減、阻害、遮断、及び／又は防止する、ことと、
ｃ）試験試料中のＣＡＲ発現免疫細胞と標的細胞との間の相互作用の量を決定することと、
ｄ）第１の対照試料におけるＣＡＲ発現免疫細胞と標的細胞との間の相互作用の量を決定することと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）において決定された相互作用の量を比較することに基づいて、ＣＡＲ発現免疫細胞の効力を決定することと、を含み、
試験試料及び第１の対照試料において、インキュベーション時間、ＣＡＲ発現免疫細胞の量及び標的細胞の量は、実質的に同じである、方法を提供する。

ＣＡＲ発現免疫細胞と標的細胞との間の相互作用は、例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞と標的細胞との結合を評価することによって、直接測定することができる。ＣＡＲ発現免疫細胞と標的細胞との間の相互作用は、例えば細胞死、アポトーシス、壊死、サイトカインの放出、細胞形態の変化などを評価することによって、間接的に測定することができる。

いくつかの実施形態では、試験試料のインキュベーション時間は、第１の対照試料のインキュベーション時間の８５～１１５％、９０％～１１０％、又は９５～１０５％である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現免疫細胞の量は、標的細胞の量の８５～１１５％、９０％～１１０％又は９５～１０５％である。

いくつかの実施形態では、インキュベーションステップ（ａ）及び（ｂ）は同時に実行される。同時実行は、これらのステップの開始時間と終了時間との間に、例えば、１時間、３０分、又は１５分などのいくらか差を許容することができる。ステップ（ａ）及び（ｂ）を同時に行うことにより、インキュベーション時間、ＣＡＲ発現免疫細胞の量及び標的細胞の量が実質的に同じである条件を提供することができる。いくつかの実施形態では、決定するステップ（ｃ）及び（ｄ）は、同時に実行される。同時実行は、これらのステップの開始時間と終了時間との間に、例えば、１時間、３０分、又は１５分などのいくらか差を許容することができる。ステップ（ｃ）及び（ｄ）を同時に行うことにより、インキュベーション時間、ＣＡＲ発現免疫細胞の量及び標的細胞の量が実質的に同じである条件を提供することができる。

いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）のＣＡＲ発現免疫細胞と標的細胞との間の相互作用の量を、第２の対照試料において決定された標的細胞死の量と比較することを更に含み、標的細胞は、ＣＡＲ発現免疫細胞の非存在下でインキュベートされる。

いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）におけるＣＡＲ発現免疫細胞と標的細胞との間の相互作用の量を、第３の対照試料において決定された標的細胞死の量と比較することを更に含み、標的細胞は、ＣＡＲ発現免疫細胞の非存在下であるが標的細胞死を引き起こす界面活性剤の存在下でインキュベートされる。特定の実施形態では、界面活性剤は、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００である。

様々な実施形態では、標的細胞は、当該標的細胞死の際に検出可能なレポーターシグナルを産生し、ステップ（ｃ）は、試験試料におけるレポーターシグナルを決定することを含み、ステップ（ｄ）は、第１の対照試料におけるレポーターシグナルを決定することを含み、ステップ（ｅ）は、ステップ（ｃ）及び（ｄ）において決定されたレポーターシグナルを比較することを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、標的細胞がＣＡＲ発現免疫細胞と相互作用するときにシグナルを産生するレポータータンパク質を発現する。

いくつかの実施形態では、レポーターシグナルは、発光である。レポーターシグナル（例えば、発光）を生成することができるタンパク質は、細胞コンパートメントにおいて発現され得る。細胞死の際に、タンパク質は、細胞コンパートメントから培地中に放出され、タンパク質は、例えば、発光を生成するための薬剤に酵素的に作用することによって、発光シグナルを生成し得る。この様式で使用され得る例示的な細胞としては、ＫＩＬＲ（登録商標）標的細胞が挙げられる。標的細胞は、キメラ抗原受容体と相互作用する抗原を発現するように操作することができる。特定の実施形態では、ＫＩＬＲ（登録商標）ＭＭ－１Ｒ多発性骨髄腫標的細胞が使用される。標的細胞はまた、標識又は酵素でタグ付けされたタンパク質を安定に発現することもできる。標的細胞株が細胞傷害性アッセイにおいて使用され、その膜が細胞死に起因して損なわれる場合、標的細胞株は、タグ付きタンパク質を培地中に放出し得る。タグ付きタンパク質は、タンパク質上の酵素タグの基質である試薬を培地に添加することによって検出することができる。例えば、β－ガラクトシダーゼ酵素は基質を加水分解して化学発光出力を与えることができる。発光は、化学発光を測定することができるプレートリーダー上で定量化することができる。あるいは、タグ付きタンパク質は、標識を検出するためのアッセイを介して検出され得る。

いくつかの実施形態では、レポーターシグナルは、蛍光である。レポーターシグナル（例えば、蛍光）を生成することができるタンパク質は、細胞コンパートメントにおいて発現され得る。細胞死の際に、タンパク質は細胞コンパートメントから培地中に放出され、そこでタンパク質は蛍光シグナルを生成することができる。

いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲと相互作用する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の抗原に特異的に結合する。理論に束縛されることを望むものではないが、抗原に結合する阻害分子の使用は、ＣＡＲ効力アッセイにおける好適な対照を提供することができ、トランスフェクトされていない又はモックトランスフェクトされた免疫細胞を対照として使用する必要がなくなる。これにより、製剤と並行してモックＣＡＲ－Ｔ細胞を産生する必要性を排除することができる。モックＣＡＲ－Ｔ細胞の産生は、いくつかの点で製剤の生産に影響を及ぼし得る。モック細胞対照の使用を排除することは、製造プロセスを簡素化することができ、患者からの任意の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞のサンプリングを低減することによって患者投薬が達成され得ることを確実にすることができ、そうでなければ、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法におけるコストを低減することができる。本明細書で説明される方法はまた、モック細胞失敗による試験遅延を低減又は排除することができる。本方法はまた、より簡素化されたフォーマットの提供を通して、試験エラーを低減することができる。試験遅延及びエラーの低減はまた、生産遅延及び／又は患者投薬遅延の回避を提供することができる。

いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲと相互作用する標的細胞上に発現される抗原に特異的に結合するＣＡＲ内の領域に特異的に結合する。ＣＡＲ、特に、抗原に特異的に結合するＣＡＲ内の領域（例えば、１つ又は２つ以上のＣＤＲ配列又はその一部を含むエピトープ）に結合することによって、阻害分子は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞と相互作用するのを遮断することができる。そのような遮断により、ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞と相互作用するのを防ぐことができる。したがって、モックトランスフェクト免疫細胞を使用する代わりに、患者自身のＣＡＲ－Ｔ細胞を、代わりに好適な対照として阻害分子を添加して使用することができる。

いくつかの実施形態では、阻害分子は、抗体である。特定の実施形態では、抗体は、抗イディオタイプ抗体である。抗イディオタイプ抗体は、キメラ抗原受容体への結合について、宿主細胞上の抗原と競合することができる。抗イディオタイプ抗体は、抗原といくつかの構造的特徴を共有し得る。

いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、キメラ抗原受容体のｓｃＦｖドメイン内の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ｓｃＦｖドメイン内のＣＤＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、キメラ抗原受容体のＦａｂドメイン内の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、Ｆａｂドメイン内のＣＤＲに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、キメラ抗原受容体のＶＨ又はＶＬドメイン内の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ＶＨドメイン又はＶＬドメイン内のＣＤＲに特異的に結合する。

いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲと相互作用する標的細胞上に発現される抗原の可溶性形態、又はその機能的断片若しくは誘導体である。

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）受容体と相互作用し、標的細胞は、ＢＣＭＡ受容体を含み、阻害分子は、ＢＣＭＡの可溶性細胞質ドメインである。いくつかの実施形態では、標的細胞は、多発性骨髄腫細胞である。ある実施態様では、多発性骨髄腫細胞は、ＭＭ－１Ｒ細胞である。

様々な他の実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ７９、ＫＬＫ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＦＬＴ３を含むがこれらに限定されない腫瘍及び疾患抗原と相互作用する。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原ＧＰＲＣ５Ｄと相互作用する。いくつかの実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄ受容体は、標的細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＣＡＲに対する抗イディオタイプ抗体又は抗体断片である。いくつかの実施形態では、阻害分子は、ＧＰＲＣ５Ｄ受容体に対する抗イディオタイプ抗体又は抗体断片である。非限定的な例として、標的細胞は、多発性骨髄腫細胞である。多発性骨髄腫細胞の非限定的な例は、ＭＭ－１Ｒ細胞である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原ＫＬＫ２と相互作用する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ２抗原は、標的細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、阻害分子は、可溶性ＫＬＫ２タンパク質である。非限定的な例として、標的細胞は、前立腺がん細胞である。前立腺細胞の非限定的な例は、ＬＮＣａＰ細胞である。

抗原特異的細胞傷害性のレベルを決定する際に対照としてモックトランスフェクトＣＡＲ－Ｔ細胞を使用する代わりに、アッセイにおいて試験される同じＣＡＲ－Ｔ細胞を、本明細書に記載される阻害分子で処理することができる。阻害分子（例えば、ＣＡＲが特異的に結合するモノクローナル抗体又は可溶性抗原）による処置は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗原に結合して細胞傷害性を発揮するのを防ぐことができる。阻害分子で処理された同じＣＡＲ－Ｔ細胞、又は非特異的に刺激されたＣＡＲ－Ｔ細胞（すなわち、抗原特異的に刺激されていない刺激ＣＡＲ－Ｔ細胞）の細胞傷害性のレベルと比較した、抗原特異的に刺激された細胞の細胞傷害性のレベルの増加の検出を使用して、療法での使用のための刺激されたＣＡＲ－Ｔ細胞を示すことができる。本方法はインビトロで実施することができる。

様々な実施形態において、阻害分子（例えば、腫瘍抗原又は抗イディオタイプ抗体）は、ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＡＲが特異的である抗原（例えば、腫瘍抗原）によって刺激され得るＣＡＲ－Ｔ細胞を刺激するのに有効ではない。そのような実施形態は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化から生じる効力パラメータを活性化しないという利点を提供することができる。

ＣＡＲ－Ｔ細胞の効力及び細胞傷害機能を決定するための方法も提供される。一般に、本方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＡＲの抗原特異的刺激、その後の抗原特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性の定量化を含む。ＣＡＲ－Ｔ細胞効力の尺度は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法製品の予想されるインビボ薬物動態のインビトロ指標として使用することができる。ＣＡＲ－Ｔ効力のアッセイは、ＣＡＲ－Ｔ細胞製品が臨床使用に適しているかどうかを決定するため、ＣＡＲ－Ｔ細胞製品の潜在的有効性を評価するため、投与されるＣＡＲ－Ｔ細胞の投与量を決定するため、及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法製品のための新しい製造アプローチを特徴付けるために更に使用することができる。

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法製品の効力は、製品の抗原特異的細胞傷害性のレベルを反映する用語で表すことができる。この細胞傷害性のレベルは、例えば、抗原特異的刺激及び本明細書に記載の阻害分子の両方に曝露されるＣＡＲ－Ｔ細胞療法製品の対照試料の細胞傷害性のレベルと比較することができる。更に、計算は、例えば、ＣＡＲを発現する試験試料中の細胞の数に基づいて正規化することができる。この情報に基づいて、以下の式による細胞傷害性指数（Cytotoxicity Index、ＣＩ）を、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法製品の効力の尺度として使用することができる。

ＣＩ＝［（刺激群における細胞傷害性）－（対照群における細胞傷害性）］／ＣＡＲを発現する細胞％
正規化のために、当該技術分野において公知の方法を使用して、ＣＡＲを発現する細胞のパーセンテージ（例えば、形質導入のレベル）を決定することができる。例えば、フローサイトメトリーを利用する試験では、ＣＡＲに対する抗体をアッセイに含めて、Ｔ細胞の総数に対するＣＡＲ発現細胞のレベルを定量するために使用することができる。

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法製品の抗原特異的インビトロ細胞傷害性のレベルは、ＣＡＲ－Ｔ製品のインビボ薬物動態（pharmacokinetic、ＰＫ）及び薬力学（pharmacodynamics、ＰＤ）特性と相関する可能性がある。本発明に従って考慮され得るＣＡＲ－Ｔ細胞調製物のＰＫ／ＰＤ特徴としては、例えば、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、及び曲線下面積（Area Under the Curve、ＡＵＣ）が挙げられ、これらは、当該技術分野における標準的な方法を使用して臨床試料において決定され得る。例えば、上記の細胞傷害性指数に反映されるようなＣＡＲ－Ｔ細胞療法製品のインビトロ細胞傷害性と、製品のインビボＰＫ／ＰＤ特性との間の関係は、例えば、これらの特徴間の線形関連を評価するために使用することができるスピアマン相関係数法などの標準的な方法を使用して示すことができる。本明細書に記載される様々な方法は、例えば、ＣＩの決定によって示されるような抗原特異的インビトロ細胞傷害性に基づいて、ＰＫ／ＰＤパラメータを予測するための基準を提供することができる。

キット
本明細書に記載される組成物のいずれも、キットに構成することができる。いくつかの実施態様では、ＣＡＲ結合抗体をキットで提供し、これはまた、細胞を拡大させるのに適した試薬、例えば、培地、ＡＰＣ、増殖因子、抗原、他の抗体（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞を選別又は特徴付けするための）及び／又はＣＡＲ又はトランスポザーゼをコードするプラスミド、を含み得る。

非限定的な例では、ＣＡＲ結合抗体、キメラ受容体発現コンストラクト（又はキメラ受容体発現コンストラクトを生成するための試薬）、発現コンストラクトのトランスフェクションのための試薬、及び／又は、発現コンストラクトのトランスフェクションのための同種異系細胞を得るための１つ若しくは２つ以上の器具（そのような器具は、注射器、ピペット、鉗子、及び／又はこのような医学的に承認された任意の装置であり得る）がキットに提供される。いくつかの態様では、キットは、細胞のエレクトロポレーションのための試薬又は装置を含む。

キットは、ＣＡＲ結合抗体と特異的に相互作用する抗原を発現する標的細胞、抗原をコードする発現コンストラクトのトランスフェクションのための試薬、及び／又は発現コンストラクトのトランスフェクションのための同種異系細胞を得るための１つ若しくは２つ以上の器具（そのような器具は、シリンジ、ピペット、鉗子、及び／又はこのような医学的に承認された任意の装置であり得る）を含み得、キットで提供される。いくつかの態様では、キットは、細胞のエレクトロポレーションのための試薬又は装置を含む。

キットは、本発明の１つ又は２つ以上の好適に等分された組成物又は本発明の組成物を生成するための試薬を含んでもよい。キットの構成成分は、水性培地又は凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化されてもよい。キットの容器手段は、少なくとも１つのバイアル瓶、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、又は、他の容器手段を含んでもよく、その中に構成成分が入れられてもよく、好ましくは、好適に等分されてもよい。キット内に２つ以上の構成成分が存在する場合、キットはまた一般に、追加の構成成分を別々に入れることができる第２、第３、又は他の追加の容器を含むことになる。しかしながら、構成成分の様々な組み合わせがバイアル瓶に含まれてもよい。本発明のキットは、典型的には、キメラ受容体コンストラクトを収容するための手段と、商用販売のために密閉された任意の他の試薬容器とを含むことになる。このような容器としては、例えば、所望のバイアルが保持される射出成形又は吹込成形プラスチック容器が挙げられ得る。

実施形態
１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を発現する免疫細胞の効力を決定するためのインビトロ方法であって、方法が、
ａ）試験試料において、ＣＡＲ発現免疫細胞を標的細胞と接触させることであって、標的細胞が、ＣＡＲと相互作用する抗原を発現する、ことと、
ｂ）第１の対照試料において、ＣＡＲ発現免疫細胞を標的細胞と接触させることであって、（ｉ）当該接触させることが阻害分子の存在下で行われるか、又は（ｉｉ）ＣＡＲ発現免疫細胞及び／若しくは標的細胞が当該接触させることの前に阻害分子とともにプレインキュベートされており、阻害分子がＣＡＲと標的細胞との間の相互作用を阻害する、ことと、
ｃ）試験試料における標的細胞死の量を決定することと、
ｄ）第１の対照試料における標的細胞死の量を決定することと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）において決定された標的細胞死の量を比較することに基づいて、ＣＡＲ発現免疫細胞の効力を決定することと、を含み、
試験試料及び第１の対照試料において、接触させる時間、ＣＡＲ発現免疫細胞の量及び標的細胞の量が、実質的に同じである、方法を提供する。

２．接触させるステップ（ａ）及び（ｂ）が同時に実行される、実施形態１の方法。

３．決定するステップ（ｃ）及び（ｄ）が同時に実行される、実施形態１又は実施形態２の方法。

４．ステップ（ｂ）（ｉ）において、ＣＡＲ発現免疫細胞及び／又は標的細胞が、接触させるステップの前に阻害分子とともにプレインキュベートされている、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。

５．当該方法が、ステップ（ｃ）において決定された標的細胞死の量を、第２の対照試料において決定された標的細胞死の量と比較することを更に含み、標的細胞が、ＣＡＲ発現免疫細胞の非存在下でインキュベートされる、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。

６．当該方法が、ステップ（ｃ）において決定された標的細胞死の量を、第３の対照試料において決定された標的細胞死の量と比較することを更に含み、標的細胞が、ＣＡＲ発現免疫細胞の非存在下であるが標的細胞死を引き起こす界面活性剤の存在下でインキュベートされる、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。

７．界面活性剤が、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００である、実施形態６に記載の方法。

８．標的細胞が、当該標的細胞死の際に検出可能なレポーターシグナルを産生し、ステップ（ｃ）が、試験試料におけるレポーターシグナルを決定することを含み、ステップ（ｄ）が、第１の対照試料におけるレポーターシグナルを決定することを含み、ステップ（ｅ）が、ステップ（ｃ）及び（ｄ）において決定されたレポーターシグナルを比較することを含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。

９．レポーターシグナルが、発光である、実施形態８に記載の方法。

１０．レポーターシグナルが、蛍光である、実施形態８に記載の方法。

１１．標的細胞が、標的細胞が細胞死を経るときにシグナルを産生するレポータータンパク質を発現する、実施形態８～１０のいずれか１つに記載の方法。

１２．レポータータンパク質が、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又はそのバリアント若しくは誘導体である、実施形態１１に記載の方法。

１３．阻害分子が、標的細胞上の抗原に特異的に結合し、抗原がＣＡＲと相互作用する、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。

１４．阻害分子が、ＣＡＲに特異的に結合する、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。

１５．阻害分子が、標的細胞上に発現される抗原に特異的に結合するＣＡＲ内の領域に特異的に結合する、実施形態１４に記載の方法。

１６．阻害分子が抗体又は抗体断片である、実施形態１３、１４又は１５に記載の方法。

１７．抗体が、抗イディオタイプ抗体である、実施形態１６に記載の方法。

１８．抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’））２、Ｆｖ若しくはＦｄ断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、線状抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインである、実施形態１６又は１７に記載の方法。

１９．抗体又は抗体断片が、ＣＡＲのｓｃＦｖドメイン内の抗原に特異的に結合する、実施形態１６、１７又は１８に記載の方法。

２０．抗体又は抗体断片が、ＣＡＲのｓｃＦｖドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）に特異的に結合する、実施形態１９記載の方法。

２１．抗体又は抗体断片が、ＣＡＲのＶＨドメイン又はＶＬドメイン内の抗原に特異的に結合する、実施形態１６、１７又は１８に記載の方法。

２２．抗体又は抗体断片が、ＣＡＲのＶＨドメイン又はＶＬドメイン内のＣＤＲに特異的に結合する、実施形態２１記載の方法。

２３．阻害分子が、ＣＡＲと相互作用する標的細胞上で発現される抗原の可溶性形態、又はその機能的断片若しくは誘導体である、実施形態１４又は１５に記載の方法。

２４．免疫細胞が、Ｔ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択される、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。

２５．ＣＡＲが、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）受容体と相互作用し、標的細胞がＢＣＭＡ受容体を含み、阻害分子がＢＣＭＡの可溶性細胞質ドメインである、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。

２６．標的細胞が、多発性骨髄腫細胞である、実施形態２５に記載の方法。

２７．多発性骨髄腫細胞が、ＭＭ－１Ｒ細胞である、実施形態２６に記載の方法。

２８．ＣＡＲが、Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）と相互作用し、標的細胞が、ＧＰＲＣ５Ｄ受容体を含み、阻害分子が、ＣＡＲに対する抗イディオタイプ抗体又は抗体断片である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。

２９．ＣＡＲが、Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）と相互作用し、標的細胞がＧＰＲＣ５Ｄ受容体を含み、阻害分子がＧＰＲＣ５Ｄ受容体に対する抗イディオタイプ抗体又は抗体断片である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。

３０．標的細胞が、多発性骨髄腫細胞である、実施形態２８又は２９に記載の方法。

３１．多発性骨髄腫細胞が、ヒトＭＭ－１Ｒ細胞である、実施形態３０に記載の方法。

３２．ＣＡＲが、カリケリン（kallikerin）２（ＫＬＫ２）と相互作用し、標的細胞がＫＬＫ２を含み、阻害分子が可溶性ＫＬＫ２タンパク質である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。

３３．標的細胞が、前立腺がん細胞である、実施形態３２に記載の方法。

３４．前立腺がん細胞が、ＬＮＣａＰ細胞である、実施形態３３に記載の方法。

３５．方法が、ハイスループット形式で行われる、実施形態１～３４のいずれか一項に記載の方法。

本発明はまた、以下の実施例によって説明及び実証される。しかしながら、本明細書中のいずれの箇所でのこれら及びその他の実施例の使用は、単に例示にすぎず、本発明の範囲及び意味を限定するものではなく、又は任意の例示的な用語の範囲及び意味を限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書に記載される任意の特定の好ましい実施形態に限定されない。実際に、本発明の多くの修正及び変形は、本明細書を読むことにより、当業者には明らかであり得、そのような変形は、趣旨又は範囲において本発明から逸脱することなくなされ得る。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲、及びこれら請求項の権利が与えられる均等物の全範囲によってのみ限定されるものである。

（実施例１）
以下の材料をこの実施例で使用した。ＣＡＲ－Ｔ ＤＰ試料を試験材料として使用し、ＫＩＬＲ（登録商標）ＭＭ１－Ｒ（登録商標）レポーター細胞（カタログ番号９７－１０４５Ｐ０５２、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を標的細胞株として使用した。ＫＩＬＲ（登録商標）ＭＭ－１Ｒ（登録商標）細胞は、ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｒｏｌａｂｅｌ（ｅＰＬ）タグ付きハウスキーピング遺伝子を発現する。細胞が溶解されると、ｅＰＬタグ付きタンパク質が培地に放出される。酵素アクセプターの添加は、β－ガラクトシダーゼ酵素断片、ＥＡ及びｅＰＬの相補を引き起こす。得られた機能的酵素は、その基質を加水分解して化学発光シグナルを生成する。

ＫＩＬＲ ＭＭ－１Ｒ（登録商標）細胞を、１０％ＨＩ－ＦＢＳ（６１４０－０７１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及び２５０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８硫酸塩（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３０－２３４－ＣＲ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＡＴＣＣ処方）（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ１０４９１－０１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で増殖させた。アッセイは、Ｌ－グルタミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号１０－０４１－ＣＶ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及び１０％ＨＩ－ＦＢＳ（６１４０－０７１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０から構成されるアッセイ培地中で実施した。

可溶性ヒトＢＣＭＡタンパク質（ｓＢＣＭＡ）（ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｗａｒｋ ＤＥ）遮断タンパク質をアッセイ培地に配合した。１０％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（カタログ番号９３４４３－１００ＭＬ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の溶液を使用して、全死亡対照を作製した。ＫＩＬＲ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（商標）キット（カタログ番号９７－００１、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用して、細胞傷害性を検出した。

本実施例では、関連抗原を発現する多発性骨髄腫標的細胞を殺傷するＣＡＲ－Ｔ細胞製剤（Drug Product、ＤＰ）の能力を測定した。エフェクターＣＡＲ－Ｔ細胞によって結合された場合に細胞死に起因して測定可能なシグナル（例えば、発光）を産生するレポーター遺伝子を発現した標的細胞を使用した。結果は、ＤＰが、放出に対し活性の適切なレベルを実証したかどうかを決定するために使用される活性測定において示された。

アッセイは、合計１６ウェルで使用される４つの成分から構成された。使用した４つの成分は、（ｉ）標的細胞を含むＣＡＲ－Ｔ製剤（ＤＰ）（全活性）、（ｉｉ）標的細胞を含む遮断試薬によって遮断されたＣＡＲ－Ｔ ＤＰ細胞（ベースライン対照）、（ｉｉｉ）培地を含む標的細胞（非細胞死対照）、及び（ｉｖ）０．１％ＴｉｔｏｎＸ－１００を含む標的細胞（全細胞死対照）であった。以下の表１Ａのプレートレイアウトに示されるように、全ての４つのアッセイ成分を４つの個別の複製として実行した。９６ウェルプレート中の試料の詳細な説明を表１Ｂに示す。１つの９６ウェルプレートを使用して、６つのアッセイを実行し、そのうちの１つは、システム適合性及び傾向方法性能（trend method performance）のために使用されるＱＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞のアッセイであった。ＱＣ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、事前に活性について適格であった。

以下のアッセイ条件を、ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ ＣＡＲ－Ｔ ＤＰ及びＫＩＬＲ（登録商標）ＭＭ－１Ｒ多発性骨髄腫標的細胞（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）に使用した。アッセイ培地は、ＲＰＭＩ１６４０及び１０％ＨＩ－ＦＢＳであった。ＫＩＬＲ（登録商標）ＭＭ－１Ｒ細胞を、製造元の指定に従って増殖させた。Ｂ細胞成熟抗原（ｓＢＣＭＡ）の可溶性細胞質ドメインでＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ ＤＰ細胞を遮断することによって、ベースライン対照を生成した。ＫＩＬＲ（登録商標）検出キット（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ ＣＡ）をアッセイ検出試薬として使用した。最適化を、エフェクター細胞（ＤＰ）対標的細胞（例えば、ＫＩＬＲ（登録商標）ＭＭ－１Ｒ）比（Ｅ：Ｔ）、並びにＣＡＲ－Ｔ細胞（ＤＰ）とそれらの標的細胞との間の相互作用を完全に遮断するために必要とされる遮断試薬の量について、行った。Ｅ：Ｔ比及び遮断試薬濃度を、各製剤及びその対応する標的細胞株について最適化した。確立されると、Ｅ：Ｔ比はアッセイにおいて固定され、全ての製剤試験について固定されたままであった。遮断試薬はロットごとに適格にし、そのレベルで製剤試験に使用された。更に、検出条件は、使用されるレポーターシステムに基づいて最適化され得る。

ＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ ＣＡＲ－Ｔ製剤のアッセイを、９６ウェル白色不透明ＴＣ処理アッセイプレートにおいて以下のように行った。各アッセイプレートは、上記の表１Ａに記載されるように、最大６つのアッセイに対応した。各アッセイについて、２５μＬの遮断試薬をアッセイプレートの遮断されたＣＡＲ－Ｔ細胞ウェル（ベースライン対照）に添加し、続いて２５μＬのアッセイ培地をＣＡＲ－Ｔ試験ウェルに添加した。次に、８×１０^５生存細胞／ｍＬで、２５μＬのＣＡＲ－Ｔ ＤＰ細胞（合計２×１０^４生存細胞／ウェルのため）をＣＡＲ－Ｔ試験ウェル及びベースライン対照ウェルに添加した。５０μＬのアッセイ培地をＫＩＬＲ ＭＭ－１Ｒ細胞のみ（細胞死なし）ウェルに添加した。ウェルの内容物を穏やかに混合し、３７℃、５％ＣＯ_２で加湿して１０分間（±５分間）インキュベートした。

インキュベーションが完了したら、５０μＬの、８×１０^４生存細胞／ｍＬの標的細胞を全てのアッセイウェルに添加し（最終的に４×１０^３生存細胞／ウェル）、最終的なＥ：Ｔ比は５：１となった。各アッセイにおいて、最後の添加は、全細胞死対照ウェルへの０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（５０μＬ／ウェル）であった。ウェルの内容物を３７℃、５％ＣＯ_２で加湿して２２時間（±１時間）インキュベートした。共培養インキュベーションが完了したら、アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で３０分間（＋／－５分間）平衡化させた。検出試薬を解凍し、次いで、同時に３０分間室温に平衡化した。平衡化したら、１００μＬのＫＩＬＲ（登録商標）検出試薬をウェルごとに添加し、光から保護しながら５０分間（＋／－５分間）インキュベートした。１０秒間振盪した後、化学発光用に設定したＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｐａｒａｄｉｇｍプレートリーダーでプレートを読み取った。

データを以下の表２及び表３に示す。表２のデータは、５０～４００ｕｇ／ｍＬの範囲のＫＩＬＲ ＭＭ－１Ｒ多発性骨髄腫標的細胞のＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍ殺傷のＢＣＭＡ遮断を実証するｓＢＣＭＡタンパク質のロット滴定を示す。表３のデータは、非Ｂ細胞標的細胞（Ｋ５６２＿ｌｕｃ細胞）と比較して、多発性骨髄腫標的細胞（ＲＰＭＩ８２２６＿Ｌｕｃ）に対するｓＢＣＭＡ遮断特異性を実証している。

（実施例２）
ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲに対する抗ＩＤ抗体を使用して試験した。ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞についてのアッセイ条件は、上記の実施例１においてＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍについて使用したものと同様である。別の多発性骨髄腫標的であるＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔについては、同じＫＩＬＲ ＭＭ－１Ｒ標的細胞を使用する。アッセイ培地及び検出試薬は、実施例１で使用したものと同じである。５：１のＥ：Ｔ比及び播種密度は実施例１と同じである。遮断試薬は、ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲに対するＧＣＰＲ５Ｄ抗イディオタイプ抗体である。アッセイで使用するためのＧＣＰＲ５Ｄ抗イディオタイプ抗体の例としては、ＧＰ５Ｂ３３７、ＧＰ５Ｂ３３２、ＧＰ５Ｂ３２４及びＧＰ５Ｂ２０６が挙げられる。これらの抗イディオタイプ抗体の重鎖及び軽鎖配列を表５に提供する。インキュベーション時間は、上記の実施例１のものと一致させた。他の試薬は全て実施例１で使用したものと同じである。以下の表４に示される初期滴定試験は、抗ＩＤ抗体（ＧＰ５Ｂ３３７）によるＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の遮断を示す。

（実施例３）
ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲに対する抗ＩＤ抗体Ｆａｂ断片を使用して試験した。ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞についてのアッセイ条件は、上記の実施例１においてＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍについて使用したものと同様であった。別の多発性骨髄腫標的であるＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔについては、同じＫＩＬＲ ＭＭ－１Ｒ標的細胞を使用した。アッセイ培地及び検出試薬は、実施例１及び２で使用したものと同じであった。５：１のＥ：Ｔ比及び播種密度は、実施例１及び２と同じであった。遮断試薬は、ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲに対するＧＣＰＲ５Ｄ抗イディオタイプＦａｂ抗体（ＧＰ５Ｂ３３７）断片であった。インキュベーション時間は、上記実施例１及び２のものと一致させた。他の試薬は全て実施例１及び２で使用したものと同じであった。以下の表６に示される初期滴定試験は、抗ＩＤ Ｆａｂ抗体（ＧＰ５Ｂ３３７）断片によるＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞の遮断を示す。

ＧＰＲＣ５Ｄ 抗イディオタイプＦａｂ断片は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｆａｂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号：ＶＦ２９９２９２）を使用して、わずかな調整を加えたキット手順に従って、ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲに対する完全長抗イディオタイプ抗体から生成した。簡単に説明すると、ＢｕｐＨリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び消化緩衝液を調製した。ＩｇＧを冷蔵庫から取り出し、調製したＰＢＳで希釈し、脱塩カラムに通した。溶出液を回収し、調製したＰａｐａｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎに移して３７℃で消化を行った。約５時間の消化及び３７℃での回転後、チューブをインキュベーターから取り出し、スピンダウンして試料を収集した。Ｋｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを調製し、試料を添加し、カラムを２～８℃で一晩、約２０時間回転させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムをスピンダウンして、画分中の試料を収集した。第１及び第２の画分を収集し、合わせて保存した。Ａ２８０及び１Ｄ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎｓのような以前の研究は、これらの画分が最も望ましい断片を含むことを示した。新鮮なＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを調製し（以前に使用されていない）、約１時間続く２～８℃二次ローテーションのために試料を再度添加した。第２のＰｒｏｔｅｉｎ Ａインキュベーションを追加して、バイオアッセイに影響を及ぼすと考えられた任意の可能性のあるＦｃ領域の汚染を更に精製及び除去した。断片を溶出し、１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎチューブ（カタログＵＦＣ５０１００８）中で濃縮し、２～８℃で保存した。

（実施例４）
ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原（ＧＰＲＣ５Ｄ受容体）に対する抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はそのＦａｂ断片を使用して、ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞を試験する。ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ細胞についてのアッセイ条件は、上記の実施例２においてＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔ ＤＰについて使用したものと同様である。別の多発性骨髄腫標的であるＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔについては、同じＫＩＬＲ ＭＭ－１Ｒ標的細胞を使用する。アッセイ培地及び検出試薬は、実施例２及び３で使用したものと同じである。５：１のＥ：Ｔ比及び播種密度は、実施例２及び３と同じである。遮断試薬は、抗ＧＣＰＲ５Ｄ抗体又はそのＦａｂ抗体フラグメントである。これらの遮断試薬は、ＫＩＬＲ ＭＭ－１Ｒ標的細胞上のＧＰＲＣ５Ｄ受容体に結合し、ＣＡＲ－Ｔ細胞がその標的に結合する能力を阻害する。抗ＧＰＲＣ ５Ｄ抗体Ｆａｂは、上で詳述した確立された方法を使用して、完全長抗ＧＰＲＣ ５Ｄ抗体から生成される。インキュベーション時間は実施例２及び３のものと一致している。他の試薬は全て実施例２及び３で使用したものと同じである。以下の表７に示される初期滴定試験は、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体又はＦａｂ断片によるＫＩＬＲ ＭＭ－１Ｒ細胞の遮断を示す。

（実施例５）
ＫＬＫ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲに対しヒト可溶性ＫＬＫ２タンパク質を使用して試験した。ＫＬＫ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞についてのアッセイ条件は、上記の実施例１においてＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍについて使用したものと同様であった。ＫＬＫ２ ＣＡＲ－Ｔは、悪性管腔（luminal）前立腺で発現する分子であるカリケリン（kallikerin）２（ＫＬＫ２）を標的とする。過剰発現されたＫＬＫ２レポーター細胞株を、ＬＮｃａＰ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１７４０）及びＤｉｓｃｏｖｅｒＸ’ｓ Ｋｉｌｌｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ－Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＫＩＬＲ）レポーターを使用して作製した。殺傷原理は、実施例１に記載したものと同じである。これらの細胞は、ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｒｏｌａｂｅｌ（ｅＰＬ）タグ付きハウスキーピング遺伝子を発現し、溶解すると、タグ付きレポータータンパク質が培地中に放出された。酵素アクセプターの添加は、β－ガラクトシダーゼ酵素フラグメント、ＥＡ及びｅＰＬの相補を引き起こした。得られた機能性酵素は、その基質を加水分解して化学発光シグナルを発生させた。アッセイ培地、検出試薬及び標的播種密度は全て実施例１で使用したものと同じであるが、Ｅ：Ｔ比は１０：１であった。遮断試薬は、ＫＬＫ２ ＣＡＲに対する可溶性タンパク質であった。Ｃ末端Ｈｉｓ_６タグを有するこの可溶性ＫＬＫ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２）を以下に提供する（下線を引いた配列はシグナルペプチドである）：

ＫＩＬＲ ＬＮｃａＰ－ＫＬＫ２細胞を、１０％ＦＢＳ（９７０６８－０８５、ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）及び２５０μｇ／ｍＬ Ｇ４１８硫酸塩（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３０－２３４－ＣＲ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１８７５－０９３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で増殖させた。アッセイは、Ｌ－グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号１０－０４０－ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）及び１０％ＦＢＳ（９７０６８－０８５、ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０から構成されるアッセイ培地中で行った。

本実施例における標的細胞株は実施例１及び２とは異なっていたが、戦略及び設定は実施例１及び２と同様であった。

以下のアッセイ条件を、ＫＬＫ２ ＣＡＲ－Ｔ ＤＰ及びＫＩＬＲ ＬＮｃａＰ－ＫＬＫ２標的細胞に使用した。アッセイ培地は、ＲＰＭＩ１６４０及び１０％ＨＩ－ＦＢＳであった。ＫＩＬＲ ＬＮｃａＰ－ＫＬＫ２細胞を、ＲＰＭＩ１６４０及び１０％ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸、２．５ｕｇ／ｍＬピューロマイシン及び５００ｕｇ／ｍＬ硫酸塩Ｇ４１８中で増殖させた。ベースライン対照及びアッセイの最適化は実施例１に従った。ＫＬＫ２ ＣＡＲ－Ｔ ＤＰ細胞を可溶性ヒトＫＬＫ２タンパク（ｓＫＬＫ２）で遮断することにより、ベースライン対照を生成した。ＫＩＬＲ（登録商標）検出キット（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｘ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ ＣＡ）をアッセイ検出試薬として使用した。最適化を、エフェクター細胞（ＤＰ）対標的細胞（例えば、ＫＩＬＲ ＬＮｃａＰ－ＫＬＫ２）比（Ｅ：Ｔ）、並びにＣＡＲ－Ｔ細胞（ＤＰ）とそれらの標的細胞との間の相互作用を完全に遮断するために必要とされる遮断試薬の量について、行った。Ｅ：Ｔ比及び遮断試薬濃度を、各製剤及びその対応する標的細胞株について最適化した。確立されると、Ｅ：Ｔ比はアッセイにおいて固定され、全ての製剤試験について固定されたままであった。遮断試薬をロットごとに適格にし、製剤試験のためにそのレベルで使用した。更に、検出条件を、使用されるレポーターシステムに基づいて最適化した。

ＫＬＫ２ ＣＡＲ－Ｔ製剤アッセイを、実施例１のように、９６ウェル白色不透明ＴＣ処理アッセイプレートにおいて実施した。アッセイステップは以下の通りであり、各アッセイプレートは、表１Ａの実施例１に記載されているように、最大６つのアッセイに対応した。各アッセイについて、２５μＬの遮断試薬をアッセイプレートの遮断されたＣＡＲ－Ｔ細胞ウェル（ベースライン対照）に添加し、続いて２５μＬのアッセイ培地をＣＡＲ－Ｔ試験ウェルに添加した。次に、１．６×１０^６生存細胞／ｍＬで、２５μＬのＣＡＲ－Ｔ ＤＰ細胞（合計４×１０^４生存細胞／ウェルのため）をＣＡＲ－Ｔ試験ウェル及びベースライン対照ウェルに添加した。５０μＬのアッセイ培地をＫＩＬＲ ＬＮｃａＰ－ＫＬＫ２細胞のみ（細胞死なし）のウェルに添加した。ウェルの内容物を穏やかに混合し、３７℃、５％ＣＯ_２で加湿して１５分間（±５分間）インキュベートした。

インキュベーションが完了したら、５０μＬの、８×１０^４生存細胞／ｍＬの標的細胞を全てのアッセイウェルに添加し（最終的に４×１０^３生存細胞／ウェル）、最終的なＥ：Ｔ比は１０：１となった。ウェルの内容物を３７℃、５％ＣＯ_２で加湿して２０時間（±２時間）インキュベートした。共培養インキュベーションが完了したら、アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で３０分間（＋／－５分間）平衡化させた。検出試薬を解凍し、次いで、同時に３０分間室温に平衡化した。各アッセイにおいて、平衡化したら、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（５０μＬ／ウェル）を全細胞死対照ウェルに添加し、続いて１００μＬのＫＩＬＲ（登録商標）検出試薬を各ウェルに添加し、光から保護しながら５０分間（＋／－５分間）インキュベートした。１０秒間振盪した後、化学発光用に設定したＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｐａｒａｄｉｇｍプレートリーダーでプレートを読み取った。

データを以下の表８に示す。データは、１０～５００ｕｇ／ｍＬの範囲のＫＩＬＲ ＬＮｃａＰ－ＫＬＫ２標的細胞のＫＬＫ２ ＣＡＲ－Ｔ ＤＰ殺傷のＫＬＫ２遮断を実証するｓＫＬＫ２タンパクのロット滴定を示した。

インキュベーション時間は、上記の実施例１のものと一致させた。他の試薬は全て実施例１で使用したものと同じであった。以下の表８に示される初期滴定試験は、ＫＬＫ２可溶性タンパク質によるＫＬＫ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の遮断を示す。（Ｉｎｔｅｒｎａｌ、ＫＬ２Ｗ１２．００９）。

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本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態及び実施例による範囲内に限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されたものに加えて本発明の多種多様な改変は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。更に、全ての値は概算値であり、説明のために提供されることを理解されたい。

特許、特許出願、刊行物、製品説明、及びプロトコルは、本出願を通して引用されており、それらの開示は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (35)

1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を発現する免疫細胞の効力を決定するためのインビトロ方法であって、前記方法が、
   ａ）試験試料において、前記ＣＡＲ発現免疫細胞を標的細胞と接触させることであって、前記標的細胞が、前記ＣＡＲと相互作用する抗原を発現する、ことと、
   ｂ）第１の対照試料において、前記ＣＡＲ発現免疫細胞を前記標的細胞と接触させることであって、（ｉ）前記接触させることが阻害分子の存在下で行われるか、又は（ｉｉ）前記ＣＡＲ発現免疫細胞及び／若しくは前記標的細胞が前記接触させることの前に前記阻害分子とともにプレインキュベートされており、前記阻害分子が前記ＣＡＲと前記標的細胞との間の相互作用を阻害する、ことと、
   ｃ）前記試験試料における標的細胞死の量を決定することと、
   ｄ）前記第１の対照試料における標的細胞死の量を決定することと、
   ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）において決定された前記標的細胞死の量を比較することに基づいて、ＣＡＲ発現免疫細胞の効力を決定することと、を含み、
   前記試験試料及び前記第１の対照試料において、接触させる時間、前記ＣＡＲ発現免疫細胞の量及び前記標的細胞の量が、実質的に同じである、方法。
2. 前記接触させるステップ（ａ）及び（ｂ）が同時に実行される、請求項１に記載の方法。
3. 前記決定するステップ（ｃ）及び（ｄ）が同時に実行される、請求項１に記載の方法。
4. ステップ（ｂ）（ｉ）において、前記ＣＡＲ発現免疫細胞及び／又は前記標的細胞が、前記接触させるステップの前に前記阻害分子とともにプレインキュベートされている、請求項１に記載の方法。
5. 前記方法が、ステップ（ｃ）において決定された前記標的細胞死の前記量を、第２の対照試料において決定された標的細胞死の量と比較することを更に含み、前記標的細胞が、前記ＣＡＲ発現免疫細胞の非存在下でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
6. 前記方法が、ステップ（ｃ）において決定された前記標的細胞死の前記量を、第３の対照試料において決定された標的細胞死の量と比較することを更に含み、前記標的細胞が、前記ＣＡＲ発現免疫細胞の非存在下であるが前記標的細胞死を引き起こす界面活性剤の存在下でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
7. 前記界面活性剤が、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００である、請求項６に記載の方法。
8. 前記標的細胞が、前記標的細胞死の際に検出可能なレポーターシグナルを産生し、ステップ（ｃ）が、前記試験試料における前記レポーターシグナルを決定することを含み、ステップ（ｄ）が、前記第１の対照試料における前記レポーターシグナルを決定することを含み、ステップ（ｅ）が、ステップ（ｃ）及び（ｄ）において決定された前記レポーターシグナルを比較することを含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記レポーターシグナルが、発光である、請求項８に記載の方法。
10. 前記レポーターシグナルが、蛍光である、請求項８に記載の方法。
11. 前記標的細胞は、前記標的細胞が細胞死を経るときにシグナルを産生するレポータータンパク質を発現する、請求項８に記載の方法。
12. 前記レポータータンパク質が、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又はそのバリアント若しくは誘導体である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記阻害分子が、前記標的細胞上の前記抗原に特異的に結合し、前記抗原が前記ＣＡＲと相互作用する、請求項１に記載の方法。
14. 前記阻害分子が、前記ＣＡＲに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
15. 前記阻害分子が、前記標的細胞上に発現される前記抗原に特異的に結合する前記ＣＡＲ内の領域に特異的に結合する、請求項１４に記載の方法。
16. 前記阻害分子が、抗体又は抗体断片である、請求項１３に記載の方法。
17. 前記抗体が、抗イディオタイプ抗体である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ若しくはＦｄ断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、線状抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変領域（ＶＨ）ドメイン、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメインである、請求項１６に記載の方法。
19. 前記抗体又は抗体断片が、前記ＣＡＲの前記ｓｃＦｖドメイン内の抗原に特異的に結合する、請求項１６に記載の方法。
20. 前記抗体又は抗体断片が、前記ＣＡＲの前記ｓｃＦｖドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）に特異的に結合する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記抗体又は抗体断片が、前記ＣＡＲの前記ＶＨドメイン又は前記ＶＬドメイン内の抗原に特異的に結合する、請求項１６に記載の方法。
22. 前記抗体又は抗体断片が、前記ＣＡＲの前記ＶＨドメイン又は前記ＶＬドメイン内のＣＤＲに特異的に結合する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記阻害分子が、前記ＣＡＲと相互作用する前記標的細胞上で発現される抗原の可溶性形態、又はその機能的断片若しくは誘導体である、請求項１４に記載の方法。
24. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
25. 前記ＣＡＲが、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）受容体と相互作用し、前記標的細胞が、前記ＢＣＭＡ受容体を含み、前記阻害分子が、ＢＣＭＡの可溶性細胞質ドメインである、請求項１に記載の方法。
26. 前記標的細胞が、多発性骨髄腫細胞である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記多発性骨髄腫細胞が、ＭＭ－１Ｒ細胞である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ＣＡＲが、Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）と相互作用し、前記標的細胞が、前記ＧＰＲＣ５Ｄ受容体を含み、前記阻害分子が、前記ＣＡＲに対する抗イディオタイプ抗体又は抗体断片である、請求項１に記載の方法。
29. 前記ＣＡＲが、Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）と相互作用し、前記標的細胞が、前記ＧＰＲＣ５Ｄ受容体を含み、前記阻害分子が、前記ＧＰＲＣ５Ｄ受容体に対する抗イディオタイプ抗体又は抗体断片である、請求項１に記載の方法。
30. 前記標的細胞が、多発性骨髄腫細胞である、請求項２８に記載の方法。
31. 前記多発性骨髄腫細胞が、ＭＭ－１Ｒ細胞である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ＣＡＲが、カリケリン（kallikerin）２（ＫＬＫ２）と相互作用し、前記標的細胞が、前記ＫＬＫ２を含み、前記阻害分子が、可溶性ＫＬＫ２タンパク質である、請求項１に記載の方法。
33. 前記標的細胞が、前立腺がん細胞である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記前立腺がん細胞が、ＬＮＣａＰ細胞である、請求項３３に記載の方法。
35. 前記方法が、ハイスループット形式で行われる、請求項１に記載の方法。

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