CA2287916A1 - Polypeptides associes a des recepteurs activateurs et leurs applications biologiques - Google Patents
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Abstract
La présente demande concerne de nouveaux moyens permettant de diagnostiquer, prévenir, pallier, traiter un fonctionnement anormal ou non désiré de récepteurs KAR (Killer cell Activatory Receptor), contreparties non inhibitrices de récepteurs KIR (Killer cell Inhibitory Receptors) de type immunoglobuline ou de type lectine. Elle est notamment relative à de nouveaux polypeptides KARAP (KAR-Associated Proteins) et à leurs applications biologiques. Un polypeptide KARAP, selon l'invention, est naturellement associé à un récepteur KAR, et en l'absence d'un tel KARAP, ledit récepteur KAR est naturellement incapable de transduire un signal activateur détectable. La présente demande vise également des méthodes d'obtention ou d'identification de tels polypeptides KARAP.
Description
2 I PCT/FR98/00883 POLYPEPTiDES ASSOCIES A DES RECEPTEURS ACTIVATEURS ET LEURS APPLICATIONS
BIOLOGIQUES
L'invention porte sur de nouveaux polypeptides particuliers capables de transduire un signal provenant d' un récepteur activateur pour des molécules du CMH de classe I, fonctionnant en tant que récepteur autonome ou en tant que co-récepteur, et d'urI KAR (Killer-tell Activatory Receptor) en particulier, sur les anticorps obtenus à partir desdits polypeptides servant d'immwlogènes, et sur les acides nucléiques correspondant auxdits Io polypeptides.
L'invention porte également sur les procédés d'obtention de tels polypeptides et sur les applications biologiques, plus particulièrement, préventives, thérapeutiques et diagnostiques, desdits polypeptides, anticorps et acides nucléiques.
Is Pour maintenir la cohérence et assurer l'intégrité de l'organisme, le système immunitaire doit Inerire en jeu un système coordonné de communications intercellulaires.
Différents types de récepteurs interviennent dans ces communications.
Trois d'entre eux, à savoir les réceptelu-s pour l'antigène des lymphocytes B
20 (BCR), les récepteurs pour l'antigène des lymphocytes T (TCR) et les récepteurs reconnaissant la portion Fc des anticorps (RFc), sont maintenant bien décrits et leurs différentes structures relativement bien connues.
D'autres récepteurs qui ne sont ni récepteurs pour antigènes, ni récepteurs pour anticorps ont été décrits mais leurs structures et mécanismes ' 2s d'action sont encore mal connus.
Il s'agit de récepteurs pour des molécules du CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité) tels que les KARs (Killer tell Activatory Receptors) et leur contrepartie inhibitrice, les KIRS (Killer tell Inhibitory Receptors).
KARs et KIRS ne sont pas limités aux cellules NK : ils sont également naturellement exprimés par des cellules T.
Les KARs sont hautement homologues aux KIRS (jusqu'à 96%
d'homologie entre KARs et KIRs au niveau extracytoplasmique).
KARs et KIRs n'asst>rent cependant pas les mêmes fonctions : les KIRS sont impliqués dans le contrôle négatif (inhibiteur) de l'activation des cellules NK et T, alors que les KARs sont impliqués dans le contrôle positif (stimulatew) de l'activation des cellules NK et T.
Des différences majewes au niveau des domaines trans- et io ilitracytoplasmiques ont pu être mises en évidence entre isoforme activatrice (KAR) et isoforme inhibitrice (KIR).
En effet, contrairement aux KIRs, les KARs expriment un résidu acide aminé chargé (lysine) dans leur domaine transmembranaire et ne contiennent aucun motif ITIM (motif d'inhibition d'immunoréceptew basé sw résidu(s) is tyrosine) dans lew domaine intracytoplasmique. Les réceptews monomériques KARs ne contiennent polo- autant pas de motif ITAM (motif d'activation d'immiuloréceptew basé siu résidus) tyrosine).
La situation observée pow les KARs, réceptews activatews pow les molécules du CNiH, et membres de la IgSF (superfamille des Zo immunoglobulines), à savoir réceptew activatew, contrepartie d'un réceptew inhibiteur à ITIM, ne présentant lui-même ni ITIM, ni ITAM mais présentant un acide aminé chargé (lysine, arginine, acide aspartique, acide glutamique) transmembranaire, peut être observée pow d'autres types de réceptews. Il en est ainsi des récepteurs activatews (ou à tout le moins non inhibiteurs) pour 2s les molécules du CMH, tels que NKG2C/D (qui est du type lectine et dont la contrepartie inhibitrice est NKG2A/B), mais aussi pow d'autres réceptews non inhibitews, tels que SIRP (3 et ILT 1, dont les ligands sont encore inconnus et qui ont été décrits soit des cellules hématopoïétiques et sw des
BIOLOGIQUES
L'invention porte sur de nouveaux polypeptides particuliers capables de transduire un signal provenant d' un récepteur activateur pour des molécules du CMH de classe I, fonctionnant en tant que récepteur autonome ou en tant que co-récepteur, et d'urI KAR (Killer-tell Activatory Receptor) en particulier, sur les anticorps obtenus à partir desdits polypeptides servant d'immwlogènes, et sur les acides nucléiques correspondant auxdits Io polypeptides.
L'invention porte également sur les procédés d'obtention de tels polypeptides et sur les applications biologiques, plus particulièrement, préventives, thérapeutiques et diagnostiques, desdits polypeptides, anticorps et acides nucléiques.
Is Pour maintenir la cohérence et assurer l'intégrité de l'organisme, le système immunitaire doit Inerire en jeu un système coordonné de communications intercellulaires.
Différents types de récepteurs interviennent dans ces communications.
Trois d'entre eux, à savoir les réceptelu-s pour l'antigène des lymphocytes B
20 (BCR), les récepteurs pour l'antigène des lymphocytes T (TCR) et les récepteurs reconnaissant la portion Fc des anticorps (RFc), sont maintenant bien décrits et leurs différentes structures relativement bien connues.
D'autres récepteurs qui ne sont ni récepteurs pour antigènes, ni récepteurs pour anticorps ont été décrits mais leurs structures et mécanismes ' 2s d'action sont encore mal connus.
Il s'agit de récepteurs pour des molécules du CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité) tels que les KARs (Killer tell Activatory Receptors) et leur contrepartie inhibitrice, les KIRS (Killer tell Inhibitory Receptors).
KARs et KIRS ne sont pas limités aux cellules NK : ils sont également naturellement exprimés par des cellules T.
Les KARs sont hautement homologues aux KIRS (jusqu'à 96%
d'homologie entre KARs et KIRs au niveau extracytoplasmique).
KARs et KIRs n'asst>rent cependant pas les mêmes fonctions : les KIRS sont impliqués dans le contrôle négatif (inhibiteur) de l'activation des cellules NK et T, alors que les KARs sont impliqués dans le contrôle positif (stimulatew) de l'activation des cellules NK et T.
Des différences majewes au niveau des domaines trans- et io ilitracytoplasmiques ont pu être mises en évidence entre isoforme activatrice (KAR) et isoforme inhibitrice (KIR).
En effet, contrairement aux KIRs, les KARs expriment un résidu acide aminé chargé (lysine) dans leur domaine transmembranaire et ne contiennent aucun motif ITIM (motif d'inhibition d'immunoréceptew basé sw résidu(s) is tyrosine) dans lew domaine intracytoplasmique. Les réceptews monomériques KARs ne contiennent polo- autant pas de motif ITAM (motif d'activation d'immiuloréceptew basé siu résidus) tyrosine).
La situation observée pow les KARs, réceptews activatews pow les molécules du CNiH, et membres de la IgSF (superfamille des Zo immunoglobulines), à savoir réceptew activatew, contrepartie d'un réceptew inhibiteur à ITIM, ne présentant lui-même ni ITIM, ni ITAM mais présentant un acide aminé chargé (lysine, arginine, acide aspartique, acide glutamique) transmembranaire, peut être observée pow d'autres types de réceptews. Il en est ainsi des récepteurs activatews (ou à tout le moins non inhibiteurs) pour 2s les molécules du CMH, tels que NKG2C/D (qui est du type lectine et dont la contrepartie inhibitrice est NKG2A/B), mais aussi pow d'autres réceptews non inhibitews, tels que SIRP (3 et ILT 1, dont les ligands sont encore inconnus et qui ont été décrits soit des cellules hématopoïétiques et sw des
3 PCT/FR98/00883 cellules non-hématopoïétiques (SIRP Vii), soit sur des cellules B, macrophages et celiules dendritiques (ILT1).
Les KA.Rs peuvent fonctionner en tant que récepteurs autonomes, notamment pour des molécules du CMH de classe I. On sait ainsi que l'engagement des KARs avec des molécules du CMH de classe I exprimées sur la smîace de cellules cibles, initie les programmes d'activation lymphocytaires tel qu'il a été établi du fait de la mobilisation du Ca2+
intracytoplasmique et de l'induction de la lyse des cellules cibles.
Outre leurs fonctions de récepteurs autonomes poiu des molécules du io CMH, les KARs peuvent également assurer des fonctions co-réceptrices pour des récepteurs TCR et RFc (Mandelboim O. et al., 1996, Science 27-x:2097 ;
Cambiaggi A. et al., 1996, Blood 87:2369).
En effet, lors de Ia reconnaissance de fragments constants (Fc) d' immtmoglobulines G (IgG) par des réceptem-s tels que CD 16 (RFc~yIII), et is lors de la reconnaissance d'antigènes par le complexe CD3/TCR restreint par des molécules du CMH de classe I ou II, les KARs peuvent jouer le rôle de co-réceptetu-s et ainsi augmenter l'intensité de la réponse cellulaire, en particulier face à de petites quantités d'antigènes, maintenir la réponse cellulaire dans le temps, et également coopérer à la stimulation de la 2o prolifération cellulaire.
Le rôle des KARs, naturellement exprimés sur des sous-populations lymphocytaires NK et T, n'est pas restreint par leurs ligands propres, à
savoir les molécules du CMH de classe I, mais s'étend à l'équilibre du système immunitaire de manière générale.
Zs Le fonctionnement des KARs naturellement exprimés influe ainsi sur la prolifération de cellules NK et T, la production par de telles cellules de substances de type cytokines, la lyse de cellules cibles telles que cellules autologues délétères, malignes ou infectées par des virus, cellules WO 98/49292 ,1 PCT/FR98/00883 allogéniques, mais aussi sm- la tolérance du système immiu~itaire face à
certains antigènes.
Tout non- ou dys-fonctionnement des KARs peut donc conduire à
différentes pathologies ou réactions indésirées, toutes Iiées au fonctionnement s du système immunitaire, telles que maladies d'immuno-déficience, maladies auto-immunes (e.g. sclérose en plaque), tumeurs, infections virales, bactériennes, parasitaires, allergies, rejets de greffe. Il a, par exemple, été
montré que si l'homme ne présente en moyenne que moins de 10% de lymphocytes exprimant des KARs, la quasi-totalité des lymphocytes de io patients atteints de LDGL (maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires) exprime des KARs.
La présente invention a poLU but de fournir des moyens permettant de diagnostiquer un fonctionnement anormal ou non désiré de récepteurs activateurs poiu des molécules du CMH de classe I tels que les KARs et d'en is contrôler le fonctionnement.
L'invention a ainsi pour objet de nouveaux polypeptides, ci-après désignés K.AR.AP (KAR Associated PYOteins), qui sont nécessaires à la transduction d'un signal provenant d'un KAR, ainsi que les anticorps et acides nucléiques obtenus à partir desdits nouveaux polypeptides. Elle a également Zo pour objet un procédé d'obtention desdits nouveaux polypeptides ainsi que leurs applications biologiques.
Par "récepteur KAR", nous entendons, dans la présente, les récepteurs humains de type immunoglobuline contreparties non inhibitrices des récepteurs KIR, tels que les récepteurs KAR p50 (KIRIIIDS1 à KiRIIDSS), Zs KIRIIIDS 1, mais également tout récepteur non inhibiteur de structure similaire à ces récepteurs KAR, et notamment les récepteurs humains de type _ Iectine tels que NKG2C, NKG2D (naturellement exprimés sur des cellules NK et T), les récepteurs marins de type immunoglobuline tels que pir A
(nariirellement exprimés sm- des cellules myéloïdes, des cellules B), gp49A
WO 98/49292 ~ PCT/FR98/00883 (naW rellement exprimés sur des mastocytes), les récepteurs marins de type lectine tels que Ly49D, Ly49H (naturellement exprimés sur des cellules NK
et T).
_ Nous entendons donc par polypeptide KARAP tout polvpeptide isolé
s (autre qu'Lm KAR) en l'absence duquel ledit réceptetu- KAR est naturellement incapable de transduire un signal activateur détectable. Ceci n'exclut pas le fait qu'un polypeptide K:AR.AP déterminé puisse non seulement s'associer à
m récepteur KAR tel que ci-dessus défini, mais également à d'autres récepteiu-s monomériques activateurs ou non iWibiteurs de structtue proche io de celle des KAR tels que ci-dessus défini, et notamment à un récepteur activateur humain de type immunoglobuline de la famille LII~/MIR/B.T tel que ILT 1.
Le terme "polypeptide" comprend, dans la présente demande, non seulement Ledit polypeptide, mais également les homologues de ce u polypeptide, tels qu'obtenus par délétion, insertion, inversion ou substitution conservatrice d'acides aminés, et les fragments de ce polypeptide, tels qu'obtenus par hydrolyse dudit polypeptide à l'aide de protéases, lesdits homologues ou fragments étant capables de transduire un signal provenant d'un KAR. Ce terme "polypeptide" couvre, dans la présente demande, aussi Zo bien des polypeptides que des protéines.
Un polypeptide selon l'invention est nécessaire à la transduction du signal reçu par un récepteur KAR : il s'agit donc d'un polypeptide isolé qui permet la restauration d'une activation KAR déficiente. Pour déterminer si un polypeptide isolé donné permet la restauration d'une activation KAR
2s déficiente, l'homme du métier peut procéder en montrant qu'il existe un récepteur KAR qui, si il est exprimé par me cellule appropriée en (absence de ce polypeptide, ne parvient pas à transduire un signal activateur détectable, ou ne parvient pas à transduire un signal activateur satisfaisant pour l'application visée. Un mode de réalisation de cette détermination est présenté dans l'exemple 3 ci-après par comparaison entre la capacité
d'activation (relargage de sérotonine) d'une cellule RBL-2H3 exprimant le récepteur KAR p50.2 seul, et celle d'une cellule RBL-2H3 qui exprime à Ia fois le récepteur KAR p50.2 et sou polypeptide K:ÄR.AP. Des exemples de s cellules appropriées sont présentées en fig~.~re 5 ci-après.
Par "activation KAR déficiente restaurée", nous entendons que la transduction, à la cellule, par ledit KAR d'un signai activateur significatif est possible, ou, le cas échéant, satisfaisante. Ceci peut être testé notamment à
l'aide d'une stimulation cellulaire par des anticorps.
io Pour déterminer au niveau d'une cellule si un signal provenant d'un KAR est ou non transduit, et pour- déterminer si un tel signal est stimulé ou inhibé, de nombreux moyens sont à la disposition de l'homme du métier. Des exemples de tels moyens incluent la stimulation dudit KAR par un ligand et la meslu-e des cytokines sécrétées (cf. par exemple, Cambiaggi et al. 1996, is Blood 87:2369), de la prolifération cellulaire (cf. par exemple Mandelboim et al. 1996, Science 274:2097), de la cytotoxicité (cf. par exemple le test de cytotoxicité redirigée ci-après décrit), de la mobilisation du calcium intracytopiasmique (cf. par exemple Bléry et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 8989-8996), et/ou de l'induction de phosphorylation (cf. par exemple Vivier 2o et al. 1991, J. Immunol. 146:206).
Un polypeptide selon l'invention est en outre caractérisé en ce qu'il est capable de s'associer à un KAR, et de ne pas s'associer à la contrepartie inhibitrice de ce KAR.
Des méthodes permettant de déterminer si un polypeptide est capable Zs de s'associer à un KAR, et de ne pas s'associer à la contrepartie inhibitrice de ce KAR (c'est-à-dire de ne pas s'associer au récepteur KIR correspondant), sont bien connues de l'homme du métier. Un exemple d'une telle méthode comprend notamment WO 98/49292 ~ PCT/FR98/00883 - faire exprimer ce polypeptide à une cellule KA.R+ KIR- d'une part, et à une cellule KAR- KIR+, - à immunoprécipiter une ou plusieurs fractions) polypeptidiques) à
_ partir du lysat de ces cellules à l'aide d'au moins anticorps anti-KAR et/ou s anti-KIR, - à observer ia présence dudit polypeptide dans la ou les fractions) issues de la cellule KAR+ KIR-, et l'absence de ce même polypeptide dans la ou les fractions issues de la cellule KAR' KIR+. Des exemples d'anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR comprennent les anticorps anti-CD158, anti-io p70/NKB1, anti-p140, et plus particulièrement les anticorps monoclonaux EB6, GL183 ou PAX250. Une méthode permettant de faire exprimer un tel polypeptide par une cellule est indiquée dans l'exemple 3 ci-dessous.
Un polypeptide K:AR.AP selon (invention peut par ailleurs être caractérisé en ce qu'il est tel qu'obtenu is i. par immunoprécipitation d'une ou plusieurs fractions) polypeptidiques) de lysats de cellules exprimant des récepteurs KAR
capables de transduire un signal activateur à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anri-KAR, tel{s) qu'un anticorps anti-CD 158, anti-p70/1'TKB 1, anti-p140, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou 2o PAX250, ü. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuisée par élimination des fractions immunoprécipitées à l'aide d'anticorps anti-CD3~ et/ou anti-FcERIy, et/ou être à nouveau précipitée à
l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR tells) qu'un Zs anticorps anti-CD158, anti-p70/NKBl, anti-p140, et plus particulièrement . (anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fractions) polypeptidiques) selon lem poids moléculaire, et récupération des polypeptides correspondant à un poids moléculaire de 12 + 2 kDa environ, ou bien par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fraction polypeptidiques) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite s (lesdites) fraction{s) polypeptidiques) à un test kinase, et récupération des polypeptides phosphorylés correspondant à un poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 t 2 kDa environ. Le test kinase peut être réalisée tel que ci-après décrit dans les exemples (c~ matériel et méthodes de l'exemple 1 ci-après).
Lesdites cellules expriment des récepteurs KAR capables de transduire io un signal activateur peuvent notamment être des cellules NK et/ou des cellules T edou des cellules myéloïdes et/ou des cellules B et/ou mastocytes.
Des moyens polo déterminer si m KAR est capable ou non de transduire im signal à la cellule ont été ci-avant indiqués.
Un polypeptide k:.AR.AP selon la présente invention est en outre is caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés - présente au moins m acide aminé tyrosine phosphorylable, - présente une masse moléculaire comprise entre 10 + 2 et 16 + 2 kDa environ (notamment, masse moléculaire réelle de 10 + 2 kDa, masse moléculaire apparente sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes ao de 12 ~ 2 à 16 + 2kDa selon le degré de phosphorylation).
Il est en outre caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés comporte au moins un motif ITAM YxxL/Ix~gYxxL/I en région intracytoplasmique.
Selon un aspect de l'invention, la séquence en acides aminés d'un zs polypeptide KAR.AP comporte une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et/ou une région entracytoplasmique. De manière .
caractéristique, cette région intracytoplasmique est majoritaire relativement aux autres régions de la séquence de ce polypeptide. Des moyens pour identifier les régions extracytoplasmiques, transmembranaires, WO 98/49292 ~~ PCT/FR98100883 intracytoplasmiques sont connus de l'homme du métier (par exemple, algorithmes d'hydropathicité, formation de vésicules inversées).
Selon m autre aspect de l'invention, la séquence en acides aminés d'un polypeptide K:ARAP comporte au moins un acide aminé cystéine s extracytoplasmique.
Selon encore m autre aspect de l'invention, la séquence en acides aminés d'un polypeptide K:ARAP, comporte au moins un acide aminé chargé
(R, K, D, E) transmembranaire.
Les polypeptides selon l'invention peuvent être phosphorylés au niveau io d'au moins Lm résidu tyrosine, ou être non phosphorylés.
Dans une forme de réalisation selon l'invention, lesdits polypeptides se présentent sous la forme de dimères liés par lui pont disulfure ; ils s'associent de manière sélective et non covalente à des KARs qui fonctionnent, soit en tant que récepteurs autonomes pour des molécules du is CMH de classe I, soit en tant que co-récepteurs du TCR ou d'un RFc tel que CD16.
Selon un aspect avantageux de l'invention, un polypeptide k;.AR.AP est capable de se lier à une molécule à domaine SH2 telle que ZAP-70, p72~'k, p561'k, p59h'", p60~~', Grb-2, pp36-38 (lat), PLC-al, p85 (PI-3 kinase), Shc, Zo ou à une molécule à domaine PTB (PhosphoTyrosine Binding) telle que Shc.
Une telle liaison peut être observée par incubation de polypeptides selon l'invention avec des molécules à domaine SH2 ou PTB et mesure de la résonance de plasmons (Olcese et al. 1996, The Journal of Immunology 156:4531-4534).
Zs Un polypeptide K:AR.AP particulier selon l'invention présente une séquence en acides aminés essentiellement constituée par la SEQ B7 n°2.
La présente invention vise également les polypeptides dont la séquence est essentiellement constituée par la partie extracytoplasmique de la SEQ ID
n°2, à savoir la SEQ ID n°3, ou par la partie transmembranaire de la SEQ ID
n°2, WO 98/49292 I~ PCT/FR98/00883 à savoir la SEQ ID n°4, ou la partie intracytoplasmique de la SEQ ID
n°2, à
savoir la SEQ ID n°5. D'autres polypeptides KARAP particuliers selon l'invention présentent w~e séquence en acides aminés essentiellement constihiée par la SEQ ID n° 11, n° 12, n° 13, n°
14, n° 15, n° 17 (séquence consensus de la protéine K:ARAP de souris C57B1/6), ou n°28 (séquence protéique de la k:A.R.AP de souris 129 obtenue à partir de la séquence génomique).
De tels polypeptides peuvent également être obtenus, après séquençage, par synthèse chimique ou à l'aide des techniques d'ADN
io recombinant.
Lesdits polypeptides KARAPs sont nécessaires à la transduction de signaux provenant de récepteurs activateurs, les KAR.s, qui ne présentent ni ITIM ni ITAM intracytoplasmiques mais qui présentent un résidu acide aminé transmembranaire.
is Selon une disposition avantageuse, les polypeptides selon (invention sont modifiés par glycosylation, phosphorylation, sulfonation, biotinylation, acylation, estérification, ou par addition, substitution, suppression d' entités de forme moléculaire proche de celle des groupes phosphate, telles que le phosphonate, par addition de réactifs de marquage tels que la luciférase, la 2o GFP (Green Fluorescence Protein) ou ses analogues, par addition de cibles de purification telles qu'w~ ligand d'affinité, par addition d'entités modifiant sa solubilité. Des modifications d'intérêt particulier comprennent celles qui modifient ledit polypeptide de telle sorte à bloquer ou inhiber sa capacité à
transduire le signal reçu (stratégie du transdominant négatifj. Un polypeptide 2s selon l'invention, sous une forme ainsi modifiée, trouve notamment des applications dans toute composition ou méthode destinée à moduler de manière négative (inhiber) une réponse immunitaire donnée, notamment une réponse immtmitaire non désirée ou anormale (par exemple, maladies auto-immimes, allergies, rejet de greffe). Des modifications ainsi appropriées WO 98/49292 1 ~ PCTIFR98/00883 comprennent celles qui rendent la phosphorylation sur tyrosine dudit polypeptide non hydrolysable dais des conditions biologiques (par exemple, par addition de groupes phosphonates). Elles comprennent également celles qui rendent non fonctiormel un résidu aminoacide critique au fonctionnement s d'im polypeptide selon l'invention : par exemple, par substiW tion ou mutation d'un résidu tyrosine (Y), notamment un résidu tyrosine contenu dans m motif ITAM, en u.n résidu phénylalanine (F), ce qui empêche la liaison dudit polypeptide ainsi modifié à une protéine à domaine SH2 ou PTB.
Selon une autre disposition avantageuse, les polypeptides de io l'invention, leurs fragments, homologi.ies, ou formes modifiées sont capables de traverser une membrane cellulaire, c'est-à-dire tme bicouche lipidique.
La présente invention vise également les anticorps, notamment les anticorps monoclonaux, et les fragments de tels anticorps, en particulier les fragments Fc, Fv, Fab, F(ab)'2, CDR, tels qu'obtenus par immunogenèse à
is partir d'iui polypeptide KARAP selon l'invention, ou tels qu'obtenus à
partir d'un fragment, homologue ou forme modifiée d'iu~ tel polypeptide.
Elle a en particulier pour objet des fragments de tels anticorps, en particulier fragment Fc, Fv, Fab, F(ab)'2, CDR, tels qu'obtenus par immunogenèse à partir d'un polypeptide dont la séquence est essentiellement 2o constituée par la partie extracytoplasmique, intracytoplasmique, ou transmembranaire d'un tel polypeptide K:AR.AP selon l'invention. Elle vise notamment de tels anticorps capables de reconnaître, selon une réaction du type antigène-anticorps, la SEQ ff~ n°2, la SEQ ll~ n°3, la SEQ
B7 n°4, la SEQ ID n°5, SEQ ID n° 11, SEQ m n° 12, SEQ ID n°
I 3, SEQ m n° 14, SEQ
2s ID n° 15, SEQ ID n° I 7 et/ou SEQ ID n°28, ainsi que leurs fragments.
. De tels anticorps sont obtenus par immunisation d'animaux, tels que lapins et souris, contre des polypeptides, fragments, homologues ou formes modifiées selon l'invention tels qu'essentiellement obtenus par élution de bandes électrophorétiques, par synthèse chimique ou par une technique de protéines de fission solubles (GST), lesdits polypeptides, fragments, homologues ou formes modifiées étant optionnellement couplés à des immunogènes tels que l'ovalbumine.
Des anticorps monoclonaux sont alors produits par fusion hybridomale s des cellules spléniques immunes, criblage et purification des sLUnageants de culhlre (K~hler et Milstein, 1975, Nah~re 256, 495-497 ; Antibodies, a laboratory manual, 1988, Harlow and David Lane, Ed. Cold Spring Harbor laboratory).
A partir de ces anticorps, des dianticorps peuvent être générés selon io des procédures standards. Lesdits fragments peuvent, si nécessaire, être insérés ou greffés à des structures hwnanisantes.
La présente invention vise également les acides nucléiques comprenant lme séquence correspondant à la lecture en cadre ouvert, selon le code génétique universel et en tenant compte de la dégénérescence dudit code, de is la séquence en acides aminés d'un polypeptide, fragment, ou homologue selon l'invention, ainsi que les variants qui présentent une homologie supérieure ou égale à 60% avec de tels acides nucléiques, et qui sont capables de coder pour une molécule transductrice d'un signal activateur provenant d'un KAR tel que ci-avant défini. Elle vise notamment tout acide 2o nucléique dont la séquence ADN est essentiellement constituée par la SEQ
ff~ n° 1 (ADNc de Ia protéine K:ARAP mature de séquence SEQ )L?
n°2), n°6, n°7, n°8, n°9, n°10, n°16 (séquence ADNc consensus du KAR.AP de souris C57B1/6), n°27 (séquence ADNc du KARAP de souris 129 obtenue à
partir de la séquence génomique), n° 18 (séquence génomique du k:.AR.AP de souris Zs 129), ou n°31 (séquence ADNc du I~:ARAP humain), ou par toute partie correspondant aux régions extra-, infra-cytoplasmique et/ou transmembranaires de ces séquences, ou par toute partie correspondant à un exon ou un intron de ces séquences.
WO 98/49292 ~3 PCT/FR98/00883 La présente invention vise également un procédé d'obtention d'un polypeptide selon l'invention comprenant les étapes i. d'immmoprécipiter une ou plusiem-s fractions) polypeptidiques) de lysats de cellules exprimant des récepteurs KAR
fonctionnels (cellules NK et/ou des cellules T et/ou des cellules myéloïdes et/ou des cellules B et/ou mastocytes par exemple) à l'aide d'url ou plusieiu-s anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR, tells) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKB1, anti-p140, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, io ü. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuisée par élimination des frâctions immunoprécipitées à l'aide d' anticorps anti-CD3 et/ou anti-FcERIy, et/ou être à nouveau précipitée à
l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR tells) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKBi, anti-p140, et plus particulièrement is l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. de séparer les polypeptides de ladite (desdites) fractions) polypeptidiques) selon leur poids moléculaire et récupérer les polypeptides correspondant à un poids moléculaire de 12 t 2 kDa environ, ou bien de séparer les polypeptides de ladite (desdites) fractions) 2o polypeptidiques) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite (lesdites) fractions) polypeptidiques) à un test kinase, et récupérer les polypeptides phosphorylés correspondant à m poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 ~ 2 kDa environ.
La présente demande a également pour objet me méthode pour obtenir 2s la séquence de polypeptides K:.ARAP particuliers selon l'invention. Cette . méthode, dont un exemple de réalisation est décrite dans l'exemple 2 ci-après (stratégies bio-informatiques), comprend notamment le criblage de celles des séquences polypeptidiques qui répondent aux critères suivants WO 98/49292 ~~ PCT/FR98/00883 - la séquence présente au moins un acide aminé tvrosine phosphorylable, - la séquence présente me masse moléculaire comprise entre 5 et 25 kDa environ, - la séquence comporte une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et une région intracytoplasmique, - la séquence comporte au moins un acide aminé cystéine dans sa région extracvtoplasmique, - la séquence comporte au moins un acide aminé chargé (R, K, D, E) iu dans sa région transmembranaire, et - la séquence comporte au moins un motif ITAM Yx~cL/Ix6_gYxxL/I
dans sa région intracytoplasmique, - le polypeptide correspondant à la séquence sélectionnée devant être capable de s'associer à un KAR, et de ne pas s'associer au récepteur is contrepartie inlùbitrice correspondant (KIR), comme ci-avant défini.
La présente demande a également pour objet une méthode pour déterminer ou contrôler si un polypeptide candidat correspond à un polypeptide I~:ARAP selon l'invention. Un exemple de réalisation d'une telle méthode est présenté dans l'exemple 2 ci-après. Une telle méthode consiste à
2o produire ~.zn anticorps contre une partie caractéristique de ce polypeptide candidat (par exemple ime région intracytoplasmique comprenant au moins un motif ITAM ou une région extracytoplasmique), et à vérifier qu'il existe un récepteur KAR qui, lorsqu'il est exprimé de manière fonctionnelle sur une cellule, se trouve associé à iui élément reconnu, selon une réaction de type Zs antigène-anticorps, par ledit anticorps.
Cette méthode, selon l'invention, d'identification de polypeptides I~:A.RAP consiste ainsi notamment à
- produire un anticorps mono- ou polyclonal dirigé contre ce polypeptide candidat, et en particulier contre Lute région extracytoplasmique WO 98/49292 ~ 5 PCT/FR98/00883 de ce polypeptide candidat et/ou une région qui comprend au moins un motif ITAM (par exemple, dans le cas de la protéine k:ARAP de souris SEQ )D
n°2 identifiée ci-dessus, un anticorps dirigé contre une région de la partie extracytoplasmique (SEQ ID n°3) ou de la partie intracytoplasmique (SEQ
s m n°5) de la SEQ m n°2), - mettre en contact cet anticorps avec un lysat de cellules, possédant, sous me forme fonctionnelle, le récepteur activateur ou non inhibiteur- pour lequel le polypeptide candidat est supposé constihier le K:AR.AP, dans des conditions douces permettant des réactions de liaison de type antigène-io anricorps, - identifier le polypeptide candidat comme étant un polypeptide k:AR.AP selon l'invention lorsque dans les produits de réaction évenhiellement formés, se trouvent m produit de masse moléculaire apparente proche de celle dudit récepteur activateur ou non inhibiteur m (environ 50 kDa pour le KAR p50) et un produit de masse moléculaire apparente proche de celle du polypeptide candidat (notamment entre 10 et 16 kDa environ).
Cette méthode d'identification selon l'invention peut notamment être réalisée 20 - en mettant en contact ledit anticorps comme ci-dessus décrit, - faire précipiter les produits de réaction éventuellement formés dans des conditions douces de détergent préservant les complexes moléculaires (par exemple digitonine à 1 %, voir exemple 1 ci-dessus), - mesurer la masse moléculaire des produits précipités, par exemple 2s par migration électrophorétique en présence des marqueurs de masse moléculaire sur un gel de polyacrylamide en conditions dénahuantes, et - en identifiant le polypeptide candidat comme étant un polypeptide K:ARA.P selon l'invention comme ci-dessus décrit.
WO 98/49292 1~ PCT/FR98/00883 La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant, en association avec m véhicule phannaceutiquement acceptable, une quantité efficace d'au moins un polypeptide, k~ARAP, fragment, homologue ou forme modifiée selon _ s l'invention, d'au moins Lm anticorps ou fragment d'anticorps selon l'invention, ou d'au moisis un acide nucléique ou variant d'acide nucléique selon l'invention.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être fonnulée sous forme solide, liquide ou sorts forme d'une suspension, pour une io administration orale, parentérale, topique, intravaginale, intrarectale ou pour une inhalation orale et/ou nasale.
Ladite composition pharmaceutique selon l'invention est destinée à
moduler l'activité d'un KAR. Potu- stimuler l'activité d'un KAR, ladite composition phannaceutique comprendra des agents facilitant la transduction is du signal provenant dudit KAR, tels que, par exemple, polypeptides, fragments, homologues, ou acides nucléiques, variants selon l'invention capables de traverser une bicouche lipidique. Pour inhiber (activité d'un KA.R, ladite composition pharmaceutique comprendra des agents bloquant la transduction des signaux issus dudit K.AR tels que, par exemple, des 2o fragments d'anticorps selon finventior: capables de traverser une bicouche lipidique de manière à bloquer les K:ARAPs cellulaires, ou des polypeptides modifiés, selon l'invention, phosphorylés ou non, par exemple à
phosphorylation non hydrolysables dans des conditions biologiques, de maniëre à bloquer des protéines à domaine SH2 (ZAP-70, p72syk) ou PTB ou Zs toute molécule adaptatrice ou effectrice de l'activation dudit KAR. De telles modifications comprennent notamment l'addition de groupements phosphonates, et/ou la mutation d'au moins un résidu Tyrosine (Y) en résidu phénylalanine (F) WO 98/49292 ~ ~ PCT/FR98/00883 La présente demande vise donc une composition pour la prévention, la palliation, et/ou le traitement d'm fonctionnement anormal ou non désiré
d'une cellule impliquée dans tune réaction immunitaire. Une telle composition comprend avantageusement des polypeptides, ou, le cas échéant, des s polypeptides modifiés selon l'invention.
Pour déterminer au niveau d'une cellule si m signal provenant d'm KAR est ou non transduit, et pour- déterminer si un tel signal est stimulé ou inhibé, de nombreux moyens sont à la disposition de l'homme du métier. Des exemples de tels moyens ont été ci-avant indiqués.
io L'utilisation desdits polvpeptides, anticorps et acides nucléiques, en tant qu'agents de diagnostic, entre également dans le champ de la présente invention (méthodes de diagnostic, et kits de diagnostics permettant de les mettre en oeuvre).
La présente invention vise également une méthode de diagnostic in is vitro d'un fonctionnement anormal ou non désiré d'une cellule comprenant les étapes de - mise en contact d'au moins une cellule, ou un extrait de cellule, avec un anticorps selon l'invention, ou un fragment d' un tel anticorps, ou avec un acide nucléique selon l'invention ou un variant d'un tel acide nucléique, et de 20 - révélation du produit de réaction éventuellement formé.
L'étape de mise en contact est réalisée dans des conditions notamment de durée, température, tampon, le cas échéant de réticulation de gel, permettant l'établissement d'une réaction de type antigène-anticorps par exemple par ELISA (Enryme Linked Immunoabsorbant Assays), où le cas as échéant, d'une réaction de type hybridation d'acides nucléiques et PCR
. (amplification en chaîne par poIymérase).
Pour la révélation du produit de réaction éventuellement formé, peuvent être utilisés des marqueurs tels que marqueurs fluorescents, enzymatiques, radioactifs ou luminescents.
Ladite méthode de diagnostic in vitro selon l'invention permet le diagnostic de fonctionnements cellulaires anormaux ou non désirés pouvant se traduire par une maladie immunoproliférative, me maladie d'immunodéficience telle qu'une maladie à VIH, m cancer tel que la maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires, une maladie auto-immune telle que la polyarthrite rhmnatoïde, une maladie infectieuse telle que le paludisme, une réponse allergique, m rejet de greffe.
La présente invention se rapporte également à ime méthode d'identification de molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'm io KAR, et à une méthode d'identification de molécules capables de moduler ime activité cellulaire résultant de l'activation d'Lm KAR.
Ladite méthode d'identification de molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'url KAR selon l'invention comprend les étapes de is i. mise en contact des molécules candidates avec des polypeptides selon l'invention (ou avec des fragments ou homologues de tels polypeptides), et de ü. sélection de celles des molécules candidates pour lesquelles une liaison auxdits polypeptides (ou auxdits fragments de polypeptides) est 20 observée.
Les molécules candidates susceptibles d'être des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR peuvent être par exemple choisies parmi les molécules à domaine SH2 ou PTB. Elles peuvent se présenter sous forme recombinante soluble.
2s L'étape de mise en contact peut être, par exemple, réalisée par couplage des molécules candidates, obtenues sous forme recombinante soluble, susceptibles d'être des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KA.R, à des billes permettant la mesure de la radioactivité
telles que billes de liquide scintillant, et par passage, sur lesdites billes, de WO 98/49292 ~,~ PCT/FR98J00883 polypeptides selon l'invention (ou de fragments ou homologues de tels polypeptides) sous forme tritiée. Sont alors sélectioimées celles des molécules candidates pom lesquelles une liaison auxdits polypeptides, fragments, ou homologues est observée par mesure de la radioactivité (cpm).
s L'étape de mise en contact peut également être réalisée par immobilisation de polypeptides selon l'invention (ou de fragments ou homologues de tels polypeptides) sur des microsupports permettant la mesure de la résonance de plasmons tel que des microsupports BIAcore (Phannacia) (cf. par exemple Olcese et al., 1996, The Journal of Immimology 156:4531-to 4534 ; Vély et al., Immimology Letters 1996, vo1.54. p145-150), ou par immobilisation de polypeptides selon l'invention phosphorylés et biotinylés sm- des billes streptavidine (Vély et al. Eur. J. Immunol. 1997, 27: 1994-2000; Le Dréan et al. Eur. J. Immunol. 1998, 28: 264-276), et par passage, sur lesdits microsupports, de molécules candidates susceptibles d'être des ts molécules adaptatrices ou effectrices de (activation d'un KAR. Sont alors sélectionnées celles des molécules candidates pour lesquelles une liaison auxdits polypeptides, fi-agments, ou homologues est observée par mesure de la résonance de plasmons (Resonance Unit).
Cette méthode d'identification des molécules adaptatrices ou 2o effectrices de (activation d'un KAR, quel qu'en soit son mode de réalisation, peut également servir de référentiel dans la mise en oeuvre de la méthode d'identification de molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR selon l'invention.
Cette méthode d'identification de molécules capables de moduler une 2s activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon l'invention, comprend les étapes de i. mise en contact des molécules candidates avec des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR telles qu'obtenues par la WO 98!49292 2~ PCT/FR98/00883 méthode selon l'invention ci-avant décrite et avec des polypeptides selon l'invention (ou avec des fragments ou homologues de tels polypeptides), et de ü. sélection de celles des molécules candidates qui exercent un effet sur la liaison entre lesdits polypeptides (ou lesdits fragments ou homologues de polypeptides) et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices, telle qu'observée en l'absence desdites molécules candidates.
Les molécules candidates susceptibles de moduler une activité
cellulaire résultant d'un KAR peuvent être choisies parmi des banques de composés nariirels ou synthétiques, en particulier parmi des banques io chimiques ou combinatoires. Lesdites molécules candidates peuvent être de narine protéique (par exemple, dérivés ou fragments d'anticorps asti-idiotypes tels que les anticorps selon l'invention, dérivés ou fragments d'anticorps catalytiques), de nature carbonée, lipidique ou nucléique.
L'étape de mise en contact de la méthode d'identification de molécules is capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon l'invention, peut être, par exemple, réalisée par incubation desdites molécules candidates avec des polypeptides selon l'invention (ou avec des fragments ou homologues de tels polypeptides) et avec des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR, telles qu'obtenues par la ?o méthode selon l'invention, dans des conditions permettant une meswe du taux de liaison entre lesdits polypeptides et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR, par exemple, en se basant sw une propriété chimique desdites molécules adaptatrices ou effectrices à l'état non lié, telle que propriété enzymatique, propriété de phosphorylation ou d'auto-2s phosphorylation.
L'étape de mise en contact de la méthode d'identification de molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon l'invention, peut également être réalisée par mise en oeuvre de techniques du type billes de liquide scintillant et poiypeptides tritiés ou du WO 98/49292 z 1 PCT/FR98/00883 type microsupport et mesure de la résonance de plasmons, telles que ci-avant décrites, en mesurant la radioactivité ou, respectivement, la résonance de plasmons, résultant de la liaison entre lesdits polypeptides et lesdites _ molécules adaptatrices ou effectrices, en l'absence et en présence des s molécules candidates. Sont alors sélectionnées celles des molécules candidates qui soit augmentent soit diminuent de manière statistiquement significative le taux de liaison témoin mesuré entre lesdits polypeptides et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices en l'absence desdites molécules candidates.
io Les molécules capables de moduler l'activation d'un KAR, telles qu'identifiées par la méthode selon l'invention, peuvent être modifiées chimiquement de manière à les rendre non hydrolysables dans des conditions biologiques, et/ou de manière à ce qu'elles puissent traverser une bicouche lipidique cellulaire.
is Les molécules capables de moduler l'activation d'un KAR, selon l'invention, avantageusement agissent en modifiant l'interaction entre lesdits KAR.APs et leurs effecteurs ou adaptateurs cellulaires.
Lesdites molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon la présente invention, peuvent alors être Zo appliquées à une cellule cultivée in vitro, telle que cellule lymphocytaire, dont l'activité KAR a été stimulée, par exemple, par mise en contact avec un ligand. Cette application se fait par pénétration à l'intérieur de ladite cellule, par exemple, par électroporation ou par modification chimique permettant le franchissement d'une bicouche lipidique.
zs La présente invention est illustrée par les exemples suivants qui ne doivent être en aucun cas considérés comme limitatifs.
Il y est fait référence aux 23 figures suivantes:
- la Figure 1 présente WO 98/49292 ~2 PCT/FR98/00883 en A, une analyse par cytomètre de flux (FACScan, marque déposée Becton-Dickinson) en ilnmunofluorescence indirecte de cellules cultivées sm IL-? (interleu.kine 2) et issues de patients atteints de LDGL (maladie lymphoprolifératrice des lymphocytes granulaires) désignés par R.P., D.F. et s MAL., et en B, les résultats d' ~m test de cytotoxicité re-dirigé avec différents anticorps monoclonaux, réalisé sur des cellules NK cultivées sur IL-2 provenant de différents donneurs ;
- la Figure 2 présente io en A, tme analyse SDS-PAGE (résolution de protéines par électrophorèse sur gel et dodécylsulfate de sodium) réalisée à partir de cellules NK de donneur R.P. (p50.1+) radiomarquées au '=SI et immunoprécipitées à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-CD158 EBb, avant et après épuisement en FcERIy et en CD3~ à l'aide d'anticorps asti-CD3~ /
is anri-FcsRIy, en B, une analyse SDS-PAGE avec une sonde anticorps anti-CD3~ de lysats complets de cellules D.F. ou d'immmoprécipités de tels lysats ;
- la Figtue 3 présente en A, une analyse SDS-PAGE des protéines phosphorylées issues de 2o tests kinase in vitro auxquels ont été soiunis des immunoprécipités de lysats de cellules NK MAL., en B, le même type d'analyse SDS-PAGE qu'en figure 3A mais réalisée à partir de cellules RBL-2H3 p50.2+, en C, une analyse par électrophorèse stu couche mince (TLE) des Zs acides aminés phosphoryiés des bandes KARAPs et CD3~ excisées après tests kinase in vitro réalisés sur des immmloprécipités anti-CDI58 et anti-CD 16, respectivement, de cellules NK R.P., - la Figure 4 présente me analyse SDS-PAGE bidimentionnelle en conditions non-dénarilrantes/dénatttrantes d'immtmoprécipités asti-CD158 de lysats de ceilules NK R.P. ayant subi un test kinase, et - la Figure 5 présente les récepteiu-s activatem-s ou non-inhibiteurs de la superfamille des imimuloglobulines (IgSF) ou du type lectine, et leurs contreparties il~hibitrices, la Figure 6 représente la stnicriire schématique de récepteurs KIR
(p58) et KAR {p50), - la Figure 7 représente la séquence ADNc d'un polvpeptide k:.ARAP
io de souris selon l'ülvention (SEQ m n°1), - la Figure 8 représente la séquence nucléotidique (comprise entre la séquence leader exclue et le codon stop) et la séquence en acides aminés d'un polypeptide IC:A.RAP selon l'invention (protéine mâh,~re, SEQ >D n°2), et - la Figure 9 représente l'alignement des ITAMs et de l'ITAM d'un i s polypeptide KARAP selon l'invention, - les Figures 10A, 11A, 12A, 13A et 14A illustrent respectivement les séquences ADNc des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41 I42 (SEQ ID n°6 à SEQ )D n° 10), - les Figures lOB, 11B, 12B, 13B et 14B illustrent respectivement les 2o séquences protéiques des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41142 (SEQ 1D n° 11 à SEQ )D n° 15), - la Figue 15 représente l'alignement des séquences ADNc des EST
AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W4I142, et la séquence consensus résultante (SEQ ID n° I 6 ; ADNc I~:ARAP de souris C57B1/6 2s consensus), - la Figure 16 représente l'alignement des séquences protéiques des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41142, et la séquence consensus résultante (SEQ ID n° 17 ; protéine K:ARAP de souris C57B1/6 consensus), WO 98/49292 2~ PCT/FR98/00883 - la Figure 17 représente la séquence du gène K:ARAP de souris de lignée I29 (SEQ ID n° 18 ; 2838 pb), - la Figure 18 représente l'organisation génomique du IC;ARAP de souris de lignée 129, s - la Figure 19 représente la séquence ADNc du KAR.AP de souris de lignée 129 (SEQ ID n°27) et la séquence protéique correspondante (SEQ
ff~
n°28), - la Figure 20 représente de haut en bas, l'orgailisation génomique du gène K:ARAP de souris de lignée I29, la séquence protéique correspondante, io et la nat<ire des différentes régions de cette protéine, - la Figure 21 représente i'ADNc du K:A.R.AP hiunain (SEQ ID n°31 ), - la Figure 22 représente le pourcentage de sérotonine relargée dans le surnageant par les cellules RBL-2H3 doublement transfectées p50/I~ARAP
humain, et stimulées par l'anticorps indiqué en abscisse (à gauche : aucun is anticorps ; au centre IgE de souris : mIgE 1/500 ; à droite : GL183 Spg/ml), - la Figure 23 illustre l'homologie entre l'organisation du gène K:ARAP
humain et celle du gène K.AR.AP marin.
1. Matériels et méthodes Anticorps monoclonaux (mAbs) et réactifs 2s Les anticorps monoclonaux suivants ont été utilisés - des anticorps anti-CD3, anti-CD16 et anti-CD56 d'isotype IgGl tels que JT3A (Coulter Immunotech référence 0178), KDl (Coulter Immunotech référence 0813) et TA181.H12 (Coulter Immunotech référence 1844), respectivement, WO 98/49292 2~ PCT/FR98/00883 - des anticorps anti- CD3~ tels que TIA-2 (Coulter hnmmotech 66045P2), - des anticorps anti-CD 158, à savoir des anticorps anti-p58. l tels que 3 EB6 (Coulter Immmotech référence 1847), des anticorps anti-p58.2 tels que s GL 183 (Coulter Immimotech référence 1846) et des anticorps anti-p50.3 tels que PAX250 décrit dans Bottino et al. (Earr. ,I. Immunol. 1996, 26, 1816), - un antisémm de lapin anti-FcERIy tel que l'antisénun 666 décrit dans Jouvin M.H. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 5918-5925, - m antisénun de lapin anti-FcERIa tel que l'antisénun BC4 décrit dans io Bociano L.K. et al., 1986, J. Biol. Biochem. 261, 11823-11831, - un antisénun de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (Sigma A-2304) et un antisénun de chèvre anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (Sigma A-0545), - une immunoglobuline de chèvre anti-souris conjuguée à de i ~ fisothiocyanate de fluoresceine (Coulter-Immunotech 0819 F(ab')2), - des anticorps monoclonaux GL183-Phycoérythrine (GL183-PE) (Coulter-Immunotech 2278), (EB6-Phycoérythrine (EB6-PE) (Coulter-Immunotech 2277) et une immunoglobuline de chèvre asti-souris-phycoérythrine (anti-souris-PE) (Coulter Immunotech 0855 F(ab')2).
2o Le tampon de lyse contenait du Tris-HCI 25 mM pH 7,5 ; NaCI
150 mM ; digitonine 1 % ; orthovanadate de sodium 100 pM ; NaF I 0 mM;
aprotinine 2 pg/ml ; leupeptine 2 pg/ml ; tous ces produits ayant été achetés auprès de Sigma (St Louis, MO, USA).
Le tampon kinase contenait de fHepes 20mM pH 7,2 ;
Zs NaCI 100 mM ; MnCl2 5 mM ; MgCl2 SmM ; 32y ATP 10 pCi = 370 kBq (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Le tampon d'électrophorèse sur couche mince (TLE) contenait de l'acide acétique glacial à 10% et de la pyridine à 1 % dans de l'eau ; pH 3,5.
Cellules Cellules NK humaines issues de patients LDGL ou cellules LDGL
s Les cellules NK h tunaines ont été obtenues à partir de patients atteints de maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires (LDGL, Lymphoprol iferative Disease of Granaclar Lymphocytes) de la lignée des cellules NK CD56+, CD16+, CD3-. Des lymphocytes de sang périphérique ~o (PBL, Peripheral Blood Lymphocyte) ont été isolés à partir d'échantillons de sang de patients atteints de LDGL par centrifugation selon un gradient Ficoll/Hypaque. Ces cellules LDGL ont été alors cultivées à 37°C à
une concentration de 106 cellules par ml sur milieu RPMI-1640, à 10 p.g/ml de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum de veau foetal, en présence de is cellules nourricières irradiées allogéniques et de 100 U/ml de rIL-2.
Obtention de cellules transfectées RTIIB.p50.2+
Des transfectants de cellules RBL-2H3 (American Type Culture 2o Collection) exprimant des KARs p50.2 (cellules RTIIB.p50.2+) ont été
réalisées telles que décrites dans Bléry et al. 1997, J. Biol. Chem., 272, 8989-8996). La figure 6, représente de manière schématique, la structure de récepteurs KIR p58 (récepteurs humains inhibiteurs de type immunoglobuline) et des récepteius KAR p50 (contrepartie non inhibitrice Zs des récepteurs KIR p58).
Brièvement, les cellules RTIIB utilisées sont les cellules classiquement décrites comme étant des cellules RBL-2H3 transfectées de manière à
exprimer le récepteur FcyRIIb2 marin et la molécule chimérique CD25/CD3 WO 98/49292 2~ PCT/FR98/00883 comprenant les domaines ecto- et trans-membrmaires complets de la CD25 humaine liés au domaine intracytoplasmique complet de la CD3 marine.
Ces cellules RTIIB ont été de plus transfectées par électroporation d'ADNc 183.Act2 (codant pom p50.283) porté sur le vecteur d'expression s RSV-Sgpt.
Des cellules transfectées RTIIB.p50.2+ stables ont été établies par culriire en présence de xanthine (250 p.g/1), d'hypoxanthine (13,6 pg/1) et d'acide mycophénolique (2 p,g/1).
io Test Cvtolvti4ue L'activité cytolytique des cellules LDGL cultivées sur IL-2 a été
mesurée par rapport à la lignée cellulaire marine P815 (American Type Culture Collection) en l'absence ou en présence des mAbs anti-CD16, anti-is CD158 et anti-CD56.
Brièvement, 5 x 10 3 cellules cibles marquées au slCr ont été ajoutées à
des dilutions en série de cellules effectrices en présence de 50 pl d'anticorps monoclonal surnageant d'hybridome au démarrage du test standard de libération de s~Cr durant 4 heures (Vivier E. et al., 1991, J. Immu»ol.
20 16:206) Radio-ioduration Les cellules (10 - 50 x 106) ont été fixées au formaldéhyde à 0,5%
2s dans du PBS (tampon de phosphate de sodium), puis perméabilisées pendant minutes à l'aide de digitonine à 30 pg/ml dans du PBS préalablement à une induration catalysée par la lactoperoxidase (l2sh NEN-Dupont, Wilinington, DE, USA) tel que décrit par Anderson P. et al., 1989, J. Immu»ol. I -13:1899.
Les cellules ont été lysées pendant 30 minutes à 4°C dans un tampon de lyse à digitonine. Les surnageants post-nucléaires pré-purifiés ont alors été
immunoprécipités à l'aide d'anticorps spécifiques couvrant des billes S4B-Sépharose (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) (Vivier E. et al., 1991, J. _ s Imma~nol. 1-X6:206). Les irrummoprécipités ont été analysés par SDS-PAGE
(résolution de protéines par électrophorèse sur- gel et dodécylsulfate de sodium) et autoradiographie.
Test kinase in vitro io Les cellules (10 x 106 par échantillon) ont été lysées dans 1 ml de tampon de lyse (voir réactifs). Les surnageants post-nucléaires prépurifiés ont été immunoprécipités pendant 2 à 3 heures en utilisant des anticorps monoclonaux liés de manière covalente à une Sépharose 4B activée par CnBr ls (Pharmacia). Les complexes immuns ont été lavés trois fois dans du tampon de lyse ; 40 p,l de tampon kinase (voir réactifs) ont alors été ajoutés aux immunoprécipités pendant 10 minutes à 37°C. La réaction kinase a été
arrêtée par addition du tampon réducteur SDS-échantillon. Les échantillons ont été portés à ébullition préalablement à wie analyse par SDS-PAGE et Zo autoradiographie. Dans certaines expériences, les échantillons ont été
analysés par SDS-PAGE diagonale non-dénaturante/dénaturante bidimensionnelle.
Analyse de la phosuhorvlation des KARAPs Après le test kinase in vitro et la séparation par SDS-PAGE, les protéines phosphorylées ont été excisées des gels séchés et ont été éluées en utilisant un Centrilutor (Amicon) ou une solution de SDS (dodécylsulfate de sodium) à 0,1 % dans du PBS (tampon de phosphate de sodium). Les WO 98/49292 2~ PCT/FR98/00883 protéines éluées ont été précipitées dans de l'acide trichloroacétique à 20% à
Les KA.Rs peuvent fonctionner en tant que récepteurs autonomes, notamment pour des molécules du CMH de classe I. On sait ainsi que l'engagement des KARs avec des molécules du CMH de classe I exprimées sur la smîace de cellules cibles, initie les programmes d'activation lymphocytaires tel qu'il a été établi du fait de la mobilisation du Ca2+
intracytoplasmique et de l'induction de la lyse des cellules cibles.
Outre leurs fonctions de récepteurs autonomes poiu des molécules du io CMH, les KARs peuvent également assurer des fonctions co-réceptrices pour des récepteurs TCR et RFc (Mandelboim O. et al., 1996, Science 27-x:2097 ;
Cambiaggi A. et al., 1996, Blood 87:2369).
En effet, lors de Ia reconnaissance de fragments constants (Fc) d' immtmoglobulines G (IgG) par des réceptem-s tels que CD 16 (RFc~yIII), et is lors de la reconnaissance d'antigènes par le complexe CD3/TCR restreint par des molécules du CMH de classe I ou II, les KARs peuvent jouer le rôle de co-réceptetu-s et ainsi augmenter l'intensité de la réponse cellulaire, en particulier face à de petites quantités d'antigènes, maintenir la réponse cellulaire dans le temps, et également coopérer à la stimulation de la 2o prolifération cellulaire.
Le rôle des KARs, naturellement exprimés sur des sous-populations lymphocytaires NK et T, n'est pas restreint par leurs ligands propres, à
savoir les molécules du CMH de classe I, mais s'étend à l'équilibre du système immunitaire de manière générale.
Zs Le fonctionnement des KARs naturellement exprimés influe ainsi sur la prolifération de cellules NK et T, la production par de telles cellules de substances de type cytokines, la lyse de cellules cibles telles que cellules autologues délétères, malignes ou infectées par des virus, cellules WO 98/49292 ,1 PCT/FR98/00883 allogéniques, mais aussi sm- la tolérance du système immiu~itaire face à
certains antigènes.
Tout non- ou dys-fonctionnement des KARs peut donc conduire à
différentes pathologies ou réactions indésirées, toutes Iiées au fonctionnement s du système immunitaire, telles que maladies d'immuno-déficience, maladies auto-immunes (e.g. sclérose en plaque), tumeurs, infections virales, bactériennes, parasitaires, allergies, rejets de greffe. Il a, par exemple, été
montré que si l'homme ne présente en moyenne que moins de 10% de lymphocytes exprimant des KARs, la quasi-totalité des lymphocytes de io patients atteints de LDGL (maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires) exprime des KARs.
La présente invention a poLU but de fournir des moyens permettant de diagnostiquer un fonctionnement anormal ou non désiré de récepteurs activateurs poiu des molécules du CMH de classe I tels que les KARs et d'en is contrôler le fonctionnement.
L'invention a ainsi pour objet de nouveaux polypeptides, ci-après désignés K.AR.AP (KAR Associated PYOteins), qui sont nécessaires à la transduction d'un signal provenant d'un KAR, ainsi que les anticorps et acides nucléiques obtenus à partir desdits nouveaux polypeptides. Elle a également Zo pour objet un procédé d'obtention desdits nouveaux polypeptides ainsi que leurs applications biologiques.
Par "récepteur KAR", nous entendons, dans la présente, les récepteurs humains de type immunoglobuline contreparties non inhibitrices des récepteurs KIR, tels que les récepteurs KAR p50 (KIRIIIDS1 à KiRIIDSS), Zs KIRIIIDS 1, mais également tout récepteur non inhibiteur de structure similaire à ces récepteurs KAR, et notamment les récepteurs humains de type _ Iectine tels que NKG2C, NKG2D (naturellement exprimés sur des cellules NK et T), les récepteurs marins de type immunoglobuline tels que pir A
(nariirellement exprimés sm- des cellules myéloïdes, des cellules B), gp49A
WO 98/49292 ~ PCT/FR98/00883 (naW rellement exprimés sur des mastocytes), les récepteurs marins de type lectine tels que Ly49D, Ly49H (naturellement exprimés sur des cellules NK
et T).
_ Nous entendons donc par polypeptide KARAP tout polvpeptide isolé
s (autre qu'Lm KAR) en l'absence duquel ledit réceptetu- KAR est naturellement incapable de transduire un signal activateur détectable. Ceci n'exclut pas le fait qu'un polypeptide K:AR.AP déterminé puisse non seulement s'associer à
m récepteur KAR tel que ci-dessus défini, mais également à d'autres récepteiu-s monomériques activateurs ou non iWibiteurs de structtue proche io de celle des KAR tels que ci-dessus défini, et notamment à un récepteur activateur humain de type immunoglobuline de la famille LII~/MIR/B.T tel que ILT 1.
Le terme "polypeptide" comprend, dans la présente demande, non seulement Ledit polypeptide, mais également les homologues de ce u polypeptide, tels qu'obtenus par délétion, insertion, inversion ou substitution conservatrice d'acides aminés, et les fragments de ce polypeptide, tels qu'obtenus par hydrolyse dudit polypeptide à l'aide de protéases, lesdits homologues ou fragments étant capables de transduire un signal provenant d'un KAR. Ce terme "polypeptide" couvre, dans la présente demande, aussi Zo bien des polypeptides que des protéines.
Un polypeptide selon l'invention est nécessaire à la transduction du signal reçu par un récepteur KAR : il s'agit donc d'un polypeptide isolé qui permet la restauration d'une activation KAR déficiente. Pour déterminer si un polypeptide isolé donné permet la restauration d'une activation KAR
2s déficiente, l'homme du métier peut procéder en montrant qu'il existe un récepteur KAR qui, si il est exprimé par me cellule appropriée en (absence de ce polypeptide, ne parvient pas à transduire un signal activateur détectable, ou ne parvient pas à transduire un signal activateur satisfaisant pour l'application visée. Un mode de réalisation de cette détermination est présenté dans l'exemple 3 ci-après par comparaison entre la capacité
d'activation (relargage de sérotonine) d'une cellule RBL-2H3 exprimant le récepteur KAR p50.2 seul, et celle d'une cellule RBL-2H3 qui exprime à Ia fois le récepteur KAR p50.2 et sou polypeptide K:ÄR.AP. Des exemples de s cellules appropriées sont présentées en fig~.~re 5 ci-après.
Par "activation KAR déficiente restaurée", nous entendons que la transduction, à la cellule, par ledit KAR d'un signai activateur significatif est possible, ou, le cas échéant, satisfaisante. Ceci peut être testé notamment à
l'aide d'une stimulation cellulaire par des anticorps.
io Pour déterminer au niveau d'une cellule si un signal provenant d'un KAR est ou non transduit, et pour- déterminer si un tel signal est stimulé ou inhibé, de nombreux moyens sont à la disposition de l'homme du métier. Des exemples de tels moyens incluent la stimulation dudit KAR par un ligand et la meslu-e des cytokines sécrétées (cf. par exemple, Cambiaggi et al. 1996, is Blood 87:2369), de la prolifération cellulaire (cf. par exemple Mandelboim et al. 1996, Science 274:2097), de la cytotoxicité (cf. par exemple le test de cytotoxicité redirigée ci-après décrit), de la mobilisation du calcium intracytopiasmique (cf. par exemple Bléry et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 8989-8996), et/ou de l'induction de phosphorylation (cf. par exemple Vivier 2o et al. 1991, J. Immunol. 146:206).
Un polypeptide selon l'invention est en outre caractérisé en ce qu'il est capable de s'associer à un KAR, et de ne pas s'associer à la contrepartie inhibitrice de ce KAR.
Des méthodes permettant de déterminer si un polypeptide est capable Zs de s'associer à un KAR, et de ne pas s'associer à la contrepartie inhibitrice de ce KAR (c'est-à-dire de ne pas s'associer au récepteur KIR correspondant), sont bien connues de l'homme du métier. Un exemple d'une telle méthode comprend notamment WO 98/49292 ~ PCT/FR98/00883 - faire exprimer ce polypeptide à une cellule KA.R+ KIR- d'une part, et à une cellule KAR- KIR+, - à immunoprécipiter une ou plusieurs fractions) polypeptidiques) à
_ partir du lysat de ces cellules à l'aide d'au moins anticorps anti-KAR et/ou s anti-KIR, - à observer ia présence dudit polypeptide dans la ou les fractions) issues de la cellule KAR+ KIR-, et l'absence de ce même polypeptide dans la ou les fractions issues de la cellule KAR' KIR+. Des exemples d'anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR comprennent les anticorps anti-CD158, anti-io p70/NKB1, anti-p140, et plus particulièrement les anticorps monoclonaux EB6, GL183 ou PAX250. Une méthode permettant de faire exprimer un tel polypeptide par une cellule est indiquée dans l'exemple 3 ci-dessous.
Un polypeptide K:AR.AP selon (invention peut par ailleurs être caractérisé en ce qu'il est tel qu'obtenu is i. par immunoprécipitation d'une ou plusieurs fractions) polypeptidiques) de lysats de cellules exprimant des récepteurs KAR
capables de transduire un signal activateur à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anri-KAR, tel{s) qu'un anticorps anti-CD 158, anti-p70/1'TKB 1, anti-p140, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou 2o PAX250, ü. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuisée par élimination des fractions immunoprécipitées à l'aide d'anticorps anti-CD3~ et/ou anti-FcERIy, et/ou être à nouveau précipitée à
l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR tells) qu'un Zs anticorps anti-CD158, anti-p70/NKBl, anti-p140, et plus particulièrement . (anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fractions) polypeptidiques) selon lem poids moléculaire, et récupération des polypeptides correspondant à un poids moléculaire de 12 + 2 kDa environ, ou bien par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fraction polypeptidiques) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite s (lesdites) fraction{s) polypeptidiques) à un test kinase, et récupération des polypeptides phosphorylés correspondant à un poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 t 2 kDa environ. Le test kinase peut être réalisée tel que ci-après décrit dans les exemples (c~ matériel et méthodes de l'exemple 1 ci-après).
Lesdites cellules expriment des récepteurs KAR capables de transduire io un signal activateur peuvent notamment être des cellules NK et/ou des cellules T edou des cellules myéloïdes et/ou des cellules B et/ou mastocytes.
Des moyens polo déterminer si m KAR est capable ou non de transduire im signal à la cellule ont été ci-avant indiqués.
Un polypeptide k:.AR.AP selon la présente invention est en outre is caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés - présente au moins m acide aminé tyrosine phosphorylable, - présente une masse moléculaire comprise entre 10 + 2 et 16 + 2 kDa environ (notamment, masse moléculaire réelle de 10 + 2 kDa, masse moléculaire apparente sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes ao de 12 ~ 2 à 16 + 2kDa selon le degré de phosphorylation).
Il est en outre caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés comporte au moins un motif ITAM YxxL/Ix~gYxxL/I en région intracytoplasmique.
Selon un aspect de l'invention, la séquence en acides aminés d'un zs polypeptide KAR.AP comporte une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et/ou une région entracytoplasmique. De manière .
caractéristique, cette région intracytoplasmique est majoritaire relativement aux autres régions de la séquence de ce polypeptide. Des moyens pour identifier les régions extracytoplasmiques, transmembranaires, WO 98/49292 ~~ PCT/FR98100883 intracytoplasmiques sont connus de l'homme du métier (par exemple, algorithmes d'hydropathicité, formation de vésicules inversées).
Selon m autre aspect de l'invention, la séquence en acides aminés d'un polypeptide K:ARAP comporte au moins un acide aminé cystéine s extracytoplasmique.
Selon encore m autre aspect de l'invention, la séquence en acides aminés d'un polypeptide K:ARAP, comporte au moins un acide aminé chargé
(R, K, D, E) transmembranaire.
Les polypeptides selon l'invention peuvent être phosphorylés au niveau io d'au moins Lm résidu tyrosine, ou être non phosphorylés.
Dans une forme de réalisation selon l'invention, lesdits polypeptides se présentent sous la forme de dimères liés par lui pont disulfure ; ils s'associent de manière sélective et non covalente à des KARs qui fonctionnent, soit en tant que récepteurs autonomes pour des molécules du is CMH de classe I, soit en tant que co-récepteurs du TCR ou d'un RFc tel que CD16.
Selon un aspect avantageux de l'invention, un polypeptide k;.AR.AP est capable de se lier à une molécule à domaine SH2 telle que ZAP-70, p72~'k, p561'k, p59h'", p60~~', Grb-2, pp36-38 (lat), PLC-al, p85 (PI-3 kinase), Shc, Zo ou à une molécule à domaine PTB (PhosphoTyrosine Binding) telle que Shc.
Une telle liaison peut être observée par incubation de polypeptides selon l'invention avec des molécules à domaine SH2 ou PTB et mesure de la résonance de plasmons (Olcese et al. 1996, The Journal of Immunology 156:4531-4534).
Zs Un polypeptide K:AR.AP particulier selon l'invention présente une séquence en acides aminés essentiellement constituée par la SEQ B7 n°2.
La présente invention vise également les polypeptides dont la séquence est essentiellement constituée par la partie extracytoplasmique de la SEQ ID
n°2, à savoir la SEQ ID n°3, ou par la partie transmembranaire de la SEQ ID
n°2, WO 98/49292 I~ PCT/FR98/00883 à savoir la SEQ ID n°4, ou la partie intracytoplasmique de la SEQ ID
n°2, à
savoir la SEQ ID n°5. D'autres polypeptides KARAP particuliers selon l'invention présentent w~e séquence en acides aminés essentiellement constihiée par la SEQ ID n° 11, n° 12, n° 13, n°
14, n° 15, n° 17 (séquence consensus de la protéine K:ARAP de souris C57B1/6), ou n°28 (séquence protéique de la k:A.R.AP de souris 129 obtenue à partir de la séquence génomique).
De tels polypeptides peuvent également être obtenus, après séquençage, par synthèse chimique ou à l'aide des techniques d'ADN
io recombinant.
Lesdits polypeptides KARAPs sont nécessaires à la transduction de signaux provenant de récepteurs activateurs, les KAR.s, qui ne présentent ni ITIM ni ITAM intracytoplasmiques mais qui présentent un résidu acide aminé transmembranaire.
is Selon une disposition avantageuse, les polypeptides selon (invention sont modifiés par glycosylation, phosphorylation, sulfonation, biotinylation, acylation, estérification, ou par addition, substitution, suppression d' entités de forme moléculaire proche de celle des groupes phosphate, telles que le phosphonate, par addition de réactifs de marquage tels que la luciférase, la 2o GFP (Green Fluorescence Protein) ou ses analogues, par addition de cibles de purification telles qu'w~ ligand d'affinité, par addition d'entités modifiant sa solubilité. Des modifications d'intérêt particulier comprennent celles qui modifient ledit polypeptide de telle sorte à bloquer ou inhiber sa capacité à
transduire le signal reçu (stratégie du transdominant négatifj. Un polypeptide 2s selon l'invention, sous une forme ainsi modifiée, trouve notamment des applications dans toute composition ou méthode destinée à moduler de manière négative (inhiber) une réponse immunitaire donnée, notamment une réponse immtmitaire non désirée ou anormale (par exemple, maladies auto-immimes, allergies, rejet de greffe). Des modifications ainsi appropriées WO 98/49292 1 ~ PCTIFR98/00883 comprennent celles qui rendent la phosphorylation sur tyrosine dudit polypeptide non hydrolysable dais des conditions biologiques (par exemple, par addition de groupes phosphonates). Elles comprennent également celles qui rendent non fonctiormel un résidu aminoacide critique au fonctionnement s d'im polypeptide selon l'invention : par exemple, par substiW tion ou mutation d'un résidu tyrosine (Y), notamment un résidu tyrosine contenu dans m motif ITAM, en u.n résidu phénylalanine (F), ce qui empêche la liaison dudit polypeptide ainsi modifié à une protéine à domaine SH2 ou PTB.
Selon une autre disposition avantageuse, les polypeptides de io l'invention, leurs fragments, homologi.ies, ou formes modifiées sont capables de traverser une membrane cellulaire, c'est-à-dire tme bicouche lipidique.
La présente invention vise également les anticorps, notamment les anticorps monoclonaux, et les fragments de tels anticorps, en particulier les fragments Fc, Fv, Fab, F(ab)'2, CDR, tels qu'obtenus par immunogenèse à
is partir d'iui polypeptide KARAP selon l'invention, ou tels qu'obtenus à
partir d'un fragment, homologue ou forme modifiée d'iu~ tel polypeptide.
Elle a en particulier pour objet des fragments de tels anticorps, en particulier fragment Fc, Fv, Fab, F(ab)'2, CDR, tels qu'obtenus par immunogenèse à partir d'un polypeptide dont la séquence est essentiellement 2o constituée par la partie extracytoplasmique, intracytoplasmique, ou transmembranaire d'un tel polypeptide K:AR.AP selon l'invention. Elle vise notamment de tels anticorps capables de reconnaître, selon une réaction du type antigène-anticorps, la SEQ ff~ n°2, la SEQ ll~ n°3, la SEQ
B7 n°4, la SEQ ID n°5, SEQ ID n° 11, SEQ m n° 12, SEQ ID n°
I 3, SEQ m n° 14, SEQ
2s ID n° 15, SEQ ID n° I 7 et/ou SEQ ID n°28, ainsi que leurs fragments.
. De tels anticorps sont obtenus par immunisation d'animaux, tels que lapins et souris, contre des polypeptides, fragments, homologues ou formes modifiées selon l'invention tels qu'essentiellement obtenus par élution de bandes électrophorétiques, par synthèse chimique ou par une technique de protéines de fission solubles (GST), lesdits polypeptides, fragments, homologues ou formes modifiées étant optionnellement couplés à des immunogènes tels que l'ovalbumine.
Des anticorps monoclonaux sont alors produits par fusion hybridomale s des cellules spléniques immunes, criblage et purification des sLUnageants de culhlre (K~hler et Milstein, 1975, Nah~re 256, 495-497 ; Antibodies, a laboratory manual, 1988, Harlow and David Lane, Ed. Cold Spring Harbor laboratory).
A partir de ces anticorps, des dianticorps peuvent être générés selon io des procédures standards. Lesdits fragments peuvent, si nécessaire, être insérés ou greffés à des structures hwnanisantes.
La présente invention vise également les acides nucléiques comprenant lme séquence correspondant à la lecture en cadre ouvert, selon le code génétique universel et en tenant compte de la dégénérescence dudit code, de is la séquence en acides aminés d'un polypeptide, fragment, ou homologue selon l'invention, ainsi que les variants qui présentent une homologie supérieure ou égale à 60% avec de tels acides nucléiques, et qui sont capables de coder pour une molécule transductrice d'un signal activateur provenant d'un KAR tel que ci-avant défini. Elle vise notamment tout acide 2o nucléique dont la séquence ADN est essentiellement constituée par la SEQ
ff~ n° 1 (ADNc de Ia protéine K:ARAP mature de séquence SEQ )L?
n°2), n°6, n°7, n°8, n°9, n°10, n°16 (séquence ADNc consensus du KAR.AP de souris C57B1/6), n°27 (séquence ADNc du KARAP de souris 129 obtenue à
partir de la séquence génomique), n° 18 (séquence génomique du k:.AR.AP de souris Zs 129), ou n°31 (séquence ADNc du I~:ARAP humain), ou par toute partie correspondant aux régions extra-, infra-cytoplasmique et/ou transmembranaires de ces séquences, ou par toute partie correspondant à un exon ou un intron de ces séquences.
WO 98/49292 ~3 PCT/FR98/00883 La présente invention vise également un procédé d'obtention d'un polypeptide selon l'invention comprenant les étapes i. d'immmoprécipiter une ou plusiem-s fractions) polypeptidiques) de lysats de cellules exprimant des récepteurs KAR
fonctionnels (cellules NK et/ou des cellules T et/ou des cellules myéloïdes et/ou des cellules B et/ou mastocytes par exemple) à l'aide d'url ou plusieiu-s anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR, tells) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKB1, anti-p140, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, io ü. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuisée par élimination des frâctions immunoprécipitées à l'aide d' anticorps anti-CD3 et/ou anti-FcERIy, et/ou être à nouveau précipitée à
l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR tells) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKBi, anti-p140, et plus particulièrement is l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. de séparer les polypeptides de ladite (desdites) fractions) polypeptidiques) selon leur poids moléculaire et récupérer les polypeptides correspondant à un poids moléculaire de 12 t 2 kDa environ, ou bien de séparer les polypeptides de ladite (desdites) fractions) 2o polypeptidiques) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite (lesdites) fractions) polypeptidiques) à un test kinase, et récupérer les polypeptides phosphorylés correspondant à m poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 ~ 2 kDa environ.
La présente demande a également pour objet me méthode pour obtenir 2s la séquence de polypeptides K:.ARAP particuliers selon l'invention. Cette . méthode, dont un exemple de réalisation est décrite dans l'exemple 2 ci-après (stratégies bio-informatiques), comprend notamment le criblage de celles des séquences polypeptidiques qui répondent aux critères suivants WO 98/49292 ~~ PCT/FR98/00883 - la séquence présente au moins un acide aminé tvrosine phosphorylable, - la séquence présente me masse moléculaire comprise entre 5 et 25 kDa environ, - la séquence comporte une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et une région intracytoplasmique, - la séquence comporte au moins un acide aminé cystéine dans sa région extracvtoplasmique, - la séquence comporte au moins un acide aminé chargé (R, K, D, E) iu dans sa région transmembranaire, et - la séquence comporte au moins un motif ITAM Yx~cL/Ix6_gYxxL/I
dans sa région intracytoplasmique, - le polypeptide correspondant à la séquence sélectionnée devant être capable de s'associer à un KAR, et de ne pas s'associer au récepteur is contrepartie inlùbitrice correspondant (KIR), comme ci-avant défini.
La présente demande a également pour objet une méthode pour déterminer ou contrôler si un polypeptide candidat correspond à un polypeptide I~:ARAP selon l'invention. Un exemple de réalisation d'une telle méthode est présenté dans l'exemple 2 ci-après. Une telle méthode consiste à
2o produire ~.zn anticorps contre une partie caractéristique de ce polypeptide candidat (par exemple ime région intracytoplasmique comprenant au moins un motif ITAM ou une région extracytoplasmique), et à vérifier qu'il existe un récepteur KAR qui, lorsqu'il est exprimé de manière fonctionnelle sur une cellule, se trouve associé à iui élément reconnu, selon une réaction de type Zs antigène-anticorps, par ledit anticorps.
Cette méthode, selon l'invention, d'identification de polypeptides I~:A.RAP consiste ainsi notamment à
- produire un anticorps mono- ou polyclonal dirigé contre ce polypeptide candidat, et en particulier contre Lute région extracytoplasmique WO 98/49292 ~ 5 PCT/FR98/00883 de ce polypeptide candidat et/ou une région qui comprend au moins un motif ITAM (par exemple, dans le cas de la protéine k:ARAP de souris SEQ )D
n°2 identifiée ci-dessus, un anticorps dirigé contre une région de la partie extracytoplasmique (SEQ ID n°3) ou de la partie intracytoplasmique (SEQ
s m n°5) de la SEQ m n°2), - mettre en contact cet anticorps avec un lysat de cellules, possédant, sous me forme fonctionnelle, le récepteur activateur ou non inhibiteur- pour lequel le polypeptide candidat est supposé constihier le K:AR.AP, dans des conditions douces permettant des réactions de liaison de type antigène-io anricorps, - identifier le polypeptide candidat comme étant un polypeptide k:AR.AP selon l'invention lorsque dans les produits de réaction évenhiellement formés, se trouvent m produit de masse moléculaire apparente proche de celle dudit récepteur activateur ou non inhibiteur m (environ 50 kDa pour le KAR p50) et un produit de masse moléculaire apparente proche de celle du polypeptide candidat (notamment entre 10 et 16 kDa environ).
Cette méthode d'identification selon l'invention peut notamment être réalisée 20 - en mettant en contact ledit anticorps comme ci-dessus décrit, - faire précipiter les produits de réaction éventuellement formés dans des conditions douces de détergent préservant les complexes moléculaires (par exemple digitonine à 1 %, voir exemple 1 ci-dessus), - mesurer la masse moléculaire des produits précipités, par exemple 2s par migration électrophorétique en présence des marqueurs de masse moléculaire sur un gel de polyacrylamide en conditions dénahuantes, et - en identifiant le polypeptide candidat comme étant un polypeptide K:ARA.P selon l'invention comme ci-dessus décrit.
WO 98/49292 1~ PCT/FR98/00883 La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant, en association avec m véhicule phannaceutiquement acceptable, une quantité efficace d'au moins un polypeptide, k~ARAP, fragment, homologue ou forme modifiée selon _ s l'invention, d'au moins Lm anticorps ou fragment d'anticorps selon l'invention, ou d'au moisis un acide nucléique ou variant d'acide nucléique selon l'invention.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être fonnulée sous forme solide, liquide ou sorts forme d'une suspension, pour une io administration orale, parentérale, topique, intravaginale, intrarectale ou pour une inhalation orale et/ou nasale.
Ladite composition pharmaceutique selon l'invention est destinée à
moduler l'activité d'un KAR. Potu- stimuler l'activité d'un KAR, ladite composition phannaceutique comprendra des agents facilitant la transduction is du signal provenant dudit KAR, tels que, par exemple, polypeptides, fragments, homologues, ou acides nucléiques, variants selon l'invention capables de traverser une bicouche lipidique. Pour inhiber (activité d'un KA.R, ladite composition pharmaceutique comprendra des agents bloquant la transduction des signaux issus dudit K.AR tels que, par exemple, des 2o fragments d'anticorps selon finventior: capables de traverser une bicouche lipidique de manière à bloquer les K:ARAPs cellulaires, ou des polypeptides modifiés, selon l'invention, phosphorylés ou non, par exemple à
phosphorylation non hydrolysables dans des conditions biologiques, de maniëre à bloquer des protéines à domaine SH2 (ZAP-70, p72syk) ou PTB ou Zs toute molécule adaptatrice ou effectrice de l'activation dudit KAR. De telles modifications comprennent notamment l'addition de groupements phosphonates, et/ou la mutation d'au moins un résidu Tyrosine (Y) en résidu phénylalanine (F) WO 98/49292 ~ ~ PCT/FR98/00883 La présente demande vise donc une composition pour la prévention, la palliation, et/ou le traitement d'm fonctionnement anormal ou non désiré
d'une cellule impliquée dans tune réaction immunitaire. Une telle composition comprend avantageusement des polypeptides, ou, le cas échéant, des s polypeptides modifiés selon l'invention.
Pour déterminer au niveau d'une cellule si m signal provenant d'm KAR est ou non transduit, et pour- déterminer si un tel signal est stimulé ou inhibé, de nombreux moyens sont à la disposition de l'homme du métier. Des exemples de tels moyens ont été ci-avant indiqués.
io L'utilisation desdits polvpeptides, anticorps et acides nucléiques, en tant qu'agents de diagnostic, entre également dans le champ de la présente invention (méthodes de diagnostic, et kits de diagnostics permettant de les mettre en oeuvre).
La présente invention vise également une méthode de diagnostic in is vitro d'un fonctionnement anormal ou non désiré d'une cellule comprenant les étapes de - mise en contact d'au moins une cellule, ou un extrait de cellule, avec un anticorps selon l'invention, ou un fragment d' un tel anticorps, ou avec un acide nucléique selon l'invention ou un variant d'un tel acide nucléique, et de 20 - révélation du produit de réaction éventuellement formé.
L'étape de mise en contact est réalisée dans des conditions notamment de durée, température, tampon, le cas échéant de réticulation de gel, permettant l'établissement d'une réaction de type antigène-anticorps par exemple par ELISA (Enryme Linked Immunoabsorbant Assays), où le cas as échéant, d'une réaction de type hybridation d'acides nucléiques et PCR
. (amplification en chaîne par poIymérase).
Pour la révélation du produit de réaction éventuellement formé, peuvent être utilisés des marqueurs tels que marqueurs fluorescents, enzymatiques, radioactifs ou luminescents.
Ladite méthode de diagnostic in vitro selon l'invention permet le diagnostic de fonctionnements cellulaires anormaux ou non désirés pouvant se traduire par une maladie immunoproliférative, me maladie d'immunodéficience telle qu'une maladie à VIH, m cancer tel que la maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires, une maladie auto-immune telle que la polyarthrite rhmnatoïde, une maladie infectieuse telle que le paludisme, une réponse allergique, m rejet de greffe.
La présente invention se rapporte également à ime méthode d'identification de molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'm io KAR, et à une méthode d'identification de molécules capables de moduler ime activité cellulaire résultant de l'activation d'Lm KAR.
Ladite méthode d'identification de molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'url KAR selon l'invention comprend les étapes de is i. mise en contact des molécules candidates avec des polypeptides selon l'invention (ou avec des fragments ou homologues de tels polypeptides), et de ü. sélection de celles des molécules candidates pour lesquelles une liaison auxdits polypeptides (ou auxdits fragments de polypeptides) est 20 observée.
Les molécules candidates susceptibles d'être des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR peuvent être par exemple choisies parmi les molécules à domaine SH2 ou PTB. Elles peuvent se présenter sous forme recombinante soluble.
2s L'étape de mise en contact peut être, par exemple, réalisée par couplage des molécules candidates, obtenues sous forme recombinante soluble, susceptibles d'être des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KA.R, à des billes permettant la mesure de la radioactivité
telles que billes de liquide scintillant, et par passage, sur lesdites billes, de WO 98/49292 ~,~ PCT/FR98J00883 polypeptides selon l'invention (ou de fragments ou homologues de tels polypeptides) sous forme tritiée. Sont alors sélectioimées celles des molécules candidates pom lesquelles une liaison auxdits polypeptides, fragments, ou homologues est observée par mesure de la radioactivité (cpm).
s L'étape de mise en contact peut également être réalisée par immobilisation de polypeptides selon l'invention (ou de fragments ou homologues de tels polypeptides) sur des microsupports permettant la mesure de la résonance de plasmons tel que des microsupports BIAcore (Phannacia) (cf. par exemple Olcese et al., 1996, The Journal of Immimology 156:4531-to 4534 ; Vély et al., Immimology Letters 1996, vo1.54. p145-150), ou par immobilisation de polypeptides selon l'invention phosphorylés et biotinylés sm- des billes streptavidine (Vély et al. Eur. J. Immunol. 1997, 27: 1994-2000; Le Dréan et al. Eur. J. Immunol. 1998, 28: 264-276), et par passage, sur lesdits microsupports, de molécules candidates susceptibles d'être des ts molécules adaptatrices ou effectrices de (activation d'un KAR. Sont alors sélectionnées celles des molécules candidates pour lesquelles une liaison auxdits polypeptides, fi-agments, ou homologues est observée par mesure de la résonance de plasmons (Resonance Unit).
Cette méthode d'identification des molécules adaptatrices ou 2o effectrices de (activation d'un KAR, quel qu'en soit son mode de réalisation, peut également servir de référentiel dans la mise en oeuvre de la méthode d'identification de molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR selon l'invention.
Cette méthode d'identification de molécules capables de moduler une 2s activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon l'invention, comprend les étapes de i. mise en contact des molécules candidates avec des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR telles qu'obtenues par la WO 98!49292 2~ PCT/FR98/00883 méthode selon l'invention ci-avant décrite et avec des polypeptides selon l'invention (ou avec des fragments ou homologues de tels polypeptides), et de ü. sélection de celles des molécules candidates qui exercent un effet sur la liaison entre lesdits polypeptides (ou lesdits fragments ou homologues de polypeptides) et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices, telle qu'observée en l'absence desdites molécules candidates.
Les molécules candidates susceptibles de moduler une activité
cellulaire résultant d'un KAR peuvent être choisies parmi des banques de composés nariirels ou synthétiques, en particulier parmi des banques io chimiques ou combinatoires. Lesdites molécules candidates peuvent être de narine protéique (par exemple, dérivés ou fragments d'anticorps asti-idiotypes tels que les anticorps selon l'invention, dérivés ou fragments d'anticorps catalytiques), de nature carbonée, lipidique ou nucléique.
L'étape de mise en contact de la méthode d'identification de molécules is capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon l'invention, peut être, par exemple, réalisée par incubation desdites molécules candidates avec des polypeptides selon l'invention (ou avec des fragments ou homologues de tels polypeptides) et avec des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR, telles qu'obtenues par la ?o méthode selon l'invention, dans des conditions permettant une meswe du taux de liaison entre lesdits polypeptides et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR, par exemple, en se basant sw une propriété chimique desdites molécules adaptatrices ou effectrices à l'état non lié, telle que propriété enzymatique, propriété de phosphorylation ou d'auto-2s phosphorylation.
L'étape de mise en contact de la méthode d'identification de molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon l'invention, peut également être réalisée par mise en oeuvre de techniques du type billes de liquide scintillant et poiypeptides tritiés ou du WO 98/49292 z 1 PCT/FR98/00883 type microsupport et mesure de la résonance de plasmons, telles que ci-avant décrites, en mesurant la radioactivité ou, respectivement, la résonance de plasmons, résultant de la liaison entre lesdits polypeptides et lesdites _ molécules adaptatrices ou effectrices, en l'absence et en présence des s molécules candidates. Sont alors sélectionnées celles des molécules candidates qui soit augmentent soit diminuent de manière statistiquement significative le taux de liaison témoin mesuré entre lesdits polypeptides et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices en l'absence desdites molécules candidates.
io Les molécules capables de moduler l'activation d'un KAR, telles qu'identifiées par la méthode selon l'invention, peuvent être modifiées chimiquement de manière à les rendre non hydrolysables dans des conditions biologiques, et/ou de manière à ce qu'elles puissent traverser une bicouche lipidique cellulaire.
is Les molécules capables de moduler l'activation d'un KAR, selon l'invention, avantageusement agissent en modifiant l'interaction entre lesdits KAR.APs et leurs effecteurs ou adaptateurs cellulaires.
Lesdites molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon la présente invention, peuvent alors être Zo appliquées à une cellule cultivée in vitro, telle que cellule lymphocytaire, dont l'activité KAR a été stimulée, par exemple, par mise en contact avec un ligand. Cette application se fait par pénétration à l'intérieur de ladite cellule, par exemple, par électroporation ou par modification chimique permettant le franchissement d'une bicouche lipidique.
zs La présente invention est illustrée par les exemples suivants qui ne doivent être en aucun cas considérés comme limitatifs.
Il y est fait référence aux 23 figures suivantes:
- la Figure 1 présente WO 98/49292 ~2 PCT/FR98/00883 en A, une analyse par cytomètre de flux (FACScan, marque déposée Becton-Dickinson) en ilnmunofluorescence indirecte de cellules cultivées sm IL-? (interleu.kine 2) et issues de patients atteints de LDGL (maladie lymphoprolifératrice des lymphocytes granulaires) désignés par R.P., D.F. et s MAL., et en B, les résultats d' ~m test de cytotoxicité re-dirigé avec différents anticorps monoclonaux, réalisé sur des cellules NK cultivées sur IL-2 provenant de différents donneurs ;
- la Figure 2 présente io en A, tme analyse SDS-PAGE (résolution de protéines par électrophorèse sur gel et dodécylsulfate de sodium) réalisée à partir de cellules NK de donneur R.P. (p50.1+) radiomarquées au '=SI et immunoprécipitées à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-CD158 EBb, avant et après épuisement en FcERIy et en CD3~ à l'aide d'anticorps asti-CD3~ /
is anri-FcsRIy, en B, une analyse SDS-PAGE avec une sonde anticorps anti-CD3~ de lysats complets de cellules D.F. ou d'immmoprécipités de tels lysats ;
- la Figtue 3 présente en A, une analyse SDS-PAGE des protéines phosphorylées issues de 2o tests kinase in vitro auxquels ont été soiunis des immunoprécipités de lysats de cellules NK MAL., en B, le même type d'analyse SDS-PAGE qu'en figure 3A mais réalisée à partir de cellules RBL-2H3 p50.2+, en C, une analyse par électrophorèse stu couche mince (TLE) des Zs acides aminés phosphoryiés des bandes KARAPs et CD3~ excisées après tests kinase in vitro réalisés sur des immmloprécipités anti-CDI58 et anti-CD 16, respectivement, de cellules NK R.P., - la Figure 4 présente me analyse SDS-PAGE bidimentionnelle en conditions non-dénarilrantes/dénatttrantes d'immtmoprécipités asti-CD158 de lysats de ceilules NK R.P. ayant subi un test kinase, et - la Figure 5 présente les récepteiu-s activatem-s ou non-inhibiteurs de la superfamille des imimuloglobulines (IgSF) ou du type lectine, et leurs contreparties il~hibitrices, la Figure 6 représente la stnicriire schématique de récepteurs KIR
(p58) et KAR {p50), - la Figure 7 représente la séquence ADNc d'un polvpeptide k:.ARAP
io de souris selon l'ülvention (SEQ m n°1), - la Figure 8 représente la séquence nucléotidique (comprise entre la séquence leader exclue et le codon stop) et la séquence en acides aminés d'un polypeptide IC:A.RAP selon l'invention (protéine mâh,~re, SEQ >D n°2), et - la Figure 9 représente l'alignement des ITAMs et de l'ITAM d'un i s polypeptide KARAP selon l'invention, - les Figures 10A, 11A, 12A, 13A et 14A illustrent respectivement les séquences ADNc des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41 I42 (SEQ ID n°6 à SEQ )D n° 10), - les Figures lOB, 11B, 12B, 13B et 14B illustrent respectivement les 2o séquences protéiques des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41142 (SEQ 1D n° 11 à SEQ )D n° 15), - la Figue 15 représente l'alignement des séquences ADNc des EST
AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W4I142, et la séquence consensus résultante (SEQ ID n° I 6 ; ADNc I~:ARAP de souris C57B1/6 2s consensus), - la Figure 16 représente l'alignement des séquences protéiques des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41142, et la séquence consensus résultante (SEQ ID n° 17 ; protéine K:ARAP de souris C57B1/6 consensus), WO 98/49292 2~ PCT/FR98/00883 - la Figure 17 représente la séquence du gène K:ARAP de souris de lignée I29 (SEQ ID n° 18 ; 2838 pb), - la Figure 18 représente l'organisation génomique du IC;ARAP de souris de lignée 129, s - la Figure 19 représente la séquence ADNc du KAR.AP de souris de lignée 129 (SEQ ID n°27) et la séquence protéique correspondante (SEQ
ff~
n°28), - la Figure 20 représente de haut en bas, l'orgailisation génomique du gène K:ARAP de souris de lignée I29, la séquence protéique correspondante, io et la nat<ire des différentes régions de cette protéine, - la Figure 21 représente i'ADNc du K:A.R.AP hiunain (SEQ ID n°31 ), - la Figure 22 représente le pourcentage de sérotonine relargée dans le surnageant par les cellules RBL-2H3 doublement transfectées p50/I~ARAP
humain, et stimulées par l'anticorps indiqué en abscisse (à gauche : aucun is anticorps ; au centre IgE de souris : mIgE 1/500 ; à droite : GL183 Spg/ml), - la Figure 23 illustre l'homologie entre l'organisation du gène K:ARAP
humain et celle du gène K.AR.AP marin.
1. Matériels et méthodes Anticorps monoclonaux (mAbs) et réactifs 2s Les anticorps monoclonaux suivants ont été utilisés - des anticorps anti-CD3, anti-CD16 et anti-CD56 d'isotype IgGl tels que JT3A (Coulter Immunotech référence 0178), KDl (Coulter Immunotech référence 0813) et TA181.H12 (Coulter Immunotech référence 1844), respectivement, WO 98/49292 2~ PCT/FR98/00883 - des anticorps anti- CD3~ tels que TIA-2 (Coulter hnmmotech 66045P2), - des anticorps anti-CD 158, à savoir des anticorps anti-p58. l tels que 3 EB6 (Coulter Immmotech référence 1847), des anticorps anti-p58.2 tels que s GL 183 (Coulter Immimotech référence 1846) et des anticorps anti-p50.3 tels que PAX250 décrit dans Bottino et al. (Earr. ,I. Immunol. 1996, 26, 1816), - un antisémm de lapin anti-FcERIy tel que l'antisénun 666 décrit dans Jouvin M.H. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 5918-5925, - m antisénun de lapin anti-FcERIa tel que l'antisénun BC4 décrit dans io Bociano L.K. et al., 1986, J. Biol. Biochem. 261, 11823-11831, - un antisénun de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (Sigma A-2304) et un antisénun de chèvre anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (Sigma A-0545), - une immunoglobuline de chèvre anti-souris conjuguée à de i ~ fisothiocyanate de fluoresceine (Coulter-Immunotech 0819 F(ab')2), - des anticorps monoclonaux GL183-Phycoérythrine (GL183-PE) (Coulter-Immunotech 2278), (EB6-Phycoérythrine (EB6-PE) (Coulter-Immunotech 2277) et une immunoglobuline de chèvre asti-souris-phycoérythrine (anti-souris-PE) (Coulter Immunotech 0855 F(ab')2).
2o Le tampon de lyse contenait du Tris-HCI 25 mM pH 7,5 ; NaCI
150 mM ; digitonine 1 % ; orthovanadate de sodium 100 pM ; NaF I 0 mM;
aprotinine 2 pg/ml ; leupeptine 2 pg/ml ; tous ces produits ayant été achetés auprès de Sigma (St Louis, MO, USA).
Le tampon kinase contenait de fHepes 20mM pH 7,2 ;
Zs NaCI 100 mM ; MnCl2 5 mM ; MgCl2 SmM ; 32y ATP 10 pCi = 370 kBq (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Le tampon d'électrophorèse sur couche mince (TLE) contenait de l'acide acétique glacial à 10% et de la pyridine à 1 % dans de l'eau ; pH 3,5.
Cellules Cellules NK humaines issues de patients LDGL ou cellules LDGL
s Les cellules NK h tunaines ont été obtenues à partir de patients atteints de maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires (LDGL, Lymphoprol iferative Disease of Granaclar Lymphocytes) de la lignée des cellules NK CD56+, CD16+, CD3-. Des lymphocytes de sang périphérique ~o (PBL, Peripheral Blood Lymphocyte) ont été isolés à partir d'échantillons de sang de patients atteints de LDGL par centrifugation selon un gradient Ficoll/Hypaque. Ces cellules LDGL ont été alors cultivées à 37°C à
une concentration de 106 cellules par ml sur milieu RPMI-1640, à 10 p.g/ml de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum de veau foetal, en présence de is cellules nourricières irradiées allogéniques et de 100 U/ml de rIL-2.
Obtention de cellules transfectées RTIIB.p50.2+
Des transfectants de cellules RBL-2H3 (American Type Culture 2o Collection) exprimant des KARs p50.2 (cellules RTIIB.p50.2+) ont été
réalisées telles que décrites dans Bléry et al. 1997, J. Biol. Chem., 272, 8989-8996). La figure 6, représente de manière schématique, la structure de récepteurs KIR p58 (récepteurs humains inhibiteurs de type immunoglobuline) et des récepteius KAR p50 (contrepartie non inhibitrice Zs des récepteurs KIR p58).
Brièvement, les cellules RTIIB utilisées sont les cellules classiquement décrites comme étant des cellules RBL-2H3 transfectées de manière à
exprimer le récepteur FcyRIIb2 marin et la molécule chimérique CD25/CD3 WO 98/49292 2~ PCT/FR98/00883 comprenant les domaines ecto- et trans-membrmaires complets de la CD25 humaine liés au domaine intracytoplasmique complet de la CD3 marine.
Ces cellules RTIIB ont été de plus transfectées par électroporation d'ADNc 183.Act2 (codant pom p50.283) porté sur le vecteur d'expression s RSV-Sgpt.
Des cellules transfectées RTIIB.p50.2+ stables ont été établies par culriire en présence de xanthine (250 p.g/1), d'hypoxanthine (13,6 pg/1) et d'acide mycophénolique (2 p,g/1).
io Test Cvtolvti4ue L'activité cytolytique des cellules LDGL cultivées sur IL-2 a été
mesurée par rapport à la lignée cellulaire marine P815 (American Type Culture Collection) en l'absence ou en présence des mAbs anti-CD16, anti-is CD158 et anti-CD56.
Brièvement, 5 x 10 3 cellules cibles marquées au slCr ont été ajoutées à
des dilutions en série de cellules effectrices en présence de 50 pl d'anticorps monoclonal surnageant d'hybridome au démarrage du test standard de libération de s~Cr durant 4 heures (Vivier E. et al., 1991, J. Immu»ol.
20 16:206) Radio-ioduration Les cellules (10 - 50 x 106) ont été fixées au formaldéhyde à 0,5%
2s dans du PBS (tampon de phosphate de sodium), puis perméabilisées pendant minutes à l'aide de digitonine à 30 pg/ml dans du PBS préalablement à une induration catalysée par la lactoperoxidase (l2sh NEN-Dupont, Wilinington, DE, USA) tel que décrit par Anderson P. et al., 1989, J. Immu»ol. I -13:1899.
Les cellules ont été lysées pendant 30 minutes à 4°C dans un tampon de lyse à digitonine. Les surnageants post-nucléaires pré-purifiés ont alors été
immunoprécipités à l'aide d'anticorps spécifiques couvrant des billes S4B-Sépharose (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) (Vivier E. et al., 1991, J. _ s Imma~nol. 1-X6:206). Les irrummoprécipités ont été analysés par SDS-PAGE
(résolution de protéines par électrophorèse sur- gel et dodécylsulfate de sodium) et autoradiographie.
Test kinase in vitro io Les cellules (10 x 106 par échantillon) ont été lysées dans 1 ml de tampon de lyse (voir réactifs). Les surnageants post-nucléaires prépurifiés ont été immunoprécipités pendant 2 à 3 heures en utilisant des anticorps monoclonaux liés de manière covalente à une Sépharose 4B activée par CnBr ls (Pharmacia). Les complexes immuns ont été lavés trois fois dans du tampon de lyse ; 40 p,l de tampon kinase (voir réactifs) ont alors été ajoutés aux immunoprécipités pendant 10 minutes à 37°C. La réaction kinase a été
arrêtée par addition du tampon réducteur SDS-échantillon. Les échantillons ont été portés à ébullition préalablement à wie analyse par SDS-PAGE et Zo autoradiographie. Dans certaines expériences, les échantillons ont été
analysés par SDS-PAGE diagonale non-dénaturante/dénaturante bidimensionnelle.
Analyse de la phosuhorvlation des KARAPs Après le test kinase in vitro et la séparation par SDS-PAGE, les protéines phosphorylées ont été excisées des gels séchés et ont été éluées en utilisant un Centrilutor (Amicon) ou une solution de SDS (dodécylsulfate de sodium) à 0,1 % dans du PBS (tampon de phosphate de sodium). Les WO 98/49292 2~ PCT/FR98/00883 protéines éluées ont été précipitées dans de l'acide trichloroacétique à 20% à
4°C pendant 2 heures, préalablement à une incubation dans 200 ~1 d'HCl
5,7 M à 110°C pendant 90 minutes. Les acides aminés individuels ont alors été
séchés et remis en suspension dans 5 ~l de tampon TLE (voir réactifs) contenant 5 pg de chaque phosphotyrosine, phosphothréonine, phosphosérine non marquée (Sigma) en tant qu'étalons standards. Les échantillons ont été
déposés sir des plaques de cellulose (DC-cellulose 100-gym) et mis à migrer à
1500 V pendant 45 minutes à 4°C siu un Multiphor II (Phaimacia). Des étalons standards ont été développés à l'aide de ninhydrine à 1 % dans de io l'acétone et les acides aminés marqués au 32P ont été identifiés par autoradiographie.
Analyse uar immunotransfert Les immunoprécipités ont été résolus par SDS-PAGE, transférés sur is filtres de nitrocellulose et confrontés aux sondes anticorps anti-CD3~ ou anti FCERIy diluées dans une solution de PBS à 5% en lait déshydraté écrémé.
Les immunotransferts ont été révélés en utilisant un antisérum de chèvre anti souris ou anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (Sigma références A
2304 et A-0545 respectivement) et le système de détection ECL
2o commercialisé par Amersham (RPN 2209).
2. Résultats Phénotvoe de surface 2s Le phénotype de surface des cellules NK issues de patients LDGL et cultivées sur IL-2 (interleukine-2) a été analysé par FACScan (tri de cellules activées par fluorescence) en immunofluorescence indirecte.
Sont ci-après reportés les résultats de l' étude relative à trois de ces patients, ci-après nommés R.P., D.F. et MAL.
WO 98/49292 3~ PCT/FR98/00883 Lesdits résultats sont illustrés par la Figure 1 A où est présentée ime analyse par FACScan en immunofluorescence indirecte de cellules LDGL
(maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires) R.P., D.F. ou MAL. cultivées sur IL-2. Une immunoglobuline de chèvre anti-som-is _ conjuguée à de l'isothiocyanate de fluoresceine a servi de réactif de seconde étape. Pour chaque type de cellules LDGL (cellules LDGL R.P. pour les analyses présentées dans la bande horizontale supérieure, cellules LDGL
D.F. poLU celles de la bande horizontale médiane, cellules LDGL MAL. pour celles de la bande horizontale inférieure) et pour chaque traitement subi io (traitement témoin C poiu- les graphes présentés à gauche ou traitement par l'anticorps monoclonal indiqué, soit de gauche à droite, anti-CD3, anti-CD16, anti-CD158 EB6, anti-CD158 GLi83, anti-CD158 PAX 250), sont reportées, en abscisse, les intensités de fluorescence et, en ordonnées, le nombre relatif de cellules.
is On peut observer que - les cellules NK R.P., D.F. et MAL. sont toutes CD3- et CD16+, - les cellules NK R.P, sont p50.1+, p50.2-, p50.3' : elles sont reconnues par l'anticorps monoclonal anti-CD158 EB6 et ne sont pas reconnues par les ao anticorps monoclonaux anti-CD158 GL183 et PAX250, - les cellules NK D.F. sont p50.1-, p50.2+, p50.3- : elles sont reconnues par l'anticorps monoclonal anti-CD 158 GL 183 et ne sont pas reconnues par les anticorps monoclonaux anti-CD158 EB6 et PAX250, - les cellules NK MAL. sont p50.1-, p50.2-, p50.3+ : elles sont 2s reconnues par l'anticorps monoclonal anti-CD158 PAX250 et ne sont pas reconnues par les anticorps monoclonaux anti-CD158 EB6 et GLI83.
Les trois patients atteints de LDGL ont donc présenté une lymphoprolifération de cellules NK reconnue par des anticorps anti-CD158 anti-KIR p58.1 (EB6), anti-KIR p58.2 (GL183) et anti-KAR p50.3 (PAX250) respectivement. Trois groupes de cellules NK ont ainsi pu être définis : cellules LDGL R.P., cellules LDGL D.F. et cellules LDGL MAL.
Test cvtolvtigue s Des essais de cytotoxicité re-dirigée utilisant P815 en tant que cellules cibles FcyR+ ont été réalisés pour les cellules NK R.P. p50.1+, D.F. p50.2+ et MAL. p50.3+.
Les résultats sont illustrés par la Figure 1 B où est présenté un test de io cytotoxicité re-dirigée avec différents anticorps monoclonaux : des cellules NK issues des donneur-s indiqués (R.P. p50.1+ à gauche, D.F. p50.2+ au centre, ou MAL. p50.3+ à droite) et cultivées sllr IL-2 ont été utilisées comme cellules effectrices. Le test a été réalisé en présence de : aucun anticorps (cercles blancs), anticorps monoclonal anti-CD 16 (triangles noirs), m anticorps monoclonal asti-CD56 (triangles blancs), anticorps monoclonal anti-CD158 (EB6 polir R.P., GL183 polo- D.F. et PAX250 pour MAL.) (cercles noirs). En abscisse sont reportés les ratios cellules effectrices cellules cibles (ratio E:T ; 8:1 ; 4:1 ; 2:1 ; 1:1 ; 0,5:1 ; 0,25:1 ) et, en ordonnées, le pourcentage de lyse spécifique. (échelle de 0 à 120%).
2o Les tests de cytotoxicité re-dirigée indiquent que, par constraste avec ce qui est observé lors d'une stimulation de récepteurs KIRS, l'addition d'anticorps anti-CD158 aux cellules NK augmente considérablement la cytolyse des cellules P815 (Figure 1B).
A titre de témoins, les anticorps monoclonaux anti-CD 16 augmentent zs la cytolyse spontanée des P815 de manière similaire aux anticorps monoclonaux anti-CD158, alors qu'un anticorps monoclonal anti-CD56 apparié à l'isotype n'a aucLUl effet (Figure 1 B).
Ces cellules NK expriment donc à leur surface des KARs, l'isoforme activatrice des KIRS. Ces résultats ont été, de plus, confirmés par analyses PCR (amplification en chaîne par polymérase) avec transcriptase inverse des ADNc KIR/KAR.
Anaivse des KARs exprimés par radio-induration et immunotransferts s identification des KARAPs Les récepteurs KARs exprimés sur les cellules NK issues de patients LDGL ont été analysés par radio-induration interne suivie d'immunoprécipitation.
io Les résultats sont illustrés par la figure 2A où est présentée une analyse SDS-PAGE, siu- gel à 13% en conditions dénahu-antes, réalisée à partir de cellules NK (10 x 106 cellules/piste) de donnera- R.P. (p50.1+) radiomarquées au '=SI et immunoprécipitées à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-CD158 EB6 (piste 1 }, puis purifiées à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-is CD3~/anti-FcERIy (pistes 2 à 7) et enfin re-immtmoprécipitées à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-CD158 EB6 (piste 8).
Les mêmes profils ont été obtenus avec les donneurs D.F. (p50.2+) et MAL. (p50.3+) (données non présentées).
On peut observer que les immunoprécipités d'anticorps anti-CD158 2o préparés à partir de lysats de cellules NK contiennent, en plus des KARs observés à ~SO kDa, une bande de masse moléculaire plus faible migrant à 12 ~ 1 kDa environ.
Il a été montré que les KIRS s'associent avec les polypeptides CD3~ et FCERIy dans les celh~les NK humaines. Les expériences de pré-épuisements 2s utilisant des anticorps anti-CD3~ et anti-FCERI~y ont éliminé la possibilité que la bande de 12 kDa environ associée au KARs soit CD3~ ou FCERI~y (Figure 2A).
WO 98/49292 3~ PCT/FR98/00883 L'ensemble protéique correspondant à cette bande à 12 ~ lkDa environ a été baptisé KARAPs (KAR-associated proteins, protéines associées aux KARs).
Ces résultats ont été confirmés par des expériences d'ilnmtulotransferts qui ont révélé l'absence de toute bande réactive en présence d'anticorps anti-CD3~ dans les immimoprécipités de mAbs anti-CD158 préparés à partir de lysats NK.
Ces résultats, obtenus en présence d'anticorps anti-CD3~, sont illustrés par la figure 2B où est présentée une analyse de lysats complets de cellules io D.F. ou d'immunoprécipités de tels iysats par résolution SDS-PAGE stu gel à
15% en conditions dénaturantes et incubation des filtres de nitrocellulose avec une sonde anticorps monoclonal asti-CD3~ (flèche de marquage à
droite). Les lysats complets de cellules (LCC) D.F. ont été déposés à 5 x 106 cellules/piste en piste l, les immunoprécipités de tels lysats à 15 x 106 u cellules/piste en pistes 2 à 4. Les immunoprécipitations ont été réalisées sur des lysats de cellules D.F. en utilisant l'anticorps monoclonal asti-FcERIa BC4 en témoin piste 2, l'anticorps monoclonal anti-CD16 en piste 3 et l'anticorps monoclonal anti-CD158 GL183 en piste 4.
Les mêmes résultats ont été obtenus pom- les cellules R.P. et MAL., à
Zo l'aide de mAb anti-CD3~.
Les résultats obtenus à l'aide de mAb asti-FC$RIy (données non présentées) ont apporté la même confirmation.
Analyse des KARAPs par test kinase in vitro et électrouhorèse sur Zs couche mince (TLE~
Les tests kinase i~ vitro réalisés sm les immunoprécipités d'anticorps monoclonaux asti-CD158 ont révélé que les KARs s'associent à une WO 98/49292 3~ PCT/FR98/00883 phosphoprotéine prédominante de faible poids moléculaire migrait à environ 14 ~ 1 kDa dans les cellules NK.
Les résultats sont illustrés par la figure 3A : des lysats préparés à partir de cellules NK MAL. ont été immunoprécipitées avec l'anticorps ilidiqué
s (anti-FcsRIa en piste 1, anti-CD16 en piste 2, anti-CD158 en piste 3) préalablement à des tests kinase in vitro. Les protéines phosphorylées ont été
séparées par SDS-PAGE sur Lm gel à 15% en conditions dénattuantes.
Ces résultats sont en accord avec le changement de masse moléculaire attendue pour la forme phosphorylée de la K:AR.A.P à 12 kDa observée par io iodllration interne. De plus, les immimoprécipités de mAbs anti-CD158 préparés à partir de cellules NK KAR+ comprennent deux autres phospho-KARAPs, migrant à 16 ~ 1 kDa et 12 ~ 1 kDa respectivement (signalés par un astéristique de part et d'autre de la flèche k;AR.AP à 14 kDa en Figiue 3A).
is L'association des KARs avec un groupe similaire de k:ARAPs phosphorylées a aussi été observée avec im panel de clones de cellules NK
KAR+ et était absente de clones NK KIR+. Il a été observé que l'intensité
relative des phospho-R:.ARAPs à 16,14 et 12 kDa peut varier selon l'origine des cellules NK.
Zo Une analyse des acides aminés phophorylés a révélé que Ia k:AR.AP
majeure à 14 kDa est principalement phosphorylée au niveau des résidus tyrosine .
Les résultats sont illustrés pas la figwe 3C : les bandes k:ARAPs (à
gauche) et CD3~ (à droite) ont été excisées après test kinase in vitro et zs soiunises à une analyse des acides aminés phophorylés par électrophorèse sur couche mince. Dans cette expérience, les bandes IS:.ARAPs et CD3~ ont été
isolées à partir d'immunoprécipités d'anticorps monoclonaux, respectivement, anti-CD158 et anti-CD16 préparés à partir de lysats de cellules NK. R.P.
WO 98/49292 3~ PCT/FR98/00883 Néanmoins, une phosphorylation au niveau de résidus sérine mais non au niveau de résidus thréonine peut aussi être détectée. A titre de témoin, l'analyse des acides aminés phophorylés a confirmé la phosphorylation de CD3~ au niveau du résidu tyrosine seulement.
s KARAPs et transduction du signal activateur (tranfectants KART
Par contraste avec les KIRs p~8.2, l'expression de KAR p50.2 dans les transfectants de Ia lignée cellulaire non lymphoïde RBL-2H3 ne conduit pas à
une reconstiW tion de la fonction activatrice des KARs p50.2. En effet, la io stimulation de tranfectants de cellules RBL-2H3 p~0.2+ induite par des anticorps anti-CD158 ne conduit à aucune mobilisation détectable du Ca2+
intracytoplasmique, ni à aucune libération détectable de sérotonine.
De manière remarquable, les tests kinase in vitro réalisés sur les immimoprécipités d'anticorps monoclonaux anti-CD158 préparés à partir de is transfectants de cellules RBL-2H3 p50.2+ n'ont inclus aucune I~:ARAP
détectable.
Les résultats sont illustrés par la figure 3B : des lysats préparés à partir de cellules RBL-2H3 p50.2+ ont été immunoprécipitées avec l'anticorps indiqué (anti-CD3E en piste 1, asti-FcERIa en piste 2, anti-CD158 en piste 3) 2o préalablement à des tests kinase i,z vitro. Les protéines phosphorylées ont été
séparées par SDS-PAGE sur tul gel à 15% en conditions dénaturantes.
Le défaut d'association des KARs aux K:AR.APs dans les transfectants de cellules RBL-2H3 p50.2+ a été également confirmé par induration interne (données non présentées).
2s Les I~:A.RAPs s'associent donc de manière sélective aux KARs, et l'absence d'association des KAR.s aux k:ARAPs est corrélée avec l'incapacité
des KA.Rs à transduire un quelconque signal activateur détectable.
Association KAR-KARAPs (gel diagonal) Finalement, une analyse siu- gel bidimensionnel diagonal des ilnmunoprécipités d'anticorps monoclonaux anti-CD158 a révélé que les phospho-KARAPs de 16, 14 et 12 kDa environ décroissent le long du gel diagonal.
s Les résultats sont illustrés par la fig<.lre 4 : des immimoprécipités (IP) d'anticorps monoclonaux anti-CD158 préparés à partir de lysats de cellules NK R.P. ont été soumis à un test kinase in vitro préalablement à analyse par SDS-PAGE si>r gel à 13% bidimensionnel en conditions non-dénattlrantes/(direction horizontale)/dénaW rames (direction verticale).
io Ces résultats indiquent ainsi que les KARs sont associés dans les cellules NK à un complexe de dimères K:.ARAPs liés par liaison disulfw-e.
3. Discussion Les KARs, réceptetus activateurs autonomes, notamment pour des is molécules du CMH de classe I, ou co-récepteurs du TCR (récepteur de lymphocyte T) ou de RFc (récepteur pour fragment constant d'immunoglobuline), représentent une voie nouvelle pour (activation des cellules NK et T.
Les inventeurs ont démontré que les KARs sont en fait assemblés dans 20 les cellules NK er. wl complexe multimérique faisant intervenir des k;ARAPs associées sous forme de dimères liés par liaison disulfure.
Si (analyse par radio-induration a mis en évidence une KARAP à
environ 12 ~ 1 kDa, l'analyse par test kinase a mis en évidence trois phospho-k;ARAPs à environ 16, 14 et 12 ~ 1 kDa.
2s La corrélation entre l'association des KARs aux K:ARAPs et la fonction activatrice des KARs suggère que les K:ARAPs agissent en tant que sous-mités transductrices du complexe KAR multimérique.
Cependant, l'absence d'association des KARs aux K;ARAPs, telle qu'observée pour les transfectants de cellules RBL-2H3, n'empêche pas WO 98/49292 3~ PCT/FR98/00883 l'expression du récepteur sur la sLU-face cellulaire, contrairement à ce qui a été
observé pom les récepteurs activateurs multirnériques pom antigènes ou anticorps incluent des polypeptides à ITAM (motif d'activation d'immunoréceptems basée sur résidus) tyrosine(s).
s D'autres récepteurs activateurs, ou à tout le moins non inhibiteurs, de la superfamille des immunoglobulines présentent de frappantes similarités avec les KARs p50 (KARs humains de type immunoglobuline) : les récepteurs KARs humains de type lectine NKG2C/D, les récepteurs KAR mtuins de type immtmoglobuline pir A, gp49A, les récepteurs KAR marins de type io lectine Ly49D, Ly49H, mais aussi les récepteurs activateurs humains de la famille LIIE~/IVIIR/IL,T tels que ILT 1.
Ces similarités sont illustrées par la figure 5 où sont présentés les récepteurs activateurs ou non-inhibiteurs de la superfamille des immunoglobulines (IgSF) ou du type lectine, et leurs contreparties is inhibitrices. En dessous du nom de chaque couple de récepteurs (de gauche à
droite, mPIR-B-mPIR-A, IhT2-ILT1, SIRPa-SIRPj3, KIR-KAR, Fc~RIIB-FcyRIII, NKG2A/B-NKG2C/D, mLy49A/B/C/E/F/G/I-mLy49D/H), sont indiquées les cellules les exprimant nattuellement. Les récepteurs activateurs ou non-inhibiteurs ne présentent ni ITIM (motif d'inhibition 2o d'immunorécepteur basée sur résidus) tyrosine) ni ITAM (motif d'activation d'immunorécepteur basée sur résidus) tyrosine) mais présentent un résidu acide aminé chargé dans leur domaine transmembranaire (TN17 (R = arginine, K= lysine, D=acide aspartique, E=acide glutamique). Les contreparties inhibitrices (élément gauche de chaque couple) comportent un motif ITIM
2s dans leur partie intracytoplasmique (IC). Chaque récepteur activateur, ou non-inhibiteur, présente, au niveau extracytoplasmique (EC), tme forte homologie avec sa contrepartie inhibitrice.
WO 98/49292 ~x PCT/FR98/00883 La caractérisation biochimique des molécules K:ARAPs (cf. exemple 1 ci-dessus) nous a permis de préciser les critères d'identification principaux des polypeptides KAR.A.P, et notamment s - polypeptides comportant un acide aminé cystéine extracytoplasmique, permettant la formation de ponts disulfilres (cf. Figure 4) - polypeptide de masse moléculaire apparente comprise entre 12 et 16 kDa environ, - polypeptides présentant au moins Lln acide-amüié tyrosine io phosphorylable (cf. Figme 3C).
Etant données les fortes similarités existant entre les molécules K:ARAPs identifiées à 12, 14 et 16 kDa, nous avons supposé que ces trois formes moléculaires représentaient des degrés de phosphorylation différents du même polypeptide KARAP, dont le poids moléculaire ne pouvait dépasser u 12 kDa.
De plus, une caractéristique majeure des KAR.APs réside dans leur association sélective avec les KARs, et non pas avec les KIRs. Etant donné
que, contrairement aux KIRs, les KAR possèdent un acide aminé chargé
transmembranaire (lysine : K), et que cette particularité est aussi à la base de zo l'association des polypeptides à ITAM Frésents dans les complexes CD3/TCR, BCR, FcgRI et FcyRIIIA (CD16), nous avons orienté notre stratégie d'identification du gène KARAP en considérant que K:AR.A.P est un nouveau membre de la famille des polypeptides transmembranaire à ITAM.
Ces derniers partagent en effet avec KARAP les mêmes caractéristiques Zs -polypeptides comportant un acide aminé cystéine extracytoplasmique (C), permettant la formation de ponts disulfures, - polypeptide de faible masse moléculaire ne dépassant pas 25 kDa, - polypeptides présentant au moins un acide aminé tyrosine phosphorylable comprise dans un motif ITAM: YxxL/Ix6_gYxxL/I, et WO 98/49292 3~~ PCT/FR98100883 - présence d'm acide aminé chargé transmembranaire Nous avons ainsi élaboré une stratégie bio-informatique d'identification d'un gène à partir des banques de cDNA publiques disponibles sous la forme . EST, GENBANK, SWISSPROT et EMBL. Nous avons utilisé 2 approches s différentes:
1/ Nous avons traduit selon les 6 phases de lect<ue l'ensemble des EST, en ne retenant que les peptides ayant entre 50 et 200 acides aminés (poids moléculaire envisagé compris entre 5,5 et 22 kDa). Siu~ cette sous-base, nous avons appliqué plusiem-s critères de sélection ~o - existence d'une région transmembranaire prédite d'au moins 10 acides aminés, commençant avant l'acide aminé 30, selon la méthode d'Argos (Rao & Argos, 1986, Biochem. Biophys. Acta, 869, 197-214). En effet, par homologie avec les polypeptides à ITAM tels que CD3~ et FcERIy, la majeLUe partie de la séquence KAR.AP est prédite comme étant is intracytoplasmique.
- recherche d'un motif ITAM (Y-x-x-[II,]-x(6,8)-Y-x-x[IL]) en position C-terminale de la zone transmembranaire.
- présence dans la région transmembranaire d'un acide aminé chargé
(R, K, D, E).
~o - présence d'un acide aminé cysteine (C) en position C-terminale de la zone transmembranaire.
2/ Recherche des entrées EST {analyse faite également avec EMBL, GENBANK et SWISSPROT) présentant des similarités de séquences avec l'entrée CD3Z ~tIJMAN. Le programme utilise est TBLASTN (version Zs 1.4.11; Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers, and David J. Lipman, 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-10) ou TBLASTN
(version 2Ø3; Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A.
Schàffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman, 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402). Sur ces entrées similaires, nous WO 98/49292 ~~ PCT/FR98/00883 avons ensuite appliqué les critères de sélection utilisés dans la première approche.
En combinant ces deux approches bio-informatiques et après avoir successivement déterminé à l'aide de profils d'hydrophobicité (programmes Genworks, DNA Strider) les régions leader, transmembranaires, infra- et extracytoplasmique des molécules candidates, nous avons obtenu un nombre important de séquences correspondant potentiellement à celle de KARAP.
Parmi ces séquences, la séquence correspondant au rnunéro d'accession AA24231 S siu- Genbank nous est appani comme la séquence du gène io K:AR.AP de la souris (SEQ )D n°1 ADNc souris C57BU6). La figure n°7 représente la séquence ADN (SEQ m n°1 ADNc) d'un polypeptide k~AkAP
selon l'invention ; cette séquence correspond à la séquence du gène k;.ARAP
de souris. En effet, la traduction de la séquence nucléotidique donne tm cadre de lecture ouvert de 396 nucléotides (SEQ ID n°2). Ce résultat est i~ illustré par la figure n°8 où est représentée la partie de séquence nucléotidique du gène k:ARAP (SEQ m n° 1 ) qui est comprise entre la séquence leader (exclue) et le codon stop, et où est également représentée, en-dessous de cette séquence nucléotidique, la séquence en acides aminés (code à 1 lettre) correspondante (SEQ ID n°2, code à 3 lettres), c'est-à-dire 20 la séquence en acides aminés de la protéine KARAP de souris matûre selon l'invention (SEQ ID n°2). L'analyse standard de cette séquence prévoit une protéine mature de 87 acides aminés (masse moléculaire de 9,6 kDa), une partie extracytoplasmique de 16 acides aminés (Q1-G16), une partie transmembranaire de 24 acides aminés (V17-G4p), et une partie Zs intracytoplasmique de 47 acides aminés (R41-Rg7). Conformément à notre stratégie de recherche, la partie extracytoplasmique comprend au moins un acide aminé cystéine (en fait deux, Cg et C 1 p), un acide aminé
transmembranaire (D25), et un ITAM intracytoplasmique (Y65QELQGQRHEVY76SDL). La figure 9 illustre les comparaisons qui WO 98149292 ~ 1 PCT/FR98l00883 peuvent être faites par aliyement de séquences entre les polypeptides à
ITAMs préalablement décrits et les poIypeptides selon l'invention possédant Lm (ou des) motifs ITAM, et indique la séquence ITAM consensus résultante la figure 9 représente l'alignement des ITAMs de polypeptides à ITAM (six s CD3, un Iga, un Ig(3, FcERIy et FcERI(3) et d'un motif ITAM du polypeptide K:ARAP marin (SEQ 117 n°2) identifié ci-dessus selon l'invention (indiqué
"k:AR.AP" sur cette figure 9). Sm cette base de comparaison avec les ITAMs préalablement décrits (Figwe 9), il nous a été permis d'envisager l'association des k:ARAP phosphorylées avec des protéine tyrosine kinases à groupement io SH2 en tandem (telles que ZAP-70 et p72Syk). L'association des KARAPs avec des protéines de fusion recombinantes correspondant aux groupements SH2 de ZAP-70 {préparation décrite dans: Olcese L., Lang P., Vély F., Cambiaggi A., Marguet D., Bléry M., Hippen K. L., Biassoni R., Moretta A., Moretta L., Cambier J. C., Vivier E. 1996, J. Immunol. 156:4531-4534), a is été vérifié in vitro: ces expériences ont été réalisées comme décrit dans la Figure 3A, piste 3, mais les lysats cellulaires ont été adsorbés par la protéine de fusion recombinante correspondant aux groupements SH2 de ZAP-70, au lieu de (anticorps anti-CD158. Ainsi K:AR.AP est une nouvelle molécule transmembranaire à ITAM qui s'associe aux KAR et qui, sous une forme 2o tyrosine phosphorylée, s'associe à ZAP-70. KARAP est donc un nouvel élément de transduction des lymphocytes T et NK. Il est possible que k;ARAP ou des analogues de KARAP s'associent aussi aux isoformes activatrices des récepteurs à ITIM, et servent dans ces complexes multimoléculaires de sous-unité de transduction des signaux émis lors de 2s (engagement du récepteur.
Une méthode particulièrement appropriée pour déterminer ou contrôler qu'un polypeptide candidat, dont on connaît la séquence, correspond à une protéine K:A.R.A.P selon l'invention consiste à produire un anticorps contre une partie caractéristique de ce polypeptide candidat {par exemple une ré~~ion WO 98/49292 ~Z PCT/FR98/00883 intracytoplasmique comprenmt au moins un motif ITAM ou une région extracvtoplasmique), et à vérifier que cet anticorps reconnaît, sur tme cellule fonctionnelle, une cellule KAR+ fonctionnelle par exemple, tme cible qtti se trouve associée au récepteur- pote lequel le polypeptide candidat est supposé
s être le KARAP (c'est-à-dire, dans le cas de cellules KAR+, à vérifier que l'anticorps reconnaît ttne cible qui se trouve associée à ttn récepteur KAR).
Cette méthode d'identification de polypeptides IC:_AR.AP selon l'invention consiste ainsi notamment à
- produire un anticorps mono- ou polyclonal dirigé contre ce io polypeptide candidat, et en particulier contre tlne région de ce polypeptide candidat qui comprend au moins ttn motif ITAM (par exemple, dans le cas de Ia protéine K:AR.AP marine identifiée ci-dessus, un anticorps dirigé contre ttne région de Ia partie extracytoplasmique (SEQ ID n°3) ou de la partie intracytoplasmique (SEQ m n°5) de la SEQ 117 n°2), is - mettre en contact cet anticorps avec un lysat de cellules, possédant, sous une forme fonctionnelle, le récepteur activateur ou non inhibiteur pour lequel le polypeptide candidat est supposé constituer le k;.ARAP, par exemple des cellules KAR+ fonctionnelles telles que des cellules NK ou T, dans des conditions douces permettant des réactions de liaison de type antigène-2o anticorps, - identifier le polypeptide candidat comme étant un polypeptide k:AR.AP selon l'invention lorsque dans les produits de réaction éventuellement formés se trouvent un produit de masse moléculaire apparente proche de celle d'un KAR (environ 50 kDa) et un produit de masse zs moléculaire apparente proche de celle du polypeptide candidat notamment entre 1 C et 16 kDa environ).
Cette méthode d'identification selon l'invention peut notamment être réalisée - en mettant en contact ledit anticorps comme ci-dessus décrit, WO 98/49292 ~3 PCT/FR98/00883 - faire précipiter les produits de réaction éventa ellement formés dans des conditions douces de détergent préservant les complexes moléculaires (par exemple digitonine à 1 %, voir exemple 1 ci-dessus), - mesurer la masse moléculaire des produits précipités, par exemple s par migration électrophorétique en présence des marqueurs de masse moléculaire sur un gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes, et - en identifiant le polypeptide candidat comme étant un polypeptide K:ARA1P selon l'invention comme ci-dessus décrit.
io EXEMPLE 3 1° Identification de plusieurs EST correspondant à KARA,P.
Notre stratégie de clonage de KA.RAP menin par bio-informatique, is telle que présentée dans l'exemple 2 ci-dessus, révèle également l'existence de 5 EST (Expressed Tag Sequences) qtù correspondent à notre définition de KAR.AP. Il s'agit des EST AA242315, AA734769, W88I59, AA098506 et W41142. Les figures l0A à 14A illustrent les séquences ADNc, respectivement, des EST AA242315, AA734769, W88159, respectivement, ao AA098506 et W41142 (SEQ ID n°6 à SEQ ID n° 10 respectivement). Les figures 10B à 14B illustrent les séquences protéiques correspondant, respectivement, à ces EST (SEQ )D n° I I à SEQ m n° 15 pour les protéines des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41142 respectivement). Tous ces EST ont été obtenus à partir de tissus provenant de 2s souris C57B1/6 et ont été alignés afin permis d'obtenir une séquence cDNA
correspondant à zen cadre de lecture ouvert. Ceci est illustré par la figure qui représente l'alignement des séquences des EST AA098506 (SEQ )D
n°9), AA242315 (SEQ ID n°6), W88159 (SEQ ID n°8), AA734769 (SEQ
)D n°7) WO 98/49292 ~~ PCT/FR98/00883 et W41142 (SEQ ID n° 10), et qui présente la séquence consensus résultante (ADNc K:.ARAP marin consensus ; SEQ ID n°16).
Ceci est également illustré par la figure 16 qui représente l'alignement des séquences protéiques des EST AA242315 (SEQ ID n°11), W88I59 (SEQ ID
n°13), W41142 (SEQ ID n°15), AA098506 (SEQ >D n°14) et (SEQ 1D n°12), et qui représente la séquence consensus résultante (protéine k:ARAP menine consensus, SEQ )D n°17). Sen ces figures 15 et 16, le symbole "." indique ime identité avec Ia séquence consensus considérée, le symbole "-" indique l'absence de données de séquençage.
io 2° Séquence génomique de KARAP marin Une librairie (phage lambda, EMBL3) de DNA génomique isolée à partir de souris de Ia lignée de souris 129 a été criblée avec le cDNA correspondant à
la séquence de l'EST AA734769 selon une technique classique. Un phage is contenant un fragment de 18 kb a été identifié comme positif. Une cartographie de ce phage par coupure avec une série d'enzyme de restrictions a été effecriiée et un fragment EcoRI-EcoRI de 9kb obtenu à partir du phage a été cloné dans le vecteur de clonage pBlue-Script et contient l'intégralité
du gène K;ARAP marin (de l'ATG initial à la séquence STOP). La séquence de 2o ce gène KARAP marin est présentée ~n figure 17 (SEQ ID n°18 ; 2838 pb).
De plus, des amorces oligonucléotides ont été générées afin d'obtenir l'organisation génomique de K:AR.AP marin. Les amorces utilisées sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous (SEQ m n°19 à SEQ m n°26) ~' M '*
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WO 98/49292 ,~~~ PCT/FR98/00883 L'orga~~isation génomique du K:A.RA.P marin est présentée en figure 18.
Nous avons aussi obtenu à partir de ces données, la séquence cDNA et donc protéique de K:ARAP de souris de la lignée 129. Cette séquence cDNA {SEQ
ID n°27) et cette séquence protéique {SEQ ID n°28) sont présentées en figure 19.
La séquence protéique ainsi traduite est:
MGALEPSWCLLFLPVLLTVLGLSPVQA Séquence signal QSDTFPI~DCSSVPG Domaine extracytoplasmique VLAGIVLGDLVLTLLIALAYSLG Domaine transmembranaire RLVSPGQEF~'RKQHIAETESPYQELQGQRPEVYSDLNTQRQYYR Domaine intracytoplasmique L'ensembie de ces résultats de cartographie génomique montrent que le gène K:ARAP marin (de l'ATG initial à la séquence STOP) est long de 2,9 kb is environ, et comprend 5 exons. Ces résultats sont illustrés par la figure 20 où
sont représentés, de haut en bas, l'ADN génomique du KARAP marin de la souris 129 (en noir : exon traduit ; en hachures horizontales : exon non traduit, en blanc : intron), la séquence protéique correspondante (SEQ ID
n°28 de l'exon n°1 à l'exon n°5), et la nahue (SS =
Séquence signal, EC =
2o domaine extracytoplasmique ; TM = domaine transmembranaire ; IC =
domaine intracytoplasmique) des différentes régions de cette protéine. L'exon 1 code pour une portion N-terminale de la séquence signal, l'exon 2 code pour le reste de la séquence signal et les trois premiers acides-aminés de la partie extracytoplasmique, l'exon 3 code pour le reste de la partie Zs extracytoplasmique, la partie transmembranaire et les 9 premiers acides-aminés de la partie intracytoplasmique, l'exon 4 code pour 14 acides-aminés de la partie intracytoplasmique et l'exon 5 code pow- le reste de la protéine.
Comme attendu de l'organisation génomique d'un polypeptide à ITAM
comme KARAP, l'ITAM est codé par deux exons (exon 4 et 5) séparés par 3u un intron de type 0.
WO 98/49292 ~~ PCT/FR98/00883 3° Reconstitution fonctionnelle d'un KAR (p50.2) exprimé dans les RBL-2H3 par le hARAP humain DAP-12.
Nous avons obtenu le cDNA codant pour KAR.AP lnunain par RT-PCR en s générant des amorces oligonucléotides déduite de la séquence de k:ARAP
marin. Les amorces utilisées sont présentées dans le tableau 2 ci-dessous (SEQ ID n°29 et n°30) io is U
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o -j z FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO 98/49292 ~~ PCT/FR98/00883 La séquence de l'ADNc obtenu est présentée en figi.~re 21 (SEQ ID
n°31 ;
ADNc du K:ARAP h mnain). De l'ARN extrait à partir de clones NK humains KA.R+ a servi de base à la génération de ce cDNA. Ce cDNA a été cloné
dans le vecteur d'expression eucaryote pNT-neo et des transfectants stables s pour ce KAR.AP h mnain ont été générés dans le transfectant KAR+ (pS0.2) de la lignée cellulaire RBL-2H3 (Bléry et al, J. Biol. Chem., 1997). La capacité des récepteLUS KAR exprimés sir les cellules RBL-2H3 ainsi doublement transfectées p50.2+ et K:ARAP+, à transduire un signal activateur a été testée par stimulation à l'aide d'anticorps dirigés contre la partie io extracytoplasmique de pS0.2 et en suivant le relargage de sérotonine tritiée.
Le protocole suivi pour cette expérience de relargage de sérotonine tritiée est le suivant Ces cellules sont décollées, centrifugées et resupendues dans du RPNII-10% SVF à une concentration finale de 1x106 cellules par ml. Les is cellules sont alors incubées avec 2~Ci de serotonine marquée au tritium par ml de cellules pendant 1 heure. Les cellules sont lavées puis remises dans du milieu pote 1 heure à 37°C afin qu'elles relarguent la sérotonine excédentaire de leurs stocks. Les cellules sont ensuite réparties dans des plaques à 96 puits (200000 cellules par puits) avec de l'IgE de sowis (2682-I) ou un Ac anti-2o pS0 (GL183). Les cellules adhèrent pendant 1 heure puis sont lavées. Elles sont remises à 37°C 15 minutes puis stimulées avec du F{ab')2 GAM
(SOpg/ml). Les cellules sont laissées 30 minutes à 37°C pour leur permettre de libérer leur sérotonine. La réaction est términée en ajouttant du HBSS
froid et en mettant les cellules sur la glace. La moitié du surnageant de as chaque puits est alors récupéré et mis dans 1 ml de liquide de scintillation. Les 100% de dégranulation sont obtenus a partir du même vohune de lysat obtenu à partir de cellules chargées en sérotonine et non stimulées. Les échantillons sont alors comptés sur un compteur Li.
WO 98/49292 ~~~ PCT/FR98/00883 Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 22 qui présente le % de sérotonine reiarguée dans le surnageant, par les cellules RBL-2H3 doublement transfectées p~O/KAR_AP humain et stimulées par l'anticorps indiqué en abscisse, (à gauche : aucun anticorps ; au centre IgE de souris s mIgE 1/500 ; à droite : GL183 ~~ug/ml). Comme üidiqué sur cette Figure 22, alors que l'engagement de KAR dans RBL-2H3 par un anticorps réagissant avec la partie extracytoplasmique de KAR (l'anticorps monoclonal GL183) ne se traduit pas par l'activation des cellules, l'engagement de KAR par GL183 dans les doubles transfectaüts RBL-2H3 exprimant à la fois KAR et K:ARAP
io hlunains, se traduit par l'activation cellulaire (objectivée ici par la libération de sérotonine à partir des cellules). Ceci est donc la preuve formelle que la séquence KARAP h mnaine identifiée reconstiW e la fonctionnalité des KAR.
La figm-e 23 illustre l'homologie entre l'organisation du gène K:AR.AP
hmnain et celle du gène k:AKAP marin (El à ES : exon 1 à exon 5 ; I1 à I4 is intron 1 à intron 4). La numérotation des paires de bases du gène k:ARAP
h iunain et de souris y est indiquée.
séchés et remis en suspension dans 5 ~l de tampon TLE (voir réactifs) contenant 5 pg de chaque phosphotyrosine, phosphothréonine, phosphosérine non marquée (Sigma) en tant qu'étalons standards. Les échantillons ont été
déposés sir des plaques de cellulose (DC-cellulose 100-gym) et mis à migrer à
1500 V pendant 45 minutes à 4°C siu un Multiphor II (Phaimacia). Des étalons standards ont été développés à l'aide de ninhydrine à 1 % dans de io l'acétone et les acides aminés marqués au 32P ont été identifiés par autoradiographie.
Analyse uar immunotransfert Les immunoprécipités ont été résolus par SDS-PAGE, transférés sur is filtres de nitrocellulose et confrontés aux sondes anticorps anti-CD3~ ou anti FCERIy diluées dans une solution de PBS à 5% en lait déshydraté écrémé.
Les immunotransferts ont été révélés en utilisant un antisérum de chèvre anti souris ou anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (Sigma références A
2304 et A-0545 respectivement) et le système de détection ECL
2o commercialisé par Amersham (RPN 2209).
2. Résultats Phénotvoe de surface 2s Le phénotype de surface des cellules NK issues de patients LDGL et cultivées sur IL-2 (interleukine-2) a été analysé par FACScan (tri de cellules activées par fluorescence) en immunofluorescence indirecte.
Sont ci-après reportés les résultats de l' étude relative à trois de ces patients, ci-après nommés R.P., D.F. et MAL.
WO 98/49292 3~ PCT/FR98/00883 Lesdits résultats sont illustrés par la Figure 1 A où est présentée ime analyse par FACScan en immunofluorescence indirecte de cellules LDGL
(maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires) R.P., D.F. ou MAL. cultivées sur IL-2. Une immunoglobuline de chèvre anti-som-is _ conjuguée à de l'isothiocyanate de fluoresceine a servi de réactif de seconde étape. Pour chaque type de cellules LDGL (cellules LDGL R.P. pour les analyses présentées dans la bande horizontale supérieure, cellules LDGL
D.F. poLU celles de la bande horizontale médiane, cellules LDGL MAL. pour celles de la bande horizontale inférieure) et pour chaque traitement subi io (traitement témoin C poiu- les graphes présentés à gauche ou traitement par l'anticorps monoclonal indiqué, soit de gauche à droite, anti-CD3, anti-CD16, anti-CD158 EB6, anti-CD158 GLi83, anti-CD158 PAX 250), sont reportées, en abscisse, les intensités de fluorescence et, en ordonnées, le nombre relatif de cellules.
is On peut observer que - les cellules NK R.P., D.F. et MAL. sont toutes CD3- et CD16+, - les cellules NK R.P, sont p50.1+, p50.2-, p50.3' : elles sont reconnues par l'anticorps monoclonal anti-CD158 EB6 et ne sont pas reconnues par les ao anticorps monoclonaux anti-CD158 GL183 et PAX250, - les cellules NK D.F. sont p50.1-, p50.2+, p50.3- : elles sont reconnues par l'anticorps monoclonal anti-CD 158 GL 183 et ne sont pas reconnues par les anticorps monoclonaux anti-CD158 EB6 et PAX250, - les cellules NK MAL. sont p50.1-, p50.2-, p50.3+ : elles sont 2s reconnues par l'anticorps monoclonal anti-CD158 PAX250 et ne sont pas reconnues par les anticorps monoclonaux anti-CD158 EB6 et GLI83.
Les trois patients atteints de LDGL ont donc présenté une lymphoprolifération de cellules NK reconnue par des anticorps anti-CD158 anti-KIR p58.1 (EB6), anti-KIR p58.2 (GL183) et anti-KAR p50.3 (PAX250) respectivement. Trois groupes de cellules NK ont ainsi pu être définis : cellules LDGL R.P., cellules LDGL D.F. et cellules LDGL MAL.
Test cvtolvtigue s Des essais de cytotoxicité re-dirigée utilisant P815 en tant que cellules cibles FcyR+ ont été réalisés pour les cellules NK R.P. p50.1+, D.F. p50.2+ et MAL. p50.3+.
Les résultats sont illustrés par la Figure 1 B où est présenté un test de io cytotoxicité re-dirigée avec différents anticorps monoclonaux : des cellules NK issues des donneur-s indiqués (R.P. p50.1+ à gauche, D.F. p50.2+ au centre, ou MAL. p50.3+ à droite) et cultivées sllr IL-2 ont été utilisées comme cellules effectrices. Le test a été réalisé en présence de : aucun anticorps (cercles blancs), anticorps monoclonal anti-CD 16 (triangles noirs), m anticorps monoclonal asti-CD56 (triangles blancs), anticorps monoclonal anti-CD158 (EB6 polir R.P., GL183 polo- D.F. et PAX250 pour MAL.) (cercles noirs). En abscisse sont reportés les ratios cellules effectrices cellules cibles (ratio E:T ; 8:1 ; 4:1 ; 2:1 ; 1:1 ; 0,5:1 ; 0,25:1 ) et, en ordonnées, le pourcentage de lyse spécifique. (échelle de 0 à 120%).
2o Les tests de cytotoxicité re-dirigée indiquent que, par constraste avec ce qui est observé lors d'une stimulation de récepteurs KIRS, l'addition d'anticorps anti-CD158 aux cellules NK augmente considérablement la cytolyse des cellules P815 (Figure 1B).
A titre de témoins, les anticorps monoclonaux anti-CD 16 augmentent zs la cytolyse spontanée des P815 de manière similaire aux anticorps monoclonaux anti-CD158, alors qu'un anticorps monoclonal anti-CD56 apparié à l'isotype n'a aucLUl effet (Figure 1 B).
Ces cellules NK expriment donc à leur surface des KARs, l'isoforme activatrice des KIRS. Ces résultats ont été, de plus, confirmés par analyses PCR (amplification en chaîne par polymérase) avec transcriptase inverse des ADNc KIR/KAR.
Anaivse des KARs exprimés par radio-induration et immunotransferts s identification des KARAPs Les récepteurs KARs exprimés sur les cellules NK issues de patients LDGL ont été analysés par radio-induration interne suivie d'immunoprécipitation.
io Les résultats sont illustrés par la figure 2A où est présentée une analyse SDS-PAGE, siu- gel à 13% en conditions dénahu-antes, réalisée à partir de cellules NK (10 x 106 cellules/piste) de donnera- R.P. (p50.1+) radiomarquées au '=SI et immunoprécipitées à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-CD158 EB6 (piste 1 }, puis purifiées à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-is CD3~/anti-FcERIy (pistes 2 à 7) et enfin re-immtmoprécipitées à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-CD158 EB6 (piste 8).
Les mêmes profils ont été obtenus avec les donneurs D.F. (p50.2+) et MAL. (p50.3+) (données non présentées).
On peut observer que les immunoprécipités d'anticorps anti-CD158 2o préparés à partir de lysats de cellules NK contiennent, en plus des KARs observés à ~SO kDa, une bande de masse moléculaire plus faible migrant à 12 ~ 1 kDa environ.
Il a été montré que les KIRS s'associent avec les polypeptides CD3~ et FCERIy dans les celh~les NK humaines. Les expériences de pré-épuisements 2s utilisant des anticorps anti-CD3~ et anti-FCERI~y ont éliminé la possibilité que la bande de 12 kDa environ associée au KARs soit CD3~ ou FCERI~y (Figure 2A).
WO 98/49292 3~ PCT/FR98/00883 L'ensemble protéique correspondant à cette bande à 12 ~ lkDa environ a été baptisé KARAPs (KAR-associated proteins, protéines associées aux KARs).
Ces résultats ont été confirmés par des expériences d'ilnmtulotransferts qui ont révélé l'absence de toute bande réactive en présence d'anticorps anti-CD3~ dans les immimoprécipités de mAbs anti-CD158 préparés à partir de lysats NK.
Ces résultats, obtenus en présence d'anticorps anti-CD3~, sont illustrés par la figure 2B où est présentée une analyse de lysats complets de cellules io D.F. ou d'immunoprécipités de tels iysats par résolution SDS-PAGE stu gel à
15% en conditions dénaturantes et incubation des filtres de nitrocellulose avec une sonde anticorps monoclonal asti-CD3~ (flèche de marquage à
droite). Les lysats complets de cellules (LCC) D.F. ont été déposés à 5 x 106 cellules/piste en piste l, les immunoprécipités de tels lysats à 15 x 106 u cellules/piste en pistes 2 à 4. Les immunoprécipitations ont été réalisées sur des lysats de cellules D.F. en utilisant l'anticorps monoclonal asti-FcERIa BC4 en témoin piste 2, l'anticorps monoclonal anti-CD16 en piste 3 et l'anticorps monoclonal anti-CD158 GL183 en piste 4.
Les mêmes résultats ont été obtenus pom- les cellules R.P. et MAL., à
Zo l'aide de mAb anti-CD3~.
Les résultats obtenus à l'aide de mAb asti-FC$RIy (données non présentées) ont apporté la même confirmation.
Analyse des KARAPs par test kinase in vitro et électrouhorèse sur Zs couche mince (TLE~
Les tests kinase i~ vitro réalisés sm les immunoprécipités d'anticorps monoclonaux asti-CD158 ont révélé que les KARs s'associent à une WO 98/49292 3~ PCT/FR98/00883 phosphoprotéine prédominante de faible poids moléculaire migrait à environ 14 ~ 1 kDa dans les cellules NK.
Les résultats sont illustrés par la figure 3A : des lysats préparés à partir de cellules NK MAL. ont été immunoprécipitées avec l'anticorps ilidiqué
s (anti-FcsRIa en piste 1, anti-CD16 en piste 2, anti-CD158 en piste 3) préalablement à des tests kinase in vitro. Les protéines phosphorylées ont été
séparées par SDS-PAGE sur Lm gel à 15% en conditions dénattuantes.
Ces résultats sont en accord avec le changement de masse moléculaire attendue pour la forme phosphorylée de la K:AR.A.P à 12 kDa observée par io iodllration interne. De plus, les immimoprécipités de mAbs anti-CD158 préparés à partir de cellules NK KAR+ comprennent deux autres phospho-KARAPs, migrant à 16 ~ 1 kDa et 12 ~ 1 kDa respectivement (signalés par un astéristique de part et d'autre de la flèche k;AR.AP à 14 kDa en Figiue 3A).
is L'association des KARs avec un groupe similaire de k:ARAPs phosphorylées a aussi été observée avec im panel de clones de cellules NK
KAR+ et était absente de clones NK KIR+. Il a été observé que l'intensité
relative des phospho-R:.ARAPs à 16,14 et 12 kDa peut varier selon l'origine des cellules NK.
Zo Une analyse des acides aminés phophorylés a révélé que Ia k:AR.AP
majeure à 14 kDa est principalement phosphorylée au niveau des résidus tyrosine .
Les résultats sont illustrés pas la figwe 3C : les bandes k:ARAPs (à
gauche) et CD3~ (à droite) ont été excisées après test kinase in vitro et zs soiunises à une analyse des acides aminés phophorylés par électrophorèse sur couche mince. Dans cette expérience, les bandes IS:.ARAPs et CD3~ ont été
isolées à partir d'immunoprécipités d'anticorps monoclonaux, respectivement, anti-CD158 et anti-CD16 préparés à partir de lysats de cellules NK. R.P.
WO 98/49292 3~ PCT/FR98/00883 Néanmoins, une phosphorylation au niveau de résidus sérine mais non au niveau de résidus thréonine peut aussi être détectée. A titre de témoin, l'analyse des acides aminés phophorylés a confirmé la phosphorylation de CD3~ au niveau du résidu tyrosine seulement.
s KARAPs et transduction du signal activateur (tranfectants KART
Par contraste avec les KIRs p~8.2, l'expression de KAR p50.2 dans les transfectants de Ia lignée cellulaire non lymphoïde RBL-2H3 ne conduit pas à
une reconstiW tion de la fonction activatrice des KARs p50.2. En effet, la io stimulation de tranfectants de cellules RBL-2H3 p~0.2+ induite par des anticorps anti-CD158 ne conduit à aucune mobilisation détectable du Ca2+
intracytoplasmique, ni à aucune libération détectable de sérotonine.
De manière remarquable, les tests kinase in vitro réalisés sur les immimoprécipités d'anticorps monoclonaux anti-CD158 préparés à partir de is transfectants de cellules RBL-2H3 p50.2+ n'ont inclus aucune I~:ARAP
détectable.
Les résultats sont illustrés par la figure 3B : des lysats préparés à partir de cellules RBL-2H3 p50.2+ ont été immunoprécipitées avec l'anticorps indiqué (anti-CD3E en piste 1, asti-FcERIa en piste 2, anti-CD158 en piste 3) 2o préalablement à des tests kinase i,z vitro. Les protéines phosphorylées ont été
séparées par SDS-PAGE sur tul gel à 15% en conditions dénaturantes.
Le défaut d'association des KARs aux K:AR.APs dans les transfectants de cellules RBL-2H3 p50.2+ a été également confirmé par induration interne (données non présentées).
2s Les I~:A.RAPs s'associent donc de manière sélective aux KARs, et l'absence d'association des KAR.s aux k:ARAPs est corrélée avec l'incapacité
des KA.Rs à transduire un quelconque signal activateur détectable.
Association KAR-KARAPs (gel diagonal) Finalement, une analyse siu- gel bidimensionnel diagonal des ilnmunoprécipités d'anticorps monoclonaux anti-CD158 a révélé que les phospho-KARAPs de 16, 14 et 12 kDa environ décroissent le long du gel diagonal.
s Les résultats sont illustrés par la fig<.lre 4 : des immimoprécipités (IP) d'anticorps monoclonaux anti-CD158 préparés à partir de lysats de cellules NK R.P. ont été soumis à un test kinase in vitro préalablement à analyse par SDS-PAGE si>r gel à 13% bidimensionnel en conditions non-dénattlrantes/(direction horizontale)/dénaW rames (direction verticale).
io Ces résultats indiquent ainsi que les KARs sont associés dans les cellules NK à un complexe de dimères K:.ARAPs liés par liaison disulfw-e.
3. Discussion Les KARs, réceptetus activateurs autonomes, notamment pour des is molécules du CMH de classe I, ou co-récepteurs du TCR (récepteur de lymphocyte T) ou de RFc (récepteur pour fragment constant d'immunoglobuline), représentent une voie nouvelle pour (activation des cellules NK et T.
Les inventeurs ont démontré que les KARs sont en fait assemblés dans 20 les cellules NK er. wl complexe multimérique faisant intervenir des k;ARAPs associées sous forme de dimères liés par liaison disulfure.
Si (analyse par radio-induration a mis en évidence une KARAP à
environ 12 ~ 1 kDa, l'analyse par test kinase a mis en évidence trois phospho-k;ARAPs à environ 16, 14 et 12 ~ 1 kDa.
2s La corrélation entre l'association des KARs aux K:ARAPs et la fonction activatrice des KARs suggère que les K:ARAPs agissent en tant que sous-mités transductrices du complexe KAR multimérique.
Cependant, l'absence d'association des KARs aux K;ARAPs, telle qu'observée pour les transfectants de cellules RBL-2H3, n'empêche pas WO 98/49292 3~ PCT/FR98/00883 l'expression du récepteur sur la sLU-face cellulaire, contrairement à ce qui a été
observé pom les récepteurs activateurs multirnériques pom antigènes ou anticorps incluent des polypeptides à ITAM (motif d'activation d'immunoréceptems basée sur résidus) tyrosine(s).
s D'autres récepteurs activateurs, ou à tout le moins non inhibiteurs, de la superfamille des immunoglobulines présentent de frappantes similarités avec les KARs p50 (KARs humains de type immunoglobuline) : les récepteurs KARs humains de type lectine NKG2C/D, les récepteurs KAR mtuins de type immtmoglobuline pir A, gp49A, les récepteurs KAR marins de type io lectine Ly49D, Ly49H, mais aussi les récepteurs activateurs humains de la famille LIIE~/IVIIR/IL,T tels que ILT 1.
Ces similarités sont illustrées par la figure 5 où sont présentés les récepteurs activateurs ou non-inhibiteurs de la superfamille des immunoglobulines (IgSF) ou du type lectine, et leurs contreparties is inhibitrices. En dessous du nom de chaque couple de récepteurs (de gauche à
droite, mPIR-B-mPIR-A, IhT2-ILT1, SIRPa-SIRPj3, KIR-KAR, Fc~RIIB-FcyRIII, NKG2A/B-NKG2C/D, mLy49A/B/C/E/F/G/I-mLy49D/H), sont indiquées les cellules les exprimant nattuellement. Les récepteurs activateurs ou non-inhibiteurs ne présentent ni ITIM (motif d'inhibition 2o d'immunorécepteur basée sur résidus) tyrosine) ni ITAM (motif d'activation d'immunorécepteur basée sur résidus) tyrosine) mais présentent un résidu acide aminé chargé dans leur domaine transmembranaire (TN17 (R = arginine, K= lysine, D=acide aspartique, E=acide glutamique). Les contreparties inhibitrices (élément gauche de chaque couple) comportent un motif ITIM
2s dans leur partie intracytoplasmique (IC). Chaque récepteur activateur, ou non-inhibiteur, présente, au niveau extracytoplasmique (EC), tme forte homologie avec sa contrepartie inhibitrice.
WO 98/49292 ~x PCT/FR98/00883 La caractérisation biochimique des molécules K:ARAPs (cf. exemple 1 ci-dessus) nous a permis de préciser les critères d'identification principaux des polypeptides KAR.A.P, et notamment s - polypeptides comportant un acide aminé cystéine extracytoplasmique, permettant la formation de ponts disulfilres (cf. Figure 4) - polypeptide de masse moléculaire apparente comprise entre 12 et 16 kDa environ, - polypeptides présentant au moins Lln acide-amüié tyrosine io phosphorylable (cf. Figme 3C).
Etant données les fortes similarités existant entre les molécules K:ARAPs identifiées à 12, 14 et 16 kDa, nous avons supposé que ces trois formes moléculaires représentaient des degrés de phosphorylation différents du même polypeptide KARAP, dont le poids moléculaire ne pouvait dépasser u 12 kDa.
De plus, une caractéristique majeure des KAR.APs réside dans leur association sélective avec les KARs, et non pas avec les KIRs. Etant donné
que, contrairement aux KIRs, les KAR possèdent un acide aminé chargé
transmembranaire (lysine : K), et que cette particularité est aussi à la base de zo l'association des polypeptides à ITAM Frésents dans les complexes CD3/TCR, BCR, FcgRI et FcyRIIIA (CD16), nous avons orienté notre stratégie d'identification du gène KARAP en considérant que K:AR.A.P est un nouveau membre de la famille des polypeptides transmembranaire à ITAM.
Ces derniers partagent en effet avec KARAP les mêmes caractéristiques Zs -polypeptides comportant un acide aminé cystéine extracytoplasmique (C), permettant la formation de ponts disulfures, - polypeptide de faible masse moléculaire ne dépassant pas 25 kDa, - polypeptides présentant au moins un acide aminé tyrosine phosphorylable comprise dans un motif ITAM: YxxL/Ix6_gYxxL/I, et WO 98/49292 3~~ PCT/FR98100883 - présence d'm acide aminé chargé transmembranaire Nous avons ainsi élaboré une stratégie bio-informatique d'identification d'un gène à partir des banques de cDNA publiques disponibles sous la forme . EST, GENBANK, SWISSPROT et EMBL. Nous avons utilisé 2 approches s différentes:
1/ Nous avons traduit selon les 6 phases de lect<ue l'ensemble des EST, en ne retenant que les peptides ayant entre 50 et 200 acides aminés (poids moléculaire envisagé compris entre 5,5 et 22 kDa). Siu~ cette sous-base, nous avons appliqué plusiem-s critères de sélection ~o - existence d'une région transmembranaire prédite d'au moins 10 acides aminés, commençant avant l'acide aminé 30, selon la méthode d'Argos (Rao & Argos, 1986, Biochem. Biophys. Acta, 869, 197-214). En effet, par homologie avec les polypeptides à ITAM tels que CD3~ et FcERIy, la majeLUe partie de la séquence KAR.AP est prédite comme étant is intracytoplasmique.
- recherche d'un motif ITAM (Y-x-x-[II,]-x(6,8)-Y-x-x[IL]) en position C-terminale de la zone transmembranaire.
- présence dans la région transmembranaire d'un acide aminé chargé
(R, K, D, E).
~o - présence d'un acide aminé cysteine (C) en position C-terminale de la zone transmembranaire.
2/ Recherche des entrées EST {analyse faite également avec EMBL, GENBANK et SWISSPROT) présentant des similarités de séquences avec l'entrée CD3Z ~tIJMAN. Le programme utilise est TBLASTN (version Zs 1.4.11; Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers, and David J. Lipman, 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-10) ou TBLASTN
(version 2Ø3; Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A.
Schàffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman, 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402). Sur ces entrées similaires, nous WO 98/49292 ~~ PCT/FR98/00883 avons ensuite appliqué les critères de sélection utilisés dans la première approche.
En combinant ces deux approches bio-informatiques et après avoir successivement déterminé à l'aide de profils d'hydrophobicité (programmes Genworks, DNA Strider) les régions leader, transmembranaires, infra- et extracytoplasmique des molécules candidates, nous avons obtenu un nombre important de séquences correspondant potentiellement à celle de KARAP.
Parmi ces séquences, la séquence correspondant au rnunéro d'accession AA24231 S siu- Genbank nous est appani comme la séquence du gène io K:AR.AP de la souris (SEQ )D n°1 ADNc souris C57BU6). La figure n°7 représente la séquence ADN (SEQ m n°1 ADNc) d'un polypeptide k~AkAP
selon l'invention ; cette séquence correspond à la séquence du gène k;.ARAP
de souris. En effet, la traduction de la séquence nucléotidique donne tm cadre de lecture ouvert de 396 nucléotides (SEQ ID n°2). Ce résultat est i~ illustré par la figure n°8 où est représentée la partie de séquence nucléotidique du gène k:ARAP (SEQ m n° 1 ) qui est comprise entre la séquence leader (exclue) et le codon stop, et où est également représentée, en-dessous de cette séquence nucléotidique, la séquence en acides aminés (code à 1 lettre) correspondante (SEQ ID n°2, code à 3 lettres), c'est-à-dire 20 la séquence en acides aminés de la protéine KARAP de souris matûre selon l'invention (SEQ ID n°2). L'analyse standard de cette séquence prévoit une protéine mature de 87 acides aminés (masse moléculaire de 9,6 kDa), une partie extracytoplasmique de 16 acides aminés (Q1-G16), une partie transmembranaire de 24 acides aminés (V17-G4p), et une partie Zs intracytoplasmique de 47 acides aminés (R41-Rg7). Conformément à notre stratégie de recherche, la partie extracytoplasmique comprend au moins un acide aminé cystéine (en fait deux, Cg et C 1 p), un acide aminé
transmembranaire (D25), et un ITAM intracytoplasmique (Y65QELQGQRHEVY76SDL). La figure 9 illustre les comparaisons qui WO 98149292 ~ 1 PCT/FR98l00883 peuvent être faites par aliyement de séquences entre les polypeptides à
ITAMs préalablement décrits et les poIypeptides selon l'invention possédant Lm (ou des) motifs ITAM, et indique la séquence ITAM consensus résultante la figure 9 représente l'alignement des ITAMs de polypeptides à ITAM (six s CD3, un Iga, un Ig(3, FcERIy et FcERI(3) et d'un motif ITAM du polypeptide K:ARAP marin (SEQ 117 n°2) identifié ci-dessus selon l'invention (indiqué
"k:AR.AP" sur cette figure 9). Sm cette base de comparaison avec les ITAMs préalablement décrits (Figwe 9), il nous a été permis d'envisager l'association des k:ARAP phosphorylées avec des protéine tyrosine kinases à groupement io SH2 en tandem (telles que ZAP-70 et p72Syk). L'association des KARAPs avec des protéines de fusion recombinantes correspondant aux groupements SH2 de ZAP-70 {préparation décrite dans: Olcese L., Lang P., Vély F., Cambiaggi A., Marguet D., Bléry M., Hippen K. L., Biassoni R., Moretta A., Moretta L., Cambier J. C., Vivier E. 1996, J. Immunol. 156:4531-4534), a is été vérifié in vitro: ces expériences ont été réalisées comme décrit dans la Figure 3A, piste 3, mais les lysats cellulaires ont été adsorbés par la protéine de fusion recombinante correspondant aux groupements SH2 de ZAP-70, au lieu de (anticorps anti-CD158. Ainsi K:AR.AP est une nouvelle molécule transmembranaire à ITAM qui s'associe aux KAR et qui, sous une forme 2o tyrosine phosphorylée, s'associe à ZAP-70. KARAP est donc un nouvel élément de transduction des lymphocytes T et NK. Il est possible que k;ARAP ou des analogues de KARAP s'associent aussi aux isoformes activatrices des récepteurs à ITIM, et servent dans ces complexes multimoléculaires de sous-unité de transduction des signaux émis lors de 2s (engagement du récepteur.
Une méthode particulièrement appropriée pour déterminer ou contrôler qu'un polypeptide candidat, dont on connaît la séquence, correspond à une protéine K:A.R.A.P selon l'invention consiste à produire un anticorps contre une partie caractéristique de ce polypeptide candidat {par exemple une ré~~ion WO 98/49292 ~Z PCT/FR98/00883 intracytoplasmique comprenmt au moins un motif ITAM ou une région extracvtoplasmique), et à vérifier que cet anticorps reconnaît, sur tme cellule fonctionnelle, une cellule KAR+ fonctionnelle par exemple, tme cible qtti se trouve associée au récepteur- pote lequel le polypeptide candidat est supposé
s être le KARAP (c'est-à-dire, dans le cas de cellules KAR+, à vérifier que l'anticorps reconnaît ttne cible qui se trouve associée à ttn récepteur KAR).
Cette méthode d'identification de polypeptides IC:_AR.AP selon l'invention consiste ainsi notamment à
- produire un anticorps mono- ou polyclonal dirigé contre ce io polypeptide candidat, et en particulier contre tlne région de ce polypeptide candidat qui comprend au moins ttn motif ITAM (par exemple, dans le cas de Ia protéine K:AR.AP marine identifiée ci-dessus, un anticorps dirigé contre ttne région de Ia partie extracytoplasmique (SEQ ID n°3) ou de la partie intracytoplasmique (SEQ m n°5) de la SEQ 117 n°2), is - mettre en contact cet anticorps avec un lysat de cellules, possédant, sous une forme fonctionnelle, le récepteur activateur ou non inhibiteur pour lequel le polypeptide candidat est supposé constituer le k;.ARAP, par exemple des cellules KAR+ fonctionnelles telles que des cellules NK ou T, dans des conditions douces permettant des réactions de liaison de type antigène-2o anticorps, - identifier le polypeptide candidat comme étant un polypeptide k:AR.AP selon l'invention lorsque dans les produits de réaction éventuellement formés se trouvent un produit de masse moléculaire apparente proche de celle d'un KAR (environ 50 kDa) et un produit de masse zs moléculaire apparente proche de celle du polypeptide candidat notamment entre 1 C et 16 kDa environ).
Cette méthode d'identification selon l'invention peut notamment être réalisée - en mettant en contact ledit anticorps comme ci-dessus décrit, WO 98/49292 ~3 PCT/FR98/00883 - faire précipiter les produits de réaction éventa ellement formés dans des conditions douces de détergent préservant les complexes moléculaires (par exemple digitonine à 1 %, voir exemple 1 ci-dessus), - mesurer la masse moléculaire des produits précipités, par exemple s par migration électrophorétique en présence des marqueurs de masse moléculaire sur un gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes, et - en identifiant le polypeptide candidat comme étant un polypeptide K:ARA1P selon l'invention comme ci-dessus décrit.
io EXEMPLE 3 1° Identification de plusieurs EST correspondant à KARA,P.
Notre stratégie de clonage de KA.RAP menin par bio-informatique, is telle que présentée dans l'exemple 2 ci-dessus, révèle également l'existence de 5 EST (Expressed Tag Sequences) qtù correspondent à notre définition de KAR.AP. Il s'agit des EST AA242315, AA734769, W88I59, AA098506 et W41142. Les figures l0A à 14A illustrent les séquences ADNc, respectivement, des EST AA242315, AA734769, W88159, respectivement, ao AA098506 et W41142 (SEQ ID n°6 à SEQ ID n° 10 respectivement). Les figures 10B à 14B illustrent les séquences protéiques correspondant, respectivement, à ces EST (SEQ )D n° I I à SEQ m n° 15 pour les protéines des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41142 respectivement). Tous ces EST ont été obtenus à partir de tissus provenant de 2s souris C57B1/6 et ont été alignés afin permis d'obtenir une séquence cDNA
correspondant à zen cadre de lecture ouvert. Ceci est illustré par la figure qui représente l'alignement des séquences des EST AA098506 (SEQ )D
n°9), AA242315 (SEQ ID n°6), W88159 (SEQ ID n°8), AA734769 (SEQ
)D n°7) WO 98/49292 ~~ PCT/FR98/00883 et W41142 (SEQ ID n° 10), et qui présente la séquence consensus résultante (ADNc K:.ARAP marin consensus ; SEQ ID n°16).
Ceci est également illustré par la figure 16 qui représente l'alignement des séquences protéiques des EST AA242315 (SEQ ID n°11), W88I59 (SEQ ID
n°13), W41142 (SEQ ID n°15), AA098506 (SEQ >D n°14) et (SEQ 1D n°12), et qui représente la séquence consensus résultante (protéine k:ARAP menine consensus, SEQ )D n°17). Sen ces figures 15 et 16, le symbole "." indique ime identité avec Ia séquence consensus considérée, le symbole "-" indique l'absence de données de séquençage.
io 2° Séquence génomique de KARAP marin Une librairie (phage lambda, EMBL3) de DNA génomique isolée à partir de souris de Ia lignée de souris 129 a été criblée avec le cDNA correspondant à
la séquence de l'EST AA734769 selon une technique classique. Un phage is contenant un fragment de 18 kb a été identifié comme positif. Une cartographie de ce phage par coupure avec une série d'enzyme de restrictions a été effecriiée et un fragment EcoRI-EcoRI de 9kb obtenu à partir du phage a été cloné dans le vecteur de clonage pBlue-Script et contient l'intégralité
du gène K;ARAP marin (de l'ATG initial à la séquence STOP). La séquence de 2o ce gène KARAP marin est présentée ~n figure 17 (SEQ ID n°18 ; 2838 pb).
De plus, des amorces oligonucléotides ont été générées afin d'obtenir l'organisation génomique de K:AR.AP marin. Les amorces utilisées sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous (SEQ m n°19 à SEQ m n°26) ~' M '*
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WO 98/49292 ,~~~ PCT/FR98/00883 L'orga~~isation génomique du K:A.RA.P marin est présentée en figure 18.
Nous avons aussi obtenu à partir de ces données, la séquence cDNA et donc protéique de K:ARAP de souris de la lignée 129. Cette séquence cDNA {SEQ
ID n°27) et cette séquence protéique {SEQ ID n°28) sont présentées en figure 19.
La séquence protéique ainsi traduite est:
MGALEPSWCLLFLPVLLTVLGLSPVQA Séquence signal QSDTFPI~DCSSVPG Domaine extracytoplasmique VLAGIVLGDLVLTLLIALAYSLG Domaine transmembranaire RLVSPGQEF~'RKQHIAETESPYQELQGQRPEVYSDLNTQRQYYR Domaine intracytoplasmique L'ensembie de ces résultats de cartographie génomique montrent que le gène K:ARAP marin (de l'ATG initial à la séquence STOP) est long de 2,9 kb is environ, et comprend 5 exons. Ces résultats sont illustrés par la figure 20 où
sont représentés, de haut en bas, l'ADN génomique du KARAP marin de la souris 129 (en noir : exon traduit ; en hachures horizontales : exon non traduit, en blanc : intron), la séquence protéique correspondante (SEQ ID
n°28 de l'exon n°1 à l'exon n°5), et la nahue (SS =
Séquence signal, EC =
2o domaine extracytoplasmique ; TM = domaine transmembranaire ; IC =
domaine intracytoplasmique) des différentes régions de cette protéine. L'exon 1 code pour une portion N-terminale de la séquence signal, l'exon 2 code pour le reste de la séquence signal et les trois premiers acides-aminés de la partie extracytoplasmique, l'exon 3 code pour le reste de la partie Zs extracytoplasmique, la partie transmembranaire et les 9 premiers acides-aminés de la partie intracytoplasmique, l'exon 4 code pour 14 acides-aminés de la partie intracytoplasmique et l'exon 5 code pow- le reste de la protéine.
Comme attendu de l'organisation génomique d'un polypeptide à ITAM
comme KARAP, l'ITAM est codé par deux exons (exon 4 et 5) séparés par 3u un intron de type 0.
WO 98/49292 ~~ PCT/FR98/00883 3° Reconstitution fonctionnelle d'un KAR (p50.2) exprimé dans les RBL-2H3 par le hARAP humain DAP-12.
Nous avons obtenu le cDNA codant pour KAR.AP lnunain par RT-PCR en s générant des amorces oligonucléotides déduite de la séquence de k:ARAP
marin. Les amorces utilisées sont présentées dans le tableau 2 ci-dessous (SEQ ID n°29 et n°30) io is U
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o -j z FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO 98/49292 ~~ PCT/FR98/00883 La séquence de l'ADNc obtenu est présentée en figi.~re 21 (SEQ ID
n°31 ;
ADNc du K:ARAP h mnain). De l'ARN extrait à partir de clones NK humains KA.R+ a servi de base à la génération de ce cDNA. Ce cDNA a été cloné
dans le vecteur d'expression eucaryote pNT-neo et des transfectants stables s pour ce KAR.AP h mnain ont été générés dans le transfectant KAR+ (pS0.2) de la lignée cellulaire RBL-2H3 (Bléry et al, J. Biol. Chem., 1997). La capacité des récepteLUS KAR exprimés sir les cellules RBL-2H3 ainsi doublement transfectées p50.2+ et K:ARAP+, à transduire un signal activateur a été testée par stimulation à l'aide d'anticorps dirigés contre la partie io extracytoplasmique de pS0.2 et en suivant le relargage de sérotonine tritiée.
Le protocole suivi pour cette expérience de relargage de sérotonine tritiée est le suivant Ces cellules sont décollées, centrifugées et resupendues dans du RPNII-10% SVF à une concentration finale de 1x106 cellules par ml. Les is cellules sont alors incubées avec 2~Ci de serotonine marquée au tritium par ml de cellules pendant 1 heure. Les cellules sont lavées puis remises dans du milieu pote 1 heure à 37°C afin qu'elles relarguent la sérotonine excédentaire de leurs stocks. Les cellules sont ensuite réparties dans des plaques à 96 puits (200000 cellules par puits) avec de l'IgE de sowis (2682-I) ou un Ac anti-2o pS0 (GL183). Les cellules adhèrent pendant 1 heure puis sont lavées. Elles sont remises à 37°C 15 minutes puis stimulées avec du F{ab')2 GAM
(SOpg/ml). Les cellules sont laissées 30 minutes à 37°C pour leur permettre de libérer leur sérotonine. La réaction est términée en ajouttant du HBSS
froid et en mettant les cellules sur la glace. La moitié du surnageant de as chaque puits est alors récupéré et mis dans 1 ml de liquide de scintillation. Les 100% de dégranulation sont obtenus a partir du même vohune de lysat obtenu à partir de cellules chargées en sérotonine et non stimulées. Les échantillons sont alors comptés sur un compteur Li.
WO 98/49292 ~~~ PCT/FR98/00883 Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 22 qui présente le % de sérotonine reiarguée dans le surnageant, par les cellules RBL-2H3 doublement transfectées p~O/KAR_AP humain et stimulées par l'anticorps indiqué en abscisse, (à gauche : aucun anticorps ; au centre IgE de souris s mIgE 1/500 ; à droite : GL183 ~~ug/ml). Comme üidiqué sur cette Figure 22, alors que l'engagement de KAR dans RBL-2H3 par un anticorps réagissant avec la partie extracytoplasmique de KAR (l'anticorps monoclonal GL183) ne se traduit pas par l'activation des cellules, l'engagement de KAR par GL183 dans les doubles transfectaüts RBL-2H3 exprimant à la fois KAR et K:ARAP
io hlunains, se traduit par l'activation cellulaire (objectivée ici par la libération de sérotonine à partir des cellules). Ceci est donc la preuve formelle que la séquence KARAP h mnaine identifiée reconstiW e la fonctionnalité des KAR.
La figm-e 23 illustre l'homologie entre l'organisation du gène K:AR.AP
hmnain et celle du gène k:AKAP marin (El à ES : exon 1 à exon 5 ; I1 à I4 is intron 1 à intron 4). La numérotation des paires de bases du gène k:ARAP
h iunain et de souris y est indiquée.
Claims (25)
1. Polypeptide isolé, caractérisé en ce qu'il permet la restauration d'une activation KAR déficiente, en ce qu'il est capable de s'associer à un KAR, et de ne pas s'associer à la contrepartie inhibitrice de ce KAR, et en ce que sa séquence en acides aminés:
- présente au moins un acide amené tyrosine phosphorylable, - présente une masse moléculaire comprise entre 10 ~ 2 et 16 ~ 2 kDa environ, - comporte au moins un motif ITAM Yxx/Ix6-8YxxL/I, - comporte une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et une région intracytoplasmique, - comporte au moins un acide aminé cystéine extracytoplasmique, - comporte au moins un acide aminé chargé (R, K, D, E) transmembranaire, ou fragment, ou homologue, d'un tel polypeptide, lesdits homologues ou fragments étant capables de transduire un signal provenant d'un KAR.
- présente au moins un acide amené tyrosine phosphorylable, - présente une masse moléculaire comprise entre 10 ~ 2 et 16 ~ 2 kDa environ, - comporte au moins un motif ITAM Yxx/Ix6-8YxxL/I, - comporte une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et une région intracytoplasmique, - comporte au moins un acide aminé cystéine extracytoplasmique, - comporte au moins un acide aminé chargé (R, K, D, E) transmembranaire, ou fragment, ou homologue, d'un tel polypeptide, lesdits homologues ou fragments étant capables de transduire un signal provenant d'un KAR.
2. Polypeptide tel qu'obtenu:
i. par immunoprécipitation d'une ou plusieurs fraction(s) polypeptidique(s) de lysats de cellules exprimant des récepteurs KAR capables de transduire un signal activateur à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR
et/ou anti-KAR, tel(s) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKB1, anti-p144, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 on PAX250, ii. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuissée par élimination des fractions immunoprécipitées à l'aide d'anticorps anti-CD3 et/ou anti-Fc.epsilon.RI.gamma., et/ou être à nouveau précipitée à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR tel(s) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKB1, anti-p140, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire, et récupération des polypeptides correspondant à un poids moléculaire de 12 ~ 2 kDa environ, ou bien par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fractions polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite (lesdites) fraction(s) polypeptidique(s) à un test kinase, et récupération des polypeptides phosphorylés correspondant à un poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 ~ 2 kDa environ, ou fragment, ou homologue, d'un tel polypeptide, lesdits homologues ou fragments étant capables de transduire un signal provenant d'un KAR.
i. par immunoprécipitation d'une ou plusieurs fraction(s) polypeptidique(s) de lysats de cellules exprimant des récepteurs KAR capables de transduire un signal activateur à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR
et/ou anti-KAR, tel(s) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKB1, anti-p144, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 on PAX250, ii. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuissée par élimination des fractions immunoprécipitées à l'aide d'anticorps anti-CD3 et/ou anti-Fc.epsilon.RI.gamma., et/ou être à nouveau précipitée à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR tel(s) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKB1, anti-p140, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire, et récupération des polypeptides correspondant à un poids moléculaire de 12 ~ 2 kDa environ, ou bien par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fractions polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite (lesdites) fraction(s) polypeptidique(s) à un test kinase, et récupération des polypeptides phosphorylés correspondant à un poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 ~ 2 kDa environ, ou fragment, ou homologue, d'un tel polypeptide, lesdits homologues ou fragments étant capables de transduire un signal provenant d'un KAR.
3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules NK et/ou des cellules T et/ou des cellules myéloïdes et/ou des cellules B et/ou des mastocytes.
4. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé
en ce qu'il est phosphorylé au niveau d'au moins un résidu tyrosine.
en ce qu'il est phosphorylé au niveau d'au moins un résidu tyrosine.
5. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé
en ce qu'il se présente sous la forme de dimères.
b. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se lie à une molécule à domaine SH2 ou PTB.
en ce qu'il se présente sous la forme de dimères.
b. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se lie à une molécule à domaine SH2 ou PTB.
69
7. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé
en ce que sa séquence en acides aminés est essentiellement constituée par la SEQ
ID N°2, n°3, n°4, ou n°5, n°11, n°12, n°13, n°14, n°15, n°17, ou u°28.
en ce que sa séquence en acides aminés est essentiellement constituée par la SEQ
ID N°2, n°3, n°4, ou n°5, n°11, n°12, n°13, n°14, n°15, n°17, ou u°28.
8. Palypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé
en ce qu'il est modifié par glycosylatian, phosphorylation, sulfonation, biotinylation, acylation, estérification, par addition, substitution ou suppression d'entités de forme motéctulaire proche de celle des groupes phosphate telles que le phosphonate, par addition de réactifs de marquage tels que la luciférase, la GFP (Green Fluarescence Protein) ou ses analogues, par addition de cibles de purification telles qu'un ligand d'affinité, par addition d'entités modifant sa solubilité.
en ce qu'il est modifié par glycosylatian, phosphorylation, sulfonation, biotinylation, acylation, estérification, par addition, substitution ou suppression d'entités de forme motéctulaire proche de celle des groupes phosphate telles que le phosphonate, par addition de réactifs de marquage tels que la luciférase, la GFP (Green Fluarescence Protein) ou ses analogues, par addition de cibles de purification telles qu'un ligand d'affinité, par addition d'entités modifant sa solubilité.
9. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé
en ce qu'il est capable de traverser une membraee cellulaire.
en ce qu'il est capable de traverser une membraee cellulaire.
10. Polypeptide selon l'une quolconnue des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est modifié de telle sorte à inhiber sa capacité à
transduire un signal.
transduire un signal.
11. Polypeptide stlon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est modifié
de telle sorte à être non hydrolysable dans des conditions biologiques, notamment par addition de groupes phosphonates.
de telle sorte à être non hydrolysable dans des conditions biologiques, notamment par addition de groupes phosphonates.
12. Polypeptide selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est modifié
par substitution d'un résidu tyrosine par ua résidu phénylalanine.
par substitution d'un résidu tyrosine par ua résidu phénylalanine.
13. Anticorps ou fragment d'un tel anticorps, en particulier fragment Fc, Fv, Fab, F(ab)'2, CDR tel qu'obtenu par immunogénèse à partir d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, ou à partir d'un fragment d'un tel polypeptide.
14. Anticorps ou fragment d'anticorps selon la revendication 19, caractérisé
en ce qu'il est capable de reconnaître la SEQ ID n°2, SEQ ID n°3. SEQ
ID n°4, SEQ
ID n°5, SEQ ID n°11, SEQ ID n°12, SEQ ID
n°13, SEQ ID n°14, SEQ ID n°15, SEQ ID n°17 et/ou SEQ ID n°28.
en ce qu'il est capable de reconnaître la SEQ ID n°2, SEQ ID n°3. SEQ
ID n°4, SEQ
ID n°5, SEQ ID n°11, SEQ ID n°12, SEQ ID
n°13, SEQ ID n°14, SEQ ID n°15, SEQ ID n°17 et/ou SEQ ID n°28.
15. Acide nucléique ou variant d'un tel acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence correspondant à la lecture en cadre ouvert, selon le code génétique universel, de la séquence en acides aminés d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes.
16. Acide nucléique selon la revendication 15, ou variant d'un tel acide nucléique, caractérisé en ce que ledit acide nucléique présente une séquence essentiellement constituée par la SEQ ID n°1, n°6, n°7, n°8, n°9, n°10, n°16, n°27, n°31, ou n°18.
17. Procédé d'obtention d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes:
i. d'immunoprécipitation d'une ou plusieurs fraction(s) polypeptidique(s) de lysats de cellules KAR+ à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR, tel(s) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKB1, anti-p140, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, ii. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuisée par élimination des fractions immunoprécipitées à l'aide d'anticorps anti-CD3 et/ou anti-Fc.epsilon.RI.gamma., et/ou être à nouveau précipitée à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR tel(s) qu'un anticorps anti-CDI58, anti-p70/NKB1, anti-p140, et plus particuliérement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. de séparation les polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire et récupérer les polypeptides correspondant à un poids moléculaire de 12 ~ 2 kDa environ, ou bien de séparation des polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite (lesdites) fraction(s) polypeptidique(s) à un test kinase, et récupérer les polypeptides phosphorylés correspondant à un poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 ~ 2 kDa environ.
i. d'immunoprécipitation d'une ou plusieurs fraction(s) polypeptidique(s) de lysats de cellules KAR+ à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR, tel(s) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKB1, anti-p140, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, ii. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuisée par élimination des fractions immunoprécipitées à l'aide d'anticorps anti-CD3 et/ou anti-Fc.epsilon.RI.gamma., et/ou être à nouveau précipitée à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR tel(s) qu'un anticorps anti-CDI58, anti-p70/NKB1, anti-p140, et plus particuliérement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. de séparation les polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire et récupérer les polypeptides correspondant à un poids moléculaire de 12 ~ 2 kDa environ, ou bien de séparation des polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite (lesdites) fraction(s) polypeptidique(s) à un test kinase, et récupérer les polypeptides phosphorylés correspondant à un poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 ~ 2 kDa environ.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que lesdites cellules KAR+ sont des cellules NK et/ou des cellules T et/ou des cellules myéloïdes et/ou des cellules B et/ou des mastocytes.
19. Méthode pour l'obtention de la séquence d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'on opéra par criblage parmi des séquences candidates pour ne sélectionner que celle(s) qui:
- présente(nt) au moins un acide aminé tyrosine phosphorylable, - présente(nt) une masse moléculaire comprise entre 5 et 25 kDa environ, - comporte(nt) une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et une région intracytoplasmique, - comporte(nt) au moins un acide aminé cystéine dans sa région extracytoplasmique, - comporte(nt) au moins un acide aminé chargé (R, K, D, E) dans sa région transmembranaire, et - comporte(nt) au moins un motif ITAM YxxL/Ix6-8 YxxL/I dans sa région intracytoplasmique, et que l'on s'assure que le(s) polypeptide(s) correspondant à
la (les) séquence(s) sélectionnée(s) est (sont) capable(s) de s'associer à un récepteur KAR tout en ne s'associant pas au récepteur contrepartie inhibitrice de ce KAR.
- présente(nt) au moins un acide aminé tyrosine phosphorylable, - présente(nt) une masse moléculaire comprise entre 5 et 25 kDa environ, - comporte(nt) une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et une région intracytoplasmique, - comporte(nt) au moins un acide aminé cystéine dans sa région extracytoplasmique, - comporte(nt) au moins un acide aminé chargé (R, K, D, E) dans sa région transmembranaire, et - comporte(nt) au moins un motif ITAM YxxL/Ix6-8 YxxL/I dans sa région intracytoplasmique, et que l'on s'assure que le(s) polypeptide(s) correspondant à
la (les) séquence(s) sélectionnée(s) est (sont) capable(s) de s'associer à un récepteur KAR tout en ne s'associant pas au récepteur contrepartie inhibitrice de ce KAR.
20. Méthode pour déterminer si un polypeptide candidat correspond à un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- produire un anticorps mono- ou polyclonal dirigé contre ce polypeptide candidat, et en particulier contre une région extracytoplasmique de ce polypeptide candidat et/ou une région qui comprend au moins un motif ITAM, mettre eu contact cet anticorps avec un lysat de cellules, possédant, sous une forme fonctionnelle, le récepteur activateur ou non inhibiteur pour lequel le polypeptide candidat est supposé constituer le KARAP dans des conditions douces permettant des réactions de liaison de type antigène-anticorps, identifier le polypeptide candidat comme étant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications I à 12 lorsque dans les produits de réaction éventuellement formés se trouvent un produit de masse moléculaire apparente proche de celle dudit récepteur activateur ou non inhibiteur, et un produit de masse moléculaire apparente proche de celle du polypeptide candidat.
- produire un anticorps mono- ou polyclonal dirigé contre ce polypeptide candidat, et en particulier contre une région extracytoplasmique de ce polypeptide candidat et/ou une région qui comprend au moins un motif ITAM, mettre eu contact cet anticorps avec un lysat de cellules, possédant, sous une forme fonctionnelle, le récepteur activateur ou non inhibiteur pour lequel le polypeptide candidat est supposé constituer le KARAP dans des conditions douces permettant des réactions de liaison de type antigène-anticorps, identifier le polypeptide candidat comme étant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications I à 12 lorsque dans les produits de réaction éventuellement formés se trouvent un produit de masse moléculaire apparente proche de celle dudit récepteur activateur ou non inhibiteur, et un produit de masse moléculaire apparente proche de celle du polypeptide candidat.
21. Composition pharmaceutique comprenant, en association avéc un Yéhicttle pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace de polypeptides selon l'une quelconque des revendications précédentes, ou de fragments de tels polypeptides, ou une quantité efficace d'anticorps selon la revendication 13 ou 14, ou de fragments de tels anticorps, ou une quantité efficace d'acides nucléiques selon la revendication 15 ou 16, ou de variants de tels acides nucléiques.
22. Méthode de diagnostic in vitro d'un fonctionnement anormal ou non désiré
d'une cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de:
- mise en contact d'au mains une cellule, ou un extrait de cellule, avec un anticorps selon la revendication 13 ou 14 ou un fragment d'un tel anticorps, ou avec un acide nucléique selon la revendication 15 ou 16 ou un variant d'un tel acide nucléique, et de - révélation du produit de réaction éventuellement formé.
d'une cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de:
- mise en contact d'au mains une cellule, ou un extrait de cellule, avec un anticorps selon la revendication 13 ou 14 ou un fragment d'un tel anticorps, ou avec un acide nucléique selon la revendication 15 ou 16 ou un variant d'un tel acide nucléique, et de - révélation du produit de réaction éventuellement formé.
23. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 22, caractérisée en ce que ledit fonctionnement anormal ou non désiré se traduit par une maladie immunoproliférative, une maladie d'immunodéficience telle qu'une maladie à
VIH, un cancer tel que la maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires, une maladie auto-immune telle que la polyarthrite rhumatoïde, une maladie infectieuse telle que le paludisme, une réponse allergique, un rejet de greffe.
VIH, un cancer tel que la maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires, une maladie auto-immune telle que la polyarthrite rhumatoïde, une maladie infectieuse telle que le paludisme, une réponse allergique, un rejet de greffe.
24. Méthode d'identification de molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR, caractérisée an ce qu'elle comprend les étapes de:
i. mise en contact des molécules candidates avec des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 (ou avec des fragments de tels polypeptides), et de ii. sélection de celles des molécules candidates pour lesquelles une liaison auxdits polypeptides (ou auxdits fragments de polypeptides) est observée.
i. mise en contact des molécules candidates avec des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 (ou avec des fragments de tels polypeptides), et de ii. sélection de celles des molécules candidates pour lesquelles une liaison auxdits polypeptides (ou auxdits fragments de polypeptides) est observée.
25. Méthode d'identification de molécules capables de moduler une activité
cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de:
i. mise en contact des molécules candidates avec des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR telles qu'obtenues par la méthode selon la revendication 24 et avec des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 (ou avec des fragments de tels polypeptides), et de ii. sélection de celles des molécules candidates qui exercent un effet sur la liaison entre lesdits polypeptides (ou lesdits fragments de polypeptides) et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices, telle qu'observée en l'absence desdites molécules candidates.
cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de:
i. mise en contact des molécules candidates avec des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR telles qu'obtenues par la méthode selon la revendication 24 et avec des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 (ou avec des fragments de tels polypeptides), et de ii. sélection de celles des molécules candidates qui exercent un effet sur la liaison entre lesdits polypeptides (ou lesdits fragments de polypeptides) et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices, telle qu'observée en l'absence desdites molécules candidates.
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