EP0977855A2 - Polypeptides associes a des recepteurs activateurs et leurs applications biologiques - Google Patents

Polypeptides associes a des recepteurs activateurs et leurs applications biologiques

Info

Publication number
EP0977855A2
EP0977855A2 EP98921586A EP98921586A EP0977855A2 EP 0977855 A2 EP0977855 A2 EP 0977855A2 EP 98921586 A EP98921586 A EP 98921586A EP 98921586 A EP98921586 A EP 98921586A EP 0977855 A2 EP0977855 A2 EP 0977855A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
kar
polypeptides
cells
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98921586A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Eric Vivier
Alessandro Moretta
Lucia Olcese
Frédéric VELY
Elena Tomasello
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9705411A external-priority patent/FR2762844B1/fr
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of EP0977855A2 publication Critical patent/EP0977855A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the invention relates to particular novel polypeptides capable of transducing a signal from an activator receptor for MHC class I molecules, functioning as a stand-alone receptor or as a co-receptor, and from a KAR (Killer -cell Activatory Receptor) in particular, on the antibodies obtained from said polypeptides serving as immunogens, and on the nucleic acids corresponding to said polypeptides.
  • KAR Killer -cell Activatory Receptor
  • the invention also relates to the methods for obtaining such polypeptides and to the biological applications, more particularly, preventive, therapeutic and diagnostic, of said polypeptides, antibodies and nucleic acids.
  • the immune system must use a coordinated system of intercellular communications.
  • BCR B lymphocyte antigen
  • TCR T lymphocyte antigen
  • RFc Fc portion of the antibodies
  • KARs Killer cell Activatory Receptors
  • KLRs Killer cell Inhibitory Receptors
  • KARs and KIRs are not limited to NK cells: they are also naturally expressed by T cells.
  • KARs are highly homologous to KIRs (up to 96% homology between KARs and KIRs at the extracytoplasmic level). KARs and KIRs do not, however, perform the same functions:
  • KIRs are involved in the negative control (inhibitor) of activation of NK and T cells, while KARs are involved in the positive control (stimulator) of activation of NK and T cells.
  • KAR activating isoform
  • KIR inhibiting isoform
  • KARs express a charged amino acid residue (lysine) in their transmembrane domain and do not contain any ITLM motif (immunoreceptor inhibition motif based on tyrosine residue (s)) in their intracytoplasmic domain.
  • ITLM motif immunoglobulin-like motif
  • the KAR monomeric receptors do not contain an ITAM motif (immunoreceptor activation motif based on tyrosine residue (s)).
  • NKG2C / D which is of the lectin type and whose inhibitory counterpart is NKG2A / B
  • non-inhibitory receptors such as SIRP ⁇ and LLT 1, whose ligands are still unknown and which have been described either on hematopoietic cells and on non-hematopoietic cells (SIRP ⁇ ), ie on B cells, macrophages and dendritic cells (ILT1).
  • KARs can function as autonomous receptors, in particular for MHC class I molecules. It is thus known that the engagement of KARs with MHC class I molecules expressed on the surface of target cells, initiates the programs of lymphocyte activation as established due to the mobilization of intracytoplasmic Ca 2+ and the induction of lysis of target cells.
  • KARs can also provide co-receptor functions for TCR and RFc receptors (Mandelboim O. et ai, 1996, Science 274: 2097; Cambiaggi A. et al., 1996 , Blood 87: 2369).
  • KARs can play the role of co-receptors and thus increase the intensity of the cellular response, in particular in the face of small quantities of antigens, maintain the cellular response over time, and also cooperate stimulation of cell proliferation.
  • KARs naturally expressed in NK and T lymphocyte subpopulations, is not restricted by their own ligands, namely MHC class I molecules, but extends to the equilibrium of the immune system in a way general.
  • the functioning of naturally expressed KARs thus influences the proliferation of NK and T cells, the production by such cells of cytokine-like substances, the lysis of target cells such as autologous cells which are deleterious, malignant or infected with viruses, cells allogenic, but also on the tolerance of the immune system to certain antigens.
  • Any failure or dysfunction of the KARs can therefore lead to various pathologies or undesirable reactions, all linked to the functioning of the immune system, such as immunodeficiency diseases, autoimmune diseases (eg multiple sclerosis), tumors, infections viral, bacterial, parasitic, allergies, transplant rejections. It has, for example, been shown that if humans have on average less than 10% of lymphocytes expressing KARs, almost all of the lymphocytes of patients suffering from LDGL (lymphoproliferative disease of granular lymphocytes) express KARs.
  • LDGL lymphoproliferative disease of granular lymphocytes
  • the object of the present invention is to provide means making it possible to diagnose abnormal or unwanted functioning of activating receptors for MHC class I molecules such as KARs and to control their functioning.
  • KARAP KAR-Associated Proteins
  • KAR receptor we mean, in the present case, human receptors of the immunoglobulin type non-inhibitory counterparts of the KIR receptors, such as the KAR p50 receptors (KTRTLOS1 to TRILDS5), KTRIILDSl, but also any non-inhibitory receptor of structure similar to these KAR receptors, and in particular human receptors of the lectin type such as NKG2C, NKG2D (naturally expressed on NK and T cells), murine receptors of the immunoglobulin type such as pir A (naturally expressed on myeloid cells, B cells) , gp49A (naturally expressed on mast cells), murine lectin receptors such as Ly49D, Ly49H (naturally expressed on NK and T cells).
  • KAR receptor we mean, in the present case, human receptors of the immunoglobulin type non-inhibitory counterparts of the KIR receptors, such as the KAR p50 receptors (KTRTLOS1 to TRILDS5), KTRIILDSl, but also any non
  • KARAP polypeptide any isolated polypeptide (other than a KAR) in the absence of which said KAR receptor is naturally incapable of transducing a detectable activating signal. This does not exclude the fact that a determined KARAP polypeptide can not only associate with a KAR receptor as defined above, but also with other activating or non-inhibiting monomeric receptors with a structure close to that of KARs such as defined above, and in particular to a human activating receptor of the immunoglobulin type of the LIR / MIR / LLT family such as LLT1.
  • polypeptide includes, in the present application, not only said polypeptide, but also the homologs of this polypeptide, as obtained by deletion, insertion, inversion or conservative substitution of amino acids, and the fragments of this polypeptide, as obtained by hydrolysis of said polypeptide using proteases, said homologs or fragments being capable of transducing a signal originating from a KAR.
  • polypeptide covers, in the present application, both polypeptides and proteins.
  • a polypeptide according to the invention is necessary for the transduction of the signal received by a KAR receptor: it is therefore an isolated polypeptide which allows the restoration of a deficient KAR activation.
  • the skilled person can proceed by showing that there is a KAR receptor which, if expressed by an appropriate cell in the absence of this polypeptide , fails to transduce a detectable activator signal, or fails to transduce an activator signal satisfactory for the intended application.
  • Example 3 One embodiment of this determination is presented in Example 3 below by comparison between the activation capacity (serotonin release) of an RBL-2H3 cell expressing the KAR p50.2 receptor alone, and that of an RBL-2H3 cell which expresses both the KAR p50.2 receptor and its KARAP polypeptide. Examples of suitable cells are shown in Figure 5 below.
  • restored deficient KAR activation we mean that transduction, at the cell, by said KAR of a significant activating signal is possible, or, if necessary, satisfactory. This can be tested in particular using cellular stimulation with antibodies. To determine at the cell level whether a signal from a
  • KAR is or is not transduced, and to determine whether such a signal is stimulated or inhibited
  • numerous means are available to those skilled in the art. Examples of such means include stimulation of said KAR by a ligand and measurement of secreted cytokines (cf. for example, Cambiaggi et al. 1996, Blood 87: 2369), of cell proliferation (cf. for example Mandelboim et al. 1996, Science 274: 2097), cytotoxicity (cf. for example the redirected cytotoxicity test described below), mobilization of intracytoplasmic calcium (cf. for example Bléry et al, 1997, J. Biol. Chem. 272, 8989-8996), and / or the induction of phosphorylation (cf. for example Vivier et al. 1991, J. Immunol. 146: 206).
  • cytokines cf. for example, Cambiaggi et al. 1996, Blood 87: 2369
  • cell proliferation cf. for
  • a polypeptide according to the invention is further characterized in that it is capable of associating with a KAR, and of not associating with the inhibitory counterpart of this KAR.
  • Methods for determining whether a polypeptide is capable of associating with a KAR, and of not associating with the inhibitory counterpart of this KAR (i.e. of not associating with the corresponding KIR receptor ) are well known to those skilled in the art.
  • An example of such a method includes in particular: - to express this polypeptide to a KAR + KIR " cell on the one hand, and to a KAR-KTR + cell,
  • polypeptide fraction (s) from the lysate of these cells using at least anti-KAR and / or anti-KTR antibodies
  • anti-KTR and / or anti-KAR antibodies include anti-CD158, anti-p70 / NKB1, anti-p140 antibodies, and more particularly monoclonal antibodies EB6, GL183 or PAX250.
  • a method for expressing such a polypeptide by a cell is indicated in Example 3 below.
  • a KARAP polypeptide according to the invention can moreover be characterized in that it is as obtained: i. by immunoprecipitation of one or more polypeptide fraction (s) of cell lysates expressing KAR receptors capable of transducing an activating signal using one or more anti-KTR and / or anti-KAR antibodies, such as (s) an anti-CD158, anti- ⁇ 70 / NKBl, anti-pl40 antibody, and more particularly the monoclonal antibody EB6, GL183 or PAX250, ii.
  • each polypeptide fraction can optionally be further depleted by elimination of the immunoprecipitated fractions using anti-CD3 ⁇ and / or anti-Fc ⁇ RI ⁇ antibodies, and / or be precipitated again using one or more anti- KTR and / or anti-KAR such as an anti-CD158, anti-p70 / NKBl, anti-pl40 antibody, and more particularly the monoclonal antibody EB6, GL183 or PAX250, iii.
  • Said cells expressing KAR receptors capable of transducing an activating signal can in particular be NK cells and / or T cells and / or myeloid cells and / or B cells and / or mast cells.
  • Means for determining whether or not a KAR is capable of transducing a signal to the cell have been indicated above.
  • - has a molecular mass of between 10 + 2 and 16 + 2 kDa approximately (in particular, actual molecular mass of 10 + 2 kDa, apparent molecular mass on polyacrylamide gel under denaturing conditions from l2 + 2 to l6 + 2kDa depending on the degree of phosphorylation).
  • amino acid sequence comprises at least one ITAM motif YxxL / Ix ⁇ 5 .8YxxL / I in the intracytoplasmic region.
  • the amino acid sequence of a KARAP polypeptide comprises an extracytoplasmic region, a transmembrane region, and / or an entracytoplasmic region.
  • this intracytoplasmic region is predominant relative to the other regions of the sequence of this polypeptide.
  • Means to identify extracytoplasmic, transmembrane regions, intracytoplasmic agents are known to those skilled in the art (for example, hydropathicity algorithms, formation of reverse vesicles).
  • the amino acid sequence of a KARAP polypeptide comprises at least one extracytoplasmic cysteine amino acid.
  • the amino acid sequence of a KARAP polypeptide comprises at least one charged amino acid (R, K, D, E) transmembrane.
  • polypeptides according to the invention can be phosphorylated at the level of at least one tyrosine residue, or be non-phosphorylated.
  • said polypeptides are in the form of dimers linked by a disulfide bridge; they associate in a selective and non-covalent manner with KARs which function, either as autonomous receptors for MHC class I molecules, or as co-receptors of TCR or of an RFc such as CD16.
  • a KARAP polypeptide is capable of binding to a molecule with an SH2 domain such as ZAP-70, p72 ⁇ , p56, p59 ⁇ , p60 / w , Grb-2, pp36-38 (lat ), PLC- ⁇ l, p85 (PI-3 kinase), Shc, or to a molecule with a PTB domain (PhosphoTyrosine Binding) such as Shc.
  • SH2 domain such as ZAP-70, p72 ⁇ , p56, p59 ⁇ , p60 / w , Grb-2, pp36-38 (lat ), PLC- ⁇ l, p85 (PI-3 kinase), Shc
  • PTB domain PhosphoTyrosine Binding
  • a particular KARAP polypeptide according to the invention has an amino acid sequence essentially constituted by SEQ ID No. 2.
  • the present invention also relates to the polypeptides whose sequence is essentially constituted by the extracytoplasmic part of SEQ LD n ° 2, namely SEQ ID n ° 3, or by the transmembrane part of SEQ LD n ° 2, namely SEQ ID No. 4, or the intracytoplasmic part of SEQ LD No. 2, namely SEQ ID No. 5.
  • Other specific KARAP polypeptides according to the invention have an amino acid sequence essentially constituted by SEQ ID No. 11, No. 12, No. 13, No. 14, No. 15, No. 17 (consensus sequence of the mouse KARAP protein C57B1 / 6), or No. 28 (mouse KARAP protein sequence 129 obtained from the genomic sequence).
  • polypeptides can also be obtained, after sequencing, by climatic synthesis or using recombinant DNA techniques.
  • Said KARAPs polypeptides are necessary for the transduction of signals originating from activating receptors, the KARs, which do not present ITEVI or ITAM intracytoplasmic but which have a transmembrane amino acid residue.
  • the polypeptides according to the invention are modified by glycosylation, phosphorylation, sulfonation, biotinylation, acylation, esterification, or by addition, substitution, deletion of entities of molecular form close to that of phosphate groups, such as phosphonate , by addition of labeling reagents such as luciferase, GFP (Green Fluorescence Protein) or its analogs, by addition of purification targets such as an affinity ligand, by addition of entities modifying its solubility.
  • Modifications of particular interest include those which modify said polypeptide so as to block or inhibit its ability to transduce the signal received (strategy of the transdominant negative).
  • a polypeptide according to the invention in a form thus modified, finds in particular applications in any composition or method intended to negatively modulate (inhibit) a given immune response, in particular an unwanted or abnormal immune response (for example, auto-diseases - immune, allergies, transplant rejection).
  • Appropriate modifications include those which render the tyrosine phosphorylation of said polypeptide non-hydrolyzable under biological conditions (for example, by addition of phosphonate groups).
  • tyrosine residues Y
  • ITAM motif a tyrosine residue contained in an ITAM motif
  • F a phenylalanine residue
  • polypeptides of the invention are capable of crossing a cell membrane, that is to say a lipid bilayer.
  • the present invention also relates to the antibodies, in particular the monoclonal antibodies, and the fragments of such antibodies, in particular the Fc, Fv, Fab, F (ab) ′ 2 , CDR fragments, as obtained by immunogenesis from a KARAP polypeptide according to the invention, or as obtained from a fragment, homologous or modified form of such a polypeptide.
  • fragments of such antibodies in particular fragment Fc, Fv, Fab, F (ab) '2, CDR, as obtained by immunogenesis from a polypeptide whose sequence consists essentially of the extracytoplasmic, intracytoplasmic or transmembrane part of such a KARAP polypeptide according to the invention.
  • Such antibodies are obtained by immunization of animals, such as rabbits and mice, against polypeptides, fragments, homologs or modified forms according to the invention as essentially obtained by elution of electrophoretic bands, by chemical synthesis or by a technique of soluble fusion proteins (GST), said polypeptides, fragments, homologs or modified forms being optionally coupled to immunogens such as ovalbumin.
  • animals such as rabbits and mice
  • polypeptides, fragments, homologs or modified forms as essentially obtained by elution of electrophoretic bands, by chemical synthesis or by a technique of soluble fusion proteins (GST), said polypeptides, fragments, homologs or modified forms being optionally coupled to immunogens such as ovalbumin.
  • immunogens such as ovalbumin.
  • Monoclonal antibodies are then produced by hybridoma fusion of immune spleen cells, screening and purification of culture supernatants (Kôhler and Milstein, 1975, Nature 256, 495-497; Antibodies, a laboratory manual, 1988, Harlow and David Lane, Ed. Cold Spring Harbor laboratory).
  • diantibodies can be generated according to standard procedures. Said fragments can, if necessary, be inserted or grafted to humanizing structures.
  • the present invention also relates to nucleic acids comprising a sequence corresponding to reading in an open frame, according to the universal genetic code and taking into account the degeneration of said code, of the amino acid sequence of a polypeptide, fragment, or homologous according to the invention, as well as the variants which have a homology greater than or equal to 60% with such nucleic acids, and which are capable of coding for a transducer molecule of an activating signal originating from a KAR as defined above .
  • nucleic acid whose DNA sequence is essentially constituted by SEQ LD n ° 1 (cDNA of the mature KARAP protein of sequence SEQ LD n ° 2), n ° 6, n ° 7, n ° 8, n ° 9, n ° 10, n ° 16 (consensus cDNA sequence of mouse KARAP C57B1 / 6), n ° 27 (cDNA sequence of mouse KARAP 129 obtained from the genomic sequence), n ° 18 (genomic sequence of KARAP mouse 129), or No.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a polypeptide according to the invention comprising the steps: i.
  • NK cells and / or T cells and / or myeloid cells and / or B cells and / or mast cells for example immunoprecipitate one or more polypeptide fraction (s) of cell lysates expressing functional KAR receptors (NK cells and / or T cells and / or myeloid cells and / or B cells and / or mast cells for example ) using one or more anti-KIR and / or anti-KAR antibodies, such as an anti-CD158 antibody, anti-p70 NKBl, anti-pl40, and more particularly the monoclonal antibody EB6 ,
  • each polypeptide fraction can optionally be further depleted by elimination of the immunoprecipitated fractions using anti-CD3 and / or anti-Fc ⁇ RI ⁇ antibodies, and / or can be precipitated again using one or more anti- KTR and / or anti-KAR such as an anti-CD158, anti-p70 / NKBl, anti-pl40 antibody, and more particularly the monoclonal antibody EB6, GL183 or PAX250, iii.
  • the said polypeptide fraction (s) to a kinase test, and recovering the phosphorylated polypeptides corresponding to a molecular weight of approximately 12, 14 and / or 16 ⁇ 2 kDa.
  • the present application also relates to a method for obtaining the sequence of specific KARAP polypeptides according to the invention. This method, an exemplary embodiment of which is described in Example 2 below
  • bioinformatics strategies includes in particular the screening of those of the polypeptide sequences which meet the following criteria: the sequence has at least one phosphorylatable tyrosine amino acid,
  • the sequence has a molecular mass of between approximately 5 and 25 kDa, the sequence comprises an extracytoplasmic region, a transmembrane region, and an intracytoplasmic region,
  • the sequence comprises at least one amino acid cysteine in its extracytoplasmic region
  • the sequence comprises at least one charged amino acid (R, K, D, E) in its transmembrane region, and
  • the sequence comprises at least one ITAM motif YXXL / IX ⁇ - S YXXL / I in its intracytoplasmic region,
  • the polypeptide corresponding to the selected sequence must be able to associate with a KAR, and not to associate with the corresponding inl ibitrix receptor receptor (KIR), as defined above.
  • the present application also relates to a method for determining or checking whether a candidate polypeptide corresponds to a KARAP polypeptide according to the invention.
  • An exemplary embodiment of such a method is presented in Example 2 below.
  • One such method consists in producing an antibody against a characteristic part of this candidate polypeptide (for example an intracytoplasmic region comprising at least one ITAM motif or an extracytoplasmic region), and in verifying that there is a KAR receptor which, when it is expressed functionally on a cell, is associated with a recognized element, according to an antigen-antibody type reaction, by said antibody.
  • This method for identifying KARAP polypeptides thus consists in particular in:
  • the candidate polypeptide as being a KARAP polypeptide according to the invention when in the reaction products possibly formed there is a product of apparent molecular mass close to that of said activating or non-inhibiting receptor (approximately 50 kDa for KAR p50) and a product of apparent molecular mass close to that of the candidate polypeptide (in particular between 10 and 16 kDa approximately).
  • This identification method according to the invention can in particular be carried out: by bringing said antibody into contact as described above,
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, an effective amount of at least one polypeptide, KARAP, fragment, homologous or modified form according to the invention, of at least one antibody or fragment d antibody according to the invention, or at least one nucleic acid or variant nucleic acid according to the invention.
  • composition according to the invention can be formulated in solid, liquid form or in the form of a suspension, for oral, parenteral, topical, intravaginal, mtrarectal administration or for oral and / or nasal inhalation.
  • Said pharmaceutical composition according to the invention is intended to modulate the activity of a KAR.
  • said pharmaceutical composition will comprise agents facilitating the transduction of the signal originating from said KAR, such as, for example, polypeptides, fragments, homologs, or nucleic acids, variants according to the invention capable of crossing a lipid bilayer.
  • said pharmaceutical composition will comprise agents blocking the transduction of signals originating from said KAR such as, for example, antibody fragments according to the invention capable of crossing a lipid bilayer so as to block the Cellular KARAPs, or modified polypeptides, according to the invention, phosphorylated or not, for example phosphorylation not hydrolysable under biological conditions, so as to block proteins with domain SH2 (ZAP-70, p72 syk ) or PTB or any molecule adapter or effector of the activation of said KAR.
  • modifications include in particular the addition of phosphonate groups, and / or the mutation of at least one Tyrosine residue (Y) to phenylalanine residue (F).
  • the present application therefore relates to a composition for the prevention, palliation, and / or treatment of an abnormal or unwanted functioning of a cell involved in an immune reaction.
  • a composition advantageously comprises polypeptides, or, where appropriate, modified polypeptides according to the invention.
  • the present invention also relates to a method of in vitro diagnosis of abnormal or unwanted functioning of a cell comprising the steps of:
  • the contacting step is carried out under conditions in particular of duration, temperature, buffer, if necessary of gel crosslinking, allowing the establishment of an antigen-antibody type reaction for example by ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assays ), or, where appropriate, a reaction of the nucleic acid hybridization and PCR type (polymerase chain reaction).
  • ELISA Enzyme Linked Immunoabsorbent Assays
  • a reaction of the nucleic acid hybridization and PCR type polymerase chain reaction
  • markers such as fluorescent, enzymatic, radioactive or luminescent markers can be used.
  • Said in vitro diagnostic method according to the invention allows the diagnosis of abnormal or unwanted cellular functioning which can result in an immunoproliferative disease, an immunodeficiency disease such as a VLH disease, a cancer such as the lymphoproliferative disease of lymphocytes granular, an autoimmune disease such as rheumatoid arthritis, an infectious disease such as malaria, an allergic response, transplant rejection.
  • the present invention also relates to a method of identifying molecules which are adapters or effectors of the activation of a KAR, and to a method of identifying molecules capable of modulating cellular activity resulting from the activation of a KAR. .
  • the candidate molecules capable of being molecules that adapt or effect the activation of a KAR can for example be chosen from molecules with a SH2 or PTB domain. They can be in soluble recombinant form.
  • the contacting step can be, for example, carried out by coupling the candidate molecules, obtained in soluble recombinant form, capable of being molecules that adapt or effect the activation of a KAR, to beads allowing the measurement.
  • radioactivity such as scintillating liquid beads, and by passing over said beads, polypeptides according to the invention (or fragments or homologs of such polypeptides) under tritiated form. Are then selected those of the candidate molecules for which a binding to said polypeptides, fragments, or homologs is observed by measurement of radioactivity (cpm).
  • the contacting step can also be carried out by immobilization of polypeptides according to the invention (or of fragments or homologs of such polypeptides) on microcarriers allowing the measurement of the resonance of plasmons such as BIAcore (Pharmacia) microcarriers (cf. for example Olcese et al., 1996, The Journal of Immunology 156: 4531-4534; Vélv et al, Immunology Letters 1996, vol. 54, pl45-150), or by immobilization of phosphorylated and biotinylated polypeptides according to the invention. streptavidin beads (Vély et al. Eur. J. Immunol. 1997, 27: 1994-2000; Le Dréan et al.
  • This method of identifying molecules that are adapters or effectors of the activation of a KAR can also serve as a reference in the implementation of the method of identifying molecules capable of modulating cellular activity resulting from the activation of a KAR according to the invention.
  • This method of identifying molecules capable of modulating cellular activity resulting from the activation of a KAR comprises the steps of: i. bringing candidate molecules into contact with molecules that are adapters or effectors of the activation of a KAR as obtained by method according to the invention described above and with polypeptides according to the invention (or with fragments or homologs of such polypeptides), and ii. selection of those of the candidate molecules which exert an effect on the link between said polypeptides (or said fragments or homologs of polypeptides) and said adapter or effector molecules, as observed in the absence of said candidate molecules.
  • the candidate molecules capable of modulating cellular activity resulting from a KAR can be chosen from banks of natural or synthetic compounds, in particular from chemical or combinatorial banks.
  • Said candidate molecules can be of a protein nature (for example, derivatives or fragments of anti-idiotype antibodies such as the antibodies according to the invention, derivatives or fragments of catalytic antibodies), of carbonaceous, lipid or nucleic nature.
  • the step of bringing the method of identification of molecules capable of modulating cellular activity resulting from the activation of a KAR, according to the invention, into contact can, for example, be carried out by incubating said candidate molecules with polypeptides according to the invention (or with fragments or homologs of such polypeptides) and with molecules which adapt or effect the activation of a KAR, as obtained by the method according to the invention, under conditions allowing a measurement the rate of binding between said polypeptides and said adapter or effector molecules for the activation of a KAR, for example, based on a chemical property of said adapter or effector molecules in the unbound state, such as enzymatic property, property phosphorylation or self-phosphorylation.
  • the step of bringing into contact the method of identifying molecules capable of modulating a cellular activity resulting from the activation of a KAR, according to the invention, can also be carried out by implementing techniques of the bead type. scintillating liquid and tritiated polypeptides or microsupport type and measurement of the plasmon resonance, as described above, by measuring the radioactivity or, respectively, the plasmon resonance, resulting from the bond between said polypeptides and said adapter or effector molecules, in the absence and in presence of candidate molecules. Those candidate molecules are then selected which either increase or decrease in a statistically significant manner the rate of control control measured between said polypeptides and said adapter or effector molecules in the absence of said candidate molecules.
  • the molecules capable of modulating the activation of a KAR can be chemically modified so as to make them non-hydrolysable under biological conditions, and / or so that they can cross a cellular lipid bilayer.
  • the molecules capable of modulating the activation of a KAR, according to the invention advantageously act by modifying the interaction between said KARAPs and their cellular effectors or adapters.
  • Said molecules capable of modulating a cellular activity resulting from the activation of a KAR, according to the present invention can then be apphquée to a cell cultured in vitro, such as lymphocyte cell, whose KAR activity has been stimulated, for example , by contacting a ligand.
  • a cell cultured in vitro such as lymphocyte cell, whose KAR activity has been stimulated, for example , by contacting a ligand.
  • This application is made by penetration inside said cell, for example, by electroporation or by chemical modification allowing the crossing of a lipid bilayer.
  • the present invention is illustrated by the following examples which are in no way to be considered as limiting. Reference is made to the following 23 figures: - Figure 1 shows in A, a flow cytometer analysis (FACScan, registered trademark
  • LL-2 interleukin 2
  • LDGL lymphoproliferative disease of granular lymphocytes
  • B the results of a re-directed cytotoxicity test with different monoclonal antibodies, performed on NK cells cultured on LL-2 from different donors;
  • FIG. 2 shows: in A, an SDS-PAGE analysis (resolution of proteins by gel electrophoresis and sodium dodecyl sulfate) carried out from NK cells of RP donor (p50.1 + ) radiolabeled at 125 I and immunoprecipitated at l using anti-CD158 EB6 monoclonal antibody, before and after depletion of Fc ⁇ RI ⁇ and CD3 ⁇ using anti-CD3 ⁇ / anti-Fc ⁇ RI ⁇ antibodies, in B, SDS-PAGE analysis with an anti- CD3 ⁇ of complete DF cell lysates or immunoprecipitates of such lysates;
  • FIG. 3 shows: in A, an SDS-PAGE analysis of phosphorylated proteins from in vitro kinase tests to which immunoprecipitates of MAL NK cell lysates were subjected.
  • B the same type of SDS-PAGE analysis as 'in Figure 3 A but performed from RBL-2H3 p50.2 + cells
  • C an analysis by thin layer electrophoresis (TLE) of phosphorylated amino acids from the KARAPs and CD3 ⁇ bands excised after in vitro kinase tests performed on anti-CD158 and anti-CD16 immunoprecipitates, respectively, of NK RP cells
  • TLE thin layer electrophoresis
  • - Figure 4 shows a two-dimensional SDS-PAGE analysis under non-denaturing / denaturing conditions of anti-CD158 immunoprecipitates of NK RP cell lysates. having undergone a kinase test, and
  • FIG. 5 shows the activating or non-inhibiting receptors of the immunoglobulin superfamily (IgSF) or of the lectin type, and their inhibiting counterparts,
  • IgSF immunoglobulin superfamily
  • FIG. 6 represents the schematic structure of KIR ( P 58) and KAR (p50) receptors
  • FIG. 7 represents the cDNA sequence of a mouse KARAP polypeptide according to the invention (SEQ LD No. 1),
  • FIG. 8 represents the nucleotide sequence (between the excluded leader sequence and the stop codon) and the amino acid sequence of a KARAP polypeptide according to the invention (mature protein, SEQ LD n ° 2), and
  • FIG. 9 represents the alignment of the ITAMs and of the ITAM of a KARAP polypeptide according to the invention.
  • FIGS. 10A, 11A, 12A, 13A and 14A respectively illustrate the cDNA sequences of ESTs AA242315, AA734769, W88159, AA098506 and W41142 (SEQ LD n ° 6 to SEQ LD n ° 10),
  • FIGS. 10B, 11B, 12B, 13B and 14B respectively illustrate the protein sequences of ESTs AA242315, AA734769, W88159, AA098506 and W41142 (SEQ LD n ° 1 to SEQ LD n ° 15),
  • FIG. 15 represents the alignment of the cDNA sequences of the ESTs AA242315, AA734769, W88159, AA098506 and W41142, and the resulting consensus sequence (SEQ ID No. 16; cDNA KARAP of mouse C57B1 / 6 consensus),
  • FIG. 16 represents the alignment of the protein sequences of ESTs AA242315, AA734769, W88159, AA098506 and W41142, and the resulting consensus sequence (SEQ LD n ° 17; mouse KARAP protein C57B1 / 6 consensus),
  • FIG. 17 represents the sequence of the KARAP gene from mouse line 129 (SEQ LD n ° 18; 2838 bp),
  • FIG. 18 represents the genomic organization of the KARAP of line 129 mice
  • - Figure 19 represents the cDNA sequence of the KARAP of line 129 mice (SEQ LD n ° 27) and the corresponding protein sequence (SEQ LD n ° 28 ),
  • FIG. 20 represents from top to bottom, the genomic organization of the KARAP gene from mouse line 129, the corresponding protein sequence, and the nature of the different regions of this protein,
  • FIG. 21 represents the cDNA of human KARAP (SEQ LD n ° 31),
  • FIG. 22 shows the percentage of serotonin released into the supernatant by RBL-2H3 cells doubly transfected p50 / human KARAP, and stimulated by the antibody indicated on the abscissa (left: no antibody; in the mouse IgE center: mlgE 1 / 500; right: GL183 5 ⁇ g / ml),
  • FIG. 23 illustrates the methodology between the organization of the human KAPAP gene and that of the murine KARAP gene.
  • anti-CD3, anti-CD16 and anti-CD56 antibodies of isotype IgGl such as JT3A (Coulter Immunotech reference 0178), KDl (Coulter Immunotech reference 0813) and TA181.H12 (Coulter Immunotech reference 1844), respectively, - anti-CD3 ⁇ antico ⁇ s such as TIA-2 (Coulter Immunotech 66045P2),
  • anti-CD158 antico ⁇ s namely anti-p58.1 antico ⁇ s such as EB6 (Coulter Immunotech reference 1847), anti-p58.2 antico ⁇ s such as GL183 (Coulter Immunotech reference 1846) and anti-p50.3 antico ⁇ s such as PAX250 described in Bottino et al. (Eur. J. Immunol. 1996, 26, 1816),
  • an anti-Fc ⁇ RI ⁇ rabbit antiserum such as the antiserum 666 described in Jouvin M.H. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 5918-5925,
  • an anti-Fc ⁇ RI ⁇ rabbit antiserum such as the BC4 antiserum described in Bociano L.K. et al., 1986, J. Biol. Biochem. 261, 11823-1 1831,
  • GL183-PE Coulter-Immunotech 2278
  • EB6-Phycoerythrin EB6-PE
  • a goat anti-mouse-phycoerythrin immunoglobulin anti-mouse-PE
  • the lysis buffer contained 25 mM Tris-HCl pH 7.5; NaCl
  • the Thin Film Electrophoresis Buffer contained 10% glacial acetic acid and 1% pyridine in water; pH 3.5. Cells
  • Human NK cells from LDGL patients or LDGL cells Human NK cells from LDGL patients or LDGL cells:
  • Human NK cells were obtained from patients with lymphoproliferative disease of granular lymphocytes (LDGL, Lymphoproliferative Disease of Granular Lymphocytes) of the NK cell line CD56 + , CD16 + , CD3 " .
  • Peripheral blood lymphocytes PBL, Peripheral Blood Lymphocyte
  • PBL Peripheral Blood Lymphocyte
  • RPMI-1640 at 10 ⁇ g / ml of penicillin-streptomycin and 10% fetal calf serum, in the presence of irradiated allogeneic feeder cells and 100 U / ml of rLL-2.
  • FIG. 6 schematically represents the structure of KIR p58 receptors (human inhibitors of the immunoglobulin type) and of KAR p50 receptors (non-inhibitory counterpart of the KIR p58 receptors).
  • the RTILB cells used are the cells conventionally described as being RBL-2H3 cells transfected so as to express the murine Fc ⁇ RIIb2 receptor and the chimeric molecule CD25 / CD3 comprising the complete ecto- and trans-membrane domains of human CD25 linked to the complete intracytoplasmic domain of murine CD3.
  • RTI B cells were further transfected by electroporation of 183.Act2 cDNA (coding for p50.283) carried on the expression vector RSV-5gpt.
  • Stable RTILB.p50.2 + transfected cells were established by culture in the presence of xanthine (250 ⁇ g / 1), hypoxanthine (13.6 ⁇ g / 1) and mycophenolic acid (2 ⁇ g / 1).
  • the cytolytic activity of the LDGL cells cultured on LL-2 was measured relative to the murine cell line P815 (American Type Culture Collection) in the absence or in the presence of the anti-CD16, anti-CD158 and anti-CD56 mAbs.
  • the cells (10 - 50 x 10 6 ) were fixed with 0.5% formaldehyde in PB S (sodium phosphate buffer), then permeabilized for
  • the cells were lysed for 30 minutes at 4 ° C in digitonin lysis buffer.
  • the pre-purified post-nuclear supernatants were then immunoprecipitated using specific antibodies covering S4B-Sepharose beads (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) (Vivier E. et al., 1991, J. Immunol. 146 : 206).
  • the immunoprecipitates were analyzed by SDS-PAGE (protein resolution by gel electrophoresis and sodium dodecylsulfate) and autoradiography.
  • the cells (10 x 10 6 per sample) were lysed in 1 ml of lysis buffer (see reagents).
  • the prepurified post-nuclear supernatants were immunoprecipitated for 2 to 3 hours using monoclonal antibodies linked covalently to a Sepharose 4B activated by CnBr (Pharmacia).
  • the immune complexes were washed three times in lysis buffer; 40 ⁇ l of kinase buffer (see reagents) were then added to the immunoprecipitates for 10 minutes at 37 ° C.
  • the kinase reaction was stopped by adding SDS-sample reducing buffer.
  • the samples were brought to the boil before analysis by SDS-PAGE and autoradiography. In some experiments, the samples were analyzed by two-dimensional non-denaturing / denaturing diagonal SDS-PAGE.
  • the phosphorylated proteins were excised from the dried gels and were eluted using a Centrilutor (Amicon) or a solution of SDS (sodium dodecyl sulfate) in 0.1%. PBS (sodium phosphate buffer). The Eluted proteins were precipitated in 20% trichloroacetic acid at 4 ° C for 2 hours, prior to incubation in 200 ⁇ l of 5.7 M HCl at 110 ° C. for 90 minutes.
  • the immunoprecipitates were resolved by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose filters and compared with anti-CD3 ⁇ or anti-FC ⁇ RI ⁇ probes diluted in a solution of PB S at 5% in dehydrated skimmed milk.
  • the immunotransferts were revealed using an anti-mouse or anti-rabbit goat antiserum conjugated with horseradish peroxidase (Sigma references A-2304 and A-0545 respectively) and the ECL detection system marketed by Amersham (RPN 2209).
  • NK cells from LDGL patients and cultured on LL-2 interleukin-2
  • FACScan sorting of fluorescently activated cells
  • FIG. 1A an analysis by FACScan in indirect immunofluorescence of LDGL cells (lymphoproliferative disease of granular lymphocytes) RP, DF or MAL is presented. grown on LL-2.
  • a goat anti-mouse immunoglobulin conjugated to fluorescein isothiocyanate served as the second step reagent.
  • LDGL RP cells for the analyzes presented in the upper horizontal band
  • LDGL DF cells for those in the middle horizontal band
  • LDGL MAL cells for those in the lower horizontal band
  • control treatment C for the graphs presented on the left or treatment with the indicated monoclonal antibody, either from left to right
  • anti-CD3, anti-CD16, anti-CD158 EB6, anti-CD158 GL183, anti-CD158 PAX 250 are plotted, on the abscissa, the fluorescence intensities and, on the ordinate, the relative number of cells.
  • - NK RP, DF and MAL cells are all CD3 " and CD16 + ,
  • - NK R cells are p50.1 + , p50.2 “ , p50.3 “ : they are recognized by the anti-CD158 EB6 monoclonal antibodies and are not recognized by the anti-CDl 58 GL183 and PAX250 monoclonal antibodies,
  • the NK DF cells are p50.1 " , p50.2 + , p50.3 " : they are recognized by the anti-CDl 58 GL183 monoclonal antibodies and are not recognized by the anti-CDl 58 EB6 and PAX250 monoclonal antibodies ,
  • - NK MAL cells are p50.1 " , p50.2 ⁇ p50.3 + : they are recognized by the anti-CDl 58 PAX250 monoclonal antibodies and are not recognized by the anti-CDl 58 EB6 and GL183 monoclonal antibodies.
  • NK cell lymphoproliferation recognized by anti-CDl 58 antibodies anti-KTR p58.1 (EB6), anti-KTR p58.2 (GL183) and anti-KAR p50.3 (PAX250) respectively.
  • Three groups of NK cells were thus defined: LDGL RP cells, LDGL DF cells and LDGL MAL cells.
  • NK cells from the donors indicated (RP. P50.1 + on the left, DF p50.2 + in the center, or MAL p50.3 + on the right) and cultured on LL-2 were used as effector cells.
  • the test was carried out in the presence of: no antico ⁇ s (white circles), monoclonal anti-CDl 6 antico ⁇ s (black triangles), anti-CD56 monoclonal antico ⁇ s (white triangles), anti-CDl 58 monoclonal antico ⁇ s (EB6 for RP, GL183 for DF and PAX250 for MAL.) (Black circles).
  • target cell ratios E: T ratio: 8: 1; 4: 1; 2: 1; 1: 1; 0.5: 1; 0.25: 1 and, on the ordinate, the percentage of specific lysis, (scale from 0 to 120%).
  • the re-directed cytotoxicity tests indicate that, by contrast with what is observed during stimulation of KIR receptors, the addition of anti-CDl 58 antibodies to NK cells considerably increases the cytolysis of P815 cells ( Figure 1B) .
  • the anti-CDl 6 monoclonal antibodies increase the spontaneous cytolysis of P815 in a similar way to the anti-CDl 58 monoclonal antibodies, while an anti-CD56 monoclonal antibody paired with the isotype has no effect (Figure 1B).
  • NK cells therefore express on their surface KARs, the activating isoform of KIRs.
  • LDGL LDGL were analyzed by internal radioiodination followed by immunoprecipitation. The results are illustrated in Figure 2A where an analysis is presented
  • the immunoprecipitates of anti-CDl 58 antico ⁇ s prepared from lysates of NK cells contain, in addition to the KARs observed at ⁇ 50 kDa, a band of lower molecular mass migrating at 12
  • KARAPs KAR-associated proteins, proteins associated with KARs
  • FIG. 2B results, obtained in the presence of anti-CD3 ⁇ antico ⁇ s, are illustrated in FIG. 2B where an analysis of complete lysates of DF cells or of immunoprecipitates of such lysates is presented by SDS-PAGE resolution on 15% gel under denaturing conditions and incubation of the nitrocellulose filters with an anti-CD3 ⁇ monoclonal antico ⁇ s probe (marking arrow on the right).
  • the complete cell lysates (LCC) DF were deposited at 5 x 10 6 cells / lane in track 1, the immunoprecipitates of such lysates at 15 x 10 6 cells / lane in tracks 2 to 4.
  • the immunoprecipitations were carried out on DF cell lysates using the anti-Fc ⁇ RI ⁇ BC4 monoclonal antibody in control lane 2, the anti-CDl 6 monoclonal antibody in lane 3 and the anti-CDl 58 monoclonal antico 58s GL183 in lane 4.
  • KARs are associated with predominantly low molecular weight phosphoprotein migrating at around 14 ⁇ 1 kDa in NK cells.
  • FIG. 3A lysates prepared from NK MAL cells. were immunoprecipitated with the indicated antico ⁇ s (anti-Fc ⁇ RI ⁇ in track 1, anti-CD16 in track 2, anti-CD168 in track 3) prior to in vitro kinase tests.
  • the phosphorylated proteins were separated by SDS-PAGE on a 15% gel under denaturing conditions.
  • the immunoprecipitates of anti-CDl 58 mAbs prepared from NK KAR + cells comprise two other phospho- KARAPs, migrating at 16 ⁇ 1 kDa and 12 + 1 kDa respectively (indicated by an asterisk on either side of the KARAP deflection at 14 kDa in Figure 3A).
  • the association of KARs with a similar group of phosphorylated KARAPs was also observed with a panel of clones of NK KAR + cells and was absent from NK KLR + clones.
  • FIG. 3C The results are illustrated in FIG. 3C: the KARAPs (left) and CD3 ⁇ (right) bands were excised after kinase test in vitro and subjected to an analysis of the phophorylated amino acids by thin layer electrophoresis.
  • the KARAPs and CD3 ⁇ bands were isolated from immunoprecipitates of monoclonal antico ⁇ s, respectively, anti-CDl 58 and anti-CD16 prepared from lysates of NK cells. RP.
  • phosphorylation at the level of serine residues but not at the level of threonine residues can also be detected.
  • the analysis of phophorylated amino acids confirmed the phosphorylation of CD3 ⁇ at the level of the tyrosine residue only.
  • the in vitro kinase tests carried out on the immunoprecipitates of anti-CD1 58 monoclonal antico ⁇ s prepared from transfectants of RBL-2H3 p50.2 + cells did not include any detectable KARAP.
  • FIG. 3B lysates prepared from RBL-2H3 p50.2 + cells were immunoprecipitated with the indicated antico ⁇ s (anti-CD3 ⁇ in track 1, anti-Fc ⁇ RI ⁇ in track 2, anti-CDl 58 lane 3) prior to in vitro kinase tests.
  • the phosphorylated proteins were separated by SDS-PAGE on a 15% gel under denaturing conditions.
  • KARAPs therefore associate selectively with KARs, and the absence of association of KARs with KARAPs is correlated with the inability of KARs to transduce any detectable activating signal.
  • KARs autonomous activating receptors, in particular for MHC class I molecules, or co-receptors for TCR (T lymphocyte receptor) or RFc (receptor for constant fragment of immunoglobulin), represent a new pathway for activation.
  • KARs are in fact assembled in NK cells into a multimeric complex involving associated KARAPs in the form of dimers linked by disulfide bond.
  • the radioiodination analysis revealed a KARAP at approximately 12 ⁇ 1 kDa
  • the kinase test analysis revealed three phospho-KARAPs at approximately 16, 14 and 12 ⁇ 1 kDa.
  • the correlation between the association of KARs with KARAPs and the activating function of KARs suggests that KARAPs act as transducing subunits of the multimeric KAR complex.
  • activating, or at least non-inhibiting, receptors for the immunoglobulin superfamily show striking similarities to p50 KARs (human immunoglobulin-type KARs): human KAR lectin-type NKG2C / D receptors, murine KAR receptors immunoglobulin pir A type, gp49A, murine KAR receptors of the lectin type Ly49D, Ly49H, but also human activating receptors of the LIR / MIR / LLT family such as LLT 1.
  • FIG. 5 presents the activating or non-inhibiting receptors of the immunoglobulin superfamily (IgSF) or of the lectin type, and their inhibiting counterparts.
  • IgSF immunoglobulin superfamily
  • FIG. 5 presents the activating or non-inhibiting receptors of the immunoglobulin superfamily (IgSF) or of the lectin type, and their inhibiting counterparts.
  • mPIR-B-mPIR-A, LLT2-LLT1, SIRP ⁇ -SIRP ⁇ , KTR-KAR, Fc ⁇ RITB- Fc ⁇ PJII, NKG2A / B-NKG2C / D, mLy49A / B / C / E / F / G / I-mLy49D / H) the cells expressing them naturally are indicated.
  • TM transmembrane domain
  • R arginine
  • K lysine
  • D aspartic acid
  • E glutamic acid
  • the inhibitory counterparts include an ITLM motif in their intracytoplasmic (IC) part.
  • Each activating or non-inhibiting receptor exhibits, at the extracytoplasmic (EC) level, a strong homology with its inhibiting counterpart.
  • EXAMPLE 2 The biochemical characterization of the KARAPs molecules (cf. example 1 above) has enabled us to specify the main identification criteria for the KARAP polypeptides, and in particular: - polypeptides comprising an amino acid cysteine extracytoplasmic, allowing the formation of disulfide bridges (cf. Figure 4)
  • KARAPs a major characteristic of KARAPs lies in their selective association with KARs, and not with KIRs. Since, unlike KIRs, KARs have a transmembrane charged amino acid (lysine: K), and this characteristic is also at the basis of the association of polypeptides with ITAM present in the CD3 / TCR, BCR, Fc ⁇ RI complexes and Fc ⁇ RLLLA (CD 16), we oriented our strategy for identifying the KARAP gene by considering that KARAP is a new member of the family of ITAM transmembrane polypeptides. The latter indeed share with KARAP the same characteristics: -polypeptides comprising an amino acid cysteine extracytoplasmic
  • FIG. 7 represents the DNA sequence (SEQ LD no. 1 cDNA) of a KARAP polypeptide according to the invention; this sequence corresponds to the sequence of the mouse KARAP gene.
  • FIG. 8 where the part of the nucleotide sequence of the KARAP gene (SEQ LD No. 1) which is between the leader sequence (excluded) and the stop codon is represented, and where is also represented, in below this nucleotide sequence, the corresponding amino acid sequence (1 letter code) (SEQ LD No. 2, 3 letter code), that is to say the amino acid sequence of the mouse KARAP protein mature according to the invention (SEQ LD n ° 2).
  • the extracytoplasmic part comprises at least one amino acid cysteine (in fact two, C8 and ClO), a transmembrane amino acid (D25), and an intracytoplasmic ITAM (Y65QELQGQRHEVY76SDL).
  • FIG. 9 illustrates the comparisons that can be made by alignment of sequences between the polypeptides with ITAMs previously described and the polypeptides according to the invention having one (or) ITAM motifs, and indicates the resulting consensus ITAM sequence:
  • FIG. 9 represents the alignment of the ITAMs of polypeptides with ITAM (six CD3, one Ig ⁇ , one Ig ⁇ , Fc ⁇ RI ⁇ and Fc ⁇ RI ⁇ ) and of an ITAM motif of the murine KARAP polypeptide (SEQ ID No. 2) identified above according to the invention (indicated "KARAP" in this FIG. 9) .
  • KARAP is a new molecule transmembrane with ITAM which s associates with KAR and which, in a phosphorylated tyrosine form, associates with ZAP-70.
  • KARAP is therefore a new transduction element for T and NK lymphocytes. It is possible that KARAP or analogs of KARAP also associate with the activating isoforms of the ITLM receptors, and serve in these multimolecular complexes as a subunit of transduction of the signals emitted during the engagement of the receptor.
  • a particularly suitable method for determining or checking that a candidate polypeptide, the sequence of which is known, corresponds to a KARAP protein according to the invention consists in producing an antico ⁇ s against a characteristic part of this candidate polypeptide (for example a region intracytoplasmic comprising at least one ITAM motif or an extracytoplasmic region), and to verify that this antico ⁇ s recognizes, on a functional cell, a functional KAR + cell for example, a target which is associated with the receptor for which the candidate polypeptide is supposed to be KARAP (that is to say, in the case of KAR + cells, to verify that the antibody recognizes a target which is associated with a KAR receptor).
  • a characteristic part of this candidate polypeptide for example a region intracytoplasmic comprising at least one ITAM motif or an extracytoplasmic region
  • This method of identifying KARAP polypeptides according to the invention thus consists in particular in:
  • the candidate polypeptide as being a KARAP polypeptide according to the invention when in the reaction products possibly formed there is a product of apparent molecular mass close to that of a KAR (approximately 50 kDa) and im product of close apparent molecular mass that of the candidate polypeptide in particular between 10 and 16 kDa approximately).
  • This identification method according to the invention can in particular be carried out:
  • KARAP KARAP. These are EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 and
  • FIGS. 10A to 14A illustrate the cDNA sequences, respectively, of ESTs AA242315, AA734769, W88159, respectively, AA098506 and W41142 (SEQ ID No. 6 to SEQ ID No. 10 respectively).
  • FIGS. 10B to 14B illustrate the protein sequences corresponding, respectively, to these ESTs (SEQ LD No. 11 to SEQ LD No. 15 for the proteins of ESTs AA242315, AA734769, W88159, AA098506 and W41142 respectively). All of these ESTs were obtained from tissues originating from C57B1 / 6 mice and were aligned in order to obtain a cDNA sequence corresponding to an open reading frame. This is illustrated by FIG. 15 which represents the alignment of the sequences of ESTs AA098506 (SEQ LD n ° 9),
  • FIG. 16 represents the alignment of the protein sequences of ESTs AA242315 (SEQ LD n ° ll), W88159 (SEQ LD n ° 13), W41142 (SEQ LD n ° 15), AA098506 (SEQ LD n ° 14) and AA734769 (SEQ LD n ° 12), and which represents the resulting consensus sequence (murine consensus KARAP protein, SEQ LD n ° 17).
  • the symbol ".” indicates an identity with the consensus sequence considered, the symbol "-" indicates the absence of sequencing data.
  • a library (phage lambda, EMBL3) of genomic DNA isolated from mice of mouse line 129 was screened with cDNA corresponding to the sequence of EST AA734769 according to a conventional technique. A phage containing an 18 kb fragment was identified as positive. A mapping of this phage by cleavage with a series of restriction enzymes was carried out and a 9 kb EcoRI-EcoRI fragment obtained from the phage was cloned into the cloning vector pBlue-Script and contains the entire KARAP gene. murine (from the initial ATG to the STOP sequence). The sequence of this murine KARAP gene is presented in FIG. 17 (SEQ LD n ° 18; 2838 bp). In addition, oligonucleotide primers were generated in order to obtain the genomic organization of murine KARAP. The primers used are presented in table 1 below (SEQ LD n ° 19 to SEQ LD n ° 26): Board
  • Exon 1 codes for an N-terminal portion of the signal sequence
  • exon 2 codes for the rest of the signal sequence and the first three amino acids of the extracytoplasmic part
  • exon 3 codes for the rest of the extracytoplasmic part
  • exon 4 codes for 14 amino acids of the intracytoplasmic part
  • exon 5 codes for the rest of the protein.
  • ITAM polypeptide such as KARAP
  • ITAM is encoded by two exons (exon 4 and 5) separated by a type 0 intron. 3 ° Functional reconstruction of a KAR (p50.2) expressed in the RBL-2H3 by the human KARAP DAP-12.
  • RNA extracted from human NAR KAR + clones served as the basis for the generation of this cDNA.
  • This cDNA was cloned into the eukaryotic expression vector pNT-neo and stable transfectants for this human KARAP were generated in the KAR + transfectant (p50.2) of the RBL-2H3 cell line (Bléry et al, J. Biol. Chem., 1997).
  • the capacity of the KAR receptors expressed on the RBL-2H3 cells thus doubly transfected p50.2 + and KARAP + , to transduce an activating signal was tested by stimulation using antibodies directed against the extracytoplasmic part of p50.2 and following the release of tritiated serotonin.
  • FIG. 23 illustrates the homology between the organization of the human KARAP gene and that of the murine KARAP gene (E1 to E5: exon 1 to exon 5; II to 14: intron 1 to intron 4). The numbering of the base pairs of the human and mouse KARAP gene is indicated there.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

La présente demande concerne de nouveaux moyens permettant de diagnostiquer, prévenir, pallier, traiter un fonctionnement anormal ou non désiré de récepteurs KAR (Killer cell Activatory Receptor), contreparties non inhibitrices de récepteurs KIR (Killer cell Inhibitory Receptors) de type immunoglobuline ou de type lectine. Elle est notamment relative à de nouveaux polypeptides KARAP (KAR-Associated Proteins) et à leurs applications biologiques. Un polypeptide KARAP, selon l'invention, est naturellement associé à un récepteur KAR, et en l'absence d'un tel KARAP, ledit récepteur KAR est naturellement incapable de transduire un signal activateur détectable. La présente demande vise également des méthodes d'obtention ou d'identification de tels polypeptides KARAP.

Description

POLYPEPΗDES ASSOCIES A DES RECEPTEURS ACΗVATEURS ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES
L'invention porte sur de nouveaux polypeptides particuliers capables de transduire un signal provenant d'un récepteur activateur pour des molécules du CMH de classe I, fonctionnant en tant que récepteur autonome ou en tant que co-récepteur, et d'un KAR (Killer-cell Activatory Receptor) en particulier, sur les anticorps obtenus à partir desdits polypeptides servant d'immunogènes, et sur les acides nucléiques correspondant auxdits polypeptides.
L'invention porte également sur les procédés d'obtention de tels polypeptides et sur les applications biologiques, plus particulièrement, préventives, thérapeutiques et diagnostiques, desdits polypeptides, anticorps et acides nucléiques. Pour maintenir la cohérence et assurer l'intégrité de l'organisme, le système immunitaire doit mettre en jeu un système coordonné de communications intercellulaires.
Différents types de récepteurs interviennent dans ces communications. Trois d'entre eux, à savoir les récepteurs pour l'antigène des lymphocytes B (BCR), les récepteurs pour l'antigène des lymphocytes T (TCR) et les récepteurs reconnaissant la portion Fc des anticorps (RFc), sont maintenant bien décrits et leurs différentes structures relativement bien connues.
D'autres récepteurs qui ne sont ni récepteurs pour antigènes, ni récepteurs pour anticorps ont été décrits mais leurs structures et mécanismes d'action sont encore mal connus.
Il s'agit de récepteurs pour des molécules du CMH (Complexe Majeur dΗistocompatibilité) tels que les KARs (Killer cell Activatory Receptors) et leur contrepartie inhibitrice, les KLRs {Killer cell Inhibitory Receptors). KARs et KIRs ne sont pas limités aux cellules NK : ils sont également naturellement exprimés par des cellules T.
Les KARs sont hautement homologues aux KIRs (jusqu'à 96% d'homologie entre KARs et KIRs au niveau extracytoplasmique). KARs et KIRs n'assurent cependant pas les mêmes fonctions : les
KIRs sont impliqués dans le contrôle négatif (inhibiteur) de l'activation des cellules NK et T, alors que les KARs sont impliqués dans le contrôle positif (stimulateur) de l'activation des cellules NK et T.
Des différences majeures au niveau des domaines trans- et intracytoplasmiques ont pu être mises en évidence entre isoforme activatrice (KAR) et isoforme inhibitrice (KIR).
En effet, contrairement aux KIRs, les KARs expriment un résidu acide aminé chargé (lysine) dans leur domaine transmembranaire et ne contiennent aucun motif ITLM (motif d'inhibition d'immunorécepteur basé sur résidu(s) tyrosine) dans leur domaine intracytoplasmique. Les récepteurs monomériques KARs ne contiennent pour autant pas de motif ITAM (motif d'activation d'immunorécepteur basé sur résidu(s) tyrosine).
La situation observée pour les KARs, récepteurs activateurs pour les molécules du CMH, et membres de la IgSF (superfamille des immunoglobulines), à savoir récepteur activateur, contrepartie d'un récepteur inhibiteur à ITLM, ne présentant lui-même ni ITLM, ni ITAM mais présentant un acide aminé chargé (lysine, arginine, acide aspartique, acide glutamique) transmembranaire, peut être observée pour d'autres types de récepteurs. Il en est ainsi des récepteurs activateurs (ou à tout le moins non inhibiteurs) pour les molécules du CMH, tels que NKG2C/D (qui est du type lectine et dont la contrepartie inhibitrice est NKG2A/B), mais aussi pour d'autres récepteurs non inhibiteurs, tels que SIRP β et LLT 1, dont les ligands sont encore inconnus et qui ont été décrits soit des cellules hématopoïétiques et sur des cellules non-hématopoïétiques (SIRP β), soit sur des cellules B, macrophages et cellules dendritiques (ILT1).
Les KARs peuvent fonctionner en tant que récepteurs autonomes, notamment pour des molécules du CMH de classe I. On sait ainsi que l'engagement des KARs avec des molécules du CMH de classe I exprimées sur la surface de cellules cibles, initie les programmes d'activation lymphocytaires tel qu'il a été établi du fait de la mobilisation du Ca2+ intracytoplasmique et de l'induction de la lyse des cellules cibles.
Outre leurs fonctions de récepteurs autonomes pour des molécules du CMH, les KARs peuvent également assurer des fonctions co-réceptrices pour des récepteurs TCR et RFc (Mandelboim O. et ai, 1996, Science 274:2097 ; Cambiaggi A. et al., 1996, Blood 87:2369).
En effet, lors de la reconnaissance de fragments constants (Fc) d' immunoglobulines G (IgG) par des récepteurs tels que CD16 (RFcγLTJ.), et lors de la reconnaissance d'antigènes par le complexe CD3/TCR restreint par des molécules du CMH de classe I ou II, les KARs peuvent jouer le rôle de co-récepteurs et ainsi augmenter l'intensité de la réponse cellulaire, en particulier face à de petites quantités d'antigènes, maintenir la réponse cellulaire dans le temps, et également coopérer à la stimulation de la prolifération cellulaire.
Le rôle des KARs, naturellement exprimés sur des sous-populations lymphocytaires NK et T, n'est pas restreint par leurs ligands propres, à savoir les molécules du CMH de classe I, mais s'étend à l'équilibre du système immunitaire de manière générale. Le fonctionnement des KARs naturellement exprimés influe ainsi sur la prolifération de cellules NK et T, la production par de telles cellules de substances de type cytokines, la lyse de cellules cibles telles que cellules autologues délétères, malignes ou infectées par des virus, cellules allogéniques, mais aussi sur la tolérance du système immunitaire face à certains antigènes.
Tout non- ou dys-fonctionnement des KARs peut donc conduire à différentes pathologies ou réactions indésirées, toutes liées au fonctionnement du système immunitaire, telles que maladies d'immuno-déficience, maladies auto-immunes (e.g. sclérose en plaque), tumeurs, infections virales, bactériennes, parasitaires, allergies, rejets de greffe. Il a, par exemple, été montré que si l'homme ne présente en moyenne que moins de 10% de lymphocytes exprimant des KARs, la quasi-totalité des lymphocytes de patients atteints de LDGL (maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires) exprime des KARs.
La présente invention a pour but de fournir des moyens permettant de diagnostiquer un fonctionnement anormal ou non désiré de récepteurs activateurs pour des molécules du CMH de classe I tels que les KARs et d'en contrôler le fonctionnement.
L'invention a ainsi pour objet de nouveaux polypeptides, ci-après désignés KARAP (KAR-Associated Proteins), qui sont nécessaires à la transduction d'un signal provenant d'un KAR, ainsi que les anticorps et acides nucléiques obtenus à partir desdits nouveaux polypeptides. Elle a également pour objet un procédé d'obtention desdits nouveaux polypeptides ainsi que leurs applications biologiques.
Par "récepteur KAR", nous entendons, dans la présente, les récepteurs humains de type immunoglobuline contreparties non inhibitrices des récepteurs KIR, tels que les récepteurs KAR p50 (KTRTLOS1 à TRILDS5), KTRIILDSl, mais également tout récepteur non inhibiteur de structure similaire à ces récepteurs KAR, et notamment les récepteurs humains de type lectine tels que NKG2C, NKG2D (naturellement exprimés sur des cellules NK et T), les récepteurs murins de type immunoglobuline tels que pir A (naturellement exprimés sur des cellules myéloïdes, des cellules B), gp49A (naturellement exprimés sur des mastocytes), les récepteurs murins de type lectine tels que Ly49D, Ly49H (naturellement exprimés sur des cellules NK et T).
Nous entendons donc par polypeptide KARAP tout polypeptide isolé (autre qu'un KAR) en l'absence duquel ledit récepteur KAR est naturellement incapable de transduire un signal activateur détectable. Ceci n'exclut pas le fait qu'un polypeptide KARAP déterminé puisse non seulement s'associer à un récepteur KAR tel que ci-dessus défini, mais également à d'autres récepteurs monomériques activateurs ou non inhibiteurs de structure proche de celle des KAR tels que ci-dessus défini, et notamment à un récepteur activateur humain de type immunoglobuline de la famille LIR/MIR/LLT tel que LLT1.
Le terme "polypeptide" comprend, dans la présente demande, non seulement ledit polypeptide, mais également les homologues de ce polypeptide, tels qu'obtenus par délétion, insertion, inversion ou substitution conservatrice d'acides aminés, et les fragments de ce polypeptide, tels qu'obtenus par hydrolyse dudit polypeptide à l'aide de protéases, lesdits homologues ou fragments étant capables de transduire un signal provenant d'un KAR. Ce terme "polypeptide" couvre, dans la présente demande, aussi bien des polypeptides que des protéines.
Un polypeptide selon l'invention est nécessaire à la transduction du signal reçu par un récepteur KAR : il s'agit donc d'un polypeptide isolé qui permet la restauration d'une activation KAR déficiente. Pour déterminer si un polypeptide isolé donné permet la restauration d'une activation KAR déficiente, l'homme du métier peut procéder en montrant qu'il existe un récepteur KAR qui, si il est exprimé par une cellule appropriée en l'absence de ce polypeptide, ne parvient pas à transduire un signal activateur détectable, ou ne parvient pas à transduire un signal activateur satisfaisant pour l'application visée. Un mode de réalisation de cette détermination est présenté dans l'exemple 3 ci-après par comparaison entre la capacité d'activation (relargage de sérotonine) d'une cellule RBL-2H3 exprimant le récepteur KAR p50.2 seul, et celle d'une cellule RBL-2H3 qui exprime à la fois le récepteur KAR p50.2 et son polypeptide KARAP. Des exemples de cellules appropriées sont présentées en figure 5 ci-après.
Par "activation KAR déficiente restaurée", nous entendons que la transduction, à la cellule, par ledit KAR d'un signal activateur significatif est possible, ou, le cas échéant, satisfaisante. Ceci peut être testé notamment à l'aide d'une stimulation cellulaire par des anticorps. Pour déterminer au niveau d'une cellule si un signal provenant d'un
KAR est ou non transduit, et pour déterminer si un tel signal est stimulé ou inhibé, de nombreux moyens sont à la disposition de l'homme du métier. Des exemples de tels moyens incluent la stimulation dudit KAR par un ligand et la mesure des cytokines sécrétées (cf. par exemple, Cambiaggi et al. 1996, Blood 87:2369), de la prolifération cellulaire (cf. par exemple Mandelboim et al. 1996, Science 274:2097), de la cytotoxicité (cf. par exemple le test de cytotoxicité redirigée ci-après décrit), de la mobilisation du calcium intracytoplasmique (cf. par exemple Bléry et al, 1997, J. Biol. Chem. 272, 8989-8996), et/ou de l'induction de phosphorylation (cf. par exemple Vivier et al. 1991, J. Immunol. 146:206).
Un polypeptide selon l'invention est en outre caractérisé en ce qu'il est capable de s'associer à un KAR, et de ne pas s'associer à la contrepartie inhibitrice de ce KAR.
Des méthodes permettant de déterminer si un polypeptide est capable de s'associer à un KAR, et de ne pas s'associer à la contrepartie inhibitrice de ce KAR (c'est-à-dire de ne pas s'associer au récepteur KIR correspondant), sont bien connues de l'homme du métier. Un exemple d'une telle méthode comprend notamment : - faire exprimer ce polypeptide à une cellule KAR+ KIR" d'une part, et à une cellule KAR- KTR+,
- à immunoprécipiter une ou plusieurs fraction(s) polypeptidique(s) à partir du lysat de ces cellules à l'aide d'au moins anticorps anti-KAR et/ou anti-KTR,
- à observer la présence dudit polypeptide dans la ou les fraction(s) issues de la cellule KAR+ KTR", et l'absence de ce même polypeptide dans la ou les fractions issues de la cellule KAR" KIR+. Des exemples d'anticorps anti-KTR et/ou anti-KAR comprennent les anticorps anti-CD158, anti- p70/NKBl, anti-pl40, et plus particulièrement les anticorps monoclonaux EB6, GL183 ou PAX250. Une méthode permettant de faire exprimer un tel polypeptide par une cellule est indiquée dans l'exemple 3 ci-dessous.
Un polypeptide KARAP selon l'invention peut par ailleurs être caractérisé en ce qu'il est tel qu'obtenu : i. par immunoprécipitation d'une ou plusieurs fraction(s) polypeptidique(s) de lysats de cellules exprimant des récepteurs KAR capables de transduire un signal activateur à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KTR et/ou anti-KAR, tel(s) qu'un anticorps anti-CD158, anti-ρ70/NKBl, anti-pl40, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, ii. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuisée par élimination des fractions immunoprécipitées à l'aide d'anticorps anti-CD3ζ et/ou anti-FcεRIγ, et/ou être à nouveau précipitée à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KTR et/ou anti-KAR tel(s) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKBl, anti-pl40, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire, et récupération des polypeptides correspondant à un poids moléculaire de 12 ± 2 kDa environ, ou bien par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fraction polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite (lesdites) fraction(s) polypeptidique(s) à un test kinase, et récupération des polypeptides phosphorylés correspondant à un poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 ± 2 kDa environ. Le test kinase peut être réalisée tel que ci-après décrit dans les exemples (cf. matériel et méthodes de l'exemple 1 ci-après).
Lesdites cellules exprimant des récepteurs KAR capables de transduire un signal activateur peuvent notamment être des cellules NK et/ou des cellules T et/ou des cellules myéloïdes et/ou des cellules B et/ou mastocytes.
Des moyens pour déterminer si un KAR est capable ou non de transduire un signal à la cellule ont été ci-avant indiqués.
Un polypeptide KARAP selon la présente invention est en outre caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés :
- présente au moins un acide aminé tyrosine phosphorylable,
- présente une masse moléculaire comprise entre 10 + 2 et 16 + 2 kDa environ (notamment, masse moléculaire réelle de 10 + 2 kDa, masse moléculaire apparente sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes de l2 + 2 à l6 + 2kDa selon le degré de phosphorylation).
Il est en outre caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés comporte au moins un motif ITAM YxxL/Ix<5.8YxxL/I en région intracytoplasmique .
Selon un aspect de l'invention, la séquence en acides aminés d'un polypeptide KARAP comporte une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et/ou une région entracytoplasmique. De manière caractéristique, cette région intracytoplasmique est majoritaire relativement aux autres régions de la séquence de ce polypeptide. Des moyens pour identifier les régions extracytoplasmiques, transmembranaires, intracytoplasmiques sont connus de l'homme du métier (par exemple, algorithmes d'hydropathicité, formation de vésicules inversées).
Selon un autre aspect de l'invention, la séquence en acides aminés d'un polypeptide KARAP comporte au moins un acide aminé cystéine extracytoplasmique.
Selon encore un autre aspect de l'invention, la séquence en acides aminés d'un polypeptide KARAP, comporte au moins un acide aminé chargé (R, K, D, E) transmembranaire.
Les polypeptides selon l'invention peuvent être phosphorylés au niveau d'au moins un résidu tyrosine, ou être non phosphorylés.
Dans une forme de réalisation selon l'invention, lesdits polypeptides se présentent sous la forme de dimères liés par un pont disulfure ; ils s'associent de manière sélective et non covalente à des KARs qui fonctionnent, soit en tant que récepteurs autonomes pour des molécules du CMH de classe I, soit en tant que co-récepteurs du TCR ou d'un RFc tel que CD16.
Selon un aspect avantageux de l'invention, un polypeptide KARAP est capable de se lier à une molécule à domaine SH2 telle que ZAP-70, p72^, p56 , p59^, p60/w, Grb-2, pp36-38 (lat), PLC-αl, p85 (PI-3 kinase), Shc, ou à une molécule à domaine PTB (PhosphoTyrosine Binding) telle que Shc. Une telle liaison peut être observée par incubation de polypeptides selon l'invention avec des molécules à domaine SH2 ou PTB et mesure de la résonance de plasmons (Olcese et al. 1996, The Journal of Immunology 156:4531-4534). Un polypeptide KARAP particulier selon l'invention présente une séquence en acides aminés essentiellement constituée par la SEQ ID n°2. La présente invention vise également les polypeptides dont la séquence est essentiellement constituée par la partie extracytoplasmique de la SEQ LD n°2, à savoir la SEQ ID n°3, ou par la partie transmembranaire de la SEQ LD n°2, à savoir la SEQ ID n°4, ou la partie intracytoplasmique de la SEQ LD n°2, à savoir la SEQ ID n°5. D'autres polypeptides KARAP particuliers selon l'invention présentent une séquence en acides aminés essentiellement constituée par la SEQ ID n°l l, n°12, n°13, n°14, n°15, n°17 (séquence consensus de la protéine KARAP de souris C57B1/6), ou n°28 (séquence protéique de la KARAP de souris 129 obtenue à partir de la séquence génomique).
De tels polypeptides peuvent également être obtenus, après séquençage, par synthèse cliimique ou à l'aide des techniques d'ADN recombinant.
Lesdits polypeptides KARAPs sont nécessaires à la transduction de signaux provenant de récepteurs activateurs, les KARs, qui ne présentent ni ITEVI ni ITAM intracytoplasmiques mais qui présentent un résidu acide aminé transmembranaire. Selon une disposition avantageuse, les polypeptides selon l'invention sont modifiés par glycosylation, phosphorylation, sulfonation, biotinylation, acylation, estérification, ou par addition, substitution, suppression d'entités de forme moléculaire proche de celle des groupes phosphate, telles que le phosphonate, par addition de réactifs de marquage tels que la luciférase, la GFP (Green Fluorescence Protein) ou ses analogues, par addition de cibles de purification telles qu'un ligand d'affinité, par addition d'entités modifiant sa solubilité. Des modifications d'intérêt particulier comprennent celles qui modifient ledit polypeptide de telle sorte à bloquer ou inhiber sa capacité à transduire le signal reçu (stratégie du transdominant négatif). Un polypeptide selon l'invention, sous une forme ainsi modifiée, trouve notamment des applications dans toute composition ou méthode destinée à moduler de manière négative (inhiber) une réponse immunitaire donnée, notamment une réponse immunitaire non désirée ou anormale (par exemple, maladies auto- immunes, allergies, rejet de greffe). Des modifications ainsi appropriées comprennent celles qui rendent la phosphorylation sur tyrosine dudit polypeptide non hydrolysable dans des conditions biologiques (par exemple, par addition de groupes phosphonates). Elles comprennent également celles qui rendent non fonctionnel un résidu aminoacide critique au fonctionnement d'un polypeptide selon l'invention : par exemple, par substitution ou mutation d'un résidu tyrosine (Y), notamment un résidu tyrosine contenu dans un motif ITAM, en un résidu phénylalanine (F), ce qui empêche la liaison dudit polypeptide ainsi modifié à une protéine à domaine SH2 ou PTB.
Selon une autre disposition avantageuse, les polypeptides de l'invention, leurs fragments, homologues, ou formes modifiées sont capables de traverser une membrane cellulaire, c'est-à-dire une bicouche lipidique.
La présente invention vise également les anticorps, notamment les anticorps monoclonaux, et les fragments de tels anticorps, en particulier les fragments Fc, Fv, Fab, F(ab)'2, CDR, tels qu'obtenus par immunogenèse à partir d'un polypeptide KARAP selon l'invention, ou tels qu'obtenus à partir d'un fragment, homologue ou forme modifiée d'un tel polypeptide.
Elle a en particulier pour objet des fragments de tels anticorps, en particulier fragment Fc, Fv, Fab, F(ab)'2, CDR, tels qu'obtenus par immunogenèse à partir d'un polypeptide dont la séquence est essentiellement constituée par la partie extracytoplasmique, intracytoplasmique, ou transmembranaire d'un tel polypeptide KARAP selon l'invention. Elle vise notamment de tels anticorps capables de reconnaître, selon une réaction du type antigène-anticorps, la SEQ LD n°2, la SEQ ID n°3, la SEQ LD n°4, la SEQ ID n°5, SEQ ID n°l l, SEQ LD n°12, SEQ ID n°13, SEQ ID n°14, SEQ LD n°15, SEQ LD n°17 et/ou SEQ LD n°28, ainsi que leurs fragments.
De tels anticorps sont obtenus par immunisation d'animaux, tels que lapins et souris, contre des polypeptides, fragments, homologues ou formes modifiées selon l'invention tels qu'essentiellement obtenus par élution de bandes électrophorétiques, par synthèse chimique ou par une technique de protéines de fusion solubles (GST), lesdits polypeptides, fragments, homologues ou formes modifiées étant optionnellement couplés à des immunogènes tels que l'ovalbumine.
Des anticorps monoclonaux sont alors produits par fusion hybridomale des cellules spléniques immunes, criblage et purification des surnageants de culture (Kôhler et Milstein, 1975, Nature 256, 495-497 ; Antibodies, a laboratory manual, 1988, Harlow and David Lane, Ed. Cold Spring Harbor laboratory).
A partir de ces anticorps, des dianticorps peuvent être générés selon des procédures standards. Lesdits fragments peuvent, si nécessaire, être insérés ou greffés à des structures humanisantes.
La présente invention vise également les acides nucléiques comprenant une séquence correspondant à la lecture en cadre ouvert, selon le code génétique universel et en tenant compte de la dégénérescence dudit code, de la séquence en acides aminés d'un polypeptide, fragment, ou homologue selon l'invention, ainsi que les variants qui présentent une homologie supérieure ou égale à 60% avec de tels acides nucléiques, et qui sont capables de coder pour une molécule transductrice d'un signal activateur provenant d'un KAR tel que ci-avant défini. Elle vise notamment tout acide nucléique dont la séquence ADN est essentiellement constituée par la SEQ LD n°l (ADNc de la protéine KARAP mature de séquence SEQ LD n°2), n°6, n°7, n°8, n°9, n°10, n°16 (séquence ADNc consensus du KARAP de souris C57B1/6), n°27 (séquence ADNc du KARAP de souris 129 obtenue à partir de la séquence génomique), n°18 (séquence génomique du KARAP de souris 129), ou n°31 (séquence ADNc du KARAP humain), ou par toute partie correspondant aux régions extra-, intra-cytopiasmique et/ou transmembranaires de ces séquences, ou par toute partie correspondant à un exon ou un intron de ces séquences. La présente invention vise également un procédé d'obtention d'un polypeptide selon l'invention comprenant les étapes : i. d'immunoprécipiter une ou plusieurs fraction(s) polypeptidique(s) de lysats de cellules exprimant des récepteurs KAR fonctionnels (cellules NK et/ou des cellules T et/ou des cellules myéloïdes et/ou des cellules B et/ou mastocytes par exemple) à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KIR et/ou anti-KAR, tel(s) qu'un anticorps anti-CD158, anti- p70 NKBl, anti-pl40, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6,
GL183 ou PAX250, ii. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuisée par élimination des fractions immunoprécipitées à l'aide d'anticorps anti-CD3 et/ou anti-FcεRIγ, et/ou être à nouveau précipitée à l'aide d'un ou plusieurs anticorps anti-KTR et/ou anti-KAR tel(s) qu'un anticorps anti-CD158, anti-p70/NKBl, anti-pl40, et plus particulièrement l'anticorps monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. de séparer les polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire et récupérer les polypeptides correspondant à un poids moléculaire de 12 ± 2 kDa environ, ou bien de séparer les polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite
(lesdites) fraction(s) polypeptidique(s) à un test kinase, et récupérer les polypeptides phosphorylés correspondant à un poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 ± 2 kDa environ.
La présente demande a également pour objet une méthode pour obtenir la séquence de polypeptides KARAP particuliers selon l'invention. Cette méthode, dont un exemple de réalisation est décrite dans l'exemple 2 ci-après
(stratégies bio-informatiques), comprend notamment le criblage de celles des séquences polypeptidiques qui répondent aux critères suivants : - la séquence présente au moins un acide aminé tyrosine phosphorylable,
- la séquence présente une masse moléculaire comprise entre 5 et 25 kDa environ, - la séquence comporte une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et une région intracytoplasmique,
- la séquence comporte au moins un acide aminé cystéine dans sa région extracytoplasmique,
- la séquence comporte au moins un acide aminé chargé (R, K, D, E) dans sa région transmembranaire, et
- la séquence comporte au moins un motif ITAM YXXL/IXÔ-SYXXL/I dans sa région intracytoplasmique,
- le polypeptide correspondant à la séquence sélectionnée devant être capable de s'associer à un KAR, et de ne pas s'associer au récepteur contrepartie inl ibitrice correspondant (KIR), comme ci-avant défini.
La présente demande a également pour objet une méthode pour déterminer ou contrôler si un polypeptide candidat correspond à un polypeptide KARAP selon l'invention. Un exemple de réalisation d'une telle méthode est présenté dans l'exemple 2 ci-après. Une telle méthode consiste à produire un anticorps contre une partie caractéristique de ce polypeptide candidat (par exemple une région intracytoplasmique comprenant au moins un motif ITAM ou une région extracytoplasmique), et à vérifier qu'il existe un récepteur KAR qui, lorsqu'il est exprimé de manière fonctionnelle sur une cellule, se trouve associé à un élément reconnu, selon une réaction de type antigène-anticorps, par ledit anticorps.
Cette méthode, selon l'invention, d'identification de polypeptides KARAP consiste ainsi notamment à :
- produire un anticorps mono- ou polyclonal dirigé contre ce polypeptide candidat, et en particulier contre une région extracytoplasmique de ce polypeptide candidat et/ou une région qui comprend au moins un motif ITAM (par exemple, dans le cas de la protéine KARAP de souris SEQ LD n°2 identifiée ci-dessus, un anticorps dirigé contre une région de la partie extracytoplasmique (SEQ LD n°3) ou de la partie intracytoplasmique (SEQ LD n°5) de la SEQ ID n°2),
- mettre en contact cet anticorps avec un lysat de cellules, possédant, sous une forme fonctionnelle, le récepteur activateur ou non inhibiteur pour lequel le polypeptide candidat est supposé constituer le KARAP, dans des conditions douces permettant des réactions de liaison de type antigène- anticorps,
- identifier le polypeptide candidat comme étant un polypeptide KARAP selon l'invention lorsque dans les produits de réaction éventuellement formés, se trouvent un produit de masse moléculaire apparente proche de celle dudit récepteur activateur ou non inhibiteur (environ 50 kDa pour le KAR p50) et un produit de masse moléculaire apparente proche de celle du polypeptide candidat (notamment entre 10 et 16 kDa environ).
Cette méthode d'identification selon l'invention peut notamment être réalisée : - en mettant en contact ledit anticorps comme ci-dessus décrit,
- faire précipiter les produits de réaction éventuellement formés dans des conditions douces de détergent préservant les complexes moléculaires (par exemple digitonine à 1%, voir exemple 1 ci-dessus),
- mesurer la masse moléculaire des produits précipités, par exemple par migration électrophorétique en présence des marqueurs de masse moléculaire sur un gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes, et
- en identifiant le polypeptide candidat comme étant un polypeptide KARAP selon l'invention comme ci-dessus décrit. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace d'au moins un polypeptide, KARAP, fragment, homologue ou forme modifiée selon l'invention, d'au moins un anticorps ou fragment d'anticorps selon l'invention, ou d'au moins un acide nucléique ou variant d'acide nucléique selon l'invention.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être formulée sous forme solide, liquide ou sous forme d'une suspension, pour une administration orale, parentérale, topique, intravaginale, mtrarectale ou pour une inhalation orale et/ou nasale.
Ladite composition pharmaceutique selon l'invention est destinée à moduler l'activité d'un KAR. Pour stimuler l'activité d'un KAR, ladite composition pharmaceutique comprendra des agents facilitant la transduction du signal provenant dudit KAR, tels que, par exemple, polypeptides, fragments, homologues, ou acides nucléiques, variants selon l'invention capables de traverser une bicouche lipidique. Pour inhiber l'activité d'un KAR, ladite composition pharmaceutique comprendra des agents bloquant la transduction des signaux issus dudit KAR tels que, par exemple, des fragments d'anticorps selon l'invention capables de traverser une bicouche lipidique de manière à bloquer les KARAPs cellulaires, ou des polypeptides modifiés, selon l'invention, phosphorylés ou non, par exemple à phosphorylation non hydrolysables dans des conditions biologiques, de manière à bloquer des protéines à domaine SH2 (ZAP-70, p72syk) ou PTB ou toute molécule adaptatrice ou effectrice de l'activation dudit KAR. De telles modifications comprennent notamment l'addition de groupements phosphonates, et/ou la mutation d'au moins un résidu Tyrosine (Y) en résidu phénylalanine (F). La présente demande vise donc une composition pour la prévention, la palliation, et/ou le traitement d'un fonctionnement anormal ou non désiré d'une cellule impliquée dans une réaction immunitaire. Une telle composition comprend avantageusement des polypeptides, ou, le cas échéant, des polypeptides modifiés selon l'invention.
Pour déterminer au niveau d'une cellule si un signal provenant d'un KAR est ou non transduit, et pour déterminer si un tel signal est stimulé ou inhibé, de nombreux moyens sont à la disposition de l'homme du métier. Des exemples de tels moyens ont été ci-avant indiqués. L'utilisation desdits polypeptides, anticorps et acides nucléiques, en tant qu'agents de diagnostic, entre également dans le champ de la présente invention (méthodes de diagnostic, et kits de diagnostics permettant de les mettre en oeuvre).
La présente invention vise également une méthode de diagnostic in vitro d'un fonctionnement anormal ou non désiré d'une cellule comprenant les étapes de :
- mise en contact d'au moins une cellule, ou un extrait de cellule, avec un anticorps selon l'invention, ou un fragment d'un tel anticorps, ou avec un acide nucléique selon l'invention ou un variant d'un tel acide nucléique, et de - révélation du produit de réaction éventuellement formé.
L'étape de mise en contact est réalisée dans des conditions notamment de durée, température, tampon, le cas échéant de réticulation de gel, permettant l'établissement d'une réaction de type antigène-anticorps par exemple par ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbant Assays), où le cas échéant, d'une réaction de type hybridation d'acides nucléiques et PCR (amplification en chaîne par polymérase).
Pour la révélation du produit de réaction éventuellement formé, peuvent être utilisés des marqueurs tels que marqueurs fluorescents, enzymatiques, radioactifs ou luminescents. Ladite méthode de diagnostic in vitro selon l'invention permet le diagnostic de fonctionnements cellulaires anormaux ou non désirés pouvant se traduire par une maladie immunoproliférative, ime maladie d'immimodéficience telle qu'une maladie à VLH, un cancer tel que la maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires, une maladie auto-immune telle que la polyarthrite rhumatoïde, une maladie infectieuse telle que le paludisme, une réponse allergique, un rejet de greffe.
La présente invention se rapporte également à une méthode d'identification de molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR, et à une méthode d'identification de molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR.
Ladite méthode d'identification de molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR selon l'invention comprend les étapes de
i. mise en contact des molécules candidates avec des polypeptides selon l'invention (ou avec des fragments ou homologues de tels polypeptides), et de ii. sélection de celles des molécules candidates pour lesquelles une liaison auxdits polypeptides (ou auxdits fragments de polypeptides) est observée.
Les molécules candidates susceptibles d'être des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR peuvent être par exemple choisies parmi les molécules à domaine SH2 ou PTB. Elles peuvent se présenter sous forme recombinante soluble. L'étape de mise en contact peut être, par exemple, réalisée par couplage des molécules candidates, obtenues sous forme recombinante soluble, susceptibles d'être des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR, à des billes permettant la mesure de la radioactivité telles que billes de liquide scintillant, et par passage, sur lesdites billes, de polypeptides selon l'invention (ou de fragments ou homologues de tels polypeptides) sous foπne tritiée. Sont alors sélectionnées celles des molécules candidates pour lesquelles une liaison auxdits polypeptides, fragments, ou homologues est observée par mesure de la radioactivité (cpm). L'étape de mise en contact peut également être réalisée par immobilisation de polypeptides selon l'invention (ou de fragments ou homologues de tels polypeptides) sur des microsupports permettant la mesure de la résonance de plasmons tel que des microsupports BIAcore (Pharmacia) (cf. par exemple Olcese et ai, 1996, The Journal of Immunology 156:4531- 4534 ; Vélv et al, Immunology Letters 1996, vol.54. pl45-150), ou par immobilisation de polypeptides selon l'invention phosphorylés et biotinylés sur des billes streptavidine (Vély et al. Eur. J. Immunol. 1997, 27: 1994- 2000; Le Dréan et al. Eur. J. Immunol. 1998, 28: 264-276), et par passage, sur lesdits microsupports, de molécules candidates susceptibles d'être des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR. Sont alors sélectionnées celles des molécules candidates pour lesquelles une liaison auxdits polypeptides, fragments, ou homologues est observée par mesure de la résonance de plasmons (Résonance Unit).
Cette méthode d'identification des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR, quel qu'en soit son mode de réalisation, peut également servir de référentiel dans la mise en oeuvre de la méthode d'identification de molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR selon l'invention.
Cette méthode d'identification de molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon l'invention, comprend les étapes de : i. mise en contact des molécules candidates avec des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR telles qu'obtenues par la méthode selon l'invention ci-avant décrite et avec des polypeptides selon l'invention (ou avec des fragments ou homologues de tels polypeptides), et de ii. sélection de celles des molécules candidates qui exercent un effet sur la liaison entre lesdits polypeptides (ou lesdits fragments ou homologues de polypeptides) et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices, telle qu'observée en l'absence desdites molécules candidates.
Les molécules candidates susceptibles de moduler une activité cellulaire résultant d'un KAR peuvent être choisies parmi des banques de composés naturels ou synthétiques, en particulier parmi des banques chimiques ou combinatoires. Lesdites molécules candidates peuvent être de nature protéique (par exemple, dérivés ou fragments d'anticorps anti-idiotypes tels que les anticorps selon l'invention, dérivés ou fragments d'anticorps catalytiques), de nature carbonée, lipidique ou nucléique.
L'étape de mise en contact de la méthode d'identification de molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon l'invention, peut être, par exemple, réalisée par incubation desdites molécules candidates avec des polypeptides selon l'invention (ou avec des fragments ou homologues de tels polypeptides) et avec des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR, telles qu'obtenues par la méthode selon l'invention, dans des conditions permettant une mesure du taux de liaison entre lesdits polypeptides et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR, par exemple, en se basant sur une propriété chimique desdites molécules adaptatrices ou effectrices à l'état non lié, telle que propriété enzymatique, propriété de phosphorylation ou d'auto- phosphorylation.
L'étape de mise en contact de la méthode d'identification de molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon l'invention, peut également être réalisée par mise en oeuvre de techniques du type billes de liquide scintillant et polypeptides tritiés ou du type microsupport et mesure de la résonance de plasmons, telles que ci-avant décrites, en mesurant la radioactivité ou, respectivement, la résonance de plasmons, résultant de la liaison entre lesdits polypeptides et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices, en l'absence et en présence des molécules candidates. Sont alors sélectionnées celles des molécules candidates qui soit augmentent soit diminuent de manière statistiquement significative le taux de liaison témoin mesuré entre lesdits polypeptides et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices en l'absence desdites molécules candidates. Les molécules capables de moduler l'activation d'un KAR, telles qu'identifiées par la méthode selon l'invention, peuvent être modifiées chimiquement de manière à les rendre non hydrolysables dans des conditions biologiques, et/ou de manière à ce qu'elles puissent traverser une bicouche lipidique cellulaire. Les molécules capables de moduler l'activation d'un KAR, selon l'invention, avantageusement agissent en modifiant l'interaction entre lesdits KARAPs et leurs effecteurs ou adaptateurs cellulaires.
Lesdites molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, selon la présente invention, peuvent alors être apphquées à une cellule cultivée in vitro, telle que cellule lymphocytaire, dont l'activité KAR a été stimulée, par exemple, par mise en contact avec un ligand. Cette application se fait par pénétration à l'intérieur de ladite cellule, par exemple, par électroporation ou par modification chimique permettant le franchissement d'une bicouche lipidique. La présente invention est illustrée par les exemples suivants qui ne doivent être en aucun cas considérés comme limitatifs. Il y est fait référence aux 23 figures suivantes: - la Figure 1 présente en A, une analyse par cytomètre de flux (FACScan, marque déposée
Becton-Dickinson) en immunofluorescence indirecte de cellules cultivées sur
LL-2 (interleukine 2) et issues de patients atteints de LDGL (maladie lymphoprolifératrice des lymphocytes granulaires) désignés par R.P., D.F. et MAL., et en B, les résultats d'un test de cytotoxicité re-dirigé avec différents anticorps monoclonaux, réalisé sur des cellules NK cultivées sur LL-2 provenant de différents donneurs ;
- la Figure 2 présente : en A, une analyse SDS-PAGE (résolution de protéines par électrophorèse sur gel et dodécylsulfate de sodium) réalisée à partir de cellules NK de donneur R.P. (p50.1+) radiomarquées au 125I et immunoprécipitées à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-CD158 EB6, avant et après épuisement en FcεRIγ et en CD3ζ à l'aide d'anticorps anti-CD3ζ / anti-FcεRIγ, en B, une analyse SDS-PAGE avec une sonde anticorps anti-CD3ζ de lysats complets de cellules D.F. ou d'immunoprécipités de tels lysats ;
- la Figure 3 présente : en A, une analyse SDS-PAGE des protéines phosphorylées issues de tests kinase in vitro auxquels ont été soumis des immunoprécipités de lysats de cellules NK MAL., en B, le même type d'analyse SDS-PAGE qu'en figure 3 A mais réalisée à partir de cellules RBL-2H3 p50.2+, en C, une analyse par électrophorèse sur couche mince (TLE) des acides aminés phosphorylés des bandes KARAPs et CD3ζ excisées après tests kinase in vitro réalisés sur des immunoprécipités anti-CD158 et anti- CD16, respectivement, de cellules NK R.P., - la Figure 4 présente une analyse SDS-PAGE bidimentionnelle en conditions non-dénaturantes/dénaturantes d' immunoprécipités anti-CD158 de lysats de cellules NK RP. ayant subi un test kinase, et
- la Figure 5 présente les récepteurs activateurs ou non-inhibiteurs de la superfamille des immunoglobulines (IgSF) ou du type lectine, et leurs contreparties inhibitrices,
- la Figure 6 représente la structure schématique de récepteurs KIR (P58) et KAR (p50),
- la Figure 7 représente la séquence ADNc d'un polypeptide KARAP de souris selon l'invention (SEQ LD n°l),
- la Figure 8 représente la séquence nucléotidique (comprise entre la séquence leader exclue et le codon stop) et la séquence en acides aminés d'un polypeptide KARAP selon l'invention (protéine mâture, SEQ LD n°2), et
- la Figure 9 représente l'alignement des ITAMs et de l'ITAM d'un polypeptide KARAP selon l'invention,
- les Figures 10A, 11A, 12A, 13A et 14A illustrent respectivement les séquences ADNc des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41142 (SEQ LD n°6 à SEQ LD n°10),
- les Figures 10B, 11B, 12B, 13B et 14B illustrent respectivement les séquences protéiques des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41142 (SEQ LD n°l l à SEQ LD n°15),
- la Figure 15 représente l'alignement des séquences ADNc des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41142, et la séquence consensus résultante (SEQ ID n°16 ; ADNc KARAP de souris C57B1/6 consensus),
- la Figure 16 représente l'alignement des séquences protéiques des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41142, et la séquence consensus résultante (SEQ LD n°17 ; protéine KARAP de souris C57B1/6 consensus), - la Figure 17 représente la séquence du gène KARAP de souris de lignée 129 (SEQ LD n°18 ; 2838 pb),
- la Figure 18 représente l'organisation génomique du KARAP de souris de lignée 129, - la Figure 19 représente la séquence ADNc du KARAP de souris de lignée 129 (SEQ LD n°27) et la séquence protéique correspondante (SEQ LD n°28),
- la Figure 20 représente de haut en bas, l'organisation génomique du gène KARAP de souris de lignée 129, la séquence protéique correspondante, et la nature des différentes régions de cette protéine,
- la Figure 21 représente l'ADNc du KARAP humain (SEQ LD n°31),
- la Figure 22 représente le pourcentage de sérotonine relargée dans le surnageant par les cellules RBL-2H3 doublement transfectées p50/KARAP humain, et stimulées par l'anticorps indiqué en abscisse (à gauche : aucun anticorps ; au centre IgE de souris : mlgE 1/500 ; à droite : GL183 5μg/ml),
- la Figure 23 illustre lTiomologie entre l'organisation du gène KAPAP humain et celle du gène KARAP murin.
EXEMPLE 1
1. Matériels et méthodes
Anticorps monoclonaux (mAbs) et réactifs
Les anticorps monoclonaux suivants ont été utilisés :
- des anticorps anti-CD3, anti-CD16 et anti-CD56 d'isotype IgGl tels que JT3A (Coulter Immunotech référence 0178), KDl (Coulter Immunotech référence 0813) et TA181.H12 (Coulter Immunotech référence 1844), respectivement, - des anticoφs anti- CD3ζ tels que TIA-2 (Coulter Immunotech 66045P2),
- des anticoφs anti-CD158, à savoir des anticoφs anti-p58.1 tels que EB6 (Coulter Immunotech référence 1847), des anticoφs anti-p58.2 tels que GL183 (Coulter Immunotech référence 1846) et des anticoφs anti-p50.3 tels que PAX250 décrit dans Bottino et al. (Eur. J. Immunol. 1996, 26, 1816),
- un antisérum de lapin anti-FcεRIγ tel que l'antisérum 666 décrit dans Jouvin M.H. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 5918-5925,
- un antisérum de lapin anti-FcεRIα tel que l'antisérum BC4 décrit dans Bociano L.K. et al., 1986, J. Biol. Biochem. 261 , 11823-1 1831 ,
- un antisérum de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (Sigma A-2304) et un antisérum de chèvre anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (Sigma A-0545),
- une immunoglobuline de chèvre anti-souris conjuguée à de l'isothiocyanate de fluoresceine (Coulter-Immunotech 0819 F(ab')2),
- des anticoφs monoclonaux GL183-Phycoérythrine (GL183-PE) (Coulter-Immunotech 2278), (EB6-Phycoérythrine (EB6-PE) (Coulter- Immunotech 2277) et une immunoglobuline de chèvre anti-souris- phycoérythrine (anti-souris-PE) (Coulter Immunotech 0855 F(ab')2). Le tampon de lyse contenait du Tris-HCl 25 mM pH 7,5 ; NaCl
150 mM ; digitonine 1% ; orthovanadate de sodium 100 μM ; NaF 10 mM; aprotinine 2 μg/ml ; leupeptine 2 μg/ml ; tous ces produits ayant été achetés auprès de Sigma (St Louis, MO, USA).
Le tampon kinase contenait de l'Hepes 20mM pH 7,2 ; NaCl 100 mM ; MnCl2 5 mM ; MgCl2 5mM ; 32γ ATP 10 μCi = 370 kBq (Amersham, Buckinghamshire, UK).
Le tampon d'électrophorèse sur couche mince (TLE) contenait de l'acide acétique glacial à 10% et de la pyridine à 1% dans de l'eau ; pH 3,5. Cellules
Cellules NK humaines issues de patients LDGL ou cellules LDGL :
Les cellules NK humaines ont été obtenues à partir de patients atteints de maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires (LDGL, Lymphoproliférative Disease of Granular Lymphocytes) de la lignée des cellules NK CD56+, CD16+, CD3". Des lymphocytes de sang périphérique (PBL, Peripheral Blood Lymphocyte) ont été isolés à partir d'échantillons de sang de patients atteints de LDGL par centrifugation selon un gradient Ficoll/Hypaque. Ces cellules LDGL ont été alors cultivées à 37°C à une concentration de 106 cellules par ml sur milieu RPMI-1640, à 10 μg/ml de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum de veau foetal, en présence de cellules nourricières irradiées allogéniques et de 100 U/ml de rLL-2.
Obtention de cellules transfectées RTILB.p50.2+ :
Des transfectants de cellules RBL-2H3 (American Type Culture Collection) exprimant des KARs p50.2 (cellules RTILB.p50.2+) ont été réalisées telles que décrites dans Bléry et al. 1997, J. Biol. Chem., 272, 8989-8996). La figure 6, représente de manière schématique, la structure de récepteurs KIR p58 (récepteurs humains inhibiteurs de type immunoglobuline) et des récepteurs KAR p50 (contrepartie non inhibitrice des récepteurs KIR p58).
Brièvement, les cellules RTILB utilisées sont les cellules classiquement décrites comme étant des cellules RBL-2H3 transfectées de manière à exprimer le récepteur FcγRIIb2 murin et la molécule chimérique CD25/CD3 comprenant les domaines ecto- et trans-membranaires complets de la CD25 humaine liés au domaine intracytoplasmique complet de la CD3 murine.
Ces cellules RTI B ont été de plus transfectées par électroporation d'ADNc 183.Act2 (codant pour p50.283) porté sur le vecteur d'expression RSV-5gpt.
Des cellules transfectées RTILB.p50.2+ stables ont été établies par culture en présence de xanthine (250 μg/1), d'hypoxanthine (13,6 μg/1) et d'acide mycophénolique (2 μg/1).
Test Cvtolvtiαue
L'activité cytolytique des cellules LDGL cultivées sur LL-2 a été mesurée par rapport à la lignée cellulaire murine P815 (American Type Culture Collection) en l'absence ou en présence des mAbs anti-CD16, anti- CD158 et anti-CD56.
Brièvement, 5 x 103 cellules cibles marquées au 51Cr ont été ajoutées à des dilutions en série de cellules effectrices en présence de 50 μl d'anticoφs monoclonal surnageant d'hybridome au démarrage du test standard de libération de 51Cr durant 4 heures (Vivier E. et al., 1991, J. Immunol. 146:206).
Radio-ioduration
Les cellules (10 - 50 x 106) ont été fixées au formaldéhyde à 0,5% dans du PB S (tampon de phosphate de sodium), puis perméabilisées pendant
5 minutes à l'aide de digitonine à 30 μg/ml dans du PB S préalablement à une ioduration catalysée par la lactoperoxidase (125I, NEN-Dupont, Wilmington,
DE, USA) tel que décrit par Anderson P. et ai, 1989, J. Immunol. I43AS99. 2o
Les cellules ont été lysées pendant 30 minutes à 4°C dans un tampon de lyse à digitonine. Les surnageants post-nucléaires pré-purifiés ont alors été immunoprécipités à l'aide d'anticoφs spécifiques couvrant des billes S4B- Sépharose (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) (Vivier E. et al., 1991, J. Immunol. 146:206). Les immunoprécipités ont été analysés par SDS-PAGE (résolution de protéines par électrophorèse sur gel et dodécylsulfate de sodium) et autoradiographie.
Test kinase in vitro
Les cellules (10 x 106 par échantillon) ont été lysées dans 1 ml de tampon de lyse (voir réactifs). Les surnageants post-nucléaires prépurifiés ont été immunoprécipités pendant 2 à 3 heures en utilisant des anticoφs monoclonaux liés de manière covalente à ime Sépharose 4B activée par CnBr (Pharmacia). Les complexes immuns ont été lavés trois fois dans du tampon de lyse ; 40 μl de tampon kinase (voir réactifs) ont alors été ajoutés aux immunoprécipités pendant 10 minutes à 37°C. La réaction kinase a été arrêtée par addition du tampon réducteur SDS-échantillon. Les échantillons ont été portés à ébullition préalablement à une analyse par SDS-PAGE et autoradiographie. Dans certaines expériences, les échantillons ont été analysés par SDS-PAGE diagonale non-dénaturante/dénaturante bidimensionnelle.
Analyse de la phosphorylation des KARAPs
Après le test kinase in vitro et la séparation par SDS-PAGE, les protéines phosphorylées ont été excisées des gels séchés et ont été éluées en utilisant un Centrilutor (Amicon) ou une solution de SDS (dodécylsulfate de sodium) à 0,1% dans du PBS (tampon de phosphate de sodium). Les protéines éluées ont été précipitées dans de l'acide trichloroacétique à 20% à 4°C pendant 2 heures, préalablement à une incubation dans 200 μl d'HCl 5,7 M à 1 10°C pendant 90 minutes. Les acides aminés individuels ont alors été séchés et remis en suspension dans 5 μl de tampon TLE (voir réactifs) contenant 5 μg de chaque phosphotyrosine, phosphothréonine, phosphosérine non marquée (Sigma) en tant qu'étalons standards. Les échantillons ont été déposés sur des plaques de cellulose (DC-cellulose 100-μm) et mis à migrer à 1500 V pendant 45 minutes à 4°C sur un Multiphor II (Pharmacia). Des étalons standards ont été développés à l'aide de ninhydrine à 1% dans de l'acétone et les acides aminés marqués au P ont été identifiés par autoradiographie.
Analyse par immunotransfert
Les immunoprécipités ont été résolus par SDS-PAGE, transférés sur filtres de nitrocellulose et confrontés aux sondes anticoφs anti-CD3ζ ou anti- FCεRIγ diluées dans une solution de PB S à 5% en lait déshydraté écrémé. Les immunotransferts ont été révélés en utilisant un antisérum de chèvre antisouris ou anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (Sigma références A- 2304 et A-0545 respectivement) et le système de détection ECL commercialisé par Amersham (RPN 2209).
2. Résultats
Phénotvpe de surface Le phénotype de surface des cellules NK issues de patients LDGL et cultivées sur LL-2 (interleukine-2) a été analysé par FACScan (tri de cellules activées par fluorescence) en immunofluorescence indirecte.
Sont ci-après reportés les résultats de l'étude relative à trois de ces patients, ci-après nommés R.P., D.F. et MAL. Lesdits résultats sont illustrés par la Figure 1A où est présentée une analyse par FACScan en immunofluorescence indirecte de cellules LDGL (maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires) R.P., D.F. ou MAL. cultivées sur LL-2. Une immunoglobuline de chèvre anti-souris conjuguée à de l'isothiocyanate de fluoresceine a servi de réactif de seconde étape. Pour chaque type de cellules LDGL (cellules LDGL RP. pour les analyses présentées dans la bande horizontale supérieure, cellules LDGL D.F. pour celles de la bande horizontale médiane, cellules LDGL MAL. pour celles de la bande horizontale inférieure) et pour chaque traitement subi (traitement témoin C pour les graphes présentés à gauche ou traitement par l'anticoφs monoclonal indiqué, soit de gauche à droite, anti-CD3, anti-CD16, anti-CD158 EB6, anti-CD158 GL183, anti-CD158 PAX 250), sont reportées, en abscisse, les intensités de fluorescence et, en ordonnées, le nombre relatif de cellules.
On peut observer que :
- les cellules NK R.P., D.F. et MAL. sont toutes CD3" et CD16+,
- les cellules NK R . sont p50.1+, p50.2", p50.3" : elles sont reconnues par l'anticoφs monoclonal anti-CD158 EB6 et ne sont pas reconnues par les anticoφs monoclonaux anti-CDl 58 GL183 et PAX250,
- les cellules NK D.F. sont p50.1", p50.2+, p50.3" : elles sont reconnues par l'anticoφs monoclonal anti-CDl 58 GL183 et ne sont pas reconnues par les anticoφs monoclonaux anti-CDl 58 EB6 et PAX250,
- les cellules NK MAL. sont p50.1", p50.2\ p50.3+ : elles sont reconnues par l'anticoφs monoclonal anti-CDl 58 PAX250 et ne sont pas reconnues par les anticoφs monoclonaux anti-CDl 58 EB6 et GL183.
Les trois patients atteints de LDGL ont donc présenté une lymphoprolifération de cellules NK reconnue par des anticoφs anti-CDl 58 : anti-KTR p58.1 (EB6), anti-KTR p58.2 (GL183) et anti-KAR p50.3 (PAX250) respectivement. Trois groupes de cellules NK ont ainsi pu être définis : cellules LDGL R.P., cellules LDGL D.F. et cellules LDGL MAL.
Test cvtolvtique
Des essais de cytotoxicité re-dirigée utilisant P815 en tant que cellules cibles FcγR+ ont été réalisés pour les cellules NK RP. p50.1+, D.F. p50.2+ et MAL. p50.3+.
Les résultats sont illustrés par la Figure 1B où est présenté un test de cytotoxicité re-dirigée avec différents anticoφs monoclonaux : des cellules NK issues des donneurs indiqués (RP. p50.1+ à gauche, D.F. p50.2+ au centre, ou MAL. p50.3+ à droite) et cultivées sur LL-2 ont été utilisées comme cellules effectrices. Le test a été réalisé en présence de : aucun anticoφs (cercles blancs), anticoφs monoclonal anti-CDl 6 (triangles noirs), anticoφs monoclonal anti-CD56 (triangles blancs), anticoφs monoclonal anti-CDl 58 (EB6 pour R.P., GL183 pour D.F. et PAX250 pour MAL.) (cercles noirs). En abscisse sont reportés les ratios cellules effectrices : cellules cibles (ratio E:T ; 8:1 ; 4: 1 ; 2: 1 ; 1 :1 ; 0,5:1 ; 0,25:1) et, en ordonnées, le pourcentage de lyse spécifique, (échelle de 0 à 120%). Les tests de cytotoxicité re-dirigée indiquent que, par constraste avec ce qui est observé lors d'une stimulation de récepteurs KIRs, l'addition d'anticoφs anti-CDl 58 aux cellules NK augmente considérablement la cytolyse des cellules P815 (Figure 1B).
A titre de témoins, les anticoφs monoclonaux anti-CDl 6 augmentent la cytolyse spontanée des P815 de manière similaire aux anticoφs monoclonaux anti-CDl 58, alors qu'un anticoφs monoclonal anti-CD56 apparié à l'isotype n'a aucun effet (Figure 1B).
Ces cellules NK expriment donc à leur surface des KARs, l'isoforme activatrice des KIRs. Ces résultats ont été, de plus, confirmés par analyses PCR (amplification en chaîne par polymérase) avec transcriptase inverse des ADNc KIRJKAR.
Analyse des KARs exprimés par radio-ioduration et immunotransferts : identification des KARAPs
Les récepteurs KARs exprimés sur les cellules NK issues de patients
LDGL ont été analysés par radio-ioduration interne suivie d'immunoprécipitation. Les résultats sont illustrés par la figure 2A où est présentée une analyse
SDS-PAGE, sur gel à 13% en conditions dénaturantes, réalisée à partir de cellules NK (10 x 106 cellules/piste) de donneur R.P. (p50.1+) radiomarquées au ι:5I et immunoprécipitées à l'aide de l'anticoφs monoclonal anti-CDl 58
EB6 (piste 1), puis purifiées à l'aide d'anticoφs monoclonaux anti- CD3ζ/anti-FcεRIγ (pistes 2 à 7) et enfin re-immunoprécipitées à l'aide de l'anticoφs monoclonal anti-CDl 58 EB6 (piste 8).
Les mêmes profils ont été obtenus avec les donneurs D.F. (p50.2+) et
MAL. (p50.3+) (données non présentées).
On peut observer que les immunoprécipités d'anticoφs anti-CDl 58 préparés à partir de lysats de cellules NK contiennent, en plus des KARs observés à ≈50 kDa, une bande de masse moléculaire plus faible migrant à 12
± lkDa environ.
Il a été montré que les KIRs s'associent avec les polypeptides CD3ζ et
FCεRIγ dans les cellules NK humaines. Les expériences de pré-épuisements utilisant des anticoφs anti-CD3ζ et anti-FCεRIγ ont éliminé la possibilité que la bande de 12 kDa environ associée au KARs soit CD3ζ ou FCεRIγ (Figure
2A). 3J
L'ensemble protéique correspondant à cette bande à 12 + lkDa environ a été baptisé KARAPs (KAR-associated proteins, protéines associées aux KARs).
Ces résultats ont été confirmés par des expériences d'immunotransferts qui ont révélé l'absence de toute bande réactive en présence d'anticoφs anti- CD3ζ dans les immunoprécipités de mAbs anti-CDl 58 préparés à partir de lysats NK.
Ces résultats, obtenus en présence d'anticoφs anti-CD3ζ, sont illustrés par la figure 2B où est présentée une analyse de lysats complets de cellules D.F. ou d'immunoprécipités de tels lysats par résolution SDS-PAGE sur gel à 15% en conditions dénaturantes et incubation des filtres de nitrocellulose avec une sonde anticoφs monoclonal anti-CD3ζ (flèche de marquage à droite). Les lysats complets de cellules (LCC) D.F. ont été déposés à 5 x 106 cellules/piste en piste 1, les immunoprécipités de tels lysats à 15 x 106 cellules/piste en pistes 2 à 4. Les immunoprécipitations ont été réalisées sur des lysats de cellules D.F. en utilisant l'anticoφs monoclonal anti-FcεRIα BC4 en témoin piste 2, l'anticoφs monoclonal anti-CDl 6 en piste 3 et l'anticoφs monoclonal anti-CDl 58 GL183 en piste 4.
Les mêmes résultats ont été obtenus pour les cellules R.P. et MAL., à l'aide de mAb anti-CD3ζ.
Les résultats obtenus à l'aide de mAb anti-FCεRIγ (données non présentées) ont apporté la même confirmation.
Analyse des KARAPs par test kinase in vitro et électrophorèse sur couche mince (TLE)
Les tests kinase in vitro réalisés sur les immunoprécipités d'anticoφs monoclonaux anti-CDl 58 ont révélé que les KARs s'associent à une phosphoprotéine prédominante de faible poids moléculaire migrant à environ 14 ± 1 kDa dans les cellules NK.
Les résultats sont illustrés par la figure 3A : des lysats préparés à partir de cellules NK MAL. ont été immunoprécipitées avec l'anticoφs indiqué (anti-FcεRIα en piste 1 , anti-CD16 en piste 2, anti-CDl 58 en piste 3) préalablement à des tests kinase in vitro. Les protéines phosphorylées ont été séparées par SDS-PAGE sur un gel à 15% en conditions dénaturantes.
Ces résultats sont en accord avec le changement de masse moléculaire attendue pour la forme phosphorylée de la KARAP à 12 kDa observée par ioduration interne. De plus, les immunoprécipités de mAbs anti-CDl 58 préparés à partir de cellules NK KAR+ comprennent deux autres phospho- KARAPs, migrant à 16 ± 1 kDa et 12 + 1 kDa respectivement (signalés par un astéristique de part et d'autre de la flèche KARAP à 14 kDa en Figure 3A). L'association des KARs avec un groupe similaire de KARAPs phosphorylées a aussi été observée avec im panel de clones de cellules NK KAR+ et était absente de clones NK KLR+. Il a été observé que l'intensité relative des phospho-KARAPs à 16,14 et 12 kDa peut varier selon l'origine des cellules NK. Une analyse des acides aminés phophorylés a révélé que la KARAP majeure à 14 kDa est principalement phosphorylée au niveau des résidus tyrosine.
Les résultats sont illustrés par la figure 3C : les bandes KARAPs (à gauche) et CD3ζ (à droite) ont été excisées après test kinase in vitro et soumises à une analyse des acides aminés phophorylés par électrophorèse sur couche mince. Dans cette expérience, les bandes KARAPs et CD3ζ ont été isolées à partir d'immunoprécipités d'anticoφs monoclonaux, respectivement, anti-CDl 58 et anti-CD16 préparés à partir de lysats de cellules NK. RP. Néanmoins, une phosphorylation au niveau de résidus serine mais non au niveau de résidus thréonine peut aussi être détectée. A titre de témoin, l'analyse des acides aminés phophorylés a confirmé la phosphorylation de CD3ζ au niveau du résidu tyrosine seulement.
KARAPs et transduction du signal activateur (tranfectants KAR+
Par contraste avec les KIRs p58.2, l'expression de KAR p50.2 dans les transfectants de la lignée cellulaire non lymphoïde RBL-2H3 ne conduit pas à une reconstitution de la fonction activatrice des KARs p50.2. En effet, la stimulation de tranfectants de cellules RBL-2H3 p50.2+ induite par des anticoφs anti-CDl 58 ne conduit à aucune mobilisation détectable du Ca2+ intracytoplasmique, ni à aucune libération détectable de sérotonine.
De manière remarquable, les tests kinase in vitro réalisés sur les immunoprécipités d'anticoφs monoclonaux anti-CDl 58 préparés à partir de transfectants de cellules RBL-2H3 p50.2+ n'ont inclus aucune KARAP détectable.
Les résultats sont illustrés par la figure 3B : des lysats préparés à partir de cellules RBL-2H3 p50.2+ ont été immunoprécipitées avec l'anticoφs indiqué (anti-CD3ε en piste 1, anti-FcεRIα en piste 2, anti-CDl 58 en piste 3) préalablement à des tests kinase in vitro. Les protéines phosphorylées ont été séparées par SDS-PAGE sur un gel à 15% en conditions dénaturantes.
Le défaut d'association des KARs aux KARAPs dans les transfectants de cellules RBL-2H3 p50.2+ a été également confirmé par ioduration interne (données non présentées). Les KARAPs s'associent donc de manière sélective aux KARs, et l'absence d'association des KARs aux KARAPs est corrélée avec l'incapacité des KARs à transduire un quelconque signal activateur détectable.
Association KAR-KARAPs (gel diagonal) Finalement, une analyse sur gel bidimensionnel diagonal des immunoprécipités d'anticoφs monoclonaux anti-CDl 58 a révélé que les phospho-KARAPs de 16, 14 et 12 kDa environ décroissent le long du gel diagonal. Les résultats sont illustrés par la figure 4 : des immunoprécipités (LP) d'anticoφs monoclonaux anti-CDl 58 préparés à partir de lysats de cellules NK R.P. ont été soumis à un test kinase in vitro préalablement à analyse par SDS-PAGE sur gel à 13% bidimensionnel en conditions non- dénaturantes/(direction horizontale)/dénaturantes (direction verticale). Ces résultats indiquent ainsi que les KARs sont associés dans les cellules NK à un complexe de dimères KARAPs liés par liaison disulfure.
3. Discussion
Les KARs, récepteurs activateurs autonomes, notamment pour des molécules du CMH de classe I, ou co-récepteurs du TCR (récepteur de lymphocyte T) ou de RFc (récepteur pour fragment constant d'immunoglobuline), représentent une voie nouvelle pour l'activation des cellules NK et T.
Les inventeurs ont démontré que les KARs sont en fait assemblés dans les cellules NK en un complexe multimérique faisant intervenir des KARAPs associées sous forme de dimères liés par liaison disulfure.
Si l'analyse par radio-ioduration a mis en évidence une KARAP à environ 12 ± 1 kDa, l'analyse par test kinase a mis en évidence trois phospho- KARAPs à environ 16, 14 et 12 ± 1 kDa. La corrélation entre l'association des KARs aux KARAPs et la fonction activatrice des KARs suggère que les KARAPs agissent en tant que sous-unités transductrices du complexe KAR multimérique.
Cependant, l'absence d'association des KARs aux KARAPs, telle qu'observée pour les transfectants de cellules RBL-2H3, n'empêche pas l'expression du récepteur sur la surface cellulaire, contrairement à ce qui a été observé pour les récepteurs activateurs multimériques pour antigènes ou anticoφs incluant des polypeptides à ITAM (motif d'activation d'immunorécepteurs basée sur résidu(s) tyrosine(s). D'autres récepteurs activateurs, ou à tout le moins non inhibiteurs, de la superfamille des immunoglobulines présentent de frappantes similarités avec les KARs p50 (KARs humains de type immunoglobuline) : les récepteurs KARs humains de type lectine NKG2C/D, les récepteurs KAR murins de type immunoglobuline pir A, gp49A, les récepteurs KAR murins de type lectine Ly49D, Ly49H, mais aussi les récepteurs activateurs humains de la famille LIR/MIR/LLT tels que LLT 1.
Ces similarités sont illustrées par la figure 5 où sont présentés les récepteurs activateurs ou non-inhibiteurs de la superfamille des immunoglobulines (IgSF) ou du type lectine, et leurs contreparties inhibitrices. En dessous du nom de chaque couple de récepteurs (de gauche à droite, mPIR-B-mPIR-A, LLT2-LLT1, SIRPα-SIRPβ, KTR-KAR, FcγRITB- FcγPJII, NKG2A/B-NKG2C/D, mLy49A/B/C/E/F/G/I-mLy49D/H), sont indiquées les cellules les exprimant naturellement. Les récepteurs activateurs ou non-inhibiteurs ne présentent ni ITLM (motif d'inhibition d'immunorécepteur basée sur résidu(s) tyrosine) ni ITAM (motif d'activation d'immunorécepteur basée sur résidu(s) tyrosine) mais présentent un résidu acide aminé chargé dans leur domaine transmembranaire (TM) (R = arginine, K= lysine, D=acide aspartique, E=acide glutamique). Les contreparties inhibitrices (élément gauche de chaque couple) comportent un motif ITLM dans leur partie intracytoplasmique (IC). Chaque récepteur activateur, ou non-inhibiteur, présente, au niveau extracytoplasmique (EC), une forte homologie avec sa contrepartie inhibitrice.
EXEMPLE 2 : La caractérisation biochimique des molécules KARAPs (cf. exemple 1 ci- dessus) nous a permis de préciser les critères d'identification principaux des polypeptides KARAP, et notamment : - polypeptides comportant un acide aminé cystéine extracytoplasmique, permettant la formation de ponts disulfiires (cf. Figure 4)
- polypeptide de masse moléculaire apparente comprise entre 12 et 16 kDa environ,
- polypeptides présentant au moins un acide-aminé tyrosine phosphorylable (cf. Figure 3C).
Etant données les fortes similarités existant entre les molécules KARAPs identifiées à 12, 14 et 16 kDa, nous avons supposé que ces trois formes moléculaires représentaient des degrés de phosphorylation différents du même polypeptide KARAP, dont le poids moléculaire ne pouvait dépasser 12 kDa.
De plus, une caractéristique majeure des KARAPs réside dans leur association sélective avec les KARs, et non pas avec les KIRs. Etant donné que, contrairement aux KIRs, les KAR possèdent un acide aminé chargé transmembranaire (lysine : K), et que cette particularité est aussi à la base de l'association des polypeptides à ITAM présents dans les complexes CD3/TCR, BCR, FcεRI et FcγRLLLA (CD 16), nous avons orienté notre stratégie d'identification du gène KARAP en considérant que KARAP est un nouveau membre de la famille des polypeptides transmembranaire à ITAM. Ces derniers partagent en effet avec KARAP les mêmes caractéristiques : -polypeptides comportant un acide aminé cystéine extracytoplasmique
(C), permettant la formation de ponts disulfiires,
- polypeptide de faible masse moléculaire ne dépassant pas 25 kDa,
- polypeptides présentant au moins un acide aminé tyrosine phosphorylable comprise dans un motif ITAM: YxxL/Ix6.8 YxxL/I, et - présence d'un acide aminé chargé transmembranaire
Nous avons ainsi élaboré une stratégie bio-informatique d'identification d'un gène à partir des banques de cDNA publiques disponibles sous la forme EST, GENBANK, SWISSPROT et EMBL. Nous avons utilisé 2 approches différentes:
1/ Nous avons traduit selon les 6 phases de lecture l'ensemble des EST, en ne retenant que les peptides ayant entre 50 et 200 acides aminés (poids moléculaire envisagé compris entre 5,5 et 22 kDa). Sur cette sous-base, nous avons appliqué plusieurs critères de sélection : - existence d'une région transmembranaire prédite d'au moins 10 acides aminés, commençant avant l'acide aminé 30, selon la méthode d'Argos (Rao & Argos, 1986, Biochem. Biophys. Acta, 869, 197-214). En effet, par homologie avec les polypeptides à ITAM tels que CD3ζ et FcεRIγ, la majeure partie de la séquence KARAP est prédite comme étant intracytoplasmique.
- recherche d'un motif ITAM (Y-x-x-[LL]-x(6,8)-Y-x-x[LL]) en position C-terminale de la zone transmembranaire.
- présence dans la région transmembranaire d'un acide aminé chargé (R, K, D, E). - présence d'un acide aminé cystéine (C) en position C-terminale de la zone transmembranaire.
2/ Recherche des entrées EST (analyse faite également avec EMBL, GENBANK et SWISSPROT) présentant des similarités de séquences avec l'entrée CD3Z_HUMAN. Le programme utilise est TBLASTN (version 1.4.1 1 ; Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugène W. Myers, and David J. Lipman, 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-10) ou TBLASTN (version 2.0.3; Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schâffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman, 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402). Sur ces entrées similaires, nous avons ensuite appliqué les critères de sélection utilisés dans la première approche.
En combinant ces deux approches bio-informatiques et après avoir successivement déterminé à l'aide de profils d'hydrophobicité (programmes Genworks, DNA Strider) les régions leader, transmembranaires, intra- et extracytoplasmique des molécules candidates, nous avons obtenu un nombre important de séquences correspondant potentiellement à celle de KARAP. Parmi ces séquences, la séquence correspondant au numéro d'accession AA242315 sur Genbank nous est apparu comme la séquence du gène KARAP de la souris (SEQ LD n°l ADNc souris C57B1/6). La figure n°7 représente la séquence ADN (SEQ LD n°l ADNc) d'un polypeptide KARAP selon l'invention ; cette séquence correspond à la séquence du gène KARAP de souris. En effet, la traduction de la séquence nucléotidique donne un cadre de lecture ouvert de 396 nucléotides (SEQ LD n°2). Ce résultat est illustré par la figure n°8 où est représentée la partie de séquence nucléotidique du gène KARAP (SEQ LD n°l) qui est comprise entre la séquence leader (exclue) et le codon stop, et où est également représentée, en-dessous de cette séquence nucléotidique, la séquence en acides aminés (code à 1 lettre) correspondante (SEQ LD n°2, code à 3 lettres), c'est-à-dire la séquence en acides aminés de la protéine KARAP de souris mature selon l'invention (SEQ LD n°2). L'analyse standard de cette séquence prévoit une protéine mature de 87 acides aminés (masse moléculaire de 9,6 kDa), une partie extracytoplasmique de 16 acides aminés (Ql-Gl6), une partie transmembranaire de 24 acides aminés (V17-G40), et une partie intracytoplasmique de 47 acides aminés (R41-R87)- Conformément à notre stratégie de recherche, la partie extracytoplasmique comprend au moins un acide aminé cystéine (en fait deux, C8 et ClO), un acide aminé transmembranaire (D25), et un ITAM intracytoplasmique (Y65QELQGQRHEVY76SDL). La figure 9 illustre les comparaisons qui peuvent être faites par alignement de séquences entre les polypeptides à ITAMs préalablement décrits et les polypeptides selon l'invention possédant un (ou des) motifs ITAM, et indique la séquence ITAM consensus résultante : la figure 9 représente l'alignement des ITAMs de polypeptides à ITAM (six CD3, un Igα, un Igβ, FcεRIγ et FcεRIβ) et d'un motif ITAM du polypeptide KARAP murin (SEQ ID n°2) identifié ci-dessus selon l'invention (indiqué "KARAP" sur cette figure 9). Sur cette base de comparaison avec les ITAMs préalablement décrits (Figure 9), il nous a été permis d'envisager l'association des KARAP phosphorylées avec des protéine tyrosine kinases à groupement SH2 en tandem (telles que ZAP-70 et p72Syk). L'association des KARAPs avec des protéines de fusion recombinantes correspondant aux groupements SH2 de ZAP-70 (préparation décrite dans: Olcese L., Lang P., Vély F., Cambiaggi A., Marguet D., Bléry M., Hippen K. L., Biassoni R., Moretta A., Moretta L., Cambier J. C, Vivier E. 1996, J. Immunol. 156:4531-4534), a été vérifié in vitro: ces expériences ont été réalisées comme décrit dans la Figure 3 A, piste 3, mais les lysats cellulaires ont été adsorbés par la protéine de fusion recombinante correspondant aux groupements SH2 de ZAP-70, au lieu de l'anticoφs anti-CDl 58. Ainsi KARAP est une nouvelle molécule transmembranaire à ITAM qui s'associe aux KAR et qui, sous une forme tyrosine phosphorylée, s'associe à ZAP-70. KARAP est donc un nouvel élément de transduction des lymphocytes T et NK. Il est possible que KARAP ou des analogues de KARAP s'associent aussi aux isoformes activatrices des récepteurs à ITLM, et servent dans ces complexes multimoléculaires de sous-unité de transduction des signaux émis lors de l'engagement du récepteur.
Une méthode particulièrement appropriée pour déterminer ou contrôler qu'un polypeptide candidat, dont on connaît la séquence, correspond à une protéine KARAP selon l'invention consiste à produire un anticoφs contre une partie caractéristique de ce polypeptide candidat (par exemple une région intracytoplasmique comprenant au moins un motif ITAM ou une région extracytoplasmique), et à vérifier que cet anticoφs reconnaît, sur une cellule fonctionnelle, une cellule KAR+ fonctionnelle par exemple, une cible qui se trouve associée au récepteur pour lequel le polypeptide candidat est supposé être le KARAP (c'est-à-dire, dans le cas de cellules KAR+, à vérifier que l'anticoφs reconnaît une cible qui se trouve associée à un récepteur KAR).
Cette méthode d'identification de polypeptides KARAP selon l'invention consiste ainsi notamment à :
- produire un anticoφs mono- ou polyclonal dirigé contre ce polypeptide candidat, et en particulier contre une région de ce polypeptide candidat qui comprend au moins un motif ITAM (par exemple, dans le cas de la protéine KARAP murine identifiée ci-dessus, un anticoφs dirigé contre une région de la partie extracytoplasmique (SEQ ID n°3) ou de la partie intracytoplasmique (SEQ LD n°5) de la SEQ LD n°2), - mettre en contact cet anticoφs avec un lysat de cellules, possédant, sous une forme fonctionnelle, le récepteur activateur ou non inhibiteur pour lequel le polypeptide candidat est supposé constituer le KARAP, par exemple des cellules KAR+ fonctionnelles telles que des cellules NK ou T, dans des conditions douces permettant des réactions de liaison de type antigène- anticoφs,
- identifier le polypeptide candidat comme étant un polypeptide KARAP selon l'invention lorsque dans les produits de réaction éventuellement formés se trouvent un produit de masse moléculaire apparente proche de celle d'un KAR (environ 50 kDa) et im produit de masse moléculaire apparente proche de celle du polypeptide candidat notamment entre 10 et 16 kDa environ).
Cette méthode d'identification selon l'invention peut notamment être réalisée :
- en mettant en contact ledit anticoφs comme ci-dessus décrit, - faire précipiter les produits de réaction éventuellement formés dans des conditions douces de détergent préservant les complexes moléculaires (par exemple digitonine à 1 %, voir exemple 1 ci-dessus),
- mesurer la masse moléculaire des produits précipités, par exemple par migration électrophorétique en présence des marqueurs de masse moléculaire sur un gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes, et
- en identifiant le polypeptide candidat comme étant un polypeptide KARAP selon l'invention comme ci-dessus décrit.
EXEMPLE 3 :
1° Identification de plusieurs EST correspondant à KARAP.
Notre stratégie de clonage de KARAP murin par bio-informatique, telle que présentée dans l'exemple 2 ci-dessus, révèle également l'existence de 5 EST (Expressed Tag Séquences) qui correspondent à notre définition de
KARAP. Il s'agit des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et
W41142. Les figures 10A à 14A illustrent les séquences ADNc, respectivement, des EST AA242315, AA734769, W88159, respectivement, AA098506 et W41142 (SEQ ID n°6 à SEQ ID n°10 respectivement). Les figures 10B à 14B illustrent les séquences protéiques correspondant, respectivement, à ces EST (SEQ LD n°l l à SEQ LD n°15 pour les protéines des EST AA242315, AA734769, W88159, AA098506 et W41142 respectivement). Tous ces EST ont été obtenus à partir de tissus provenant de souris C57B1/6 et ont été alignés afin permis d'obtenir une séquence cDNA correspondant à un cadre de lecture ouvert. Ceci est illustré par la figure 15 qui représente l'alignement des séquences des EST AA098506 (SEQ LD n°9),
AA242315 (SEQ LD n°6), W88159 (SEQ LD n°8), AA734769 (SEQ LD n°7) et W41142 (SEQ ID n°10), et qui présente la séquence consensus résultante (ADNc KARAP murin consensus ; SEQ LD n°16).
Ceci est également illustré par la figure 16 qui représente l'alignement des séquences protéiques des EST AA242315 (SEQ LD n°l l), W88159 (SEQ LD n°13), W41142 (SEQ LD n°15), AA098506 (SEQ LD n°14) et AA734769 (SEQ LD n°12), et qui représente la séquence consensus résultante (protéine KARAP murine consensus, SEQ LD n°17). Sur ces figures 15 et 16, le symbole "." indique une identité avec la séquence consensus considérée, le symbole "-" indique l'absence de données de séquençage.
2° Séquence génomique de KARAP murin
Une librairie (phage lambda, EMBL3) de DNA génomique isolée à partir de souris de la lignée de souris 129 a été criblée avec le cDNA correspondant à la séquence de l'EST AA734769 selon une technique classique. Un phage contenant un fragment de 18 kb a été identifié comme positif. Une cartographie de ce phage par coupure avec une série d'enzyme de restrictions a été effectuée et un fragment EcoRI-EcoRI de 9kb obtenu à partir du phage a été clone dans le vecteur de clonage pBlue-Script et contient l'intégralité du gène KARAP murin (de l'ATG initial à la séquence STOP). La séquence de ce gène KARAP murin est présentée en figure 17 (SEQ LD n°18 ; 2838 pb). De plus, des amorces oligonucléotides ont été générées afin d'obtenir l'organisation génomique de KARAP murin. Les amorces utihsées sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous (SEQ LD n°19 à SEQ LD n°26) : Tableau
Numéro d'identification Orientation Position* Séquence (5'-3')
7134 Sens. 60-81 CGC TCT GGΛ GCC CI C CTG GTG C SEQ I n° I 9 7132 Antisens 581-561 ACT CTG CGC CITÎ TAC GGG ACr SEQ ID n°20 7133 Sens» 561-581 ACiT CCC OTA CΛG GCC CΛG AGT SEQ ID n°21 7130 Antisens 800-780 CAO AGT AA CAC CΛΛ GTC ΛCC SEQ ID n°22 7131 Sens, 780-800 G< ; r AG ÏTG GT<Ï TTG ACT CΓG SEQ I D n°23 7128 Antisens 978-958 crc Acrr crc ACÏC AAT GTG TTG SEQ ID n°24 7129 Sea-v 958-978 CAA CAC A IT GCT GAG ACT GAG SEQ ID n°25 7127 AiuisenA 2703-2683 CTG TOT GIT CÏAG GTC ACT GTA SEQ ID n°26
Position selon la séquence génonique.
L'organisation génomique du KARAP murin est présentée en figure 18.
Nous avons aussi obtenu à partir de ces données, la séquence cDNA et donc protéique de KARAP de souris de la lignée 129. Cette séquence cDNA (SEQ
LD n°27) et cette séquence protéique (SEQ LD n°28) sont présentées en figure 19.
La séquence protéique ainsi traduite est:
MGALEPSWCLLFLPVLLTVLGLSPVQA Séquence signal
QSDTFPPCDCSSVPG Domaine extracytoplasmique V AGIVLGDLV TLLIALAYSLG Domaine transmembranaire
RVSFGQEKTRKQHIAETESPYQELQGQRPEVYSDLNTQFQYYR Domaine intracytoplasmique
L'ensemble de ces résultats de cartographie génomique montrent que le gène KARAP murin (de l'ATG initial à la séquence STOP) est long de 2,9 kb environ, et comprend 5 exons. Ces résultats sont illustrés par la figure 20 où sont représentés, de haut en bas, l'ADN génomique du KARAP murin de la souris 129 (en noir : exon traduit ; en hachures horizontales : exon non traduit, en blanc : intron), la séquence protéique correspondante (SEQ ID n°28 de l'exon n°l à l'exon n°5), et la nature (SS = Séquence signal, EC = domaine extracytoplasmique ; TM = domaine transmembranaire ; IC = domaine intracytoplasmique) des différentes régions de cette protéine. L'exon 1 code pour une portion N-terminale de la séquence signal, l'exon 2 code pour le reste de la séquence signal et les trois premiers acides-aminés de la partie extracytoplasmique, l'exon 3 code pour le reste de la partie extracytoplasmique, la partie transmembranaire et les 9 premiers acides- aminés de la partie intracytoplasmique, l'exon 4 code pour 14 acides-aminés de la partie intracytoplasmique et l'exon 5 code pour le reste de la protéine. Comme attendu de l'organisation génomique d'un polypeptide à ITAM comme KARAP, l'ITAM est codé par deux exons (exon 4 et 5) séparés par un intron de type 0. 3° Reconstitution fonctionnelle d'un KAR (p50.2) exprimé dans les RBL- 2H3 par le KARAP humain DAP-12.
Nous avons obtenu le cDNA codant pour KARAP humain par RT-PCR en générant des amorces oligonucléotides déduite de la séquence de KARAP murin. Les amorces utilisées sont présentées dans le tableau 2 ci-dessous (SEQ ID n°29 et n°30) :
Tableau 2
l ç m τ~ Oligonucléυϋdes liuuuin KARAI1 m o m N° Identification O • ricnlalion localisation * Séquence (5'-3 —')
30 m
S 7367 Sens ΛTG (53) CCGCl CGΛGGGCTTCΛTGGGGGGΛCTrGΛΛC (SEQ ID n°29)
"D
X o 1 Cυdon initiation
O
S 7368 Λutisens 398 CrΛσrCl'ΛGA GGΛTCCΛGGTΛ'i ΛTrσrGCrGΛCroTCΛTGATTCGπ'JS) z Xba l Bam III (SHQ I D n°30)
3J jπ 'Numérotation en fonction de la séquence cDNΛ nuirine (SEQ ID n°27). r- m
La séquence de l'ADNc obtenu est présentée en figure 21 (SEQ LD n°31 ; ADNc du KARAP humain). De l'ARN extrait à partir de clones NK humains KAR+ a servi de base à la génération de ce cDNA. Ce cDNA a été clone dans le vecteur d'expression eucaryote pNT-neo et des transfectants stables pour ce KARAP humain ont été générés dans le transfectant KAR+ (p50.2) de la lignée cellulaire RBL-2H3 (Bléry et al, J. Biol. Chem., 1997). La capacité des récepteurs KAR exprimés sur les cellules RBL-2H3 ainsi doublement transfectées p50.2+ et KARAP+, à transduire un signal activateur a été testée par stimulation à l'aide d'anticorps dirigés contre la partie extracytoplasmique de p50.2 et en suivant le relargage de serotonine tritiée.
Le protocole suivi pour cette expérience de relargage de serotonine tritiée est le suivant :
Ces cellules sont décollées, centrifugées et resupendues dans du RPMI-10% S VF à une concentration finale de 1x10^ cellules par ml. Les cellules sont alors incubées avec 2μCi de serotonine marquée au tritium par ml de cellules pendant 1 heure. Les cellules sont lavées puis remises dans du milieu pour 1 heure à 37°C afin qu'elles relarguent la serotonine excédentaire de leurs stocks. Les cellules sont ensuite réparties dans des plaques à 96 puits (200000 cellules par puits) avec de l'IgE de souris (2682-1) ou un Ac anti- p50 (GL183). Les cellules adhèrent pendant 1 heure puis sont lavées. Elles sont remises à 37°C 15 minutes puis stimulées avec du F(ab')2 GAM (50μg/ml). Les cellules sont laissées 30 minutes à 37°C pour leur permettre de libérer leur serotonine. La réaction est terminée en ajouttant du HBSS froid et en mettant les cellules sur la glace. La moitié du surnageant de chaque puits est alors récupéré et mis dans 1ml de liquide de scintillation. Les 100% de dégranulation sont obtenus a partir du même volume de lysat obtenu à partir de cellules chargées en serotonine et non stimulées. Les échantillons sont alors comptés sur un compteur β. Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 22 qui présente le % de serotonine relarguée dans le surnageant, par les cellules RBL-2H3 doublement transfectées p50 KARAP humain et stimulées par l'anticorps indiqué en abscisse, (à gauche : aucun anticorps ; au centre IgE de souris : mlgE 1/500 ; à droite : GL183 5 μg ml). Comme indiqué sur cette Figure 22, alors que l'engagement de KAR dans RBL-2H3 par un anticorps réagissant avec la partie extracytoplasmique de KAR (l'anticorps monoclonal GL183) ne se traduit pas par l'activation des cellules, l'engagement de KAR par GL183 dans les doubles transfectants RBL-2H3 exprimant à la fois KAR et KARAP humains, se traduit par l'activation cellulaire (objectivée ici par la libération de serotonine à partir des cellules). Ceci est donc la preuve formelle que la séquence KARAP humaine identifiée reconstitue la fonctionnalité des KAR.
La figure 23 illustre l'homologie entre l'organisation du gène KARAP humain et celle du gène KARAP murin (El à E5 : exon 1 à exon 5 ; Il à 14 : intron 1 à intron 4). La numérotation des paires de bases du gène KARAP humain et de souris y est indiquée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide isolé, caractérisé en ce qu'il permet la restauration dîme activation KAR déficiente, ou fragment, ou homologue, d'un tel polypeptide.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est capable de s'associer à un KAR, et de ne pas s'associer à la contrepartie inhibitrice de ce KAR, ou fragment, ou homologue, d'un tel polypeptide.
3. Polypeptide tel qu'obtenu : i. par immunoprécipitation d'une ou plusieurs fraction(s) polyρeptidique(s) de lysats de cellules exprimant des récepteurs KAR capables de transduire un signal activateur à l'aide d'un ou plusieurs anticoφs anti-KTR et/ou anti-KAR, tel(s) qu'un anticoφs anti-CDl 58, anti-p70/NKBl, anti-pl40, et plus particulièrement l'anticoφs monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, ii. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuisée par élimination des fractions immunoprécipitées à l'aide d'anticoφs anti-CD3 et/ou anti-FcεRIγ, et/ou être à nouveau précipitée à l'aide d'un ou plusieurs anticoφs anti-KTR et/ou anti-KAR tel(s) qu'un anticoφs anti-CD158, anti-p70/NKBl, anti-pl40, et plus particulièrement l'anticoφs monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire, et récupération des polypeptides correspondant à un poids moléculaire de 12 ± 2 kDa environ, ou bien par résolution des polypeptides de ladite (desdites) fractions polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite
(lesdites) fraction(s) polypeptidique(s) à un test kinase, et récupération des polypeptides phosphorylés correspondant à un poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 ± 2 kDa environ, ou fragment, ou homologue, d'un tel polypeptide.
4. Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules NK et/ou des cellules T et/ou des cellules myéloïdes et/ou des cellules B et/ou des mastocytes.
5. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés :
- présente au moins un acide aminé tyrosine phosphorylable, - présente une masse moléculaire comprise entre 10 +_2 et 16 + 2 kDa environ.
6. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés comporte au moins un motif ITAM YxxL/Ixô.gYxxL/1.
7. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés comporte une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et une région intracytoplasmique.
8. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés comporte au moins un acide aminé cystéine extracytoplasmique.
9. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés comporte au moins un acide aminé chargé (R, K, D, E) transmembranaire.
10. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est phosphorylé au niveau d'au moins un résidu tyrosine.
11. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme de dimères.
12. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se lie à une molécule à domaine SH2 ou PTB.
13. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés est essentiellement constituée par la SEQ LD N°2, n°3, n°4, ou n°5, n°l l, n°12, n°13, n°14, n°15, n°17, ou n°28.
14. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est modifié par glycosylation, phosphorylation, sulfonation, biotinylation, acylation, estérification, par addition, substitution ou suppression d'entités de forme moléculaire proche de celle des groupes phosphate telles que le phosphonate, par addition de réactifs de marquage tels que la luciférase, la GFP ou ses analogues (Green Fluorescence Protein), par addition de cibles de purification telles qu'un ligand d'affinité, par addition d'entités modifiant sa solubilité.
15. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est capable de traverser une membrane cellulaire.
16. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est modifié de telle sorte à inhiber sa capacité à transduire un signal.
17. Polypeptide selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il est modifié de telle sorte à être non hydrolysable dans des conditions biologiques, notamment par addition de groupes phosphonates.
18. Polypeptide selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il est modifié par substitution d'un résidu tyrosine par un résidu phénylalanine.
19. Anticoφs ou fragment d'un tel anticoφs, en particulier fragment Fc, Fv, Fab, F(ab)'2, CDR tel qu'obtenu par immunogenèse à partir d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, ou à partir d'un fragment d'un tel polypeptide.
20. Anticoφs ou fragment d'anticoφs selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître la SEQ LD n°2, SEQ LD n°3, SEQ LD n°4, SEQ LD n°5, SEQ LD n°l l, SEQ ID n°12, SEQ LD n°13, SEQ LD n°14, SEQ LD n°15, SEQ LD n°17 et/ou SEQ ID n°28.
21. Acide nucléique ou variant d'un tel acide nucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence correspondant à la lecture en cadre ouvert, selon le code génétique universel, de la séquence en acides aminés d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes.
22. Acide nucléique selon la revendication 22, ou variant d'un tel acide nucléique, caractérisé en ce que ledit acide nucléique présente une séquence essentiellement constituée par la SEQ ID n°2, n°6, n°7, n°8, n°9, n°10, n°16, n027, n031, ou n°18.
23. Procédé d'obtention d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes : i. d'immunoprécipitation d'une ou plusieurs fraction(s) polypeptidique(s) de lysats de cellules KAR+ à l'aide d'un ou plusieurs anticoφs anti-KLR et/ou anti-KAR, tel(s) qu'un anticoφs anti-CDl 58, anti- p70/NKBl, anti-pl40, et plus particulièrement l'anticoφs monoclonal EB6,
GL183 ou PAX250, ii. chaque fraction polypeptidique pouvant optionnellement être plus avant épuisée par élimination des fractions immunoprécipitées à l'aide d'anticoφs anti-CD3 et/ou anti-FcεRIγ, et/ou être à nouveau précipitée à l'aide d'un ou plusieurs anticoφs anti-KLR et/ou anti-KAR tel(s) qu'un anticoφs anti-CDl 58, anti-p70/NKBl, anti-pl40, et plus particulièrement l'anticoφs monoclonal EB6, GL183 ou PAX250, iii. de séparation les polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire et récupérer les polypeptides correspondant à im poids moléculaire de 12 ± 2 kDa environ, ou bien de séparation des polypeptides de ladite (desdites) fraction(s) polypeptidique(s) selon leur poids moléculaire après avoir soumis ladite
(lesdites) fraction(s) polypeptidique(s) à un test kinase, et récupérer les polypeptides phosphorylés correspondant à un poids moléculaire de 12, 14 et/ou 16 ± 2 kDa environ.
24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que lesdites cellules KAR+ sont des cellules NK et/ou des cellules T et/ou des cellules myéloïdes et/ou des cellules B et/ou des mastocytes.
25. Méthode pour l'obtention de la séquence d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée en ce qu'on opère par criblage parmi des séquences candidates pour ne sélectionner que celle(s) qui :
- présente(nt) au moins un acide aminé tyrosine phosphorylable, - présente(nt) une masse moléculaire comprise entre 5 et 25 kDa environ,
- comporte(nt) une région extracytoplasmique, une région transmembranaire, et une région intracytoplasmique,
- comporte(nt) au moins un acide aminé cystéine dans sa région extracytoplasmique,
- comporte(nt) au moins un acide aminé chargé (R, K, D, E) dans sa région transmembranaire, et
- comporte(nt) au moins un motif ITAM YXXL/IXÔ-SYXXL/I dans sa région intracytoplasmique, et que l'on s'assure que le(s) polypeptide(s) correspondant à la (les) séquence(s) sélectionnée(s) est (sont) capable(s) de s'associer à un récepteur KAR tout en ne s'associant pas au récepteur contrepartie inhibitrice de ce KAR.
26. Méthode pour déterminer si un polypeptide candidat correspond à un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- produire un anticoφs mono- ou polyclonal dirigé contre ce polypeptide candidat, et en particulier contre une région extracytoplasmique de ce polypeptide candidat et/ou une région qui comprend au moins un motif ITAM,
- mettre en contact cet anticoφs avec un lysat de cellules, possédant, sous une forme fonctionnelle, le récepteur activateur ou non inhibiteur pour lequel le polypeptide candidat est supposé constituer le KARAP dans des conditions douces permettant des réactions de liaison de type antigène- anticoφs,
- identifier le polypeptide candidat comme étant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 lorsque dans les produits de réaction éventuellement formés se trouvent un produit de masse moléculaire apparente proche de celle dudit récepteur activateur ou non inhibiteur, et un produit de masse moléculaire apparente proche de celle du polypeptide candidat.
27. Composition pharmaceutique comprenant, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace de polypeptides selon l'une quelconque des revendications précédentes, ou de fragments de tels polypeptides, ou une quantité efficace d'anticoφs selon la revendication 19 ou 20, ou de fragments de tels anticoφs, ou une quantité efficace d'acides nucléiques selon la revendication 21 ou 22, ou de variants de tels acides nucléiques.
28. Méthode de diagnostic in vitro d'im fonctionnement anormal ou non désiré d'une cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de: - mise en contact d'au moins une cellule, ou un extrait de cellule, avec un anticoφs selon la revendication 21 ou 22 ou un fragment d'un tel anticoφs, ou avec un acide nucléique selon la revendication 21 ou 22 ou un variant d'un tel acide nucléique, et de
- révélation du produit de réaction éventuellement formé.
29. Méthode de diagnostic in vitro selon la revendication 28, caractérisée en ce que ledit fonctionnement anormal ou non désiré se traduit par une maladie immunoproliférative, une maladie d'immunodéficience telle qu'une maladie à VIH, un cancer tel que la maladie lymphoproliférative des lymphocytes granulaires, une maladie auto-immune telle que la polyarthrite rhumatoïde, une maladie infectieuse telle que le paludisme, une réponse allergique, im rejet de greffe.
30. Méthode d'identification de molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de : i. mise en contact des molécules candidates avec des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 (ou avec des fragments de tels polypeptides), et de ii. sélection de celles des molécules candidates pour lesquelles une liaison auxdits polypeptides (ou auxdits fragments de polypeptides) est observée.
31. Méthode d'identification de molécules capables de moduler une activité cellulaire résultant de l'activation d'un KAR, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes de : i. mise en contact des molécules candidates avec des molécules adaptatrices ou effectrices de l'activation d'un KAR telles qu'obtenues par la méthode selon la revendication 30 et avec des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 (ou avec des fragments de tels polypeptides), et de ii. sélection de celles des molécules candidates qui exercent un effet sur la liaison entre lesdits polypeptides (ou lesdits fragments de polypeptides) et lesdites molécules adaptatrices ou effectrices, telle qu'observée en l'absence desdites molécules candidates.
EP98921586A 1997-04-30 1998-04-30 Polypeptides associes a des recepteurs activateurs et leurs applications biologiques Withdrawn EP0977855A2 (fr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9705411 1997-04-30
FR9705411A FR2762844B1 (fr) 1997-04-30 1997-04-30 Nouveaux polypeptides associes a des recepteurs activateurs et leurs applications biologiques
FR9800927 1998-01-28
FR9800927 1998-01-28
PCT/FR1998/000883 WO1998049292A2 (fr) 1997-04-30 1998-04-30 Polypeptides associes a des recepteurs activateurs et leurs applications biologiques

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP0977855A2 true EP0977855A2 (fr) 2000-02-09

Family

ID=26233499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP98921586A Withdrawn EP0977855A2 (fr) 1997-04-30 1998-04-30 Polypeptides associes a des recepteurs activateurs et leurs applications biologiques

Country Status (5)

Country Link
US (1) US7569666B2 (fr)
EP (1) EP0977855A2 (fr)
JP (2) JP2002503094A (fr)
CA (1) CA2287916A1 (fr)
WO (1) WO1998049292A2 (fr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999006557A2 (fr) * 1997-08-01 1999-02-11 Schering Corporation Proteines de membrane cellulaire mammalienne et reactifs associes
US6416973B1 (en) 1997-08-01 2002-07-09 Schering Corporation Nucleic acids encoding mammalian cell membrane protein MDL-1
US20040045041A1 (en) * 2000-09-20 2004-03-04 Eric Vivier Means for the identification compounds capable of inhibiting karap-transduced signals
CA2433474A1 (fr) * 2001-02-23 2002-09-06 Human Genome Sciences, Inc. 70 proteines humaines secretees
JP2008502597A (ja) * 2004-04-30 2008-01-31 イネイト・ファーマ Ｎｋ型ｌｄｇｌのような免疫増殖性障害を処置するための組成物および方法
ATE531733T1 (de) 2005-01-06 2011-11-15 Novo Nordisk As Kir-bindende wirkstoffe und verfahren zu ihrer verwendung
JP6424757B2 (ja) * 2015-07-14 2018-11-21 株式会社島津製作所 ポリペプチドの質量分析方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1908395A (en) * 1994-01-28 1995-08-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Antibodies to mammalian natural killer antigens and uses

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9849292A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2287916A1 (fr) 1998-11-05
WO1998049292A2 (fr) 1998-11-05
JP2002503094A (ja) 2002-01-29
US20050130130A1 (en) 2005-06-16
WO1998049292A3 (fr) 1999-05-27
JP2009005699A (ja) 2009-01-15
US7569666B2 (en) 2009-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chan et al. Differential expression of ZAP-70 and Syk protein tyrosine kinases, and the role of this family of protein tyrosine kinases in TCR signaling.
Clevers et al. The T cell receptor/CD3 complex: a dynamic protein ensemble
KR100202435B1 (ko) 세포간 유착 분자(아이씨에이엠-1)과 유사하나 뚜렷하게 구별되는 가용성 세포간 유착 분자(에스아이씨에이엠-1)
US20090304657A1 (en) Chimeric t cell receptors and related materials and methods of use
US20090042798A1 (en) T cell receptors and related materials and methods of use
EP0942973B1 (fr) Mutants de la proteine lag-3, leur expression et utilisation
JP3973167B2 (ja) リンパ球活性化抗原ｈｂ１５：免疫グロブリン上科の一種
US20050221438A1 (en) Novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells and antibodies that identify the same
CA2379336A1 (fr) Utilisation d&#39;un polypeptide pour detecter, prevenir ou traiter un etat pathologique associe a une maladie degenerative, neurologique ou autoimmune
JP2013535963A (ja) Ｍｈｃクラスｉｉと糖尿病関連自己抗原性ペプチドとの天然型複合体に対するｔ細胞受容体様特異性を有する単離された高親和性実体
JP2009005699A (ja) 活性化レセプタに会合される新しいポリペプチド及びその生物学的応用
US5891437A (en) Antigen associated with type I diabetes mellitus
JP3176338B2 (ja) ヒト ガンマ，デルタｔ細胞抗原レセプターポリペプチド及び核酸
WO2001036630A9 (fr) Nouveau recepteur de declenchement implique dans la cytotoxicite naturelle induite par les lymphocytes tueurs naturels (nk) et anticorps permettant de l&#39;identifier
US20190359677A1 (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same for the treatment of cancer and infectious diseases
CA2461692A1 (fr) Utilisation d&#39;une proteine de la famille des crmps pour le traitement des maladies liees au systeme immunitaire
CA2051651A1 (fr) Anticorps monoclonaux reconnaissant un peptide associe a un antigene majeur d&#39;histocompatibilite
US20040248257A1 (en) SPEX compositions and methods of use
EP1228212B1 (fr) Proteine presente a la surface des cellules souches hematopoietiques de la lignee lymphoide et des cellules nk, et ses applications.
JP2023530238A (ja) キメラ抗原発現免疫細胞のインビトロ腫瘍殺傷活性を決定するための細胞ベースのアッセイ
JPH07504817A (ja) Ｂ２９（Ｉｇ‐βまたはＩｇ−γ）を含むレセプタ複合体およびその利用
FR2762844A1 (fr) Nouveaux polypeptides associes a des recepteurs activateurs et leurs applications biologiques
JPH10510707A (ja) 哺乳動物細胞表面抗原をコードする精製された遺伝子；タンパク質および抗体
WO2000050611A1 (fr) Proteines ganp
WO1996024846A1 (fr) Recepteur d&#39;inositol 1,4,5-triphosphate des lymphocytes t chez l&#39;homme

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 19991124

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: TOMASELLO, ELENA

Inventor name: VELY, FREDERIC

Inventor name: OLCESE, LUCIA

Inventor name: MORETTA, ALESSANDRO

Inventor name: VIVIER, ERIC

17Q First examination report despatched

Effective date: 20030704

17Q First examination report despatched

Effective date: 20030704

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20091027