JP3176338B2 - ヒト ガンマ，デルタｔ細胞抗原レセプターポリペプチド及び核酸 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、２ｂｃ型と称する
ヒトγＴ細胞抗原レセプターポリペプチドの１つの型に
関し、この型は分子量が約４０，０００ダルトン、かつ
２つのＣγ２ＣＩＩエキソンコピーのみによってコード
された配列を含む１つの定常領域を有する。また本発明
は、γ２ｂｃ型からなるＴ細胞抗原レセプターヘテロダ
イマー、及びγ２ｂｃ型及びそれらの一部分をコードす
る核酸配列に関する。本発明はまた、γ又はδＴ細胞抗
原レセプターポリペプチドのエピトープに特異的な反応
性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】Ｔ細胞
抗原レセプター（ＴＣＲ）は、一方がα鎖、他方がβ鎖
と呼ばれる二種類のグリコシルサブユニットからなり、
Ｔ細胞上でクローン特異的ジスルフィド結合ヘテロダイ
マーであるとされていた。α及びβＴＣＲサブユニット
は、それぞれ、約５０，０００及び約４０，０００の相
対分子質量（Ｍｒ）を有する（Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：２２９３
−２３００；Ｍｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：７０５−７１９； Ｈａ
ｓｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１５７：１１４９−１１６９）。遺伝子は、Ｔ細
胞の個体発生の間に再編成され、そしてβＴＣＲ（Ｙａ
ｎａｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｅｒ ３
０８：１４５−１４９； Ｈｅｄｒｉｃｋ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３０８：１５３−１５
８）及びαＴＣＲ（Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８
４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３１−３５；Ｓａｉｔｏ
ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３６
−４０； Ｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１２：７７１−７７５）をコードする遺伝子
は、サブトラクティブハイブリダイゼーンョン又はオリ
ゴヌクレオチドによるつりあげのいずれかによって単離
された。

【０００３】Ｔ細胞クローンのＴ細胞抗原レセプターの
α及びβ鎖は、それぞれ、Ｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ）、Ｄ
（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｊ（ｊｏｉｎｉｎｇ）及びＣ
（ｃｏｎｓｔａｎｔ）と呼ばれるドメインのユニークな
組み合わせから構成される（Ｓｉｕ ｅｔ ａｌ．，１
９８４，Ｃｅｌｌ ３７：３９３； Ｙａｎａｇｉｅｔ
ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２； ３４３０）。超可変領域が同
定された（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１２：４０； Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：４３０）。各
Ｔ細胞クローンにおいて、α及びβ鎖のＶ、Ｄ及びＪド
メインの組み合わせは、Ｔ細胞クローン抗原認識にユニ
ークな様式で関与し、そしてＴ細胞クローンのイディオ
タイプとしても公知のユニークは結合部位を定義する。
対照的に、Ｃドメインは抗原の結合には関与しない。

【０００４】ヒトα、βＴＣＲのユニークな特性は、観
察されたコモジュレーション（Ｍｅｕｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：７０５
−７１９）、同時免疫沈降（ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ
８８／００２０９号，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊａｎｕ
ａｒｙ １４，１９８８； Ｏｅｔｔｇｅｎ，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１
２，０３９−１２，０４８）であり、α、βＴＣＲ分子
とＣＤ３グリコタンパク質複合体との要求される同時共
発現（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１６０：１２８４−１２９９）であった。

【０００５】その後、二種類のタンパク質複合体の直接
的な物理的会合は、α、βＴＣＲ分子をＴ３グリコタン
パク質への化学的架橋と、ＴＣＲサブユニット及びＴ３
グリコタンパク質（Ｍｒ ２８，０００）サブユニット
のような架橋複合体成分を同定することによって証明さ
れた（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｃｅ
ｌｌ ４０：１８３−１９０）。Ｔ３のカウンタパート
は、マウスα、βＴＣＲと同様に会合する（Ａｌｌｉｓ
ｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４：１
０７−１０９； Ｓａｍｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９
８４，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８１：１３１−１４
４）。

【０００６】Ｔ細胞中で再編成され、γＴＣＲと呼ばれ
る第３の遺伝子は、最初マウスで（Ｓａｉｔｏ ｅｔ
ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３０９：７５７−７
６２； Ｋｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１３：７６２−７５５； Ｈａｙｄａｙ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８５，Ｃｅｌｌ ４０：２５９−２６
９）同定され、ついでヒトで同定された（Ｌｅｆｒａｃ
ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４
６４−４６６； Ｍｕｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８
５，Ｎａｔｕｒｅ ３１６；５４９−５５２）。

【０００７】ヒトγＴＣＲ遺伝子座は、５〜１０個の可
変領域遺伝子、５個の結合領域遺伝子及び２個の定常領
域遺伝子からなるらしい（Ｄｉａｌｙｎａｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：２６１９）。機能的な可変領域
及び結合領域の総数は限定されているが、重要な多様性
がＶ−Ｊ結合プロセスにおいて導入される（Ｋｒａｎｚ
ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：７
５２−７５５； Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９
８６，Ｃｅｌｌ ４５：２３７−２４６； Ｑｕｅｒｔ
ｅｒｍａｎｕｓｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ
３２２：１８４）。γＴＣＲ遺伝子の再編成は、サプ
レッサー表現型、細胞障害表現型並びにヘルパー表現型
を有するリンパ球で生ずる（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１６：４６４−４６
６； Ｍｕｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１６：５４９−５５２； Ｑｕｅｒｔｅｒｍａ
ｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
１：２５２−２５５； Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔａｌ．，
１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：２３７−２４６； Ｉｗａ
ｍｏｔｏ ｅｔａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１６３；１２０３−１２１２； Ｚａｕｄｅｒｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６
３：１３１４−１３１８）。

【０００８】γＴＣＲ遺伝子産物は、Ｔ３同時免疫沈降
で、αβＴＣ−ＣＤ３⁻Ｔから同定されている（Ｂｒｅ
ｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３
２２：１４５−１４９； Ｂａｎｋ ｅｔ ａｌ．，１
９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２ ：１７９−１８１；
Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ３
２５，６８３−６８８： Ｍｏｉｎｇｅｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５，７２３−７２
６，ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ８８／００２０９号，ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊａｎｕａｒｙ １４，１９８
７）。γＴＣＲポリペプチドは、γＴＣＲペプチド配列
に対するモノクローナル抗体を使用して同定され、これ
らのポリペプチドは、δＴＣＲと呼ばれる他のポリペプ
チドを有するヘテロダイマーに組み込まれることが見い
出された（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔａｌ．，１９８６ Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２２；１４５−１６９）。γ，δヘテロ
ダイマーは、非共有結合的にＣＤ３と会合することが報
告された。

【０００９】γＴＣＲ特異的ペプチドに対する抗血清を
使用すると、末梢血、胸腺及び白血病細胞系に起源を有
する細胞上でＣＤ３会合γＴＣＲポリペプチドを同定す
ることができる（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９
８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１４５−１４９； Ｂａ
ｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２
２：１７９−１８１； Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，１
９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８３：６９９８−７００２； Ｂｒｅｎｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６
８９−６９４；Ｌｅｗ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３４：１４０１−１４０５）。

【００１０】Ｂａｎｋら（前出）は、ヒト胸腺細胞クロ
ーン表面上で６２，０００ｋＤのペプチド及びＴ３と会
合した４４ｋＤのγ型を開示した。また、類似のγＴＣ
ＲポリペプチドがマウスＴリンパ球上で同定され、そし
て胸腺細胞の分化中におけるこのペプチドの発現は、最
近の多くの研究の対象である（Ｒｏｕｌｅｔ ｅｔａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：１０３−１０
７； Ｓｎｏｄｇｒａｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，
Ｎａｔｕｒｅ ３１５：２３２−２３３； Ｌｅｗ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１４
０１−１４０８； Ｐａｒｄａｕ ｅｔ ａｌ．，１９
８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２６：７９−８１； Ｂｌｕｅ
ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ
３２６：８２−８４）。

【００１１】γＴＣＲ^＋ヒト細胞系の研究によると、２
種類の異なるγＴＣＲポリペプチドでは、分子量及びジ
スルフィド結合形成能が異なることが認められた（Ｂｏ
ｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２
５：６８３−６８８； Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９−６９
４； Ｍｏｉｎｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２５：７２３−７２６： Ｌａｎｉｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６
５：１０７６）。それぞれＣγ１及びＣγ２と呼ばれる
２種類の異なるγＴＣＲ定常領域遺伝子セグメントを比
較し、Ｃγ１の第２エキソンでコードされたンステイン
残基はＣγ２エキソンセグメント中にはなく、その欠失
によっていくつかのγＴＣＲペプチドにジスルフィド結
合形成能がないことが説明されることが示唆された（Ｋ
ｒａｎｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３７：１５０１−１０５５： Ｌｉｔｔｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２６：８５０８８）。

【００１２】γＴＣＲが多くの形態を有することとは対
照的に、δＴＣＲは比較的変化がなく、定常領域のみが
存在する（Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２）。Ｔ細胞個体発生
の間、γＴＣＲ遺伝子の再編成がβＴＣＲ遺伝子及びα
ＴＣＲ遺伝子の再編成に先行することが示された（Ｒｏ
ｕｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３
１４：１０３−１０７； Ｓｎｏｄｇｒａｓｓ ｅｔａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：２３２−２３
３； Ｓａｎｇｏｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１４９１−１５０８）。

【００１３】成熟した、循環しているＴリンパ球の比較
的少ない部分がγδ ＴＣＲ^＋であり、ＣＤ３^＋４⁻
８⁻（二重陰性）表面抗原又はＣＤ３^＋４⁻８^＋表面抗
原を示す。ＣＤ３^＋４⁻８⁻Ｔ細胞は、成熟ＣＤ３^＋Ｔ
細胞の約２％を構成する。大部分の成熟ＣＤ３^＋４^＋又
はＣＤ３^＋８^＋の主要組織適合性遺伝子座（ＭＨＣ）が
細胞障害Ｔ細胞を拘束するのとは異なり、ＣＤ３⁻ナチ
ュラルキラー細胞と同様に、γδ ＴＣＲ^＋ＣＤ３^＋４
⁻８⁻クローン化リンパ球は、ＭＨＣ非拘束細胞溶解活
性を現すことが示された。しかしながら、ナチュラルキ
ラー細胞と異なり、これらのγδ^＋ＣＤ３^＋４⁻８⁻Ｔ
細胞はＫ−５６２などのナチュラルキラー細胞の標的を
首尾一貫して殺さなかった（Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，３２５：６８３−６８８；Ｂｒｅｎｎ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２
５：６８９−６９４； Ｍｏｉｎｇｅｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７２３−７２
６； Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，
Ｎａｔｕｒｅ ３２６：８２−８４）。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、２ｂｃ型と呼
ばれるヒトγＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）ポリペプ
チドの１型に関する。２ｂｃ型のγＴＣＲ鎖は、図１４
に実質的に示した一次アミノ酸配列を有する。２ｂｃ型
のγＴＣＲ鎖は、分子量が約４０，０００ダルトンであ
り、２つのＣγ２ＣＩＩエキソンコピーだけでコードさ
れた配列からなる定常領域を含む。また、本発明は、γ
ＴＣＲポリペプチド２ｂｃ型を含むＴＣＲヘテロダイマ
ーに関する。

【００１５】また、本発明は、γＴＣＲの２ｂｃ型をコ
ードする核酸配列及び２つのＣＩＩエキソンだけを有す
るＣγ２定常領域を含む核酸配列に関する。特別の実施
態様においては、本発明の核酸は、図１４に示した核酸
配列の少なくとも一部分を含む。

【００１６】本発明は、γ又はδＴＣＲポリペプチドの
エピトープに特異的な反応性を示すモノクローナル抗体
を提供する。かかる抗体は、γδＴＣＲ及びＣＤ３抗原
の両方を発現している細胞上でＣＤ３抗原をコモジュレ
ートする能力を検出することによって同定し得る。特別
の実施態様においては、本発明はδＴＣＲ鎖の可変領域
に反応性を示す抗体に関する。

【００１７】さらに特殊な実施態様においては、かかる
抗体は、細胞における機能的なδＴＣＲ可変遺伝子の再
編成の検出に使用することができる。他の実施態様にお
いては、本発明は、δＴＣＲポリペプチド定常領域に反
応性を示す抗体に関する。さらに別の実施態様におい
て、本発明は、γＴＣＲポリペプチド定常領域に反応性
を有する抗体に関する。本発明の他の態様において、細
胞中でγδＴＣＲを発現させる方法が提供される。

【００１８】すなわち、本発明は、ヒトＴ細胞抗原レセ
プターデルタ鎖の可変領域又は再編成された可変−結合
領域の１エピトープと反応性を有するモノクローナル抗
体である。上記抗体は、ＡＴＣＣに寄託され、受託番号
ＨＢ９５７８が与えられたハイブリドーマによって産生
され、ヒトＴ細胞抗原レセプターデルタ鎖の定常領域の
１エピトープと反応性を有するモノクローナル抗体ＴＣ
Ｓδ１（δＴＣＡＲ−３）からなることを特徴とする。

【００１９】さらに、本発明は、ＡＴＣＣに寄託され、
受託番号ＨＢ９７７２が与えられたハイブリドーマによ
って産生されるモノクローナル抗体抗ＴＣＲδ１からな
るモノクローナル抗体であることを特徴とする。また、
本発明は、上記のいずれかに記載のモノクローナル抗体
のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａ’又はＦ（ａｂ’）_２フラグメン
トである。

【００２０】本発明はまた、上記のいずれかに記載のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。本
発明は、細胞におけるヒトデルタＴ細胞抗原レセプター
可変遺伝子の機能的再編成の存在を検出する方法であっ
て、細胞又は細胞のポリペプチド含有サンプルを、再編
成された遺伝子によってコードされたポリペプチドの１
エピトープに特異的な反応性を有するモノクローナル抗
体と接触させることからなる方法である。ここで、モノ
クローナル抗体が、ＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＨＢ
９５７８が与えられたハイブリドーマによって産生され
たＴＣＳδ１（δＴＣＡＲ−３）を含有することを特徴
とする。

【００２１】本発明はさらに、 （ａ）生細胞表面上でγ，δＴ細胞抗原レセプター及び
ＣＤ３抗原を発現する細胞と抗体とを、ＣＤ３抗原がコ
モジュレーションを生じるのに十分な時間接触させ、そ
して、 （ｂ）ＣＤ３抗原のコモジュレーションを検出する工程
を含んでなる、γ，δＴ細胞抗原レセプターと反応性を
有するモノクローナル抗体の同定方法である。

【００２２】ここで、上記コモジュレーションの検出
が、 （ａ）細胞とＣＤ３抗原に対する標識抗体とを、標識抗
体がＣＤ３抗原に結合するのに十分な時間接触させ、そ
して （ｂ）結合した標識抗体の量を測定することからなるこ
とを特徴とする。本発明はまた、ＣＤ３抗原をコモジュ
レーションさせる能力を有することを特徴とする上記の
モノクローナル抗体である。

【００２３】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本明細書で使用される用語の意味を次に示す。 ＴＣＲ＝Ｔ細胞抗原レセプター Ｖ ＝可変 Ｄ ＝ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｊ ＝結合 Ｃ ＝定常 ｍＡｂ＝モノクローナル抗体

【００２４】図１に、抗ＴＣＲ δ１を使用したＴ細胞
系のサイトフルオログラフ分析（細胞蛍光間接撮影分
析）の結果を示す。図２には、ｍＡｂ 抗ＴＣＲδ１の
特異性の免疫化学分析の結果を示す。表面^１２５Ｉ標識
ＩＤＰ２細胞を、対照ｍＡｂ Ｐ３（レーン１及び
２）、抗ｌｅｕ４（レーン３〜５）、抗ＴＣＲδ１（レ
ーン６〜８）又は抗Ｃγ血清（レーン９）を使用して免
疫沈降させ、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動）によって分離し、オートラジオグラ
フィーで可視化した。Ｎは非還元条件を表わし、Ｒは還
元条件を表わす。

【００２５】図３に、δＴＣＲのＮ−グリカナーゼ消化
の結果を示す。図４には、ｐＧＥＭ３−０−２４０／３
８の地図を示す。図５に、ｍＡｂ 抗ＴＣＲδ１による
ｃＤＮＡクローンＩＤＰ２ ０−２４０／３８のｉｎ
ｖｉｔｒｏ翻訳生成物の免疫沈降の結果を示す。図６
に、Ｔ細胞抗原レセプターの免疫沈降及びＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析の結果を示す。白抜きの矢印はδ鎖の位置を示
す。黒い矢印はγ鎖の位置を示す。溶解物は、δＴＣＡ
Ｒ−３抗体（奇数レーン）又はβＦ１抗体（偶数レー
ン）を使用して免疫沈降させた。

【００２６】図７には、δＴＣＡＲ−３抗体によるδ鎖
の免疫沈降の結果を示す。ＭＯＬＴ−１３細胞は、０．
３％のＨＣＡＰＳ含有トリス−バッファー生理食塩水
（ｐＨ８）（レーン１）又は１％のＴｒｉｔｏｎｘ−１
００（レーン２〜７）に溶解した。レーン１では、δＴ
ＣＡＲ−３は、ＣＤ３タンパク質でγ，δＴＣＲヘテロ
ダイマーを免疫沈降させた。レーン２では、δＴＣＡＲ
−３は、ＣＤ３タンパク質なしでγ，δＴＣＲヘテロダ
イマーを免疫沈降させた。レーン３と４では、δＴＣＡ
Ｒ−３は、変性溶解物からの一本のδ鎖を、それぞれ非
還元条件（Ｎ）及び還元条件（Ｒ）において免疫沈降さ
せた。レーン５では、ＵＣＨＴ−１は、ＣＤ３タンパク
質を免疫沈降させた。レーン６では、βＦ１抗体は、Ｍ
ＯＬＴ−１３細胞からヘテロダイマーを免疫沈降させな
かった。レーン７では、抗Ｃγ抗血清は、一本のγ鎖を
免疫沈降させた。

【００２７】図８には、フロサイトメトリーによる細胞
表面染色分析の結果を示す。γ，δＴＣＲ陽性細胞（Ｍ
ＯＬＴ−１３，ＰＥＥＲ，ＩＤＰ２）及びα，βＴＣＲ
陽性細胞（ＨＰＢ−ＡＬＬ，Ｊｕｒｋａｔ）は、δＴＣ
ＡＲ−３、ＯＫＴ−３、ＷＴ３１及び正常マウス血清
（ＮＭＳ）とともにインキュベートし、フローサイトメ
トリーによって分析した。Ｂ細胞系のＤａｕｄｉを陰性
対照とした。図９に、δＴＣＡＲ−３^＋及びＯＫＴ３^＋
末梢血リンパ球の二色サイトフルオログラフ分析（細胞
間接撮影分析）結果を示す。フルオレセインイソチオシ
アネート（ＦＩＴＣ）の蛍光をＹ軸に、フィコエリトリ
ン（ＰＥ）のケイ光をＸ軸に示した。このサンプル中の
ＣＤ３^＋γ、δＴＣＲ^＋細胞は２．４％のＣＤ３^＋リン
パ球を示す。

【００２８】図１０には、細胞質内Ｃａ^２＋濃度（［Ｃ
ａ^２＋］_ｉ）を経時的に測定した結果を表す。上部パネ
ル：δＴＣＡＲ−３。下部パネル：抗Ｌｅｕ抗体。矢印
は、抗体添加時を示す。図１１に、３型のγ，δＴＣＲ
の免疫沈降の結果を示す。Ａ〜Ｅの部分について、免疫
沈降に使用した抗体は、抗Ｌｅｕ４（抗ＣＤ３）、βＦ
１（抗ＴＣＲβ）、抗δ１ＴＣＲ（抗δＴＣＲ）、抗Ｃ
γｂ血清（抗γＴＣＲ）及びＰ３（非標識レーン、対
照）であった。^１２５Ｉ標識細胞溶解物からの免疫沈降
物は、還元条件（Ｒ）又は非還元条件（Ｎ）において、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）で分析
した。白い矢印は還元条件下におけるＴＣＲ δの位置
を示し、一方黒い矢印は非還元条件下におけるδＴＣＲ
の位置を示す。サイズマーカーのＭｒは１０００の単位
で、左側に示す。

【００２９】Ａ）ＰＢＬ−Ｌ２上でジスルフィド結合し
ていないγＴＣＲ（４０ｋＤ）。レーン１〜６において
放射性標識された細胞を、０．３％のＣＨＡＰＳ界面活
性剤で可溶化した。この界面活性は、ＴＣＲ−ＣＤ３会
合を保存する。一方、レーン７と８においては、免疫沈
降を鎖の分離後に行なった（方法を参照のこと）。 Ｂ）ＩＤＰ２細胞上でジスルフィド結合していないγＴ
ＣＲ（５５ｋＤ）。レーン１〜４では、放射性標識され
た細胞を０．３％のＣＨＡＰＳ界面活性剤で可溶化し、
一方、レーン５と６においては、免疫沈降を鎖の分離後
に行なった。 Ｃ）ＷＭ−１４上でジスルフィド結合したγＴＣＲ（４
０ｋＤ）。全てのレーンは、１％ジギトニン溶解放射性
標識細胞からの免疫沈降物に対応する。

【００３０】Ｄ）胸腺クローンＩＩ細胞上でジスルフィ
ド結合していないγＴＣＲ（４０ｋＤ）。放射性標識細
胞は、１％ジギトニン（レーン１〜４）又は０．１％の
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（レーン５と６）で可溶化
し、一方、レーン７と８においては、鎖の分離後に免疫
沈降を行なった。 Ｅ）ＭＯＬＴ−１３白血病Ｔ細胞上でジスルフィド結合
していないγＴＣＲ（４０ｋＤ）。レーン１〜４におい
て０．３％のＣＨＡＰＳ界面活性剤で細胞を可溶化した
後に免疫沈降を行ない、一方、レーン５と６では、鎖の
分離後に免疫沈降を行なった。

【００３１】図１２には、抗Ｃγｍ１抗体及び抗ＴＣＲ
δ１抗体のそれぞれによるγＴＣＲ鎖及びδＴＣＲ鎖
の免疫沈降の結果を示す。細胞表面放射性標識ＭＯＬＴ
−１３細胞を、０．３％のＣＨＡＰＳ界面活性剤で可溶
化し、γ，δＴＣＲ−ＣＤ３複合体を抗ＣＤ３モノクロ
ーナル抗体で単離した。免疫沈降物を、還元条件にて１
０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。 レーン１：坑Ｌｅｕ４（抗ＣＤ３）ｍＡｂによる免疫沈
降。 レーン３：単離されたγ，δＴＣＲ−ＣＤ３複合体の鎖
を分離した後の抗Ｃγｍ１（抗ＴＣＲγ）による免疫沈
降。 レーン４：単離されたγ，δＴＣＲ−ＣＤ３複合体の鎖
を分離した後の抗ＴＣＲδ１（抗ＴＣＲδ）による免疫
沈降。

【００３２】図１３には、ＰＥＥＲ及びＭＯＬＴ−１３
細胞からのγＴＣＲ及びδＴＣＲのペプチド骨格の大き
さ及びグリコシル化の測定の結果を示す。免疫沈降に用
いられたモノクローナル抗体は、各レーン上部に示した
ように抗Ｃγｍ１（抗ＴＣＲγ）、抗ＴＣＲδ１（抗Ｔ
ＣＲδ）及びＰ３（標識対照）である。使用した標識細
胞系は、各１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフ
又はフルオグラフの下部に示した。サンプルは全て還元
条件で分離した。サイズマーカーＭｒは１，０００の単
位である。

【００３３】Ａ）ＰＥＥＲ及びＭＯＬＴ−１３細胞から
のγＴＣＲペプチド主鎖の大きさ。細胞を^３５Ｓ−シス
テイン及び^３５Ｓ−メチオニンで１５分間、生合成的に
標識した。サンプルは、Ｅｎｄｏ Ｈ（＋）処理又はｍ
ｏｃｋ処理のいずれかの処理を行なった。坑Ｃγｍ１に
よる免疫沈降はＰＥＥＲ細胞（レーン３）及びＭＯＬＴ
−１３細胞（レーン７）の未成熟なγＴＣＲの位置を示
すが、対応するポリペプチド骨格の大きさはＥｎｄｏ
Ｈ（レーン４と８）処理後に可視化した。 Ｂ）ＭＯＬＴ−１３細胞からのＴＣＲδのグリコシル
化。^１２５Ｉ標識細胞は抗ＣＤ３のｍＡｂで免疫沈降
し、δＴＣＲポリペプチドは、Ｎ−グリカナーゼ（レー
ン４）、Ｅｎｄｏ Ｈ（レーン２）とインキュベーショ
ンするか、又はｍｏｃｋ処理（レーン１と３）の前にゲ
ル精製した（方法を参照のこと）。

【００３４】図１４に、ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲの核
酸配列（２ｂｃ型）を示す。パートＡ：クローンＭ１３
Ｋの配列決定の戦略。１．１ｋｂのｃＤＮＡクローンＭ
１３Ｋの部分制限地図を示す。パートＢ；クローンＭ１
３Ｋの核酸及び推定アミノ酸配列。シグナル配列遺伝子
セグメント（Ｓ）、可変領域遺伝子セグメント（Ｖ）、
Ｎ−領域遺伝子セグメント（Ｎ）、結合領域遺伝子セグ
メント（Ｊ）及び定常領域遺伝子（ＣＩ、ＣＩＩｂ、Ｃ
ＩＩｃ及びＣＩＩＩ）セグメントを矢印で示す。

【００３５】これらは、ＳとＶについてはＬｅｆｒａｎ
ｃら（１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：２３７−２４６）に
よって記載されたゲノム配列と、ＪについてはＬｅｆｒ
ａｎｃら（１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３１９：４２０−
４２２）とＱｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓら（１９８７，Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１３８：２６８７−２６９０）によって記
載されたゲノム配列と、そしてＣについてはＬｅｆｒａ
ｎｃら（１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９５９６−９６００）及びＰ
ｅｌｌｉｃｃｉら（１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
７：１０５１−１０５５）によって記載された配列と比
較して同定された。イニシエーターであるメチオニンで
始まる推定アミノ酸配列は、核酸配列の下に示す。細胞
外システインは四角で囲み、潜在的なＮ−結合炭水化物
接着部位［Ｎ−Ｘ−Ｓ又はＮ−Ｘ−Ｔ；（Ｍａｒｓｈａ
ｌｌ，１９７７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４
１；６３７−７０２）］はかっこで示した。

【００３６】図１５には、γ，δＴＣＲ１型の優先的使
用の結果を示す。３人の健常ドナーからの新鮮な単離末
梢血液単核細胞を^１２５Ｉ標識し、１％のＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００で可溶化した。Ｐ３（対照、レーン１と
３）及び抗ＴＣＲδ１（抗ＴＣＲδ、レーン２と４）に
よる免疫沈降物は、非還元条件（Ｎ）及び還元条件
（Ｒ）で分析した。１０００単位を有するマーカーのＭ
ｒを左側に示す。

【００３７】図１６は、ヒトにおける三種のγ，δＴＣ
Ｒ型の模式図である。ＣＩＩエキソンがコードするコネ
クターペプチドは、Ｃγ１ＣＩＩエキソンがコードする
ペプチドとして黒ぬり部分とした。細い斜線を付した部
分、細かい点を付した部分、太い斜線を付した部分は、
それぞれＣγ２ＣＩＩエキソンコピーａ、コピーｂそし
てコピーｃコードペプチドを示す。潜在的なＮ−結合グ
リカン付着部位（Ｏ）、スルフヒドリル基（−ＳＨ）及
び推定ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を示した。

【００３８】図１７は、再配列されたδＴＣＲ遺伝子地
図である。ＥｃｏＲＩ（ＲＩ）、ＨｉｎｃＩＩ（Ｈ
ｃ）、ＳｃａＩ（Ｓ）とＰｖｕＩＩ（Ｐ）部位を含むｒ
１１９δ１地図及びサザンブロット分析で使用したプロ
ーブを示す。 図１８Ａは、ＭＯＬＴ−１３細胞系への
トランスフェクションに使用したγＴＣＲ鎖を示す模式
図である。模式図は、報告された分析に基づく（Ｂｒｅ
ｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２２：１４５−１４９； Ｂｒｅｎｎｅｒ，
Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２５：６８９−６９４： Ｋｒａｎｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．，
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７：６４
−６７）。図中、Ｐｒｅｄ．は予測値、Ｏｂｓ．は実測
値を示す。それぞれ３ｋＤの付着した炭水化物を含むと
推定される、すべての有用なＮ−結合グリコシル化部位
（頭に○をつけた棒で示した）が使用され、有意なサイ
ズの相違は他の翻訳後修飾によって導入されないという
ことが、予測されたグリコンル化ポリペプチドの大きさ
から仮定された。

【００３９】Ｉｇ様分子を代表とする鎖内ジスルフィド
結合を示す。システイン残基（Ｃｙｓ）はＰＢＬＣ１γ
ＴＣＲのＣＩＩエキソンによってコードされるが、この
ようなシステインは二種の他のγＴＣＲ鎖で使用された
ＣＩＩエキソンの全コピーには存在しないことに注意す
べきである。同様に５５ｋＤのγＴＣＲタンパク質を発
現する（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１
９８７，Ｎａｔｕｒｅ３２５：６８９−６９４； Ｗｅ
ｉｓｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．， １９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：６９９８−
７００２）γ，δＴ白血病細胞系ＰＥＥＲ（Ｌｉｔｔｍ
ａｎ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２６：８５−８８）のγＴＣＲ定常領域はＩＤＰ
２のそれと同一である。

【００４０】図１８Ｂには、発現プラスミド構築物ｐＦ
ｎｅｏ．ＰＢＬ及びｐＦｎｅｏ．ＩＤＰ２γを示す。Ｉ
ＤＰ２γをγＴＣＲクローンをＭＯＬＴ−１３細胞系に
導入するために使用した。ＰＢＬＣ１ γＴＣＲのｃＤ
ＮＡクローン（ＰＢＬ Ｃ１．１５）及び修復されたＩ
ＤＰ２γＴＣＲのｃＤＮＡクローン（ＩＤＰ２．１１
ｒ）（Ｋｒａｎｇｅｌ．Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６７）を、Ｅｃｏ
ＲＩ消化によって親プラスミドベクター（ｐＵＣ１８）
から切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で両
末端を末端切断型とし、ついでこのｃＤＮＡをＳａｌＩ
切断、及びクレノウ処理したｐＦｎｅｏ哺乳類発現ベク
ターへライゲートした。ＳＦＦＶ（ｓｐｌｅｅｎ ｆｏ
ｃｕｓ ｆｏｒｍｉｇ ｖｉｒｕｓ）のＬＴＲに関して
適切な方向でｃＤＮＡインサートを含むクローンを、制
限マッピングに基づいて選択した。ｐＦｎｅｏ（Ｓａｉ
ｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ
３２５：１２５−１３０）は、ＢａｍＨＩ 消化し、マ
ウスのβＴＣＲのｃＤＮＡインサートを除き、その後Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼでライゲートすることによって得ら
れたｐＴβＦｎｅｏの誘導体である（Ｏｈａｓｈｉ，
Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１６：
６０６−６０９）。図示したように、このベクターはＳ
Ｖ４０プロモーター制御下に細菌のネオマイシン耐性遺
伝子（ｎｅｏ^ｒ）を有し、哺乳類のレシピエント細胞に
抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。カッコ内の
制限部位は構築中に破壊した。

【００４１】図１９は、ＯＬＴ−１３のγＴＣＲトラン
スフェクタント上のγ，δＴＣＲの免疫沈降分析の結果
を示す図である。表面^１２５Ｉ標識細胞を、０．３％の
ＣＨＡＰＳ界面活性剤で可溶化して鎖の会合を保護し、
ｍＡｂ Ｐ３（対照）、抗ｌｅｕ４（抗ＣＤ３）、抗Ｔ
ＣＲδ１（抗δＴＣＲ）又は抗Ｔｉ−γＡ（抗Ｖγ２）
で免疫沈降し、その後、非還元条件（Ｎ）又は還元条件
（Ｒ）下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、先に記載した
オートラジオグラフィーによって可視化した（Ｂｒｅｎ
ｎｅｒ Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２２：１４５−１４９： Ｂｒｅｎｎｅｒ，
Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２５：６８９−６９４）。抗ＴｉγＡのｍＡｂは、Ｖγ
２セグメントの認識と一致する、異なるＴ細胞クローン
上での反応性のパターンを示す。Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１
はＰＢＬ Ｃ１由来のγＴＣＲ ｃＤＮＡでトランスフ
ェクトしたＭＯＬＴ−１３細胞であり、クローン＃７を
分析用に使用した。Ｍ１３．ＩＤＰ２γは、ＩＤＰＳ由
来γＴＣＲ ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＭＯＬＴ
−１３細胞であり、クローン＃１０を分析用に使用し
た。サイズマーカー、Ｍｒ（分子量）は、１０００ダル
トン単位である。白い矢印は、固有のＭＯＬＴ−１３γ
ＴＣＲ鎖を示し、黒い矢印はトランスフェクトした（Ｐ
ＢＬ Ｃ１又はＩＤＰ２由来）γＴＣＲ ｃＤＮＡを氏
示し、星印は、非還元条件下のＭＯＬＴ−１３のδＴＣ
Ｒ鎖を示す。還元すると、δＴＣＲ鎖は移動度が変化
し、４０ｋＤのγＴＣＲ鎖とともに移動する。しかしな
がら、δＴＣＲ鎖は、Ｍ１３．ＩＤＰ２γの抗Ｖγ２免
疫沈降（図１９レーン８）で見られたように、４０ｋＤ
のγＴＣＲタンパク質が同時免疫沈降しないときに、還
元条件下で４０ｋＤのバンドとしてはっきりと可視化さ
れた。

【００４２】図２０には、トランスフェクタントのγＴ
ＣＲポリペプチドの二次元ゲル分析の結果を示す。２×
１０^７個の細胞を表面^１２５Ｉ標識し、ノイラミダーゼ
（各々１ｍｇ／ｍＬのグルコースとウシ血清アルブミン
とを含む１．５ｍＬのＰＢＳ中に１５０ユニット、２３
℃で１．５時間）処理し、０．３％のＣＨＡＰＳ界面活
性剤で可溶化し、１μｇの抗ｌｅｕ４ ｍＡｂで免疫沈
降し、還元条件下で二次元（２Ｄ）ゲル分析した。平衡
化していないｐＨグラジェントゲル電気泳動（ＮＥＰＨ
ＧＥ）を、ｐＨ ３．５〜１０のアンフォリン（Ａｍｐ
ｈｏｌｉｎｅ，ＬＫＢ，スウェーデン）を使用して行な
い、その後１０．５％のアクリルアミドゲル上でＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった（Ｂｒｅｎ
ｎｅｒ．Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２５：６８９−６９４）。ＣＤ３成分の位置
（図示せず）を用いて異なる細胞系で発現されたγＴＣ
Ｒ種を同定し、比較した。Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１γトラ
ンスフェクタントのクローン＃１０とＭ１３．ＩＤＰ２
γの形質転換体のクローン＃１０を使用した。白い矢印
はＭＯＬＴ−１３ γＴＣＲ種を、黒い矢印はＩＤＰ２
γＴＣＲ種を、星印はＰＢＬ Ｃ１γＴＣＲ種を示す。

【００４３】図２１には、トランスフェクタントのγＴ
ＣＲ鎖の骨格ポリペプチドの大きさの分析の結果を示
す。細胞を^３５Ｓ−メチオニン及び^３５Ｓ−システイン
で１５分間パルス標識し、Ｐ３（対照）、抗Ｃγｍ１
（抗γＴＣＲ）又は抗ＴｉγＡ（抗Ｖγ２）ｍＡｂで免
疫沈降した。免疫沈降物を、エンドグリコシダーゼＨ
（Ｅｎｄｏ−Ｈ，＋）処理又はｍｏｃｋインキュベート
（−）処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、フルオログ
ラフィーで可視化した。全てのサンプルを還元した。Ｍ
ｒは分子量マーカーであり、１，０００ダルトン単位で
ある。アクチンのバンドに混入している４３ｋＤのもの
は、別の内部マーカーとして働く。Ｍ１３．ＩＤＰ２γ
はＩＤＰ２のγＴＣＲのｃＤＮＡ、クローン＃１０でト
ランスフェクトしたＭＯＬＴ−１３細胞であり、Ｍ１
３．ＰＢＬ Ｃ１γは、ＰＢＬ Ｃ１のγＴＣＲのｃＤ
ＮＡである、クローン＃１０でトランスフェクトしたＭ
ＯＬＴ−１３細胞である。

【００４４】図２２には、γδＴ細胞クローン及びポリ
クローナルヒトＴ細胞集団のサザンブロット分析の結果
を示す。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、Ｖ−Ｊプ
ローブでつりあげた。ＤＮＡ源は以下の通りである。Ｐ
ＢＬ Ｔ細胞クローン（レーン１、３〜９）、ＰＢＬ
（レーン１０）、新生児胸腺リンパ球（ＮＢＴ、レーン
１１）、胎児胸腺リンパ球（ＦＴ，レーン１２）及びＢ
細胞（胚細胞系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）、レーン２）であ
る。胚細胞系の３ｋｂのＶδ及び６．７ｋｂのＪδフラ
グメントをブロットの左側に示し、一方、５個の通常の
再編成、番号Ｉ〜Ｖを右側に示した。Ｉ〜Ｖの再編成の
大きさは、それぞれ、２．９ｋｂ、３．５ｋｂ、４．２
ｋｂ、６．２ｋｂ及び７．１ｋｂである。

【００４５】以下に本発明を詳細に説明する。 ５．１．γＴＣＲ ２ｂｃ型ポリペプチド及び核酸 本発明は、２ｂｃ型と呼ばれるある型のヒトγＴＣＲポ
リペプチドに関する（詳細は第８節及び第９節に記載す
る）。また、本発明は、ＤＮＡ及びＲＮＡなどのγ２ｂ
ｃ型をコードする核酸及びそれらに相補的な核酸に関す
る。

【００４６】１型と２ａｂｃ型γＴＣＲポリペプチドと
は、以前に、ヒトγＴＣＲの型であると報告されている
（ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ０８８／００２０９、１９
８８年１月４日発行）。１型γＴＣＲポリペプチドは、
約４０，０００ダルトンの分子量を有する。２ａｂｃ型
γＴＣＲポリペプチドは、約５５，０００ダルトンの分
子量を有する。２ａｂｃ型のγＴＣＲ鎖は、１型より若
干長いペプチド骨格を有し、かつ１型より１個多い特別
な潜在的Ｎ−結合グリカンを有する。対照的に、本発明
のγＴＣＲ鎖である、２ｂｃ型は約４０，０００ダルト
ンの分子量を有する。その上、２ｂｃ型γＴＣＲポリペ
プチドは、若干短いペプチド骨格及び２〜３個少ないＮ
−結合グリカンを有する。

【００４７】γＴＣＲ鎖２ｂｃ型は、前述した２ａｂｃ
型と比較して大きさが１５ｋＤ以上も相違する（４０ｋ
Ｄに対して５５ｋＤ）。この相違は、５ｋＤ短いポリペ
プチド骨格（３５ＫＤに対して４０ｋＤ）及び炭水化物
量の減少（５ｋＤに対して１５ｋＤ）によって説明され
る。２ｂｃ型の約３５ｋＤのポリペプチド骨格は、１型
からそれを区別することに役立つ：ちなみに１型の骨格
は４０ｋＤである。

【００４８】同様に、γＴＣＲポリペプチド２ｂｃ型
は、定常領域（Ｃγ）遺伝子セグメントの使用において
１型及び２ａｂｃ型と相違する。１型のγＴＣＲ鎖は、
単一のＣＩＩエキソンを含むＣγ１遺伝子セグメントに
よってコードされる定常領域を有する（Ｋｒａｎｇｅｌ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：
６４−６７）。２ａｂｃ型γポリペプチドは、３つのＣ
ＩＩエキソンコピー、すなわちコピーａ、コピーｂ及び
コピーｃを含むＣγ２遺伝子セグメントによってコード
される（Ｋｒａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６７； Ｌｉｔｔｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ３２６：８５
−８８）。これに対し、２ｂｃ型は、２ａｂｃ型のｃＤ
ＮＡに存在するＣγ２第２エキソンによってコードされ
た配列の１コピーを欠いている。このことにより、２ｂ
ｃ型は２つのＣγ２ＣＩＩエキソンコピー、すなわちコ
ピーｂとコピーｃとを含有する。ＣＩＩのコピーａは、
２ｂｃ型では欠失しているが、膜を貫く領域と細胞外定
常ドメインとの間の結合領域の一部分をコードする。

【００４９】６個の潜在的Ｎ結合炭水化物付着部位は、
２ｂｃ型ポリペプチド上に存在する。生化学データよ
り、２〜３個のＮ結合グリカンだけがポリペプチド鎖に
付着していることが示唆され、全ての潜在的部位が使用
されるわけではないことが示唆された。特別の実施態様
において、γＴＣＲポリペプチド２ｂｃ型は、ＭＯＬＴ
−１３（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３０：５６９−５７２）Ｔ細胞系又は胸腺由来ク
ローンＩＩ（Ｂａｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２２：１７９−１８１）の細胞から得られ
る。また、γＴＣＲ鎖２ｂｃ型は、そのγＴＣＲ型を発
現している被験者のＴリンパ球から得られる。２ｂｃ型
のγＴＣＲポリペプチドは、図１４に示されるγＴＣＲ
ポリペプチドの一次アミノ酸配列又はＣγ２のＣＩＩの
コピーｂとコピーｃとからなる定常領域を含むそれらの
いかなる部分をも含む。

【００５０】また、本発明は、分子量約４０，０００ダ
ルトンのγＴＣＲ ２ｂｃ型ポリペプチドをコードする
核酸分子を提供する。γＴＣＲ ２ｂｃ型ポリペプチド
の定常領域は、３つのＣγ２のＣＩＩエキソンのうち２
つだけを有する核酸配列の翻訳によって生ずる。同様
に、本発明はまた、２つのＣＩＩエキソンだけを有する
Ｃγ２定常領域を含む核酸配列に関する。核酸は、ＤＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらに相補的な核酸及びそ
れらの誘導体である。本発明の特別な実施態様において
は、ＤＮＡ分子は、図１４に示す核酸配列の少なくとも
一部を含む。第８節で議論する実施例では、２ｂｃのγ
ＴＣＲポリペプチド及びそのコード核酸配列を記載す
る。第９節で議論する実施例では、γＴＣＲポリペプチ
ドのジスルフィド結合を形成するかどうか、又はグリコ
シル化されるかどうかはその定常領域一次配列によって
決定されることを示す。

【００５１】５．２．γＴＣＲ ２ｂｃ型含有ポリペプ
チド複合体 また、本発明は、γＴＣＲ鎖２ｂｃ型を含むポリペプチ
ド複合体に関する。特別の実施態様において、ポリペプ
チド複合体はＴ細胞抗原レセプターダイマーからなる。
とりわけ、このようなダイマーは、ヘテロダイマー
（γ，δヘテロダイマー、γ，βヘテロダイマー、及び
α，γヘテロダイマー、又はγ’がγＴＣＲポリペプチ
ド１型、２ａｂｃ型又は２ｂｃ型であるγ，γ’ヘテロ
ダイマーなどを含むが、それらに限定されることはな
い）又はホモダイマーである。

【００５２】本発明の特別な実施態様において、γＴＣ
Ｒ ２ｂｃ型を含むポリペプチド複合体はγδＴＣＲヘ
テロダイマーである。このように、δＴＣＲポリペプチ
ド及びγＴＣＲ ２ｂｃ型ポリペプチドの少なくとも一
部を含む精製された複合体が、本発明によって提供され
る。δポリペプチドは、少なくとも１つの鎖内共有結合
ジスルフィド結合を有してもよい。加えて、このポリペ
プチドは、分子量約４０，０００ダルトンのδＴＣＲポ
リペプチドを含んでもよい。

【００５３】下記実施例で詳細に示すように、γＴＣＲ
２ｂｃ型鎖はδＴＣＲ鎖を有する複合体と非共有結合
的に会合する。このようにして、γ２ｂｃ型は、ジスル
フィド結合していないＴＣＲ複合体を形成する。また、
γＴＣＲ鎖２ａｂｃ型は、δＴＣＲ鎖とジスルフィド結
合ではなく複合体を形成し、（例えば、ＩＤＰ２細胞上
で）、一方γＴＣＲ鎖１型は、δＴＣＲポリペプチドと
のジスルフィド結合複合体を形成する。

【００５４】下記第９節の実施例に示すように、γＴＣ
Ｒの定常領域ＣＩＩエキソンの使用（及びγＴＣＲ鎖の
一次配列）は、ＴＣＲγ及びδ間のジスルフィド結合の
存在の有無を決定するばかりでなく、γＴＣＲに付着し
た炭水化物量をも決定し、この炭水化物量は、細胞表面
のγＴＣＲタンパク質の大きさの相違に大きく寄与す
る。このようにして、本発明は、ある定義された分子内
結合（ジスルフィド結合又は非ジスルフイド結合）とγ
ＴＣＲグリコシル化の程度とを有するγδＴＣＲヘテロ
ダイマーの発現を促進する方法を提供し、そしてこれは
特別なγ遺伝子を発現することができる細胞中に特別な
γポリペプチド型をコードするγＴＣＲ遺伝子を導入
し、細胞がδＴＣＲ鎖を発現する工程を含んでなる。

【００５５】加えて本発明は、別のγＴＣＲポリペプチ
ド（例えば、１型、２ａｂｃ型又は２ｂｃ型）と会合し
た本発明のγＴＣＲ ２ｂｃ型ポリペプチドを含む精製
された複合体を提供する。本発明のある実施態様では、
２種のγＴＣＲポリペプチドが、少なくとも１つの鎖間
の共有ジスルフィド結合を介して互いに会合する。本発
明の別の実施態様では、２種のγＴＣＲポリペプチド
は、互いに非共有結合的に会合している。本発明のさら
に別の実施態様において、２種のγＴＣＲポリペプチド
は同一の定常ドメインを有する。また、本発明の異なる
実施態様では、２種のγＴＣＲポリペプチドは異なる定
常ドメインを有する。

【００５６】５．３．γδＴＣＲポリペプチドと反応性
のモノクローナル抗体 γ又はδＴ細胞抗原レセプターのエピトープに対するモ
ノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、培地中で継代可能な細
胞系によって抗体分子の産生を提供するいかなる技術を
使用しても調製することができる。これらの技術には、
最初にケーラーとミルンュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎ
ｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５
６：４９５−４９７）によって記載されたハイブリドー
マ技術、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋ
ｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリ
ドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ７７−９６）を挙げることができる
が、これらに限定されるものではない。

【００５７】ある実施態様では、モノクローナル抗体
は、抗ヒトモノクローナル抗体又はキメラのヒト−マウ
ス（又は他の種の）モノクローナル抗体であってもよ
い。抗ヒトモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知
の多くの技術のいずれを用いて作製してもよい（例え
ば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：７３０
８−７３１２； Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８
３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２−７
９； Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：３−１６）。ヒト定常領域
を有するマウス（又はラット又は他の種の）抗原結合ド
メイン含有キメラ抗体分子を調製してもよい（Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎ ｅｔａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１；
Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ
３１４：４５２）。

【００５８】また、本発明は、Ｔ細胞抗原レセプターと
反応性を有するモノクローナル抗体の同定法に関する。
このようなｍＡｂは、Ｔ細胞抗原レセプターとＣＤ３複
合体の両方を発現する細胞にｍＡｂを結合させるとＣＤ
３抗原をコモジュレートする能力を検出することによっ
て同定するとができる。ＣＤ３のコモジュレーション
は、例えば、細胞が結合する標識抗ＣＤ３抗体の量を測
定することによって検出することができる。この方法
は、後述の第７．１．１節の実施例で示すが、そこでは
抗Ｖδ ｍＡｂであるδＴＣＡＲ−３を分泌するハイブ
リドーマを同定するために使用する。

【００５９】γ又はδＴＣＲポリペプチドのエピトープ
に対する抗体の分子クローンは、公知の技術によって作
製することができる。組み換えＤＮＡの方法（例えば、
Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）は、モノクローナ
ル抗体分子、又はそれらの抗原結合領域をコードする核
酸配列を構築するために使用してもよい。

【００６０】抗体分子は、公知の方法、例えば、免疫吸
着又はイムノアフィニティークロマトグラフィー、ＨＰ
ＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）などのクロマトグ
ラフィー法、又はそれらを組み合わせた方法等によって
精製してもよい。イディオタイプ分子を含む抗体のフラ
グメントは、公知の技術によって作製することができ
る。このようなフラグメントには、例えば、抗体分子の
ペプンン消化によって産生できるＦ（ａｂ’）_２フラグ
メント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド結
合を還元することによって作製できるＦａｂ’フラグメ
ント、及び抗体分子をパパインと還元剤とによって処理
して作製できるＦａｂフラグメントがあるが、これらに
限定されるのものではない。

【００６１】本発明の一実施態様は、δＴＣＲ鎖の可変
領域に反応性を有するモノクローナル抗体に関する。か
かる抗体はδＴＣＡＲ−３（ａｋａ ＴＣＳ δ１）
（第７節参照のこと）であり、特異的なδ遺伝子の再編
成によって発現されたエピトープを認識する。第７２節
で記載するようにｍＡｂ δ ＴＣＡＲ−３は、γ，δ
^＋Ｔリンパ球の増殖を促進することができる。また、モ
ノクローナル抗体δＴＣＡＲ−３は、γ，δ^＋Ｔリンパ
球の細胞質の遊離カルンウムイオン濃度の上昇を促進す
ることができる。

【００６２】別の実施態様においては、本発明は、γ又
はδＴＣＲポリペプチドの定常領域と反応性を有する抗
体に関する。特別な実施態様においては、本発明はδＴ
ＣＲ鎖定常領域と反応するｍＡｂ ＴＣＲδ１に関する
（第６節参照のこと）。また別の実施態様においては、
本発明はγＴＣＲ鎖の定常領域と反応するｍＡｂ抗Ｃγ
ｍ１に関する（第８．１．７節参照のこと）。

【００６３】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるも
のではない。 ６．ＴＣＲデルタサブユニット定常領域と特異的な反応
性を有する モノクローナル抗体抗ＴＣＲ δ１の生成 ６．１．実験手順 ６．１．１．抗ＴＣＲ δ１を有するＴ細胞系のサイト
フルオログラフィー分析 δＴＣＲ鎖の定常領域と特異的に反応する抗ＴＣＲ δ
１のｍＡｂを、以下のように作製した。１ｇのＰＥＥＲ
細胞を５０ｍＬの０．３％のＣＨＡＰＳ（３−［３−ク
ロロアミドプロピルジメチル−アンモニノ］１−プロパ
ンスルホネート）界面活性剤中で可溶化し、１μＬのＵ
ＣＨＴ１腹水（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｐ．Ｃ．，ａｎｄ
Ｃａｌｌａｒｄ．１９８１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１１：３２９−３３４）］、５００μＬのｍＡｂ１
８７．１培養上清及びＳＡＣＩ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ株）で免疫沈
降させた。６週間間隔で４回、腹腔内注射を行ない、つ
いで、２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用して免疫複
合体からγδＴＣＲを選択的溶出により単離したγδＴ
ＣＲ（ＣＤ３なし）で最終の追加免疫を行なった。溶出
物質を、静脈内及び腹腔内の双方に投与した。この最終
免疫の４日後にマウスを殺し、前述のように融合を行な
った（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９
８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１５０２−１５０
９）。

【００６４】γδＴＣＲ細胞系のＰＥＥＲ及びＩＤＰ２
又はαβＴＣＲ細胞系のＨＰＢ−ＭＬＴ及びＪＵＲＫＡ
Ｔを５０μＬの抗ＴＣＲ δ１培養上清で染色し、続い
てＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇ Ｆ（ａｂ）’_２フラ
グメントを用いて染色し、オルソ社製のサイトフルオロ
グラフで分析した（図１参照のこと）。対照はＰ３Ｘ６
３．Ａｇ８ハイブリドーマ（Ｐ３）によって分泌される
ｍＡｂとし、抗ＣＤ３ｍＡｂは抗Ｌｅｕ４とした（Ｌｅ
ｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９８１，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３：３１０）。

【００６５】６．１．２．ｍＡｂ 抗ＴＣＲ δ１の特
異性の免疫化学的分析 表面^１２５Ｉ標識ＩＤＰ２細胞を可溶化し、それらのタ
ンパク質を対照のｍＡｂであるＰ３、抗Ｌｅｕ４、抗Ｔ
ＣＲ δ１又は抗Ｃγ血清を用いて免疫沈降させた。沈
降サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、続いてオート
ラジオグラフィーを行なった。ＣＨＡＰＳ界面活性剤中
で残っているγδＴＣＲとＣＤ３とは会合し、抗Ｌｅｕ
４によって複合体として免疫沈降した（図２、レーン３
と４）。しかしながら、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０界面活性剤中で可溶化した後、抗ＴＣＲ δ１はγδ
ＴＣＲをＣＤ３なしでダイマーの複合体として免疫沈降
させ（レーン６）、抗Ｌｅｕ４はＣＤ３をγδＴＣＲな
しで三量体の複合体として免疫沈降させた（レーン
５）。

【００６６】γδＴＣＲ−ＣＤ３成分鎖を分離した後、
抗ＴＣＲ δ１はＴＣＲ δだけを免疫沈降させ（レー
ン７と８）。一方、抗Ｃγ血清はＴＣＲγだけを免疫沈
降させた（レーン９）。鎖の分離実験のため（レーン７
〜９）、ＣＨＡＰＳ可溶化ＩＤＰ２細胞からの抗Ｌｅｕ
４免疫沈降物を１％ＳＤＳ中で煮沸し、その後４容の２
％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈し、抗ＴＣＲ δ１
又は抗Ｃγ血清で免疫沈降を行った。この後、以前に、
用いた手順を行なう（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ
ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１４
５）。

【００６７】６．１．３．ＴＣＲ δポリペプチドのＮ
−結合グリコシル化 ^１２５ Ｉ標識したＩＤＰ２細胞を０．３％のＣＨＡＰＳ
で可溶化し、抗Ｌｅｕ４で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって分離した（図３）。対照レーンはｍｏｃｋ消
化ＩＤＰ２のδＴＣＲポリペプチドである。δＴＣＲポ
リペプチドのＮ−グリカナーゼ消化は次のように行なっ
た。δＴＣＲをゲルスライスから溶出させ、３７℃で１
６時間、０．１７％のＳＤＳ、１．２５％のＮｏｎｉｄ
ｅｔ Ｐ−４０を含む３０μＬの０．２のＭリン酸ナリ
トウムバッファー（ｐＨ８．６）中でＮ−グリカナーゼ
（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｒｏｐ．）消化を行なった（Ｔａ
ｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，１９８５，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４：４６６５）。消化した
δＴＣＲサンプル又はｍｏｃｋインキュベートδＴＣＲ
サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、オートラ
ジオグラフィーで可視化した。

【００６８】６．１．４．ｍＡｂ抗ＴＣＲ δ１による
ｃＤＮＡクローンＩＤＰ２０−２４ ０／３８のｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ翻訳生成物の認識 ｐＧＥＭ−３−０−２４０／３８と命名したプラスミド
を次のように構築し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写−翻訳に使
用した（図４）。ＩＤＰ２０−２４０／３８（δＴＣ
Ｒ）ｃＤＮＡクローンの１．５ｋｂのインサートは、成
分グループＯの配列のコドン７の範囲内で始まり、そし
て残っているコード領域及び大部分の３’非翻訳領域を
含む。このインサートを、部分ＥｃｏＲＩ消化によって
（内部のＥｃｏＲＩ部位の開裂を防止するために）λｇ
ｔ１０アームから単一のＥｃｏＲＩフラグメントとして
切断した。このフラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋
ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へサブクローニング
した。その後、このインサートをベクターから単一のＢ
ａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメント（末端はＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクターのポリリンカーからのものである）と
して削除し、ｐＧＥＭ−３（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）のＴ７プロモーターの下流に方向性クローニン
グ（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ）した。
生成されたｐＧＥＭ３−０−２４０／３８プラスミドを
ＳａｌＩで直鎖状にし、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用
いて合成された転写物をキャップした（Ｋｒａｎｇｅ
ｌ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３７：６４）。転写物の完全性及び大きさを、
^３２Ｐ−ＡＴＰを含有するアリコートの反応混合物によ
りモニターした。１．５ｋｂの一本鎖のＲＮＡ種が観察
された。^３５Ｓ−メチオニン存在下におけるｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ翻訳を、ウサギ網状赤血球溶解物中で行なった。

【００６９】ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳の後、サンプルを２
ｍＭのジチオスレイトールとともに１％ＳＤＳ中で沸騰
させ、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むトリス緩
衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を１０容加えた。サンプル
を対照のｍＡｂ Ｐ３（図５のレーン１と３）又は抗Ｔ
ＣＲ δ１ ｍＡｂ（レーン２と４）で免疫沈降させ、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、続いてフルオログラフィー
を行なった（Ｂｏｎｎｅｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌａｓｋ
ｅｙ Ｒ．Ａ．，１９７４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．４６：８３−８８ ）。

【００７０】６．２．実験結果 我々は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である抗ＴＣＲ
δ１を作製した。これはδＴＣＲ定常領域と特異的な
反応性を有していた。ＰＥＥＲ細胞系からのγδＴＣＲ
−ＣＤ３複合体（Ｗｅｉｓｓ，Ａ．，ｅｔａｌ．，１９
８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８３：６９９８−７００２； Ｂｒｅｎｎｅ
ｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ
３２５：６８９−６９４）を、抗体分泌ハイブリドー
マ細胞系の産生における免疫原として使用した。ハイブ
リドーマを、細胞表面結合（細胞フルオログラフ分析）
及びＰＥＥＲ細胞タンパク質の免疫沈降の双方によって
スクリーニングし、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。

【００７１】２種のハイブリドーマの上清（５Ａ６と４
Ａ１）は、ＰＥＥＲ細胞表面に結合した。サブクローニ
ングの後、１つのｍＡ（５Ａ６．Ｅ９、このモノクロー
ナル抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション
（ＡＴＣＣ）に１９８８年０７月２７日付けで寄託さ
れ、受託番号ＨＢ９７７２が付与されている）の特徴づ
けをさらに行なった。このｍＡｂはγδＴＣＲリンパ球
（ＰＥＥＲ，ＩＤＰ２）表面に結合するが、αβＴＣＲ
細胞（ＨＰＢ−ＭＬＴ、ＪＵＲＫＡＴ）又は非Ｔ白血球
（図１、データは示していない）とは反応しなかった。
免疫原はγδＴＣＲとＣＤ３との複合体からなるが、γ
δＴＣＲ細胞系に対するｍＡｂのより大きな親和性は、
このｍＡｂがＣＤ３の抗原決定基に対するものではない
こと示唆した。

【００７２】ｍＡｂの特異性は、各種の界面活性剤を使
用する免疫沈降の研究で決定されたが、これらの界面活
性剤はレセプター複合体を含むタンパク質の会合に影響
を与えるものである。^１２５Ｉ標識ＩＤＰ２細胞をＣＨ
ＡＰＳ界面活性剤で可溶化した後、ＴＲγとδ、及びＣ
Ｄ３のγ、δ及びεサブユニットの会合した複合体の残
存部分が抗ＣＤ３抗体によって免疫沈降した（図２、レ
ーン３と４）。しかしながら、放射性標識ＩＤＰ２細胞
を２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤で可溶化
すると、γδＴＣＲとＣＤ３とは大部分が解離し、抗Ｃ
Ｄ３ｍＡｂを使用すると、ＣＤ３の選択的な沈降が生じ
た（図２、レーン５）。後者の条件において、ｍＡｂ
５Ａ６．Ｅ９は会合されたＣＤ３なしでヘテロダイマー
としてγδＴＣＲを免疫沈降させた（図２レーン６）。

【００７３】この観察から、ＴＣＲ γとＴＣＲ δと
はジスルフィド結合していないヘテロダイマーとして存
在しているという最初の直接的な証拠が提供された。ｍ
Ａｂ５Ａ６．Ｅ９がγＴＣＲ鎖、δＴＣＲ鎖又は組合わ
せの抗原決定基と反応するかどうかを決定するために、
分離されたポリペプチド鎖の免疫沈降が行なわれた。放
射性標識され、ＣＨＡＰＳで可溶化されたＩＤＰ２細胞
からの抗Ｌｅｕ４免疫沈降物を１％ＳＤＳ中で沸騰さ
せ、γＴＣＲ、δＴＣＲ及びＣＤ３タンパク質を解離さ
せた。

【００７４】４容の２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希
釈した後、ｍＡｂ ５Ａ６．Ｅ９は特異的に４０ｋＤ
（δＴＣＲ）種を免疫沈降させた（図２、レーン７）。
１アリコートの同じの免疫沈降物を還元条件下で分析す
ると（図２、レーン８）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの移動度の
劇的なシフトが観察された。この現象は、ＩＤＰ２とＰ
ＥＥＲ細胞系からのδＴＣＲに特徴的である（Ｂｒｅｎ
ｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２５：６８９−６９４）。対照的に、分離鎖が抗
Ｃγ血清とともに免疫沈降された場合には、５５ｋＤ種
（γＴＣＲ）は免疫沈降したが、４０ｋＤ種（δＴＣ
Ｒ）は免疫沈降しなかった（図２、レーン９）。これら
の生化学的研究及び表面結合の研究に基づいて、ｍＡｂ
５Ａ６．Ｅ９を抗ＴＣＲ δ１という。ＰＥＥＲとＩ
ＤＰ２に加えて、抗ＴＣＲ δ１もまた、ＭＯＬＴ−１
３及びＰＢＬ系２を含む他のγδＴＣＲ細胞系からＴＣ
Ｒ δを免疫沈降させた。次の実験では、抗ＴＣＲ δ
１はＴＣＲ δ定常（Ｃ）遺伝子セグメントによってコ
ードされる抗原決定基と反応することが示された。

【００７５】我々は、ＴＣＲ δサブユニットをコード
する遺伝子を表示するサブトラクティブアプローチによ
って、ＩＤＰ２細胞系（例えば、Ｏ−２４０／３８）か
らｃＤＮＡクローンを単離した。サザンブロット実験に
おいて、ＩＤＰ２グループＯのｃＤＮＡクローンがハイ
ブリダイズする遺伝子はγδＴＣＲリンパ球において、
発現され、再編成されるが、αβＴＣＲ細胞においては
発現されない（そして、しばしば欠損している）。他の
ＴＣＲ遺伝子との配列比較によると、これらのｃＤＮＡ
クローンは、新規なＶ、Ｄ、Ｊ及びＣ遺伝子セグメント
からなるらしい。ＩＤＰ２グループＯコンポジットのＤ
ＮＡ配列は、２つの潜在的アスパラギン結合グリコシル
化部位を有し、分子量が３１．３キロダルトンであるこ
とが予測される長いオープンリーディングフレームを含
む。グリコンル化されていないδＴＣＲタンパク質の分
子量と成熟したＩＤＰ２のδＴＣＲポリペプチド上に存
在するアスパラギン結合炭水化物の数を決定するため
に、ゲル精製δＴＣＲをＮ−グリカナーゼ処理又はｍｏ
ｃｋインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した（図
３）。Ｎ結合炭水化物を除くとみかけの分子量が５ｋＤ
減少し（４０ｋＤから３５ｋＤへ）、ＩＤＰ２のδＴＣ
Ｒ上に２種類の（２．５〜３ＫＤ）Ｎ結合グリカンが存
在することが示唆された。これは、図５の翻訳アミノ酸
配列から予想されるＮ結合グリカンの数とよく相関し
た。タンパク質のみかけの分子量は、３．７ｋＤと予想
されたものとは相違したが、一般的に一致した。

【００７６】ＩＤＰ２細胞上の抗ＴＣＲ δ１の反応
性、δＴＣＲポリペプチドに対する特異性及び部分変性
（ＳＤＳで煮沸）δＴＣＲの認識について、我々はこの
ｍＡｂがδＴＣＲのｃＤＮＡのクローンによってコード
されたポリペプチドを直接的に認識するはずであるか否
かを試験した。このようにして、ｃＤＮＡクローンＩＤ
Ｐ２ Ｏ−２４０／３８からのインサートをｐＧＥＭ−
３発現ベクター中、Ｔ７プロモーターの下流にサブクロ
ーニングした（図４）。その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼでｉｎ ｖｉｖｏ生成された転写物を、ウサギの網
状赤血球溶解物系で使用し、^３５Ｓ−メチオニン存在下
におけるタンパク質の合成させた。ｉｎｖｉｔｒｏ転写
−翻訳の後、反応混合物を１％ＳＤＳ中で沸騰させ、１
０容の２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈し、イソ
タイプ適合型の対照のｍＡｂ又は抗ＴＣＲδ１のいずれ
かで免疫沈降させた。抗ＴＣＲ δ１ ｍＡｂは優先種
（３４ｋＤ）を特異的に免疫沈降させた（図５、レーン
４）。

【００７７】対照のｍＡｂを使用した場合（レーン
３）、ＲＮＡ転写物を除いた場合（レーン１と２）、又
はγＴＣＲ構築物を使用した場合には、免疫沈降物の中
にはこのようなバンドは観察されなかった。このように
して、ｍＡｂ抗ＴＣＲ δ１によって免疫沈降された放
射性標識種は、該合成物がＩＤＰ２ Ｏ−２４０／３８
のｃＤＮＡクローンによって特異的に合成されたδポリ
ペプチドに対応する。このポリペプチド（３４ｋＤ）
は、Ｎ−グリカナーゼ処理されたＩＤＰ２のδＴＣＲ鎖
（３５ｋＤ）と比較して、大きさが非常に近い。ＩＤＰ
２ Ｏ−２４０／３８クローンは、リーダー配列と同様
に天然のＡＴＧ開始コドンを欠損している。このクロー
ンのＶ領域の範囲内に、２つの潜在的な内部ＡＴＧコド
ン（１２番残基及び４４番残基）がある（図５）。これ
らのコドンを使用して合成を開始すると、注目すべきマ
イナーな種に起因する２種以上のポリペプチド種が生じ
る（図５レーン４）。このようにして、クローンＩＤＰ
２ Ｏ−２４０／３８によってコードされるＩＤＰ２の
δＴＣＲサブユニットのｍＡｂ、抗ＴＣＲδ１による直
接的血清学的認識が存在する。

【００７８】７．ＴＣＲ δサブユニットの可変領域部
と特異的に反応する モノクローナル抗体δＴＣＡＲ−３
の生成 ７．１．実験方法 ７．１．１．Ｔ細胞抗原レセプターの免疫沈降及びＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析 δＴＣＲ鎖の可変領域に特異的な反応性を有するδＴＣ
ＡＲ−３ ｍＡｂを、次のように作製した。１匹のマウ
スに２×１０^７個のＭＯＬＴ−１３細胞を腹腔内注射し
て免疫した。１ケ月後に、１×１０^７個のＭＯＬＴ−１
３細胞を３日間連続してマウスに静脈注射し、免疫脾臓
細胞を５０％のポリエチレングリコール１５００の存在
下でマウスのミエローマであるＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５
３細胞と融合させた。ＣＤ３のコモジュレーションをフ
ローサイトメトリーで分析することによってハイブリド
ーマをスクリーニングした（ここで得られたハイブリド
ーマは、１９８７年１０月２９日付けでＡＴＣＣに寄託
され、受託番号ＨＢ９５７８が付与されている）。

【００７９】ＣＤ３のコモジュレーンョンの分析は、
α，βＴ細胞抗原レセプターに対する抗体を細胞ととも
にインキュベートしたときに、これらがＣＤ３複合体の
インターナリゼーンョンを引き起こすという観察に基づ
くものであった（Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：２２８
６； Ｍｅｕｅｒ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，１９８
３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：７０５）。ＭＯＬＴ
−１３、ＰＥＥＲ、及びＨＰＢ−ＡＬＬ細胞系は、ラク
トパーオキシダーゼ技術を使用してヨード化した。
^１２５Ｉ−βＦ１標識細胞を１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００を含有するトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ８）で可
溶化した。溶解産物をδＴＣＡＲ−３抗体又はβＦ１抗
体を用いて免疫沈降した。βＦ１はβＴＣＲ鎖に対する
フレームワークモノクローナル抗体であり、他の文献に
記載されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１５０
２−１５０９）。全サンプルを還元条件下又は非還元条
件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した（図６）。ＭＯＬＴ−
１３とＰＥＥＲは両方ともＣＤ３^＋４⁻８⁻ＷＴ３１⁻
であった。ＨＰＢはＣＤ３^＋４^＋８^＋ＷＴ３１^＋であっ
た。

【００８０】図６に示したように、δＴＣＡＲ−３はＭ
ＯＬＴ−１３及びＰＥＥＲ細胞からのジスルフィド結合
していないγ鎖及びδ鎖を免疫沈降させ、一方、βＦ１
はＨＰＢ−ＡＬＬ細胞からのジスルフィド結合したα鎖
及びβ鎖を免疫沈降させた。δ鎖及びγ鎖に対応するバ
ンド間のオートラジオグラフ強度の相違は、これらの二
種のタンパク質のヨード化の程度の相違を表わす。

【００８１】７．１．２ δＴＣＡＲ−３抗体によるδ
ＴＣＲ鎖の免疫沈降 図７は、０．３％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロロアミ
ドプロピル（ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ジメチ
ルアンモニ］１−プロパンスルホネート）を含むトリス
緩衝生理食塩水（ｐＨ８）又は１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００で可溶化された^１２５Ｉ−標識ＭＯＬＴ−１３
細胞を示す。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で、γ
δＴＣＲはＣＤ３複合体から解離し、一方０．３％のＣ
ＨＡＰＳ中ではγδＴＣＲはＣＤ３複合体と会合して残
る。免疫沈降の前に、図７のレーン３、４及び７で使用
した^１２５Ｉ−標識溶解物を、終濃度１％になるまでＳ
ＤＳを加えて変性させ、続いて６８℃で５分間加熱し
た。冷却後、ヨードアセトアミドを終濃度が２０ｍＭと
なるまで加えた。この混合物を、４容の１．５％のＴｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐ
Ｈ８）で希釈した。この変性プロセスにより、γ鎖、δ
鎖及びＣＤ３タンパク質が相互に完全に解離する。

【００８２】全てのサンプルを、還元条件下（Ｒ）であ
るレーン４のサンプルを除いて、非還元条件（Ｎ）下で
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。還元条件下及び非還元条件
下におけるδ鎖の移動度の相違に注意すべきである。γ
定常領域からの２０アミノ酸の合成ペプチドでウサギを
免疫して、抗Ｃγ抗血清を得た（残基１１７番〜１３６
番）。

【００８３】７．１．３．フローサイトメトリーによる
細胞表面染色分析 ５×１０^５個の細胞を適切な抗体（ＮＭＳ（正常マウス
血清）、δＴＣＡＲ−３、ＯＫＴ−３、又はＷＴ３１）
とともに４℃で３０分間インキュベートし、０．２％の
ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。フ
ルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧとともに４℃で３
０分間インキュベートした後、細胞をオルソ社製のサイ
トフルオログラフで分析した（図８）。

【００８４】７．１．４．δＴＣＡＲ−３ ^＋ とＯＫＴ３
^＋ 末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）の 二色サイトフルオログ
ラフ分析 最初に末梢液リンパ球をδＴＣＡＲ−３とともに４℃で
３０分間インキュベートした。洗浄後、この細胞をフィ
コエリトリン（ＰＥ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧとともに
４℃でさらに３０分間インキュベートした。洗浄後、細
胞をフルオレセイン結合ＯＫＴ３とともに４℃で３０分
間インキュベートし、そして細胞をオルソ社製のサイト
フルオログラフで分析した（図９）。

【００８５】７．１．５．細胞質内Ｃａ ^２＋ 濃度（［Ｃ
ａ ^２＋ ］ _ｉ ）の経時測定 ＭＯＬＴ−１３細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加した
ＲＰＭＩ１６４０中１０^７個／ｍＬの濃度で、温度３７
℃にて３０分間、Ｃａ^２＋感受性プローブｆｕｒａ２の
アセトキシメチルエステル型（ジメチルスルホキシド中
１ｍＭ濃度のストックから２μＭを使用（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）
で標識した。その後、細胞を洗浄し、５％のウシ胎児血
清を添加したハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に１０^７
個／ｍＬ濃度で再懸濁し、使用するまで室温にて、暗所
で保存した。蛍光測定の直前に、２×１０^６個の細胞を
遠心分離し、２ｍＬの新鮮なＨＢＳＳに再懸濁し、３７
℃で石英キュベットに入れ、コンスタントに撹拌した。
ＳＰＦ−５００Ｃ蛍光検出器（ＳＬＭ Ａｍｉｃｏ，Ｕ
ｒｂａｎａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）で細胞懸濁液の蛍光
を、３４０（±２）〜３８０（±２）ｎｍの間の励起波
長を用い、放出を５１０（±５）ｎｍで検出した。３５
０／３８０の比を自動的に計算し（２秒ごとに１つの
比）、プロットし、ＩＢＭ ＰＣ ＡＴに格納した。蛍
光の比からの［Ｃａ^２＋］_ｉの定量化は、Ｇｒｙｎｋｉ
ｅｗｉｃｓら（１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６０：３４４０）が記載したように行なった。不適当な
抗体を加えても［Ｃａ^２＋］_ｉは変化しなかったが、１
μＭの［Ｃａ^２＋］_ｉで細胞溶解が生じた。

【００８６】７．２．結果 我々は、モノクローナル抗体、δＴＣＡＲ−３を作製し
た。このモノクローナル抗体は、ＴＣＲ δ鎖の可変領
域に対するものであり、かつδポリペプチドを特徴づけ
るために使用することができる。このモノクローナル抗
体はγδＴＣＲを有するＴ細胞と結合し、またＭＯＬＴ
−１３細胞に結合するとｆｕｒａ−２のＣａ^２＋ングナ
ルを顕在化させる。

【００８７】δＴＣＡＲ−３モノクローナル抗体は、Ｃ
Ｄ３^＋４⁻８⁻ＷＴ３１⁻表現型を有するＭＯＬＴ−１
３細胞系でマウスを免疫することにより生成させた。最
初に、ハイブリドーマをＣＤ３コモジュレーションによ
ってスクリーニングした。さらに陽性クローンを免疫沈
降によってスクリーニングした。^１２５Ｉ標識ＭＯＬＴ
−１３及びＰＥＥＲ溶解物からのγδＴＣＲヘテロダイ
マーのδＴＣＲ−３免疫沈降を、図６に示した。δＴＣ
ＡＲ−３は、ＨＰＢ−ＡＬＬからいずれのポリペプチド
をも免疫沈降させなかった（図６）。対照的に、βＦ
１、すなわちβ鎖に特異的なフレームワークモノクロー
ナル抗体（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１５０２−１
５０９）は、ＨＰＢＢ−ＡＬＬ細胞系からαβヘテロダ
イマーを免疫沈降させた（図６、レーン１０及び１
２）。ＭＯＬＴ−１３とＰＥＥＲ細胞からの免疫沈降γ
δレセプターは、還元条件下又は非還元条件のいずれか
で分析した場合にも、これら二種類の細胞系においてジ
スルフィド結合していないγδＴＣＲを示唆するヘテロ
ダイマー構造を示した。非還元条件下で観察した場合と
比べて、還元条件下ではδ鎖の移動度が若干シフトし
（図６、レーン１と３、５及び７）、ＩＤＰ２とＰＥＥ
Ｒ細胞系で以前に注目された現象（Ｂｒｅｎｎｅｒ，
Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２５：６８９−６９４）は、鎖内ジスルフィド結合の存
在を示唆した。

【００８８】δＴＣＡＲ−３抗体がＣＤ３と会合したγ
δＴＣＲを認識することを示すために、０．３％のＣＨ
ＡＰＳ界面活性剤で可溶化した^１２５Ｉ標識ＭＯＬＴ−
１３細胞溶解物を使用して免疫沈降を行なった（図７、
レーン１）。これらの条件下で、レセプターと会合した
ＣＤ３複合体が残り、γδヘテロダイマー及びＣＤ３複
合体の両方はδＴＣＡＲ−３によって免疫沈降した。し
かしながら、^１２５Ｉ標識溶解物をγδレセプターから
のＣＤ３複合体と大きく解離させる１％のＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００界面活性剤で可溶化すると、γδヘテロダ
イマーだけがδＴＣＡＲ−３によって免疫沈降する（図
７、レーン２）。対照として、抗ＣＤ３抗体、ＵＣＨＴ
−１（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄ Ｃａｌｌａ
ｒｄ，Ｒ．Ｅ．，１９８１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１１：３２９−３３４）は、ＣＤ３複合体だけを免
疫沈降させるが、γδヘテロダイマーは免疫沈降させな
い（図７、レーン５）。

【００８９】δＴＣＡＲ−３の特異性を、γ，δＴＣＲ
とＣＤ３タンパク質とが完全に解離した変性^１２５Ｉ標
識ＭＯＬＴ−１３溶解産物の免疫沈降を使用して分析し
た。δＴＣＡＲ−３は、非還元条件下におけるみかけの
分子量は３８ｋＤ（図７、レーン３）、還元条件下では
４０ｋＤ（レーン４）のδ鎖を特異的に免疫沈降させ
た。抗Ｃγ抗血清は、還元条件下で分子量４２ｋＤのγ
鎖を免疫沈降させた。これらのデータは、δＴＣＡＲ−
３がδ鎖特異的であることを示す。

【００９０】δＴＣＡＲ−３は、ＰＥＥＲ及びＭＯＬＴ
−１３細胞系からγ，δＴＣＲヘテロダイマーを免疫沈
降させるばかりでなく、これらの細胞系の表面及びＩＤ
Ｐ２クローンにも結合した（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．，ｅ
ｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９
−６９４）。δＴＣＡＲ−３は、αβＴＣＲ担持ＨＰＢ
−ＡＬＬとＪｕｒｋａｔ細胞系には結合しなかった（図
８）。対照的に、ＷＴ３１（Ｔａｘ，Ｗ．Ｊ．Ｍ．，ｅ
ｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０４：４４５
−４４７）、すなわちαβＴＣＲに対するフレームワー
クモノクローナル抗体は、αβＴＣＲ陽性ＨＰＢ−ＡＬ
Ｌ細胞系及びＪｕｒｋａｔ細胞系とは反応するが、γδ
ＴＣＲ陽性ＭＯＬＴ−１３、ＰＥＥＲ細胞及びＩＤＰ２
細胞（図８）とは反応しなかった。正常な末梢血液リン
パ球（ＰＢＬ）を試験すると、ＣＤ３^＋リンパ球のサブ
集団（０．９〜２．４％）はδＴＣＡＲ−３陽性であっ
た（図９）。組織培養プレート上に固定されたδＴＣＡ
Ｒ−３を正常ヒトＰＢＬの培養に使用した場合には、γ
δＴＣＲ陽性サブ集団の増殖を選択的に刺激した。培養
４５日後、γδＴＣＲサブ集団は全細胞数の９６％を示
した。

【００９１】αβＴ細胞抗原レセプターに対する抗体
は、細胞質の遊離カルシウムイオン濃度［Ｃａ^２＋］_ｉ
の上昇を刺激した（Ｗｅｉｓｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，
１９８６，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：５９
３）。ＭＯＬＴ−１３細胞とδＴＣＡＲ−３とのインキ
ュベーションにより、抗Ｔ３抗体によって誘導された応
答に類似する［Ｃａ^２＋］_ｉの急速な上昇を引き起こし
た（図１０）。さらに、δＴＣＡＲ−３は上述のよう
に、ＰＥＥＲ細胞及びＰＢＬから作られたγδＴＣＲ陽
性細胞系におけるのＣａ^２＋フラックスを同様に刺激し
た。また、我々は、ＭＯＬＴ−１３、ＰＥＥＲ、及びＩ
ＤＰ２細胞とδＴＣＡＲ−３とのインキュベーションに
よりＣＤ３タンパク質複合体のコモジュレーションが惹
起されることを観察した。さらにまた、ｍＡｂであるδ
ＴＣＡＲ−３のエピトープ特異性の他の特徴付け（ｍＡ
ｂ ＴＣＳ δ１という）を、後述の１１．２．２．節
に示す。

【００９２】８．ヒトＴ細胞レセプターγδの３つの
型： 選ばれた健常人における１の型の好適な用途 この実施例においては、ＴＣＲδ鎖と非共有結合的に会
合した４０ｋＤのＴＣＲγ糖タンパク質からなる、新し
い型のヒトＴ細胞レセプターγδ（γδＴＣＲ）の構造
を示す。２ｂｃ型という新たに同定されたγＴＣＲ糖タ
ンパク質は、上述したジスルフィド結合で架橋していな
いＴＣＲγ型（２ａｂｃ型）と比較して、大きさが１５
ｋＤ以上（５５ｋＤ対４０ｋＤ）相違する。この相違
は、ポリペプチド骨格が５ｋＤ小さく（４０ｋＤ対３５
ｋＤ）、炭水化物量が少ない（１５ｋＤ対５ｋＤ）によ
る。２ｂｃ型に対応するｃＤＮＡクローンのヌクレオチ
ド配列分析より、２ｂｃ型のｃＤＮＡクローンは、他の
ジスルフィド結合していないＴＣＲγサブユニット（２
ａｂｃ型）のｃＤＮＡ中に存在する、定常領域（ｃγ
２）の第２エキソンを１コピー欠いていることが明らか
になった。このＣＩＩエキソンコピーは、膜貫通領域と
細胞外定常ドメインとの間の結合部領域をコードする。
潜在的なＮ結合炭水化物付着部位の数及び局在はいずれ
のジスルフィド結合していない型と同じであるので、お
そらくはタンパク質のコンホメーションに影響を与える
ことによって、結合領域が付着炭水化物量に影響するも
のと結論された。対照的に、γδＴＣＲ型のδＴＣＲサ
ブユニットはペプチド骨格の大きさ又はペプチド地図分
析においては、ほとんど多様性を示さなかった。

【００９３】また、我々は末梢血におけるγδＴＣＲ複
合体の３つの型の使用について調べた。ジスルフィド結
合型（１型）は、ある健常被験者において、ほぼ排他的
に使用された。何人かでは、１型は２ｂｃ型とともに発
現された。２ａｂｃ型は、試験された被験者では同定さ
れなかった。

【００９４】８．１．実験方法 ８．１．１．抗体 使用したモノクローナル抗体は、抗Ｌｅｕ４（抗体ＣＤ
３）（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３：３１０−３２３）、βＦ
１（抗βＴＣＲ）（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１
９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１５０２−１５
０９）、抗ＴＣＲδ１（抗δＴＣＲ）（前記第６節参照
のこと、δＴＣＲ鎖定常領域と反応性）、Ｐ３（対照）
（Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８によって分泌された抗体（Ｋｏｅ
ｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａ
ｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）、１８７．１（ラ
ット抗マウスκ軽鎖）（Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，
１９８１，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １：５−１１）、及び
ＷＴ３１（明るく染色するαβＴＣＲリンパ球）（Ｓｐ
ｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３５：１９２２−１９２８）であった。抗Ｃγｂ
ペプチド血清（抗γＴＣＲ）は、２２個からなるアミノ
酸合成ペプチドに対して得られた。（Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ
−Ｃｙｓ）（ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ８８／００２０
９号、１９８８年１月１４日公開）。

【００９５】８．１．２．細胞系 ＰＥＥＲ（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
３：６９９８−７００２）及びＭＯＬＴ−１３（Ｊ．Ｍ
ｉｎｏｗａｄａ，Ｌｏｈらによって単離された細胞、
Ｊ．Ｍｉｎｏｗａｄａ，Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９−５７２）はＴ白血
病性細胞系である。臍帯血由来のクローンＷＭ−１４
（Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：
３８６１−３８６５）、末梢血由来細胞系ＩＤＰ２（Ｂ
ｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ
３２２：１４５−１４９：ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ
８８／００２０９号、１９８８年１月１４日公開）、及
び胸腺由来クローンＩＩ（Ｂａｎｋ ｅｔ ａｌ．，１
９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１７９−１８１）を、
前述のように培養した。末梢血由来細胞系２（ＰＢＬ−
Ｌ２）を、ｍＡｂ ＷＴ３１で染色されない末梢血単離
リンパ球を選別することによって単離した。その後、単
離細胞を、ＩＬ−２と１０％（ｖ／ｖ）ヒト血清とを含
有する１０％（ｖ／ｖ）馴化培地を添加したＲＰＭＩ１
６４０培地にて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、放射線
を照射した自己由来のフィーダー細胞で３週間ごとに刺
激した。

【００９６】８．１．３．ヨード化と免疫沈降 ２×１０^７細胞をフィコール−ジアトリゾエート（Ｏｒ
ｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．）遠心分離に
よって単離し、１００μｇのラクトパーオキシターゼ
（８０〜１００Ｕ／ｍｇ，Ｓｉｇｍａ）と１ｍＣｉのＮ
ａ^１２５Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ）を加えた、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭのグルコー
スを含有する０．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．４、ＰＢＳ）中で、氷上にてヨード化した。３０分
間の反応時間中、０．０３％の過酸化水素１０μＬを５
分間間隔で加えた。細胞を１ｍＭのフェニルメチルスル
ホニルフルオライド（ＰＭＳＦ，Ｓｉｇｍａ）と８ｍＭ
のヨードアセトアミド（ＩＡＡ，Ｓｉｇｍａ）を含有す
るＴＢＳ（５０ｍＭのトリス−ベース（ｐＨ７．６）、
１４０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加した界面活性剤で、一夜
可溶化した。ここで示すように、この実験で使用する異
なる界面活性剤としては、０．３％（ｗ／ｖ）の３−
［（３−クロロアミドプロピルジメチルアンモニ）］１
−プロパン−スルホネート（ＣＨＡＰＳ，Ｓｉｇｍ
ａ）、１％（ｗ／ｖ）ジギトニン（Ａｌｄｒｉｃｈ）及
びＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＴＸ−１００，Ｓｉｇｍ
ａ）がある。

【００９７】１０，０００×ｇで２０分間遠心して不溶
性物質を除いた後、界面活性剤溶解物を４μＬの正常ウ
サギ血清（ＮＲＳ）と４００μＬの１８７．１ハイブリ
ドーマ培地とともに３０分間インキュベートすることに
よって予備清浄し、続いて固定化Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（Ｐａｎｓｏｒ
ｂｉｎ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の１０％（ｗ／ｖ）細
胞懸濁液を２００μＬ加えた。１時間インキュベーンョ
ンした後、Ｐａｎｓｏｒｂｉｎを遠心分離により除去し
た。０．２５μＬのβＦ１の腹水、１μＬの１ｍｇ／ｍ
Ｌの抗Ｌｅｕ４又は０．２５μＬのＰ３の腹水を、１５
０μＬの１８７．１培養上清とともに各サンプルに加え
て特異沈降を行い、続いて１時間インキュベーションし
た。１００μＬの１０％（ｖ／ｖ）プロテインＡ−セフ
ァロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を加え、４℃で１時間
ロッキングした。免疫沈降物をＴＢＳを含有する０．１
％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて５回
洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｍｌｉ，
１９７０，Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５）で
分析した。

【００９８】抗Ｃγｂペプチド血清を用いる免疫沈降用
のために、ヨード細胞をＴＢＳを含有する１％（ｗ／
ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化し、
ついで３分間沸騰させた。冷却後、ＰＭＳＦ及びＩＡＡ
を含み、２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含
むＴＢＳの５容量を、１ｍｇ／ｍＬのデオキンリボヌク
レアーゼ（ＤＮａｓｅ）と０．５ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓ
ｅとを含む５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２混合物２００μＬとと
もに加えた。予備清浄及び免疫沈降は、前記のように１
８７．１ｍＡｂを添加せずに行なった。免疫沈降物を
０．５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．
５％（ｗ／ｖ）のデオキシコレート（ＤＯＣ）、０．０
５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含むＴＢＳ中で洗浄した。

【００９９】８．１．４．生合成標識 ４×１０^７個の対数増殖期にある細胞を、１０％の透析
ウン胎児血清（ＦＣＳ）及び２０ｍＭへペスを加えた、
メチオニン及びシステイン不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｅ
ｌｅｃｔ−Ａｍｉｎｅ ｋｉｔ，Ｇｉｂｃｏ）４ｍＬに
再懸濁した。３７℃で３０分間の欠乏状態に置いた後、
１ｍＣｉの^３５Ｓ−メチオニンと１ｍＣｉの^３５Ｓ−シ
ステインとを加え、１５分間標識した。細胞を集めて、
２％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＴＢ
Ｓで可溶化した。前記のように予備清浄及び免疫沈降を
行なった。免疫沈降物を０．５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００、０．５％（ｗ／ｖ）のデオキシコー
ル酸、０．０５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含むＴＢＳで４
回洗浄し、続いて、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴ
Ａ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）で３回洗浄した。
このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、標準的なフ
ルオログラフィー手順によって可視化した（Ｂｏｎｎｅ
ｒ ａｎｄ Ｌａｓｋｅｙ，１９７４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ，４６：８３−８８）。

【０１００】８．１．５．δＴＣＲタンパク質のゲル精
製 表面ヨード化細胞を０．３％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ−
ＴＢＳで可溶化し、５０μＬの抗Ｌｅｕ４結合セファロ
ースビーズを用いて免疫沈降させた。免疫沈降種を非還
元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、湿った
ゲルを４℃にて２４時間、ＸＡＲ−５フィルム（Ｋｏｄ
ａｋ）を感光させて、放射性標識δＴＣＲタンパク質を
可視化した。δＴＣＲに対応するゲル領域を除去し、５
％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールを含むサンプ
ルバッファー中でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって２回目の分離を行なった。還元による特徴的な
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度のシフトのために、δＴＣＲタ
ンパク質が分離し、夾雑物からの精製が可能となった。
ＴＣＲタンパク質を０．０５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含
有する５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムバッファー中
で、３７℃にて、１夜インキュベートしてゲルスライス
から溶出させ、凍結乾燥した。

【０１０１】８．１．６．エンドグリコシダーゼ消化 エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）消化用のため
に、免疫沈降物質又はゲル精製タンパク質を、４０μＬ
の０．１４Ｍの２−メルカプトエタノールを含有する１
％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ溶液中で３分間沸騰させた。冷却
後、１ｍＭのＰＭＳＦを含有する０．１５Ｍの酢酸バッ
フアー（ｐＨ５．５）、３６０μＬで混合物を希釈し
た。５μＬのＥｎｄｏ Ｈ（１Ｕ／ｍＬのＥｎｄｏ−β
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ Ｈ、Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ）を、３７℃で１４時間、上記溶液の半量とともにイ
ンキュベートし、残りの半分をｍｏｃｋ処理した。

【０１０２】Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−ＧＬＹ）消化用
に、ゲル精製物を０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含む
０．１０Ｍの２−メルカプトエタノール３５μＬ中で３
分間沸騰させた。その後、１００μＬの０．２Ｍのリン
酸ナトリウム（ｐＨ８．６）、１．２５％（ｖ／ｖ）の
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えた。混合物の半分を、
１μＬのＮ−グリカナーゼ（２５０Ｕ／ｍＬ、ペプチド
−Ｎ−［Ｎ−アセチル−β−グリコサミニル］アスパラ
ギン・アミダーゼ：Ｇｅｎｚｙｍｅ）とともにインキュ
ベートし、３７℃にてさらに１６時間インキュベート
し、一方、残りの半分をｍｏｃｋ処理した。消化後、ウ
ン血清アルブミン１０μｇをキャリアーとして加え、ト
リクロロ酢酸沈降によってサンプルを回収した。タンパ
ク質のペレットは、５％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエ
タノールを含有するサンプルバッファー中に集めた。

【０１０３】８．１．７．モノクローナル抗体抗Ｃγｍ
１産生 ＨＰＢ−ＭＬＴのｐＴγ−１のＣγＣＩエキソンとＣＩ
Ｉエキソンの部分を、ヌクレオチド位置５７１と８４８
でＢａｍＨＩとＰｓｔＩとを使用して単離し（Ｄｉａｌ
ｙｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：２６１９−
２６２３）、発現ベクターｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）中にクローニングした。生じるプロテインＡ融
合タンパク質を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎ４８３０で
発現させた。リゾチームを用いて細菌を溶解し、融合タ
ンパク質をＩｇＧセファロースカラムを用いた精製によ
って単離した。０、７及び２８日目に、融合タンパク質
１００μｇを含むフロイントアジュバントをマウスの腹
腔内に注射した。２８日後、融合タンパク質１００μｇ
を含むＰＢＳを静脈注射した。３日後、脾臓細胞を単離
し、ブレナー等の記載に従ってハイブリドーマＰ３×６
３Ａｇ８．６５３と融合させた（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３８：１
５０２−１５０９）。ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ（ｅ
ｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂ
ｅｎｔ ａｓｓａｙ）を用いてスクリーニングした（こ
こで得られたハイブリドーマは、１９８８年０７月２７
日付けでＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＨＢ９７７３が
付与されている）。９６ウエル平底プレート（ＬＩＮＢ
ＲＯ，Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、０．
４μｇの融合タンパク質又は非融合タンパク質を含むＰ
ＢＳを用いて一晩インキュベートした。２３℃にて、
０．２５ｍｇ／ｍＬの正常ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）
を含む、５０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ含有ＰＢＳを用いて
非特異結合部位をブロックした。５０μＬのハイブリド
ーマの上清を、４℃で１時間かけて加え、続いて５μｇ
／ｍＬのパーオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐ
ｐｅｌ）５０μＬ中で、同様にインキュベートした。記
載したインキュベーションの全てに、１０％（ｖ／ｖ）
のＦＣＳ、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳを
使用した洗浄ステップを行った。０．０８％（ｗ／ｖ）
のｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）を含む０．０
１２％（ｗ／ｖ）過酸化水素含有リン酸−クエン酸塩バ
ッファー（ｐＨ５．０）を用いてＥＬＩＳＡを発色させ
た。

【０１０４】抗Ｃγｍ１（ＩｇＧ１）はサイトフルオロ
グラフ分析において天然のγδＴＣＲ／ＣＤ３複合体を
認識せず、また免疫沈降においてＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００可溶化細胞からのγδＴＣＲヘテロダイマーも認識
しないが、ＣＤ３／γδＴＣＲタンパク質を個別の鎖へ
分離した後、生合成標識γＴＣＲ前駆体及び成熟γＴＣ
Ｒタンパク質を認識する。この方法では、抗ＣＤ３免疫
沈降物を１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含むＴＢＳ中で沸騰さ
せることによって、ＣＤ３／γδＴＣＲ複合体を個々の
鎖へ分離させた後、抗Ｃγｍ１はγＴＣＲタンパク質を
認識することが示された。

【０１０５】８．１．８．ＭＯＬＴ−１３ γＴＣＲ
ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを尿素／塩化リチウム沈降によって
ＭＯＬＴ−１３細胞から調製し、続いてオリゴ（ｄＴ）
セルロースアフィニティクロマトグラフィーを行なっ
た。ヘアピンループ開裂用ナタ豆（Ｍｕｎｇ ｂｅａ
ｎ）ヌクレアーゼ（ＭｃＣｕｔｃｈａｍ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：６２６−６
２８）を用いるＨｕｙｎｈ等の方法（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ
ａｌ．，１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｇｌｏ
ｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｄ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ，Ｉ：４９−７８）によって、λｇｔ１０ ｃＤＮ
Ａライブラリーをポリ（Ａ）^＋ＲＮＡから調製した。ｃ
ＤＮＡライブラリーを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｃ６０
０Ｈｆ１上で増幅させ、^３２Ｐ−標識ＰＴγＩをプラー
クフィルターハイブリダイゼーンョンによってスクリー
ニングした（Ｄｉａｌｙｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８
６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ８３：２６１９−２６２３）。陽性クローンを大きさ
及び制限酵素地図について分析し、ｃＤＮＡクローンＭ
１３Ｋを配列決定のために選択した。Ｍ１３ＫのｃＤＮ
Ａを、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩを用いてλｇｔ１
０ファージから切り出し、さらに適切な制限酵素で消化
した。フラグメントをＭ１３ベクターへサブクローニン
グし、修飾Ｔ７ポリメラーゼ（シーケナーゼ（Ｓｅｑｕ
ｅｎａｓｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．））を使用するジデオキシチ
ェインターミネーター法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって配列
決定した。

【０１０６】クローンＭ１３Ｋは、３６ヌクレオチドの
５’未翻訳領域と７２ヌクレオチドの３’非コード領域
とを含有する、フレーム内の、全長γＴＣＲ転写物に対
応する（図１４）。Ｖ領域のヌクレオチド配列は、推定
ングナル配列中におけるＣ〜Ｔ（Ｉｌｅ−Ｖａｌ）の５
３ヌクレオチド変化を除き、ゲノムＶγ１．３の配列と
同じである（Ｌｅｆｒａｎｃらに基づく命名：Ｌｅｆｒ
ａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９８６ａ，Ｃｅｌｌ ４５：
２３７−２４６：Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９
８７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１２７１−１２１
９）。Ｊ領域はＪγ２．３の配列と同じである（Ｌｅｆ
ｒａｎｃらに基づく命名：Ｌｅｆｒａｎｃｅｔ ａ
ｌ．，１９８６ｂ，Ｎａｔｕｒｅ ３１９：４２０−４
２２： Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ ｅｔ ａｌ，１９８
７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２６８７−２６９
０）。驚くべきことに、８ヌクレオチドが、Ｖ−Ｊ結合
領域で生じた。これはゲノムＶ配列又はＪ配列によって
コードされていないらしく、かつ、おそらくＮ領域を表
わすＶ−Ｊ結合領域を表す。Ｃ領域の配列は、ヌクレオ
チド５５９（ＧからＣ：ＶａｌからＩｌｅ）及びヌクレ
オチド９０８（ＴからＣ；ＭｅｔからＴｈｒ）を除いて
対応ゲノム配列と一致する（Ｌｅｆｒｎａｃ ｅｔａ
ｌ．，１９８６ｃ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９５９６−９６００）。

【０１０７】８．２．結果 ８．２．１．新規γδＴＣＲタンパク質複合体 末梢血γδＴＣＲリンパ球の予備実験より、既知のヒト
γδＴＣＲ型と異なるＣＤ３会合複合体が存在すること
が示された。この型を叙述する試みにおいて、我々は正
常ヒトのドナー由来の多くの細胞系の作製と、特徴づけ
とを行なった。末梢血リンパ球はモノクローナル抗体
（ｍＡｂ）ＷＴ３１で染色され、それにより休止してい
るαβＴＣＲリンパ球が明るく染色される。染色されな
い細胞を細胞のソーティングによって単離し、ＩＬ−２
を含む培地中でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた。この方
法で得られた末梢血リンパ球系２（ＰＢＬ−Ｌ２）は、
均一にＣＤ３^＋ＣＤ４⁻ＣＤ８⁻であり、γδＴＣＲリ
ンパ球の細胞表面表現型の特徴であることが証明され
た。

【０１０８】ＰＢＬ−Ｌ２細胞上のγδ複合体を可視化
するために、ＣＨＡＰＳ又はジギトニンで可溶化した細
胞表面^１２５Ｉ標識細胞からの抗ＣＤ３ ｍＡｂを用い
て免疫沈降法を行なった。これらの界面活性剤中では、
ＣＤ３複合体とγδＴＣＲサブユニットとの間で物理的
会合が保持された。ＰＢＬ−Ｌ２細胞からの抗ＣＤ３免
疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、４０ｋＤと４４ｋＤ
のタンパク質（４０ｋＤタンパク質という）が分離され
た。これらは、抗Ｃγｂ血清（γＴＣＲ定常領域ペプチ
ドに対する抗血清）によってγＴＣＲサブユニットとし
て同定されるタンパク質である（第１１Ａ図、方法の節
を参照のこと）。

【０１０９】ＰＢＬ−Ｌ２上のこれらのγＴＣＲタンパ
ク質は非共有結合的にδＴＣＲサブユニットと会合して
おり、非還元条件下で分析された抗ＣＤ３免疫沈降物中
に弱いヨード化タンパク質として可視化された（図１１
Ａ、レーン６、黒い矢印）。この弱いヨード化タンパク
質は、抗Ｃγｂ血清によって認識されないので、ＰＢＬ
−Ｌ２細胞上のδＴＣＲサブユニットを表わす（図１１
Ａ、レーン８）。加えて、ＩＤＰ２及びＰＥＥＲ細胞上
のδＴＣＲタンパク質について明記したように（下記、
ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ８８／００２０９号、１９８
８年１月１４日公開を参照せよ）、非還元条件下及び還
元条件下において同じＳＤＳ移動度シフト比較分析を示
した。δＴＣＲタンパク質は、還元後は見ることができ
ない（図１１Ａ。レーン３）。なぜなら、４０ｋＤの移
動（下記）とともに移動し、そして類似の大きさのγＴ
ＣＲタンパク質（白い矢印）に妨害されるためである。

【０１１０】γδＴＣＲ型は、正常な末梢血Ｔリンパ球
上に存在するばかりでなく、胸腺由来クローンＩＩ細胞
（図１１Ｄ）及びＴ白血病細胞系ＭＯＬＴ−１３（図１
１Ｅ）上でも観察される。これら三種類の細胞系は、γ
ＴＣＲ種を有する。これらの３つの細胞系は、ＰＢＬ−
Ｌ２（４０ｋＤと４４ｋＤ：図１１Ａ、レーン８）及び
クローンＩＩ細胞（４０ｋＤと４４ｋＤ：図１１Ｄ、レ
ーン８）上で観察されたγＴＣＲタンパク質のダブレッ
ト、又はＭＯＬＴ−１３細胞上で観察された拡散的に標
識されたγＴＣＲタンパク質のバンド（４０〜４６ｋ
Ｄ：図１１Ｅ、レーン６）を生ずる差別的なグリコンル
化を表示するγＴＣＲ種を有する。ＭＯＬＴ−１３のγ
ＴＣＲタンパク質バンドを二次元ゲル分析［ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにかけ、ついで非平衡ｐＨグラジェント電気泳動
（ＮＥＰＨＧＥ）］すると、２つの平行なγＴＣＲ種が
分離され、その中で４４ｋＤのγＴＣＲ種は４０ｋＤ種
と比べて、別の高マンノース（又はハイブリッド）Ｎ−
結合グリカンを含有する。このように、３種類の異なる
細胞源（末梢血、胸腺及び白血病）から単離されたこの
レセプター複合体のγＴＣＲサブユニットから、δＴＣ
Ｒパートナー鎖と非共有結合的に会合した４０ｋＤの細
胞表面種が明らかにされた。

【０１１１】ＰＢＬ−Ｌ２、クローンＩＩ及びＭＯＬＴ
−１３細胞上のγδＴＣＲ型を比較するために、ＩＤＰ
２とＷＭ−１４細胞系上の既知の型について調べた。Ｉ
ＤＰ２細胞系（ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ８８／００２
０９号、１９８８年１月１４日公開、Ｂｒｅｎｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２；１４
５−１４９）は、より大きな５５〜６０ｋＤのγＴＣＲ
タンパク質（５５ｋＤという）を含有し、それは抗Ｃγ
ｂ血清によって認識される（図１１Ｂ）。抗ＣＤ３免疫
沈降物を非還元条件で調べたところ、ＩＤＰ２のγＴＣ
Ｒタンパク質がδＴＣＲパートナー鎖と非共有結合的に
会合することが明らかになった（図１１Ｂ、レーン４、
黒い矢印）。還元すると、δＴＣＲタンパク質は、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ移動度において相対分子量４０ｋＤにを示
した（図１１Ｂ、レーン４、黒い矢印と図１１Ｂ、レー
ン２、白い矢印を比較のこと）。

【０１１２】非共有結合的に会合したγδＴＣＲ型とは
対照的に、末梢血由来Ｔ細胞クローン、ＷＭ−１４は７
０ｋＤのジスルフィド結合ＴＣＲダイマーを生成し（図
１１Ｃ、レーン７）、抗Ｃγ血清によって認識された
（Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：
３８６１−３８６５）。また、このダイマーは、δＴＣ
Ｒサブユニットに対するｍＡｂである抗ＴＣＲδ１（図
１１Ｃ、レーン５）によっても認識され、それゆえγδ
ＴＣＲヘテロダイマーを表わす。還元条件下で分析する
と、３６ｋＤ、４０ｋＤ及び４３ｋＤの３種類のγＴＣ
Ｒタンパク質を表わした（４０ｋＤという）。

【０１１３】このように、ＰＢＬ−Ｌ２、クローンＩＩ
及びＭＯＬＴ−１３細胞上のＣＤ３会合複合体は、既知
型と比較して新規なγδＴＣＲヘテロダイマーを構成す
る。その理由は、そのＴＣＲγサブユニットが４０ｋＤ
（ＷＭ−１４細胞上のジスルフィド結合Ｃγ１コードす
るγＴＣＲタンパク質の大きさに類似する）であるが、
そのパートナー鎖（ＩＤＰ２細胞上の５５ｋＤＣγ２コ
ードγＴＣＲタンパク質に類似する）にジスルフィド結
合しないことによる。この複合体分子の基礎を理解する
ために、そのγＴＣＲとδＴＣＲサブユニットのより詳
細な構造分析は、実施例としてＭＯＬＴ−１３細胞系を
使用して下記のように行なった。

【０１１４】８．２．２．ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲサ
ブユニットのコアポリペプチドの大きさ ＭＯＬＴ−１３細胞（４０ｋＤのγＴＣＲ糖タンパク
質）のγＴＣＲコアポリペプチドの大きさを決定し、か
つＰＥＥＲ細胞（５５ｋＤのγＴＣＲ糖タンパク質）の
ものと比較するために、両細胞系を^３５Ｓ−メチオン及
びＳ−システインの存在下で１５分間生合成的に標識
し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で可溶化し、その後抗Ｃ
γｍ１（γＴＣＲ鎖を特異的に認識するモノクローナル
抗体）（図１３Ａ、方法を参照のこと）を用いて免疫沈
降させた。その後免疫沈降物質をエンドグリコシダーゼ
Ｈ（Ｅｎｄｏ Ｈ）消化し、未熟Ｎ結合グリカンを除い
た。ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲポリペプチド骨格は、３
５ｋＤの相対分子量を有し（図１３Ａ、レーン８）、Ｐ
ＥＥＲのγＴＣＲコアポリペプチド（４０ｋＤ：第１３
Ａ図、レーン４）又はＩＤＰ２のγＴＣＲコアポリペプ
チド（４０ｋＤ、国際公開番号第ＷＯ８８／００２０
９、１９８８年１月１４日公開、参照のこと）よりも５
ｋＤ小さい。ＭＯＬＴ−１３細胞は、５ｋＤ小さいため
にＩＤＰ２及びＰＥＥＲのγＴＣＲコアポリペプチドか
ら区別し得るγＴＣＲのコアポリペプチドを発現すると
結論される。加えて、成熟ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲ細
胞表面糖タンパク質における５〜１１ｋＤの大きさのみ
が、翻訳後プロセスによって説明される（４０〜４６ｋ
Ｄの表面の大きさから３５ｋＤのコアの大きさを引
く）。ここで、１５〜２０ｋＤの相対分子量はＰＥＥＲ
とＩＤＰ２のγＴＣＲ糖タンパク質における翻訳後プロ
セスによって説明し得る（５５〜６０ｋＤの表面大きさ
から４０ｋＤのコアの大きさを差し引く）。

【０１１５】すべての翻訳後プロセスがＮ−結合グリカ
ンであり、かつ、各グリカン鎖が約３ｋＤの相対分子量
であると仮定すると、２〜３本のＮ−結合グリカンがＭ
ＯＬＴ−１３のγＴＣＲタンパク質に付着し、一方、５
本のＮ−結合グリカンがＰＥＥＲ細胞及びＩＤＰ２細胞
上のポリペプチドに付加されることが予想される。Ｎ−
グリカナーゼを用いて細胞表面のγＴＣＲタンパク質か
らＮ−架橋炭水化物を除去する実験では、コアペプチド
に付加される翻訳後プロセスの大部分が実際にＮ−結合
グリカンであることが示された。

【０１１６】８．２．３．ＭＯＬＴ−１３ γＴＣＲの
一次配列 ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲサブユニットをコードする定
常領域遺伝子セグメントの構造を理解するために、ＭＯ
ＬＴ−１３のγＴＣＲ転写物を表すｃＤＮＡクローンの
配列を決定した。ＭＯＬＴ−１３由来ポリＡ^＋ ＲＮＡ
からのλｇｔ１０ライブラリーを構築し、ヒトγＴＣＲ
のｃＤＮＡクローン、ｐＴγ−１でつりあげた（Ｄｉａ
ｌｙｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：２６１９
−２３）。大きさと限定された制限酵素地図に基づい
て、１つのクローン、Ｍ１３Ｋを選択し、そのヌクレオ
チド配列を決定した（図１４）。クローンＭ１３Ｋは、
Ｊγ２．３遺伝子セグメントに結合したＶγ１．３遺伝
子セグメントを使用した、全長の、フレーム内γＴＣＲ
転写物を表わす（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９
８６，Ｃｅｌｌ ４５：２３７−２４６； Ｌｅｆｒａ
ｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３１９：
４２０−４２２； Ｓｔｒａｕｓｓらによる命名（Ｓｔ
ｒａｕｓｓｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３７：１２１７−１２１９）；Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕ
ｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３８：２６８７−２６９０）。定常領域の配列が、最近
報告された非機能性γＴＣＲ（Ｐｅｌｌｉｃｉ ｅｔ
ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１０５１
−１０５５）及び２種類のＣＩＩエキソンコピーｂ及び
ｃを含有するＣγ２ゲノム配列（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ
ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９５９６−９６００）とほ
ぼ同一であることが明らかになった（詳細に説明された
方法の節を参照のこと）。このこのとは、細胞表面上に
発現されたγＴＣＲタンパク質をコードする第一のフラ
ーム内転写物を表わし、これは二種類のＣＩＩエキソン
コピーを有するＣγ２遺伝子セグメントを利用するもの
である。

【０１１７】このｃＤＮＡクローンの推定アミノ酸配列
から３４．８ｋＤのポリペプチト骨格の大きさが予測さ
れ、これは前記の生化学データとよく一致した。驚くべ
きことに、６個のの潜在的なＮ−結合炭水化物付着部位
がこの転写物によってコードされる。生化学データによ
れば２〜３個のＮ−結合グリカンがポリペプチド鎖に付
着することが示唆されるため、潜在的な結合部位の全て
が使用されることはないことが示される。

【０１１８】Ｃγ遺伝子セグメントの使用を反映させる
ために、ＰＢＬ−Ｃ１及びＷＭ−１４によって“１型”
として発現されるジスルフィド結合γδＴＣＲ型に注目
した。これは、ジスルフィド結合したγＴＣＲ鎖がＣγ
１遺伝子セグメントを利用することによる（Ｋｒａｎｇ
ｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
７：６４−６７）。ＩＤＰ２細胞及びＰＥＥＲ細胞上で
発現されたγδＴＣＲ型の大きな（５５ｋＤ）、ジスル
フィド結合していないγＴＣＲサブユニットは、３種類
のＣＩＩエキソンコピー、すなわちコピーａ、コピーｂ
及びコピーｃを含有するＣγ２遺伝子セグメントによっ
てコードされ（Ｋｒａｎｇｅｌ ｅｔａｌ．，１９８
７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６７：Ｌｉｔｔｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２
６：８５−８８）、それゆえこのγδＴＣＲ型をここで
“２ａｂｃ型”という。同様に、ＭＯＬＴ−１３細胞上
で特徴づけられた型を“２ｂｃ型”という。

【０１１９】８．２．４．好適なＣγ遺伝子セグメント
の使用 新鮮な単離された末梢血中に三種類のγδＴＣＲ型が存
在することを決定するために、１０人の健常被験者から
の単核細胞を、ｍＡｂ抗ＴＣＲδ１（前記の第６節に記
載、δＴＣＲ定常領域と反応性を有する）による生化学
分析を用いて分析した。この抗体は、すべてがγ，δＴ
ＣＲリンパ球でないならば、大多数と反応する。このパ
ネルからの典型的な結果を図１５に示す。被験者１で
は、抗ＴＣＲδ１の免疫沈降物（非還元条件下で分析し
た）より、ジスルフィド結合γ，δＴＣＲ複合体を７０
ｋＤのタンパク質がバンド（１型）として、また、ジス
ルフィド結合していないγ，δＴＣＲ複合体がブロード
な４０ｋＤのタンパク質のバンド（２ｂｃ型）として存
在することが示された（図１５、レーン２）。このこと
から、Ｃγ１定常領域及びＣγ２定常領域の両方が、こ
れらの個別に発現されたγ，δＴＣＲにより使用される
ことが示された。しかしながら、２ｂｃ型の量は個々の
間で変動があった。被験者１と２における４０ｋＤタン
パク質のバンドの強度を比較することによって、被験者
１に比べたときの被験者２における２ｂｃ型のより小さ
なフラクションに注目すべきである（被験者２のレーン
２と被験者１のレーン２とを比較せよ）。より厳密に
は、ジスルフィド結合γ，δＴＣＲ複合体は、オートラ
ジオグラフで長時間感光させた後であっても、試験した
１０人の被験者中３人の被験者の単核細胞上で検出され
た（被験者３を参照のこと）。分析された個々の被験者
のいずれにおいても、末梢血中で５５ｋＤのジスルフィ
ド結合していないγ，δＴＣＲ複合体（２ａｂｃ型）は
示されなかった。

【０１２０】８．２．５．δＴＣＲサブユニットの特徴
付け γＴＣＲタンパク質の大きさ及びグリコンル化における
著しい構造上の相違とは対照的に、異なる細胞源からの
δＴＣＲサブユニットは、著しく類似することが証明さ
れた。ＭＯＬＴ−１３細胞上のδＴＣＲ糖タンパク質の
相対分子量は、抗δＴＣＲ ｍＡｂを使用して、大きさ
がＩＤＰ２細胞上のδＴＣＲ糖タンパク質と同様である
ことを確認しながら（図１１Ｂ、レーン２、白い矢
印）、直接的に４０ｋＤと決定した（図１２、レーン
４）。

【０１２１】同様に、δＴＣＲポリペプチド骨格の大き
さを比較するために、ＭＯＬＴ−１３細胞からの細胞表
面^１２５Ｉ標識δＴＣＲタンパク質をＮ−グリカナーゼ
消化して（高マンノース型、ハイブリッド型及び複合体
型の（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ，２４：４６６５−４６７１； Ｈｉｒａ
ｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，１６２：４８５−４９２）アスパラギン結合グリカ
ンを除去した。ＭＯＬＴ−１３細胞のδＴＣＲコアポリ
ペプチドは３５ｋＤの相対分子量を有し（図１３Ｂ、レ
ーン４）、ＩＤＰ２細胞のδＴＣＲ骨格の相対分子量
（３５ｋＤ）と同様であった（Ｂａｎｄｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６８２−６８
４）。

【０１２２】加えて、細胞表面^１２５Ｉ標識ＭＯＬＴ−
１３ δＴＣＲタンパク質をエンドグリコシダーゼＨで
消化すると（Ｅｎｄｏ Ｈ、高マンノース型とある種の
ハイブリッドＮ−グリカンのみを除去；（Ｔａｒｅｎｅ
ｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２４９：８１１−８１７； Ｔｒｉｍｂｌｅａ
ｎｄ Ｍａｌｅｙ，１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，１４１：５１４−５２２）、ポリペプチドに付着し
た、相対分子量２．５ｋＤのＥｎｄｏ Ｈ耐性の炭水化
物が除去され、１の炭水化物部分と一致する２．５ｋＤ
の相対分子量が減少した（図１３Ｂ、レーン２）。δＴ
ＣＲ定常ドメイン中に２箇所の潜在的なＮ−グリカン付
着部位が存在するため（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６
８２： Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３０：５６９−５７２）、これらのデータは、い
ずれの部位も使用されたが、そこに付着したＮ−グリカ
ンは異なるプロセシングを受けること、すなわち、一方
は高マンノースＮ−グリカン（Ｅｎｄｏ Ｈ感受性）と
して、他方は複合体Ｎ−グリカン（Ｅｎｄｏ Ｈ耐性だ
がＮ−グリカナーゼ感受性）として別個のプロセシング
を受けることを示す。γＴＣＲポリペプチド鎖上に付着
したＮ−結合炭水化物の異なる量とは対照的に、ＰＥＥ
Ｒ細胞、ＩＤＰ２細胞及びＭＯＬＴ−１３細胞上で発現
されたδＴＣＲサブユニットは、すべて同一のペプチド
コアサイズを有し、２箇所のＮ−結合グリカンが存在す
ることを示す（図１３Ｂ、データは示していない）。

【０１２３】８．３．検討 この実施例において、ヒトγＴＣＲ糖タンパク質の３種
のタンパク質の型、すなわちジスルフィド結合した４０
ｋＤのγＴＣＲタンパク質（１型）、ジスルフィド結合
していない５５ｋＤのγＴＣＲタンパク質（２ａｂｃ
型）及びジスルフィド結合していない４０ｋＤのγＴＣ
Ｒタンパク質（２ｂｃ型）を比較した。３種類の型はす
べて、δＴＣＲサブユニットと結合していることが示さ
れた。最初の２つのγＴＣＲ型を表す相補的ＤＮＡ配列
が報告されている（Ｋｒａｎｇｅｌｅｔ ａｌ．，１９
８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７；６４−６７； Ｌｉｔ
ｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２６：８５−８８）。（ＰＢＬ−Ｃ１上の）γＴＣＲポ
リペプチド１型の定常領域は、単一のＣＩＩエキソンを
含有するＣγ１遺伝子セグメントによってコードされ、
一方、（ＩＤＰ２細胞及びＰＥＥＲ細胞上の）γＴＣＲ
ポリペプチドの２ａｂｃ型は、ＣＩＩエキソンコピー
ａ、コピーｂ及びコピーｃを含有するＣγ２遺伝子セグ
メントを利用する。２ｂｃ型のγＴＣＲ鎖に対応するｃ
ＤＮＡ配列は、２種のＣＩＩエキソンコピー、すなわ
ち、コピーｂとコピーｃのみを利用するＣγ２遺伝子セ
グメントを含むことが示された。同様に、クローンＩＩ
おびＰＢＬ−Ｌ２のγＴＣＲ結合領域の遺伝子構造（ジ
スルフィド結合していない、４０ｋＤのγＴＣＲタンパ
ク質）は、ここで決定されたＭＯＬＴ−１３の構造、す
なわち、２ｂｃ型に類似するようである。使用したδＴ
ＣＲ定常領域はこれらの型の全てについて同様であるた
め（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２；Ｌｏｈ．Ｅ．
Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３
０：５６９−５７２）、ヒトにおけるγδＴＣＲ型の３
つの構造を、完全に比較することができる（図１６）。

【０１２４】２種類のＣγ２多型ゲノム型はヒトに存在
する（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
３１９：４２０−４２２；Ｐｅｌｌｉｃｉ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１０５１−
１０５５）。２つの転写物型（２ａｂｃ型と２ｂｃ型）
は、多分これらの異なる対立遺伝子型の産物である。今
まで、γＴＣＲポリペプチドの対立遺伝子型はマウスで
は発見されていなかった。我々は、２ａｂｃ型（５５ｋ
Ｄ）と２ｂｃ型（４０ｋＤ）との間のγＴＣＲ細胞表面
タンパク質の大きさの劇的な相違は、付着したＮ−結合
炭水化物の量、最もありそうなこととしてＮ−結合グリ
カンの数を反映することによってほぼ決定されるものと
結論された。

【０１２５】ＩＤＰ２のγＴＣＲ（２ａｂｃ型）タンパ
ク質及びＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲ（２ｂｃ型）タンパ
ク質の骨格の大きさは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、
それぞれ４０ｋＤと３５ｋＤであると測定された。それ
らの値は、ｃＤＮＡ配列に基づいて計算されたそれぞれ
の予想分子量３６．６ｋＤ及び３５．８ｋＤとよい相関
性を有する。骨格の大きさのわずかな相違（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで５ｋＤ）は、１６アミノ酸からなる１つのＣＩ
Ｉエキソンコードペプチドによって主に説明することが
でき、このような相違に関与するが、５５ｋＤ及び４０
ｋＤのジスルフィド結合していないγＴＣＲ表面型の間
における分子量の観察された相違の全てを説明すること
はできない。１箇所の付加的な潜在的付着部位を生ずる
ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲポリペプチドとは対照的に、
２ａｂｃ型のγＴＣＲポリペプチドは、おそらくすべて
を使用できる５箇所の潜在的なＮ結合グリカン付着部位
を有するが、わずか２〜３個のＮ−結合グリカンを有す
る。潜在的な付着部位について、このように使用が制限
されることに対する理由は明らかではないが、γＴＣＲ
タンパク質のコンホメーションに対するＣＩＩエキソン
コードペプチドの影響から生ずるものかもしれない。Ｃ
ＩＩエキソンコードペプチド及びその隣接アミノ酸は原
形質膜と免疫グロブリン様定常ドメインとの間の結合領
域を作る。この領域は大部分のＮ結合グリカン付着部位
を含む（図１７）。我々は、ＣＩＩエキソンコピーが、
ポリペプチド骨格の大きさを決定するばかりでなく、ジ
スルフィド結合鎖を形成する能力によって、付着した炭
水化物量にも影響を与えることによって、タンパク質の
型を決定するものと結論した。

【０１２６】ＩＤＰ２細胞（Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８
２）、ＰＥＥＲ細胞（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９−５７２）及びＭＯ
ＬＴ−１３細胞のδＴＣＲに相補的なＤＮＡを配列決定
し、可変領域遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメ
ントとの間をつなぐＤ／Ｎ領域を除いて、同一であるこ
とを見い出した。ＷＭ−１４細胞上のδＴＣＲタンパク
質は４３ｋＤの相対分子量を有し、これは前記のδＴＣ
Ｒタンパク質と同様であった（Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８３−６８
８： Ｌａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：１０７６−１０９４）が、他の
δＴＣＲ鎖よりも３ｋＤ大きかった。これらの４３ｋＤ
のδＴＣＲタンパク質は、異なるδ可変ドメインに別の
Ｎ−結合グリコンル部位が存在することを示す。

【０１２７】γＴＣＲ定常領域セグメントに関して記載
した構造と比較しうる構造上の相違は、αＴＣＲ遺伝子
及びβＴＣＲ遺伝子については観察されなかった（Ｙｏ
ｓｈｉｋａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ
３１６：８３７−８４０；Ｔｏｙｏｎａｇａ ｅｔ
ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：８６２４−８６２８； Ｒｏ
ｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１６０：９４７−９５３； Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ
ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：６
４７−６５３）。マウスＣγ領域の長さを有するヒトＣ
ＩＩエキソン反復配列の数と蓋然性の高い構造的な類似
性があり、そのＣγ１、Ｃγ２及びＣγ４定常領域はそ
れぞれ１５アミノ酸、１０アミノ酸及び３３アミノ酸か
らなる結合領域をコードする（Ｇａｒｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６．Ｃｅｌｌ ４５：７３３−７４２：
Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１６３：１２０３−１２１２）。しかしな
がら、マウスの結合領域は適切なエキソンの大きさの相
違を反映するが、ヒトの２ａｂｃ型のγＴＣＲ及び２ｂ
ｃ型のγＴＣＲで見られたような、エキソンの汎用性の
用途を示さない。また、マウスのγＴＣＲは、２種類の
ジスルフィド結合していないヒトの型とは対照的に、ジ
スルフィド結合型にだけ存在する。重要なことは、ヒト
のγ，δＴＣＲ型と全く同じようには使用されないこと
である。数人（高率のγ，δＴＣリンパ球のために選択
した）において、単一の型（１型）が優性であり、この
型のための陽性選択が生じるか、又は別のγ，δＴＣリ
ンパ球の型に対する選択が存在するかどうかが示唆され
る。

【０１２８】９．個別にトランスフェクトしたγＴＣＲ
鎖と一本鎖δＴＣＲサブユニットとの対形成によって再
構成した３種類のＴ細胞レセプターγ，δイソタイプ型 この実施例で記載するように、γδヘテロダイマー形成
におけるγδＴＣＲポリペプチドの役割を調べた。トラ
ンスフェクションによって、３種類のγδＴＣＲ型（１
型、２ａｂｃ型及び２ｂｃ型）に対応するγＴＣＲ鎖と
一本鎖の固有δＴＣＲ鎖との会合によって形成されたγ
δＴＣＲ複合体を調べた。γＴＣＲポリペプチドの１型
又は２ａｂｃ型のいずれかをコードするγＴＣＲのＤＮ
ＡをＭＯＬＴ−１３細胞系中にトランスフェクトした。
このＤＮＡは、δＴＣＲポリペプチドと非共有結合的に
会合した２ｂｃ型γＴＣＲから成るγδヘテロダイマー
を構造的に発現した。トランスフェクトした細胞は、Ｍ
ＯＬＴ−１３細胞系のγδＴＣＲの特徴とともに、δＴ
ＣＲと非共有結合的に会合した２ａｂｃ型γＴＣＲ又は
δＴＣＲと共有結合的に結合した１型γＴＣＲからなる
γδヘテロダイマーを発現することが可能であった。そ
の上、トランスフェクトしたγＴＣＲ遺伝子産物のグリ
コシル化は、それらの天然の細胞系におけるこれらの遺
伝子のグリコシル化と同じであった。このように、グリ
コシル化の程度及びジスルフィド結合能は、γＴＣＲ遺
伝子によって決定される。γＴＣＲの定常領域のＣＩＩ
エキソンを使用すると、ＴＣＲγ及びＴＣＲδポリペプ
チド間のジスルフィド結合の有無ばかりでなく、γＴＣ
Ｒ鎖に付着した炭水化物量をも決定し、細胞表面γＴＣ
Ｒタンパク質の大きさの差に強く影響を与える。

【０１２９】９．１．材料と方法 ９．１．１．細胞系 ＭＯＬＴ−１３、ＴＣＲγδ^＋Ｔ白血病細胞系（Ｈａｔ
ａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３８：６７８−６８２：Ｌｏｈ，Ｅ．Ｙ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９−５７
２）、及び末梢血由来のＴＣＲ γδ^＋細胞系ＰＢＬ
Ｃ１（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９−６９４）及びＩＤ
Ｐ２（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２２：１４５−１４９）を前記のように培
養した。

【０１３０】９．１．２．抗体 使用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は以下のものを使用
した。抗Ｌｅｕ−４（抗ヒトＣＤ３：ＩｇＧ１）（Ｌｅ
ｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９８１，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３：３１０−３２３）、抗Ｔ
ＣＲ δ１（抗ヒトＴＣＲ δ鎖定常領域：ＩｇＧ１）
（第６節を参照のこと（Ｂａｎｄ，Ｈ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６８２−６
８４））、抗ＴｉγＡ（抗Ｖγ２：ＩｇＧ２ａ）（Ｊｉ
ｔｓｕｋａｗａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１１９２−１１９７）、抗Ｃ
γｍ１（抗ヒトγＴＣＲ定常領域：第８．１．７節を参
照のこと）、Ｐ３（Ｐ３×６３ＡＧ８ミエローマによっ
て分泌されたＩｇＧ１）（Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｇ．，ａｎ
ｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５−４９７）、及び１８７．１（ラット抗
マウスκ軽鎖特異性）（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ
ａｌ．，１９８１，ハイブリドーマ１：５−１１）。

【０１３１】９．１．３．ＭＯＬＴ−１３のδＴＣＲの
ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 ベクターλｇｔ１０中にＭＯＬＴ−１３のポリＡ^＋ＲＮ
Ａから調製した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリー
（Ｈｕｙｎｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８５，ｉｎＤＡＮ
ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ＩＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ），ｖｏｌｕｍｅ ｌ，
ｐｐ４９−７８）を、^３２Ｐ標識ヒトδＴＣＲのｃＤＮ
ＡクローンＩＤＰ２ ０−２４０／３８とのハイブリダ
イゼーションによってスクリーニングした（Ｈａｔａ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６
７８−６８２）。クローンを、大きさ及び限定制限酵素
地図に基づいて詳細な分析のために選択した。核酸配列
は、修飾Ｔ７ポリメラーゼを用いるジデオキシチェイン
ターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９
７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．７４：５４６３−５４６７）を使用してＭ１３
ベクター中で決定した（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ，Ｕｎｉｔ
ｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒ
ｐ．）（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
１：７１６１−７１６５）。

【０１３２】９．１．４．発現プラスミドの構築及びト
ランスフェクンョン γＴＣＲのｃＤＮＡ（ＰＢＬ Ｃ１．１５とＩＤＰ２．
１１ｒ）（Ｋｒａｎｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６７）は、
図１０Ｂに模式的に示したように、Ｆｒｉｅｎｄ ｓｐ
ｌｅｅｎ ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｒｕｓ（ＳＦＦＶ）の
長い末端反復配列（ＬＴＲ）の下流で、ｐＦｎｅｏ哺乳
動物発現ベクター（Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：１２５−１３０；
Ｏｈａｓｈｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１６：６０６−６０９）中にクローニングし
た。プラスミド構築物をエレクトロポレーションによっ
てＭＯＬＴ−１３細胞ヘトランスフェクトした（Ｐｏｔ
ｔｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８１：７１７６−７１６
５）。形質転換体を選択し、２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８含
有培地（バイオアッセイによれば４８０μｇ／ｍＬの固
形分。ＧＩＢＣＯ）中で維持し、限界希釈によりクロー
ニングした。

【０１３３】９．１．５．ヨード化及び免疫沈降 ラクトパーオキシダーゼを使用する^１２５Ｉによる細胞
表面標識、３−［（３−コラミドプロピル（ｃｈｏｌａ
ｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））ジメチルアンモニオ）］１−
プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ： Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で
の可溶化、各種抗体を使用する免疫沈降、非平衡ｐＨグ
ラジェントゲル電気泳動法（ＮＥＰＨＧＥ）及びＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を記載の通りに行なった（第８．１．３．節参照の
こと。（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１
９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１４５−１４９：Ｂｒ
ｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２５：６８９−６９４）。特異的な免疫沈
降は、１μｇの抗Ｌｅｕ−４、０．１μＬの抗ＴＣＲ
δ１腹水、又は１μＬのＰ３腹水を用いて、１８７．１
の培養上清１５０μＬとともに行なった。抗Ｔ９−γＡ
に対しては、１μＬの腹水を用い、１８７．１なしで行
なった。

【０１３４】９．１．６．生合成標識化 対数増殖期にある細胞をメオチニン及びシステインを含
まない培地で３０分間インキュベートし、続いて３７℃
で^３５Ｓ−メチオニン及び^３５Ｓ−ンステインを用いて
１５分間パルス標識を行ない、そして前記第８．１．３
節に記載したように免疫沈降を行なった。免疫沈降物を
エンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏ Ｈ）処理するか又
はｍｏｃｋインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て分離し、フルオログラフィーによって可視化した（Ｂ
ｏｎｎｅｒ Ｗ．Ｍ．ａｎｄ Ｌａｓｋｅｙ，Ｒ．Ａ．
１９７４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：８３−
８８）。

【０１３５】９．２．結果 我々は、各種γＴＣＲイソタイプ間の構造上の相違を決
定する際に、γＴＣＲ遺伝子、特にＴＣＲ ＣＩＩエキ
ソンの役割を証明するために、構造上異なるγＴＣＲ遺
伝子産物と一本鎖δＴＣＲタンパク質との会合から生ず
る生成物を調べた。この目的のために、ＭＯＬＴ−１
３、すなわち４０ｋＤ非ジスルフィド結合γＴＣＲポリ
ペプチド（２ｂｃ型）を発現するＴ白血病細胞系を、レ
セプターの他の２つの型に対応するγＴＣＲ鎖のｃＤＮ
Ａクローンのためのレンピエントとして使用した（１型
と２ａｂｃ）。これらのγＴＣＲ鎖を表すｃＤＮＡクロ
ーンの完全な配列は、図１４（２ｂｃ型）及びクランゲ
ル等（Ｋｒａｎｇｅｌ ｅｔａｌ．，１９８７，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３７：６４−６７）（１型と２ａｂｃ）の
文献に記載されており、図１８Ａに図示した。

【０１３６】９．２．１．一本鎖機能的δＴＣＲ鎖はＭ
ＯＬＴ−１３細胞系に存在する ＭＯＬＴ−１３細胞系のδＴＣＲ遺伝子の再編成の研究
より（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２）、一本鎖の機能
的δＴＣＲ遺伝子産物だけがこの細胞系において発現さ
れることが示唆された。しかしながら、δＴＣＲのため
の一本鎖の機能的転写物がＭＯＬＴ−１３細胞内で作ら
れたことを直接的に証明するために、δＴＣＲのｃＤＮ
Ａプローブとの交差ハイブリダイゼーンョンさせたｃＤ
ＮＡクローン（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２）をλｇ
ｔ１０中で作製したＭＯＬＴ−１３ライブラリーから単
離し、選択したｃＤＮＡクローンの配列を決定した。こ
の分析から、ＭＯＬＴ−１３細胞が機能的に再編成され
たもの及びδＴＣＲ遺伝子を突然変異的に再編成された
ものに対応する転写物を発現することが示された。機能
的に再編成されたδＴＣＲ遺伝子に対応するｃＤＮＡク
ローンは、ＩＤＰ２細胞系について先に記載したのと同
じＶ（Ｖδ１）、Ｊ（Ｊδ１）、及びＣ遺伝子セグメン
トを有する（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，１９８７．
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２）。しかしな
がら、ＭＯＬＴ−１３のδＴＣＲのｃＤＮＡクローン
は、Ｄセグメントの利用（ＭＯＬＴ−１３はおそらくＤ
δ２のみを使用する）、不正確な連結、Ｖ−Ｄ結合部及
びＤ−Ｊ結合部におけるＮ領域の多様性より生ずるＶ遺
伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントの間に異なる核
酸配列を有する（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９
８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１５４１−１５４
４）。また、ＭＯＬＴ−１３のδＴＣＲのｃＤＮＡよ
り、定常領域の膜近位結合領域におけるンステイン残基
を予測させる。この結合領域は、Ｃγ１遺伝子セグメン
トを利用するγＴＣＲ遺伝子産物へのジスルフィド結合
を有用なものとするはずである。ＭＯＬＴ−１３細胞系
はジスルフィド結合していないγ，δＴＣＲレセプター
を発現するが、そのδＴＣＲ鎖の膜近位結合領域におけ
るンステイン残基の存在は、δＴＣＲサブユニットがジ
スルフィド結合していない複合体又はジスルフィド結合
した複合体のいずれかに関係し得る可能性を明らかに残
している。

【０１３７】９．２．２．γＴＣＲ遺伝子産物はレセプ
ターの型を決定する γＴＣＲのｃＤＮＡ構築物でトランスフェクトしたＭＯ
ＬＴ−１３細胞を、Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１γ（ＰＢＬ
Ｃ１由来のγＴＣＲのｃＤＮＡでトランスフェクトした
ＭＯＬＴ−１３細胞について）と、そしてＭ１３．ＩＤ
Ｐ２γ（ＩＤＰ２由来のγＴＣＲのｃＤＮＡでトランス
フェクトしたＭＯＬＴ−１３細胞について）と略称す
る。バルクの形質転換細胞系及びこれらの系に由来する
代表的なサブクローンは、γＴＣＲ（ＶＪＣ）又はＶγ
２−特異的ｃＤＮＡプローブを用いるノーザンブロット
分析によって分析した。固有の１．６ｋｂのＭＯＬＴ−
１３γＴＣＲ転写物に加えて、約１．８ｋｂの第２のγ
ＴＣＲ転写物（発現プラスミドのＳＦＦＶ ＬＴＲで開
始されるγＴＣＲ転写物に対して期待される大きさ）
が、形質転換体及びそれらのクローンにおいて観察され
た。Ｖγ１．３と交差ハイブリダイズしないＶγ２プロ
ーブと特異的にハイブリダイズするこの１．８ｋｂの転
写物が、固有のＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲ転写物中に存
在し、こうして、この１．８ｋｂ転写物はトランスフェ
クトされたγＴＣＲのｃＤＮＡの転写物を表わす（この
転写物はＶγ２セグメントを利用する）。

【０１３８】形質転換体の表面上に発現されたγＴＣＲ
タンパク質を生化学的に特徴づけるために、各細胞系に
由来する代表的なクローンを、Ｐ３（対照）、抗Ｌｅｕ
−４（抗ＣＤ３）、抗ＴＣＲ δ１（抗δＴＣＲ）又は
抗Ｔｉ−γＡのｍＡｂを用いる表面ヨード化細胞免疫沈
降によって分析した。抗Ｔｉ−γＡ（Ｊｉｔｓｕｋａｗ
ａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１６６：１１９２−１１９７）は、それらのγＴＣ
Ｒ鎖可変領域としてＶγ２遺伝子セグメントを利用す
る、γ，δＴＣＲ細胞を特異的に認識するらしい。トラ
ンスフェクトしていないＭＯＬＴ−１３（図１９Ａ）な
らびにトランスフェクトしたＭＯＬＴ−１３細胞（図１
９Ｂ及び図１９Ｃ）とは、期待された親γＴＣＲ（４０
ｋＤ；白い矢印を参照せよ）とδＴＣＲサブユニット
（星印を参照せよ）とを発現する。抗Ｖγ２−特異的ｍ
Ａｂ（抗Ｔｉ−γＡ）は固有のＭＯＬＴ−１３γＴＣＲ
鎖と反応しないことに注意すべきである（図１９Ａ、レ
ーン７及び８）。Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１γ形質転換細胞
の抗ＣＤ３免疫沈降は、非還元条件下で試験した場合に
別のＣＤ３会合種（６８ｋＤ）を示した（図１９Ｂ、レ
ーン３、黒い矢印を参照せよ）。ＰＢＬ Ｃ１細胞（図
１９Ｄ）レーン３及び４）及びＭ１３．ＰＢＬＣ１γ形
質転換細胞系（図１９Ｂ、レーン３及び４）の両方につ
いて、６８ｋＤ複合体は、還元により４０ｋＤ種及び３
６ｋＤ種を産生した（Ｍ１３．ＰＢＬＣ１γ形質転換体
の場合に、これらのバンドは抗Ｖγ２の免疫沈降におい
て、明瞭に可視化された。図１９Ｂ、レーン７及び８、
黒い矢印を参照せよ）。これらの４０ｋＤ種おび３６ｋ
Ｄ種は、異なってグリコシル化されたγＴＣＲポリペプ
チドを示す（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９−６９
４）。これらの免疫沈降において、δＴＣＲ鎖（４０ｋ
Ｄ還元）は４０ＫＤのγＴＣＲポリペプチドとともに移
動し、それゆえに可視化されない（しかしながら、下記
参照のこと）。

【０１３９】重要なことは、これらの実験より、ＭＯＬ
Ｔ−１３細胞系の固有のδＴＣＲ鎖が、通常、ジスルフ
ィド結合していない複合体の一部であり、ＰＢＬ Ｃ１
のγＴＣＲタンパク質と会合して形質転換細胞系中でジ
スルフィド結合した、γ，δＴＣＲヘテロダイマーを形
成することが示された。対照的に、Ｍ１３．ＩＤＰ２形
質転換細胞系におけるＩＤＰ２由来γＴＣＲタンパク質
（５５ｋＤ）は、固有のＭＯＬＴ−１３ δＴＣＲ鎖と
ともにジスルフィド結合していない複合体を形成した
（図１９Ｃ、レーン３及び４）。抗ＴＣＲ δ１のｍＡ
ｂ（δＴＣＲペプチドに特異的）を用いて行なった免疫
沈降により、これらの細胞系の全てからの内因性のγＴ
ＣＲ（図１９Ａ、Ｄ図及びＥ図、レーン５及び６）なら
びにトランスフェクトしたγＴＣＲ鎖（図１９Ｂ及び図
１９Ｃ、レーン５及び６）が直接的にδＴＣＲ鎖と会合
することが確認された。抗Ｔｉ−γＡは、Ｍ１３．ＰＢ
ＬＣ１形質転換細胞からの６８ｋＤジスルフィド結合
γ，δＴＣＲヘテロダイマー（図１９Ｂ、レーン７及び
８）、Ｍ１３．ＥＤＰ２γ形質転換細胞からの５５ｋＤ
のγＴＣＲ鎖を４０ｋＤのδＴＣＲ鎖（図１９Ｃ、レー
ン７と８）とともに特異的に免疫沈降させ、これらの複
合体の一部であるγＴＣＲがそれぞれトランスフェクト
されたＰＢＬ Ｃ１及びＩＤＰ２由来γＴＣＲのｃＤＮ
Ａに対応することが確認された。

【０１４０】各種γＴＣＲタンパク質をさらに特徴づけ
るために、表面^１２５Ｉ標識細胞の生化学的二次元（２
Ｄ）ゲル分析（ＮＥＰＨＧＥに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
を行なった。ＣＤ３成分の位置に関する固有の（ＭＯＬ
Ｔ−１３ ）γＴＣＲ鎖及びトランスフェクトした（Ｐ
ＢＬ Ｃ１又はＩＤＰ２）γＴＣＲ鎖の２Ｄパターンの
重ね合せにより、適切なγＴＣＲ種の比較を行なった。
ＭＯＬＴ−１３細胞からの免疫沈降物において、γＴＣ
Ｒ鎖は、２つの分離したヨード化種の平行なシリーズと
して分離した（図２０Ａ、白い矢印を参照せよ）。ＰＢ
Ｌ Ｃ１又はＩＤＰ２のＴＣＲのｃＤＮＡでトランスフ
ェクトしたＭＯＬＴ−１３細胞は、固有のＭＯＬＴ−１
３のγＴＣＲポリペプチドシリーズを示したが、加え
て、２Ｄゲルパターンで、それぞれ、ＰＢＬ Ｃ１のγ
ＴＣＲポリペプチド（図２０Ｂ及び図Ｄを比較せよ、図
２０Ｂの星印を参照せよ）、又はＩＤＰ２（図２０Ｃ及
び図Ｄを比較せよ、図２０Ｃの黒い矢印を参照せよ）と
同一である放射性標識種を示した。このように、２Ｄゲ
ルの生化学分析では、トランスフェクトしたγＴＣＲ鎖
が発現され、ＭＯＬＴ−１３の形質転換細胞及び親細胞
系である、ＰＢＬ Ｃ１とＩＤＰ２で同様にプロセシン
グされることが確認された。

【０１４１】９．２．３．トランスフェクトしたγＴＣ
Ｒ鎖タンパク質の ポリペプチド骨格の大きさ トランスフェクトされたγＴＣＲ鎖のペプチド骨格の大
きさは、代謝的にパルス標識された細胞から免疫沈降さ
れた物質のエンドグリコシダーゼＨ処理によって決定し
た。抗ＣγＭ１（γＴＣＲ鎖に特異的）を用いた免疫沈
降では、内因性のＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲポリペプチ
ドを表わすトランスフェクトされていないＭＯＬＴ−１
３細胞（図２１、レーン４）において３５．５ｋＤ種及
び３４ｋＤ種が同定された。これらの２種類のポリペプ
チドの小さい方（白い矢印を参照のこと）は期待された
ポリペプチドコアサイズのＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲポ
リペプチドに対応し、一方、大きい方は、ポリペプチド
は部分的にプロセシングされた中間体を表わすらしい。
これらの固有のＭＯＬＴ−１３ γＴＣＲポリペプチ
ド、すなわち、脱グリコシル化された４１ｋＤの大きさ
を有するポリペプチドは、Ｍ１３．ＩＤＰ２γ形質転換
体からの抗ＣγＭ１によって免疫沈降された（図２１、
レーン８、黒い矢印を参照のこと）。この形質転換体特
異的γＴＣＲポリペプチドの大きさは、ＩＤＰ２細胞で
先に決定した脱グリコシル化ＩＤＰ２γＴＣＲポリペプ
チドのコアサイズとよく一致する（Ｂｒｅｎｎｅｒ，
Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２５：６８９−６９４）。期待されたように、Ｍ１３．
ＰＢＬ Ｃ１γ形質転換細胞は、３２ｋＤの脱グリコシ
ル化されたサイズ（図２１、レーン１２、黒い矢印参照
のこと）を有する別のγＴＣＲタンパク質を示し（Ｂｒ
ｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａ
ｔｕｒｅ３２５：６８９−６９４）、これは以前にＰＢ
Ｌ Ｃ１細胞系について報告されたγＴＣＲポリペプチ
ド骨格の大きさに十分に匹敵する。この３２ｋＤ種は、
Ｖγ２特異的ｍＡｂ、抗Ｔｉ−γＡ（図２１、レーン１
３、黒い矢印を参照のこと）によって特異的に免疫沈降
し、それによってこの細胞系における固有のγＴＣＲ種
及びトランスフェトクされたγＴＣＲ種の割り当て量を
明確にする。このようにして、ＩＤＰ２細胞系及びＰＢ
Ｌ Ｃ１細胞系に由来するトランスフェクトされたγＴ
ＣＲ鎖の決定された骨格の大きさが、それらの親細胞系
におけるこられのポリペプチド骨格の大きさと合致す
る。γＴＣＲポリペプチドコアの大きさと細胞表面タン
パク質の大きさとを比較することによって、ＭＯＬＴ−
１３由来γＴＣＲ鎖、ＩＤＰ２由来γＴＣＲ鎖及びＰＢ
Ｌ Ｃ１由来γＴＣＲ鎖が、それぞれ、６ｋＤ、１４ｋ
Ｄ、及び８ｋＤのＮ−結合炭水化物を有していることが
結論される。

【０１４２】９．３．検討 ヒトγδＴＣＲサブユニット構造には３種類の生化学的
に区別される型が存在する。今日の研究において、我々
は、一本鎖δＴＣＲポリペプチドが、これら３種類のレ
セプター型の各々を表わすγＴＣＲ鎖と会合して適切な
γ，δＴＣＲヘテロダイマーを再構成することを示す。
ＭＯＬＴ−１３の固有のγＴＣＲポリペプチド（２ｂｃ
型）は４０ｋＤであり、δＴＣＲサブユニットと非共有
結合的に会合している。ＰＢＬ Ｃ１のジスルフィド結
合レセプター（１型）又はＩＤＰ２細胞系の５５ｋＤの
ジスルフィド結合していないレセプター（２ａｂｃ型）
に対応するγＴＣＲのｃＤＮＡクローンをＭＯＬＴ−１
３細胞系へトランスフェクトさせた場合、ｃＤＮＡドナ
ー細胞系中で見いだされるそれらに対応するγδＴＣＲ
型が再構成された。現在のトランスフェクションに関す
る研究から、ジスルフィド結合はγＴＣＲの定常セグメ
ントの使用によって指図されるという直接的な証拠が示
された。その理由は、固有のＭＯＬＴ−１３のδＴＣＲ
鎖はＰＢＬＣ１由来のγＴＣＲ鎖を有するジスルフィド
結合レセプター複合体（１型）に関係し、ＩＤＰ２由来
γＴＣＲ鎖を有するジスルフィド結合していないレセプ
ター複合体（２ａｂｃ型）に関係することが認められる
からである。

【０１４３】我々は、５５ｋＤ（２ａｂｃ型）及び４０
ｋＤ（２ｂｃ型）のジスルフィド結合していないγＴＣ
Ｒポリペプチド間の大きさの顕著な相違が、主にγＴＣ
Ｒポリペプチド骨格に付着したＮ−結合炭水化物の量の
相違によることを示した（前記第８．２．２．節参照の
こと）。このように、同じ数のＮ−結合グリカンアクセ
プター部位（各々５箇所）がこれらの型のいずれにおい
ても使用された定常領域遺伝子セグメントによってコー
ドされたとしても、１５ｋＤ（ＩＤＰ２又はＰＥＥＲ上
の２ａｂｃ型）又はわずか５ｋＤ（ＭＯＬＴ−１３上の
２ｂｃ型）のＮ−結合炭水化物がこれらのγＴＣＲポリ
ペプチドに付着する。これらのＮ−結合グリコシル化部
位の４箇所が、ＣＩＩエキソンコードコネクター領域及
びその周辺に存在する。ここにおける実施例において、
我々は、トランスフェクトしたγＴＣＲのｃＤＮＡクロ
ーンのタンパク質産物のペプチドコアサイズ及び成熟細
胞表面サイズの比較に基づいて、トランスフェクトした
γＴＣＲタンパク質に付着したＮ−結合炭水化物の量
が、それらの親細胞系に見られるのと同一であることを
示す。このように、２種類のＣγ２コードタンパク質セ
グメントのコンホメーションは十分に相違するに違いな
く、グリコシル化において劇的な相違を生じさせる。こ
れら２種類の型のＣγセグメント間の主要な相違は、Ｃ
ＩＩエキソンのコピー“ａ”が２ａｂｃ型の５５ｋＤの
γＴＣＲ鎖に存在し、２ｂｃ型の４０ｋＤのγＴＣＲ鎖
に存在しないということにある。このように、ＣＩＩエ
キソンのコピーが存在するか否かは、γＴＣＲポリペプ
チドの大きさを説明するグリコシル化の相違に大きく関
与する。このような相似はαβＴＣＲにおいて観察され
ないので、Ｔ細胞レセプターの間ではヒトγδＴＣＲイ
ソタイプ型の構造の変化は新規なものである。

【０１４４】１０．ＣＤ３と会合しないＴ細胞レセプタ
ーγδ複合体は ヒト子宮内膜腺上皮において同定される 胎盤形成初期においては、単核細胞の浸潤は、母体の子
宮組織におけるらせん状の動脈及び子宮内膜腺の付近で
多い。これらは、通常にはない未知の機能のＴ系統の細
胞の集団を含む。多くの絨毛外の栄養膜は新規なタイプ
のクラスＩ ＭＨＣ抗原を発現し、これらは大部分の体
細胞上で発現されたものとは相違している。我々は、妊
娠子宮又は非妊娠子宮におけるＴＣＲγδヘテロダイマ
ー（γδＴＣＲ）に対する１パネルのモノクローナル抗
体を試験した。驚くべきことに、γδＴＣＲ複合体は白
血球では検出されなかったが、妊娠子宮からの子宮内膜
腺上皮の細胞質に局在していた。また、これらの抗体は
非妊娠子宮からの腺上皮とも反応し、その反応性は月経
周期の増殖相においてよりも分泌相においてさらに強
い。しかしながら、ＣＤ３（ＯＫＴ３、抗Ｌｅｕ−４、
ＵＣＨＴ−１）に対する３種類の異なるモノクローナル
抗体を用いた免疫沈降物を調べることで示されるよう
に、γδＴＣＲはＣＤ３複合体と会合しなかった。γδ
ＴＣＲ陽性腺上皮細胞はαβＴＣＲに対するモノクロー
ナル抗体と反応しなかった。この細胞もまたＣＤ４及び
ＣＤ８陰性であった。さらに、腺上皮細胞は妊娠初期に
おいてクラスＩ ＭＨＣ抗原を失なう。これらのデータ
から、γδＴＣＲを有する子宮内膜腺細胞は、少なくと
も、遺伝子発現の局所的調節のもとで表現型修飾を受け
ることを示唆する。

【０１４５】１１．実施例：ヒトδＴ細胞レセプター遺
伝子 及びＶδ特異モノクローナル抗体の特徴付け 我々は、ヒトγδＴ細胞クローン、ＡＫ１１９からδＴ
ＣＲのｃＤＮＡ及び再編成されたδＴＣＲ遺伝子を単離
した。これらのＤＮＡクローンから、κδプローブが得
られ、これを使用して、１パネルの１３個のヒトγ，δ
Ｔ細胞クローンと３個のγ，δヒトＴ細胞腫瘍系におけ
るδＴＣＲ遺伝子再編成の多様性を決定した。全体で５
つの異なる再編成が検出され、これらは２〜５個の異な
るｘδ遺伝子を用いる再編成に対応していた。ある特別
な再編成が、ｍＡｂ ＴＣＳ δ１（δＴＣＡＲ−３）
と反応するヒトγ，δＴ細胞で常に見られた。加えて、
ＴＣＳ δ１はγ，δ腫瘍細胞系、ＭＯＬＴ−１３から
のδＴＣＲポリペプチドを免疫沈降させた。我々は、モ
ノクローナル抗体ＴＣＳδ１が、ＡＫ１１９のＶδ遺伝
子でコードされたエピトープ、又は再編成されたＡＫ１
１９遺伝子のＶδ−Ｊδ遺伝子の組み合わせでコードさ
れたエピトープを認識する証拠を提供する。

【０１４６】１１．１．原料及び方法 １１．１．１．ＡＫ１１９のδＴＣＲのｃＤＮＡクロー
ンの単離と配列決定 ｃＤＮＡライブラリーを、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａ
ｎの方法（Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，１
９８３，Ｇｅｎｅ ２５：２６３）によって、ＰＢＬの
Ｔ細胞クローンであるＡＫ１１９から作製した。約１０
０，０００プラークの増幅ライブラリーを^３２Ｐ標識し
たニックトランスレートＣδプローブを使用してスクリ
ーニングし、Ｏ−０２４というδＴＣＲクローンから単
離した（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８）。最も長いハイブリダ
イズｃＤＮＡクローン（１．３ｋｂクローンＣ１１９δ
３）をジデオキシチェーンターミネーンョン法（ｄｉｄ
ｅｏｘｙ ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔ
ｈｏｄ）によって配列分析のために選択した。

【０１４７】１１．１．２．再編成されたδＴＣＲ遺伝
子のクローニング 再編成されたＶδ遺伝子含有３．５ｋｂのゲノムＤＮＡ
クローンを、下記のようにしてＡＫ１１９細胞から得
た。すなわち、ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを分取用アガロー
スゲル上でサイズ分画し、λｇｔ１０へライゲートし、
そしてパッケージングしてＥ．ｃｏｌｉへトランスフェ
クトした。組換えファージを、ｃＤＮＡクローンである
Ｃ１１９δ ３由来の^３２Ｐ標識したニックトランスレ
ート５５０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを用いてスク
リーニングした。ｒ１１９δ１と呼ぶ再編成クローンが
単離され、このクローンには０．８ｋｂのＨｉｎｃＩＩ
フラグメント（Ｖ領域特異的）と１ｋｂのＨｉｎｃＩＩ
−ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｖ−Ｊ領域）とが含有され
ていた。

【０１４８】１１．１．３．ＤＮＡの調製 胎児及び新生児の胸腺組織を、患者の権利及び認可に関
する許容されたガイドラインに従って集めた。限界希釈
により末梢血、胸膜滲出物又は脳脊髄液からＴ細胞クロ
ーンを得て、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した（Ｈａｆｌｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．
８：４５１，Ｖａｎ ｄｅ Ｇｒｉｅｎｄ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１６２
７）。すべての場合において、プロテイナーゼＫを含む
１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いて消化し、続いてフ
ェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈降を行な
ってＤＮＡを調製した。

【０１４９】１１．１．４．サザンブロット分析 ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、０．９％アガロー
スゲル上でサイズ分画し、ニトロセルロースに移した。
前記のように^３２Ｐニックトランスレートプローブを用
いてハイブリダイゼーションを行なつた（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ； Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ； Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ）。

【０１５０】１１．１．５．サイトフルオロメーター分
析 提供者から得られた正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
は、フィコールグラジエント上で分画することによって
単離した。ＰＢＭＣ及びＰＢＬのＴ細胞を、ＴＣＳ δ
１ｍＡｂ（すでにδＴＣＡＲ−３と命名した、第７節参
照のこと）及びフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ
（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて間接蛍
光染色し、そして蛍光活性化フローサイトメーターで分
析した。

【０１５１】１１．２結果 １１．２．１．δＴＣＲ遺伝子再編成の多様性 Ｃδプローブを用いて、Ｔ細胞クローンＡＫ１１９のλ
ｇｔ１０のｃＤＮＡライブラリーからｃ１１９δ３と称
する１．３ｋｂのδＴＣＲのｃＤＮＡクローンを単離し
た。ｃ１１９δ３の５’端を配列決定し、すでに同定し
たＶδとＪδ遺伝子とが使用されることを見い出された
（Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３８：６７８； Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９）。Ｖ−Ｊ結合部の
配列は、Ｃ１１９δ３がフレーム内のＶ−Ｊ結合を有す
ることを示した。

【０１５２】すべての可変領域と結合領域、及び一部の
定常領域をコードする５５０塩基対（ｂｐ）のＥｃｏＲ
Ｉフラグメント（Ｖ−Ｊ−Ｃプローブ）をＣ１１９δ３
から単離し、ＡＫ１１９からのＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤ
ＮＡサザンブロット分析に使用した。このプローブは、
胚細胞系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）の３．２ｋｂのＶδ及び
胚細胞系の１．０ｋｂのＣδバンドを検出した。ＡＫ１
１９は、特別な再編成がされた３．５ｋｂのバンドを示
し、これは共通のδＴＣＲの再編成と同一であった（Ｈ
ａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３８：６７８；Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３０：５６９）（図２２における再編成Ｉ
Ｉ）。この３．５ｋｂのバンドは、Ｖ−Ｊ−Ｃ ｃＤＮ
Ａプローブを用いてＥｃｏＲＩサイズ分画したλｇｔ１
０ゲノムライブラリーからクローニングした。ｒ１１９
δ１と称するクローニングされた再編成δＴＣＲ遺伝子
の部分地図を、図１７に示す。可変領域及び結合領域の
局在化を、Ｊオリゴヌクレオチドプローブ及び可変領域
特異的プローブとを用いて決定した。ｒ１１９δ１か
ら、１ｋｂのＶ−ＪプローブをＨｉｎｃＩＩ酵素及びＥ
ｃｏＲＩ酵素とを用いて消化して単離した（図１７）。

【０１５３】このＶ−Ｊプローブを用いて、１パネルの
１３個のヒトγδＴＣＲ陽性Ｔ細胞クローンと３個のヒ
トγ−δＴＣＲ陽性腫瘍細胞系におけるδＴＣＲ遺伝子
の再編成の多様性を決定した。図２２に示すように、Ｉ
−Ｖと番号付けした５つの共通の再編成がポリクローナ
ル新生児胸腺細胞サンプル中に見られた（レーン１
１）。これらの再編成はヒトγδＴ細胞クローンによっ
て使用された再編成の代表的なものである。再編成ＩＩ
だけがＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｃＩＩＶδ特異的プローブ
にハイブリダイズする。これらの再編成の全てがＤ−Ｊ
再編成よりもＶ−Ｄ−Ｊ再編成を表わすということは知
られていないが、これらうちの幾つかは、以前に特徴づ
けられたＪδ遺伝子セグメントに対する新しい可変領域
の再編成を示すに違いない。その理由は、これらの細胞
が細胞表面上に機能的なδＴＣＲポリペプチド鎖を発現
するためである。我々は、新たな再編成が、他のＪδ遺
伝子に対する単一の新たなＶδ遺伝子の再編成を表すと
いう可能性を除外していないが、まだ同定していない。
我々のデータは、δＴＣＲの遺伝子の再編成に使用し得
る２〜５個の可変領域遺伝子が存在するにちがいないと
いう事実と一致する。

【０１５４】１１．２．２．ｍＡｂ ＴＣＳ δ１の特
異性の決定 以前にδＴＣＡＲ−３と命名したＴＣＳδ１を、ヒト腫
瘍γδＴＣＲ細胞系ＭＯＬＴ−１３で免疫したマウスの
牌細胞とマウスのミエローマ系とを融合させて作製し
た。ケイ光活性細胞ソーター分析で使用する場合は、Ｔ
ＣＳ δ１はヒトγδＴ細胞のいくつかとのみ反応し、
全てのものとは反応しない。この結果を表１に示す。Ｔ
ＣＳ δ１によって陽性染色とＡＫ１１９のＶδ遺伝子
（再編成ＩＩ）の使用とは完全に相関性を有する。この
データから、δＴＣＳ １によって認識されたエピトー
プが、ＡＫ１１９のＶδ遺伝子中又は再編成されたＡＫ
１１９のＶδ−Ｊδ遺伝子の組み合せエピトープ中でコ
ードされているという強力な証拠を提供する。

【０１５５】

【表１】 １．図２２に示すように１−Ｖと番号付けしたＶ−Ｊプ
ローブによって検出したδＴＣＲの再編成。 ２．胚細胞系Ｊδは検出されないとしても、各場合にお
いて１つだけ再編成が同定された。 ３．新生児又は胎児胸腺細胞では見られない新たな再編
成が観察された。この再編成を再編成ＶＩとした。 ４．＋は陽性の染色を、−は陰性の染色を示し、ｎｄは
決定していないことを示す。

【０１５６】１２．ハイブリドーマの寄託 示唆されたモノクローナル抗体を産生する次のハイブリ
ドーマ細胞系を、記載の日にメリーランドロックビルの
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託し、ここに示す受託
番号を得た。 本発明は、寄託された実施態様が本発明の１つの特徴を
例証することを意図するものであり、機能的に均等ない
かなる細胞系も本発明の範囲内にあるので、寄託した細
胞系によって範囲が限定されることはない。事実、当業
者には、本明細書に示されかつ記載された種々の変形に
加えて各種の変更が、上述した記載及び添付図面から明
らかであろう。このような変更は、添付した請求の範囲
内に入るであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、抗ＴＣＲ δ１を使用したＴ細胞系
のサイトフルオログラフ分析（細胞蛍光間接撮影分析）
の結果を示す図である。

【図２】 図２は、ｍＡｂ抗ＴＣＲ δ１特異性の免疫
化学分析ず示す図である。

【図３】 図３は、δＴＣＲのＮ−グリカナーゼ消化の
結果を示す図である。

【図４】 図４は、ｐＧＥＭ３−０−２４０／３８の地
図である。

【図５】 図５は、ｍＡｂ抗ＴＣＲ δ１によるｃＤＮ
ＡクローンＩＤＰ２ ０−２４０／３８のｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ翻訳生成物の免疫沈降の結果を示す図である。

【図６】 図６は、Ｔ細胞抗原レセプターの免疫沈降及
びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。

【図７】 図７は、δＴＣＡＲ−３抗体によるδ鎖の免
疫沈降の結果を示す図である。

【図８】 図８は、フロサイトメトリーによる細胞表面
染色分析の結果を示す図である。

【図９】 図９は、δＴＣＡＲ−３^＋及びＯＫＴ３^＋末
梢血リンパ球の二色サイトフルオログラフ分析（細胞間
接撮影分析）の結果を示す図である。

【図１０】 図１０は、細胞質内Ｃａ^２＋濃度（［Ｃａ
^２＋］_ｉ）を経時的に測定した結果を表す図である。

【図１１】 図１１は、３型のγ，δＴＣＲの免疫沈降
の結果を示す図である。

【図１２】 図１２は、抗Ｃγｍ１抗体及び抗ＴＣＲδ
１抗体のそれぞれによるγＴＣＲ鎖及びδＴＣＲ鎖の免
疫沈降の結果を示す図である。

【図１３】 図１３は、ＰＥＥＲ及びＭＯＬＴ−１３細
胞からのγＴＣＲ及びδＴＣＲのペプチド骨格の大きさ
及びグリコシル化の測定の結果を示す図である。

【図１４】 図１４は、ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲの核
酸配列（２ｂｃ型）を示す図である。

【図１５】 図１５は、γ，δＴＣＲ １型の優先的使
用を示す図である。

【図１６】 図１６は、ヒトにおける三種のγ、δＴＣ
Ｒ型の模式図である。

【図１７】 図１７は、再配列されたδＴＣＲ遺伝子地
図である。

【図１８】 図１８Ａは、ＭＯＬＴ−１３細胞系へのト
ランスフェクンョンに使用したγＴＣＲ鎖を示す模式図
である。図１８Ｂは、発現プラスミド構築物ｐＦｎｅ
ｏ．ＰＢＬ及びｐＦｎｅｏ．Ｉ ＤＰ２γを示す。ＩＤ
Ｐ２γをγＴＣＲクローンをＭＯＬＴ−１３細胞系に導
入するために使用した。

【図１９】 図１９は、ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲトラ
ンスフェクタント上のγ，δＴＣＲの免疫沈降分析の結
果を示す図である。

【図２０】 図２０は、トランスフェクタントのγＴＣ
Ｒポリペプチドの二次元ゲル分析である。

【図２１】 図２１は、トランスフェクタントのγＴＣ
Ｒ鎖の骨格ポリペプチドの大きさの分析の結果を示す図
である。

【図２２】 図２２は、γδＴ細胞クローン及びポリク
ローナルヒトＴ細胞集団のサザンブロット分析の結果を
示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９８４３ (73)特許権者 592257310 プレジデント・アンド・フェロウズ・オ ブ・ハーバード・カレッジ アメリカ合衆国02138マサチューセッツ 州ケンブリッジ、クウィンシー・ストリ ート17 (72)発明者 ブレンナー，マイケル，ビー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01721 アッシュランド，♯73，オーク ストリート，99 (72)発明者 イブ，ステファン，エイチ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01710， フラミンハム ジョディー ロード 45 (72)発明者 サイドマン，ジョナサン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02186， ミルトン，キャントン アベ ニュー1350 (72)発明者 バンド、ハミド アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02215， ボストン，ブルックライン アベニュー ♯５−シー 400 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，322［6075］（1986) ｐ．145−149 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，83［８］（1986）ｐ．2619 −2623 金光修著「抗体工学入門」（1994年１ 月25日）地人書館 ｐ．88−89 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/28 C12N 5/10 G01N 33/53 G01N 33/577 C12N 15/02 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＴ細胞抗原レセプターデルタ鎖の可
   変領域又は再編成された可変−結合領域と反応性を有す
   る非ヒトモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ATCCに寄託され、受託番号HB9578が与え
   られたハイブリドーマによって産生されたモノクローナ
   ル抗体TCSδ1（δTCAR-3）からなる請求項１に記載のモ
   ノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 ヒトＴ細胞抗原レセプターデルタ鎖の定
   常領域と反応性を有する非ヒトモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 ATCCに寄託され、受託番号HB9772が与え
   られたハイブリドーマによって産生されるモノクローナ
   ル抗体抗TCRδ1からなる請求項３に記載のモノクローナ
   ル抗体。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載のモノク
   ローナル抗体のFv、Fab、Fab’又はF(ab’)₂フラグメン
   ト。
6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれかに記載のモノク
   ローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
7. 【請求項７】 細胞におけるヒトデルタＴ細胞抗原レセ
   プター可変遺伝子の機能的再編成の存在を検出する方法
   であって、細胞又は細胞のポリペプチド含有サンプル
   を、再編成された遺伝子によってコードされたポリペプ
   チドに特異的な反応性を有する請求項１に記載のモノク
   ローナル抗体と接触させることからなる方法。
8. 【請求項８】 モノクローナル抗体が、ATCCに寄託さ
   れ、受託番号HB9578が与えられたハイブリドーマによっ
   て産生されたTCSδ1（δTCAR-3）を含有する請求項７に
   記載の方法。
9. 【請求項９】 （ａ）生細胞表面上でγ，δＴ細胞抗原
   レセプター及びCD3抗原を発現する細胞と抗体とを、CD3
   抗原がコモジュレーションを生じるのに十分な時間接触
   させ、そして、 （ｂ）CD3抗原のコモジュレーションを検出する工程を
   含んでなる、請求項１〜４のいずれかに記載のモノクロ
   ーナル抗体の同定方法。
10. 【請求項１０】 コモジュレーションの検出が、 （ａ）細胞とCD3抗原に対する標識抗体とを、標識抗体
    がCD3抗原に結合するのに十分な時間接触させ、そして （ｂ）結合した標識抗体の量を測定することからなる、
    請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 CD3抗原をコモジュレーションさせる
    能力を有することを特徴とする請求項１〜４に記載のモ
    ノクローナル抗体。