DE3853718T2

DE3853718T2 - Menschliche gamma, delta-t-zellen-antigen-rezeptor-polypeptide und nukleinsäuren.

Info

Publication number: DE3853718T2
Application number: DE3853718T
Authority: DE
Inventors: Hamid Band; Michael Brenner; Stephen Ip; Jonathan Seidman
Original assignee: Harvard College; Dana Farber Cancer Institute Inc; T Cell Sciences Inc
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1987-10-29
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 1995-09-07
Anticipated expiration: 2008-10-29
Also published as: WO1989003996A1; JP3176049B2; JPH1169975A; ATE122148T1; EP0345318A4; KR890702031A; AU2712288A; AU631780B2; JP3176338B2; EP0345318A1; US5260223A; EP0345318B1; DE3853718D1; HK1005893A1; KR0132680B1; CA1340140C; JPH03503956A

Description

1. EINLEITUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine mit Form 2bc bezeichnete Form des humanen γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids mit einer relativen Molekülmasse von etwa 40 000 Dalton und einer konstanten Region, die eine Sequenz enthält, welche durch lediglich zwei Cγ2-CII-Exonkopien kodiert wird. Die Erfindung betrifft ferner T-Zell-Antigen-Rezeptor-Heterodimere, die γ-Form 2bc umfassen, und Nukleinsäuresequenzen, die für γ-Form 2bc und Teile davon kodieren. Mit der Erfindung werden ferner monoklonale Antikörper bereitgestellt, die in spezifischer Weise gegenüber einem Epitop der γ- oder δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptide reaktiv sind.

2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es wurde gezeigt, daß der T-Zell-Antigen-Rezeptor (TCR) ein Klon-spezifisches, über Disulfidbrücken verknüpftes Heterodimer auf T-Zellen ist und aus zwei glykosylierten Untereinheiten besteht, von denen eine mit α-Kette und die andere mit β-Kette bezeichnet wird. Die α- und β-TCR-Untereinheiten besitzen eine relative Molekülmasse (Mr) von ungefähr 50 000 bzw. 40 000 Dalton (Allison et al., 1982, Immunol. 129:2293-2300; Meuer et al., 1983, J. Exp. Med. 157:705-719; Haskins et al., 1983, J. Exp. Med. 157:1149-1169). Gene, die während der Ontogenie der T-Zelle rearrangiert werden und für die β-TCR- (Yanagi et al., 1984, Nature 308:145-149; Hedrick et al., 1984, Nature 308:153-158) und α-TCR- (Chien et al., 1984, Nature 312:31-35; Saito et al., 1984, Nature 312:36-40; Sim et al., 1984, Nature 312:771-775) Untereinheiten kodieren, wurden entweder durch subtraktive Hybridisierung oder durch Sondierung mit Oligonukleotiden isoliert.
Die α- und β-Ketten des T-Zell-Antigen-Rezeptors eines T-Zell- Klons sind jeweils zusammengesetzt aus einer einmaligen Kombination von Domänen mit der Bezeichnung variabel (V), Verschiedenheit (diversity) (D), verknüpfend (joining) (J), und konstant (C) (Siu et al., 1984, Cell 37:393; Yanagi et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3430). Hypervariable Regionen sind identifiziert worden (Patten et al., 1984, Nature 312:40; Becker et al., 1985, Nature 317:430). Bei jedem T-Zell-Klon ist die Kombination von V-, D-, und J-Domänen sowohl bei der α- als auch bei der β-Kette an der Antigenerkennung in einer Weise beteiligt, welche für diesen T-Zell-Klon in einmaliger Weise charakteristisch ist und eine einmalige Bindungsstelle definiert, welche auch als Idiotyp des T-Zell-Klons bezeichnet wird. Demgegenüber ist die C-Domäne nicht an der Antigenbindung beteiligt.
Eine einmalige Eigenschaft des menschlichen α,β-TCR war die beobachtete Comodulation (Meuer et al., 1983, J. Exp. Med. 157:705-719), die Communpräzipitation (Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. Wo 88/00209, veröffentlicht am 14. Januar 1988; Oettgen, et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:12039-12048) und die erforderliche Coexpression (Weiss et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1284-1299) der α,β-TCR-Moleküle mit einem CD3-Glykoproteinkomplex. Nachfolgend wurde die direkte physikalische Assoziation der beiden Proteinkomplexe nachgewiesen, indem die α,β-TCR-Moleküle mit dem T3-Glykoprotein chemisch vernetzt und die Komponenten des vernetzten Komplexes als TCR-Untereinheit und als T3-Glykoprotein (Mr 28 000)-Untereinheit (Brenner et al., 1985, Cell 40:183-190) identifiziert wurden. Ein T3-Gegenstück ist in ähnlicher Weise mit dem murinen α,β-TCR assoziiert (Allison et al., 1985, Nature 314:107-109; Samelson et al., 1984, Immunol. Rev. 81:131-144).
Ein drittes Gen, welches in T-Zellen rearrangiert wird und mit γ-TCR bezeichnet worden ist, wurde zunächst bei Mäusen (Saito et al., 1984, Nature 309:757-762; Kranz et al., 1985, Nature 313:762-755; Hayday et al., 1985, Cell 40:259-269) und anschließend bei Menschen identifiziert (Lefranc et al., 1985, Nature 316:464-466; Murre et al., 1985, Nature 316:549-552). Der menschliche γ-TCR-Locus scheint aus Genen für 5 bis 10 variable, 5 verknüpfende und zwei konstante Regionen zu bestehen (Dialynas et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:2619). Obgleich die Gesamtzahl funktioneller variabler und verknüpfender Regionen beschränkt ist, wird bei der Verknüpfung von V-J ein hohes Maß an Verschiedenheit erreicht (Kranz et al., 1985, Nature 313:752-755; Lefranc et al., 1986, Cell 45:237-246; Quertermaus et al., 1986, Nature 322:184). Die γ-TCR-Gen-Rearrangements kommen in Lymphozyten mit Suppressor-zytotoxischem als auch mit Helfer-Phänotyp vor (Lefranc et al., 1985, Nature 316:464-466; Murre et al., 1985, Nature 316:549-552; Quertermaus et al., 1986, Science 231:252-255; Lefranc et al., 1986, Cell 45:237- 246; Iwamoto et al., 1986, J. Exp. Med. 163:1203-1212; Zauderer et al., 1986, J. Exp. Med. 163:1314-1318).
Die Produkte des γ-TCR-Gens sind in T3-Coimmunpräzipitaten von α,β-TCR&supmin;CD&spplus; T identifiziert worden (Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149; Bank et al., 1986, Nature 322:179-181; Borst et al., 1987, Nature 325, 683-688; Moingeon et al., 1987, Nature 325, 723-726, Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/00209, veröffentlicht am 14. Januar 1988). Die γ-TCR-Polypeptide wurden durch Verwendung von monoklonalen Antikörpern identifiziert, die gegen γ-TCR-Peptidsequenzen gerichtet sind; es wurde gefunden, daß diese Polypeptide zusammen mit einem anderen Polypeptid mit der Bezeichnung δ-TCR in Heterodimere eingeschlossen werden (Brenner et al., 1986, Nature 322:145- 149). Das γ,δ-Heterodimer ist Berichten zufolge mit CD3 nicht- kovalent assoziiert.
Die Verwendung von Antiseren gegen γ-TCR-spezifische Peptide hat zur Identifizierung von CD3-assoziierten γ-TCR-Polypeptiden auf Zellen geführt, die aus peripherem Blut, Thymus, und einer leukämischen Zellinie stammen (Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149; Bank et al., 1986, Nature 322:179-181; Weiss et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:6998-7002; Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694; Lew et al., 1986, Science 234:1401-1405). Bank et al. (a.a.O.) beschrieben eine γ-Form von 44 kD, die mit einem Peptid von 62 000 kD und T3 auf der Oberfläche eines menschlichen Thymozytenklons assoziiert war. Ein ähnliches γ-TCR-Polypeptid wurde ebenfalls auf murinen T-Lymphozyten identifiziert, und die Expression dieses Peptids während der Differenzierung der Thymozyten ist Gegenstand derzeit umfangreich durchgeführter Untersuchungen (Roulet et al., 1985, Nature 314:103-107; Snodgrass et al., 1985, Nature 315:232-233; Let et al., 1986, Science 234:1401-1408; Pardau et al., 1987, Nature 326:79-81; Bluestone et al., 1987, Nature 326:82-84).
Im Rahmen der Untersuchung von menschlichen γ-TCR&spplus;-Zellinien sind zwei verschiedene γ-TCR-Polypeptide identifiziert worden, die in ihrer relativen Molekülmasse und in ihrer Fähigkeit voneinander abweichen, Disulfidbrücken auszubilden (Borst et al., 1987, Nature 325:683-688; Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694; Moingeon et al., 1987, Nature 325:723-726; Lanier et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1076). Zwei verschiedene γ-TCR-Gensegmente für die konstante Region mit der Bezeichnung Cγ1 bzw. Cγ2 sind verglichen worden; ein durch das zweite Exon von Cγ1 kodierter Cysteinrest scheint in Cγ2-Exon-Segmenten zu fehlen, und es ist vorgeschlagen worden, die Unfähigkeit einiger γ-TCR-Peptide zur Bildung von Disulfidbrücken mit diesem Fehlen zu erklären (Krangel et al., 1987, Science, 237:1051-1055; Littman et al., Nature 326:85088).
Im Gegensatz zu den multiplen Formen von γ-TCR ist das δ-TCR- Molekül relativ gleichbleibend, und es scheint, als gäbe es lediglich eine konstante δ-TCR-Region (Hata et al., 1987, Science 238:678-682).
Während der Ontogenie der T-Zelle ist gezeigt worden, daß einem β- und α-TCR-Gen-Rearrangeinent ein γ-TCR-Gen-Rearrangement vorausgeht (Roulet et al., 1985, Nature 314:103-197; Snodgrass et al., 1985, Nature 315:232-233; Sangoter et al., 1986, J. Exp. Med. 163:1491-1508).
Unter reifen zirkulierenden T-Lymphozyten ist ein relativ kleiner Teil γ,δ-TCR&spplus; und weist entweder CD3&spplus;4&supmin;8&supmin;-(doppelt negativ) oder CD3&spplus;4&supmin;8&spplus;-Oberflächenantigene auf. Ungefähr 2 % der reifen CD3&spplus;-T-Zellen entfallen auf CD3&spplus;4&supmin;8&supmin;-T-Zellen. Ungleich den meisten reifen CD3&spplus;4&spplus;- oder CD3&spplus;8&spplus;-Haupthistokompatibilitäts-Locus (MHC)-restringierten zytoxischen T-Zellen, aber ähnlich den CD3&supmin;- Natural-Killer-Zellen, ist bei γ,δ-TCR&spplus; CD3&spplus;4&supmin;8&supmin;-klonierten Lymphozyten gezeigt worden, daß sie MHC-nicht-restringierte zytolytische Aktivität aufweisen; diese γ,δ&spplus; CD3&spplus;4&supmin;8&supmin;-T-Zellen haben jedoch im Gegensatz zu Natural-Killer-Zellen nicht einheitlich zu einer Abtötung der Zielsubstanzen der Natural-Killer-Zellen wie K-562 geführt (Borst et al., 1987, 325:683-688; Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694; Moingeon et al., 1987, Nature 325:723-726; Bluestone et al., 1987, Nature 326:82-84).

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Form des humanen γ-T- Zell-Antigen-Rezeptor (TCR)-Polypeptids mit der Bezeichnung Form 2bc. Die Form 2bc-γ-TCR-Kette besitzt eine primäre Aminosäuresequenz im wesentlichen gemäß Darstellung in Figur 14. Die Form 2bc-γ-TCR-Kette weist eine relative Molekülmasse von etwa 40 000 Dalton auf und umfaßt eine konstante Region, die eine Sequenz enthält, welche durch lediglich zwei Cγ2-CII-Exonkopien kodiert wird. Die Erfindung betrifft ferner TCR-Heterodimere, die das γ- TCR-Polypeptid Form 2bc umfassen.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein gereinigtes Polypeptid bereitgestellt, welches eine Aminosäuresequenz einer konstanten Region eines γ-T-Zell-Antigen-Rezeptors Form 2bc umfaßt, die durch die Nukleotide 439 bis 1008 der Figur 14 kodiert wird. Das gereinigte Polypeptid weist insbesondere eine relative Molekülmasse von etwa 40 000 Dalton und eine Sequenz auf, die eine konstante Region, welche im wesentlichen aus der durch die Nukleotide 439 bis 1088 der Figur 14 kodierten Aminosäuresequenz besteht, und eine variable Region umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein gereinigtes Polypeptid bereit, das einen γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor Form 2bc umfaßt mit einer primären Aminosäuresequenz im wesentlichen gemäß Darlegung in Figur 14 für die variable, N-, verknüpfende (joining) und konstante Region.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Nukleinsäuresequenzen bereit, die für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren.
Durch die vorliegende Erfindung werden ferner ein monoklonaler Antikörper, der gegenüber einem Epitop einer variablen oder rearrangierten variablen-verknüpfenden Region einer δ-Kette des menschlichen T-Zell-Antigen-Rezeptors reaktiv ist, ein monoklonaler Antikörper, der gegenüber einem Epitop der konstanten Region der δ-Kette des menschlichen T-Zell-Antigen-Rezeptors reaktiv ist, und ein monoklonaler Antikörper bereitgestellt, der gegenüber einem Epitop der konstanten Region der Form 2bc-γ- Kette des menschlichen T-Zell-Antigen-Rezeptors reaktiv ist, wobei das Epitop für die Form 2bc-γ-Kette charakteristisch ist.
Die Erfindung betrifft ferner monoklonaler Antikörper, die in spezifischer Weise reaktiv gegenüber einem Epitop der γ- oder δ- TCR-Polypeptide sind. Derartige Antikörper können identifiziert werden durch Nachweis ihrer Fähigkeit, das CD3-Antigen auf einer Zelle zu comodulieren, die sowohl den γ,δ-TCR als auch ein CD3- Antigen exprimiert. Nach einer spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung einen monoklonaler Antikörper bereit, der gegenüber einem Epitop einer variablen oder rearrangierten variablen-verknüpfenden Region der δ-TCR-Kette reaktiv ist. Nach einer besonderen Ausführungsform kann ein derartiger Antikörper verwendet werden, um funktionale Rearrangements des variablen Gens von δ-TCR in einer Zelle nachzuweisen. Nach einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen monoklonalen Antikörper bereit, der gegenüber einem Epitop der konstanten Region des δ-TCR-Polypeptids reaktiv ist. In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung einen monoklonalen Antikörper, der gegenüber einem Epitop der konstanten Region der Form 2bc-γ-Kette des menschlichen T-Zell-Antigen-Rezeptors reaktiv ist, wobei das Epitop für die Form 2bc-γ-Kette charakteristisch ist.
Durch die vorliegende Erfindung wird ferner ein gereinigter Polypeptidkomplex bereitgestellt, welcher ein T-Zell-Antigen- Rezeptor-Heterodimer umfaßt, das aus dem γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid gemäß Anspruch 17 und einem zweiten T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den α-, β-, γ-, und δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptiden, besteht.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Herstellung eines γ,δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Heterodimers, umfassend das Kultivieren einer Zelle, die (a) in der Lage ist, eine Nukleinsäure zu exprimieren, welche für ein δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid kodiert, und die (b) mit einer Nukleinsäure transfiziert worden ist, welche für ein γ-T-Zell-Antigen- Rezeptor-Polypeptid kodiert, unter solchen Bedingungen, daß sowohl das γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid als auch das δ- T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid von der Zelle exprimiert werden und sich zur Bildung eines Heterodimers zusammenfügen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Herstellung mindestens eines Teils eines γ,δ-T-Zell-Antigen- Rezeptor-Heterodimers, umfassend das Kultivieren einer transfizierten Zelle, die (a) in der Lage ist, eine Nukleinsäure zu exprimieren, welche für mindestens eine Region eines γ-T-Zell- Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten Region, einer variablen Region, und einer verknüpfenden Region, kodiert; und die (b) in der Lage ist, eine Nukleinsäure zu exprimieren, welche für mindestens eine Region eines δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten Region, einer variablen Region, einer verknüpfenden Region und einer Verschiedenheits-Region, kodiert; und das Zuführen der Zelle unter solche Bedingungen, daß beide Nukleinsäuresequenzen von der Zelle exprimiert werden.
Die Zeile kann mit der Nukleinsäure transformiert werden, welche für mindestens eine Region des γ-TCRs kodiert.
Durch die vorliegende Erfindung werden ferner Zellen bereitgestellt, die mindestens einen Bereich des γ,δ-TCRs exprimieren.
Zusätzlich wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereitgestellt zur Bestimmung der relativen Verwendung eines γ- T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids in einer Probe aus einem menschlichen Individuum, bei dem man:
(a) in einer Probe, die T-Zellen von einem Individuum enthält, die Menge eines γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids der Form 2bc bestimmt;
(b) in einer Probe eines Individuums die Menge eines γ-T- Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem γ-Polypeptid der Form 1 und einem γ-Polypeptid der Form 2abc, bestimmt; und
(c) die in Stufe (a) ermittelte Menge mit der in Stufe (b) ermittelten Menge vergleicht und dadurch die relative Verwendung bestimmt.

3.1. DEFINITIONEN

Die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung nachfolgend aufgeführten Begriffe haben die dort angegebene Bedeutung:
TCR = T-Zell-Antigen-Rezeptor
V = variabel
D = Verschiedenheit (diversity)
J = verknüpfend (joining)
C = konstant
mAb = monoklonaler Antikörper

4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1. Cytofluorographische Analyse von T-Zell-Linien mit Anti-TCRδ1.
Figur 2. Immunchemische Analyse der Spezifität des mAb Anti-TCRδ1. Mit ¹²&sup5;I Oberflächen-markierte IDP2-Zellen wurden immunpräzipitiert unter Verwendung von Kontroll-mAb P3 (Spuren 1 und 2), Anti-Leu 4 (Spuren 3-5), Anti-TCRδ1 (Spuren 6-8), oder Anti- Cγ-Serum (Spur 9), und wurden anschließend mittels SCD-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) auf getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. N = nicht-reduzierende Bedingungen; R = reduzierende Bedingungen.
Figur 3. Spaltung von S-TCR mit N-Glykanase.
Figur 4. Kartierung von pGEM3-0-240/38.
Figur 5. Immunpräzipitation von in vitro-Translationsprodukten des cDNA-Klons IDP2 0-240/38 mittels mAb Anti-TCRδ1.
Figur 6. Immunpräzipitation und Analyse des T-Zell-Antigen-Rezeptors durch SDS-PAGE. Die weißen Pfeile zeigen die Position der δ-Ketten. Die schwarzen Pfeile zeigen die Position der γ- Ketten. Die Lysate wurden immunpräzipitiert unter Verwendung von δTCAR-3-Antikörper (mit ungeraden Zahlen bezifferte Spuren) oder βF1-Antikörper (mit geraden Zahlen bezifferte Spuren).
Figur 7. Immunpräzipitation der δ-Kette mittels δTCAR-3-Antikörper. Molt-13-Zellen, gelöst in Tris-gepufferter Saline (pH- Wert 8,0), enthaltend 0,3 % CHAPS (Spur 1), oder in 1 % Triton X-100 (Spuren 2-7). Spur 1, δTCAR-3 immunpräzipitiert das γ,δ- TCR-Heterodimer mit den CD3-Proteinen. Spur 2, δTCAR-3 immunpräzipitiert das γ,δ-TCR-Heterodimer ohne CD3-Proteine. Spuren 3 und 4, δTCAR-3 immunpräzipitiert einzelne δ-Kette von denaturierten Lysaten (N)- bzw. reduzierenden (R)-Bedingungen. Spur 5, UCHT-1 immunpräzipitiert die CD3-Proteine. Spur 6, βF1-Antikörper führt zu keiner Immunpräzipitation eines Heterodimers von MOLT-13-Zellen. Spur 7, Anti-Cγ-Antiserum immunpräzipitiert eine einzelne γ-Kette.
Figur 8. Analyse der Färbung der Zeiloberfläche mittels Durchflußcytometrie. γ,δ-TCR-positive Zellen (MOLT-13, PEER, IDP2) und α,β-TCR-positive Zellen (HPB-ALL, Jurkat) wurden inkubiert mit δTCAR-3-, OKT3-, WT31- und normalen Mäuseserum (NMS)-Antikörpern und mittels Durchflußcytometrie analysiert. Die B-Zell- Linie Daudi war die negative Kontrolle.
Figur 9. Zwei farbige farbcytofluorographische Analyse von δTCAR- 3&spplus;- und OKT3&spplus;-Lymphozyten des peripheren Blutes. Die Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Fluoreszenz ist auf der Y-Achse aufgetragen, und die Phycoerythrin (PE)-Fluoreszenz ist auf der X-Achse angegeben. Die CD3&spplus; γ,δ-TCR+-Zellen in dieser Probe repräsentieren 2,4 % der CD3&spplus;-Lymphozyten.
Figur 10. Messung der intrazytoplasmatischen Ca2&spplus;-Konzentration ([Ca²&spplus;]i) im Zeitverlauf. Obere Darstellung: δTCAR-3. Untere Darstellung: Anti-Leu-Antikörper. Die Pfeile kennzeichnen den Zeitpunkt der Zugabe des Antikörpers.
Figur 11. Immunpräzipitation der drei Formen von γ,δ-TCR. Für A- E waren die zur Immunpräzipitation verwendeten Antikörper Anti-Leu 4 (Anti-CD3), βF1 (Anti-TCRβ), Anti-δ1TCR (Anti-δTCR), Anti- Cγb-Serum (Anti-γTCR) und P3 (unmarkierte Spuren, Kontrolle). Die Immunpräzipitationen von mit ¹²&sup5;I markierten Zellysaten wurden mittels SDS-PAGE (10 % Polyacrylamid) unter reduzierenden (R) oder nicht-reduzierenden (N)-Bedingungen analysiert. Ein weißer Pfeil ( ) gibt die Position von δ-TCR unter reduzierenden Bedingungen an, wohingegen der schwarze Pfeil ( ) die Position von δ-TCR unter nicht-reduzierenden Bedingungen angibt. Die Größenmarker, Mr in Tausend, sind auf der linken Seite dargestellt.
A) Nicht über Disulfidbrücken verknüpfter γ-TCR (40 kD) auf PBL-L2. In den Spuren 1-6 wurden die radioaktiv markierten Zellen in 0,3 % CHAPS-Detergens, welches die TCR-CD3-Assoziation konserviert, gelöst, wohingegen die 5Immunpräzipitationen in Spuren 7 und 8 nach Trennung der Ketten durchgeführt wurden (vgl. Methoden).
B) Nicht über Disulfidbrücken verknüpfter γ-TCR (55 kD) auf IDP2-Zellen. In den Spuren 1-4 wurden radioaktiv markierte Zellen in 0,3 % CHAPS-Detergens gelöst, wohingegen die Immunpräzipitationen in Spuren 5 und 6 nach Trennung der Ketten durchgeführt wurden.
C) Über Disulfidbrücken verknüpfter γ-TCR (40 kD) auf WM- 14-Zellen. Sämtliche Spuren korrespondieren mit Immunpräzipitationen von in 1 % Digitonin gelösten, radioaktiv markierten Zellen.
D) Nicht über Disulfidbrücken verknüpfter γ-TCR (40 kD) auf Zellen des thymischen Klons II. Radioaktiv markierte Zellen wurden in 1 % Digitonin (Spuren 1-4) oder in 0,1 % Triton X-100 (Spuren 5 und 6) gelöst, wohingegen die Immunpräzipitationen in Spuren 7 und 8 nach Trennung der Ketten erfolgten.
E) Nicht über Disulfidbrücken verknüpfter δ-TCR (40 kD) auf MOLT-13 leukämischen T-Zellen. Die Immunpräzipitationen in Spuren 1-4 erfolgten nach Lösung der Zellen in 0,3 % CHAPS-Detergens, wohingegen die Immunpräzipitationen in Spuren 5 und 6 nach Kettentrennung erfolgten.
Figur 12. Immunpräzipitation der γ-TCR- und δ-TCR-Kette durch Anti-Cγm1-Antikörper bzw. Anti-TCRδ1-Antikörper. Die radioaktiv Oberflächen-markierten MOLT-13-Zellen wurden in 0,3 % CHAPS- Detergens gelöst, und der γ,δ-TCR-CD3-Komplex wurde mit monoklonalem Anti-CD3-Antikörper isoliert. Die Immunpräzipitate wurden durch 10 % SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert.
Spur 1: Immunpräzipitation mit Anti-Leu4 (Anti-CD3)-mAb
Spur 3: Immunpräzipitation mit Anti-Cγm1 (Anti-TCRγ)-mAb nach Trennung der Ketten von isolierten γ,δ-TCR- CD3-Komplexen.
Spur 4: Immunpräzipitation mit Anti-TCRδ1 (Anti-TCRS)-mAb nach Trennung der Ketten von isolierten γ,δ-TCR- CD3-Komplexen.
Figur 13: Bestimmung der Größen des Peptidgerüstes und der Glykosylierung von γ- und β-TCRs von PEER- und MOLT-13-Zellen. Die zur Immunpräzipitation eingesetzten monoklonalen Antikörper waren Anti-Cγm1 (Anti-TCRγ), Anti-TCRδ1 (Anti-TCRδ) und P3 (markierten Kontrolle), wie oben an jeder Spur angegeben ist. Die eingesetzten markierten Zellinien sind unten auf jeder 10 % SDS- PAGE-Autoradiographie oder -Fluorographie dargestellt. Sämtliche Proben wurden unter reduzierenden Bedingungen aufgelöst. Größenmarker, Mr in Tausend.
A) Größen der Peptidgerüste von γ-TCR von PEER- und MOLT- 13-Zellen. Die Zellen wurde 15 Minuten lang biosynthetisch markiert mit ³&sup5;S-Cystein und ³&sup5;S-Methionin. Die Proben wurden entweder mit Endo H (+) oder "Mock" (-) - behandelt. Die Immunpräzipitation mit Anti-Cγm1 zeigt die Positionen von unreifem γ-TCR von PEER-Zellen (Spur 3) und von MOLT-13-Zellen (Spur 7), während die korrespondierenden Größen der Polypeptidgerüste nach Behandlung mit Endo H sichtbar gemacht wurden (Spuren 4 und 8)
B) Glykosylierung von S-TCR von MOLT-13-Zellen. ¹²&sup5;I-markierte Zellen wurden mit Anti-CD3-mAb immunpräzipitiert, und die δ-TCR-Polypeptide wurden vor der Inkubation mit N-Glykanase (Spur 4), Endo H (Spur 2), oder Mock-Behandlung (Spuren 1 und 3) auf einem Gel gereinigt (vgl. Methoden).
Figur 14: Nukleotidsequenz von MOLT-13 γ-TCR (Form 2bc). Teil A: Sequenzierungsstrategie für den Klon M13k. Eine partielle Restriktionskarte des 1,1 Kb groben cDNA-Klons M13k ist dargestellt. Teil B: Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des Klons M13k. Die Gensegmente für die Signalsequenz (S), sowie für die variable (V), N-Region (N), verknüpfende (J) und konstante (CI, CIIb, CIIc und CIII) Region sind durch Pfeile gekennzeichnet und wurden identifiziert durch Vergleich mit genomischen Sequenzen, beschrieben von Lefranc et al., (1980, Cell 45:237-246) (für S und V), Lefranc et al., (1986, Nature 319:420-422) und Quertermous et al., (1987, Immunol. 138:2687- 2690) (für J) und Lefranc et al., (1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9596-9600) und Pellicci et al., (1987, Science 237:1051-1055) (für C). Die abgeleitete Aminosäuresequenz, die am Initiator Methionin beginnt, ist unter der Nukleotidsequenz dargestellt. Extrazelluläre Cysteine sind durch Kästchen hervorgehoben, und potentielle N-verknüpfte Kohlenhydratanheftungsstellen (N-X-S oder N-X-T; Marshall, 1977, Ann. Rev. Biochem. 41:673-702) sind in Klammern angegeben.
Figur 15: Bevorzugte Verwendung von γ,δ-TCR Form 1. Frisch isolierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes von drei gesunden Spendern wurden mit ¹²&sup5;I markiert und in 1 % Triton X-100 gelöst. Immunpräzipitate mit P3 (Kontrolle, Spuren 1 und 3) und Anti-TCRδ1 (Anti-TCRδ, Spuren 2 und 4) wurden unter nicht-reduzierenden (N) und reduzierenden (R) Bedingungen analysiert. Mr- Marker in Tausend sind auf der linken Seite dargestellt.
Figur 16: Schematische Darstellung der drei γ,δ-TCR-Formen beim Menschen. Die vom CII-Exon kodierten Konnektorpeptide sind durch ausgefüllte Bereiche hervorgehoben ( als Cγ1-CII-Exon kodiertes Peptid; die Kennzeichnungen , , , stehen für Peptide, die durch Cγ2-CII-Exonkopie a , Kopie b bzw. Kopie c kodiert werden). Potentielle N-verknüpfte Glykananheftungsstellen (o) und Sulfhydrylgruppen (-SH) sowie putative Disulfidbrücken (-S-S-) sind angegeben.
Figur 17: Karte des rearrangierten 6-TCR-Gens. Eine Karte von r119δ1 einschließlich EcoRI- (RI), Hinc II-(Hc), ScaI-(S) und Puv II-(P) Stellen und in der Southern-Blot-Analyse verwendete Sonden sind dargestellt.
Figur 18A. Schematische Darstellung der γ-TCR-Ketten, die zur Transfektion der Zellinie MOLT-13 verwendet wurden. Das Schema basiert auf veröffentlichten Analysen (M.B. Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149; M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694; M.S. Krangel et al., 1987, Science 237:64-67). Vor., vorhergesagt; beob., beobachtet. Die vorhergesagte Größe des glykosylierten Polypeptids geht davon aus, daß sämtliche zur Verfügung stehenden N-verknüpften Glykosylierungsstellen (dargestellt als Lollis), von denen jede über drei kD angehefteten Kohlenhydrats verfügt, verwendet werden, und daß durch andere post-translationale Modifizierungen keine signifikanten Größenunterschiede eingeführt werden. Die für Ig-ähnliche Moleküle typischen Disulfidbindungen innerhalb einer Kette sind dargestellt. Es wird darauf hingewiesen, daß durch das CII-Exon im PBL C1 γ-TCR ein Cysteinrest (Cys) kodiert wird, wobei ein Cystein jedoch in keiner der bei den anderen beiden γ-TCR-Ketten verwendeten Kopien des CII-Exons vorhanden ist. Die konstante Region von γ-TCR in der leukämischen γ,δ-T-Zell-Linie PEER (D.R. Littman et al., 1987, Nature 326:85-88), die ebenfalls ein 55 kD großes γ-TCR-Protein exprimiert (M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694; A. Weiss et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6998-7002) ist identisch mit derjenigen von IDP2.
Figur 18B. Die Expressionsplasmidkonstrukte pFneo.PBL C1γ und pFneo.IDP2γ wurden verwendet, um γ-TCR-Klone in die Zellinie Molt-13 einzuführen. Der PBL C1 γ-TCR cDNA-Klon (PBL C1.15) und der reparierte IDP2 γ-TCR cDNA-Klon (IDP2.11r) (M.S. Krangel et al., 1987, Science 237:64-67) wurden von ihrem Mutterplasmidvektor (pUC 18) durch Verdau mit EcoRI abgespalten, die Enden wurden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I glatt gemacht, und die cDNAs wurden anschließend mit einem mit SalI geschnittenen und mit Klenow behandelten Säugerexpressionsvektor des Typs pFneo ligiert. Klone, die die cDNA-Insertionen im Hinblick auf den LTR des Spleen Focus Forming Virus (SFFV) in richtiger Orientierung enthielten, wurden auf der Grundlage einer Restriktionskartierung ausgewählt. pFneo (T.Saito et al., 1987, Nature 325:125-130) ist ein Derivat von pTβFneo (P. Ohashi et al., 1985, Nature 316:606-609), erhalten durch Verdau mit BamHI zur Entfernung des murinen βTCR cDNA-Inserts, gefolgt durch Ligation mit T4 DNA-Ligase. Gemäß Darstellung enthält dieser Vektor ein bakterielles Neomycin-Resistenzgen (neor) unter der Kontrolle des SV40-Promotors, wodurch den Säugerempfängerzellen Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418 verliehen wird. Die Restriktionsstellen innerhalb der Klammern wurden während der Herstellung zerstört.
Figur 19. Immunpräzipitationsanalyse von γ,δ-TCR auf Molt-13 γ- TCR-Transfektanten. Mit ¹²&sup5;I Oberflächen-markierte Zellen wurden in 0,3 % CHAPS-Detergens gelöst, um die Kettenassoziation zu konservieren, mit mAb P3 (Kontrolle), Anti-Leu-4 (Anti-CD3), Anti-TCRδ1 (Anti-δTCR) oder Anti-Ti-γA (Anti-Vγ2) immunpräzipitiert und anschließend mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden (N), oder reduzierenden (R) Bedingungen auf getrennt und gemäß vorheriger Beschreibung autoradiographisch sichtbar gemacht (M.B. Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149; M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694). Anti-Ti-γA-mAb zeigt ein Reaktivitätsmuster gegenüber verschiedenen T-Zell-Klonen, das mit seiner Erkennung des Vγ2-Segments übereinstimmt. M13.PBL C1γ: MOLT-13-Zellen, transfiziert mit der PBL C1-abgeleiteten γ- TCR-cDNA; der Klon Nr. 7 wurde für diese Analyse verwendet. M13- IDP2γ: MOLT-13-Zellen, transfiziert mit der IDP2-abgeleiteten γ- TCR-cDNA; der Klon Nr. 10 wurde für diese Analyse verwendet. Die Größenmarker Mr (relative Molekülmasse) sind in Tausend Dalton dargestellt. Der weiße Pfeil kennzeichnet die γ-TCR-Kette von MOLT-13; der schwarze Pfeil kennzeichnet die transfizierte (PBL C1- oder IDP2-abgeleitete) γ-TCR-cDNA; das Sternchen kennzeichnet die δ-TCR-Kette von MOLT-13 unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Bei der Reduktion durchläuft die δ-TCR-Kette eine Veränderung ihrer Mobilität und comigriert mit der γ-TCR-Kette von 40 kD. Wenn das γ-TCR-Protein von 40 kD nicht coimmunpräzipitiert wird, ist die δ-TCR-Kette unter reduzierenden Bedingungen jedoch als eine Bande von 40 kD einzeln sichtbar, wie bei Anti- Vγ2-Immunpräzipitaten von M13.IDP2γ zu sehen ist (Fig. 19, Spur 8).
Figur 20. Zweidimensionale Gelanalyse von γ-TCR-Polypeptiden von Transfektanten. 2x10&sup7; Zellen wurden mit ¹²&sup5;I Oberflächen-markiert, mit Neuraminidase behandelt (150 Einheiten in 1,5 ml PBS mit je 1 mg/ml Glukose und bovinem Serumalbumin für 1,5 Stunden bei 23 ºC), in 0,3 % CHAPS-Detergens gelöst, mit 1 ug Anti-Leu-4 mAb immunpräzipitiert und einer 2D-Gelanalyse unter reduzierenden Bedingungen zugeführt. Es folgte eine Ungleichgewichts-pH-Gradienten-Gelelektrophorese (NEPHGE) unter Anwendung von pH 3,5 bis 10 Ampholines (LKB, Schweden), gefolgt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 10,5 %-igen Acrylamidgel (M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694). Die Positionen der CD3-Komponenten (nicht dargestellt) wurden zur Identifizierung und zum Vergleich der von verschiedenen Zellinien exprimierten γ-TCR-Spezies verwendet. Es wurden der M13.PBL C1γ-Transfektantenklon Nr. 10 und der M13.IDP2γ-Transfektantenklon Nr. 10 verwendet. Die weißen Pfeile kennzeichnen γ-TCR-Spezies von MOLT- 13; die schwarzen Pfeile kennzeichnen die γ-TCR-Spezies von IDP2; die Sternchen kennzeichnen die γ-TCR-Spezies von PBL C1.
Figur 21. Analyse der Größen der Polypeptidgerüste von γ-TCR- Ketten der Transfektanten. Die Zellen wurden mit ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Cystein 15 Minuten lang pulsmarkiert und mit P3 (Kontrolle), Anti-Cγm1 (Anti-γTCR) oder Anti-Ti-γA (Anti-Vγ2) mAb wie angegeben immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden mit Endoglykosidase H (Endo H, +) behandelt oder Mock-inkubiert (-), mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Fluorographie sichtbar gemacht. Sämtliche Proben liefen reduziert. Die Marker für die relative Molekülmasse Mr sind in Tausend Dalton angegeben. Die kontaminierende Aktinbande von 43 kD diente als zusätzlicher interner Marker. M13.IDP2γ: MOLT-13-Zellen, transfiziert mit der IDP2 γ-TCR-cDNA, Klon Nr. 10; M13.PBL.C1γ: MOLT-13-Zellen, transfiziert mit der PBL C1 γ-TCR-cDNA, Klon Nr. 10.
Figur 22: Southern-Blot-Analyse von γ,δ-T-Zell-Klonen und polyklonalen menschlichen T-Zell-Populationen. Die genomische DNA wurde mit EcoRI gespalten und mit der V-J-Sonde sondiert. Die DNA-Quellen sind: PBL-T-Zell-Klone (Spuren 1, 3-9), PBL (Spur 10), Neugeborenen-Thymozyten (NBT-Spur 11), fötale Thymozyten (FT-Spur 12), und B-Zellen (Keimbahn-Spur 2). Die 3 Kb Vδ- und 6,7 Kb Jδ-Fragmente der Keimbahn sind auf der linken Seite des Blots angegeben, während die 5 üblichen, mit I-V bezifferten Rearrangements auf der rechten Seite angegeben sind. Die Größen der Rearrangements von I-V sind 2,9 Kb, 3,5 Kb, 4,2 Kb, 6,2 Kb bzw. 7,1 Kb.

5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

5.1. DAS γ-TCR FORM 2bc-POLYPEPTID UND NUKLEINSÄUREN

Die Erfindung betrifft eine mit Form 2bc bezeichnete Form des menschlichen γ-TCR-Polypeptids (eingehend erläutert unten in den Abschnitten 8 und 9). Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuren, die für γ-Form 2bc kodieren, wie DNA und RNA, und ihre komplementären Nukleinsäuren.
Form 1- und Form 2abc γ-TCR-Polypeptide sind zuvor veröffentlichte Formen des menschlichen γ-TCRs (s. Internationale PCT- Veröffentlichung Nr. WO 88/00209, veröffentlicht am 14. Januar 1988). Das Form 1-γ-TCR-Polypeptid besitzt eine relative Molekülmasse von etwa 40 000 Dalton. Das Form 2abc-γ-TCR-Polypeptid besitzt eine relative Molekülmasse von etwa 55 000 Dalton. Die Form 2abc-γ-TCR-Kette hat ein geringfügig größeres Peptidgerüst und enthält gegenüber Form 1 ein zusätzliches, potentiell N-verknüpftes Glykan. Demgegenüber weist die erfindungsgemäße γ-TCR-Kette Form 2bc eine relative Molekülmasse von etwa 40 000 Dalton auf. Darüber hinaus besitzt das Form 2bc-γ-TCR- Polypeptid ein geringfügig kleineres Peptidgerüst und 2-3 weniger N-verknüpfte Glykane.
Die γ-TCR-Kette Form 2bc weicht verglichen mit der zuvor beschriebenen Form 2abc in ihrer Größe im Umfang von mehr als 15 kD ab (40 kD gegenüber 55 kD). Dieser Unterschied ist auf eine um 5 kD kleinere Größe des Polypeptidgerüstes (35 kD gegenüber 40 kD) und auf eine Verminderung der Anzahl von Kohlenhydraten (5 kD gegenüber 15 kD) zurückzuführen. Die ungefähre Größe des Polypeptidgerüstes der Form 2bc von 35 kD dient auch zu ihrer Unterscheidung von der Form 1; Form 1 besitzt eine Gerüstgröße von 40 kD.
Das γ-TCR-Polypeptid Form 2bc unterscheidet sich von Form 1 und Form 2abc auch in der Verwendung der Gensegmente für die konstante Region (Cγ). Die Form 1 γ-TCR-Ketten haben eine konstante Region, die durch das Cγ1-Gensegment kodiert wird (Krangel et al., 1987, Science 237:64-67), welches ein einziges CII-Exon enthält. Das Form 2abc γ-Polypeptid wird durch Cγ2-Gensegmente kodiert, die drei CII-Exonkopien enthalten, nämlich Kopie a, Kopie b und Kopie c (Krangel et al., 1987, Science 237:64-67; Littman et al., 1987, Nature 326:85-88). Demgegenüber fehlt Form 2bc eine Kopie der Sequenz, die von dem zweiten Cγ2-Exon kodiert wird, welches in der cDNA von Form 2abc vorhanden ist. Diese Form 2bc enthält zwei Cγ2 CII-Exonkopien, nämlich Kopie b und Kopie c. Die Kopie a von CII, die in Form 2bc fehlt, kodiert für einen Teil einer Konnektorregion zwischen der die Membran durchziehenden Region und der extrazellulären konstanten Domäne.
Auf dem Form 2bc-Polypeptid existieren sechs potentielle, N- verknüpfte Kohlenhydratanheftungsstellen. Da die biochemischen Daten nahelegen, daß lediglich 2-3 N-verknüpfte Glykane an die Polypeptidkette angeheftet werden, bedeutet dies, daß nicht sämtliche potentiellen Stellen verwendet werden.
Bei spezifischen Ausführungsformen kann das γ-TCR-Polypeptid Form 2bc aus Zellen der MOLT-13 (Loh et al., 1987, Nature 330:569-572)-T-Zell-Linie oder dem vom Thymus abgeleiteten Klon II (Bank et al., 1986, Nature 322:179-181) erhalten werden. Die γ-TCR-Kette Form 2bc kann ebenfalls von T-Lymphozyten eines menschlichen Individiums erhalten werden, welches diese γ-TCR- Form exprimiert.
Das Form 2bc γ-TCR-Polypeptid umfaßt die primäre Aminosäuresequenz des in Figur 14 dargestellten γ-TCR-Polypeptids oder irgendeinen Teil davon, umfassend eine konstante Region bestehend aus Kopie b und Kopie c von Cγ2-CII.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Nukleinsäuremolekül bereit, das für ein γ-TCR Form 2bc-Polypeptid mit einer relativen Molekülmasse von etwa 40 000 Dalton kodiert. Die konstante Region des γ-TCR Form 2bc-Polypeptids resultiert aus der Translation einer Nukleinsäuresequenz, die lediglich zwei der drei Cγ2 CII-Exons aufweist. Die Erfindung betrifft ebenfalls Nukleinsäuresequenzen, die eine Cγ2-konstante Region mit lediglich zwei CII-Exons umfassen. Die Nukleinsäure kann eine DNA, eine cDNA, eine RNA und komplementäre Nukleinsäuren und Derivate davon sein. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung umf aßt das DNA-Molekül mindestens einen Bereich der in Figur 14 dargestellten Nukleinsäuresequenz.
In einem Beispiel, das im Abschnitt 8 diskutiert wird, werden das 2bc γ-TCR-Polypeptid und seine kodierende Nukleinsäuresequenz beschrieben. In einem Beispiel, welches in Abschnitt 9 diskutiert wird, ist dargelegt, daß die Fähigkeit des γ-TCR- Polypeptids zur Bildung von Disulfidbrücken oder zur Glykosylierung durch seine Primärsequenz der konstanten Region festgelegt wird.

5.2. POLYPEPTIDKOMPLEXE, DIE γ-TCR FORM 2bc ENTHALTEN

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polypeptidkomplexe, die die γ-TCR-Kette Form 2bc umfassen. In einer spezifischen Ausführungsform besteht der Polypeptidkomplex aus einem T-Zell- Antigen-Rezeptor-Dimer. Insbesondere kann ein solches Dimer ein Heterodimer (einschließlich, aber nicht beschränkt, auf ein γ,δ- Heterodimer, ein γ,β-Heterodimer, und ein α,γ-Heterodimer oder ein γ,γ'-Heterodimer, bei dem γ' γ-TCR-Polypeptid Form 1, 2abc, oder 2bc sein kann) oder ein Homodimer sein.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der γ- TCR Form 2bc umfassende Polypeptidkomplex ein γ,δ-TCR-Heterodimer. Demgemäß wird erfindungsgemäß ein gereinigter Komplex bereitgestellt, welcher mindestens einen Bereich eines δ-TCR-Polypeptids und γ-TCR Form 2bc-Polypeptids umfaßt. Das δ-Polypeptid kann mindestens eine kovalente Disulfidbrücke innerhalb der Kette aufweisen. Zusätzlich kann das Polypeptid ein δ-TCR-Polypeptid mit einer relativen Molekülmasse von etwa 40 000 Dalton umfassen.
Wie in den nachfolgenden Beispielen detailliert dargelegt wird, ist die γ-TCR Form 2bc-Kette nicht-kovalent in einem Komplex mit der δ-TCR-Kette assoziiert. Somit bildet γ Form 2bc einen nicht über Disulfidbrücken verknüpften TCR-Komplex. Die γ-TCR-Kette Form 2abc bildet ebenfalls einen nicht über Disulfidbrücken verknüpften Komplex mit einer δ-TCR-Kette (z.B. bei IDP2-Zellen), während die γ-TCR-Kette Form 1 einen über Disulfidbrücken verknüpften Komplex mit einem δ-TCR-Polypeptid bildet.
Wie im Beispiel im nachfolgenden Abschnitt 9 dargelegt, wird durch die Verwendung des CII-Exons für die konstante Region von γ-TCR (und somit durch die Primärsequenz der γ-TCR-Kette) nicht nur die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Disulfidverknüpfung zwischen TCR γ und δ, sondern auch die Menge an Kohlenhydrat festgelegt, die an γ-TCR angeheftet ist, welche für die Unterschiede hinsichtlich der Größe der Zelloberflächen-γ-TCR-Proteine weitgehend verantwortlich ist. Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Expression von γ,δ-TCR- Heterodimeren mit definierter intermolekularer Verknüpfung (über Disulfidbrücken oder ohne solche Brücken verknüpft) und definiertem Ausmaß der γ-TCR-Glykosylierung, bei dem man ein für eine bestimmte γ-Polypeptidform kodierendes γ-TCR-Gen in eine Zelle einführt, die in der Lage ist, das γ-Gen zu exprimieren, wobei die Zelle die δ-TCR-Kette exprimiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen gereinigten Komplex bereit, welcher ein erfindungsgemäßes γ-TCR Form 2bc-Polypeptid umfaßt, das mit einem anderen γ-TCR-Polypeptid (z.B. Form 1, 2abc, oder 2bc) assoziiert ist. In einer Ausführungsform der Erfindung sind die beiden γ-TCR-Polypeptide über mindestens eine kovalente Disulfidverknüpfung innerhalb der Kette miteinander assoziiert. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die beiden γ-TCR-Polypeptide nicht-kovalent miteinander assoziiert. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung haben die beiden γ-TCR-Polypeptide dieselbe konstante Domäne. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung besitzen die beiden γ-TCR-Polypeptide unterschiedliche konstante Domänen.

5.3. MONOKLONALE ANTIKÖRPER, DIE GEGENÜBER DEN γ,δ-TCR-POLYPEPTIDEN REAKTIV SIND

Ein gegen ein Epitop des γ- oder δ-T-Zell-Antigen-Rezeptors gerichteter monoklonaler Antikörper (mAb) kann durch Anwendung jedweder Technik hergestellt werden, die zur Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierlich kultivierte Zellinien führt. Diese schließen die ursprünglich von Köhler und Milstein (1975, Nature 256:495-497) beschriebene Hybridomtechnik sowie die neuere Hybridomtechnik mit menschlichen B-Zellen (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77-96) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Nach einer Ausführungsform können die monoklonalen Antikörper menschliche monoklonale Antikörper oder chimäre monoklonale Mensch-Maus (oder andere Spezies) Antikörper sein. Menschliche monoklonale Antikörper können nach einer der zahlreich im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden (z.B. Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). Chimäre Antikörpermoleküle können hergestellt werden, die eine antigenbindende Domäne einer Maus (oder Ratte, oder einer anderen Spezies) mit menschlichen konstanten Regionen enthalten (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851; Takeda et al., 1985, Nature 314:452).
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung eines gegenüber einem T-Zell-Antigen-Rezeptor reaktiven monoklonalen Antikörpers. Ein derartiger mAb kann identifiziert werden durch Nachweis seiner Fähigkeit, das CD3-Antigen bei Bindung des mAb an eine Zelle, welche sowohl ein T-Zell-Antigen-Rezeptor als auch einen CD3-Komplex exprimiert, zu comodulieren. Die CD3- Comodulation kann beispielsweise nachgewiesen werden, indem man die Menge an markiertem Anti-CD3-Antikörper mißt, die von der Zelle gebunden ist. Dieses Verfahren ist beispielhaft im nachfolgenden Abschnitt 7.1.1 dargestellt, in welchem es zur Identifizierung von Hybridomen angewendet wurde, die Anti-Vδ mAb δTCAR- 3 sekretieren.
Ein molekularer Klon eines Antikörpers gegen ein Epitop eines γ- oder δ-TCR-Polypeptids kann anhand bekannter Techniken hergestellt werden. Die rekombinante DNA-Methodenlehre (s. z.B. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) kann angewendet werden zur Herstellung von Nukleinsäuresequenzen, die für ein monoklonales Antikörpermolekül oder eine Antigenbindungsregion davon kodieren.
Die Antikörpermoleküle können anhand bekannter Techniken gereinigt werden, z.B. durch Immunabsorptions- oder Immunaffinitäts-Chromatographie, chromatographische Verfahren wie HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) oder durch eine Kombination davon, etc.
Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können mittels bekannter Techniken hergestellt werden. Beispielsweise schließend derartige Fragmente die folgenden Fragmente ein, sind aber nicht darauf beschränkt das F(ab')&sub2;-Fragment, welches durch Pepsinspaltung des Antikörpermoleküls gebildet werden kann; die Fab'-Fragmente, welche durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')&sub2;-Fragments hergestellt werden können; und die Fab-Fragmente, welche durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel hergestellt werden können.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die gegenüber der variablen Region der δ-TCR-Kette reaktiv sind. Ein solcher Antikörper ist δTCAR-3 (aka TCSδ1) (s. Abschnitt 7, unten), welcher ein Epitop erkennt, das von einem spezifischen δ-Gen-Rearrangement exprimiert wird. Wie im nachfolgenden Abschnitt 7.2 beschrieben wird, ist mAb δTCAR-3 in der Lage, die Proliferation eines γ,δ&spplus;-T-Lymphozyten zu stimulieren. Der monoklonale Antikörper δTCAR-3 ist ebenfalls in der Lage, einen Anstieg der zytoplasmafreien Calcium-Ionenkonzentration von γ,δ&spplus;-T Lymphozyten zu stimulieren.
Nach einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Antikörper, die gegenüber der konstanten Region des γ- oder δ-TCR- Polypeptids reaktiv sind. Nach einer spezifischen Ausführungsform betrifft die Erfindung den mAb TCRδ1, welcher gegenüber der konstanten Region der δ-TCR-Kette reaktiv ist (s. nachfolgender Abschnitt 6). Nach einer weiteren spezifischen Ausführungsform betrifft die Erfindung den mAb Anti-Cγm1, welcher reaktiv gegenüber der konstanten Region der γ-TCR-Kette ist (s. nachfolgender Abschnitt 8.1.7).

6. HERSTELLUNG DES SPEZIFISCH GEGENÜBER DER TCR-δ-UNTEREINHEIT DER KONSTANTEN REGION REAKTIVEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS ANTI-TCRδ1

6.1. EXPERIMENTELLE VORGEHENSWEISE

6.1.1. CYTOFLUOROGRAPHISCHE ANALYSE VON T-ZELL-LINIEN MIT ANTI-TCRδ1

Der mAb Anti-TCRδ1, welcher in spezifischer Weise gegenüber der konstanten Region der δ-TCR-Kette reaktiv ist, wurde wie folgt hergestellt: 1 g PEER-Zellen wurden in 50 ml 0,3 % CHAPS (3-[3- Cholamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propansulfonat)-Detergens gelöst und mit 1 ul UCHT1 (P.C. Beverley and Callard, 1981, Eur. J. Immunol. 11:329-334)-Aszites, 500 ul mAb 187.1-Kulturüberstand und Staphylococcus aureus Stamm Cowan I (SACI) immunpräzipitiert. Es erfolgten vier intraperitoneale Injektionen im Abstand von jeweils 6 Wochen, wonach eine endgültige Boost-Injektion mit γ,δ-TCR (ohne CD3) durchgeführt wurde, welcher durch selektive Elution von γ,δ-TCR aus dem Immunkomplex unter Verwendung von 2 % Triton X-100 isoliert worden war. Das eluierte Material wurde sowohl intjavenös als auch intraperitoneal verabreicht; vier Tage nach dieser Boost-Injektion wurden die Mäuse eingeschläfert und es erfolgte eine Fusion wie zuvor beschrieben (M.B. Brenner et. al., 1987, J. Immunol. 138:1502-1509).
Die γ,δ-TCR-Zellinien PEER und IDP2 oder die α,β-TCR-Zellinien HPB-MLT und JURKAT wurden mit 50 ul Anti-TCRδ1-Kulturüberstand und nachfolgender Anfärbung mit FITC-konjugierten Anti-Maus Ig F(ab)'&sub2;-Fragmenten der Ziege und Analyse mit Hilfe eines Cytofluorographs von Ortho gefärbt (s. Fig. 1). Als Kontrolle diente der vom Hybridom P3X63.Ag8 (P3) sekretierte mAb, und Anti-CD3 mAb war Anti-Leu4 (J.A. Ledbetter et al., 1981, J. Exp. Med. 153:310).

6.1.2. IMMUNCHEMISCHE ANALYSE DER SPEZIFITÄT VOM mAb ANTI-TCRδ1

Mit ¹²&sup5;I Oberflächen-markierte IDP2-Zellen wurden gelöst und ihre Proteine wurden immunpräzipitiert mit Kontroll-mAb P3, Anti- Leu 4, Anti-TCRδ1 oder Anti-Cγ-Serum. Die präzipitierten Proben wurden durch SDS-PAGE und nachfolgender Autoradiographie analysiert. Unter CHAPS-Detergens blieben γ,δ-TCR und CD3 miteinander assoziiert und wurden als Komplex durch Anti-Leu 4 immunpräzipitiert (Fig. 2, Spuren 3 und 4). Nach Lösung in 2 % Triton X-100- Detergens immunpräzipitiert der γ,δ-TCR durch Anti-TCRδ1 jedoch in Form eines dimeren Komplexes ohne CD3 (Spur 6), und Anti- Leu 4 immunpräzipitierte CD3 in Form eines trimeren Komplexes ohne γ,δ-TCR (Spur 5). Nach Trennung der γ,δ-TCR-CD3-Komponentenketten wurde δ-TCR durch Anti-TCRδ1 allein immunpräzipitiert (Spuren 7 und 8), während Anti-Cy-Serum γ-TCR allein immunpräzipitierte (Spur 9). Für die Experimente der Kettentrennung (Spuren 7-9) wurden die Immunpräzipitate durch Anti-Leu 4 aus mit CHAPS gelösten IDP2-Zellen in 1 % SDS gekocht und anschließend mit 4 Volumina 2 % Triton X-100 verdünnt, gefolgt durch Immunpräzipitation mit Anti-TCRδ1 oder Anti-Cγ-Serum. Dieses erfolgte nach bekannten Verfahren (M.B. Brenner et al., 1986, Nature 322:145).

6.1.3. N-VERKNÜPFTE GLYKOSYLIERUNG DES δ-TCR-POLYPEPTIDS

Mit ¹²&sup5;I markierte IDP2-Zellen wurden in 0,3 % CHAPS gelöst, mit Anti-Leu 4 immunpräzipitiert und durch SDS-PAGE aufgetrennt (Fig. 3). Die Kontrollspur betrifft Mock-gespaltenes γ-TCR-Polypeptid von IDP2. Die Spaltung des δ-TCR-Polypeptids mit N-Glykanase wurde wie folgt durchgeführt: δ-TCR wurde aus einem Gelstreifen eluiert, anschließend mit N-Glykanase (Genzyme Corp.) (10 U/ml) 16 Stunden lang bei 37 ºC in 30 ul 0,17 % SDS, 1,25 % Nonidet P-40, 0,2 M Natriumphosphatpuffer pH-Wert 8,6, gespalten (A.L. Tarentino et al., 1985, Biochemistry 24:4665). Die gespaltenen oder Mock-inkubierten δ-TCR-Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht.

6.1.4. ERKENNUNG VON IN VITRO-TRANSLATIONSPRODUKTEN DES cDNA-KLONS IDP2O-240/38 DURCH mAb ANTI-TCRδ1

Ein mit pGEM3-O-240/38 bezeichnetes Plasmid wurde wie folgt hergestellt und für eine in vitro-Transkription-Translation eingesetzt (Fig. 4). Das 1,5 Kb lange Insert des cDNA-Klons IDP2 O-240/38 (δ-TCR) beginnt innerhalb des Kodons Nr. 7 der zusammengesetzten Gruppe O-Sequenz und schließt die verbleibende Kodierungsregion und den größten Teil der 3'-nicht-translatierten Region ein. Dieses Insert wurde durch partiellen Verdau mit EcoRI (um eine Spaltung der internen EcoRI-Stelle zu vermeiden) in Form eines einzelnen Eco-RI-Fragments von λgt10-Armen abgespalten. Das Fragment wurde in einem Bluescript+-Vektor (Stratagene) subkloniert. Das Insert wurde anschließend aus dem Vektor in Form eines einzelnen BamHI-SalI-Fragments (die Enden stammen vom Bluescript-Vektor-Polylinker) entfernt, wodurch ein gerichtetes Klonieren in pGEM-3 (Promega Biotech) stromabwärts des T7- Promotors ermöglicht wird. Das resultierende Plasmid pGEM3-O- 240/38 wurde mit SalI linearisiert und es wurden mit Kappen versehene Transkripte synthetisiert unter Verwendung von T7 RNA- Polymerase (M.S. Krangel et al., 1987, Science 237:64). Die Integrität und Größe der Transkripte wurde mit einem Aliquot der Reaktionsmischung, die ³²P-ATP enthielt, überwacht. Es wurde eine einzige RNA-Spezies von 1,5 Kb beobachtet. Die in vitro-Translation erfolgte in einem Kaninchen-Retikulozytenlysat in Anwesenheit von ³&sup5;S-Methionin. Nach der in vitro-Translation wurden die Proben in l % SDS mit 2 mM Dithiothreitol gekocht, gefolgt durch Zugabe von 10 Volumina 2 % Triton X-100 in Tris-gepufferter Saline, pH-Wert 7,5. Die Proben wurden mit Kontroll-mAb P3 (Fig. 5, Spuren 1 und 3) oder mit Anti-TCRSI mAb (Spuren 2 und 4) immunpräzipitiert und durch SDS-PAGE und Fluorographie analysiert (W.J. Bonner und R.A. Laskey, 1974, Eur. J. Biochem. 46:83-88).

6.2. EXPERIMENTELLE ERGEBNISSE

Wir haben einen monoklonalen Antikörper (mAb) Anti-TCRδ1 generiert, welcher in spezifischer Weise gegenüber der konstanten Region von δ-TCR reaktiv ist.
Der γ,δ-TCR-CD3-Komplex von der PEER-Zellinie (A. Weiss et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:6998-7002; M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694) wurde als Immunogen bei der Herstellung von Antikörper sekretierenden Hybridom-Zellinien verwendet. Ein Screening der Hybridome erfolgte sowohl durch Oberflächenbindung (cytofluorographische Analyse) als auch durch Immunpräzipitation von PEER-Zellproteinen, gefolgt durch Analyse mittels SDS-PAGE. Zwei Hybridom-Überstände (5A6 und 4A1) banden an die Oberfläche von PEER-Zellen. Nach dem Subklonieren wurde ein mAb (5A6.E9) weiter charakterisiert. Dieser mAb band an die Oberfläche von γ,δ-TCR-Lymphozyten (PEER, IDP2), konnte jedoch weder mit α,β-TCR-Zellen (HPB-MLT, JURKAT) noch mit non-T-Leukozyten reagieren (Fig. 1 und nicht gezeigte Daten). Obgleich das Immunogen aus einem Komplex von γ,δ-TCR und CD3 zusammengesetzt war, deutete die größere Affinität des mAb für γ,δ-TCR-Zellinien darauf hin, daß der mAb nicht gegen CD3-Determinanten gerichtet war.
Die Spezifität des mAb wurde bestimmt in Immunpräzipitationsstudien unter Verwendung verschiedener Detergentien, die die Assoziation der den Rezeptorkomplex bildenden Proteine beeinflussen. Nach der Lösung von mit ¹²&sup5;I markierten IDP2-Zellen in CHAPS-Detergens blieben γ- und δ-TCR sowie γ,δ-CD3, als auch &epsi;- Untereinheiten Teil eines assoziierten Komplexes, der durch Anti-CD3-Antikörper immunpräzipitiert wurde (Fig. 2, Spuren 3, 4). Wenn die radioaktiv markierten IDP2-Zellen jedoch in 2 % Triton X-100-Detergens gelöst wurden, kam es zu einer starken Dissoziation von γ,δ-TCR und CD3, und die Verwendung von Anti- CD3 mAb führte zu einer selektiven Präzipitation von CD3 (Fig. 2, Spur 5). Unter diesen letztgenannten Bedingungen wurde γ,δ-TCR durch den mAb 5A6.E9 als Heterodimer ohne assoziierten CD3 immunpräzipitiert (Fig. 2, Spur 6). Diese Beobachtung lieferte den ersten direkten Nachweis dafür, daß γ-TCR und δ-TCR in Form eines nicht über Disulfidbrücken verknüpften Heterodimers existieren. Um festzustellen, ob mAb 5A6.E9 mit einer γ-TCR-Kette, einer δ-TCR-Kette oder einer kombinatorischen Determinante reagiert, wurde eine Immunpräzipitation von getrennten Polypeptidketten durchgeführt. Ein Anti-Leu 4-Immunpräzipitat von radioaktiv markierten, CHAPS-gelösten IDP2-Zellen wurde in 1 % SDS gekocht, um die γ-TCR-, δ-TCR- und CD3-Proteine zu dissoziieren. Nach Verdünnung mit 4 Volumina 2 % Triton X-100 wurde die 40 kD (δ-TCR)-Spezies durch mAb 5A6.E9 in spezifischer Weise immunpräzipitiert (Fig. 2, Spur 7). Im Falle der Analyse eines Aliquots desselben Immunpräzipitats unter reduzierenden Bedingungen (Fig. 2, Spur 8) wurde eine dramatische Veränderung der Mobilität in SDS-PAGE beobachtet. Dieses Phänomen ist charakteristisch für δ-TCR von den Zellinien IDP2 und PEER (M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694). Demgegenüber wurde im Falle der Immunpräzipitation der getrennten Ketten mit Anti-Cγ-Serum die 55 kD Spezies (γ-TCR), nicht aber die 40 kD Spezies (δ-TCR) immunpräzipitiert (Fig. 2, Spur 9). Aufgrund dieser biochemischen Analysen und den Untersuchungen zur Oberflächenbindung wird der mAb 5A6.E9 nachfolgend als Anti-TCRδ1 bezeichnet.
Zusätzlich zu PEER und IDP2 führte Anti-TCRδ1 ebenfalls zur Immunpräzipitation von δ-TCR anderer γ,δ-TCR-Zellinien einschließlich MOLT-13 und der PBL-Linie 2. Weitere Experimente haben gezeigt, daß Anti-TCRδ1 mit einer Determinante reagiert, die von einem konstanten (C) TCRδ-Gensegment kodiert wird.
Wir haben aus der IDP2-Zellinie mit dem subtraktiven Ansatz cDNA-Klone isoliert (z.B. IDP2 O-240/38), die ein Gen repräsentieren, welches für die TCR-δ-Untereinheit kodiert. Gene, mit denen cDNA-Klone der IDP2-Gruppe O bei Southern-Blot-Experimenten hybridisieren, werden in γ,δ-TCR-Lymphozyten exprimiert und rearrangiert, werden aber gewöhnlich in α,β-TCR-Zellen nicht exprimiert (und häufig deletiert). Ein Sequenzvergleich mit anderen TCR-Genen deutet darauf hin, daß diese cDNA-Klone aus neuen V-, D- (?), J- und C-Gensegmenten zusammengesetzt sind. Die zusammengesetzte DNA-Sequenz der IDP2-Gruppe O enthält einen langen offenen Leserahmen für ein Polypeptid mit zwei potentiellen Asparagin-verknüpften Glykosylierungsstellen und einer relativen Molekülmasse von 31,3 Kilodalton. Um die relative Molekülmasse des unglykosylierten δ-TCR-Proteins und die Anzahl von Asparagin-verknüpften Kohlenhydraten zu bestimmen, die im reifen IDP2-δ-TCR-Polypeptid vorhanden sind, wurde der mittels Gel gereinigte δ-TCR entweder mit N-Glykanase behandelt oder Mock- inkubiert und durch SDS-PAGE analysiert (Fig. 3). Eine Entfernung der N-verknüpften Kohlenhydrate führte zu einer Verminderung der geschätzten relativen Molekülmasse im Umfang von 5 kD (40 kD zu 35 kD), wodurch die Anwesenheit von zwei (2,5-3 kD) N- verknüpften Glykanen auf dem IDP2-δ-TCR nahegelegt wird. Dies stimmt mit der aus der translatierten Aminosäuresequenz gemäß Figur 5 vorhergesagten Anzahl von N-verknüpften Glykanen überein. Die geschätzte relative Molekülmasse des Proteins stimmt damit allgemein überein und weicht von der vorhergesagten um 3,7 kD ab.
Nach Kenntnis der Reaktivität von Anti-TCRδ1 gegenüber IDP2- Zellen und der Spezifität für das δ-TCR-Polypeptid und der Erkennung von partiell denaturiertem (SDS-gekochtem) δ-TCR untersuchten wir, ob dieser mAb das durch den δ-TCR cDNA-Klon kodierte Polypeptid direkt erkennen würde. Demgemäß wurde das Insert des cDNA-Klons IDP2 O-240/38 in den Expressionsvektor pGEM-3 stromabwärts des T7-Promotors subkloniert (Fig. 4). Die in vitro mit T7 RNA-Polymerase generierten Transkripte wurden anschließend in einem Kaninchen-Retikulozytenlysat-System eingesetzt, um die Proteinsynthese in Anwesenheit von ³&sup5;S-Methionin zu steuern. Im Anschluß an eine in vitro-Transkription-Translation wurden die Reaktionsmischungen in 1 % SDS gekocht, mit 10 Volumina 2 % Triton X-100 verdünnt, und anschließend entweder mit einem Isotyp-gematchten Kontroll-mAb oder mit Anti-TCRδ1 immunpräzipitiert. Der mAb Anti-TCRδ1 führte zur spezifischen Immunpräzipitation einer dominierenden Spezies (34 kD) (Fig. 5. Spur 4). Keine derartige Bande wurde bei Immunpräzipitaten beobachtet, wenn Kontroll-mAbs eingesetzt wurden (Spur 3), RNA- Transkripte weggelassen wurden (Spuren 1 und 2), oder wenn γ- TCR-Konstrukte verwendet wurden. Somit korrespondiert die durch den mAb Anti-TCRδ1 immunpräzipitierte, radioaktiv markierte Spezies mit einem δ-Polypeptid, dessen Synthese in spezifischer Weise von dem cDNA-Klon IDP2 O-240/38 gesteuert wurde. Dieses Polypeptid (34 kD) ist hinsichtlich seiner Größe der mit N-Glykanase behandelten IDP2-δ-TCR-Kette (35 kD) sehr ähnlich. Dem IDP2-Klon O-240/38 fehlt sowohl ein natürliches ATG-Initiationskodon als auch die Leader-Sequenz. Es gibt zwei potentielle interne ATG-Kodons (bei den Resten 12 und 44) innerhalb der V- Region dieses Klons (Fig. 5). Eine Verwendung dieser Kodons zur Initiierung der Synthese könnte zu mehr als einer Polypeptidspezies und möglicherweise zu der genannten kleineren Spezies (Fig. 5, Spur 4) führen. Demgemäß gibt es eine direkte serologische Erkennung der von dem Klon IDP2 O-240/38 kodierten Untereinheit des IDP2-δ-TCRs durch den mAb Anti-TCRδ1.

7. HERSTELLUNG DES IN SPEZIFISCHER WEISE GEGENÜBER DER TCR-δ-UNTEREINHEIT DER VARIABLEN REGION REAKTIVEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS δTCAR-3

7.1. EXPERIMENTELLE VORGEHENSWEISEN

7.1.1. IMMUNPRÄZIPITATION UND SDS-PAGE-ANALYSE DES T-ZELL-ANTIGEN-REZEPTORS

Der gegenüber der variablen Region der δTCR-Kette in spezifischer Weise reaktive mAb δTCAR-3 wurde wie folgt hergestellt: Eine Maus wurde immunisiert durch intraperitoneale Injektion von 2 x 10&sup7; Molt-13-Zellen. Einen Monat später erhielt die Maus an drei aufeinanderfolgenden Tagen eine intravenöse Boost-Injektion von 1 x 10&sup7; Molt-13-Zellen, und anschließend wurden immune Splenozyten mit Zellen des Mausmyeloms P 3 x 63 Ag8.653 in Anwesenheit von 50 % Polyethylenglykol 1500 fusioniert. Die Hybridome wurden abgesucht durch Analyse der CD3-Comodulation mittels Durchflußcytometrie. Die Analyse der CD3-Comodulation basierte auf der Beobachtung, daß Antikörper gegen den α,β-T-Zell-Antigen-Rezeptor bei Inkubation mit den Zellen die Internalisierung des CD3-Komplexes hervorriefen (L.L. Lanier et al., 1986, J. Immunol. 137:2286; S.C. Meuer et al., 1983, J. Exp. Med. 157:705).
Die Zellinien Molt-13, PEER und HPB-ALL wurden unter Anwendung des Lactoperoxidase-Verfahrens jodiert. Die mit ¹²&sup5;I-βF1 markierten Zellen wurden in Tris-gepufferte Saline (PH-Wert 8) enthaltend 1 % Triton X-100 gelöst. Die Lysate wurden unter Verwendung von δTCAR-3-Antikörper oder ßFl-Antikörper immunpräzipitiert. βF1 ist ein monoklonaler Framework-Antikörper gegen die β-TCR- Kette und ist anderswo beschrieben (M.B. Brenner et al., 1987, J. Immunol. 138:1502-1509). Sämtliche Proben wurden durch SDS- PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert (Fig. 6). Molt-13 und PEER sind beide CD3&spplus;4&supmin;8&supmin;WT31&supmin;. HPB ist CD3&spplus;4&spplus;8&spplus;WT31&spplus;.
Wie in Figur 6 gezeigt, führte δTCAR-3 zur Immunpräzipitation nicht über Disulfidbrücken verknüpfter γ- und 6-Ketten von Molt- 13- und PEER-Zellen, während βF1 zur Immunpräzipitation von über Disulfidbrücken verknüpften α- und β-Ketten von HPB-ALL-Zellen führte. Der Unterschied in der autoradiographischen Intensität zwischen den Banden, die mit den δ- und γ-Ketten korrespondieren, zeigt die Unterschiede im Ausmaß der Jodierung dieser beiden Proteine.

7.1.2. IMMUNPRAZIPITATION DER δ-TCR- KETTE DURCH δTCAR-3-ANTIKÖRPER

Die Figur 7 zeigt mit ¹²&sup5;I markierte Molt-13-Zellen, gelöst in Tris-gepufferter Saline (pH-Wert 8) enthaltend 0,3 % CHAPS (3- [(3-Cholamidopropyl)dimethylammoni]1-propansulfonat) oder in 1 % Triton X-100. In 1 % Triton X-100 dissoziiert γ,δ-TCR vom CD3- Komplex, während γ,δ-TCR in 0,3 % CHAPS mit dem CD3-Komplex assoziiert bleibt. Vor der Immunpräzipitation wurden die mit ¹²&sup5;I markierten und in Spuren 3, 4 und 7 der Figur 7 eingesetzten Lysate durch Zugabe von SDS in einer Endkonzentration von 1 % und nachfolgender 5-minütiger Erhitzung auf 68 ºC denaturiert. Nach dem Abkühlen erfolgte die Zugabe von Jodacetamid in einer Endkonzentration von 20 mM. Die Mischung wurde anschließend mit 4 Volumina 1,5 % Triton X-100 in Tris-gepufferter Saline (pH- Wert 8) verdünnt. Diese Denaturierung führt zu einer vollständigen Dissoziation der γ-Kette, der δ-Kette und der CD3-Proteine voneinander. Sämtliche Proben wurden durch SDS-PAGE unter nicht- reduzierenden Bedingungen (N) analysiert mit Ausnahme der Probe in Spur 4, welche unter reduzierenden Bedingungen (R) gefahren wurde. Auf den Unterschied in der Mobilität der δ-Kette unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen wird hingewiesen. Das Anti-Cγ-Antiserum wurde generiert durch Immunisierung eines Kaninchens mit einem 20 Aminosäuren langen synthetischen Peptid aus der konstanten γ-Region (Reste 117-136).

7.1.3. ANALYSE DER ZELLOBERFLÄCHENFÄRBUNG MIT DURCHFLUßCYTOMETRIE

5 x 10&sup5; Zellen wurden 30 Minuten lang bei 4 ºC mit den passenden Antikörpern (NMS (normales Mausserum), δTCAR-3, OKT3 oder WT31) inkubiert und anschließend zweimal mit 0,2 % BSA in PBS (pH-Wert 7,4) gewaschen. Nach 30 Minuten langer Inkubation mit Fluorescein-konjugiertem Anti-Maus-IgG der Ziege bei 4 ºC wurden die Zellen mit einem Cytofluorograph von Ortho analysiert (Fig. 8).

7.1.4. ZWEI-FARBEN-CYTOFLUOROGRAPHISCHE ANALYSE VON δTCAR-3&spplus;- UND OKT3&spplus;-LYMPHOZYTEN DES PERIPHEREN BLUTES

Die Lymphozyten des peripheren Blutes wurden zunächst 30 Minuten lang mit δTCAR-3 bei 4 ºC inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen für weitere 30 Minuten bei 4 ºC mit Phycoerythrin (PE)- konjugiertem Anti-Mäuse-IgG der Ziege inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen 30 Minuten lang bei 4 ºC mit Fluorescein (FITC)-konjugiertem OKT3 inkubiert und anschließend mit einem Cytofluorograph von Ortho analysiert (Fig. 9).

7.1.5. MESSUNG DER INTRACYTOPLASMATISCHEN Ca²&spplus;- KONZENTRATION ([Ca²&spplus;]i) IM ZEITVERLAUF

Molt-13-Zellen wurden mit der Acetoxymethylesterform der Ca²&spplus;- sensitiven Sonde Fura-2 (2 uM einer 1 mM Vorratslösung in Dimethylsulfoxid, Molecular Probes, Eugene, Oregon) in einer Konzentration von 10&sup7; zellen/ml in RPMI 1640 plus 10 % fötalem Rinderserum 30 Minuten lang bei 37 ºC markiert. Die Zellen wurden anschließend gewaschen und in einer Konzentration von 10&sup7; Zellen/ml in Hanks balanced salt solution (HBSS) plus 5 % fötales Rinderserum resuspendiert und bei Raumtemperatur bis zu Verwendung im Dunkeln belassen. Unmittelbar vor der Fluoreszenzmessung wurden 2 x 10&sup6; Zellen zentrifugiert und in 2 ml frischer HBSS resuspendiert und in eine Quarzküvette bei 37 ºC überführt und konstant gerührt. Die Fluoreszenz der Zellsuspension wurde in einem SPF-500C Fluorometer (SLM Aminco, Urbana, Illinois) gemessen, wobei die Anregungswellenlänge zwischen 340 (±2) und 380 (±2) nm wechselte und die Emission bei 510 (±5) nm abgelesen wurde. Das Verhältnis von 350/380 wurde automatisch berechnet (alle 2 Sekunden ein Wert), aufgetragen, und in einem IBM PC AT abgespeichert. Die Quantifizierung von [Ca²&spplus;]i anhand des Fluoreszenzverhältnisses erfolgte wie von Grynkiewicz et al. beschrieben (1985, J. Biol. Chem. 260:3440). Die Zugabe irrelevanter Antikörper führte zu keiner Veränderung von [Ca²&spplus;]i, während es bei Zellysis zu einer [Ca²&spplus;]i von 1 uM kam.

7.2. ERGEBNISSE

Wir haben einen monoklonalen Antikörper δTCAR-3 hergestellt, der gegen eine variable Region der δ-TCR-Kette gerichtet ist und zur Charakterisierung des δ-Polypeptids verwendet werden kann. Dieser monoklonale Antikörper bindet an T-Zellen, die den γ,δ-TCR tragen, und führt auch zur Auslösung eines Fura-2 Ca²&spplus;-Signals bei Bindung an Molt-13-Zellen.
Der monoklonale Antikörper δTCAR-3 wurde hergestellt durch Immunisierung einer Maus mit der Zellinie Molt-13, welche einen CD3&spplus;4&supmin;8&supmin;WT31&supmin;-Phänotyp aufweist. Die Hybridome wurden zunächst auf CD3-Comodulation abgesucht. Die positiven Klone wurden weiter durch Immunpräzipitation einem Screening zugeführt. Die Immunpräzipitation des γ,δ-TCR-Heterodimers durch δTCAR-3 aus mit ¹²&sup5;I markierten Molt-13- und PEER-Lysaten ist in Figur 6 dargestellt. δTCAR-3 führt nicht zu einer Immunpräzipitation irgendeines Polypeptids von HPB-ALL (Fig. 6). Demgegenüber wird das α,β- Heterodimer von der Zellinie HPB-ALL durch βF1, einem monoklonalen Framework-Antikörper, der gegen die β-Kette spezifisch ist (M.B. Brenner et al., 1987, J. Immunol. 138:1502-1509) immunpräzipitiert (Fig. 6, Spuren 10 und 12). Der immunpräzipitierte γ,δ-Rezeptor sowohl von Molt-13- als auch von PEER-Zellen zeigt bei Analyse unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen eine heterodimere Struktur, die auf einen nicht über Disulfidbrücken verknüpften γ,δ-TCR in diesen beiden Zellinien hinweist. Es gibt eine geringe Veränderung in der Mobilität der δ-Kette unter reduzierenden Bedingungen in Relation zu derjenigen, die unter nicht-reduzierenden Bedingungen beobachtet wurde (Fig. 6, Spuren 1 und 3, 5 und 7), was ein Phänomen darstellt, welches zuvor bei den Zellinien IDP2 und PEER beobachtet worden ist (M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694), wodurch die Existenz von Disulfidbindungen innerhalb der Kette angezeigt wird. Um zu zeigen, daß der Antikörper δTCAR-3 einen CD3-assoziierten γ,δ-TCR erkennt, wurden Immunpräzipitationen mit in 0,3 % CHAPS-Detergens gelösten, mit ¹²&sup5;I markierten Molt-13-Zellysaten durchgeführt (Fig. 7, Spur 1). Unter diesen Bedingungen blieb der CD3-Komplex mit dein Rezeptor assoziiert, und sowohl das γ,δ-Heterodimer als auch der CD3-Komplex werden durch δTCAR- 3 immunpräzipitiert. Wenn die mit ¹²&sup5;I markierten Lysate jedoch in 1 % Triton X-100-Detergens, welches eine starke Dissoziation des CD3-Komplexes vom γ,δ-Rezeptor bewirkt, gelöst wurden, wird lediglich das γ,δ-Heterodimer durch δTCAR-3 immunpräzipitiert (Fig. 7, Spur 2). Als Kontrolle wurde durch den Anti-CD3-Antikörper UCHT-1 (P.C.Beverley und R.E. Callard, 1981, Eur. J. Immunol. 11:329-334) lediglich der CD3-Komplex, nicht aber das γ,δ-Heterodimer immunpräzipitiert (Fig. 7, Spur 5).
Die Spezifität von δTCAR-3 wurde weiter analysiert durch Anwendung von Immunpräzipitationen von denaturierten, mit ¹²&sup5;I markierten Molt-13-Lysaten, bei denen γ,δ-TCR- und CD3-Proteine vollständig dissoziiert waren. Die δ-Kette mit einer geschätzten relativen Molekülmasse von 38 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen (Fig. 7, Spur 3) und von 40 kD unter reduzierenden Bedingungen (Spur 4) wurde durch δTCAR-3 in spezifischer Weise immunpräzipitiert. Das Anti-Cγ-Antiserum führte zur Immunpräzipitation der γ-Kette mit einer relativen Molekülmasse von 42 kD unter reduzierenden Bedingungen (Fig. 7, Spur 7). Diese Daten zeigen, daß δTCAR-3 für die δ-Kette spezifisch ist.
δTCAR-3 führt nicht nur zur Immunpräzipitation des γ,δ-TCR-Heterodimers von den Zellinien PEER und Molt-13, sondern bindet ferner an die Oberfläche dieser Zellinien und an den IDP2-Klon (M. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694). Er bindet nicht an die den α,β-TCR aufweisenden Zellinien HPB-ALL und Jurkat (Fig. 8). Demgegenüber reagiert WT31 (W.J.M. Tax et al., 1983, Nature 304:445-447), ein monoklonaler Framework-Antikörper gegen den α,β-TCR, mit α,β-TCR-positiven HPB-ALL- und Jurkat-Zellinien, nicht jedoch mit γ,δ-TCR-positiven Molt-13-, PEER- und IDP2-Zellen (Fig. 8). Bei der Untersuchung normaler Lymphozyten des peripheren Blutes (PBL) war eine Subpopulation (0,9-2,4 %) der CD3&spplus;-Lymphozyten positiv gegenüber δTCAR-3 (Fig. 9). Bei Verwendung von auf Gewebekulturschalen zur Kultur normaler menschlicher PBL immobilisiertem δTCAR-3 stimulierte er selektiv die Proliferation der γ,δ-TCR-positiven Subpopulation. Nach einer Kulturdauer von 45 Tagen repräsentierte die γ,δ-TCR-Subpopulation 96 % der gesamten Zellzahl.
Die Antikörper gegen den α,β-T-Zell-Antigen-Rezeptor stimulieren einen Anstieg der cytoplasmafreien Calciumionenkonzentration [Ca²&spplus;]i (A. Weiss et al.,1986, Ann. Rev. Immunol. 4:593). Die Inkubation von Molt-13-Zellen mit δTCAR-3 führte zu einem raschen Anstieg von [Ca²&spplus;]i, ähnlich der Antwort, wie sie durch Anti-T3-Antikörper induziert wurde (Fig. 10). Darüber hinaus stimulierte δTCAR-3 in ähnlicher Weise einen Flux von Ca²&spplus; in PEER-Zellen und in der γ,δ-TCR-positiven Zellinie, hergestellt von PBL gemäß obiger Darlegung. Wir haben ferner beobachtet, daß die Inkubation von Molt-13-, PEER- und IDP2-Zellen mit δTCAR-3 die Comodulation des CD3-Proteinkomplexes bewirkt.
Eine weitere Charakterisierung der Epitopspezifität des mAb δTCAR-3 (auch bezeichnet mit mAb TCSδ1) erfolgt nachfolgend im Abschnitt 11.2.2.

8. DREI FORMEN DES MENSCHLICHEN γ,δ-T-ZELL-REZEPTORS: BEVORZUGTE VERWENDUNG EINER FORM BEI AUSGEWÄHLTEN GESUNDEN INDIVIDUEN

Mit den vorliegenden Beispielen wird die Struktur einer neuen Form des menschlichen γ,δ-T-Zell-Rezeptors (γ,δ-TCR) dargestellt, die aus einem nicht-kovalent mit einer δ-TCR-Kette assoziiertem γ-TCR-Glykoprotein von 40 kD besteht. Das neu identifizierte γ-TCR-Glykoprotein mit der Bezeichnung Form 2bc weicht verglichen mit der zuvor beschriebenen, nicht über Disulfidbrükken verknüpften TCR-γ-Form (Form 2abc) in der Größe im Umfang von mehr als 15 kD ab (40 kD gegenüber 55 kD). Dieser Unterschied wird zurückgeführt auf eine um 5 kD kleinere Größe des Polypeptidgerüstes (35 kD gegenüber 40 kD) und auf eine Verminderung in der Anzahl von Kohlenhydraten (5 kD gegenüber 15 kD). Die Analyse der Nukleotidsequenz von cDNA-Klonen, die mit der Form 2bc korrespondieren, ergab, daß den cDNA-Klonen der Form 2bc eine Kopie des zweiten Exons für die konstante Region (Cγ2) fehlt, welche in der cDNA der anderen, nicht über Disulfidbrükken verknüpften TCR-γ-Untereinheit (Form 2abc) vorhanden ist. Diese Kopie des CII-Exons kodiert für einen Teil einer Konnektorregion zwischen der membranständigen Region und der extrazellulären konstanten Domäne. Da die Anzahl und Lokalisierung der potentiellen N-verknüpften Kohlenhydratanheftungsstellen bei beiden, nicht über Disulfidbrücken verknüpften Formen dieselben sind, ziehen wir die Schlußfolgerung, daß die Konnektorregion die Anzahl angehefteter Kohlenhydrate beeinflußt, vermutlich über die Auswirkungen auf die Konformation des Proteins. Demgegenüber zeigen die δ-TCR-Untereinheiten dieser γ,δ-TCR-Formen hinsichtlich der Größen der Peptidgerüste oder bei Analysen zur Peptidkartierung geringe Variabilität.
Wir untersuchten ferner die Verwendung der drei Formen des γ,δ- TCR-Komplexes in peripherem Blut. Bei bestimmten gesunden Individuen wurde eine nahezu ausschließliche Verwendung der über Disulfidbrücken verknüpften Form Form 1 beobachtet. Bei einigen Individuen wurde die Form 1 zusammen mit der Form 2bc exprimiert. Die Form 2abc wurde in den untersuchten Individuen nicht identifiziert.

8 .1. EXPERIMENTELLE VORGEHENSWEISEN

8.1.1 ANTIKÖRPER

Die verwendeten monoklonalen Antikörper waren Anti-Leu 4 (Anti- CD3) (Ledbetter et al., 1981, J. Exp. Med. 153:310-323), βF1 (Anti-βTCR) (Brenner et al., 1987, J. Immunol. 138:1502-1509), Anti-TCRδ1 (Anti-δTCR) (beschrieben im obigen Abschnitt 6; reaktiv gegenüber der konstanten Region der δ-TCR-Kette), P3 (Kontrolle) (sekretiert von P3X63.Ag8; Koehler und Milstein, 1975, Nature 256:495-497), 187.1 (anti-leichte κ-Kette der Maus aus der Ratte) (Yelton et al., 1981, Hybridoma 1:5-11), und WT31 (färbt α,β-TCR-Lymphozyten stark an) (Spits et al., 1985, J. Immunol. 135:1922-1928). Anti-Cγb-Peptidserum (Anti-γTCR) wurde generiert gegen ein 22 Aminosäuren umfassendes synthetisches Peptid(Gln-Leu-Asp-Ala-Asp-Val-Ser-Pro-Lys-Pro-Thr-Ile-Phe-Leu- Pro-Ser-Ile-Ala-Glu-Thr-Lys-Cys) (Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/00209, veröffentlicht am 14. Januar 1988).

8.1.2. ZELLINIEN

PEER (Weiss et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:6998- 7002) und MOLT-13 (isoliert von J. Minowada, Loh et al., 1987, Nature 330:569-572) sind leukämische T-Zell-Linien. Der aus Blut der Nabelschnur abgeleitete Klon WM-14 (Alarcon et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3861-3865) und die aus peripherein Blut abgeleitete Zellinie IDP2 (Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149; Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/00209, veröffentlicht am 14. Januar 1988) und der vom Thymus abgeleitete Klon II (Bank et al., 1986, Nature 322:179- 181) wurden wie zuvor beschrieben kultiviert. Die aus peripherem Blut abgeleitete Zellinie 2 (PBL-L2) wurde isoliert durch Sortierung von aus peripherem Blut isolierten Lymphozyten, die sich mit dem mAb WT31 nicht anfärben ließen. Die isolierten Zellen wurden anschließend in vitro im Medium RPMI 1640 expandiert, welches mit 10 % (Vol./Vol.) konditioniertem Medium enthaltend IL-2 und 10 % (Vol./Vol.) humanem Serum angereichert war, und sie wurden alle 3 Wochen mit bestrahlten autologen Nährzellen stimuliert.

8.1.3. JODIERUNG UND IMMUNPRÄZIPITATION

2 x 10&sup7; Zellen wurden isoliert durch Ficoll-Diatrizoat (Organon Teknika Corp.)-Zentrifugation und sie wurden auf Eis joniert in 0,5 ml Phosphat-gepufferter Saline, pH-Wert 7,4 (PBS), enthaltend 1 mM MgCl&sub2;, 5 mM Glukose, durch Zugabe von 100 ug Lactoperoxidase (80-100 U/mg, Sigma) und 1 mCi Na¹²&sup5;I (New England Nuclear). In Abständen von 5 Minuten über eine Reaktionsdauer von insgesamt 30 Minuten wurden 10 ul einer 0,03 %-igen Wasserstoffperoxidlösung zugegeben. Die Zellen wurden über Nacht in mit Detergens angereicherter TBS (50 mM Tris-Base pH-Wert 7,6, 140 mM NaCl) gelöst, welche 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma) und 8 mM Jodacetamid (IAA, Sigma) enthielt. Wie angegeben, waren die in dieser Untersuchung eingesetzten unterschiedlichen Detergenzien 0,3 % (Gew./Vol.) 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propan-sulfonat (CHAPS, Sigma), 1 % (Gew./Vol.) Digitonin (Aldrich) und Triton X-100 (TX-100, Sigma). Nach einer Zentrifugation für 20 Minuten mit 10 000 x g zur Entfernung unlöslichen Materials wurden die Detergenslysate vorgeklärt durch eine 30-minütige Inkubation mit 4 ul normalem Kaninchenserum (NRS) und 400 ul Kulturmedium des Hybridoms 187.1, gefolgt durch Zugabe von 200 ul einer 10 %-igen (Gew./- Vol.) Zellsuspension von fixiertem Staphylococcus aureus Cowan I (Pansorbin, Calbiochem). Nach einer einstündigen Inkubation wurde Pansorbin durch Zentrifugation entfernt. Die spezifischen Präzipitationen erfolgten durch Zugabe von 0,25 ul βF1-Aszites, 1 ul 1 mg/ml Anti-Leu 4 oder 0,25 ul P3-Aszites, zusammen mit 150 ul vom Überstand der Kultur 187.1 zu jeder Probe, gefolgt von einer einstündigen Inkubation. 100 ul 10 %-ige (Vol./Vol.) Protein A-Sepharose (Pharmacia) wurden zugegeben, und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 4 ºC belassen. Die Immunpräzipitate wurden fünfmal mit 0,1 % (Vol./Vol.) Triton X-100 enthaltend TBS gewaschen und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970, Nature 227:680-685) analysiert.
Für die Immunpräzipitationen mit dem Anti-Cγb-Peptidserum wurden die jodierten Zellen in 1 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) enthaltend TBS gelöst und anschließend 3 Minuten lang gekocht. Nach dem Abkühlen wurden 5 Volumina 2 % (Vol./Vol.) Triton X-100 in TBS enthaltend PMSF und IAA zugegeben, zusammen mit 200 ul einer Mischung von 1 mg/ml Desoxyribonuklease (DNAse) und 0,5 mg/ml RNAse in 50 mM MgCl&sub2;. Die Schritte zur Vorklärung und Immunpräzipitation erfolgten wie oben dargelegt, wobei die Zugabe des mAb 187.1 unterblieb. Die Immunpräzipitate wurden gewaschen in TBS enthaltend 0,5 % (Vol./Vol.) Triton X-100, 0,5 % (Gew./Vol.) Desoxycholat (DOC), 0,05 % (Gew./Vol.) SDS. Triton und Sepharose sind Warenzeichen.

8.1.4. BIOSYNTHETISCHE MARKIERUNG

4 x 10&sup7; exponentiell wachsende Zellen wurden in 4 ml Methioninund Cystein-freiem RPMI 1640 (Select-Aminkit, Gibco), angereichert mit 10 % dialysiertem fötalem Kälberserum (FCS) und 20 mM Hepes, resuspendiert. Nach einer Fastenzeit von 30 Minuten bei 37 ºC wurden 1 mCi 35S-Methionin und 1 mCi ³&sup5;S-Cystein zugegeben, und die Inkubationszeit zur Markierung betrug 15 Minuten. Die Zellen wurden geernted und in 2 % (Vol./Vol.) Triton X-100, TBS, gelöst. Die Schritte zur Vorklärung und Immunpräzipitation erfolgten wie oben dargelegt. Die Immunpräzipitate wurden viermal mit 0,5 % (Vol./Vol.) Triton X-100, 0,5 % (Gew./Vol.) Desoxycholinsäure, 0,05 % (Gew./Vol.) SDS, TBS, gewaschen, gefolgt von drei Waschschritten mit 0,5 % (Vol./Vol.) Triton X-100, 0,5 M NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH-Wert 7,6. Die Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert und nach bekannten Verfahren der Fluorographie sichtbar gemacht (Bonner und Laskey, 1974, Eur. J. Biochem. 46:83-88).

8.1.5. GELAUFREINIGUNG VON δ-TCR-PROTEINEN

Oberflächen-jodierte Zellen wurden gelöst in 0,3 % (Gew./Vol.) CHAPS-TBS und wurden unter Verwendung von 50 ul Anti-Leu4-gekoppelten Sepharosekügelchen immunpräzipitiert. Die immunpräzipitierten Spezies wurden mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt, und das nasse Gel wurde 24 Stunden lang bei 4 ºC mit einem XAR-5-Film (Kodak) exponiert, um die radioaktiv markierten δ-TCR-Proteine sichtbar zu machen. Die Gelregionen, die mit δ-TCR korrespondierten, wurden herausgeschnitten, in 5 % (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol enthaltend Probenpuffer inkubiert, und ein zweites Mal durch SDS-PAGE aufgetrennt. Aufgrund der charakteristischen Veränderung der Mobilität in SDS-PAGE nach Reduktion, konnte das δ-TCR-Protein abgetrennt und anschließend von verunreinigenden Substanzen gereinigt werden. Die TCR-Proteine wurden aus den Gelstreifen eluiert durch Inkubation über Nacht bei 37 ºC in 0,05 % (Gew./Vol.) SDS, 50 mM Ammoniumbicarbonatpuffer und lyophilisiert.

8.1.6. ENDOGLYKOSIDASE-SPALTUNG

Für die Spaltungen mit Endoglykosidase H (Endo H) wurde das immunpräzipitierte Material oder das mittels Gel gereinigte Protein 3 Minuten lang in 40 ul einer 1 %-igen (Gew./Vol.) SDS- Lösung enthaltend 0,14 M 2-Mercaptoethanol gekocht. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung mit 360 ul 0,15 M Acetatpuffer, pH- Wert 5,5, enthaltend 1 mM PMSF, verdünnt. 5 ul Endo H (1 U/ml Endo-β-N-acetylglucosaminidase H, Genzyme) wurden 14 Stunden lang bei 37 ºC mit einer Hälfte der obigen Lösung inkubiert, während die andere Hälfte Mock-behandelt wurde.
Für die Spaltung mit N-Glykanase (N-GLY) wurde das mittels Gel gereinigte Material 3 Minuten lang in 35 ul 0,5 % (Gew./Vol.) SDS, 0,10 M 2-Mercaptoethanol, gekocht. Anschließend wurden 100 ul 0,2 M Natriumphosphat (pH-Wert 8,6), 1,25 % (Vol./Vol.) Triton X-100 zugegeben. Eine Hälfte der Mischung wurde mit 1 ul N-Glykanase (250 U/ml, Peptid-N-[N-acetyl-β-glucosaminyl]asparaginamidase; Genzyme) für 16 Stunden bei 37 ºC inkubiert, während die andere Hälfte Mock-behandelt wurde.
Nach der Spaltung wurden 10 ug bovines Serumalbumin als Träger zugegeben, und die Proben wurden durch Fällung mit Trichloressigsäure rückgewonnen. Die Proteinniederschläge wurden in Probenpuffer enthaltend 5 % (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol aufgenommen.

8.1.7. HERSTELLUNG DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS Anti-Cγm1

Unter Verwendung der BamHI- und PstI-Stellen an den Nukleotidpositionen 571 und 848 wurde ein Teil der Cγ CI- und CII-Exons von HPB-MLT pTγ-1 isoliert (Dialynas et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2619-2623) und in den Expressionsvektor pRIT2T (Pharmacia) kloniert. Das resultierende Protein A-Fusionsprotein wurde in E. coli N4830 exprimiert. Die Bakterien wurden mit Lysozym lysiert, und das Fusionprotein wurde isoliert durch Reinigung über eine IgG Sepharose-Säule. Mäusen wurden an den Tagen 0, 7 und 28 100 ug des Fusionsproteins in Freund's Adjuvans intraperitoneal injiziert. 28 Tage später wurden 100 ug des Fusionsproteins in PBS intravenös injiziert. 3 Tage später wurden die Splenozyten isoliert und mit dem Hybridom P3X63Ag8.653 wie beschrieben fusioniert (Brenner et al., 1987, J. Immunol. 138:1502-1509). Die Hybridome wurden abgesucht durch Enzym-gekoppelten Immunoassay (ELISA). Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden (LINBRO, Flow Laboratories) wurden über Nacht mit 0,4 ug des Fusionsproteins oder mit nicht-fusioniertem Protein in PBS inkubiert. Die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden bei 23 ºC mit 0,25 mg/ml normalem Kaninchen-IgG (Sigma) in PBS enthaltend 50 % (Vol./Vol.) FCS blockiert. 50 ul Hybridom-Überstand wurden für 1 Stunde bei 4 ºC zugegeben, gefolgt von einer ähnlichen Inkubation mit 50 ul einer 5 ug/ml Lösung von Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus IgG (Cappel). Alle beschriebenen Inkubationen wurden durch Waschschritte unterbrochen, wobei 10 % (Vol./Vol.) FCS, 0,1 % (Gew./Vol.) BSA und PBS verwendet wurden. Der ELISA wurde mit 0,08 % (Gew./Vol.) O-Phenylendiamin (Sigma) in 0,012 % (Gew./Vol.) Wasserstoffperoxid enthaltend Phosphat- Citrat-Puffer, pH-Wert 5,0, entwickelt.
Obgleich Anti-Cγm1 (IgG&sub1;) weder den nativen γ,δ-TCR/CD3-Komplex in der cytofluorographischen Analyse noch das γ,δ-TCR-Heterodimer von in Triton X-100 gelösten Zellen bei der Immunpräzipitation erkennt, erkennt er den biosynthetisch markierten γ-TCR- Vorläufer und die reifen γ-TCR-Proteine nach Trennung der CD3/γ,δ-TCR-Proteine in einzelne Ketten. Auf diese Weise wurde gezeigt, daß Anti-Cyml das γ-TCR-Protein nach Trennung des CD3/γ,δ-TCR-Komplexes in einzelne Ketten durch Kochen von Anti-CD3- Immunpräzipitaten in 1 % (Gew./Vol.) SDS in TBS erkennt (Fig. 12, Spur 3).

8.1.8. ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG EINES MOLT-13 γ-TCR cDNA-Klons

Poly(A)&spplus;-RNA wurde aus MOLT-13-Zellen durch Fällung mit Harnstoff/Lithiumchlorid und anschließender Oligo (dT) Cellulose- Affinitätschromatographie hergestellt. Aus der Poly(A)&spplus;-RNA wurde nach dem Verfahren von Huyn et al.,1985 (DNA Cloning, D.M. Glover, Her. IRL Press, Oxford, I:49-78) eine λgt 10 cDNA-Bibliothek hergestellt unter Verwendung von Mung Bean Nuclease für die Spaltung der Haarnadelschleife (McCutcham et al., 1984, Science 225:626-628). Die cDNA-Bibliothek wurde im E. coli-Stamm C600 Hf1 amplifiziert und mittels Plaque-Filterhybridisierung mit ³²P-markiertem PTγI abgesucht (Dialynas et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:2619-2623). Positive Klone wurden hinsichtlich ihrer Größe und Restriktionsenzymkartierung analysiert, und der cDNA-Klon M13k wurde zur Sequenzierung ausgewählt. Die cDNA von M13k wurde aus dem Phagen λgt 10 mit der Endonuklease EcoRI herausgeschnitten und mit geeigneten Restriktionsenzymen weiter verdaut. Die Fragmente wurden in M13-Vektoren subkloniert und unter Anwendung des Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahrens (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467) sequenziert unter Verwendung der modifizierten T7 Polymerase (Sequenase, United States Biochemical Corp.).
Der Klon M13k korrespondiert mit einem vollständigen, im Leserahmen liegenden γ-TCR-Transkript, welches 36 Nukleotide der 5'- nicht-translatierten Region und 72 Nukleotide der 3'-nicht-kodierenden Region einschließt (Fig. 14). Die Nukleotidsequenz der V-Region ist identisch mit der genomischen Vγ1.3-Sequenz (Nomenklatur Lefranc et al., 1986a, Cell 45:237-246; Strauss et al., 1987, Science 237:1217-1219) mit Ausnahme eines Austausches des Nukleotids 53 in der putativen Signalsequenz von C zu T (Ile zu Val). Die J-Region ist identisch mit der Jγ2.3-Sequenz (Nomenklatur basiert auf Lefranc et al., 1986b, Nature 319:420-422; Quertermous et al., 1987, J. Immunol. 138:2687-2690). Interessanterweise tauchen an der V-J-Verbindungsstelle 8 Nukleotide auf, welche nicht von den genomischen V- oder J-Sequenzen kodiert zu werden scheinen und vermutlich eine N-Region repräsentieren. Die Sequenzen der C-Region stimmen mit der korrespondierenden genomischen Sequenz (Lefranc et al., 1986c, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9596-9600) überein mit Ausnahme der Nukleotide 559 (G zu C; Val zu Ile) und 908 (T zu C; Met zu Thr).

8.2. ERGEBNISSE

8.2.1. NEUER γ,δ-TCR-PROTEINKOMPLEX

Erste Studien über γ,δ-TCR-Lymphozyten des peripheren Blutes zeigten die Anwesenheit eines CD3-assoziierten Komplexes, der sich von den bekannten menschlichen γ,δ-TCR-Formen unterschied. Um zu versuchen, die Ableitung dieser Form zu erfahren, stellten wir eine Reihe van aus gesunden menschlichen Spendern abgeleiteten Zellinien her und charakterisierten diese. Die Lymphozyten des peripheren Blutes wurden mit dem monoklonalen Antikörper (mAb) WT31 gefärbt, welcher vorhandene α,β-TCR-Lymphozyten stark anfärbt. Die Zellen, die sich nicht anfärben ließen, wurden mittels Zellsortierung isoliert und anschließend in vitro auf IL-2 enthaltendes Medium ausgebracht. Die auf diese Weise erhaltene Lymphozytenlinie 2 des peripheren Blutes (PBL-L2) erwies sich als homogen für CD3&spplus;CD4&supmin;CD8&supmin;, einem für γ,δ-TCR-Lymphozyten charakteristischer Phänotyp der Zelloberfläche.
Um γ,δ-TCR-Komplexe auf PBL-L2-Zellen sichtbar zu machen, wurden Immunpräzipitationen mit einem Anti-CD3 mAb und mit ¹²&sup5;I Zelloberflächen-markierten Zellen, gelöst in CHAPS oder Digitonin, durchgeführt. In diesen Detergentien wird die physikalische Assoziation zwischen dem CD3-Komplex und den γ,δ-TCR-Untereinheiten bewahrt. Eine SDS-PAGE von Anti-CD3-Immunpräzipitaten von PBL-L2-Zellen ergab Proteine von 40 kD und 44 kD (bezeichnet mit 40 kD), die durch Anti-Cγb-Serum, einem gegen ein γ-TCR-Peptid der konstanten Region (Fig. 11A; s. Methodenabschnitt) gerichtetes Antiserum, als γ-TCR-Untereinheiten identifiziert wurden.
Diese γ-TCR-Proteine auf PBL-L2 sind nicht-kovalent mit einer δ- TRC-Untereinheit assoziiert, welche in dem unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysierten Anti-CD3-Immunpräzipitat als schwach jodiertes Protein sichtbar ist (Fig. 11A, Spur 6, schwarzer Pfeil). Dieses schwach jodierte Protein repräsentiert die δ-TCR-Untereinheit auf PBL-L2-Zellen, da es von Anti-Cγb- Serum nicht erkannt wird (Fig. 11A, Spur 8). Ferner zeigt es bei Vergleich der Analysen unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen dieselbe Veränderung der SDS-Mobilität, wie sie bei δ-TCR-Proteinen auf IDP2- und PEER-Zellen beobachtet worden war (s. u.; s. auch Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/00209, veröffentlicht am 14. Januar 1988). Das δ-TCR-Protein konnte nach Reduktion nicht sichtbar gemacht werden (Fig. 11A, Spur 3), da es mit einer Mobilität von 40 kD migrierte (s. u.) und anschließend von dem γ-TCR-Protein ähnlicher Größe (weißer Pfeil) überdeckt wurde.
Diese γ,δ-TCR-Form ist nicht nur auf normalen T-Lymphozyten des peripheren Blutes vorhanden, sondern sie wird auch auf den Zellen des vom Thyinus abgeleiteten Klon 11 (Fig. 11D) und auf der leukämischen T-Zell-Linie MOLT-13 beobachtet (Fig. 11E). Diese drei Zellinien besitzen γ-TCR-Spezies, die eine differentielle Glykosylierung zeigen, die zu einem γ-TCR-Protein-Doublet, das auf Zellen von PBL-L2 (40 kD und 44 kD; Fig. 11A, Spur 8) und Klon II (40 kD und 44 kD; Fig. 11D, Spur 8) oder zu einer bei MOLT-13-Zellen (40 bis 46 kD; Fig. 11E, Spur 6) beobachteten diffus markierten γ-TCR-Proteinbande führte. Eine zwei-dimensionale Gelanalyse [Ungleichgewichts-pH-Gradienten-Elektrophorese (NEPHGE) gefolgt von SDS-PAGE] der γ-TCR-Proteinbande von MOLT- 13 ergab zwei parallele γ-TCR-Spezies (40 kD und 44 kD), von denen die γ-TCR-Spezies von 44 kD verglichen mit den γ-TCR-Spezies von 40 kD ein mit viel Mannose (oder Hybrid) N-verknüpftes Glykan enthielt. Demgemäß ergaben die γ-TCR-Untereinheiten dieses aus drei verschiedenen Zellquellen (peripheres Blut, Thymus und Leukämie) isolierten Rezeptorkomplexes Zelloberflächenspezies von 40 kD, die mit δ-TCR-Partnerketten nicht-kovalent assoziiert sind.
Zum Vergleich mit der γ,δ-TCR-Form auf Zellen von PBL-L2, dem Klon II und MOLT-13 untersuchten wir die zuvor bekannten Formen auf den Zellinien IDP2 und WM-14. Die IDP2-Zellinie (s. Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/00209, veröffentlicht am 14. Januar 1988; Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149) enthält ein größeres γ-TCR-Protein von 55-60 kD (nachfolgend mit 55 kD bezeichnet), welches durch Anti-Cγb-Serum erkannt wird (Fig. 11B). Wenn das Anti-CD3-Immunpräzipitat unter nicht-reduzierenden Bedingungen untersucht wird, ist es offensichtlich, daß das γ-TCR-Protein von IDP2 nicht-kovalent mit seiner δ-TCR- Partnerkette assoziiert ist (Fig. 11B, Spur 4, schwarzer Pfeil). Bei Reduktion zeigt das δ-TCR-Protein einen Abfall in der Mobilität in der SDS-PAGE auf eine relative Molekülmasse von 40 kD (vgl. Figur 11B, Spur 4, schwarzer Pfeil, mit Fig. 11B, Spur 2, weißer Pfeil).
Im Gegensatz zu den nicht-kovalent assoziierten γ,δ-TCR-Formen trägt der aus peripherem Blut abgeleitete T-Zell-Klon WM-14 ein über Disulfide verknüpftes TCR-Dimer von 40 kD (Fig. 11C, Spur 7), welches von Anti-Cγ-Serum erkannt wurde (Alarcon et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3861-3865). Dieses Dimer wird ferner durch Anti-TCRδ1, einem gegen die δ-TCR-Untereinheit gerichteten mAb erkannt (Fig. 11C, Spur 5) und repräsentiert demgemäß ein γ,δ-TCR-Heterodimer. Eine Analyse unter reduzierenden Bedingungen ergab drei γ-TCR-Proteine von 36 kD, 40 kD und 43 kD (bezeichnet mit 40 kD).
Somit stellt der CD3-assoziierte Komplex auf Zellen von PBL-L2, des Klons II und MOLT-13 ein verglichen mit den zuvor bekannten Formen neues γ,δ-TCR-Heterodimer dar, da seine TCR-γ-Untereinheit 40 kD aufweist (ähnlich der Größe des über Disulfidbrücken verknüpften, von Cγ1 kodierten γ-TCR-Proteins auf WM-14-Zellen), obgleich es mit seiner Partnerkette nicht über Disulfidbrücken verknüpft ist (ähnlich dem 55 kD großen, von Cγ2 kodierten γ- TCR-Protein auf IDP2-Zellen). Um die molekulare Grundlage dieses Komplexes zu verstehen, wurden detailliertere strukturelle Analysen seiner γ-TCR- und δ-TCR-Untereinheiten nach folgender Beschreibung durchgeführt, wobei als Beispiel die Zellinie MCLT-13 verwendet wurde.

8.2.2. GRÖßE DES KERNPOLYPEPTIDS DER γ-TCR-UNTEREINHEIT VON MOLT-13

Um die Größe des γ-TCR-Kernpolypeptids von MOLT-13-Zellen (40 kD γ-TCR-Glykoprotein) zu ermitteln und mit derjenigen von PEER- Zellen (55 kD γ-TCR-Glykoprotein) zu vergleichen, wurden beide Zellinien biosynthetisch 15 Minuten lang in Anwesenheit von ³&sup5;S- Methionin und ³&sup5;S-Cystein markiert, in Triton X-100 gelöst und anschließend immunpräzipitiert mit Anti-Cγm1, einem monoklonalen Antikörper, der die γ-TCR-Kette in spezifischer Weise erkennt (Fig. 13A, s. Methodenabschnitt). Das immunpräzipitierte Material wurde nachfolgend mit Endoglykosidase H (Endo H) gespalten, um die unreifen N-verknüpften Glykane zu entfernen. Das Polypeptidgerüst von γ-TCR von MOLT-13 besitzt eine relative Molekülmasse von 35 kD (Fig 13A, Spur 8) und ist somit 5 kD kleiner als das γ-TCR-Kernpolypeptid von PEER (40 kD; Fig. 13A, Spur 4) oder das γ-TCR-Kernpolypeptid von IDP2 (40 kD; s. Internationale PCT- Veröffentlichung Nr. WO 88/00209, veröffentlicht am 14. Januar 1988). Es kann nunmehr gefolgert werden, daß MOLT-13-Zellen ein γ-TCR-Kernpolypeptid exprimieren, das aufgrund seiner 5 kD kleineren Größe von den γ-TCR-Kernpolypeptiden von IDP2 und PEER abweicht. Zusätzlich sind nur etwa 5-11 kD der Größe des reifen γ-TCR-Zelloberflächen-Glykoproteins von MOLT-13 auf post-translationale Prozesse zurückzuführen (40-46 kD Oberflächengröße minus 35 kD Kerngröße), und 15-20 kD der relativen Molekülmasse können auf post-translationale Prozesse der γ-TCR-Glykoproteine von PEER und IDP2 zurückgeführt werden (55-60 kD Oberflächengröße minus 40 kD Kerngröße). Unter der Annahme, daß sämtliche post-translationalen Prozesse N-verknüpfte Glykane sind, und daß jede Glykankette ungefähr 3 kD an relativer Molekülmasse beiträgt, gehen wir davon aus, daß 2 bis 3 N-verknüpfte Glykane an das γ-TCR-Protein von MOLT-13 angeheftet werden, während an die Polypeptide auf PEER- und IDP2-Zellen 5 N-verknüpfte Glykane angefügt werden. Die Experimente unter Verwendung von N-Glykanase zur Entfernung N-verknüpfter Kohlenhydrate von γ-TCR-Proteinen der Zelloberfläche zeigten, daß die Mehrzahl der post-translationalen Prozesse, durch die das Kernpolypeptid Anheftungen erfährt, tatsächlich N-verknüpfte Glykane betreffen.

8.2.3. PRIMÄRSEOUENZ VON γ-TCR AUS MOLT-13

Um die Struktur des für die γ-TCR-Untereinheit von MOLT-13 kodierenden Gensegments für die konstante Region zu verstehen, wurde die Sequenz eines cDNA-Klons ermittelt, der das γ-TCR- Transkript von MOLT-13 repräsentiert. Ausgehend von aus MOLT-13 abgeleiteter Poly(A)&spplus;-RNA wurde eine λgT10 Bibliothek erstellt und mit einein humanen γ-TCR cDNA-Klon pTγ-1 (Dialynas et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:2619-23) abgesucht. Aufgrund der Größe und der beschränkten Restriktionsenzymkartierung wurde ein Klon M13k ausgewählt, und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt (Fig. 14). Der Klon M13k repräsentiert ein vollständiges γ-TCR-Transkript innerhalb des Leserahmens unter Verwendung eines Vγ1.3-Gensegments, verbunden mit einem Jγ2.3-Gensegment (Lefranc et al., 1986, Cell 45:237-246; Lefranc et al., 1986, Nature 319:420-422; die Nomenklatur basiert auf Strauss et al., 1987, Science 237:1217-1219; Quertermous et al., 1987, J. Immunol. 138:2687-2690). Die Sequenz der konstanten Region erwies sich als nahezu identisch mit einem vor kurzem veröffentlichten nicht-funktionellen γ-TCR (Pellici et al., 1987, Science 287:1051-1055) und mit der zwei CII-Exonkopien b und c enthaltenden genomischen Cγ2-Sequenz (Lefranc et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9596-9600) (s. Methodenabschnitt zur näheren Erläuterung). Diese repräsentiert das erste Transkript innerhalb des Leserahmens, welches für ein auf der Zelloberfläche exprimiertes γ-TCR-Protein kodiert und ein Cγ2-Gensegment mit zwei CII-Exonkopien verwendet.
Aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz dieses cDNA-Klons ergibt sich eine Größe des Polypeptidgerüstes von 34,8 kD, was mit den oben dargelegten biochemischen Daten gut übereinstimmt. Überraschenderweise werden von diesem Transkript sechs potentielle N-verknüpfte Kohlenhydratanheftungsstellen kodiert. Da die biochemischen Daten nahelegen, daß lediglich 2 bis 3 N-verknüpfte Glykane an die Polypeptidkette angeheftet werden, deutet dies darauf hin, daß nicht sämtliche potentiellen Stellen verwendet werden.
Um die Verwendung des Cγ-Gensegments zum Ausdruck zu bringen, haben wir die über Disulfidbrücken verknüpfte und von PB1-C1 und WM-14 als exprimierte γ,δ-TCR-Form mit "Form 1" bezeichnet, da derartige über Disulfidbrücken verknüpfte γ-TCR-Ketten das Cγ1- Gensegment verwenden (Krangel et al., 1987, Science 237:64-67). Die große (55 kD), nicht über Disulfidbrücken verknüpfte γ-TCR- Untereinheit der auf IDP2- und PEER-Zellen exprimierten γ,δ-TCR- Form wird durch Cγ2-Gensegmente kodiert, die drei CII-Exonkopien enthalten, nämlich Kopie a, Kopie b und Kopie c (Krangel et al., 1987, Science 237:64-67; Littman et al., 1987, Nature 326:85- 88), und demgemäß wird diese γ,δ-TCR-Form vorliegend mit "Form 2abc" bezeichnet. In Übereinstimmung hiermit wird die auf MOLT-13-Zellen charakterisierte Form mit "Form 2bc" bezeichnet.

8.2.4. BEVORZUGTE VERWENDUNG DES Cγ-GENSEGMENTS

Um die Anwesenheit dieser drei γ,δ-TCR-Formen in frisch isoliertem peripherem Blut nachzuweisen, analysierten wir die mononukleären Zellen von 10 gesunden Individuen unter Anwendung biochemischer Analysen mit dem mAb Anti-TCRδ1 (beschrieben im obigen Abschnitt 6; reaktiv gegenüber der konstanten δ-TCR-Region). Dieser Antikörper reagiert mit der überwiegenden Mehrzahl, wenn nicht mit allen γ,δ-TCR-Lymphozyten. Repräsentative Ergebnisse dieses Versuches sind in Figur 15 dargestellt. Beim Individium 1 zeigen Anti-TCRδ1-Immunpräzipitate (analysiert unter nicht-reduzierenden Bedingungen) die Anwesenheit von sowohl über Disulfidbrücken verknüpften γ,δ-TCR-Komplexen in Form einer Proteinbande von 70 kD (Form 1) als auch von nicht über Disulfidbrücken verknüpften γ,δ-TCR-Komplexen in Form einer breiten Proteinbande von 40 kD (Form 2bc) (Fig. 15, Spur 2). Dies zeigt, daß sowohl die konstante Cγ1- als auch die Cγ2-Region bei dem in diesem Individium exprimierten γ,δ-TCR verwendet werden. Die Menge an Form 2bc variierte jedoch bei den Individuen. Man beachte die verglichen mit dem Individium 1 kleinere Fraktion der Form 2bc im Individium 2 durch Vergleich der Intensität der Proteinbanden von 40 kD beider Individuen (vgl. Spur 2 des Individiums 2 mit Spur 2 des Individiums 1). Noch auffallender ist, daß auf den mononukleären Zellen von 3 der 10 untersuchten Individuen selbst nach langer Exposition der Autoradiographien lediglich über Disulfidbrücken verknüpfte γ,δ-TCR-Komplexe nachgewiesen werden konnten (s. Individium 3). Keines der analysierten Individuen verfügte im peripheren Blut über den nicht über Disulfidbrücken verknüpften γ,δ-TCR-Komplex (Form 2abc) von 55 kD.

8.2.5 CHARAKTERISIERUNG DER δ-TCR-UNTEREINHEIT

Im Gegensatz zu den auffallenden strukturellen Unterschieden in der Größe und Glykosylierung der γ-TCR-Proteine erwiesen sich die δ-TCR-Untereinheiten aus verschiedenen Zellquellen als ausgesprochen ähnlich. Die relative Molekülmasse des δ-TCR-Glykoproteins auf MOLT-13-Zellen wurde unter Anwendung des mAb Anti- δTCR direkt mit 40 kD bestimmt (Fig. 12, Spur 4), wodurch bestätigt wird, daß er eine ähnliche Größe aufweist wie das δ-TCR- Glykoprotein auf IDP2-Zellen (Fig. 11B, Spur 2, weißer Pfeil).
Um auch die Gerüstgrößen des δ-TCR-Polypeptids zu vergleichen, wurde das mit ¹²&sup5;I Zelloberflächen-markierte δ-TCR-Protein von MOLT-13-Zellen zur Entfernung von Asparagin-verknüpften Glykanen (des stark mannosehaltigen, Hybrid- und Komplex-Typs; Tarentino et al., 1985, Biochem. 24:4665-4671; Hirani et al., 1987, Anal. Biochem. 162:485-492) mit N-Glykanase gespalten. Die δ-TCR-Kernpolypeptide von MOLT-13-Zellen besitzen eine relative Molekülmasse von 35 kD (Fig. 13B, Spur 4), ähnlich derjenigen des δ- TCR-Gerüstes von IDP2-Zellen (35 kD) (Band et al., 1987, Science 238:682-684).
Zusätzlich führte eine Spaltung des mit ¹²&sup5;I Zelloberflächenmarkierten δ-TCR-Proteins von MOLT-13 mit Endoglykosidase H (Endo H, entfernt lediglich im starken Maße mannosehaltige und bestimmte Hybrid-N-Glykane; Tarentino et al., 1974, J. Biol. Chem. 249:811-817; Trimble and Maley, 1984, Anal. Biochem. 141:514-522) zu einer Verminderung der relativen Molekülmasse um 2,5 kD (Fig. 13B, Spur 2), was mit der Anwesenheit eines Kohlenhydratrestes übereinstimmt, wodurch an dem Polypeptid gegenüber Endo H resistente Kohlenhydrate im Umfang einer relativen Masse von 2,5 kD verbleiben. Da es in der konstanten Domäne von δ-TCR zwei potentielle N-Glykan-Anheftungsstellen gibt (S. Hata et al., 1987, Science 238:678-682; Loh et al., 1987, Nature 330:569-572), zeigen diese Daten, daß beide verwendet werden, aber daß ihre N-Glykane unterschiedlich prozessiert werden, nämlich eins als N-Glykan mit hohem Mannoseanteil (Endo H-sensitiv) und daß andere als komplexes N-Glykan (Endo H-resistent, aber N-Glykanase-sensitiv). Im Gegensatz zu den unterschiedlichen Mengen an angehefteten N-verknüpf ten Kohlenhydraten bei γ- TCR-Polypeptidketten ergaben die auf PEER-, IDP2- und MOLT-13- Zellen exprimierten δ-TCR-Untereinheiten alle dieselbe Größe des Peptidkerns und die Anwesenheit von zwei N-verknüpf ten Glykanen (Fig. 13B und nicht gezeigte Daten).

8.3. DISKUSSION

In diesem Beispiel werden drei Proteinformen des menschlichen γ- TCR-Glykoproteins verglichen, nämlich das über Disulfidbrücken verknüpfte γ-TCR-Protein von 40 kD (Form 1), das nicht über Disulfidbrücken verknüpfte γ-TCR-Protein von 55 kD (Form 2abc), und das nicht über Disulfidbrücken verknüpfte γ-TCR-Protein von 40 kD (Form 2bc). Sämtliche dieser drei Formen sind mit einer δ- TCR-Untereinheit assoziiert. Die komplementären DNA-Sequenzen, die die ersten beiden γ-TCR-Formen repräsentieren, sind zuvor veröffentlicht worden (Krangel et al., 1987, Science 237:64-67; Littman et al., 1987, Nature 326:85-88). Die konstante Region des γ-TCR-Polypeptids Form 1 (auf PBL-C1) wird durch das ein einziges CII-Exon enthaltende Cγ1-Gensegment kodiert, während das γ-TCR-Polypeptid Form 2abc (auf IDP2- und PEER-Zellen) das Cγ2-Gensegment verwendet, welches die CII-Exonkopien a, b und c enthält. Es wurde gezeigt, daß die mit einer γ-TCR-Kette der Form 2bc korrespondierende cDNA-Sequenz ein Cγ2-Gensegment enthält, welches lediglich zwei CII-Exonkopien verwendet, nämlich die Kopien b und c. In ähnlicher Weise ist es wahrscheinlich, daß die Genstruktur der γ-TCR-Konnektorregion des Klons II und von PBL-L2 (nicht über Disulfidbrücken verknüpftes γ-TCR-Protein von 40 kD) ebenfalls der vorliegend bestimmten Struktur der Form 2bc bei MOLT-13 ähnlich ist. Da die verwendete konstante Region von δ-TCR bei all diesen Formen dieselbe ist (S. Hata et al., 1987, Science 238:678-682; E.Y. Loh et al., 1987, Nature 330:569-572), kann ein vollständiger Vergleich der Strukturen der drei γ,δ-TCR-Formen im Menschen nunmehr durchgeführt werden (Fig. 16).
Der Mensch verfügt über zwei polymorphe genomische Formen von Cγ2 (Lefranc et al., Nature 319:420-422; Pellici et al., 1987, Science 237:1051-1055). Die beiden Transkriptformen (Form 2abc und Form 2bc) sind vermutlich Produkte dieser unterschiedlichen allelischen Typen. Bis heute sind in Mäusen keine allelischen Formen von γ-TCR-Polypeptiden gefunden worden. Wir folgern daraus, daß der dramatische Unterschied in der Größe des Zelloberflächenproteins γ-TCR zwischen der Form 2abc (55 kD) und der Form 2bc (40 kD) weitgehend durch die Menge an angehefteten, N- verknüpften Kohlenhydraten festgelegt wird, wodurch höchstwahrscheinlich die Anzahl an N-verknüpften Glykanen wiedergespiegelt wird. Auf der Grundlage von SDS-PAGE sind die Gerüstgrößen der IDP2-γ-TCR (Form 2abc)- und MOLT-13-γ-TCR- (Form 2bc)-Proteine mit 40 kD bzw. 35 kD gemessen worden, wobei die Werte gut mit ihren auf der Grundlage der cDNA-Sequenzen berechneten Molekülmassen von 36,6 kD bzw. 34,8 kD übereinstimmen. Es ist klar, daß dieser kleine Unterschied in der Größe des Gerüstes (5 kD in der SDS-PAGE), der hauptsächlich auf das vom CII-Exon kodierte Peptid von 16 Aminosäuren zurückzuführen ist, zwar zum beobachteten Unterschied in der Molekülmasse zwischen den nicht über Disulfidbrücken verknüpften γ-TCR-Oberflächenformen von 55 kD und 40 kD beitrug, diesen Unterschied aber nicht allein erklärte. Die γ-TCR-Polypeptide der Form 2abc besitzen 5 potentielle N- verknüpf te Glykananheftungsstellen, welche vermutlich alle verwendet werden, wohingegen das γ-TCR-Polypeptid von MOLT-13 eine zusätzliche potentielle Anheftungsstelle trägt, während es lediglich 2 bis 3 N-verknüpfte Glykane aufweist. Der Grund für diese beschränkte Verwendung potentieller Anheftungsstellen ist unbekannt, er kann aber aus dem Einfluß der vom CII-Exon kodierten Peptide auf die Konformation des γ-TCR-Proteins resultieren. Die durch das CII-Exon kodierten Peptide und ihre benachbarten Aminosäuren bilden eine Konnektorregion zwischen der Plasmamembran und der Immunglobulin-ähnlichen konstanten Domäne. Diese Region enthält die meisten der N-verknüpften Glykananheftungsstellen (Fig. 17). Wie folgern, daß die CII-Exonkopien die Proteinform nicht nur durch die Festlegung der Größe des Polypeptidgerüstes und durch Schaffung der Fähigkeit zur Ausbildung über Disulfidbrücken verknüpfter Ketten, sondern auch durch die Beeinflussung der Menge an angehefteten Kohlenhydraten bestimmen.
Die δ-TCR-cDNAs von IDP2- (Hata et al., 1987, Science 238:678- 682), PEER- (Loh et al., 1987, Nature 330:569-572) und MOLT-13- Zellen sind sequenziert worden und erwiesen sich als identisch mit Ausnahme der Verschiedenheits/N-Region, die zwischen den Genseginenten für die variable und konstante Region liegt. Das δ- TCR-Protein von WM-14-Zellen weist eine relative Molekülmasse von 43 kD auf und ähnelt somit dem zuvor beschriebenen δ-TCRProtein (Borst et al., 1987, Nature 325:683-688; Lanier et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1076-1094), aber es ist um 3 kD größer als die anderen δ-TCR-Ketten. Diese δ-TCR-Proteine von 43 kD könnten auf die Anwesenheit einer zusätzlichen N-verknüpften Glykosylierungsstelle in einer unterschiedlichen variablen δ- Domäne hinweisen.
Für die α-TCR- und β-TCR-Gene sind keine strukturellen Unterschiede beobachtet worden, die mit den für die γ-TCR-Segmente der konstanten Region beschriebenen vergleichbar sind (Yoshikai et al., 1985, Nature 316:837-840; Toyonaga et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:8624-8628; Royer et al., 1984, J. Exp. Med. 160:947-952; Kronenberg et al., 1985, Nature 313:647- 653). Es existiert eine mögliche strukturelle Ähnlichkeit zwischen der Anzahl von Wiederholungen des menschlichen CII-Exons und der Länge in murinen Cγ-Regionen, von denen die konstanten Cγ1-, Cγ2- und Cγ4-Regionen für Konnektorregionen von 15, 10 bzw. 33 Aminosäuren kodieren (Garman et al., 1986, Cell 45:733- 742; Iwamoto et al., 1986, J. Exp. Med. 163:1203-1212). Die Konnektorregionen in der Maus reflektieren jedoch einen Unterschied in der Größe des relevanten Exons, nicht aber der multiplen Verwendung von Exons, wie sie bei γ-TCR Form 2abc und γ-TCR Form 2bc des Menschen beobachtet wurde. Ferner existiert der murine γ-TCR gegenüber den beiden nicht über Disulfidbrücken verknüpften menschlichen Formen lediglich in über Disulfidbrükken verknüpften Formen.
Es ist wichtig darauf hinzuweisen, daß die menschlichen γ,δ-TCR- Formen nicht gleichmäßig verwendet zu werden scheinen. Bei einigen Individuen (ausgewählt aufgrund hoher Gehalte an γ,δ-TCR- Lymphozyten) dominiert eine einzige Form (Form 1), was darauf hindeutet, daß es entweder eine positive Selektion für diese Form gibt, oder daß eine Selektion gegen andere γ,δ-TCR-Formen vorliegt.

9. DREI ISOTYPE FORMEN DES γ,δ-T-ZELL-REZEPTORS, REKONSTRUIERT DURCH PAARUNG VON VERSCHIEDENEN TRANSFIZIERTEN γ-TCR-KETTEN MIT EINER EINZIGEN δ-TCR-UNTEREINHEIT

Wie im vorliegenden Beispiel beschrieben wird, wurde die Funktion des γ-TCR-Polypeptids bei der Bildung des γ,δ-Heterodimers untersucht. Auf dem Wege der Transfektion untersuchten wir die γ,δ-TCR-Komplexe, die durch Assoziation der mit den drei γ,δ- TCR-Formen (Form 1, 2abc und 2bc) korrespondierenden γ-TCR-Ketten mit einer einzigen residenten δ-TCR-Kette gebildet wurden. Die Zellinie MOLT-13, die konstitutiv ein γ,δ-TCR-Heterodimer exprimiert, welches aus dem γ-TCR-Polypeptid Form 2bc und damit nicht kovalent assoziiertem δ-TCR-Polypeptid besteht, wurde mit γ-TCR-DNA transfiziert, die entweder für die Form 1 oder die Form 2abc des γ-TCR-Polypetids kodiert. Die transfizierten Zellen waren in der Lage, zusammen mit dem für die Zellinie MOLT-13 charakteristischen y,δ-TCR y,δ-Heterodimere zu exprimieren, die entweder aus der γ-TCR Form 2abc, nicht-kovalent mit δ-TCR assoziiert, oder der γ-TCR Form 1 bestanden, die kovalent mit δ-TCR verknüpft ist. Ferner war die Glykosylierung der transfizierten y-TCR-Genprodukte identisch mit der Glykosylierung dieser Gene in ihren nativen Zellinien. Demgemäß sind das Ausmaß der Glykosylierung und die Fähigkeit zur Bildung von Disulfidbindungen Eigenschaften, die durch das γ-TCR-Gen festgelegt werden. Die Verwendung des CII-Exons für die konstante Region von γ-TCR bestimmt nicht nur die Anwesenheit oder Abwesenheit von Disulfidbindungen zwischen TCR-γ und δ-Polypeptiden, sondern auch die Menge an Kohlenhydraten, die an die γ-TCR-Kette angeheftet werden, welche für die Unterschiede in der Größe der γ-TCR-Zelloberflächenproteine weitgehend verantwortlich sind.

9.1 MATERIALIEN UND METHODEN

9.1.1. ZELLINIEN

MOLT-13, eine TCR-y,δ&spplus;-T-Leukämie-Zellinie (S. Hata et al., 1987, Science 238:678-682; E.Y. Loh et al., 1987, Nature 330:569-572) sowie die aus peripherem Blut abgeleiteten TCR-y,δ&spplus;-Zellinien PBL C1 (M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694) und IDP2 (M.B. Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149) wurden wie zuvor beschrieben kultiviert.

9.1.2. ANTIKÖRPER

Die verwendeten monoklonalen Antikörper (mAb) waren: Anti-Leu-4 (Anti-human CD3: IgG1) (J.A. Ledbetter et al., 1981, J. Exp. Med. 153:310-323), Anti-TCRδ1 (Anti-konstante Region der humanen TCR-δ-Kette; IgG1) (s. Abschnitt 6; H. Band et al., 1987, Science 238:682-684), Anti-Ti-γA (Anti-Vγ2; IgG2a) (S. Jitsukawa et al., 1987, J. Exp. Med. 166:1192-1179; Anti-Cγm1 (anti-humaner γ-TCR, konstante Region; s. Abschnitt 8.1.7), P3 (IgG1, sekretiert vom Myelom P3X63Ag8) (G. Koehler und C. Milstein, 1975, Nature 256:495-497), und 187.1 (Anti-Maus leichte κ-Kette- spezifisch, Ratte) (D.E. Yelton et al., 1981, Hybridoma 1:5-11).

9.1.3. ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG DER δ-TCR cDNA-KLONE VON MOLT-13

Eine aus Poly(A)&spplus;-RNA von MOLT-13 im Vektor λgt10 (Huynh et al., 1985, in DNA Cloning, Her. D.M. Glover (IRL Press, Oxford), Band 1, Seiten 49-78) hergestellte komplementäre DNA (cDNA)- Bibliothek wurde einem Screening zugeführt durch Hybridisierung mit dem mit ³²P markierten humanen δ-TCR cDNA-Klon IDP2 0-240/38 (Hata et al., 1987, Science 238:678-682). Die Klone wurden zur detaillierten Analyse auf der Grundlage der Größe und beschränkten Restriktionsenzymkartierung ausgewählt. Die Nukleotidsequenz wurde in M13-Vektoren unter Anwendung des Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahrens (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467) unter Verwendung der modifizierten T7 Polymerase (Sequenace, United States Biochemical Corp.) (Potter et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:7161-7165) bestimmt.

9.1.4. HERSTELLUNG VON EXPRESSIONSPLASMIDEN UND TRANSFEKTIONEN

γ-TCR-cDNAs (PBL C1.15 und IDP2.11r) (M.S. Krangel et al., 1987, Science 237:64-67) wurden in den Säugerexpressionsvektor pFneo (T. Saito et al., 1987, Nature 325:125-130; P. Ohashi et al., 1985, Nature 316:606-609) stromabwärts der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Friend Spleen Focus Forming Virus (SFFV) kloniert, wie schematisch in Figur 10B dargestellt. MOLT-13- Zellen wurden mit den Plasmidkonstrukten transfiziert durch Elektroporation (H. Potter et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci 81:7161-7165). Die Transfektanten wurden selektiert und gehalten in einem Medium, das 2 mg/ml G418 (480 ug/mg Feststoffe durch Bioassay; Gibco) enthielt, und durch beschränkte Verdünnung kloniert.

9.1.5. JODIERUNG UND IMMUNPRÄZIPITATION

Die Markierung der Zelloberfläche mit ¹²&sup5;I unter Verwendung von Lactoperoxidase, die Lösung in 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]1-propansulfonat (CHAPS; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), die Immunpräzipitation mit verschiedenen Antikörpern, die Ungleichgewichts-pH-Gradienten-Gelelektrophorese (NEPHGE), und die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden wie beschrieben durchgeführt (s. Abschnitt 8.1.3,; M.B. Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149; M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694). Die spezifischen Immunpräzipitationen erfolgten mit 1 ug Anti-Leu-4, 0,1 ug Anti-TCR-δ1-Aszites, oder mit 1 ul P3-Aszites, zusammen mit 150 ul Kulturüberstand von 187.1. Für Anti-T9-γA wurde 1 ul Aszites ohne 187.1 verwendet.

9.1.6. B BIOS?NTHETISCHE MARKIERUNG

Exponentiell wachsende Zellen wurden 30 Minuten lang in Methionin- und Cystein-freiem Medium inkubiert, gefolgt von einer 15- minütigen Pulsmarkierung bei 37 ºC mit ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S-Cystein, und die Immunpräzipitationen wurden wie im obigen Abschnitt 8.1.3. beschrieben durchgeführt. Die Immunpräzipitate wurden entweder mit Endoglykosidase H (Endo H) behandelt oder Mock-inkubiert, durch SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Fluorographie sichtbar gemacht (W.M. Bonner und R.A. Laskey, 1974, Eur. J. Biochem. 46:83-88).

9.2. ERGEBNISSE

Wir untersuchten die aus der Assoziation von strukturell verschiedenen γ-TCR-Genprodukten mit einem einzigen δ-TCR-Protein resultierenden Produkte, um die Funktion des γ-TCR-Gens und insbesondere der CII-Exons von TCR bei der Bestimmung der strukturellen Unterschiede zwischen verschiedenen γ-TCR-Isotypen aufzuzeigen. Hierfür wurde MOLT-13, eine T-Leukämie-Zellinie, welche das nicht über Disulfidbrücken verknüpfte γ-TCR-Polypeptid von 40 kD (Form 2bc) exprimiert, als Rezipient für cDNA- Klone für die γ-TCR-Kette verwendet, welche mit den anderen beiden Formen des Rezeptors (Form 1 und 2abc) korrespondierten. Die vollständigen Sequenzen der diese drei γ-TCR-Ketten repräsentierenden cDNA-Klone sind in Figur 14 (Form 2bc) und von Krangel et al. (1987, Science 237:64-67) (Formen 1 und 2abc) beschrieben und in Figur 18A schematisch dargestellt.

9.2.1. IN DER ZELLINIE MOLT-13 IST EINE EINZIGE FUNKTIONELLE δ-TCR-KETTE VORHANDEN

Studien zur Untersuchung des δ-TCR-Gen-Rearrangements in der Zellinie MOLT-13 (S. Hata et al., 1987, Science 238:678-682) deuteten darauf hin, daß in dieser Zellinie lediglich ein einziges funktionelles δ-TCR-Genprodukt exprimiert wurde. Um jedoch direkt zu zeigen, daß in MOLT-13-Zellen ein einziges funktionelles Transkript für δ-TCR hergestellt wird, wurden cDNA-Klone, die mit einer δ-TCR cDNA-Sonde (S. Hata et al., 1987, Science 238:678-682) kreuz-hybridisierten, aus einer in λgt10 hergestellten MOLT-13 cDNA-Bibliothek isoliert, und die Sequenz der selektierten cDNA-Klone wurde bestimmt. Diese Analyse ergab, daß MOLT-13-Zellen Transkripte exprimieren, die mit einem funktionell rearrangierten und einem aberrant rearrangierten δ-TCR-Gen korrespondieren. Der mit dem funktionell rearrangierten δ-TCR- Gen korrespondierende cDNA-Klon besitzt dieselben V (Vδ1)-, J (Jδ1)- und C-Gensegmente, wie sie zuvor für die Zellinie IDP2 beschrieben wurden (S. Hata et al., 1987, Science 238:678-682). Der δ-TCR cDNA-Klon von MOLT-13 besitzt jedoch eine unterschiedliche Nukleotidsequenz zwischen den V- und J-Genseqmenten, die aus der Verwendung des D-Segments (vermutlich verwendet MOLT-13 lediglich Dδ2), einer unpräzisen Verknüpfung, und einer Verschiedenheit der N-Region an den V-D- und D-J-Verbindungsstellen herrührt (S. Hata et al., 1988, Science 240:1541-1544). Die δ- TCR cDNA von MOLT-13 läßt ferner auf einen Cγsteinrest in der proximal zur Membran gelegenen Konnektorregion des konstanten Genseqments schließen, welcher zur Disulf idbindung der γ-TCR- Genprodukte, die das Cγ1-Gensegment verwenden, verfügbar wäre. Obgleich die Zellinie MOLT-13 einen nicht über Disulfidbrücken verknüpften γ,δ-TCR-Rezeptor exprimiert, ist durch die Anwesenheit eines Cysteinrestes in der proximal zur Membran gelegenen Konnektorregion seiner δ-TCR-Kette die Möglichkeit gegeben, daß diese δ-TCR-Untereinheit in der Lage wäre, entweder an einem nicht über Disulfidbrücken verknüpften oder an einem über Disulfidbrücken verknüpften Komplex beteiligt zu sein.

9.2.2. DIE FORM DES REZEPTORS WIRD DURCH DAS γ-TCR-GENPRODUKT FESTGELEGT

Die mit den γ-TCR cDNA-Konstrukten transfizierten MOLT-13-Zellen wurden abgekürzt mit M13.PBL C1γ (für MOLT-13-Zellen, transfiziert mit PBL C1-abgeleiteter γ-TCR cDNA) und M13.IDP2γ (für MOLT-13-Zellen, transfiziert mit IDP2-abgeleiteter γ-TCR cDNA). Die überwiegende Menge der Transfektanten-Zellinien und von diesen Linien abgeleitete repräsentative Subklone wurden mittels Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von γ-TCR (VJC)- oder Vγ2-spezifischen cDNA-Sonden analysiert. Zusätzlich zu dem residenten MOLT-13 γ-TCR-Transkript von 1,6 Kb wurde in Transfektanten-Linien und ihren Klonen ein zweites γ-TCR-Transkript von etwa 1,8 Kb beobachtet (erwartete Größe für ein γ-TCR-Transkript, welches die SFFV-LTR des Expressionsplasmids initiiert). Das Transkript von 1,8 Kb hybridisierte spezifisch mit einer Vγ2-Sonde, welche mit dem im residenten γ-TCR-'Transkript von MOLT-13 vorhandenen Vγ1.3 nicht kreuz-hybridisierte, und daher repräsentiert das Transkript von 1.8 Kb das Transkript der transfizierten γ-TCR cDNAs (welche ein Vγ2-Segment verwendet).
Um das (die) auf der Oberfläche von Transfektanten exprimierte(n) γ-TCR-Protein(e) biochemisch zu charakterisieren, wurde ein aus jeder Linie abgeleiteter repräsentativer Klon analysiert durch Immunpräzipitation der Oberflächen-jodierten Zellen mit P3 (Kontrolle), Anti-Leu-4 (Anti-CD3), Anti-TCRδ1 (Anti-STCR) oder Anti-Ti-γA mAbs. Anti-Ti-γA (S. Jitsukawa et al., 1987, J. Exp. Med. 166:1192-1197) scheint die y,δ-TCR-Zellen, die das Vγ2- Gensegment als variablen Teil ihrer γ-TCR-Ketten verwenden, spezifisch zu erkennen. Untransfizierte (Fig. 19A) wie auch die transfizierten MOLT-13-Zellen (Fig. 19B und 19C) exprimieren die erwarteten parentalen γ-TCR- (40 kD; s. weißer Pfeil) und δ-TCR- Untereinheiten (s. Sternchen). Man beachte, daß der Anti-Vγ2- spezifische mAb (Anti-Ti-γA) nicht mit der residenten γ-TCR- Kette von MOLT-13 reagiert (Fig. 19A, Spuren 7 und 8). Anti-CD3- Immunpräzipitate der Transfektanten-Zellen M13.PBL C1γ ergaben bei Untersuchung unter nicht-reduzierenden Bedingungen eine zusätzliche CD3-assoziierte Spezies (68 kD) (Fig. 19B, Spur 3, s. schwarzer Pfeil). Sowohl bei den PBL C1-Zellen (Fig. 19D, Spuren 3 und 4) als auch bei der Transfektanten-Zellinie M13.PBL.C1γ (Fig. 19B, Spuren 3 und 4) ergab der Komplex von 68 kD unter Reduktion Spezies von 40 und 36 kD (im Falle des Transfektanten M13.PBL C1γ werden diese Banden im Anti-Vγ2-Immunpräzipitat deutlich sichtbar gemacht, s. Fig. 19B, Spuren 7 und 8, schwarze Pfeile). Diese Spezies von 40 und 36 kD repräsentieren unterschiedlich glykosylierte γ-TCR-Polypeptide (M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694). In diesen Immunpräzipitaten comigriert die δ-TCR-Kette (40 kD, reduziert) mit dem γ- TCR-Polypeptid von 40 kD und wird daher nicht sichtbar gemacht (allerdings, s.u.).
Diese Experimente zeigen den wichtigen Befund, daß die residente δ-TCR-Kette der Zellinie MOLT-13, normalerweise Teil eines nicht über Disulfidbrücken verknüpften Komplexes, mit dem γ-TCR-Protein von PBL C1 assoziiert ist, um in der Transfektanten-Zellinie ein über Disulfidbrücken verknüpftes γ,δ-TCR-Heterodimer zu bilden. Demgegenüber bildete das von IDP2 abgeleitete γ-TCR- Protein (55 kD) in der Transfektanten-Zellinie M13.IDP2 einen nicht über Disulfidbrücken verknüpften Komplex mit der residenten δ-TCR-Kette van MOLT-13 (Fig. 19C, Spuren 3 und 4). Mit Anti-TCRδ1 mAb (spezifisch für δ-TCR-Peptide) erhaltene Immunpräzipitate bestätigten, daß die endogenen (Figuren 19A, D und E, Spuren 5 und 6) als auch die transfizierten γ-TCR-Ketten (Fig. 19B und C, Spuren 5 und 6) von sämtlichen dieser Zellinien direkt mit der δ-TCR-Kette assoziiert wurden. Anti-Ti-γA immunpräzipitierte das über Disulfidbrücken verknüpfte γ,δ-TCR-Heterodimer von 68 kD aus den Transfektanten-Zellen M13.PBL C1 (Fig. 19B, Spuren 7 und 8), und die γ-TCR-Kette von 55 kD, zusammen mit der δ-TCR-Kette von 40 kD von den Transfektanten-Zellen M13.IDP2γ (Fig. 19C, Spuren 7 und 8) in spezifischer Weise, wodurch bestätigt wird, daß die γ-TCR-Ketten, welche Teil dieser Komplexe sind, mit den transfizierten, von PBL C1 bzw. IDP2 abgeleiteten γ-TCR cDNAs korrespondieren.
Um ferner die verschiedenen γ-TCR-Proteine biochemisch zu charakterisieren, wurden zweidimensionale (2D) Gelanalysen (NEPHGE, gefolgt von SDS-PAGE) von mit ¹²&sup5;I Oberflächen-markierten Zellen durchgeführt. Eine Doppelbelichtung der 2D-Muster der residenten (MOLT-13) und transfizierten (PBL C1 oder IDP2) γ-TCR-Ketten in Relation zu den Positionen der CD3-Komponenten ermöglichte einen Vergleich der relevanten γ-TCR-Spezies. In den Immunpräzipitaten von MOLT-13-Zellen wurden die γ-TCR-Ketten in Form zweier unterschiedlicher paralleler Reihen von jodierten Spezies auf getrennt (Fig. 20A, s. weiße Pfeile). Mit den TCR-cDNAs von PBL C1 oder IPD2 transfizierte MOLT-13-Zellen ergaben die Reihe der residenten γ-TCR-Polypeptide von MOLT-13, sie zeigten jedoch zusätzlich radioaktiv markierte Spezies, die hinsichtlich der 2D-Gelmuster identisch mit den γ-TCR-Polypeptiden von PBL C1- (vgl. Figur 20B und D; s. Sternchen in Fig. 20B) bzw. IDP2- (vgl. Fig. 20C und D; s. schwarze Pfeile in Fig. 20C) Zellen waren. Demgemäß bestätigten die biochemischen 2D-Gelanalysen, daß die transfizierten γ-TCR-Ketten in MOLT-13-Transfektanten und in den parentalen Zellinien PBL C1 und IDP2 in ähnlicher Weise exprimiert und prozessiert wurden.

9.2.3. GRÖßEN DER POLYPEPTIDGERÜSTE DER TRANSFIZIERTEN γ-TCR-KETTENPROTEINE

Die Größen der Peptidgerüste der transfizierten γ-TCR-Ketten wurden bestimmt durch Behandlung des von metabolisch pulsmarkierten Zellen immunpräzipitierten Materials mit Endoglykosidase H. Die mit Anti-CγM1 (spezifisch für γ-TCR-Kette) erhaltenen Immunpräzipitate identifizierten in nicht-transfizierten MOLT- 13-Zellen Spezies von 35,5 und 34 kD (Fig. 21, Spur 4), die endogene γ-TCR-Polypeptide von MOLT-13 repräsentieren. Das kleinere dieser beiden Polypeptide (s. weiße Pfeile) korrespondiert mit der erwarteten Polypeptid-Kerngröße des γ-TCR-Polypeptids von MOLT-13, wohingegen das größere Polypeptid ein partiell prozessiertes Intermediat zu repräsentieren scheint. Zusätzlich zu diesen residenten γ-TCR-Polypeptiden von MOLT-13 wurde durch Anti-CγM1 von dem Transfektanten M13.IDP2γ ein Polypeptid mit einer deglykosylierten Größe von 41 kD immunpräzipitiert (Fig. 21, Spur 8. s. schwarzer Pfeil). Die Größe dieses Transfektanten-spezifischen γ-TCR-Polypeptids stimmt mit der zuvor in IDP2-Zellen ermittelten (M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694) deglykosyliertem IDP2 γ-TCR-Polypeptidkerngröße überein. Wie erwartet, ergaben die Transfektanten-Zellen M13.PBL C1γ ein zusätzliches γ-TCR-Protein mit einer deglykosylierten Größe von 32 kD (Fig. 21, Spur 12, s. schwarzer Pfeil), was mit der für die Zellinie PBL C1 zuvor berichteten Größe des γ-TCR- Polypeptidgerüstes gut übereinstimmt (M.B. Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694). Diese Spezies von 32 kD wurde in spezifischer Weise durch den Vγ2-spezifischen mAb Anti-Ti-γA (Fig. 21, Spur 13, s. schwarzer Pfeil) immunpräzipitiert, wodurch es möglich war, zwischen residenten und transfizierten γ-TCR-Spezies in dieser Zellinie eindeutig zu unterscheiden. Demgemäß entsprechen die ermittelten Gerüstgrößen der transfizierten γ-TCR-Ketten, abgeleitet von den Zellinien IDP2 und PBL C1, den Gerüstgrößen dieser Polypeptide in ihren parentalen Zellinien. Durch Vergleich der γ-TCR-Polypeptidkerngrößen mit denjenigen der Zelloberflächenproteine schließen wir, daß die von MOLT-13, IDP2 und PBL C1 abgeleiteten γ-TCR-Ketten 6, 14 bzw. 8 kD N-verknüpfte Kohlenhydrate tragen.

9.3. DISKUSSION

Es existieren drei biochemisch unterschiedliche Strukturformen der menschlichen γ,δ-TCR-Untereinheit. Im Rahmen der vorliegenden Arbeiten haben wir dargelegt, daß sich ein einzelnes δ-TCR- Polypeptid mit γ-TCR-Ketten assoziieren kann, die jede der drei Rezeptorformen repräsentieren, um geeignete γ,δ-TCR-Heterodimere zu rekonstruieren. Das residente γ-TCR-Polypeptid von MOLT-13 (Form 2bc) ist 40 kD groß und nicht-kovalent mit der δ-TCR-Untereinheit assoziiert. Wenn die γ-TCR cDNA-Klone, die mit dem über Disulfidbrücken verknüpften Rezeptor von PBL C1 (Form 1) korrespondieren, oder der nicht über Disulfidbrücken verknüpfte Rezeptor von 55 kD der Zellinie IDP2 (Form 2abc) in die Zellinie MOLT-13 transfiziert wurden, wurden die y,δ-TCR-Formen rekonstruiert, die mit denjenigen korrespondieren, die in den cDNA- Spenderzellinien gefunden wurden. Die vorliegenden Transfektionsstudien liefern einen direkten Nachweis dafür, daß die Verknüpfung über Disulfidbrücken durch die Verwendung des konstanten γ-TCR-Segments festgelegt wird, da gezeigt wurde, daß die residente δ-TCR-Kette von MOLT-13 an einem über Disulfidbrücken verknüpften Rezeptorkomplex mit der aus PBL C1 abgeleiteten γ-TCR-Kette (Form 1) und an einem nicht über Disulfidbrükken verknüpften Rezeptorkomplex mit der von IDP2 abgeleiteten γ- TCR-Kette (Form 2abc) beteiligt ist.
Wir haben gezeigt, daß der bemerkenswerte Größenunterschied zwischen den nicht über Disulfidbrücken verknüpften γ-TCR-Polypeptiden von 55 kD (Form 2abc) und 40 kD (Form 2bc) in erster Linie auf unterschiedliche Mengen von an das γ-TCR-Polypeptidgerüst angehefteten N-verknüpften Kohlenhydraten zurückzuführen ist (s. obiger Abschnitt 8.2.2.). Demgemäß werden diesen γ-TCR- Polypeptiden entweder 15 kD (Form 2abc bei IDP2 oder PEER) oder lediglich 5 kD (Form 2bc bei MOLT-13) N-verknüpfte Kohlenhydrate angeheftet, obgleich dieselbe Anzahl (jeweils 5) an N-verknüpften Glykan-Akzeptorstellen von den bei beiden dieser Formen verwendeten Gensegmenten für die konstante Region kodiert werden. Vier dieser N-verknüpften Glykosylierungsstellen sind in oder um die durch das Exon CII kodierte Konnektorregion herum vorhanden. In dem vorliegenden Beispiel zeigen wir, daß die Menge von an die transfizierten γ-TCR-Proteine angehefteten N- verknüpften Kohlenhydraten identisch ist mit derjenigen ihrer parentalen Zellinien, was auf der Grundlage eines Vergleichs der Peptidkerngröße und der Zelloberflächengröße der reifen Proteinprodukte von transfizierten γ-TCR cDNA-Klonen ermittelt wurde. Demgemäß muß sich die Konformation der beiden durch Cγ2 kodierten Proteinsegmente ausreichend voneinander unterscheiden, um drastische Unterschiede in der Glykosylierung zu ergeben. Der hauptsächliche Unterschied zwischen den Cγ-Segmenten dieser beiden Formen liegt darin, daß die Kopie "a" des CII-Exons in der γ-TCR-Kette von 55 kD der Form 2abc vorhanden ist, der γ- TCR-Kette der Form 2bc von 40 kD jedoch fehlt. Somit kann die Anwesenheit oder Abwesenheit dieser CII-Exonkopie in starkem Maße für die Unterschiede in der Glykosylierung verantwortlich sein, durch die die Größen der γ-TCR-Polypeptide festgelegt werden.
Die strukturelle Variation der isotypen Formen des menschlichen γ,δ-TCRs ist von anderen T-Zell-Rezeptoren nicht bekannt, da beim α,β-TCR keine derartige Parallele beobachtet wird.

10. DER NICHT MIT CD3 ASSOZIIERTE T-ZELLREZEPTOR-γ,δ-KOMPLEX WIRD IDENTIFIZIERT IN HUMANEM DRÜSENEPITHELGEWEBE DES ENDOMETRIUMS

In den frühen Phasen der Plazentaentstehung kommt es in der Nähe spiralförmiger Arterien und Drüsen des Endometriums in mütterlichen Uteringeweben zu einer starken Infiltration von mononukleären Zellen. Diese schließen eine ungewöhnliche Population von T- abgeleiteten Zellen unbekannter Funktion ein. Viele extravillöse Trophoblasten exprimieren einen neuen Typ von Klasse I-MHC-Antigenen, der sich von dem auf den meisten somatischen Zellen exprimierten unterscheidet. Wir haben ein Panel von monoklonalen Antikörpern gegen das TCR-γ,δ-Heterodimer (γ,δ-TCR) in schwangeren und nicht-schwangeren Uteri untersucht. Überraschenderweise wurde der γ,δ-TCR-Komplex in Leukozyten nicht nachgewiesen, er war aber im Zytoplasma des Drüsenepithels des Endometriums von schwangeren Uteri lokalisiert. Diese Antikörper reagierten ebenfalls mit dem Drüsenepithel von nicht-schwangeren Uteri, und die Reaktivität war stärker in der sekretorischen Phase als in der proliferativen Phase des Menstruationszyklus. Der γ,δ-TCR war jedoch nicht mit dem CD3-Komplex assoziiert, wie durch Untersuchung von Immunpräzipitaten unter Verwendung von drei verschiedenen monoklonalen Antikörpern gegen CD3 (OKT3, Anti-Leu-4, UCHT-1) gezeigt wurde. Die γ,δ-TCR-positiven Drüsenepithelzellen reagierten nicht mit monoklonalen Antikörpern gegen den α,β-TCR; die Zellen waren ebenfalls CD4- und CD8-negativ. Darüber hinaus verlieren die Zellen des Drüsenepithels die Klasse I-MHC-Antigene in der frühen Phase der Schwangerschaft. Diese Daten legen nahe, daß diese den γ,δ-TCR tragenden Drüsenzellen des Endometriums zumindest phänotypische Veränderungen unter lokaler Regulierung der Genexpression durchlaufen.

11. BEISPIEL: CHARAKTERISIERUNG EINES HUMANEN δ-T-ZELL-REZEPTORGENS UND EINES Vδ-SPEZIFISCHEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS

Wir haben die δ-TCR-cDNA und ein rearrangiertes δ-TCR-Gen aus einem humanen γ,δ-T-Zell-Klon mit der Bezeichnung AK119 isoliert. Von diesen DNA-Klonen wurde eine κδ-Sonde erhalten und zur Bestimmung der Verschiedenheit von S-TCR-Gen-Rearrangements in einem Panel von 13 humanen γ,δ-T-Zell-Klonen und drei γ,δ-humanen T-Zell-Tumorlinien verwendet. Insgesamt wurden 5 verschiedene Rearrangements nachgewiesen, die mit Rearrangements korrespondieren, welche 2 bis 5 unterschiedliche Xδ-Gene verwenden. In den humanen γ,δ-T-Zellen, die mit dem mAb TCSδ1 (δTCAR-3) reagierten, wurde stets ein besonderes Rearrangement beobachtet. Zusätzlich führte TCSδ1 zur Immunpräzipitation des δ-TCR-Polypeptids von einer humanen γ,δ-Tumor-Zellinie mit der Bezeichnung Molt-13. Wie liefern den Nachweis dafür, daß der monoklonale Antikörper TCSδ1 ein vom AK119 Vδ-Gen oder von einer Epitopkombination des rearrangierten AK119 Vδ-Jδ-Gens kodiertes Epitop erkennt.

11.1. MATERIALIEN UND METHODEN

11.1.1. ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON δ-TCR cDNA-KLONEN VON AK119

Eine cDNA-Bibliothek wurde erstellt vom PBL T-Zell-Klon AK119 nach dem Verfahren von Gubler und Hoffmann (Gubler und Hoffman, 1983, Gene 25:263). Unter Verwendung einer mit ³²P markierten Nick-translatierten Cδ-Sonde, isoliert aus einem mit O-024 bezeichneten δ-TCR-Klon (S. Hata et al., 1987, Science 238:678) wurden etwa 100 000 Plaques einer amplifizierten Bibliothek einem Screening zugeführt. Der längste hybridisierende cDNA-Klon (1,3 Kb Klon C11δ3) wurde für die Sequenzanalyse nach dem Didesoxy-Kettenabbruchverfahren ausgewählt.

11.1.2. KLONIERUNG EINES REARRANGIERTEN &-TCR-GENS

Aus AK119-Zellen wurde ein genomischer DNA-Klon von 3,5 Kb, der das rearrangierte VS-Gen enthält, wie folgt erhalten: mit EcoRI gespaltene DNA wurde auf einem präparativen Agarosegel der Größe nach fraktioniert, mit λgt10 ligiert, verpackt und zur Transfektion von E. coli eingesetzt. Rekombinante Phagen wurden einem Screening zugeführt mit einer von dem cDNA-Klon c119δ3 abgeleiteten, mit ³²P markierten, Nick-translatierten EcoRI-Fragment von 550 Bp. Es wurde ein mit r119δ1 bezeichneter rearrangierter Klon isoliert, der ein HincII-Fragment von 0,8 Kb (V-Region-spezifisch) und ein HincII-EcoRI-Fraqment von 1 Kb (V-J-Region) enthält.

11.1.3. DNA-PRÄPARATION

Fötales sowie von Neugeborenen erhaltenes Thymusgewebe wurde unter Einhaltung anerkannter Richtlinien hinsichtlich der Rechte und Zustimmung der Patienten gewonnen. Aus peripherem Blut, pleuralem Exsudat oder vom Liquor cerebrospinales wurden durch Grenzverdünnung T-Zell-Klone erhalten und in vitro kultiviert (Hafler et al., 1985, Ann. Neurol. 18:451; Van de Griend et al., 1987, J. Immunol. 138:1627). In sämtlichen Fällen erfolgte die Präparation der DNA durch Verdau mit Proteinase K in 1 % Natriumdodecylsulfat und nachfolgender Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ethanolfällung.

11.1.4. SOUTHERN-BLOT-ANALYSE

Die genomische DNA wurde mit EcoRI gespalten, auf einem 0,9 %- igen Agarosegel der Größe nach fraktioniert und auf Nitrocellulose übertragen. Die Hybridisierung erfolgte mit ³²P-Nick-translatierten Sonden wie zuvor beschrieben (Maniatis, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, New York)).

11.1.5. CYTOFLUOROMETRISCHE ANALYSE

Normale mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) von freiwilligen Spendern wurden isoliert mittels Fraktionierung auf einem Ficoll-Gradienten. PBMC- und PBL-T-Zell-Klone wurden gefärbt durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung des mAb TCSδ1 (zuvor bezeichnet mit δTCAR-3; s. obiger Abschnitt 7) und Fluorescein-konjugiertem Anti-Maus-IgG der Ziege (Becton Dickinson) und sie wurden in einem fluoreszenzaktivierten Durchflußcytometer analysiert.

11.2. ERGEBNISSE

11.2.1. VERSCHIEDENHEIT VON δ-TCR-GEN-REARRANGEMENTS

Unter Verwendung einer Cδ-Sonde isolierten wir aus einer λgt10 cDNA-Bibliothek des T-Zell-Klons AK119 einen mit c119δ3 bezeichneten δ-TCR cDNA-Klon von 1,3 Kb. Das 5'-Ende von c119δ3 wurde sequenziert und es zeigte sich, daß zuvor identifizierte Vδ- und Jδ-Gene verwendet werden (Hata et al., 1987, Science 238:678; Loh et al., 1987, Nature 330:569). Die Sequenz der V-J-Verbindung zeigt, daß c119δ3 eine im Leserahmen gelegene V-J-Verknüpfung aufweist.
Ein 550 Basenpaare (Bp) langes EcoRI-Fragment, das für die vollständige variable und verknüpfende Region sowie für einen Teil der konstanten Region (V-J-C-Sonde) kodiert, wurde von c119δ3 erhalten und bei der Southern-Blot-Analyse von mit EcoRI gespaltener genomischer DNA von AK119 eingesetzt. Mit dieser Sonde können die Banden von dem 3,2 Kb großen Vδ der Keimbahn und das 1,0 Kb große C8 der Keimbahn nachgewiesen werden. AK119 zeigte eine extra-rearrangierte 3,5 Kb Bande, die identisch ist mit dem üblichen δ-TCR-Rearrangement (beschrieben von Hata et al., 1987, Science 238:678; Loh et al., 1987, Nature 330:569) (Rearrangement 11 in Fig. 22). Diese Bande von 3,5 Kb wurde von einer mit EcoRI der Größe nach fraktionierten genomischen λgt10-Bibliothek kloniert unter Verwendung der V-J-C-cDNA-Sonde. Eine partielle Kartierung des mit r119δ1 bezeichneten klonierten rearrangierten δ-TCR-Gens ist in Figur 17 dargestellt. Die Lokalisierung der variablen und verknüpfenden Region wurde bestimmt unter Verwendung von J-Oligonukleotidsonden und spezifischen Sonden für die variable Region. Aus r119δ1 wurde durch Spaltung mit den Enzymen Hincll und EcoRI eine V-J-Sonde von 1 Kb isoliert (s. Fig. 17).
Diese V-J-Sonde wurde verwendet zur Bestimmung der Verschiedenheit von δ-TCR-Gen-Rearrangements in einem Panel von 13 humanen γ,δ-TCR-positiven T-Zell-Klonen und 3 humanen γ,δ-TCR-positiven Tumor-Zellinien. Wie in Figur 22 dargestellt, können in der polyklonalen, aus Neugeborenen erhaltenen Thymozytenprobe 5 mit I-V bezeichnete übliche Rearrangements festgestellt werden (Spur 11). Diese Rearrangements sind repräsentativ für Rearrangements, wie sie von humanen γ,δ-T-Zell-Klonen verwendet werden. Lediglich das Rearrangement II hybridisiert mit der für Vδ spezifischen HincII-HincII-Sonde. Obgleich wir nicht wissen, ob sämtliche dieser Rearrangements eher Rearrangements von V-D-J als solche von D-J repräsentieren, müssen einige von ihnen Rearrangements neuer variabler Regionen mit dem zuvor charakterisierten Jδ-Gensegment repräsentieren, da diese Zellen auf ihren Zelloberflächen eine funktionelle δ-TCR-Polypeptidkette exprimieren. Wir haben die Wahrscheinlichkeit nicht weiter untersucht, daß diese neuen Rearrangements Rearrangements eines einzelnen neuen Vδ-Gens mit anderen, noch zu identifizierenden Jδ-Genen repräsentieren. Unsere Daten stimmen mit der Tatsache überein, daß 2-5 Gene für die variable Region vorhanden sein müssen, die bei den Rearrangements des δ-TCR-Gens angewendet werden können.

11.2.2. BESTIMMUNG DER SPEZIFITÄT VOM mAb TCSδ1

Der zuvor mit δTCAR-3 bezeichnete TCSδ1 wurde gewonnen durch Fusionieren von Splenozyten aus Mäusen, die mit der humanen γ,δ- TCR-Tumor-Zellinie MOLT-13 immunisiert worden waren, mit einer Maus-Myelomlinie. Bei einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierungsanalyse reagierte TCSδ1 lediglich mit einigen aber nicht allen humanen γ,δ-T-Zellen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Es besteht bei Verwendung des Vδ-Gens von AK119 (Rearrangement II) mit der positiven Färbung durch TCSδ1 eine perfekte Korrelation. Diese Daten liefern deutliche Nachweise dafür, daß das von δTCS1 erkannte Epitop vom Vδ-Gen von AK119 oder einem kombinatorischen Epitop des rearrangierten Vδ-Jδ-Gens von AK119 kodiert wird. TABELLE 1 KORRELATION ZWISCHEN FÄRBUNG DURCH mAb TCS1δ UND EINEM SPEZIFISCHEN Vδ-REARRANGEMENT Humane γ,δ-TCR-T-Zell-Klone δ-Rearrangement¹ TCSδ1 Humane γ,δ-TCR-T-Zell-Tumor-Linien PEER Molt-13 DND41
¹ δ-TCR-Rearrangements, nachgewiesen mit V-J-Sonde, bezeichnet mit I-V wie in Figur 22.
² In jedem Fall wurde lediglich ein Rearrangement identifiziert, obwohl kein Jδ der Keimbahn nachgewiesen wurde.
³ Es wird ein neues Rearrangement beobachtet, das bei fötalen oder aus Neugeborenen abgeleiteten Thymozyten nicht beobachtet wird. Dieses Rearrangement ist mit Rearrangement VI bezeichnet worden.
&sup4; + bedeutet positive Färbung, - bedeutet negative Färbung. nu bedeutet nicht untersucht.

12. HINTERLEGUNG VON HYBRIDOMEN

Die folgenden, die angegebenen monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridom-Zellinien sind bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12310 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., zu den angegebenen Zeitpunkten unter den nachfolgend dargelegten Zugriffsnummern hinterlegt worden: Hybridom Monoklonaler Antikörper Tag der Hinterlegung Zugriffsnummer
Die folgenden Hybridom-Zellinien sind ebenfalls bei der American Type Culture Collection zu den angegebenen Zeitpunkten unter den folgenden Zugriffsnummern hinterlegt worden: Hybridom Tag der Hinterlegung Zugriffsnummer
Die vorliegende Erfindung wird in ihrem Schutzumfang nicht durch die hinterlegten Zellinien beschränkt, da die hinterlegten Ausführungsformen als einzelne Veranschaulichungen eines Aspekts der Erfindung dienen und jedwede Zellinien, die funktionell äquivalent sind, von dem Schutzbereich der vorliegenden Erfindung erfaßt werden. In der Tat ergeben sich für den Durchschnittsfachmann aus der vorangegangenen Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen zahlreiche Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den vorliegend dargestellten und beschriebenen. Derartige Modifikationen werden vom Schutzumfang der anhängenden Ansprüche mit umfaßt.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper, der gegenüber einem Epitop einer variablen oder rearrangierten variablen-verknüpfenden (joining) Region einer δ-Kette des menschlichen T-Zell-Antigen- Rezeptors reaktiv ist.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, umfassend den monoklonalen Antikörper TCSδ1 (δTCAR-3), wie er von dem Hybridom produziert wird, welches bei der ATCC unter der Zugriffsnummer HB 9578 hinterlegt ist.

3. Monoklonaler Antikörper, der gegenüber einem Epitop der konstanten Region der δ-Kette des menschlichen T-Zell-Antigen-Rezeptors reaktiv ist.

4. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3, umfassend den monoklonalen Antikörper Anti-TCRδ1, wie er von dem Hybridom produziert wird, welches bei der ATCC unter der Zugriffsnummer HB 9772 hinterlegt ist.

5. Monoklonaler Antikörper, der gegenüber einem Epitop der konstanten Region der Form 2bc-γ-Kette des menschlichen T- Zell-Antigen-Rezeptors reaktiv ist, wobei das Epitop für die Form 2bc-γ-Kette charakteristisch ist.

6. Monoklonaler Antikörper Anti-Cγm1, wie er von dem Hybridom produziert wird, welches bei der ATCC unter der Zugriffsnummer HB 9773 hinterlegt ist.

7. Fv-, Fab-, Fab'- oder F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 1, 2 oder 3.

8. Fv-, Fab-, Fab'- oder F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 4, 5 oder 6.

9. Hybridom, das den monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2 produziert.

10. Hybridom, das den monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 3 oder 4 produziert.

11. Hybridom, das den monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 5 oder 6 produziert.

12. Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines funktionellen Rearrangements eines menschlichen δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor- variablen Gens in einer Zelle, umfassend das Kontaktieren der Zelle oder einer Probe, die Polypeptide der Zelle enthält, mit einem monoklonalen Antikörper, der in spezifischer Weise gegenüber einem Epitop eines von dem rearrangierten Gen kodierten Polypeptids reaktiv ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der monoklonale Antikörper TCSδ1 (δTCAR-3) umfaßt, wie er von dem Hybridom produziert wird, welches bei der ATCC unter der Zugriffsnummer HB 9578 hinterlegt ist.

14. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, ein CD3-Antigen zu comodulieren.

15. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3, der durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, ein CD3-Antigen zu comodulieren.

16. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 5, der durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, ein CD3-Antigen zu comodulieren.

17. Gereinigtes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz einer konstanten Region eines γ-T-Zell-Antigen-Rezeptors Form 2bc umfaßt, die durch die Nukleotide 439 bis 1008 der Figur 14 kodiert wird.

18. Gereinigtes Polypeptid nach Anspruch 17, umfassend einen γ- T-Zell-Antigen-Rezeptor Form 2bc, mit einer relativen Molekülmasse von etwa 40 000 Dalton und einer Sequenz umfassend eine konstante Region, welche im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, welche durch die Nukleotide 439 bis 1008 der Figur 14 kodiert wird, und eine variable Region.

19. Gereinigtes Polypeptid, umfassend einen γ-T-Zell-Antigen- Rezeptor Form 2bc mit einer primären Aminosäuresequenz im wesentlichen gemäß Darstellung in Figur 14 für die variable, N-, verknüpfende (joining) und konstante Region.

20. Isolierte Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß Anspruch 17 kodiert.

21. Isolierte Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß Anspruch 18 kodiert.

22. Isolierte Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß Anspruch 19 kodiert.

23. Nukleinsäure nach Anspruch 22, welche ein cDNA-Klon ist.

24. Nukleinsäurevektor, umfassend den cDNA-Klon gemäß Anspruch 23.

25. Zelle, die den Nukleinsäurevektor gemäß Anspruch 24 enthält.

26. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 20, 21 oder 22, die DNA umfaßt.

27. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 20, 21 oder 22, die RNA umfaßt.

28. Gereinigter Polypeptidkomplex, umfassend ein T-Zell-Antigen- Rezeptor-Heterodimer, bestehend aus dem γ-T-Zell-Antigen- Rezeptor-Polypeptid gemäß Anspruch 17 und einem zweiten T- Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den α-, β-, γ- und δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor- Polypeptiden.

29. Komplex nach Anspruch 28, bei dem der zweite T-Zell-Antigen- Rezeptor das δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid ist.

30. Verfahren zur Herstellung eines γ,δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor- Heterodimers, umfassend das Kultivieren einer Zelle, die (a) in der Lage ist, eine Nukleinsäure zu exprimieren, welche für ein δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid kodiert, und die (b) mit einer Nukleinsäure transfiziert worden ist, welche für ein γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid kodiert, unter solchen Bedingungen, daß sowohl das γ-T-Zell-Antigen- Rezeptor-Polypeptid als auch das δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor- Polypeptid von der Zelle exprimiert werden und sich zur Bildung eines Heterodimers zusammenfügen.

31. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem das γ-T-Zell-Antigen- Rezeptor-Polypeptid eine Aminosäuresequenz einer konstanten Region eines γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids Form 2bc umfaßt, welche durch die Nukleotide 439 bis 1008 der Figur 14 kodiert wird.

32. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem das γ-T-Zell-Antigen- Rezeptor-Polypeptid die Form 2bc aufweist mit einer primären Aminosäuresequenz im wesentlichen gemäß Darlegung in Figur 14 für die variable, N-, verknüpfende (joining) und konstante Region.

33. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem das γ-T-Zell-Antigen- Rezeptor-Polypeptid die Form 2bc aufweist mit einer relativen Molekülmasse von etwa 40 000.

34. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem die Untereinheiten des Heterodimers über Disulfidbrücken verknüpft sind, und bei dem das γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid die Form 1 aufweist mit einer relativen Molekülmasse von etwa 40 000.

35. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem das γ-T-Zell-Antigen- Rezeptor-Polypeptid die Form 2abc aufweist mit einer relativen Molekülmasse von etwa 55 000 Dalton.

36. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem die Zelle eine T-Zelle ist.

37. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem die Nukleinsäure, die für ein γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid kodiert, ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: (i) einer Nukleinsäure, die ein einziges CII-Exon umfaßt; (ii) einer Nukleinsäure, die zwei CII-Exons umfaßt; und (iii) einer Nukleinsäure, die drei CII-Exons umfaßt.

38. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem das exprimierte γ-T- Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid und das exprimierte δ-T- Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid nicht-kovalent assoziiert sind.

39. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem das exprimierte γ-T- Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid und das exprimierte δ-T- Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid kovalent assoziiert sind.

40. Verfahren zur Herstellung mindestens eines Teils eines γ,δ- T-Zell-Antigen-Rezeptor-Heterodimers, umfassend das Kultivieren einer transfizierten Zelle, die (a) in der Lage ist, eine Nukleinsäure zu exprimieren, welche für mindestens eine Region eines γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten Region, einer variablen Region, und einer verknüpfenden (joining) Region, kodiert; und die (b) in der Lage ist, eine Nukleinsäure zu exprimieren, welche für mindestens eine Region eines δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten Region, einer variablen Region, einer verknüpfenden (joining) Region, und einer Verschiedenheits (diversity)-Region, kodiert; und das Zuführen der Zelle unter solche Bedingungen, daß beide Nukleinsäuresequenzen von der Zelle exprimiert werden.

41. Verfahren zur Expression mindestens eines Bereiches eines γ,δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Heterodimers, umfassend das Kultivieren einer transfizierten Zelle, die (a) in der Lage ist, eine Nukleinsäure zu exprimieren, welche für mindestens eine Region eines γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer variablen Region, einer verknüpfenden (joining) Region, und einer konstanten Region, kodiert; und die (b) in der Lage ist, eine Nukleinsäure zu exprimieren, welche für mindestens eine Region eines δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten Region, einer variablen Region, einer verknüpfenden (joining) Region, und einer Verschiedenheits- (diversity) Region, kodiert; und das Zuführen der Zelle unter solche Bedingungen, daß beide Nukleinsäuresequenzen von der Zelle exprimiert werden, wobei die Zelle mit der Nukleinsäure transfiziert worden ist, welche für mindestens eine Region des γ-T-Zell- Antigen-Rezeptor-Polypeptids kodiert.

42. Verfahren nach Anspruch 41, bei dem das γ-T-Zell-Antigen- Rezeptor-Polypeptid die Form 2bc umfaßt, eine relative Molekülmasse von etwa 40 000 Dalton aufweist und eine Sequenz besitzt, die eine konstante Region, welche im wesentlichen aus der von den Nukleotiden 439 bis 1008 der Figur 14 kodierten Aminosäuresequenz besteht, und eine variable Region umfaßt.

43. Verfahren nach Anspruch 40, 41 oder 42, bei dem die Zelle eine T-Zelle ist.

44. Verfahren nach Anspruch 40 oder 41, bei dem die Nukleinsäure, welche für mindestens einen Bereich des γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids kodiert, ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: (i) einer Nukleinsäure, die ein einziges CII-Exon umfaßt; (ii) einer Nukleinsäure, die zwei CII-Exons umfaßt; und (iii) einer Nukleinsäure, die drei CII-Exons umfaßt.

45. Verfahren nach Anspruch 40 oder 41, bei dem der Bereich des γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids und der Bereich des δ- T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids nicht-kovalent assoziiert sind.

46. Verfahren nach Anspruch 40 oder 41, bei dem der Bereich des γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids und der Bereich des δ- T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids kovalent assoziiert sind.

47. Isolierte Zellen, die mindestens einen Bereich eines γ,δ-T- Zell-Antigen-Rezeptor-Heterodimers exprimieren, wobei der Bereich eines γ,δ-T-Zell-Antigen-Rezeptors mindestens eine Region eines γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten Region, einer variablen Region, und einer verknüpf enden (joining) Region, assoziiert mit mindestens einer Region eines δ-T- Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten Region, einer variablen Region, einer verknüpfenden (joining) Region, und einer Verschiedenheits (diversity)-Region, umfaßt, und wobei das Heterodimer nicht mit einem CD3-Komplex assoziiert ist.

48. Zellen nach Anspruch 47, wobei die Zellen Drüsenzellen des Endometriumepithels sind.

49. Transfizierte Zelle, die ein γ,δ-T-Zell-Antigen-Rezeptor- Heterodimer exprimiert, wobei das γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor- Polypeptid des Heterodimers durch Expression einer Nukleinsäure produziert wird, welche für das γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid kodiert und mit welcher die Zelle transfiziert worden ist.

50. Zelle nach Anspruch 49, in der das γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptid die Form 2bc aufweist mit einer relativen Molekülmasse von etwa 40 000 Dalton und einer Sequenz, die eine konstante Region, welche im wesentlichen aus der von den Nukleotiden 439 bis 1008 der Figur 14 kodierten Aminosäuresequenz besteht, und eine variable Region umfaßt.

51. Transfizierte Zelle, die mindestens einen Bereich eines γ,δ- T-Zell-Antigen-Rezeptor-Heterodimers exprimert, wobei der Bereich eines γ,δ-T-Zell-Antigen-Rezeptors mindestens eine Region eines γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten Region, einer variablen Region, und einer verknüpfenden (joining) Region, assoziiert mit mindestens einer Region eines δ-T- Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer konstanten Region, einer variablen Region, einer verknüpfenden (joining) Region, und einer Verschiedenheits (diversity)-Region, umfaßt; wobei das Heterodimer nicht mit einem CD3-Komplex assoziiert ist, und wobei der Bereich des γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids durch Expression einer Nukleinsäure produziert wird, welche für den Bereich des γ-T-Zell-Antigen-Rezeptors kodiert und mit welcher die Zelle transfiziert worden ist.

52. Verfahren zur Bestimmung der relativen Verwendung eines γ-T- Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids in einer Probe aus einem menschlichen Individuum, bei dem man:

(a) in einer Probe, die T-Zellen von einem Individuum enthält, die Menge eines γ-T-Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids der Form 2bc bestimmt;

(b) in einer Probe eines Individuums die Menge eines γ-T- Zell-Antigen-Rezeptor-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem γ-Polypeptid der Form 1 und einem γ-Polypeptid der Form 2abc, bestimmt; und

(c) die in Stufe (a) ermittelte Menge mit der in Stufe (b) ermittelten Menge vergleicht und dadurch die relative Verwendung bestimmt.