JP3176049B2 - ヒト ガンマ，デルタｔ細胞抗原レセプターポリペプチドおよび核酸 - Google Patents

ヒト ガンマ，デルタｔ細胞抗原レセプターポリペプチドおよび核酸

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Description

【発明の詳細な説明】 1.序 本発明は、2bc型と称するヒトγＴ細胞抗原レセプタ
ーポリペプチドの１つの型に関し、この型は分子量が約
40,000ダルトン、かつ２つのＣγ2C IIエキソンコピー
のみによってコードされた配列を含む１つの定常領域を
有する。また、本発明は、γ2bc型からなるＴ細胞抗原
レセプターヘテロダイマー、およびγ2bc型およびそれ
らの一部分をコードする核酸配列に関する。本発明はま
た、γまたはδＴ細胞抗原レセプターポリペプチドのエ
ピトープに特異的な反応性を有するモノクローナル抗体
を提供する。
2.発明の背景 Ｔ細胞抗原レセプター（TCR）は、一方がα鎖、他方
がβ鎖と呼ばれる二種類のグリコシルサブユニットから
なり、Ｔ細胞上でクローン特異的ジスルフィド結合ヘテ
ロダイマーであるとされていた。αおよびβTCRサブユ
ニットは、それぞれ、約50,000および約40,000の相対分
子質量（Mr）を有する（Allison et al.,1982,Immunol.
129:2293−2300;Meuer et al.,1983,J.Exp.Med.157:705
−719;Haskins et al.,1983,J.Exp.Med.157:1149−116
9）。遺伝子は、Ｔ細胞の個体発生の間に再編成され、
そしてβTCR（Yanagi et al.,1984,Natuer 308:145−14
9;Hedrick et al.,1984,Nature 308:153−158）および
αTCR（Chien et al.,1984,Nature 312:31−35;Saito e
t al.,1984,Nature 312:36−40;Sim et al.,1984,Natur
e 312:771−775）をコードする遺伝子は、サブトラクテ
ィブハイブリダイゼーションまたはオリゴヌクレオチド
によるつりあげのいずれかによって単離された。
Ｔ細胞クローンのＴ細胞抗原レセプターのαおよびβ
鎖は、それぞれ、Ｖ（variable）、Ｄ（diversity）、
Ｊ（joining）およびＣ（constant）と呼ばれるドメイ
ンのユニークな組み合わせから構成される（Siu et a
l.,1984,Cell 37:393;Yanagi et al.,1985,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 82;3430）。超可変領域が同定された（Pat
ten et al.,1984,Nature 312:40;Becker et al.,1985,N
ature 317:430）。各Ｔ細胞クローンにおいて、αおよ
びβ鎖のＶ、ＤおよびＪドメインの組み合わせは、Ｔ細
胞クローン抗原認識にユニークな様式で関与し、そして
Ｔ細胞クローンのイディオタイプとしても公知のユニー
クは結合部位を定義する。対照的に、Ｃドメインは抗原
の結合には関与しない。
ヒトα、βTCRのユニークな特性は、観察されたコモ
ジュレーション（Meuer et al.,1983,J.Exp.Med.157:70
5−719）、同時免疫沈降（PCT国際公開番号第WO88/0020
9号,published January 14,1988;Oettgen,et al.,1984,
J.Biol.Chem.259:12,039−12,048）であり、α、βTCR
分子とCD3グリコタンパク質複合体との要求される同時
共発現（Weiss et al.,1984,J.Exp.Med.160:1284−129
9）であった。その後、二種類のタンパク質複合体の直
接的な物理的会合は、α、βTCR分子をT3グリコタンパ
ク質への化学的架橋と、TCRサブユニットおよびT3グリ
コタンパク質（Mr 28,000）サブユニットのような架橋
複合体成分を同定することによって証明された（Brenne
r et al.,1985,Cell 40:183−190）。T3のカウンタパー
トは、マウスα、βTCRと同様に会合する（Allison et
al,1985,Nature 314:107−109;Samelson et al,1984,Im
munol.Rev.81:131−144）。
Ｔ細胞中で再編成され、γTCRと呼ばれる第３の遺伝
子は、最初マウスで（Saito et al.,1984,Nature 309:7
57−762;Kranz et al.,1985,Nature 313:762−755;Hayd
ay et al.,1985,Cell 40:259−269）同定され、ついで
ヒドで同定された（Lefrac et al.,1985,Nature 316:46
4−466;Murre et al.,1985,Nature 316;549−552）。ヒ
トγTCR遺伝子座は、５〜10個の可変領域遺伝子、５個
の結合領域遺伝子および２個の定常領域遺伝子からなる
らしい（Dialynas et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.83:2619）。機能的な可変領域および結合領域の総
数は限定されているが、重要な多様性がＶ−Ｊ結合プロ
セスにおいて導入される（Kranz et al.,1985,Nature 3
13:752−755;Lefranc et al.,1986,Cell 45:237−246;Q
uertermanus et al.,1986,Nature 322:184）。γTCR遺
伝子の再編成は、サプレッサー表現型、細胞障害表現型
並びにヘルパー表現型を有するリンパ球で生ずる（Lefr
anc et al.,1985,Nature 316:464−466;Murre et al.,1
985,Nature 316:549−552;Quertermaus et al.,1986,Sc
ience 231:252−255;Lefranc et al.,1986,Cell 45:237
−246;Iwamoto et al.,1986,J.Exp.Med.163;1203−121
2;Zauderer et al.,1986,J.Exp.Med.163:1314−131
8）。
γTCR遺伝子産物は、T3同時免疫沈降で、αβTCR−CD
3+Tから同定されている（Brenner et al.,1986,Nature
322:145−149;Bank et al.,1986,Nature 322:179−181;
Borst et al.,1987,Nature 325,683−688:Moingeon et
al.,1987,Nature 325,723−726,PCT国際公開番号第WO88
/00209号,published January 14,1987）。γTCRポリペ
プチドは、γTCRペプチド配列に対するモノクローナル
抗体を使用して同定され、これらのポリペプチドは、δ
TCRと呼ばれる他のポリペプチドを有するヘテロダイマ
ーに組み込まれることが見い出された（Brenner et a
l.,1986 Nature 322;145−169）。γ，δヘテロダイマ
ーは、非共有結合的にCD3と会合することが報告され
た。
γTCR特異的ペプチドに対する抗血清を使用すると、
末梢血、胸腺および白血病細胞系に起源を有する細胞上
でCD3会合γTCRポリペプチドを同定することができる
（Brenner et al.,1986,Nature 322:145−149;Bank et
al.,1986,Nature 322:179−181;Weiss et al.,1986,Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:6998−7002;Brenner et a
l.,1987,Nature 325:689−694;Lew et al.,1986,Scienc
e 234:1401−1405）。Bankら（前出）は、ヒト胸腺細胞
クローン表面上で62,000kDのペプチドおよびT3と会合し
た44kDγ型を開示した。また、類似のγTCRポリペプチ
ドがマウスＴリンパ球上で同定され、そして胸腺細胞の
分化中におけるこのペプチドの発現は、最近の多くの研
究の対象である（Roulet et al.,1985,Nature 314:103
−107;Snodgrass et al.,1985,Nature 315:232−233;Le
w et al.,1986,Science 234:1401−1408;Pardau et a
l.,1987,Nature 326:79−81;Bluestone et al.,1987,Na
ture 326:82−84）。
γTCR+ヒト細胞系の研究によると、２種類の異なるγ
TCRポリペプチドでは、分子量およびジスルフィド結合
形成能が異なることが認められた（Borst et al.,1987,
Nature 325:683−688;Brenner et al.,1987,Nature 32
5:689−694;Moingeon et al.,1987,Nature 325:723−72
6:Lanier et al.,1987,J.Exp.Med.165:1076）。それぞ
れＣγ１およびＣγ２と呼ばれる２種類の異なるγTCR
定常領域遺伝子セグメントを比較し、Ｃγ１の第２エキ
ソンでコードされたシステイン残基はＣγ２エキソンセ
グメント中にはなく、その欠失によっていくつかのγTC
Rペプチドにジスルフィド結合形成能がないことが説明
されることが示唆された（Krangel,et al.,1987,Scienc
e,237:1501−1055:Littman et al.,Nature 326:8508
8）］。
γTCRが多くの形態を有することとは対照的に、δTCR
は比較的変化がなく、定常領域のみが存在する（Hata e
t al.,1987,Science 238:678−682）。
Ｔ細胞個体発生の間、γTCR遺伝子の再編成がβおよ
びαTCR遺伝子の再編成に先行することが示された（Rou
let et al.,1985,Nature 314:103−107;Snodgrass et a
l.,1985,Nature 315:232−233;Sangoter et al.,1986,
J.Exp.Med.163:1491−1508）。
成熟した、循環しているＴリンパ球の比較的少ない部
分がγδTCR+であり、CD3+4-8-（二重陰性）表面抗原ま
たはCD3+4-8+表現抗原を示す。CD3+4-8-T細胞は、成熟C
D3+T細胞の約２％を構成する。大部分の成熟CD3+4+また
はCD3+8+の主要組織適合性遺伝子座（MHC）が細胞障害
Ｔ細胞を拘束するのとは異なり、CD3-ナチュラルキラー
細胞と同様に、γδTCR+CD3+4-8-クローン化リンパ球
は、MHC非拘束細胞溶解活性を現すことが示された。し
かしながら、ナチュラルキラー細胞と異なり、これらの
γδ+CD3+4-8-T細胞はＫ−562などのナチュラルキラー
細胞の標的を首尾一貫して殺さなかった（Borst et a
l.,1987,325:683−688;Brenner et al.,1987,Nature 32
5:689−694;Moingeon et al.,1987,Nature 325:723−72
6;Bluestone et al.,1987,Nature 326:82−84）。
3.発明の概要 本発明は、2bc型と呼ばれるヒトγＴ細胞抗原レセプ
ター（TCR）ポリペプチドの１型に関する。2bc型のγTC
R鎖は、第14図に実質的に示した一次アミノ酸配列を有
する。2bc型のγTCR鎖は、分子量が約40,000ダルトンで
あり、２つのＣγ2C IIエキソンコピーだけでコードさ
れた配列からなる定常領域を含む。また、本発明は、γ
TCRポリペプチド2bc型を含むTCRヘテロダイマーに関す
る。
また、本発明は、γTCR 2bc型をコードする核酸配列
および２つのC IIエキソンだけを有するＣγ２定常領域
を含む核酸配列に関する。特別の実施態様においては、
本発明の核酸は、第14図に示した核酸配列の少なくとも
一部分を含む。
本発明は、γまたはδTCRポリペプチドのエピトープ
に特異的な反応性を示すモノクローナル抗体を提供す
る。かかる抗体は、γδTCRおよびCD3抗原の両方を発現
している細胞上でCD3抗原をコモジュレートする能力を
検出することによって同定し得る。特別の実施態様にお
いては、本発明はδTCR鎖の可変領域に反応性を示す抗
体に関する。さらに特殊な実施態様においては、かかる
抗体は、細胞における機能的なδTCR可変遺伝子の再編
成の検出を使用することができる。他の実施態様におい
ては、本発明は、δTCRポリペプチド定常領域に反応性
を示す抗体に関する。さらに別の実施態様において、本
発明は、γTCRポリペプチド定常領域に反応性を有する
抗体に関する。
本発明の他の態様において、細胞中でγδTCRを発現
させる方法が提供される。
3.1 定義 本明細書で使用される用語の意味を次に示す。
TCR＝Ｔ細胞抗原レセプター V ＝可変 D ＝diversity J ＝結合 C ＝定常 mAb＝モノクローナル抗体 4.図面の説明 第１図は、抗TCRδ１を使用したＴ細胞系のサイトフ
ルオログラフ分析（細胞蛍光間接撮影分析）である。
第２図は、mAb抗TCRδ１特異性の免疫化学分析であ
る。表面125I標識IDP2細胞を、対照mAb P3（レーン１お
よび２）、抗leu4（レーン３〜５）、抗TCRδ１（レー
ン６〜８）または抗Ｃγ血清（レーン９）を使用して免
疫沈降させ、その後SDS−PAGE（ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動）によって分離し、オートラジオグラフィー
で可視化した。Ｎ＝非還元条件、Ｒ＝還元条件。
第３図は、δTCRのＮ−グリカナーゼ消化である。
第４図は、pGEM3−０−240/38の地図である。
第５図は、mAb抗TCRδ１によるcDNAクローンIDP2 0−
240/38のin vitro翻訳生成物の免疫沈降である。
第６図は、Ｔ細胞抗原レセプターの免疫沈降およびSD
S−PAGE分析である。白抜きの矢印はδ鎖の位置を示
す。黒い矢印はγ鎖の位置を示す。溶解物は、δTCAR−
３抗体（奇数レーン）またはβF1抗体（偶数レーン）を
使用して免疫沈降させた。
第７図は、δTCAR−３抗体によるδ鎖の免疫沈降であ
る。MOLT−13細胞は、0.3％HCAPS含有トリスーバッファ
ー生理食塩水（pH8）（レーン１）または１％Triton X
−100（レーン２〜７）に溶解した。レーン１では、δT
CAR−３は、CD3タンパク質でγ，δTCRヘテロダイマー
を免疫沈降させた。レーン２では、δTCAR−３は、CD3
タンパク質なしでγ，δTCRヘテロダイマーを免疫沈降
させた。レーン３と４では、δTCAR−３は、変性溶解物
からの一本のδ鎖を、それぞれ非還元（Ｎ）および還元
条件（Ｒ）において免疫沈降させた。レーン５では、UC
HT−１は、CD3タンパク質を免疫沈降させた。レーン６
では、βF1抗体は、MOLT−13細胞からヘテロダイマーを
免疫沈降させなかった。レーン７では、抗Ｃγ抗血清
は、一本のγ鎖を免疫沈降させた。
第８図は、フロサイトメトリーによる細胞表面染色分
析である。γ，δTCR陽性細胞（MOLT−13,PEER,IDP2）
およびα、βTCR陽性細胞（HPB−ALL,Jurkat）は、δTC
AR−３、OKT−３、WT31および正常マウス血清（NMS）と
ともにインキュベートし、フロサイトメトリーによって
分析した。Ｂ細胞系、Daudiを陰性対照とした。
第９図は、δTCAR−3+およびOKT3+末梢血リンパ球の
二色サイトフルオログラフ分析（細胞間接撮影分析）で
ある。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）の蛍
光をＹ軸に、フィコエリトリン（PE）のケイ光をＸ軸に
示した。このサンプル中のCD3+γ、δTCR+細胞は2.4％
のCD3+リンパ球を示す。
第10図は、細胞質内Ca2+濃度（［Ca2+］ｉ）を経時的
に測定した結果を表す。上部パネル：δTCAR−３。下部
パネル：抗Leu抗体。矢印は、抗体添加時を示す。
第11図は、３型のγ，δTCRの免疫沈降である。Ａ〜
Ｅの部分について、免疫沈降に使用した抗体は、抗Leu4
（抗CD3）、βF1（抗TCRβ）、抗δ1TCR（抗δTCR）、
抗Ｃγｂ血清（抗γTCR）およびP3（非標識レーン、対
照）であった。125I標識細胞溶解物からの免疫沈降物
は、還元条件（Ｒ）または非還元条件（Ｎ）において、
SDS−PAGE（10％ポリアクリルアミド）で分析した。白
い矢印（⇒）は還元条件下におけるTCRδの位置を示
し、一方黒い矢印（→）は非還元条件下におけるδTCR
の位置を示す。サイズマーカーMrは1000の単位で、左側
に示す。
Ａ）PBL−L2上でジスルフィド結合していないγTCR（40
kD）。レーン１〜６において放射性標識された細胞を、
0.3％CHAPS界面活性剤で可溶化した。この界面活性は、
TCR−CD3会合を保存する。一方、レーン７と８において
は、免疫沈降を鎖の分離後に行なった（方法を参照のこ
と）。
Ｂ）IDP2細胞上でジスルフィド結合していないγTCR（5
5kD）。レーン１〜４では、放射性標識された細胞を0.3
％CHAPS界面活性剤で可溶化し、一方、レーン５と６に
おいては、免疫沈降を鎖の分離後に行なった。
Ｃ）WM−14上でジスルフィド結合したγTCR（40kD）。
全てのレーンは、１％ジギトニン溶解放射性標識細胞か
らの免疫沈降物に対応する。
Ｄ）胸腺クローンII細胞上でジスルフィド結合していな
いγTCR（40kD）。放射性標識細胞は、１％ジギトニン
（レーン１〜４）または0.1％のTriton X−100（レーン
５と６）で可溶化し、一方、レーン７と８においては、
鎖の分離後に免疫沈降を行なった。
Ｅ）MOLT−13白血病Ｔ細胞上でジスルフィド結合してい
ないγTCR（40kD）。レーン１〜４において0.3％のCHAP
S界面活性剤で細胞を可溶化した後に、免疫沈降を行な
い、一方、レーン５と６では、鎖の分離後に免疫沈降を
行なった。
第12図は、抗Ｃγm1抗体および抗TCRδ１抗体のそれ
ぞれによるγTCR鎖およびδTCR鎖の免疫沈降である。細
胞表面放射性標識MOLT−13細胞を、0.3％のCHAPS界面活
性剤で可溶化し、γ，δTCR−CD3複合体を抗CD3モノク
ローナル抗体で単離した。免疫沈降物を、還元条件にて
10％SDS−PAGE分析した。
レーン1:抗Leu4（抗CD3）mAbによる免疫沈降。
レーン3:単離されたγ，δTCR−CD3複合体の鎖を分
離した後の抗Ｃγm1（抗TCRγ）による免疫沈降。
レーン4:単離されたγ，δTCR−CD3複合体の鎖を分
離した後の抗TCRδ１（抗TCRδ）による免疫沈降。
第13図は、PEERおよびMOLT−13細胞からのγTCRおよ
びδTCRのペプチド骨格の大きさおよびグリコシル化の
測定である。免疫沈降に用いられたモノクローナル抗体
は、各レーン上部に示したように抗Ｃγm1（抗TCR
γ）、抗TCRδ１（抗TCRδ）およびP3（標識対照）であ
る。使用した標識細胞系は、各10％SDS−PAGEオートラ
ジオグラフまたはフルオグラフの下部に示した。サンプ
ルは全て還元条件で分離した。サイズマーカーMrは1,00
0の単位である。
Ａ）PEERおよびMOLT−13細胞からのγTCRペプチド主鎖
の大きさ。細胞を35S−システインおよび35S−メチオニ
ンで15分間、生合成的に標識した。サンプルは、Endo H
（＋）処理またはmock処理のいずれかの処理を行なっ
た。抗Ｃγm1による免疫沈降はPEER細胞（レーン３）お
よびMOLT−13細胞（レーン７）の未成熟なγTCRの位置
を示すが、対応するポリペプチド骨格の大きさはEndo H
（レーン４と８）処理後に可視化した。
Ｂ）MOLT−13細胞からのTCRδのグリコシル化。125I標
識細胞は抗CD3のmAbで免疫沈降し、δTCRポリペプチド
は、Ｎ−グリカナーゼ（レーン４）、Endo H（レーン
２）とインキュベーションするか、またはmock処理（レ
ーン１と３）の前にゲル精製した（方法を参照のこ
と）。
第14図は、MOLT−13のγTCRの核酸配列（2bc型）であ
る。パートA:クローンM13Kの配列決定の戦略。1.1kbのc
DNAクローンM13Kの部分制限地図を示す。パートB;クロ
ーンM13Kの核酸及び推定アミノ酸配列。シグナル配列遺
伝子セグメント（Ｓ）、可変領域遺伝子セグメント
（Ｖ）、Ｎ−領域遺伝子セグメント（Ｎ）、結合領域遺
伝子セグメント（Ｊ）および定常領域遺伝子（C I、C I
I b、C II cおよびC III）セグメントを矢印で示す。こ
れらは、ＳとＶについてはLefrancら（1986,Cell 45:23
7−246）によって記載されたゲノム配列と、Ｊについて
はLefrancら（1986,Nature,319:420−422）とQuertermo
usら（1987,Immunol.138:2687−2690）によって記載さ
れたゲノム配列と、そしてＣについてはLefrancら（198
6,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:9596−9600）およびPe
llicciら（1987,Science 237:1051−1055）によって記
載された配列と比較して同定された。イニシエーターで
あるメチオニンで始まる推定アミノ酸配列は、核酸配列
の下に示す。細胞外システインは四角で囲み、潜在的な
Ｎ−結合炭水化物接着部位［Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−
T;（Marshall,1977,Ann.Rev.Biochem,41;637−702）は
かっこで示した。
第15図は、γ，δTCR 1型の優先的使用。３人の健常
ドナーからの新鮮な単離末梢血液単核細胞を125I標識
し、１％のTriton X−100で可溶化した。P3（対照、レ
ーン１と３）および抗TCRδ１（抗TCRδ、レーン２と
４）による免疫沈降物は、非還元条件（Ｎ）および還元
条件（Ｒ）で分析した。1000単位を有するマーカーMrを
左側に示す。
第16図は、ヒトにおける三種のγ、δTCR型の模式図
である。C IIエキソンがコードするコネクターペプチド
は、Ｃγ1C IIエキソンがコードするペプチドとして黒
ぬり部分（■）とした。
それぞれＣγ2C IIエキソンコピーａ、コピーｂそして
コピーｃコードペプチドを示す。潜在的なＮ−結合グリ
カン付着部位（Ｏ）、スルフヒドリル基（−SH）および
推定ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を示した。
第17図は、再配列されたδTCR遺伝子地図である。Eco
R I（RI）、Hinc II（Hc）、Sca I（Ｓ）とPvu II
（Ｐ）部位を含むr119δ１地図およびサザンブロット分
析で使用したプローブを示す。
第18図Ａは、MOLT−13細胞系へのトランスフェクショ
ンに使用したγTCR鎖を示す模式図である。模式図は、
報告された分析に基づく（Brenner,M.B.,et al.1986,Na
ture 322:145−149;Brenner,M.B.,et al.,1987,Nature
325:689−694:Krangel,M.S.,et al.,1987,Science 237:
64−67）。図中、Pred.は予測値、Obs.は実測値を示
す。それぞれ3kDの付着した炭水化物を含むと推定され
る、すべての有用なＮ−結合グリコシル化部位（頭に○
をつけた棒で示した）が使用され、有意なサイズの相違
は他の翻訳後修飾によって導入されないということが、
予測されたグリコシル化ポリペプチドの大きさから仮定
された。Ig様分子を代表とする鎖内ジスルフィド結合を
示す。システイン残基（Cys）はPBLClγTCRのC IIエキ
ソンによってコードされるが、このようなシステインは
二種の他のγTCR鎖で使用されたC IIエキソンの全コピ
ーには存在しないことに注意すべきである。同様に55kD
のγTCRタンパク質を発現する（Brenner,M.B.,et al.,1
987,Nature 325:689−694;Weiss,A.et al.,1986,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 83:6998−7002）γ、δＴ白血病細胞
系PEER（Littman,D.R.,et al.,1987,Nature 326:85−8
8）のγTCR定常領域はIDP2のそれと同一である。
第18図Ｂは、発現プラスミド構築物pFneo.PBLおよびp
Fneo.IDP2γを示す。IDP2γをγTCRクローンをMOLT−13
細胞系に導入するために使用した。PBLClγTCRのcDNAク
ローン（PBL C1.15）および修復されたIDP2γTCRのcDNA
クローン（IDP2.11r）（Krangel.M.S.et al.,1987,Scie
nce 237:64−67）を、EcoR I消化によって親プラスミド
ベクター（pUC18）から切断し、DNAポリメラーゼＩのク
レノウ断片で両末端を末端切断型とし、ついでこのcDNA
をSal I切断、およびクレノウ処理したpFneo哺乳類発現
ベクターヘライゲートした。SFFV（spleen focus formi
g virus）のLTRに関して適切な方向でcDNAインサートを
含むクローンを、制限マッピングに基づいて選択した。
pFneo（Saito,T.,et al.,1987,Nature 325:125−130）
は、BamH I消化し、マウスのβTCRのcDNAインサートを
除き、その後T4 DNAリガーゼでライゲートすることによ
って得られたpTβFneoの誘導体である（Ohashi,P.,et a
l.,1985,Nature 316:606−609）。図示したように、こ
のベクターはSV40プロモーター制御下に細菌のネオマイ
シン耐性遺伝子（neo r）を有し、哺乳類のレシピエン
ト細胞に抗生物質G418に対する耐性を付与する。カッコ
内の制限部位は構築中に破壊した。
第19図は、MOLT−13のγTCRトランスフェクタント上
のγ、δTCRの免疫沈降分析である。表面125I標識細胞
を、0.3％のCHAPS界面活性剤で可溶化して鎖の会合を保
護し、mAb P3（対照）、抗leu4（抗CD3）、抗TCRδ１
（抗δTCR）または抗Ti−γＡ（抗Ｖγ２）で免疫沈降
し、その後、非還元条件（Ｎ）または還元条件（Ｒ）下
にてSDS−PAGEで分離し、先に記載したオートラジオグ
ラフィーによって可視化した（Brenner M.B.,et al.,19
86,Nature 322:145−149:Brenner,M.B.,et al.,1987,Na
ture 325:689−694）。抗TiγＡのmAbは、Ｖγ２セグメ
ントの認識と一致する、異なるＴ細胞クローン上での反
応性のパターンを示す。M13.PBL ClはPBL Cl由来のγTC
R cDNAでトランスフェクトしたMOLT−13細胞であり、ク
ローン＃７を分析用に使用した。M13.IDP2γは、IDPS由
来γTCR cDNAでトランスフェクトしたMOLT−13細胞であ
り、クローン＃10を分析用に使用した。サイズマーカ
ー、Mr（分子量）は、1000ダルトン単位である。白い矢
印は、固有のMOLT−13γTCR鎖を示し、黒い矢印はトラ
ンスフェクトした（PBL ClまたはIDP2由来）γTCR cDNA
を氏示し、星印は、非還元条件下のMOLT−13のδTCR鎖
を示す。還元すると、δTCR鎖は移動度が変化し、40kD
のγTCR鎖とともに移動する。しかしながら、δTCR鎖
は、M13.IDP2γの抗Ｖγ２免疫沈降（第19図レーン８）
で見られたように、40kDのγTCRタンパク質が同時免疫
沈降しないときに、還元条件下で40kDのバンドとしては
っきりと可視化された。
第20図は、トランスフェクタントのγTCRポリペプチ
ドの二次元ゲル分析である。２×107個の細胞を表面125
I標識し、ノイラミダーゼ（各々1mg/mLのグルコースと
ウシ血清アルブミンとを含む1.5mLのPBS中に150ユニッ
ト、23℃で1.5時間）処理し、0.3％のCHAPS界面活性剤
で可溶化し、１μｇの抗leu4mAbで免疫沈降し、還元条
件下で二次元（2D）ゲル分析した。平衡化していないpH
グラジェントゲル電気泳動（NEPHGE）を、pH3.5〜10の
アンフォリン（Ampholine,LKB,スウェーデン）を使用し
て行ない、その後10.5％のアクリルアミドゲル上でSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった（Brenner.
M.B.,et al.,1987,Nature 325:689−694）。CD3成分の
位置（図示せず）を用いて異なる細胞系で発現されたγ
TCR種を同定し、比較した。M13.PBL Clγトランスフェ
クタントのクローン＃10とM13.IDP2γの形質転換体のク
ローン＃10を使用した。白い矢印はMOLT−13γTCR種
を、黒い矢印はIDP2γTCR種を、星印はPBL ClγTCR種を
示す。
第21図は、トランスフェクタントのγTCR鎖の骨格ポ
リペプチドの大きさの分析である。細胞を35S−メチオ
ニンおよび35S−システインで15分間パルス標識し、P3
（対照）、抗Ｃγm1（抗γTCR）または抗TiγＡ（抗Ｖ
γ２）mAbで免疫沈降した。免疫沈降物を、エンドグリ
コシダーゼＨ（Endo−H,＋）処理またはmockインキュベ
ート（−）処理し、SDS−PAGEで分離し、フルオログラ
フィーで可視化した。全てのサンプルを還元した。Mrは
分子量マーカーであり、1,000ダルトン単位である。ア
クチンのバンドに混入している43kDのものは、別の内部
マーカーとして働く。M13.IDP2γはIDP2のγTCRのcDN
A、クローン＃10でトランスフェクトしたMOLT−13細胞
であり、M13.PBL Clγは、PBL ClのγTCRのcDNAであ
る、クローン＃10でトランスフェクトしたMOLT−13細胞
である。
第22図は、γδＴ細胞クローンおよびポリクローナル
ヒトＴ細胞集団のサザンブロット分析である。ゲノムDN
AをEcoR Iで消化し、Ｖ−Ｊプローブでつりあげた。DNA
源は以下の通りである。PBL T細胞クローン（レーン
１、３〜９）、PBL（レーン10）、新生児胸腺リンパ球
（NBT、レーン11）、胎児胸腺リンパ球（FT,レーン12）
およびＢ細胞（胚細胞系（germline）、レーン２）であ
る。胚細胞系の3kbのＶδおよび6.7kbのＪδフラグメン
トをブロットの左側に示し、一方、５個の通常の再編
成、番号Ｉ〜Ｖを右側に示した。Ｉ〜Ｖの再編成の大き
さは、それぞれ、2.9kb、3.5kb、4.2kb、6.2kbおよび7.
1kbである。
5.発明の詳細な説明 5.1.γTCR 2bc型ポリペプチドおよび核酸 本発明は、2bc型と呼ばれるある型のヒトγTCRポリペ
プチドに関する（詳細は第８節および第９節に記載す
る）。また、本発明は、DNAおよびRNAなどのγ2bc型を
コードする核酸およびそれらに相補的な核酸に関する。
１型と2abc型γTCRポリペプチドとは、以前に、ヒト
γTCRの型であると報告されている（PCT国際公開番号第
WO88/00209、1988年１月４日発行）。１型γTCRポリペ
プチドは、約40,000ダルトンの分子量を有する。2abc型
γTCRポリペプチドは、約55,000ダルトンの分子量を有
する。2abc型のγTCR鎖は、１型より若干長いペプチド
骨格を有し、かつ１型より１個多い特別な潜在的Ｎ−結
合グリカンを有する。対照的に、本発明のγTCR鎖であ
る、2bc型は約40,000ダルトンの分子量を有する。その
上、2bc型γTCRポリペプチドは、若干短いペプチド骨格
および２〜３個少ないＮ−結合グリカンを有する。
γTCR鎖2bc型は、前述した2abc型と比較して、大きさ
が15kD以上も相違する（40kDに対して55kD）。この相違
は、5kD短いポリペプチド骨格（35kDに対して40kD）お
よび炭水化物量の減少（5kDに対して15kD）によって説
明される。2bc型の約35kDのポリペプチド骨格は、１型
からそれを区別することに役立つ：ちなみに１型の骨格
は40kDである。
同様に、γTCRポリペプチド2bc型は、定常領域（Ｃ
γ）遺伝子セグメントの使用において１型および2abc型
と相違する。１型のγTCR鎖は、単一のC IIエキソンを
含むＣγ１遺伝子セグメントによってコードされる定常
領域を有する（Krangel et al.,1987,Science 237:64−
67）。2abc型γポリペプチドは、３つのC IIエキソンコ
ピー、すなわちコピーａ、コピーｂおよびコピーｃを含
むＣγ２遺伝子セグメントによってコードされる（Kran
gel et al.,1987,Science 237:64−67;Littman et al.,
1987,Nature 326:85−88）。これに対し、2bc型は、2ab
c型のcDNAに存在するＣγ２第２エキソンによってコー
ドされた配列の１コピーを欠いている。このことによ
り、2bc型は２つのＣγ2C IIエキソンコピー、すなわち
コピーｂとコピーｃとを含有する。C IIのコピーａは、
2bc型では欠失しているが、膜を貫く領域と細胞外定常
ドメインとの間の結合領域の一部分をコードする。
６個の潜在的Ｎ結合炭水化物付着部位は、2bc型ポリ
ペプチド上に存在する。生化学データより、２〜３個の
Ｎ結合グリカンだけがポリペプチド鎖に付着しているこ
とが示唆され、全ての潜在的部位が使用されるわけでは
ないことが示唆された。
特別の実施態様において、γTCRポリペプチド2bc型
は、MOLT−13（Loh et al.,1987,Nature 330:569−57
2）Ｔ細胞系または胸腺由来クローンII（Bank et al.,1
986,Nature 322:179−181）の細胞から得られる。ま
た、γTCR鎖2bc型は、そのγTCR型を発現している被験
者のＴリンパ球から得られる。
2bc型のγTCRポリペプチドは、第14図に示されるγTC
Rポリペプチドの一次アミノ酸配列またはＣγ２のC II
のコピーｂとコピーｃとからなる定常領域を含むそれら
のいかなる部分をも含む。
また、本発明は、分子量約40,000ダルトンのγTCR 2b
c型ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。γT
CR 2bc型ポリペプチドの定常領域は、３つのＣγ２のC
IIエキソンのうち２つだけを有する核酸配列の翻訳によ
って生ずる。同様に、本発明はまた、２つのC IIエキソ
ンだけを有するＣγ２定常領域を含む核酸配列に関す
る。核酸は、DNA、cDNA、RNAおよびそれらに相補的な核
酸およびそれらの誘導体である。本発明の特別な実施態
様においては、DNA分子は、第14図に示す核酸配列の少
なくとも一部を含む。
第８節で議論する実施例では、2bcのγTCRポリペプチ
ドおよびそのコード核酸配列を記載する。第９節で議論
する実施例では、γTCRポリペプチドのジスルフィド結
合を形成するかどうか、またはグリコシル化されるかど
うかはその定常領域一次配列によって決定されることを
示す。
5.2.γTCR 2bc型含有ポリペプチド複合体 また、本発明は、γTCR鎖2bc型を含むポリペプチド複
合体に関する。特別の実施態様において、ポリペプチド
複合体はＴ細胞抗原レセプターダイマーからなる。とり
わけ、このようなダイマーは、ヘテロダイマー（γ，δ
ヘテロダイマー、γ，βヘテロダイマー、およびα，γ
ヘテロダイマー、またはγ′がγTCRポリペプチド１
型、2abc型または2bc型であるγ，γ′ヘテロダイマー
などを含むが、それらに限定されることはない）または
ホモダイマーである。
本発明の特別な実施態様において、γTCR 2bc型を含
むポリペプチド複合体はγδTCRヘテロダイマーであ
る。このように、δTCRポリペプチドおよびγTCR 2bc型
ポリペプチドの少なくとも一部を含む精製された複合体
が、本発明によって提供される。δポリペプチドは、少
なくとも１つの鎖内共有結合ジスルフィド結合を有して
もよい。加えて、このポリペプチドは、分子量約40,000
ダルトンのδTCRポリペプチドを含んでもよい。
下記実施例で詳細に示すように、γTCR 2bc型鎖は、
δTCR鎖を有する複合体と非共有結合的に会合する。こ
のようにして、γ2bc型は、ジスルフィド結合していな
いTCR複合体を形成する。また、γTCR鎖2abc型は、δTC
R鎖とジスルフィド結合ではなく複合体を形成し、（例
えば、IDP2細胞上で）、一方γTCR鎖１型は、δTCRポリ
ペプチドとのジスルフィド結合複合体を形成する。
下記第９節の実施例に示すように、γTCRの定常領域C
IIエキソンの使用（およびγTCR鎖の一次配列）は、TC
Rγおよびδ間のジスルフィド結合の存在の有無を決定
するばかりでなく、γTCRに付着した炭水化物量をも決
定し、この炭水化物量は、細胞表面のγTCRタンパク質
の大きさの相違に大きく寄与する。このようにして、本
発明は、ある定義された分子内結合（ジスルフィド結合
または非ジスルフィド結合）とγTCRグリコシル化の程
度とを有するγδTCRヘテロダイマーの発現を促進する
方法を提供し、そしてこれは特別なγ遺伝子を発現する
ことができる細胞中に特別なγポリペプチド型をコード
するγTCR遺伝子を導入し、細胞がδTCR鎖を発現する工
程を含んでなる。
加えて、本発明は、別のγTCRポリペプチド（例え
ば、１型、2abc型または2bc型）と会合した本発明のγT
CR 2bc型ポリペプチドを含む、精製された複合体を提供
する。本発明のある実施態様では、２種のγδTCRポリ
ペプチドが、少なくとも１つの鎖間の共有ジスルフィド
結合を介して互いに会合する。本発明の別の実施態様で
は、２種のγTCRポリペプチドは、互いに非共有結合的
に会合している。本発明のさらに別の実施態様におい
て、２種のγTCRポリペプチドは同一の定常ドメインを
有する。また、本発明の異なる実施態様では、２種のγ
TCRポリペプチドは異なる定常ドメインを有する。
5.3.γδTCRポリペプチドと反応性のモノクローナル抗
体 γまたはδＴ細胞抗原レセプターのエピトープに対す
るモノクローナル抗体（mAb）は、培地中で継代可能な
細胞系によって抗体分子の産生を提供するいかなる技術
を使用しても調製することができる。これらの技術に
は、最初にケーラーとミルシュタイン（Kohler and Mil
stein,1975,Nature 256:495−497）によって記載された
ハイブリドーマ技術、より最近のヒトＢ細胞ハイブリド
ーマ技術（Kozbor et al.,1983,Immunology Today 4:7
2）およびEBV−ハイブリドーマ技術（Cole et al.,1985
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.L
iss,Inc.,pp77−96）を挙げることができるが、これら
に限定されるものではない。
ある実施態様では、モノクローナル抗体は、抗ヒトモ
ノクローナル抗体またはキメラのヒト−マウス（または
他の種の）モノクローナル抗体であってもよい。抗ヒト
モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の多くの技
術のいずれを用いて作製してもよい（例えば、Teng et
al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:7308−7312;Ko
zbor et al.,1983,Immunology Today 4:72−79;Olsson
et al.,1982,Meth.Enzymol.92:3−16）。ヒト定常領域
を有するマウス（またはラットまたは他の種の）抗原結
合ドメイン含有キメラ抗体分子を調製してもよい（Morr
ison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851;
Takeda et al.,1985,Nature 314:452）。
また、本発明は、Ｔ細胞抗原レセプターと反応性を有
するモノクローナル抗体の同定法に関する。このような
mAbは、Ｔ細胞抗原レセプターとCD3複合体の両方を発現
する細胞にmAbを結合させるとCD3抗原をコモジュレート
する能力を検出することによって同定するとができる。
CD3のコモジュレーションは、例えば、細胞が結合する
標識抗CD3抗体の量を測定することによって検出するこ
とができる。この方法は、後述の第7.1.1節の実施例で
示すが、そこでは抗ＶδmAbであるδTCAR−３を分泌す
るハイブリドーマを同定するために使用する。
γまたはδTCRポリペプチドのエピトープに対する抗
体の分子クローンは、公知の技術によって作製すること
ができる。組み換えDNAの方法（例えば、Maniatis et a
l.,1982,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New Y
ork）は、モノクローナル抗体分子、またはそれらの抗
原結合領域をコードする核酸配列を構築するために使用
してもよい。
抗体分子は、公知の方法、例えば、免疫吸着またはイ
ムノアフィニティークロマトグラフィー、HPLC（高速液
体クロマトグラフィー）などのクロマトグラフィー法、
またはそれらを組み合わせた方法等によって精製しても
よい。
イディオタイプ分子を含む抗体のフラグメントは、公
知の技術によって作製することができる。このようなフ
ラグメントには、例えば、抗体分子のペプシン消化によ
って産生できるＦ（ab′）２フラグメント、Ｆ（ab′）
２フラグメントのジスルフィド結合を還元することによ
って作製できるFab′フラグメント、および抗体分子を
パパインと還元剤とによって処理して作製できるFabフ
ラグメントがあるが、これらに限定されるのものではな
い。
本発明の一実施態様は、δTCR鎖の可変領域に反応性
を有するモノクローナル抗体に関する。かかる抗体はδ
TCAR−３（aka TCSδ１）（第７節参照のこと）であ
り、特異的なδ遺伝子の再編成によって発現されたエピ
トープを認識する。第7.2節で記載するようにmAbδTCAR
−３は、γ，δ+Tリンパ球の増殖を促進することができ
る。また、モノクローナル抗体δTCAR−３は、γ，δ+T
リンパ球の細胞質の遊離カルシウムイオン濃度の上昇を
促進することができる。
別の実施態様においては、本発明は、γまたはδTCR
ポリペプチドの定常領域と反応性を有する抗体に関す
る。特別な実施態様においては、本発明はδTCR鎖定常
領域と反応するmAb TCRδ１に関する（第６節参照のこ
と）。また別の実施態様においては、本発明はγTCR鎖
の定常領域と反応するmAb抗Ｃγm1に関する（第8.1.7節
参照のこと）。
6.TCRデルタサブユニット定常領域と特異的な反応性を
有するモノクローナル抗体抗TCRδ１の生成 6.1.実験手順 6.1.1.抗TCRδ１を有するＴ細胞系のサイトフルオログ
ラフィー分析 δTCR鎖の定常領域と特異的に反応する抗TCRδ1mAb
を、以下のように作製した。1gのPEER細胞を50mLの0.3
％のCHAPS（３−［３−クロロアミドプロピルジメチル
−アンモニノ］１−プロパンスルホネート）界面活性剤
中で可溶化し、１μＬのUCHT1腹水（Beverley,P.C.,and
Callard.1981,Eur.J.Immunol.11:329−334）］、500μ
ＬのmAb187.1培養上清およびSACI（Staphylococcus aur
eus Cowan I株）で免疫沈降させた。６週間間隔で４
回、腹腔内注射を行ない、ついで、２％のTriton X−10
0を使用して免疫複合体からγδTCRを選択的溶出により
単離したγTCR（CD3なし）で最終の追加免疫を行なっ
た。溶出物質を、静脈内および腹腔内の双方に投与し
た。この最終免疫の４日後にマウスを殺し、前述のよう
に融合を行なった（Brenner,M.B.,et al.,1987,J.Immun
ol.138:1502−1509）。
γδTCR細胞系のPEERおよびIDP2またはαβTCR細胞系
のHPB−MLTおよびJURKATを50μＬの抗TCRδ１培養上清
で染色し、続いてFITC結合ヤギ抗マウスIgF（ab）′２
フラグメントを用いて染色し、オルソ社製のサイトフル
オログラフで分析した（第１図参照のこと）。対照はP3
X63.Ag8ハイブリドーマ（P3）によって分泌されるmAbと
し、抗CD3 mAbは抗Leu4とした（Ledbetter,J.A.,et a
l.,1981,J.Exp.Med.153:310）。
6.1.2.mAb抗TCRδ１の特異性の免疫化学的分析 表面125I標識IDP2細胞を可溶化し、それらのタンパク
質を対照のmAb P3、抗Leu4、抗TCRδ１または抗Ｃγ血
清を用いて免疫沈降させた。沈降サンプルをSDS−PAGE
で分析し、続いてオートラジオグラフィーを行なった。
CHAPS界面活性剤中で残っているγδTCRとCD3とは会合
し、抗Leu4によって複合体として免疫沈降した（第２
図、レーン３と４）。しかしながら、２％のTriton X−
100界面活性剤中で可溶化した後、抗TCRδ１はγδTCR
をCD3なしでダイマーの複合体として免疫沈降させ（レ
ーン６）、抗Leu4はCD3をγδTCRなしで三量体の複合体
として免疫沈降させた（レーン５）。γδTCR−CD3成分
鎖を分離した後、抗TCRδ１はTCRδだけを免疫沈降させ
（レーン７と８）。一方、抗Ｃγ血清はTCRγだけを免
疫沈降させた（レーン９）。鎖の分離実験のため（レー
ン７〜９）、CHAPS可溶化IDP2細胞からの抗Leu4免疫沈
降物を１％SDS中で煮沸し、その後４容の２％Triton X
−100で希釈し、抗TCRδ１または抗Ｃγ血清で免疫沈降
を行った。この後、以前に、用いた手順を行なう（Bren
ner,M.B.,et al.,1986,Nature 322:145）。
6.1.3.TCRδポリペプチドのＮ−結合グリコシル化 125I標識したIDP2細胞を0.3％のCHAPSで可溶化し、抗
Leu4で免疫沈降し、SDS−PAGEによって分離した（第３
図）。対照レーンはmock消化IDP2のδTCRポリペプチド
である。δTCRポリペプチドのＮ−グリカナーゼ消化は
次のように行なった。δTCRをゲルスライスから溶出さ
せ、37℃で16時間、0.17％のSDS、1.25％のNonidet P−
40を含む30μＬの0.2のＭリン酸ナトリウムバッファー
（pH8.6）中でＮ−グリカナーゼ（Genzyme Crop.）消化
を行なった（Tarentino,A.L.,et al.,1985,Biochemistr
y 24:4665）。消化したδTCRサンプルまたはmockインキ
ュベートδTCRサンプルをSDS−PAGEによって分析し、オ
ートラジオグラフィーで可視化した。
6.1.4.mAb抗TCRδ１によるcDNAクローンIDP20−240/38
のin vitro翻訳生成物の認識 pGEM−３−０−240/38と命名したプラスミドを次のよ
うに構築し、in vitro転写−翻訳に使用した（第４
図）。IDP20−240/38（δTCR）cDNAクローンの1.5kbの
インサートは、成分グループ０の配列のコドン７の範囲
内で始まり、そして残っているコード領域および大部分
の３′非翻訳領域を含む。このインサートを、部分EcoR
I消化によって（内部のEcoR I部位の開裂を防止するた
めに）λgt10アームから単一のEcoR Iフラグメントとし
て切断した。このフラグメントをBluescript＋ベクター
（Stratagene）ヘサブクローニングした。その後、この
インサートをベクターから単一のBamH I−Sal Iフラグ
メント（末端はBluescriptベクターのポリリンカーから
のものである）として削除し、pGEM−３（Promega Biot
ech）のT7プロモーターの下流に方向性クローニング（d
irectional cloning）した。生成されたpGEM3−０−240
/38プラスミドをSal Iで直鎖状にし、T7 RNAポリメラー
ゼを用いて合成された転写物をキャップした（Krangel,
M.S.,et al.,1987,Science 237:64）。転写物の完全性
および大きさを、32P−ATPを含有するアリコートの反応
混合物によりモニターした。1.5kbの一本鎖のRNA種が観
察された。35S−メチオニン存在下におけるin vitro翻
訳を、ウサギ網状赤血球溶解物中で行なった。in vitro
翻訳の後、サンプルを2mMのジチオスレイトールととも
に１％SDS中で沸騰させ、２％のTriton X−100を含むト
リス緩衝生理食塩水（pH7.5）を10容加えた。サンプル
を対照のmAb P3（第５図レーン１と３）または抗TCRδ1
mAb（レーン２と４）で免疫沈降させ、SDS−PAGEで分析
し、続いてフルオログラフィーを行なった（Bonner,W.
J.and Laskey R.A.,1974,Eur.J.Biochem.46:83−88）。
6.2.実験結果 我々は、モノクローナル抗体（mAb）である抗TCRδ１
を作製した。これはδTCR定常領域と特異的な反応性を
有していた。
PEER細胞系からのγδTCR−CD3複合体（Weiss,A.,et
al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:6998−7002;Br
enner,M.B.,et al.,1987,Nature 325:689−694）を、抗
体分泌ハイブリドーマ細胞系の産生における免疫原とし
て使用した。ハイブリドーマを、細胞表面結合（細胞フ
ルオログラフ分析）およびPEER細胞タンパク質の免疫沈
降の双方によってスクリーニングし、続いてSDS−PAGE
分析した。２種のハイブリドーマの上清（5A6と4A1）
は、PEER細胞表面に結合した。サブクローニングの後、
１つのmAb（5A6.E9、このモノクローナル抗体は、アメ
リカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に1988年
07月27日付けで寄託され、受託番号HB9772が付与されて
いる）の特徴づけをさらに行なった。このmAbはγδTCR
リンパ球（PEER,IDP2）表面に結合するが、αβTCR細胞
（HPB−MLT、JURKAT）または非Ｔ白血球（第１図、デー
タは示していない）とは反応しなかった。免疫原はγδ
TCRとCD3との複合体からなるが、γδTCR細胞系に対す
るmAbのより大きな親和性は、このmAbがCD3の抗原決定
基に対するものではないこと示唆した。
mAbの特異性は、各種の界面活性剤を使用する免疫沈
降の研究で決定されたが、これらの界面活性剤はレセプ
ター複合体を含むタンパク質の会合に影響を与えるもの
である。125I標識IDP2細胞をCHAPS界面活性剤で可溶化
した後、T Rγとδ、およびCD3のγ、δおよびεサブユ
ニットの会合した複合体の残存部分が抗CD3抗体によっ
て免疫沈降した（第２図、レーン３と４）。しかしなが
ら、放射性標識IDP2細胞を２％のTriton X−100界面活
性剤で可溶化すると、γδTCRとCD3とは大部分が解離
し、抗CD3mAbを使用すると、CD3の選択的な沈降が生じ
た（第２図、レーン５）。後者の条件において、mAb 5A
6.E9は会合されたCD3なしでヘテロダイマーとしてγδT
CRを免疫沈降させた（第２、図レーン６）。この観察か
ら、TCRγとTCRδとはジスルフィド結合していないヘテ
ロダイマーとして存在しているという最初の直接的な証
拠が提供された。mAb 5A6.E9がγTCR鎖、δTCR鎖または
組合わせの抗原決定基と反応するかどうかを決定するた
めに、分離されたポリペプチド鎖の免疫沈降が行なわれ
た。放射性標識され、CHAPSで可溶化されたIDP2細胞か
らの抗Leu4免疫沈降物を１％SDS中で沸騰させ、γTCR、
δTCRおよびCD3タンパク質を解離させた。４容の２％
Triton X−100で希釈した後、mAb 5A6.E9は特異的に40k
D（δTCR）種を免疫沈降させた（第２図、レーン７）。
１アリコートの同じの免疫沈降物を還元条件下で分析す
ると（第２図、レーン８）、SDS−PAGEの移動度の劇的
なシフトが観察された。この現象は、IDP2とPEER細胞系
からのδTCRに特徴的である（Brenner,M.B.,et al.,198
7,Nature 325:689−694）。対照的に、分離鎖が抗Ｃγ
血清とともに免疫沈降された場合には、55kD種（γTC
R）は免疫沈降したが、40kD種（δTCR）は免疫沈降しな
かった（第２図、レーン９）。これらの生化学的研究お
よび表面結合の研究に基づいて、mAb 5A6.E9を抗TCRδ
１という。
PEERとIDP2に加えて、抗TCRδ１もまた、MOLT−13お
よびPBL系２を含む他のγδTCR細胞系からTCRδを免疫
沈降させた。次の実験では、抗TCRδ１はTCRδ定常
（Ｃ）遺伝子セグメントによってコードされる抗原決定
基と反応することが示された。
我々は、TCRδサブユニットをコードする遺伝子を表
示するサブトラクティブアプローチによって、IDP2細胞
系（例えば、０−240/38）からcDNAクローンを単離し
た。サザンブロット実験において、IDP2グループ０のcD
NAクローンがハイブリダイズする遺伝子はγδTCRリン
パ球において、発現され、再編成されるが、αβTCR細
胞においては発現されない（そして、しばしば欠損して
いる）。他のTCR遺伝子との配列比較によると、これら
のcDNAクローンは、新規なＶ、Ｄ、ＪおよびＣ遺伝子セ
グメントからなるらしい。IDP2グループ０コンポジット
のDNA配列は、２つの潜在的アスパラギン結合グリコシ
ル化部位を有し、分子量が31.3キロダルトンであること
が予測される長いオープンリーディングフレームを含
む。グリコシル化されていないδTCRタンパク質の分子
量と成熟したIDP2のδTCRポリペプチド上に存在するア
スパラギン結合炭水化物の数を決定するために、ゲル精
製δTCRをＮ−グリカナーゼ処理またはmockインキュベ
ートし、SDS−PAGE分析した（第３図）。Ｎ結合炭水化
物を除くとみかけの分子量が5kD減少し（40kDから35kD
へ）、IDP2のδTCR上に２種類の（2.5〜3kD）Ｎ結合グ
リカンが存在することが示唆された。これは、第５図の
翻訳アミノ酸配列から予想されるＮ結合グリカンの数と
よく相関した。タンパク質のみかけの分子量は、3.7kD
と予想されたものとは相違したが、一般的に一致した。
IDP2細胞上の抗TCRδ１の反応性、δTCRポリペプチド
に対する特異性および部分変性（SDSで煮沸）δTCRの認
識について、我々はこのmAbがδTCRのcDNAのクローンに
よってコードされたポリペプチドを直接的に認識するは
ずであるか否かを試験した。このようにして、cDNAクロ
ーンIDP2 0−240/38からのインサートをpGEM−３発現ベ
クター中、T7プロモーターの下流にサブクローニングし
た（第４図）。その後、T7 RNAポリメラーゼでin vivo
生成された転写物を、ウサギの網状赤血球溶解物系で使
用し、35S−メチオニン存在下におけるタンパク質の合
成させた。in vitro転写−翻訳の後、反応混合物を１％
SDS中で沸騰させ、10容の２％のTriton X−100で希釈
し、イソタイプ適合型の対照のmAbまたは抗TCRδ１のい
ずれかで免疫沈降させた。抗TCRδ1mAbは優先種（34k
D）を特異的に免疫沈降させた（第５図、レーン４）。
対照のmAbを使用した場合（レーン３）、RNA転写物を除
いた場合（レーン１と２）、またはγTCR構築物を使用
した場合には、免疫沈降物の中にはこのようなバンドは
観察されなかった。このようにして、mAb抗TCRδ１によ
って免疫沈降された放射性標識種は、該合成物がIDP2 0
−240/38のcDNAクローンによって特異的に合成されたδ
ポリペプチドに対応する。このポリペプチド（34kD）
は、Ｎ−グリカナーゼ処理されたIDP2のδTCR鎖（35k
D）と比較して、大きさが非常に近い。IDP2 0−240/38
クローンは、リーダー配列と同様に天然のATG開始コド
ンを欠損している。このクローンのＶ領域の範囲内に、
２つの潜在的な内部ATGコドン（12番残基および44番残
基）がある（第５図）。これらのコドンを使用して合成
を開始すると、注目すべきマイナーな種に起因する２種
以上のポリペプチド種が生じる（第５図レーン４）。こ
のようにして、クローンIDP2 0−240/38によってコード
されるIDP2のδTCRサブユニットのmAb、抗TCRδ１によ
る直接的血清学的認識が存在する。
7.TCRδサブユニットの可変領域部と特異的に反応する
モノクローナル抗体δTCAR−３の生成 7.1.実験方法 7.1.1.T細胞抗原レセプターの免疫沈降およびSDS−PAGE
分析 δTCR鎖の可変領域に特異的な反応性を有するδTCAR
−3mAbを、次のように作製した。１匹のマウスに２×10
7個のMOLT−13細胞を腹腔内注射して免疫した。１ケ月
後に、１×107個のMOLT−13細胞を３日間連続してマウ
スに静脈注射し、免疫脾臓細胞を50％のポリエチレング
リコール1500の存在下でマウスのミエローマであるP3x6
3Ag8.653細胞と融合させた。CD3のコモジュレーション
をフローサイトメトリーで分析することによってハイブ
リドーマをスクリーニングした（ここで得られたハイブ
リドーマは、1987年10月29日付けでATCCに寄託され、受
託番号HB9578が付与されている）。CD3のコモジュレー
ションの分析は、α、βＴ細胞抗原レセプターに対する
抗体を細胞とともにインキュベートしたときに、これら
がCD3複合体のインターナリゼーションを引き起こすと
いう観察に基づくものであった（Lanier,L.L.,et al.,1
986.J.Immunol.137:2286;Meuer,S.C.,et al.,1983,J.Ex
p.Med.157:705）。
MOLT−13、PEER、およびHPB−ALL細胞系は、ラクトパ
ーオキシダーゼ技術を使用してヨード化した。125I−β
F1標識細胞を１％のTriton X−100を含有するトリス緩
衝生理食塩水（pH8）で可溶化した。溶解産物をδTCAR
−３抗体またはβF1抗体を用いて免疫沈降した。βF1は
βTCR鎖に対するフレームワークモノクローナル抗体で
あり、他の文献に記載されている（Brenner,M.B.,et a
l.,1987,J.Immunol.138:1502−1509）。全サンプルを還
元条件下または非還元条件下でSDS−PAGE分析した（第
６図）。MOLT−13とPEERは両方ともCD3+4-8-WT31-であ
った。HPBはCD3+4+8+WT31+であった。
第６図に示したように、δTCAR−３はMOLT−13および
PEER細胞からのジスルフィド結合していないγ鎖および
δ鎖を免疫沈降させ、一方、βF1はHPB−ALL細胞からの
ジスルフィド結合したα鎖およびβ鎖を免疫沈降させ
た。δ鎖およびγ鎖に対応するバンド間のオートラジオ
グラフ強度の相違は、これらの二種のタンパク質のヨー
ド化の程度の相違を表わす。
7.1.2 δTCAR−３抗体によるδTCR鎖の免疫沈降 第７図は、0.3％CHAPS（３−［（３−クロロアミドプ
ロピル（cholamidopropyl）ジメチルアンモニ］１−プ
ロパンスルホネート）を含むトリス緩衝生理食塩水（pH
8）または１％のTriton X−100で可溶化された125I−標
識MOLT−13細胞を示す。１％のTriton X−100中で、γ
δTCRはCD3複合体から解離し、一方0.3％のCHAPS中では
γδTCRはCD3複合体と会合して残る。免疫沈降の前に、
第７図のレーン３、４および７で使用した125I−標識溶
解物を、終濃度１％になるまでSDSを加えて変性させ、
続いて68℃で５分間加熱した。冷却後、ヨードアセトア
ミドを終濃度が20mMとなるまで加えた。この混合物を、
４容の1.5％のTriton X−100を含むトリス緩衝生理食塩
水（pH8）で希釈した。この変性プロセスにより、γ
鎖、δ鎖およびCD3タンパク質が相互に完全に解離す
る。全てのサンプルを、還元条件下（Ｒ）であるレーン
４のサンプルを除いて、非還元条件（Ｎ）下でSDS−PAG
E分析した。還元条件下および非還元条件下におけるδ
鎖の移動度の相違に注意すべきである。γ定常領域から
の20アミノ酸の合成ペプチドでウサギを免疫して、抗Ｃ
γ抗血清を得た（残基117番〜136番）。
7.1.3.フローサイトメトリーによる細胞表面染色分析 ５×105個の細胞を適切な抗体（NMS（正常マウス血
清）、δTCAR−３、OKT−３、またはWT31）とともに４
℃で30分間インキュベートし、0.2％のBSAを含むPBS（p
H7.4）で２回洗浄した。フルオレセイン結合ヤギ抗マウ
スIgGとともに４℃で30分間インキュベートした後、細
胞をオルソ社製のサイトフルオログラフで分析した（第
８図）。
7.1.4.δTCAR−3+とOKT3+末梢血液リンパ球（PBL）の二
色サイトフルオログラフ分析 最初に末梢液リンパ球をδTCAR−３とともに４℃で30
分間インキュベートした。洗浄後、この細胞をフィコエ
リトリン（PE）結合ヤギ抗マウスIgGとともに４℃でさ
らに30分間インキュベートした。洗浄後、細胞をフルオ
レセイン結合OKT3とともに４℃で30分間インキュベート
し、そして細胞をオルソ社製のサイトフルオログラフで
分析した（第９図）。
7.1.5.細胞質内Ca2+濃度（［Ca2+］ｉ）の経時測定 MOLT−13細胞を、10％ウシ胎児血清を添加したRPMI16
40中107個/mLの濃度で、温度37℃にて30分間、Ca2+感受
性プローブ fura2のアセトキシメチルエステル型（ジ
メチルスルホキシド中1mM濃度のストックから２μＭを
使用（Molecular Probes,Eugene,Oregon）で標識した。
その後、細胞を洗浄し、５％のウシ胎児血清を添加した
ハンクス平衡塩溶液（HBSS）に107個/mL濃度で再懸濁
し、使用するまで室温にて、暗所で保存した。蛍光測定
の直前に、２×106個の細胞を遠心分離し、2mLの新鮮な
HBSSに再懸濁し、37℃で石英キュベットに入れ、コンス
タントに撹拌した。SPF−500C蛍光検出器（SLM Amico,U
rbana,Illinois）で細胞懸濁液の蛍光を、340（±２）
〜380（±２）nmの間の励起波長を用い、放出を510（±
５）nmで検出した。350/380の比を自動的に計算し（２
秒ごとに１つの比）、プロットし、IBM PC ATに格納し
た。蛍光の比からの［Ca2+］ｉの定量化は、Grynkiewic
sら（1985,J.Biol.Chem.260:3440）が記載したように行
なった。不適当な抗体を加えても［Ca2+］ｉは変化しな
かったが、１μＭの［Ca2+］ｉで細胞溶解が生じた。
7.2.結果 我々は、モノクローナル抗体、δTCAR−３を作製し
た。このモノクローナル抗体は、TCRδ鎖の可変領域に
対するものであり、かつδポリペプリドを特徴づけるた
めに使用することができる。このモノクローナル抗体は
γδTCRを有するＴ細胞と結合し、またMOLT−13細胞に
結合するとfura−２のCa2+シグナルを顕在化させる。
δTCAR−３モノクローナル抗体は、CD3+4-8-WT31-表
現型を有するMOLT−13細胞系でマウスを免疫することに
より生成させた。最初に、ハイブリドーマをCD3コモジ
ュレーションによってスクリーニングした。さらに陽性
クローンを免疫沈降によってスクリーニングした。125I
標識MOLT−13およびPEER溶解物からのγδTCRヘテロダ
イマーのδTCR−３免疫沈降を、第６図に示した。δTCA
R−３は、HPB−ALLからいずれのポリペプチドをも免疫
沈降させなかった（第６図）。対照的に、βF1、すなわ
ちβ鎖に特異的なフレームワークモノクローナル抗体
（Brenner,M.B.,et al.,1987,J.Immunol.138:1502−150
9）は、HPBB−ALL細胞系からαβヘテロダイマーを免疫
沈降させた（第６図、レーン10および12）。MOLT−13と
PEER細胞からの免疫沈降γδレセプターは、還元条件下
または非還元条件のいずれかで分析した場合にも、これ
ら二種類の細胞系においてジスルフィド結合していない
γδTCRを示唆するヘテロダイマー構造を示した。非還
元条件下で観察した場合と比べて、還元条件下ではδ鎖
の移動度が若干シフトし（第６図、レーン１と３、５お
よび７）、IDP2とPEER細胞系で以前に注目された現象
（Brenner,M.B.,et al.,1987,Nature 325:689−694）
は、鎖内ジスルフィド結合の存在を示唆した。δTCAR−
３抗体がCD3と会合したγδTCRを認識することを示すた
めに、0.3％のCHAPS界面活性剤で可溶化した125I標識MO
LT−13細胞溶解物を使用して免疫沈降を行なった（第７
図、レーン１）。これらの条件下で、レセプターと会合
したCD3複合体が残り、γδヘテロダイマーおよびCD3複
合体の両方はδTCAR−３によって免疫沈降した。しかし
ながら、125I標識溶解物をγδレセプターからのCD3複
合体と大きく解離させる１％のTriton X−100界面活性
剤で可溶化すると、γδヘテロダイマーだけがδTCAR−
３によって免疫沈降する（第７図、レーン２）。対照と
して、抗CD3抗体、UCHT−１（Beverley,P.C.and Callar
d,R.E.,1981,Eur.J.Immunol.11:329−334）は、CD3複合
体だけを免疫沈降させるが、γδヘテロダイマーは免疫
沈降させない（第７図、レーン５）。
δTCAR−３の特異性を、γ，δTCRとCD3タンパク質と
が完全に解離した変性125I標識MOLT−13溶解産物の免疫
沈降を使用して分析した。δTCAR−３は、非還元条件下
におけるみかけの分子量は38kD（第７図、レーン３）、
還元条件下では40kD（レーン４）のδ鎖を特異的に免疫
沈降させた。抗Ｃγ抗血清は、還元条件下で分子量42kD
のγ鎖を免疫沈降させた。これらのデータは、δTCAR−
３がδ鎖特異的であることを示す。
δTCAR−３は、PEERおよびMOLT−13細胞系からγ，δ
TCRヘテロダイマーを免疫沈降させるばかりでなく、こ
れらの細胞系の表面およびIDP2クローンにも結合した
（Brenner,M.,et al.,1987,Nature 325:689−694）。δ
TCAR−３は、αβTCR担持HPB−ALLとJurkat細胞系には
結合しなかった（第８図）。対照的に、WT31（Tax,W.J.
M.,et al.,1983,Nature 304:445−447）、すなわち、α
βTCRに対するフレームワークモノクローナル抗体は、
αβTCR陽性HPB−ALL細胞系およびJurkat細胞系とは反
応するが、γδTCR陽性MOLT−13、PEER細胞およびIDP2
細胞（第８図）とは反応しなかった。正常な末梢血液リ
ンパ球（PBL）を試験すると、CD3+リンパ球のサブ集団
（0.9〜2.4％）はδTCAR−３陽性であった。（第９
図）。組織培養プレート上に固定されたδTCAR−３を正
常ヒトPBLの培養に使用した場合には、γδTCR陽性サブ
集団の増殖を選択的に刺激した。培養45日後、γδTCR
サブ集団は全細胞数の96％を示した。
αβＴ細胞抗原レセプターに対する抗体は、細胞質の
遊離カルシウムイオン濃度［Ca2+］ｉの上昇を刺激した
（Weiss,A.,et al.,1986,Ann.Rev.Immunol.4:593）。MO
LT−13細胞とδTCAR−３とのインキュベーションによ
り、抗T3抗体によって誘導された応答に類似する［C
a2+］ｉの急速な上昇を引き起こした（第10図）。さら
に、δTCAR−３は上述のように、PEER細胞およびPBLか
ら作られたγδTCR陽性細胞系におけるのCa2+フラック
スを同様に刺激した。また、我々は、MOLT−13、PEER、
およびIDP2細胞とδTCAR−３とのインキュベーションに
よりCD3タンパク質複合体のコモジュレーションが惹起
されることを観察した。
さらにまた、mAbであるδTCAR−３のエピトープ特異
性の他の特徴付け（mAb TCSδ１という）を、後述の11.
2.2.節に示す。
8.ヒトＴ細胞レセプターγδの３つの型：選ばれた健常
人における１の型の好適な用途 この実施例においては、TCRδ鎖と非共有結合的に会
合した40kDのTCRγ糖タンパク質からなる、新しい型の
ヒトＴ細胞レセプターγδ（γδTCR）の構造を示す。2
bc型という新たに同定されたγTCR糖タンパク質は、上
述したジスルフィド結合で架橋していないTCRγ型（2ab
c型）と比較して、大きさが15kD以上（55kD対40kD）相
違する。この相違は、ポリペプチド骨格が5kD小さく（4
0kD対35kD）、炭水化物量が少ない（15kD対5kD）によ
る。2bc型に対応するcDNAクローンのヌクレオチド配列
分析より、2bc型のcDNAクローンは、他のジスルフィド
結合していないTCRγサブユニット（2abc型）のcDNA中
に存在する、定常領域（ｃγ２）の第２エキソンを１コ
ピー欠いていることが明らかになった。このC IIエキソ
ンコピーは、膜貫通領域と細胞外定常ドメインとの間の
結合部領域をコードする。潜在的なＮ結合炭水化物付着
部位の数及び局在はいずれのジスルフィド結合していな
い型と同じであるので、おそらくはタンパク質のコンホ
メーションに影響を与えることによって、結合領域が付
着炭水化物量に影響するものと結論された。対照的に、
γδTCR型のδTCRサブユニットはペプチド骨格の大きさ
またはペプチド地図分析においては、ほとんど多様性を
示さなかった。
また、我々は末梢血におけるγδTCR複合体の３つの
型の使用について調べた。ジスルフィド結合型（１型）
は、ある健常被験者において、ほぼ排他的に使用され
た。何人かでは、１型は2bc型とともに発現された。2ab
c型は、試験された被験者では同定されなかった。
8.1.実験方法 8.1.1.抗体 使用したモノクローナル抗体は、抗Leu4（抗体CD3）
（Ledbetter et al.,1981,J.Exp.Med.153:310−323）、
βF1（抗βTCR）（Brenner et al.,1987,J.Immunol.13
8:1502−1509）、抗TCRδ１（抗δTCR）（前記第６節参
照のこと、δTCR鎖定常領域と反応性）、P3（対照）（P
3X63.Ag8によって分泌された抗体（Koehler and Milste
in,1975,Nature 256:495−497）、187.1（ラット抗マウ
スκ軽鎖）（Yelton et al.,1981,Hydridoma 1:5−1
1）、およびWT31（明るく染色するαβTCRリンパ球）
（Spits et al.,1985.J.Immunol.135:1922−1928）であ
った。抗Ｃγｂペプチド血清（抗γTCR）は、22個から
なるアミノ酸合成ペプチドに対して得られた。（Gln−L
eu−Asp−Ala−Asp−Val−Ser−Pro−Lys−Pro−Thr−I
le−Phe−Leu−Pro−Ser−Ile−Ala−Glu−Thr−Lys−C
ys）（PCT国際公開番号第WO88/00209号、1988年１月14
日公開）。
8.1.2.細胞系 PEER（Weiss et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.83:6998−7002）およびMOLT−13（J.Minowada,Lohら
によって単離された細胞、J.Minowada,Loh et al.,198
7,Nature 330:569−572）はＴ白血病性細胞系である。
臍帯血由来のクローンWM−14（Alarcon et al.,1987,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:3861−3865）、末梢血由来
細胞系IDP2（Brenner et al.,1986,Nature 322:145−14
9:PCT国際公開番号第WO88/00209号、1988年１月14日公
開）、および胸腺由来クローンII（Bank et al.,1986,N
ature 322:179−181）を、前述のように培養した。末梢
血由来細胞系２（PBL−L2）を、mAb WT31で染色されな
い末梢血単離リンパ球を選別することによって単離し
た。その後、単離細胞を、IL−２と10％（v/v）ヒト血
清とを含有する10％（v/v）馴化培地を添加したRPMI164
0培地にて、in vitroで増殖させ、放射線を照射した自
己由来のフィーダー細胞で３週間ごとに刺激した。
8.1.3.ヨード化と免疫沈降 ２×107細胞をフィコール−ジアトリゾエート（Organ
on Teknika Corp.）遠心分離によって単離し、100μｇ
のラクトパーオキシターゼ（80〜100U/mg、Sigma）と1m
CiのNa125I（New England Nuclear）を加えた、1mMのMg
Cl2、5mMのグルコースを含有する0.5mLのリン酸緩衝生
理食塩水（pH7.4、PBS）中で、氷上にてヨード化した。
30分間の反応時間中、0.03％の過酸化水素10μＬを５分
間間隔で加えた。細胞を1mMのフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド（PMSF,Sigma）と8mMのヨードアセトア
ミド（IAA,Sigma）を含有するTBS（50mMのトリス−ベー
ス（pH7.6）、140mM NaCl）を添加した界面活性剤で、
一夜可溶化した。ここで示すように、この実験で使用す
る異なる界面活性剤としては、0.3％（w/v）の３−
［（３−クロロアミドプロピルジメチルアンモニ）］１
−プロパン−スルホネート（CHAPS,Sigma）、１％（w/
v）シギトニン（Aldrich）およびTriton X−100（TX−1
00,Sigma）がある。10,000×ｇで20分間遠心して不溶性
物質を除いた後、界面活性剤溶解物を４μＬの正常ウサ
ギ血清（NRS）と400μＬの187.1ハイブリドーマ培地と
ともに30分間インキュベートすることによって予備清浄
し、続いて固定化Staphylococcs aureus Cowan I（Pans
orbin,Calbiochem）の10％（w/v）細胞懸濁液を200μＬ
加えた。１時間インキュベーションした後、Pansorbin
を遠心分離により除去した。0.25μＬのβF1の腹水、１
μＬの1mg/mLの抗Leu4または0.25μＬのP3の腹水を、15
0μＬの187.1培養上清とともに各サンプルに加えて特異
沈降を行い、続いて１時間インキュベーションした。10
0μＬの10％（v/v）プロテインＡ−セファロース（Phar
macia）を加え、４℃で１時間ロッキングした。免疫沈
降物をTBSを含有する0.1％（v/v）のTriton X−100を用
いて５回洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）（Laemmli,1970,Na
ture 227:680−685）で分析した。
抗Ｃγｂペプチド血清を用いる免疫沈降用のために、
ヨード細胞をTBSを含有する１％（w/v）のドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）で可溶化し、ついで３分間沸騰させ
た。冷却後、PMSFおよびIAAを含み、２％（v/v）Triton
X−100を含むTBSの５容量を、1mg/mLのデオキシリボヌ
クレアーゼ（DNase）と0.5mg/mLのRNaseとを含む50mM M
gCl2混合物200μＬとともに加えた。予備清浄及び免疫
沈降は、前記のように187.1mAbを添加せずに行なった。
免疫沈降物を0.5％（v/v）のTriton X−100、0.5％（w/
v）のデオキシコート（DOC）、0.05％（w/v）のSDSを含
むTBS中で洗浄した。
8.1.4.生合成標識 ４×107個の対数増殖期にある細胞を、10％の透析ウ
シ胎児血清（FCS）および20mMヘペスを加えた、メチオ
ニンおよびシステイン不含RPMI1640（Select−Amine ki
t,Gibco）4mLに再懸濁した。37℃で30分間の欠乏状態に
置いた後、1mCiの35S−メチオニンと1mCiの35S−システ
インとを加え、15分間標識した。細胞を集めて、２％
（v/v）のTriton X−100を含むTBSで可溶化した。前記
のように予備清浄及び免疫沈降を行なった。免疫沈降物
を0.5％（v/v）のTriton X−100、0.5％（w/v）のデオ
キシコール酸、0.05％（w/v）のSDSを含むTBSで４回洗
浄し、続いて、0.5％（v/v）のTriton X−100、0.5MのN
aCl、5mMのEDTA、50mMのトリス（pH7.6）で３回洗浄し
た。このサンプルをSDS−PAGEで分析し、標準的なフル
オログラフィー手順によって可視化した（Bonner and L
askey,1974,Eur.J.Biochem,46:83−88）。
8.1.5.δTCRタンパク質のゲル精製 表面ヨード化細胞を0.3％（w/v）CHAPS−TBSで可溶化
し、50μＬの抗Leu4結合セファロースビーズを用いて免
疫沈降させた。免疫沈降種を非還元条件下でSDS−PAGE
によって分離させ、湿ったゲルを４℃にて24時間、XAR
−５フィルム（Kodak）を感光させて、放射性標識δTCR
タンパク質を可視化した。δTCRに対応するゲル領域を
除去し、５％（v/v）の２−メルカプトエタノールを含
むサンプルバッファー中でインキュベートし、SDS−PAG
Eによって２回目の分離を行なった。還元による特徴的
なSDS−PAGE移動度のシフトのために、δTCRタンパク質
が分離し、夾雑物からの精製が可能となった。TCRタン
パク質を0.05％（w/v）のSDSを含有する50mMの炭酸水素
アンモニウムバッファー中で、37℃にて、１夜インキュ
ベートしてゲルスライスから溶出させ、凍結乾燥した。
8.1.6.エンドグリコシダーゼ消化 エンドグリコシダーゼＨ（Endo H）消化用のために、
免疫沈降物質またはゲル精製タンパク質を、40μＬの0.
14Mの２−メルカプトエタノールを含有する１％（w/v）
のSDS溶液中で３分間沸騰させた。冷却後、1mMのPMSFを
含有する0.15Mの酢酸バッファー（pH5.5）、360μＬで
混合物を希釈した。５μＬのEndo H（1U/mLのEndo−β
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ Ｈ、Genzyme）
を、37℃で14時間、上記溶液の半量とともにインキュベ
ートし、残りの半分をmock処理した。
Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−GLY）消化用に、ゲル精製物
を0.5％（w/v）のSDSを含む0.10Mの２−メルカプトエタ
ノール35μＬ中で３分間沸騰させた。その後、100μＬ
の0.2Mのリン酸ナトリウム（pH8.6）、1.25％（v/v）の
Triton X−100を加えた。混合物の半分を、１μＬのＮ
−グリカナーゼ（250U/mL、ペプチド−Ｎ−［Ｎ−アセ
チル−β−グリコサミニル］アスパラギン・アミダー
ゼ:Genzyme）とともにインキュベートし、37℃にてさら
に16時間インキュベートし、一方、残りの半分をmock処
理した。
消化後、ウシ血清アルブミン10μｇをキャリアーとし
て加え、トリクロロ酢酸沈降によってサンプルを回収し
た。タンパク質のペレットは、５％（v/v）の２−メル
カプトエタノールを含有するサンプルバッファー中に集
めた。
8.1.7.モノクローナル抗体抗Ｃγm1産生 HPB−MLTのpTγ−１のＣγC IエキソンとC IIエキソ
ンの部分を、ヌクレオチド位置571と848でBamH IとPst
Iとを使用して単離し（Dialynas et al.,1986.Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.83:2619−2623）、発現ベクターpRIT
2T（Pharmacia）中にクローニングした。生じるプロテ
インＡ融合タンパク質を、大腸菌（E.coli）N4830で発
現させた。リゾチームを用いて細菌を溶解し、融合タン
パク質をIgGセファロースカラムを用いた精製によって
単離した。０、７および28日目に、融合タンパク質100
μｇを含むフロイントアジュバンドをマウスの腹腔内に
注射した。28日後、融合タンパク質100μｇを含むPBSを
静脈注射した。３日後、脾臓細胞を単離し、ブレナー等
の記載に従ってハイブリドーマP3×63Ag8.653と融合さ
せた（Brenner et al.,1987,J.Immunol,138:1502−150
9）。ハイブリドーマをELISA（enzyme−linked immunoa
bsorbentassay）を用いてスクリーニングした（ここで
得られたハイブリドーマは、1988年07月27日付けでATCC
に寄託され、受託番号HB9773が付与されている）。96ウ
エル平底プレート（LINBRO,Flow Laboratories）を、0.
4μｇの融合タンパク質または非融合タンパク質を含むP
BSを用いて一晩インキュベートした。23℃にて、0.25mg
/mLの正常ウサギIgG（Sigma）を含む、50％（v/v）のFC
S含有PBSを用いて非特異結合部位をブロックした。50μ
Ｌのハイブリドーマの上清を、４℃で１時間かけて加
え、続いて５μg/mLのパーオキシダーゼ結合抗マウスIg
G（Cappel）50μＬ中で、同様にインキュベートした。
記載したインキュベーションの全てに、10％（v/v）のF
CS、0.1％（w/v）のBSAを含むPBSを使用した洗浄ステッ
プを行った。0.08％（w/v）のｏ−フェニレンジアミン
（Sigma）を含む0.012％（w/v）過酸化水素含有リン酸
−クエン酸塩バッファー（pH5.0）を用いてELISAを発色
させた。
抗Ｃγm1（IgG1）はサイトフルオログラフ分析におい
て天然のγδTCR/CD3複合体を認識せず、また免疫沈降
においてTriton X−100可溶化細胞からのγδTCRヘテロ
ダイマーも認識しないが、CD3/γδTCRタンパク質を個
別の鎖へ分離した後、生合成標識γTCR前駆体および成
熟γTCRタンパク質を認識する。この方法では、抗CD3免
疫沈降物を１％（w/v）のSDSを含むTBS中で沸騰させる
ことによって、CD3/γδTCR複合体を個々の鎖へ分離さ
せた後、抗Ｃγm1はγTCRタンパク質を認識することが
示された。
8.1.8.MOLT−13γTCR cDNAクローンの単離および配列決
定 ポリ（Ａ）+RNAを尿素／塩化リチウム沈降によってMO
LT−13細胞から調製し、続いてオリゴ（dT）セルロース
アフィニティクロマトグラフィーを行なった。ヘアピン
ループ開裂用ナタ豆（Mung bean）ヌクレアーゼ（McCut
cham et al.,1984,Science 225:626−628）を用いるHuy
nh等の方法（Huynh et al.,1985,DNA Cloning,Glover,
D.M.ed.IRL Press,Oxford,I:49−78）によって、λgt10
cDNAライブラリーをポリ（Ａ）+RNAから調製した。cDN
Aライブラリーを大腸菌（E.coli）株C600Hf1上で増幅さ
せ、32P−標識PTγＩをプラークフィルターハイブリダ
イゼーションによってスクリーニングした（Dialynas e
t al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 83:2619−262
3）。陽性クローンを大きさおよび制限酵素地図につい
て分析し、cDNAクローンM13Kを配列決定のために選択し
た。M13KのcDNAを、エンドヌクレアーゼEcoR Iを用いて
λgt10ファージから切り出し、さらに適切な制限酵素で
消化した。フラグメントをM13ベクターヘサブクローニ
ングし、修飾T7ポリメラーゼ（シーケナーゼ（Sequenas
e,United States Biochemical Corp.））を使用するジ
デオキシチェインターミネーター法（dideoxy chain te
rmination method）によって配列決定した。
クローンM13Kは、36ヌクレオチドの５′未翻訳領域と
72ヌクレオチドの３′非コード領域とを含有する、フレ
ーム内の、全長γTCR転写物に対応する（第14図）。Ｖ
領域のヌクレオチド配列は、推定シグナル配列中におけ
るＣ〜Ｔ（Ile〜Val）の53ヌクレオチド変化を除き、ゲ
ノムＶγ1.3の配列と同じである（Lefrancらに基づく命
名:Lefranc et al.,1986a,Cell 45:237−246:Strauss e
t al.,1987.Science 237:1271−1219）。Ｊ領域はＪγ
2.3の配列と同じである（Lefrancらに基づく命名:Lefra
nc et al.,1986b,Nature 319:420−422:Quertermous et
al,1987,J.Immunol.138:2687−2690）。驚くべきこと
に、８ヌクレオチドが、Ｖ−Ｊ結合領域で生じた。これ
はゲノムＶ配列またはＪ配列によってコードされていな
いらしく、かつ、おそらくＮ領域を表わすＶ−Ｊ結合領
域を表す。Ｃ領域の配列は、ヌクレオチド559（Ｇから
C:ValからIle）およびヌクレオチド908（ＴからC;Metか
らThr）を除いて対応ゲノム配列と一致する（Lefrnac e
t al.,1986c,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:9596−960
0）。
8.2.結果 8.2.1.新規γδTCRタンパク質複合体 末梢血γδTCRリンパ球の予備実験より、既知のヒト
γδTCR型と異なるCD3会合複合体が存在することが示さ
れた。この型を叙述する試みにおいて、我々は正常ヒト
のドナー由来の多くの細胞系の作製と、特徴づけとを行
なった。末梢血リンパ球はモノクローナル抗体（mAc）W
T31で染色され、それにより休止しているαβTCRリンパ
球が明るく染色される。染色されない細胞を細胞のソー
ティングによって単離し、IL−２を含む培地中でin vit
roで増殖させた。この方法で得られた末梢血リンパ球系
２（PBL−L2）は、均一にCD3+CD4-CD8-であり、γδTCR
リンパ球の細胞表面表現型の特徴であることが証明され
た。
PBL−L2細胞上のγδ複合体を可視化するために、CHA
PSまたはジギトニンで可溶化した細胞表面125I標識細胞
からの抗CD3mAbを用いて免疫沈降法を行なった。これら
の界面活性剤中では、CD3複合体とγδTCRサブユニット
との間で物理的会合が保持された。PBL−L2細胞からの
抗CD3免疫沈降物のSDS−PAGEでは、40kDと44kDのタンパ
ク質（40kDタンパク質という）が分離された。これら
は、抗Ｃγｂ血清（γTCR定常領域ペプチドに対する抗
血清）によってγTCRサブユニットとして同定されるタ
ンパク質である（第11A図、方法の節を参照のこと）。
PBL−L2上のこれらのγTCRタンパク質は非共有結合的
にδTCRサブユニットと会合しており、非還元条件下で
分析された抗CD3免疫沈降物中に弱いヨード化タンパク
質として可視化された（第11A図、レーン６、黒い矢
印）。この弱いヨード化タンパク質は、抗Ｃγｂ血清に
よって認識されないので、PBL−L2細胞上のδTCRサブユ
ニットを表わす（第11A図、レーン８）。加えて、IDP2
およびPEER細胞上のδTCRタンパク質について明記した
ように（下記、PCT国際公開番号第WO88/00209号、1988
年１月14日公開を参照せよ）、非還元条件下および還元
条件下において同じSDS移動度シフト比較分析を示し
た。δTCRタンパク質は、還元後は見ることができない
（第11A図。レーン３）。なぜなら、40kDの移動（下
記）とともに移動し、そして類似の大きさのγTCRタン
パク質（白い矢印）に妨害されるためである。
γδTCR型は、正常な末梢血Ｔリンパ球上に存在する
ばかりでなく、胸腺由来クローンII細胞（第11D図）お
よびＴ白血病細胞系MOLT−13（第11E図）上でも観察さ
れる。これら三種類の細胞系は、γTCR種を有する。こ
れらの３つの細胞系は、PBL−L2（40kDと44kD:第11A
図、レーン８）およびクローンII細胞（40kDと44kD:第1
1D図、レーン８）上で観察されたγTCRタンパク質のダ
ブレット、またはMOLT−13細胞上で観察された拡散的に
標識されたγTCRタンパク質のバンド（40〜46kD:第11E
図、レーン６）を生ずる差別的なグリコシル化を表示す
るγTCR種を有する。MOLT−13のγTCRタンパク質バンド
を二次元ゲル分析［SDS−PAGEにかけ、ついで非平衡pH
グラジエント電気泳動（NEPHGE）］すると、２つの平行
なγTCR種が分離され、その中で44kDのγTCR種は40kD種
と比べて、別の高マンノース（またはハイブリッド）Ｎ
−結合グリカンを含有する。このように、３種類の異な
る細胞源（末梢血、胸腺および白血病）から単離された
このレセプター複合体のγTCRサブユニットから、δTCR
パートナー鎖と非共有結合的に会合した40kDの細胞表面
種が明らかにされた。
PBL−L2、クローンIIおよびMOLT−13細胞上のγδTCR
型を比較するために、IDP2とWM−14細胞系上の既知の型
について調べた。IDP2細胞系（PCT国際公開番号第WO88/
00209号、1988年１月14日公開、Brenner et al.,1986,N
ature 322;145−149）は、より大きな55〜60kDのγTCR
タンパク質（55kDという）を含有し、それは抗Ｃγｂ血
清によって認識される（第11B図）。抗CD3免疫沈降物を
非還元条件で調べたところ、IDP2のγTCRタンパク質が
δTCRパートナー鎖と非共有結合的に会合することが明
らかになった（第11B図、レーン４、黒い矢印）。還元
すると、δTCRタンパク質は、SDS−PAGE移動度において
相対分子量40kDにを示した（第11B図、レーン４、黒い
矢印と第11B図、レーン２、白い矢印を比較のこと）。
非共有結合的に会合したγδTCR型とは対照的に、末
梢血由来Ｔ細胞クローン、WM−14は70kDのジスルフィド
結合TCRダイマーを生成し（第11C図、レーン７）、抗Ｃ
γ血清によって認識された（Alarcon et al.,1987,Pro
c.Natl.Acad.Sci,U.S.A.84:3861−3865）。また、この
ダイマーは、δTCRサブユニットに対するmAbである抗TC
Rδ１（第11C図、レーン５）によっても認識され、それ
ゆえγδTCRヘテロダイマーを表わす。還元条件下で分
析すると、36kD、40kDおよび43kDの３種類のγTCRタン
パク質を表わした（40kDという）。
このように、PBL−L2、クローンIIおよびMOLT−13細
胞上のCD3会合複合体は、既知型と比較して新規なγδT
CRヘテロダイマーを構成する。その理由は、そのTCRγ
サブユニットが40kD（WM−14細胞上のジスルフィド結合
Ｃγ１コードするγTCRタンパク質の大きさに類似す
る）であるが、そのパートナー鎖（IDP2細胞上の55kDC
γ２コードγTCRタンパク質に類似する）にジスルフィ
ド結合しないことによる。この複合体分子の基礎を理解
するために、そのγTCRとδTCRサブユニットのより詳細
な構造分析は、実施例としてMOLT−13細胞系を使用して
下記のように行なった。
8.2.2.MOLT−13のγTCRサブユニットのコアポリペプチ
ドの大きさ MOLT−13細胞（40kDのγTCR糖タンパク質）のγTCRコ
アポリペプチドの大きさを決定し、かつPEER細胞（55kD
のγTCR糖タンパク質）のものと比較するために、両細
胞系を35S−メチオンおよびＳ−システインの存在下で1
5分間生合成的に標識し、Triton X−100で可溶化し、そ
の後抗Ｃγm1（γTCR鎖を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体）（第13A図、方法を参照のこと）を用いて免
疫沈降させた。その後免疫沈降物質をエンドグリコシダ
ーゼＨ（Endo H）消化し、未熟Ｎ結合グリカンを除い
た。MOLT−13のγTCRポリペプチド骨格は、35kDの相対
分子量を有し（第13A図、レーン８）、PEERのγTCRコア
ポリペプチド（40kD:第13A図、レーン４）またはIDP2の
γTCRコアポリペプチド（40kD、国際公開番号第WO88/00
209、1988年１月14日公開、参照のこと）よりも5kD小さ
い。MOLT−13細胞は、5kD小さいためにIDP2およびPEER
のγTCRコアポリペプチドから区別し得るγTCRのコアポ
リペプチドを発現すると結論される。加えて、成熟MOLT
−13のγTCR細胞表面糖タンパク質における５〜11kDの
大きさのみが、翻訳後プロセスによって説明される（40
〜46kDの表面の大きさから35kDのコアの大きさを引
く）。ここで、15〜20kDの相対分子量はPEERとIDP2のγ
TCR糖タンパク質における翻訳後プロセスによって説明
し得る（55〜60kDの表面大きさから40kDのコアの大きさ
を差し引く）。
すべての翻訳後プロセスがＮ−結合グリカンであり、
かつ、各グリカン鎖が約3kDの相対分子量であると仮定
すると、２〜３本のＮ−結合グリカンがMOLT−13のγTC
Rタンパク質に付着し、一方、５本のＮ−結合グリカン
がPEER細胞およびIDP2細胞上のポリペプチドに付加され
ることが予想される。Ｎ−グリカナーゼを用いて細胞表
面のγTCRタンパク質からＮ−架橋炭水化物を除去する
実験では、コアペプチドに付加される翻訳後プロセスの
大部分が実際にＮ−結合グリカンであることが示され
た。
8.2.3.MOLT−13γTCRの一次配列 MOLT−13のγTCRサブユニットをコードする定常領域
遺伝子セグメントの構造を理解するために、MOLT−13の
γTCR転写物を表すcDNAクローンの配列を決定した。MOL
T−13由来ポリA+RNAからのλgt10ライブラリーを構築
し、ヒトγTCRのcDNAクローン、pTγ−１でつりあげた
（Dialynas et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8
3:2619−23）。大きさと限定された制限酵素地図に基づ
いて、１つのクローン、M13Kを選択し、そのヌクレオチ
ド配列を決定した（第14図）。クローンM13Kは、Ｊγ2.
3遺伝子セグメントに結合したＶγ1.3遺伝子セグメント
を使用した。全長の、フレーム内γTCR転写物を表わす
（Lefranc et al.,1986,Cell 45:237−246;Lefranc et
al.,1986,Nature 319:420−422;Straussらによる命名
（Strauss et al.,1987,Science 237:1217−1219）;Que
rtermous et al.,1987,J.Immunol.138:2687−2690）。
定常領域の配列が、最近報告された非機能性γTCR（Pel
lici et al.,1987,Science 287:1051−1055）および２
種類のC IIエキソンコピーｂおよびｃを含有するＣγ２
ゲノム配列（Lefranc et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.83:9596−9600）とほぼ同一であることが明ら
かになった（詳細に説明された方法の節を参照のこ
と）。このこのとは、細胞表面上に発現されたγTCRタ
ンパク質をコードする第一のフラーム内転写物を表わ
し、これは二種類のC IIエキソンコピーを有するＣγ２
遺伝子セグメントを利用するものである。
このcDNAクローンの推定アミノ酸配列から34.8kDのポ
リペプチド骨格の大きさが予測され、これは前記の生化
学データとよく一致した。驚くべきことに、６個のの潜
在的なＮ−結合炭水化物付着部位がこの転写物によって
コードされる。生化学データによれば２〜３個のＮ−結
合グリカンがポリペプチド鎖に付着することが示唆され
るため、潜在的な結合部位の全てが使用されることはな
いことが示される。
Ｃγ遺伝子セグメントの使用を反映させるために、PB
L−C1およびWM−14によって“１型”として発現される
ジスルフィド結合γδTCR型に注目した。これは、ジス
ルフィド結合したγTCR鎖がＣγ１遺伝子セグメントを
利用することによる（Krangel et al.,1987,Science 23
7:64−67）。IDP2細胞およびPEER細胞上で発現されたγ
δTCR型の大きな（55kD）、ジスルフィド結合していな
いγTCRサブユニットは、３種類のC IIエキソンコピ
ー、すなわちコピーａ、コピーｂおよびコピーｃを含有
するＣγ２遺伝子セグメントによってコードされ（Kran
gel et al.,1987,Science 237:64−67:Littman et al.,
1987,Nature 326:85−88）、それゆえこのγδTCR型を
ここで“2abc型”という。同様に、MOLT−13細胞上で特
徴づけられた型を“2bc型”という。
8.2.4.好適なＣγ遺伝子セグメントの使用 新鮮な単離された末梢血中に三種類のγδTCR型が存
在することを決定するために、10人の健常被験者からの
単核細胞を、mAb抗TCRδ１（前記の第６節に記載、δTC
R定常領域と反応性を有する）による生化学分析を用い
て分析した。この抗体は、すべてがγ，δTCRリンパ球
でないならば、大多数と反応する。このパネルからの典
型的な結果を第15図に示す。被験者１では、抗TCRδ１
の免疫沈降物（非還元条件下で分析した）より、ジスル
フィド結合γ，δTCR複合体を70kDのタンパク質がバン
ド（１型）として、また、ジスルフィド結合していない
γ，δTCR複合体がブロードな40kDのタンパク質のバン
ド（2bc型）として存在することが示された（第15図、
レーン２）。このことから、Ｃγ１定常領域およびＣγ
２定常領域の両方が、これらの個別に発現されたγ，δ
TCRにより使用されることが示された。しかしながら、2
bc型の量は個々の間で変動があった。被験者１と２にお
ける40kDタンパク質のバンドの強度を比較することによ
って、被験者１に比べたときの被験者２における2bc型
のより小さなフラクションに注目すべきである（被験者
２のレーン２と被験者１のレーン２とを比較せよ）。よ
り厳密には、ジスルフィド結合γ，δTCR複合体は、オ
ートラジオグラフで長時間感光させた後であっても、試
験した10人の被験者中３人の被験者の単核細胞上で検出
された（被験者３を参照のこと）。分析された個々の被
験者のいずれにおいても、末梢血中で55kDのジスルフィ
ド結合していないγ，δTCR複合体（2abc型）は示され
なかった。
8.2.5.δTCRサブユニットの特徴付け γTCRタンパク質の大きさおよびグリコシル化におけ
る著しい構造上の相違とは対照的に、異なる細胞源から
のδTCRサブユニットは、著しく類似することが証明さ
れた。MOLT−13細胞上のδTCR糖タンパク質の相対分子
量は、抗δTCR mAbを使用して、大きさがIDP2細胞上の
δTCR糖タンパク質と同様であることを確認しながら
（第11B図、レーン２、白い矢印）、直接的に40kDと決
定した（第12図、レーン４）。
同様に、δTCRポリペプチド骨格の大きさを比較する
ために、MOLT−13細胞からの細胞表面125I標識δTCRタ
ンパク質をＮ−グリカナーゼ消化して（高マンノース
型、ハイブリッド型および複合体型の（Tarentino et a
l.,1985,Biochem,24:4665−4671;Hirai et al.,1987,An
al.Biochem.162:485−492）アスパラギン結合グリカン
を除去した。MOLT−13細胞のδTCRコアポリペプチドは3
5kDの相対分子量を有し（第13B図、レーン４）、IDP2細
胞のδTCR骨格の相対分子量（35kD）と同様であった（B
and et al.,1987,Science 238:682−684）。
加えて、細胞表面125I標識MOLT−13δTCRタンパク質
をエンドグリコシダーゼＨで消化すると（Endo H、高マ
ンノース型とある種のハイブリッドＮ−グリカンのみを
除去；（Tarenetino et al.,1974,J.Biol.Chem.249:811
−817;Trimble and Maley,1984,Anal.Biochem,141:541
−522）、ポリペプチドに付着した、相対分子量2.5kDの
Endo H耐性の炭水化物が除去され、１の炭水化物部分と
一致する2.5kDの相対分子量が減少した（第13B図、レー
ン２）、δTCR定常ドメイン中に２箇所の潜在的なＮ−
グリカン付着部位が存在するため（Hata,S.,et al.,198
7,Science 238:678−682:Loh et al.,1987,Nature 330:
569−572）、これらのデータは、いずれの部位も使用さ
れたが、そこに付着したＮ−グリカンは異なるプロセシ
ングを受けること、すなわち、一方は高マンノースＮ−
グリカン（Endo H感受性）として、他方は複合体Ｎ−グ
リカン（Endo H耐性だがＮ−グリカナーゼ感受性）とし
て別個のプロセシングを受けることを示す。γTCRポリ
ペプチド鎖上に付着したＮ−結合炭水化物の異なる量と
は対照的に、PEER細胞、IDP2細胞およびMOLT−13細胞上
で発現されたδTCRサブユニットは、すべて同一のペプ
チドコアサイズを有し、２箇所のＮ−結合グリカンが存
在することを示す（第13B図、データは示していな
い）。
8.3.検討 この実施例において、ヒトγTCR糖タンパク質の３種
のタンパク質の型、すなわちジスルフィド結合した40kD
のγTCRタンパク質（１型）、ジスルフィド結合してい
ない55kDのγTCRタンパク質（2abc型）およびジスルフ
ィド結合していない40kDのγTCRタンパク質（2bc型）を
比較した。３種類の型はすべて、δTCRサブユニットと
結合していることが示された。最初の２つのγTCR型を
表す相補的DNA配列が報告されている（Krangel et al.,
1987,Science 237:64−67;Littman et al.,1987,Nature
326:85−88）。（PBL−Cl上の）γTCRポリペプチド１
型の定常領域は、単一のC IIエキソンを含有するＣγ１
遺伝子セグメントによってコードされ、一方、（IDP2細
胞およびPEER細胞上の）γTCRポリペプチドの2abc型
は、C IIエキソンコピーａ、コピーｂおよびコピーｃを
含有するＣγ２遺伝子セグメントを利用する。2bc型の
γTCR鎖に対応するcDNA配列は、２種のC IIエキソンコ
ピー、すなわち、コピーｂとコピーｂのみを利用するＣ
γ２遺伝子セグメントを含むことが示された。同様に、
クローンIIおびPBL−L2のγTCR結合領域の遺伝子構造
（ジスルフィド結合していない、40kDのγTCRタンパク
質）は、ここで決定されたMOLT−13の構造、すなわち、
2bc型に類似するようである。使用したδTCR定常領域は
これらの型の全てについて同様であるため（Hata,S.,et
al.,1987,Science 238:678−682;Loh.E.Y.,et al.,198
7,Nature 330:569−572）、ヒトにおけるγδTCR型の３
つの構造を、完全に比較することができる（第16図）。
２種類のＣγ２多型ゲノム型はヒトに存在する（Lefr
anc et al.,Nature 319:420−422;Pellici et al.,198
7,Science 237:1051−1055）。２つの転写物型（2abc型
と2bc型）は、多分これらの異なる対立遺伝子型の産物
である。今まで、γTCRポリペプチドの対立遺伝子型は
マウスでは発見されていなかった。我々は、2abc型（55
kD）と2bc型（40kD）との間のγTCR細胞表面タンパク質
の大きさの劇的な相違は、付着したＮ−結合炭水化物の
量、最もありそうなこととしてＮ−結合グリカンの数を
反映することによってほぼ決定されるものと結論され
た。IDP2のγTCR（2abc型）タンパク質およびMOLT−13
のγTCR（2bc型）タンパク質の骨格の大きさは、SDS−P
AGEに基づいて、それぞれ40kDと35kDであると測定され
た。それらの値は、cDNA配列に基づいて計算されたそれ
ぞれの予想分子量36.6kDおよび35.8kDとよい相関性を有
する。骨格の大きさのわずかな相違（SDS−PAGEで5kD）
は、16アミノ酸からなる１つのC IIエキソンコードペプ
チドによって主に説明することができ、このような相違
に関与するが、55kDおよび40kdのジスルフィド結合して
いないγTCR表面型の間における分子量の観察された相
違の全てを説明することはできない。１箇所の付加的な
潜在的付着部位を生ずるMOLT−13のγTCRポリペプチド
とは対照的に、2abc型のγTCRポリペプチドは、おそら
くすべてを使用できる５箇所の潜在的なＮ結合グリカン
付着部位を有するが、わずか２〜３個のＮ−結合グリカ
ンを有する。潜在的な付着部位について、このように使
用が制限されることに対する理由は明らかではないが、
γTCRタンパク質のコンホメーションに対するC IIエキ
ソンコードペプチドの影響から生ずるものかもしれな
い。C IIエキソンコードペプチドおよびその隣接アミノ
酸は原形質膜と免疫グロブリン様定常ドメインとの間の
結合領域を作る。この領域は大部分のＮ結合グリカン付
着部位を含む（第17図）。我々は、CII エキソンコピー
が、ポリペプチド骨格の大きさを決定するばかりでな
く、ジスルフィド結合鎖を形成する能力によって、付着
した炭水化物量にも影響を与えることによって、タンパ
ク質の型を決定するものと結論した。
IDP2細胞（Hata et al.,1987,Science 238:678−68
2）、PEER細胞（Loh et al.,1987,Nature 330:569−57
2）およびMOLT−13細胞のδTCRに相補的なDNAを配列決
定し、可変領域遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグ
メントとの間をつなぐD/N領域を除いて、同一であるこ
とを見い出した。WM−14細胞上のδTCRタンパク質は43k
Dの相対分子量を有し、これは前記のδTCRタンパク質と
同様であった（Borst et al.,1987,Nature 325:683−68
8:Lanier et al.,1987,J.Exp.Med.165:1076−1094）
が、他のδTCR鎖よりも3kD大きかった。これらの43kDの
δTCRタンパク質は、異なるδ可変ドメインに別のＮ−
結合グリコシル部位が存在することを示す。
γTCR定常領域セグメントに関して記載した構造と比
較しうる構造上の相違は、αTCR遺伝子およびβTCR遺伝
子については観察されなかった（Yoshikai et al.,198
5,Nature 316:837−840;Toyonaga et al.,1985,Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.82:8624−8628;Royer et al.,1984,
J.Exp.Med.160:947−953;Kronenberg et al.,1985,Natu
re 313:647−653）。マウスＣγ領域の長さを有するヒ
トC IIエキソン反復配列の数と蓋然性の高い構造的な類
似性があり、そのＣγ１、Ｃγ２およびＣγ４定常領域
はそれぞれ15アミノ酸、10アミノ酸および33アミノ酸か
らなる結合領域をコードする（Garman et al.,1986.Cel
l 45:733−742:Iwamoto et al.,1986,J.Exp.Med.163:12
03−1212）。しかしながら、マウスの結合領域は適切な
エキソンの大きさの相違を反映するが、ヒトの2abc型の
γTCRおよび2bc型のγTCRで見られたような、エキソン
の汎用性の用途を示さない。また、マウスのγTCRは、
２種類のジスルフィド結合していないヒトの型とは対照
的に、ジスルフィド結合型にだけ存在する。
重要なことは、ヒトのγ，δTCR型と全く同じように
は使用されないことである。数人（高率のγ，δTCリン
パ球のために選択した）において、単一の型（１型）が
優性であり、この型のための陽性選択が生じるか、また
は別のγ，δTCリンパ球の型に対する選択が存在するか
どうかが示唆される。
9.個別にトランスフェクトしたγTCR鎖と一本鎖δTCRサ
ブユニットとの対形成によって再構成した３種類のＴ細
胞レセプターγ，δイソタイプ型 この実施例で記載するように、γδヘテロダイマー形
成におけるγδTCRポリペプチドの役割を調べた。トラ
ンスフェクションによって、３種類のγδTCR型（１
型、2abc型および2bc型）に対応するγTCR鎖と一本鎖の
固有δTCR鎖との会合によって形成されたγδTCR複合体
を調べた。γTCRポリペプチドの１型または2abc型のい
ずれかをコードするγTCRのDNAをMOLT−13細胞系中にト
ランスフェクトした。このDNAは、δTCRポリペプチドと
非共有結合的に会合した2bc型γTCRから成るγδヘテロ
ダイマーを構造的に発現した。トランスフェクトした細
胞は、MOLT−13細胞系のγδTCRの特徴とともに、δTCR
と非共有結合的に会合した2abc型γTCRまたはδTCRと共
有結合的に結合した１型γTCRからなるγδヘテロダイ
マーを発現することが可能であった。その上、トランス
フェクトしたγTCR遺伝子産物のグリコシル化は、それ
らの天然の細胞系におけるこれらの遺伝子のグリコシル
化と同じであった。このように、グリコシル化の程度お
よびジスルフィド結合能は、γTCR遺伝子によって決定
される。γTCRの定常領域のC IIエキソンを使用する
と、TCRγおよびTCRδポリペプチド間のジスルフィド結
合の有無ばかりでなく、γTCR鎖に付着した炭水化物量
をも決定し、細胞表面γTCRタンパク質の大きさの差に
強く影響を与える。
9.1.材料と方法 9.1.1.細胞系 MOLT−13、TCRγδ+T白血病細胞系（Hata,S.,et al.,
1987,Science 238:678−682:Loh,E.Y.,et al.,1987,Nat
ure 330:569−572）、および末梢血由来のTCRγδ＋細
胞系PBL Cl（Brenner,M.B.,et al.,1987,Nature 325:68
9−694）およびIDP2（Brenner,M.B.,et al.,Nature 32
2:145−149）を前記のように培養した。
9.1.2.抗体 使用モノクローナル抗体（mAb）は以下のものを使用
した。抗Leu−４（抗ヒトCD3:IgG1）（Ledbetter,J.A.e
t al.,1981,J.Exp.Med.153:310−323）、抗TCRδ１（抗
ヒトTCRδ鎖定常領域:IgG1）（第６節を参照のこと（Ba
nd,H.,et al.,1987,Science 238:682−684））、抗Tiγ
Ａ（抗Ｖγ2:IgG2a）（Jitsukawa,S.,et al.,1987,J.Ex
p.Med.166:1192−1197）、抗Ｃγm1（抗ヒトγTCR定常
領域：第8.1.7節を参照のこと）、P3（P3×63AG8ミエロ
ーマによって分泌されたIgG1）（Koehler,G.,and Milst
ein,C.,1975,Nature 256:495−497）、および187.1（ラ
ット抗マウスκ軽鎖特異性）（Yelton,D.E.,et al.,198
1,ハイブリドーマ1:5−11）。
9.1.3.MOLT−13のδTCRのcDNAクローンの単離および配
列決定 ベクターλgt10中にMOLT−13のポリA+RNAから調製し
た相補的DNA（cDNA）ライブラリー（Huynh,et al.,198
5,in DAN cloning,ed.Glover,D.M.（IRL Press.Oxfor
d）,volume 1,pp49−78）を、32P標識ヒトδTCRのcDNA
クローンIDP2 0−240/38とのハイブリダイゼーションに
よってスクリーニングした（Hata et al.,1987,Science
238:678−682）。クローンを、大きさ及び限定制限酵
素地図に基づいて詳細な分析のために選択した。核酸配
列は、修飾T7ポリメラーゼを用いるジデオキシチェイン
ターミネーター法（Sanger et al.,1977,Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.74:5463−5467）を使用してM13ベクター中
で決定した（Sequenase,United States Biochemical Co
rp.）（Potter et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.81:7161−7165）。
9.1.4.発現プラスミドの構築およびトランスフェクショ
ン γTCRのcDNA（PBL C1.15とIDP2.11r）（Krangel,M.
S.,et al.,1987,Science 237:64−67）は、第10B図に模
式的に示したように、Friend spleen forming virus（S
FFV）の長い末端反復配列（LTR）の下流で、pFneo哺乳
動物発現ベクター（Saito,T.,et al.,1987,Nature 325:
125−130;Ohashi,P.,et al.,1985,Nature 316:606−60
9）中にクローニングした。プラスミド構築物をエレク
トロポレーションによってMOLT−13細胞へトランスフェ
クトした（Potter,H.,et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sc
i,81:7176−7165）。形質転換体を選択し、2mg/mLのG41
8含有培地（バイオアッセイによれば480μg/mLの固形
分。GIBCO）中で維持し、限界希釈によりクローニング
した。
9.1.5.ヨード化および免疫沈降 ラクトパーオキシダーゼを使用する125Iによる細胞表
面標識、３−［（３−コラミドプロピル（cholamidopro
pyl））ジメチルアンモニオ）］１−プロパンスルホネ
ート（CHAPS:Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）中での
可溶化、各種抗体を使用する免疫沈降、非平衡pHグラジ
ェントゲル電気泳動法（NEPHGE）およびSDSポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法（SDS−PAGE）を記載の通りに
行なった（第8.1.3.節参照のこと。（Brenner,M.B.,et
al.,1986,Nature 322:145−149:Brenner,M.B.,et al.,1
987,Nature 325:689−694）。特異的な免疫沈降は、１
μｇの抗Leu−４、0.1μＬの抗TCRδ１腹水、または１
μＬのP3腹水を用いて、187.1の培養上清150μＬととも
に行なった。抗T9−γＡに対しては、１μＬの腹水を用
い、187.1なしで行なった。
9.1.6.生合成標識化 対数増殖期にある細胞をメチオニンおよびシステイン
を含まない培地で30分間インキュベートし、続いて37℃
で35S−メチオニンおよび35S−システインを用いて15分
間パルス標識を行ない、そして前記第8.1.3節に記載し
たように免疫沈降を行なった。免疫沈降物をエンドグリ
コシダーゼＨ（endo H）処理するかまたはmockインキュ
ベートし、SDS−PAGEによって分離し、フルオログラフ
ィーによって可視化した（Bonner W.M.and Laskey,R.A.
1974,Eur.J.Biochem.46:83−88）。
9.2.結果 我々は、各種γTCRイソタイプ間の構造上の相違を決
定する際に、γTCR遺伝子、特にTCR C IIエキソンの役
割を証明するために、構造上異なるγTCR遺伝子産物と
一本鎖δTCRタンパク質との会合から生ずる生成物を調
べた。この目的のために、MOLT−13、すなわち、40kD非
ジスルフィド結合γTCRポリペプチド（2bc型）を発現す
るＴ白血病細胞系を、レセプターの他の２つの型に対応
するγTCR鎖のcDNAクローンのためのレシピエントとし
て使用した（１型と2abc）。これらのγTCR鎖を表すcDN
Aクローンの完全な配列は、第14図（2bc型）およびクラ
ンゲル等（Krangel et al.,1987,Science 237:64−67）
（１型と2abc）の文献に記載されており、第18A図に図
示した。
9.2.1.一本鎖機能的δTCR鎖はMOLT−13細胞系に存在す
る MOLT−13細胞系のδTCR遺伝子の再編成の研究より（H
ata,S.,et al.,1987.Science 238:678−682）、一本鎖
の機能的δTCR遺伝子産物だけがこの細胞系において発
現されることが示唆された。しかしながら、δTCRのた
めの一本鎖の機能的転写物がMOLT−13細胞内で作られた
ことを直接的に証明するために、δTCRのcDNAプローブ
との交差ハイブリダイゼーションさせたcDNAクローン
（Hata,S.,et al.,1987,Science 238:678−682）をλgt
10中で作製したMOLT−13ライブラリーから単離し、選択
したcDNAクローンの配列を決定した。この分析から、MO
LT−13細胞が機能的に再編成されたものおよびδTCR遺
伝子を突然変異的に再編成されたものに対応する転写物
を発現することが示された。機能的に再編成されたδTC
R遺伝子に対応するcDNAクローンは、IDP2細胞系につい
て先に記載したのと同じＶ（Ｖδ１）、Ｊ（Ｊδ１）、
およびＣ遺伝子セグメントを有する（Hata,S.,et al.,1
987.Science 238:678−682）。しかしながら、MOLT−13
のδTCRのcDNAクローンは、Ｄセグメントの利用（MOLT
−13はおそらくＤδ２のみを使用する）、不正確な連
結、Ｖ−Ｄ結合部およびＤ−Ｊ結合部におけるＮ領域の
多様性より生ずるＶ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セ
グメントの間に異なる核酸配列を有する（Hata,S.,et a
l.,1988,Science 240:1541−1544）。また、MOLT−13の
δTCRのcDNAより、定常領域の膜近位結合領域における
システイン残基を予測させる。この結合領域は、Ｃγ１
遺伝子セグメントを利用するγTCR遺伝子産物へのジス
ルフィド結合を有用なものとするはずである。MOLT−13
細胞系はジスルフィド結合していないγ，δTCRレセプ
ターを発現するが、そのδTCR鎖の膜近位結合領域にお
けるシステイン残基の存在は、δTCRサブユニットがジ
スルフィド結合していない複合体またはジスルフィド結
合した複合体のいずれかに関係し得る可能性を明らかに
残している。
9.2.2.γTCR遺伝子産物はレセプターの型を決定する γTCRのcDNA構築物でトランスフェクトしたMOLT−13
細胞を、M13.PBL Clγ（PBLCl由来のγTCRのcDNAでトラ
ンスフェクトしたMOLT−13細胞について）と、そしてM1
3.IDP2γ（IDP2由来のγTCRのcDNAでトランスフェクト
したMOLT−13細胞について）と略称する。バルクの形質
転換細胞系及びこれらの系に由来する代表的なサブクロ
ーンは、γTCR（VJC）またはＶγ２−特異的cDNAプロー
ブを用いるノーザンブロット分析によって分析した。固
有の1.6kbのMOLT−13γTCR転写物に加えて、約1.8kbの
第２のγTCR転写物（発現プラスミドのSFFV LTRで開始
されるγTCR転写物に対して期待される大きさ）が、形
質転換体およびそれらのクローンにおいて観察された。
Ｖγ1.3と交差ハイブリダイズしないＶγ２プローブと
特異的にハイブリダイズするこの1.8kbの転写物が、固
有のMOLT−13のγTCR転写物中に存在し、こうして、こ
の1.8kb転写物はトランスフェクトされたγTCRのcDNAの
転写物を表わす（この転写物はＶγ２セグメントを利用
する）。
形質転換体の表面上に発現されたγTCRタンパク質を
生化学的に特徴づけるために、各細胞系に由来する代表
的なクローンを、P3（対照）、抗Leu−４（抗CD3）、抗
TCRδ１（抗δTCR）または抗Ti−γＡのmAbを用いる表
面ヨード化細胞免疫沈降によって分析した。抗Ti−γＡ
（Jitsukawa,S.,et al.,1987,J.Exp.Med.166:1192−119
7）は、それらのγTCR鎖可変領域としてＶγ２遺伝子セ
グメントを利用する。γ，δTCR細胞を特異的に認識す
るらしい。トランスフェクトしていないMOLT−13（第19
A図）ならびにトランスフェクトしたMOLT−13細胞（第1
9B図および第19C図）とは、期待された親γTCR（40kD;
白い矢印を参照せよ）とδTCRサブユニット（星印を参
照せよ）とを発現する。抗Ｖγ２−特異的mAb（抗Ti−
γＡ）は固有のMOLT−13γTCR鎖と反応しないことに注
意すべきである（第19A図、レーン７および８）。M13.P
BL Clγ形質転換細胞の抗CD3免疫沈降は、非還元条件下
で試験した場合に別のCD3会合種（68kD）を示した（第1
9B図、レーン３、黒い矢印を参照せよ）。PBL Cl細胞
（第19D図、レーン３および４）およびM13.PBL Clγ形
質転換細胞系（19B図、レーン３および４）の両方につ
いて、68kD複合体は、還元により40kD種および36kD種を
産生した（M13.PBL Clγ形質転換体の場合に、これらの
バンドは抗Ｖγ２の免疫沈降において、明瞭に可視化さ
れた。第19B図、レーン７および８、黒い矢印を参照せ
よ）。これらの40kD種おび36kD種は、異なってグリコシ
ル化されたγTCRポリペプチドを示す（Brenner,M.B.,et
al.,1987,Nature 325:689−694）。これらの免疫沈降
において、δTCR鎖（40kD還元）は40kDのγTCRポリペプ
チドとともに移動し、それゆえに可視化されない（しか
しながら、下記参照のこと）。
重要なことは、これらの実験より、MOLT−13細胞系の
固有のδTCR鎖が、通常、ジスルフィド結合していない
複合体の一部であり、PBL ClのγTCRタンパク質と会合
して形質転換細胞系中でジスルフィド結合した、γ，δ
TCRヘテロダイマーを形成することが示された。対照的
に、M13.IDP2形質転換細胞系におけるIDP2由来γTCRタ
ンパク質（55kD）は、固有のMOLT−13δTCR鎖とともに
ジスルフィド結合していない複合体を形成した（第19C
図、レーン３および４）。抗TCRδ１のmAb（δTCRペプ
チドに特異的）を用いて行なった免疫沈降により、これ
らの細胞系の全てからの内因性のγTCR（第19A図、Ｄ図
およびＥ図、レーン５および６）ならびにトランスフェ
クトしたγTCR鎖（第19B図および19C図、レーン５およ
び６）が直接的にδTCR鎖と会合することが確認され
た。抗Ti−γＡは、M13.PBL Cl形質転換細胞からの68kD
ジスルフィド結合γ，δTCRヘテロダイマー（第19B図、
レーン７および８）、M13.EDP2γ形質転換細胞からの55
kDのδTCR鎖を40kDのδTCR鎖（第19C図、レーン７と
８）とともに特異的に免疫沈降させ、これらの複合体の
一部であるγTCRがそれぞれトランスフェクトされたPBL
ClおよびTdp2由来γTCRのcDNAに対応することが確認さ
れた。
各種γTCRタンパク質をさらに特徴づけるために、表
面125I標識細胞の生化学的二次元（2D）ゲル分析（NEPH
GEに続くSDS−PAGE）に行なった。CD3成分の位置に関す
る固有の（MOLT−13）γTCR鎖およびトランスフェクト
した（PBL ClまたはIDP2）γTCR鎖の2Dパターンの重ね
合せにより、適切なγTCR種の比較を行なった。MOLT−1
3細胞からの免疫沈降物において、γTCR鎖は、２つの分
離したコード化種の平行なシリーズとして分離した（第
20A図、白い矢印を参照せよ）。PBL ClまたはIDP2のTCR
のcDNAでトランスフェクトしたMOLT−13細胞は、固有の
MOLT−13のγTCRポリペプチドシリーズを示したが、加
えて、2Dゲルパターンで、それぞれ、PBL ClのγTCRポ
リペプチド（第20B図およびＤ図を比較せよ、第20B図の
矢印を参照せよ）、またはIDP2（第20C図およびＤ図を
比較せよ、第20C図の黒い星印を参照せよ）と同一であ
る放射性標識種を示した。このように、2Dゲルの生化学
分析では、トランスフェクトしたγTCR鎖が発現され、M
OLT−13の形質転換細胞および親細胞系である、PBL Cl
とIDP2で同様にプロセシングされることが確認された。
9.2.3.トランスフェクトしたγTCR鎖タンパク質のポリ
ペプチド骨格の大きさ トランスフェクトされたγTCR鎖のペプチド骨格の大
きさは、代謝的にパルス標識された細胞から免疫沈降さ
れた物質のエンドグリコシダーゼＨ処理によって決定し
た。
抗ＣγM1（γTCR鎖に特異的）を用いた免疫沈降で
は、内因性のMOLT−13のγTCRポリペプチドを表わすト
ランスフェクトされていないMOLT−13細胞（第21図、レ
ーン４）において35.5kD種および34kD種が同定された。
これらの２種類のポリペプチドの小さい方（白い矢印を
参照のこと）は期待されたポリペプチドコアサイズのMO
LT−13のγTCRポリペプチドに対応し、一方、大きい方
は、ポリペプチドは部分的にプロセシングされた中間体
を表わすらしい。これらの固有のMOLT−13γTCRポリペ
プチド、すなわち、脱グリコシル化された41kDの大きさ
を有するポリペプチドは、M13.IDP2γ形質転換体からの
抗ＣγM1によって免疫沈降された（第21図、レーン８、
黒い矢印を参照のこと）。この形質転換体特異的γTCR
ポリペプチドの大きさは、IDP2細胞で先に決定した脱グ
リコシル化IDP2γTCRポリペプチドのコアサイズとよく
一致する（Brenner,M.B.,et al.,1987,Nature 325:689
−694）。期待されたように、M13.PBL Clγ形質転換細
胞は、32kDの脱グリコシル化されたサイズ（第21図、レ
ーン12、黒い矢印参照のこと）を有する別のγTCRタン
パク質を示し（Brenner,M.B.,et al.,1987,Nature 325:
689−694）、これは以前にPBL Cl細胞系について報告さ
れたγTCRポリペプチド骨格の大きさに十分に匹敵す
る。この32kD種は、Ｖγ２特異的mAb、抗Ti−γＡ（第2
1図、レーン13、黒い矢印を参照のこと）によって特異
的に免疫沈降し、それによってこの細胞系における固有
のγTCR種およびトランスフェトクされたγTCR種の割り
当て量を明確にする。このようにして、IDP2細胞系およ
びPBL Cl細胞系に由来するトランスフェクトされたγTC
R鎖の決定された骨格の大きさが、それらの親細胞系に
おけるこられのポリペプチド骨格の大きさと合致する。
γTCRポリペプチドコアの大きさと細胞表面タンパク質
の大きさとを比較することによって、MOLT−13由来γTC
R、鎖、IDP2由来γTCR鎖およびPBL Cl由来γTCR鎖が、
それぞれ、6kD、14kD、および8kDのＮ−結合炭水化物を
有していることが結論される。
9.3.検討 ヒトγδTCRサブユニット構造には３種類の生化学的
に区別される型が存在する。今日の研究において、我々
は、一本鎖δTCRポリペプチドが、これら３種類のレセ
プター型の各々を表わすγTCR鎖と会合して適切なγ，
δTCRヘテロダイマーを再構成することを示す。MOLT−1
3の固有のγTCRポリペプチド（2bc型）は40kDであり、
δTCRサブユニットと非共有結合的に会合している。PBL
Clのジスルフィド結合レセプター（１型）またはIDP2
細胞系の55kDのジスルフィド結合していないレセプター
（2abc型）に対応するγTCRのcDNAクローンをMOLT−13
細胞系へトランスフェクトさせた場合、cDNAドナー細胞
系中で見いだされるそれらに対応するγδTCR型が再構
成された。現在のトランスフェクションに関する研究か
ら、ジスルフィド結合はγTCRの定常セグメントの使用
によって指図されるという直接的な証拠が示された。そ
の理由は、固有のMOLT−13のδTCR鎖はPBL Cl由来のγT
CR鎖を有するジスルフィド結合レセプター複合体（１
型）に関係し、IDP2由来γTCR鎖を有するジスルフィド
結合していないレセプター複合体（2abc型）に関係する
ことが認められるからである。
我々は、55kD（2abc型）および40kD（2bc型）のジス
ルフィド結合していないγTCRポリペプチド間の大きさ
の顕著な相違が、主にγTCRポリペプチド骨格に付着し
たＮ−結合炭水化物の量の相違によることを示した（前
記第8.2.2.節参照のこと）。このように、同じ数のＮ−
結合グリカンアクセプター部位（各々５箇所）がこれら
の型のいずれにおいても使用された定常領域遺伝子セグ
メントによってコードされたとしても、15kD（IDP2また
はPEER上の2abc型）またはわずか5kD（MOLT−13上の2bc
型）のＮ−結合炭水化物がこれらのγTCRポリペプチド
に付着する。これらのＮ−結合グリコシル化部位の４箇
所が、C IIエキソンコードコネクター領域およびその周
辺に存在する。ここにおける実施例において、我々は、
トランスフェクトしたγTCRのcDNAクローンのタンパク
質産物のペプチドコアサイズおよび成熟細胞表面サイズ
の比較に基づいて、トランスフェクトしたγTCRタンパ
ク質に付着したＮ−結合炭水化物の量が、それらの親細
胞系に見られるのと同一であることを示す。このよう
に、２種類のＣγ２コードタンパク質セグメントのコン
ホメーションは十分に相違するに違いなく、グリコシル
化において劇的な相違を生じさせる。これら２種類の型
のＣγセグメント間の主要な相違は、C IIエキソンのコ
ピー“a"が2abc型の55kDのγTCR鎖に存在し、2bc型の40
kDのγTCR鎖に存在しないということにある。このよう
に、C IIエキソンのコピーが存在するか否かは、γTCR
ポリペプチドの大きさを説明するグリコシル化の相違に
大きく関与する。
このような相似はαβTCRにおいて観察されないの
で、Ｔ細胞レセプターの間ではヒトγδTCRイソタイプ
型の構造の変化は新規なものである。
10.CD3と会合しないＴ細胞レセプターγδ複合体はヒト
子宮内膜腺上皮において同定される 胎盤形成初期においては、単核細胞の浸潤は、母体の
子宮組織におけるらせん状の動脈および子宮内膜腺の付
近で多い。これらは、通常にはない未知の機能のＴ系統
の細胞の集団を含む。多くの絨毛外の栄養膜は新規なタ
イプのクラスI MHC抗原を発現し、これらは大部分の体
細胞上で発現されたものとは相違している。我々は、妊
娠子宮または非妊娠子宮におけるTCRγδヘテロダイマ
ー（γδTCR）に対する１パネルのモノクローナル抗体
を試験した。驚くべきことに、γδTCR複合体は白血球
では検出されなかったが、妊娠子宮からの子宮内膜腺上
皮の細胞質に局在していた。また、これらの抗体は非妊
娠子宮からの腺上皮とも反応し、その反応性は月経周期
の増殖相においてよりも分泌相においてさらに強い。し
かしながら、CD3（OKT3、抗Leu−４、UCHT−１）に対す
る３種類の異なるモノクローナル抗体を用いた免疫沈降
物を調べることで示されるように、γδTCRはCD3複合体
と会合しなかった。γδTCR陽性腺上皮細胞はαβTCRに
対するモノクローナル抗体と反応しなかった。この細胞
もまたCD4およびCD8陰性であった。さらに、腺上皮細胞
は妊娠初期においてクラスI MHC抗原を失なう。これら
のデータから、γδTCRを有する子宮内膜腺細胞は、少
なくとも、遺伝子発現の局所的調節のもとで表現型修飾
を受けることを示唆する。
11.実施例：ヒトδＴ細胞レセプター遺伝子およびＶδ
特異モノクローナル抗体の特徴付け 我々は、ヒトγδＴ細胞クローン、AK119からδTCRの
cDNAおよび再編成されたδTCR遺伝子を単離した。これ
らのDNAクローンから、Ｋδプローブが得られ、これを
使用して、１パネルの13個のヒトγ，δＴ細胞クローン
と３個のγ，δヒトＴ細胞腫瘍系におけるδTCR遺伝子
再編成の多様性を決定した。全体で５つの異なる再編成
が検出され、これらは２〜５個の異なるＸδ遺伝子を用
いる再編成に対応していた。ある特別な再編成が、mAb
TCSδ１（δTCAR−３）と反応するヒトγ，δＴ細胞で
常に見られた。加えて、TCSδ１はγ，δ腫瘍細胞系、M
OLT−13からのδTCRポリペプチドを免疫沈降させた。我
々は、モノクローナル抗体TCSδ１が、AK119のＶδ遺伝
子でコードされたエピトープ、または再編成されたAK11
9遺伝子のＶδ−Ｊδ遺伝子の組み合わせでコードされ
たエピトープを認識する証拠を提供する。
11.1.原料および方法 11.1.1.AK119のδTCRのcDNAクローンの単離と配列決定 cDNAライブラリーを、GublerとHoffmanの方法（Guble
r and Hoffman,1983,Gene 25:263）によって、PBLのＴ
細胞クローンであるAK119から作製した。約100,000プラ
ークの増幅ライブラリーを32P標識したニックトランス
レートＣδプローブを使用してスクリーニングし、０−
024というδTCRクローンから単離した（Hata,S.,et a
l.,1987,Science 238:678）。最も長いハイブリダイズc
DNAクローン（1.3kbクローンC119δ３）をジデオキシチ
ェーンターミネーション法（dideoxy chain terminatio
n method）によって配列分析のために選択した。
11.1.2.再編成されたδTCR遺伝子のクローニング 再編成されたＶδ遺伝子含有3.5kbのゲノムDNAクロー
ンを、下記のようにしてAK119細胞から得た。すなわ
ち、EcoR I消化DNAを分取用アガロースゲル上でサイズ
分画し、λgt10ヘライゲートし、そしてパッケージング
してE.coliへトランスフェクトした。組換えファージ
を、cDNAクローン、C119δ３由来の32P標識したニック
トランスレート550bpのEcoR Iフラグメントを用いてス
クリーニングした。r119δ１と呼ぶ再編成クローンが単
離され、このクローンには0.8kbのHinc IIフラグメント
（Ｖ領域特異的）と1kbのHinc II−EcoR Iフラグメント
（Ｖ−Ｊ領域）とが含有されていた。
11.1.3.DNAの調製 胎児および新生児の胸腺組織を、患者の権利および認
可に関する許容されたガイドラインに従って集めた。限
界希釈により末梢血、胸膜滲出物または脳脊髄液からＴ
細胞クローンを得て、in vitroで培養した（Hafler et
al.,1985.Ann Neurol.8:451,Van de Griend et al.,198
7,J.Immunol.138:1627）。すべての場合において、プロ
テイナーゼＫを含む１％ドデシル硫酸ナトリウムを用い
て消化し、続いてフェノール／クロロホルム抽出及びエ
タノール沈降を行なってDNAを調製した。
11.1.4.サザンブロット分析 ゲノムDNAをEcoR Iで消化し、0.9％アガロースゲル上
でサイズ分画し、ニトロセルロースに移した。前記のよ
うに32Pニックトランスレートプローブを用いてハイブ
リダイゼーションを行なった（Maniatis,1982,Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor
Laboratory;Cold spring Harbor;New York）。
11.1.5.サイトフルオロメーター分析 提供者から得られた正常な末梢血単核細胞（PBMC）
は、フィコールグラジエント上で分画することによって
単離した。PBMCおよびPBLのＴ細胞を、TCSδ1mAb（すで
にδTCAR−３と命名した、第７節参照のこと）およびフ
ルオレセレン結合ヤギ抗マウスIgG（Becton Dickinso
n）を用いて間接蛍光染色し、そして蛍光活性化フロー
サイトメーターで分析した。
11.2結果 11.2.1.δTCR遺伝子再編成の多様性 Ｃδプローブを用いて、Ｔ細胞クローンAK119のλgt1
0のcDNAライブラリーからc119δ３と称する1.3kbのδTC
RのcDNAクローンを単離した。c119δ３の５′端を配列
決定し、すでに同定したＶδとＪδ遺伝子とが使用され
ることを見い出された（Hata et al.,1987,Science 23
8:678;Loh et al.,1987,Nature 330:569）。Ｖ−Ｊ結合
部の配列は、C119δ３がフレーム内のＶ−Ｊ結合を有す
ることを示した。
すべての可変領域と結合領域、および一部の定常領域
をコードする550塩基対（bp）のEcoR Iフラグメント
（Ｖ−Ｊ−Ｃプローブ）をC119δ３から単離し、AK119
からのEcoR I消化ゲノムDNAサザンブロット分析に使用
した。このプローブは、胚細胞系（germline）の3.2kb
のＶδおよび胚細胞系の1.0kbのＣδバンドを検出し
た。AK119は、特別な再編成がされた3.5kbのバンドを示
し、これは共通のδTCRの再編成と同一であった（Hata
et al.,1987,Science 238:678;Loh et al.,1987,Nature
330:569）（第22図における再編成II）。この3.5kbの
バンドは、Ｖ−Ｊ−Ｃ cDNAプローブを用いてEcoR Iサ
イズ分画したλgt10ゲノムライブラリーからクローニン
グした。r119δ１と称するクローニングされた再編成δ
TCR遺伝子の部分地図を、第17図に示す。可変領域およ
び結合領域の局在化を、Ｊオリゴヌクレオチドプローブ
および可変領域特異的プローブとを用いて決定した。r1
19δ１から、1kbのＶ−ＪプローブをHinc II酵素および
EcoR I酵素とを用いて消化して単離した（第17図）。
このＶ−Ｊプローブを用いて、１パネルの13個のヒト
γδTCR陽性Ｔ細胞クローンと３個のヒトγ−δTCR陽性
腫瘍細胞系におけるδTCR遺伝子の再編成の多様性を決
定した。第22図に示すように、Ｉ−Ｖと番号付けした５
つの共通の再編成がポリクローナル新生児胸腺細胞サン
プル中に見られた（第11レーン）。これらの再編成はヒ
トγδＴ細胞クローンによって使用された再編成の代表
的なものである。再編成IIだけがHinc II−Hinc IIVδ
特異的プローブにハイブリダイズする。これらの再編成
の全てがＤ−Ｊ再編成よりもＶ−Ｄ−Ｊ再編成を表わす
ということは知られていないが、これらうちの幾つか
は、以前に特徴づけられたＪδ遺伝子セグメントに対す
る新しい可変領域の再編成を示すに違いない。その理由
は、これらの細胞が細胞表面上に機能的なδTCRポリペ
プチド鎖を発現するためである。我々は、新たな再編成
が、他のＪδ遺伝子に対する単一の新たなＶδ遺伝子の
再編成を表わすという可能性を除外していないが、まだ
同定していない。我々のデータは、δTCRの遺伝子の再
編成に使用し得る２〜５個の可変領域遺伝子が存在する
にちがいないという事実と一致する。
11.2.2.mAb TCSδ１の特異性の決定 以前にδTCAR−３と命名したTCSδ１を、ヒト腫瘍γ
δTCR細胞系MOLT−13で免疫したマウスの脾細胞とマウ
スのミエローマ系とを融合させて作製した。ケイ光活性
細胞ソーター分析で使用する場合は、TCSδ１はヒトγ
δＴ細胞のいくつかとのみ反応し、全てのものとは反応
しない。この結果を第１表に示す。TCSδ１によって陽
性染色とAK119のＶδ遺伝子（再編成II）の使用とは完
全に相関性を有する。このデータから、δTCS 1によっ
て認識されたエピトープが、AK119のＶδ遺伝子中また
は再編成されたAK119のＶδ−Ｊδ遺伝子の組み合せエ
ピトープ中でコードされているという強力な証拠を提供
する。
12.ハイブリドーマの寄託 示唆されたモノクローナル抗体を産生する次のハイブ
リドーマ細胞系を、記載の日にメリーランドロックビル
のATCC（American Type Culture Collection）に寄託
し、ここに示す受託番号を得た。
本発明は、寄託された実施態様が本発明の１つの特徴
を例証することを意図するものであり、機能的に均等な
いかなる細胞系も本発明の範囲内にあるので、寄託した
細胞系によって範囲が限定されることはない。事実、当
業者には、本明細書に示されかつ記載された種々の変形
に加えて各種の変更が、上述した記載および添付図面か
ら明らかであろう。このような変更は、添付した請求の
範囲内に入るであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９５７８ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９７７２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９８４２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ９８４３ (73)特許権者 999999999 プレジデント アンド フェローズ オ ブ ハーバード カレッジ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02138，ケンブリッジ，クィニー スト リート 17 (72)発明者 ブレンナー，マイケル，ビー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01721 アッシュランド，＃73，オーク ストリート，99 (72)発明者 イプ，ステファン，エイチ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01710，フラミンハム ジョディー ロ ード 45 (72)発明者 サイドマン，ジョナサン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02186，ミルトン，キャントン アベニ ュー 1350 (72)発明者 バンド、ハミド アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02215，ボストン，ブルックライン ア ベニュー ＃５‐シー 400 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，322［6075］（1986) ｐ．145−149 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，83［８］（1986）ｐ．2619 −2623 金光修著「抗体工学入門」（1994年１ 月25日）地人書館 ｐ．88−89 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 16/28 C07K 14/725 C12N 5/10 C12N 15/09 C12P 21/02 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトＴ細胞抗原レセプター（TCR）γ鎖の
    下記のアミノ酸配列： を有する定常領域に対する、ヒトモノクローナル抗体を
    含まないモノクローナル抗体であって、サイトフルオロ
    グラフ分析において天然のγ，δTCR/CD3複合体を認識
    せず、また免疫沈降においてトリトン（Triton）Ｘ−10
    0可溶化細胞からのγ，δTCRヘテロダイマーも認識しな
    いが、2bc型γ，δTCR/CD3タンパク質を個別の鎖へ分離
    した後、生合成標識γTCR前駆体および成熟γTCRタンパ
    ク質を認識する、前記モノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】ATCCに寄託され、受託番号HB 9773が与え
    られたハイブリドーマによって産生される抗Ｃγm1モノ
    クローナル抗体である請求項１に記載のモノクローナル
    抗体。
  3. 【請求項３】請求項１に記載のモノクローナル抗体のF
    v、Fab、Fab′またはＦ（ab′）２フラグメント。
  4. 【請求項４】請求項１に記載のモノクローナル抗体を産
    生するハイブリドーマ。
  5. 【請求項５】分子量約40,000ダルトンを有するγＴ細胞
    抗原レセプター2bc型であり、下記のアミノ酸配列： からなる定常領域を含む配列を有する精製ポリペプチ
    ド。
  6. 【請求項６】下記のアミノ酸配列： を含む精製ポリペプチド。
  7. 【請求項７】下記の一次アミノ酸配列： を有するγＴ細胞抗原レセプター2bc型を含む精製ポリ
    ペプチド。
  8. 【請求項８】請求項５、６または７に記載のポリペプチ
    ドをコードする核酸。
  9. 【請求項９】DNAまたはRNAからなる請求項８に記載の核
    酸。
  10. 【請求項１０】請求項５に記載のγＴ細胞抗原レセプタ
    ーポリペプチドと、α、β、γおよびδＴ細胞抗原レセ
    プターポリペプチドからなる群から選択される第２のＴ
    細胞抗原レセプターポリペプチドとからなるＴ細胞抗原
    レセプターヘテロダイマーを含む精製ポリペプチド複合
    体。
  11. 【請求項１１】コードされたγＴ細胞抗原レセプターポ
    リペプチドおよびδＴ細胞抗原レセプターポリペプチド
    が細胞によって発現されるような条件下で、請求項５に
    記載のγＴ細胞抗原レセプターポリペプチドをコードす
    る核酸配列をδＴ細胞抗原レセプターポリペプチドを発
    現することが可能な細胞へ導入する工程を含んでなる、
    細胞中のγ，δＴ細胞抗原レセプターヘテロダイマーの
    発現を生じさせる方法。
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