KR0132680B1 - 사람의 γ,δ,T 세포 항원 수용체와 반응하는 단일 클론 항체 - Google Patents

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Description

사람의 γ,δ,T 세포 항원 수용체와 반응하는 단일 클론 항체

제1도는 항-TCRδ1에 의한 T세포 배양주의 사이토풀루오로 그래프분석

제2도는 mAb 항-TCRδ의 특이성의 면역학적 분석. 표면에 1-라벨이된 IDP2 세포를 기준 mAb P3(1열 및 2열), 항-1eu 4(3-5열), 항-TCRδ1(6-9열), 또는 항-cr 혈청(9열)을 사용하여 면역 침전시키고 다음에 SDS-PAGE(폴리아크릴아미드겔 전기영동)으로 용해시키고 그리고 방사선사진법을 써서 가시화하였다.

N=비환원조건; R=환원조건.

제3도는 δTCR의 N-글리카니스 소화.

제4도는 pGEM3-0-240/38의 설명도.

제5도는 mAb 항-TCRδ1에 의한 cDNA 클론 IDP2 0-240/38의 시험관내 번역 생성물의 면역침전.

제6도는 T세포항원 수용체의 면역침전 및 SDS-PAGE분석. 개방된 화살표는 δ 사슬의 위치를 나타낸다.

연속화살표는 γ사슬의 위치를 나타낸다.

용해(lysate)은 δTCAR-3 항체(기수열)또는βF1 항체(우수열)을 사용하여 면역침전 하였다.

제7도는 δTCAR-3 항체에 의한 δ사슬의 면역침전.

Molt-13 세포는 0.3% CHAPS(1열)을 포함하는 트리스-완충된 식염수(pH8)(1열)이나 1% 트리톤 X-100(2-7열)에 용해시켰다.

1열은 δTCAR-3가 CD3 단백질을 가진 γ,δTCR헤테로 이량체를 면역침전한다.

3 및 4 열은 δTCAR-3이 각각 변성된 용해생성물(N)과 환원(R)조건으로부터의 단일의 δ사슬을 면역침전시킨다.

5열은 UCHT-1이 CD3 단백질을 면역침전시킨다.

6열은 βF1 항체가 MOLT-13 세포로부터의 헤테로 이량체를 면역침전 시키지 않는다.

7열은 항-cr 항혈청이 단일의 γ사슬을 면역침전시킨다.

제8도는 유량세포계(flow cytometry)에 의해 착색되는 세포표면의 분석. γ,δTCR-양성세포(MOLT-13)PEER, IDP2) 및 α,βTCR-양성세포(HPB-ALL, Jurkat)을 δTCAR-3, OKT3, WT31 및 정상 취혈청(NMS) 항체로 배양시키고 유량세포계로 분석하였다.B 세포로 배양주 Daudi은 음성 기준이었다.

제9도는 δTCAR-3⁺및 OKT3⁺말초혈액 임파구의 2색 사이토 플루오로 그래프분석. 형광 이소티오시안산염(FITC) 형광을 Y축에 나타내고 피코에리트린(Phycoerythrin)(PE) 형광은 X축에 나타낸다.

이 시료의 CD3⁺,γ,δ TCR⁺세포는 2.4%의 CD3⁺임파구를 나타낸다.

제10도는 시간에 대한 세포질내 Ca2+ 농도([Ca2+]i)의 측정. 상부파엘: δTCAR-3. 바닥파넬:항-Leu항체. 화살표는 항체의 첨가시간을 나타낸다.

제11도는 γ,δTCAR의 세형태의 면역침전. A-E부분에 대해서 면역침전에 사용한 항체는 항-Leu 4 (항 CD3), βF1 (항-TCRβ), 항-δ1TCR (항-δTCR), 항-crb혈청 (항-rTCR) 및 P3(라벨을 않은 열, 기준)이다.

125 I-라벨을 한 세포용해 생성물로부터의 면역침전물을 환원(R) 또는 비환 원(N)조건에서 SDS-PAGE ( 10% 폴리아크릴아미드)로 분석하였다.

개방화살표(△)는 환원조건에서의 TCR δ의 위치를 나타내고 연속화살표(▶)는 비환원조건에서의 δTCR의 위치를 나타낸다. 크기표식, Mr(천으로된) 은 좌측에 나타낸다.

A) PBL-L2 에 비이황화물-결합된 γTCR(40KD) 1-6열에서 방사성 라벨을 한 세포를 TCR-CD3 연결을 유지하는 0.3% CHAPS 세제에 용해시키고 한편으로는 7 및 8열 에서는 면역침전은 사슬 분리후 실시하였다.(방법을 참조)

B) IDP2 세포에의비이황화물-결합된γTCR(55KD)1-4열에서 방사성라벨을한 세포를 0.3% CHAPS 세제에 용해시키고 한편으로 5 및 6열에서는 면역침전은 사슬분리 후에 실시하였다.

C) WM-14 세포 비이황화물-결합된 γTCR(40KD) 모든열은 1% 디지토닌 용해된 방사성 라벨이된 세포에서 면역침전에 상응된다.

D) 티민(thymic)클론 II세포에 비이황화물-결합된 γTCR (40KD) 방사성 라벨을한 세포를 1% 디지토닌(1-4열) 또는 0.1% 트리톤 X-100(5 및 6열)에 용해 시키고 한편으로 7 및 8열에서는 면역침전은 사슬분리 후에 실시하였다.

E) MOLT-13 백혈병 T 세포에의 비이황화물-결합된 γTCR(40KD) 1-4 열에서 면역침전은 0-3% CHAPS세제에 용해시킨후 실시하고, 반면에 5 및 6열에서는 면역침전은 사슬분리후 실시하였다.

제12도는 각각 항-cr ml 항체 및 항-TCRδ1 항체에 의한 γTCR 및 δTCR 사슬의 면역침전.

세포표면에 방사성라벨이된 MOLT-13 세포를 0.3% CHAPS 세제에 용해시키고 γ,δTCR-CD3 착화합물은 항-CD3 단일 클론의 항체로 단리하였다.

면역침전물은 환원 조건에서 10% SDS-PAGE로 분석하였다.

1열 : 항-Leu4 (항-CD3) mAb 에 의한 면역침전 3열 : 단리한 γ,δTCR-CD 착화합물의 사슬을 분리한후 항-cr1(항-TCRγ) mAb에 의한 면역침전, 4열 : 단리한 γ,δTCR-CD3 착화합물의 사슬을 분리한 후 항-TCRδ1 (항-TCRδ) mAb 에 의한 면역침전

제13도는 PEER 와 MOLT-13 세포로부터의 γ및δTCRs 의 펩티드 골격크기와 글리코실화의 측정. 면역침전에 사용된 단일클론의 항체는 각열의 상부에서 나타낸 것 같이 항-cr ml(항-TCRγ), 항-TCRδ1(항-TCRδ) 및 P3(라벨이된기준)이다.

사용된 라벨이된 세포배양주는 각각 10% SDS-PAGE 방사선 사진법이나 또는 풀루오로그래프의 바닥에 표시되어 있다.

모든 시료는 환원 조건에서 용해된다. 크기표시, Mr는 천단위이다.

A) PEER 와 MOLT-13 세포로부터의 γTCR의 펩티드 골격크기. 세포는35 s-시스타인과35 s-메티오닌으로 15분간 생합성식으로 라벨을 하였다.

시료는 엔도 H(+) 또는 모의처리(-) 처리하였다.

항-cr ml에 의한 면역 침전은 PEER세포(3열)과 MOLT-13 세포(7열)의 비성숙 γTCR의 위치를 나타내는 한편 상응하는 폴리펩티드 골격크기는 엔도 H(4 및 8열)로 처리한 후에 가시화된다.

B) MOLT-13 세포로부터의 TCR의 글리코실화.¹²⁵I-라벨이된 세포를 항-CD3 mAb로 면역 침전시키고 그리고 δTCR 폴리펩티드는 N-글리카나제(4열), 엔도 H(2열)로 배양하거나 또는 모의처리(1 및 3열)하기전에 정제(방법을 참조)하였다.

제14도는 MOLT-13 γTCR(형태 2bc)의 누클레오티드 배열순서. 부분 A:클론 M13K의 배열순서 전략. 1.1kb cDNA 클론M13K의 부분적 제한 설명도를 나타낸다.

부분B:클론 M13K의 누클레오티드 및 추론한 아미노산 배열순서. 신호배열순서(S), 변수(V), N-영역(N), 연결(J) 및 상수(CI, CIIb, CIIc 및 CIII) 영역 유전자 배열순서를 화살표로 나타내고 그리고 다음으로 기술된 게놈의 배열순서와 비교하여 확인하였다.

Lefrance et al. ,(1987, IMMUNOL. 138:2687-2690)(J에 대해서)and Lefranc et aI.,(1986 cell 45:237-246)(s 및 v에 대해서), Lefrance et al. ,(1986, Nature, 319:420-422) and Quertermous et al., (1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9596-9000) and Pellicci et al. ,(1987, Science 237:1051-1055)(C에 대해서).

개시 제인 메티오닌으로부터 시작하는 추론된 아미노산 배열순서는 누클레오티드 배열순서 밑에 나타낸다.

세포외의 시스타인은 사각형으로 표시하였다.

그리고 잠재력 있는 N-결합된 탄수화물 부착위치( N-X-T; Marshall, 1977, Ann. Rev. Biochem 41: 673-702)는 괄호로 나타낸다.

제15도는 γ,δTCR 형태1의 바람직한 용도. 세 사람의 건강한 수여자로부터 새로이 단리한 말단의 혈액 단일 핵세포를125 I-라벨을 하고 1% Triton X-100 에 용해시켰다.

P3에 의한 면역침전물(기준, 1 및 3열)을 비환원조건(N)과 환원조건(R)에서 분석하였다.

천단위로된 Mr 표식은 좌측에 나타낸다.

제16도는 남자의 세 개의 γ,δTCR 형태의 개략도. CII 엑손인코드된 연결기 펩티드는 cr1 CII엑손 인코드된 펩티드된 펩티드 같이 채워진 사각형(▒)으로 나타낸다; ▨, ▦, ▧는 cr2 CII 엑손 전사 a, 전사 b 및 전사c로 인코드된 펩티드를 각각 나타낸다. 잠재력 N-결합된 글리칸 부착 위치(O) 및 술피드릴(sulfhydryl) 그룹(-SH) 및 상상되는 이황화를 가교(-S-S)를 나타낸다.

제17도는 재배치된 δTCR 유전자의 설명도. 서선 블룻 분석에서 사용한 EcoRI (RI), Hinc II (Hc), ScaI (S) 및 PveII (P) 위치와 탐침을 포함하는 γ119δ1의 설명도를 나타낸다.

제18a도는 MOLT-13 세포배양수로 트란스펙트하는데 사용한 γTCR 사슬의 개략도.

이 개략도는 보고된 분석을 근거로 한다.(Brenner, M.B., et al., 1986, Nature 322:145-149; Brenner, M.B., et al., 1987, Nature 325:689-694; Krangel, M.S., et al., 1987, science 237:64-67).

Pred., 는 예측(predicted) 을 나타내고 Obs., 는 관찰(observed)을 나타낸다.

예측한 글리코실화한 폴리펩티드의 크기는 각각 3KD의 부착된 탄수화물을 포함하는 모든 가능한 N-결합된 글리코실화 위치(막대기 끝의 사탕으로 표시한)를 사용하고중요한 위치 차이는 다른 번역 후수식으로 도입됨을 측정한다.

Ig-같은 분자의 내부-사슬 이황화를 결합형태도 표시한다.

시스타인 잔기(cys)는 PBL CI γTCR에든 CII엑손으로 인코드되지만 이러한 시스타인은 두 개의 다른 γTCR사슬에서 사용한 CII 엑손의 모든 전사에는 없음을알아야 한다.

또한 55KD γTCR 단백질(Brenner, M.B.,et al.,1987, Nature 325-689-694; Weiss, A. et al.,1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6998-7002 )은 IDP2의 그것과 같다.

제18b도는 발헌 플라스미드 구조를 pFneo.PBL CIr 및 pFneo. IDP2r를 MOLT-13 세포배양주속으로 γTCR 클론을 주입하는데 사용하였다.

PBL CI γTCR cDNA 클론(PBL CI.15)와수리한 IDP2 γTCRcDNA클론(IDP2.11r)(Krangel, M.S., et al., 1987, science 237:64-67)을 EcoRI 소화에 의해서 이들의 모체 플라스미드 전달매개체(pUC 18)로부터 분할하고 그 끝은 DNA 중합효소의 Klenow단편으로 무디게 만들고 그리고 다음에 cDNA를 Sall-절단 및 Klenow-처리한 pFneo 포유동물발현 전달매개체에 결찰시켰다.

비장촛점을 형성하는 비루스(SFFV)와 관련하여 적절한 위치에의 cDNA삽입물을 포함하는 클론을 제한 설명도에서 선택하였다.

pFneo(Saito, T., et al.,1987, Nature 325;125-130)은 쥐의 βTCR cDNA 삽입물을 분할하기 위해 BamHI로 소화시키고 다음에 T4 DNA합성효소로 결찰하여 수득한 pTβ Fneo 의 유도체이다.(Ohashi, P., et al., 1985, Nature 316:606-609)표시된 바와 같이 이 전달매개체는 SV40 촉진부위의 조절하에 박테리아 네오마이신 저항 유전자(neo)를 포함하여서 포유동물 수용체 세포에서 항체성 G418에 저항을 부여한다.

이 괄호 속의 제한위치는 구성중에 파괴되었다.

제19도는 MOLT-13 트란스펙탄트에서의 γ,δTCR의 면역침전분석이다.

표면¹²⁵1-라벨이된 세포를 사슬 해리를 보존하기 위해 0.3% CHAPS 세제에 용해시키고 mAb P3(기준), 항-leu-4 (항-CD3), 항-TCRδ1 (항-δTCR) 또는 항-Ti-γA(항-Vr2)로 면역침전시키고 그리고 비환원(N)이나 환원(R)조건에서 SDS-PAGE로 용해시키고 그리고 다음에 앞에서 기술한 것 같이 방사선 사진법으로 가시화 하였다.(Brenner, M.B., et al., 1986, Nature 322:145-149; Brenner, M.B., et al., 1987, Nature 325:689-694).

항-Ti-γA mAb는 vr2 단편의 인식과 일치하는 상이한 T세포 클론에 대한 반응성의 형태를 나타낸다.

M13.PBL CL-유도된 γTCR cDNA로 트랜스 펙트된 MOLT-13 세포; 클론 #7를 이분석에 사용하였다. M13. IDP2r; IDP2-유도된 γTCR cDNA로 트랜스펙트된 MOLT-13세포; 클론 #10을 이 분석에 사용하였다.

크기표시기, M(분자량)은 천단위 달론으로 한다.

개방 화살표, 잔유 MOLT-13 γTCR 사슬; 연속 화살, 트란스펙트된(PBL Cl-또는 IDP2-유도된)γTCR cDNA; #표, 비환원조건에서의 MOLT-13 δTCR 사슬을 나타낸다. 환원하면 δTCR 사슬은 δTCR사슬은 가동성변화를 받고 그리고 40KD γTCR사슬과 동시-이동한다.

그러나 δTCR사슬은 M13.IDP2r 의 항-vr2 항면역침전에서 볼수 있듯이(제 19도 8열). 40KD γTCR 단백질이 동시 면역침전 안될 때 환원조건에서 40KD띠로서 분명히 가시화된다.

제20도는 트렌스펙션의 γTCR 폴리펩티드의 2차원의 겔분석이다. 2×10 세포를 표면 I라벨을 하고 뉴라미니다제(neuramindase)(각각 1mg/ml의 포도당과 소혈청 알부민으로 1.5ml PBS에서 23℃에서 1.5분간 넣는것 150단위)로 처리하고 0.3% CHAPS세제에 용해시키고 1 ug 항-leu-4 mAb로 면역침전시키고 그리고 환원조건에서 20겔분석하였다.

비-평형 pH 경사겔 전기영동(NEPHGE)를 pH3.5 내지 10의 암포린(Ampholine)(LKB, 스웨덴)을 사용하여 실시하고 다음에 10.5% 아크릴아미드겔에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔전기영동으로 실시하였다.(Brenner, M.B., et al., 1987 Nature 325:689-694).

CD3 성분의 위치(표시안됨)을 상이한 세포배양주에서 발현된 γTCR종을 확인하고 비교하는데 사용하였다.

개방화살표; MOLT-13 γTCR종; 연속화살표, IDP2 γTCR종 ; #표, PBL Cl γTCR종.

제21도는 트란스펙탄트의 γTCR사슬의 골격폴리펩티드 크기의 분석. 세포는 나타낸 것 같이 35S-메티오닌과 35S-시스타인으로 15분간 맥박 라벨을 시키고 P3(기준), 항-Cγml(항-γTCR) 또는 항-Ti-γA(항-Vr2) mAb로 면역침전 시켰다.

면역침전은 에도 글리 코시다제-H (Endo-H, +)로 처리하거나 또는 모의-배양하고(-), SDS-PAGE로 용해시키고 그리고 형광사진으로 가시화 하였다.

모든 시료는 환원처리 하였다.

M분자량 표식은 천단위 달톤으로 함.

활서띠를 포함하는 43KD를 추가의 내부 표식으로 작용한다. M13.IDP2r; IDP2 γTCR cDNA 클론 #10으로 트란스펙트한 MOLT-13 세포.

제22도는 γδT세포클론과 다중클론의 사람 T세포 모집단의 서선 블롯분석. 게놈의 DNA를 EcoRI로 소화시키고 그리고 V-J탐침으로 추적하였다.

DNA 공급원은; PBL T-세포 클론(1,3-9열), PBL(10열), 신생흉선세포(NBT-11열), 태아의 흉선세포(FT-12열) 및 B세포(게름라인(germline-2열). 게름라인-3Kb V δ 및 6.7KbJδ단편을 블룻의 좌측에 나타내고, 한편으로 번호가 I-V 인 다섯 개의 공동재배치를 우측으로 나타낸다.

I-V로부터의 재배치의 크기는 각각 2.9kb, 3.5kb, 4.2kb, 6.2kb 및 7.1kb가 된다.

T 세포 항원수용체(TCR)는 T세포에서 클론 특이성의 이황화물-결합된 헤테로이량체인 것으로 나타났으며 이는 두 개의 글리코실화한 서브유닛으로 구성되고 이 중 하나는 α 사슬이라 지칭하고 다른 하나는 β 사슬이라 지칭한다.

α 및 βTCR 서브유닛은 각각 대략 50,000 및 40,000 달톤의 상대 분자량(Mr)을 가진다(Allison et al., 1982, Immunol. 129:2293-2300; Meuer et al., 1983, J. Exp. Med. 157:705-719; Haskins et al., 1983, J. Exp. Med 157:1149-1169).

T 세포 개체 발생중에 재배치하고 그리고 βTCR(Yanagi et al., 1984, Nature 308:145-149; Hedrick et al., 1984, Nature 308:153-158)와 αTCR(Chien et al., 1984 Nature 312:31-35; Saito et al., 1984, Nature 312:36-40, Sim et al., 1984, Nature 312:771-775) 서브유닛을 인코드하는 유전자를 대용의 하니브리드화에 의하거나 또는 올리고누클레오티드로 탐침하여서 단리하였다.

T 세포 클론의 T 세포항원 수용체의 α 및 β 사슬은 각각 변수(V), 다양성(D), 연결(J) 및 상수(C)로 자칭하는 영역의 독특한 결합으로 구성된다(Siu et al., 1984, Cell 37:393; Yanagi et al., 1985, Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 82::3430).

가변화성(hypervariable) 영역은 확인하였다(Patten et al., 1984, Nature 312:40; Becker et al., 1985, Nature 317:430).

각 T 세포 클론에서 α 와 β사슬의 두가지 모두의 V, D 및 J 영역의 결합이 T 세포 클론의 독특한 특징이고 또한 T 세포클론의 인자형으로서 또한 알려진 독특한 결합위치를 한정하는 방법으로 항원인식에 관여한다.

반대로 C 영역은 항원결합에 관여하지 않는다.

사람 α, βTCR의 독특한 특징은 CD3 당단백질 착화합물로서 α,βTCR의 관찰된 동시조절(Meuer et al., 1983, J. Exp. Med. 157:705-719), 동시면역침전(PCT International Publication No. WO 88/00209, published January 14, 1988; Oettgen, et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:12,039-12,048) 및 소요의 동시발현(Weiss et al., 1984, J. Exp. Med. 160:1284-1299)이었다.

따라서 두 개의 단백질 착화합물의 직접적 물리적 관련이 이 T3 당단백질에 α, βTCR 분자를 화학적으로 가교결합시키고 TCR 서브유닛과 T3 당단백질(Mr 28,000) 서브유닛으로서 가교결합된 착화합물의 성분을 확인하여 나타내었다(Brenner et al., 1985, Cell 40:183-190).

T3 대응물은 쥐의 α, βTCR와 유사하게 관련되었다(Allison et al., 1985, Nature 314:107-109; Samelson et al., 1984, Immunol. Rev. 81:131-144).

γTCR라 지칭되며 T 세포에서 재배치하는 제3의 유전자는 처음에 쥐에서 확인하고(Saito et al., 1984, Nature 309:757-762; Kranz et al., 1985, Nature 313:762-755; Hayday et al., 1985, Cell 40:259-269) 그리고 다음에 사람에게 확인하였다(Lefranc et al.,1985, Nature 316:464-466; Murre et al.,1985; Nature

316:549-552).

사람 γTCR 위치는 5 및 10변수사이, 5의 결합 및 2의 상수 영역 유전자로 구성되는 것으로 나타난다(Dialynas et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:2619). 비록 기능적 변수와 연결영역의 전체수가 제한된다하더라도 중요한 다양성을 V-J의 연결가정중에 삽입하였다(Kranz et al., 1985; Nature 313:752-755; Lefranc et al., 1986, Cell 45:237-246; Quertermaus et al., 1986, Nature 322:184).

γTCR 유전자 재배치는 억제제-세포독성은 물론 보조제 표현형에서도 발생한다(Lefranc et al., 1985, Nature 316:464-466; Murre et al., 1985, Nature 316:549-552, Quertermaus et al., 1986, Science 231:252-255; Lefranc et al., 1986, Cell 45:237-246, Iwamoto et al., 1986, J. Exp. Med. 163:1203-1212; Zauderer et al., 1986, J. Exp. Med. 163:1314-1318).

γTCR의 생성물을 α, βTCR-CD3+T 로부터 T3 동시 면역침전물에서 확인하였다(Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149; Bank et al., 1986, Nature 322:181; Borst et al., 1987, Nature 325, 683-688; Moingeon et al., 1987, Nature 325, 723-726, PCT International Publication No. WO 88/00209, published Janauary 14, 1987).

γTCR 폴리펩티드는 γTCR 펩티드 배열순서에 대항하도록 된 단일클론의 항체를 사용하여 확인하였고; 이러한 폴리펩티드는 δTCR 라 칭하는 또다른 폴리펩티드를 가진 헤테로 이량체 속으로 삽입되는 것으로 발견되었다(Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149).

γ,δ 헤테로 이량체는 CD3 과 비공유결합으로 관련된 것으로 보고되었다.

γTCR-특이성 펩티드에 대항하도록 의도된 항혈청의 사용을 말초 혈액, 흉선 및 백혈병 세포배양주에서 유래되는 세포에서 CD3-연관된 γTCR 폴리펩티드를 확인 하도록 하였다(Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149; Bank et al., 1986, Nature 322:179-181, Weiss et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:6998-7002; Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694; Lew et al., 1986, Science 234:1401-1405). Bank et al.

(위에 나온)는 사람 흉선세포 클론의 표면에서 62,000KD 펩티드와 T3와 관련된 44KD γ 형을 개시하였다.

유사한 γTCR 폴리펩티드도 또한 쥐의 T 임파구에서 확인하였으며 그리고 흉선세포 분열증에 이 펩티드의 발현이 가장 현대연구의 과제이다(Roulet et al., 1985, Nature 314:103-107; Snodgrass et al., 1985, Nature 315:232-233; Lew et al., 1986, Science 234:1401-1408; Pardau et al., 1987, Nature 326:79-81; Bluestone et al., 1987, Nature 326:82-84).

γTCR⁺사람 세포배양주를 연구하여 두가지의 상이한 γTCR 폴리펩티드가 분자량이 다르고 이 황화물 결합을 형성하는 능력도 다르다는 것을 확인하였다(Borst et al., 1987, Nature 325:683-688; Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694; Moingeon et al., 1987, Nature 325:723-726; Lanier et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1076).

각각 Cγ1 및 Cγ2 라 칭하는 두가지의 상이한 γTCR 일정한 영역 유전자 단편을 비고하였다.

Cγ1 의 제2엑손으로 인코드된 시스타인 잔기는 Cγ2 엑손 단편에는 없었고 그리고 이러한 없음으로 이황화물 결합을 형성하는 몇몇 γTCR 펩티드의 무능력을 설명하도록 제시하였다(Krangel et al., 1987, Science, 237:1051-1055; Littman et al., Nature 326:85088).

γTCR 의 다중형태와는 반대로 δTCR 분자는 비교적 불변성이 δTCR 일정영역만이 있는 것으로 보인다(Hata et al., 1987, Science 238:678-682).

T 세포 개체발생중에 γTCR 유전자 재배치가 β 및 αTCR 유전자 재배치를 진행시키는 것을 나타낸다(Roulet et al., 1985, Nature 314:103-107; Snodgrass et al., 1985, Nature 315:232-233; Sangoter et al., 1986, J. Exp. Med. 163-1491-1508).

숙성한 순환하는 T 임파구중에서 비교적 적은 부분은 γTCR 이고, 그리고 CD3+4-8+ 표면 항원의 어느 것이든 나타낸다.

CD3⁺4^-8^-T 세포는 대략 2%의 숙성 CD3⁺T 세포를 구성한다.

대부분의 숙성 CD3⁺4⁺또는 CD3⁺8⁺주요 조직상용성 위치(MHC)로 제한된 세포독성 T 세포와 달리 그러나 CD3⁺천연의 킬로세포에는 유사하게 γδTCR⁺CD3⁺4^-8^-클론이된 임파구는 MHC 비제한된 세포분해성 활성도를 나타내는 것으로 보였으며; 그러나 천연의 킬로세포와는 달리 이러한 γδ⁺CD3⁺4^-8^-T 세포는 K-52 와 같은 천연 킬로세포 표적을 일관되게 죽어지는 않았다(Brost et al., 1987, 325:683-688; Brenner et al., 1987, Nature 325:689-694; Moingeon et al., 1987, Nature 325:723-726; Bluestone et al., 1987, Nature 326:82-84).

본 발명의요약

본 발명은 형태 2bc 라 칭하는 사람 γT 세포 항원 수용체(TCR) 폴리펩티드의 형태에 관한 것이다.

형태 2bc γTCR 사슬은 제14도에서 실질적으로 나타낸 것 같은 제 1 아미노산 배열순서를 가진다.

형태 2bc γTCR 사슬은 약 40,000 달톤의 분자량을 가지고 그리고 단지 두 개의 Cγ2CII 엑손 전사에 의해서만 인코드된 배열순서를 포함하는 일정한 영역을 포함한다.

본 발명은 또한 γTCR 폴리펩티드 형태 2bc를 포함하는 TCR 헤테로 이량체에도 관련한다.

본 발명은 또한 γTCR 형태 2bc 를 인코드하는 핵산 배열순서에 그리고 단지 두 개의 CII엑손만을 가지는 cr 2 일정영역을 포함하는 핵산배열순서에 관한 것이다.

특이한 구체예에서 본 발명의 핵산은 제14도에서 나타낸 핵산 배열순서의 최소한 한 부위를 포함한다.

본 발명은 또한 γ또는 δTCR폴리펩티드의 에피토프와 특이하게 반응하는 단일클론의 항체를 제공한다.

이러한 항체는 γδTCR 및 CD3 항원의 두가지 모두를 발현하는 세포에서 CD3 항원을 동시-조절하는 능력을 탐지하여 확인할 수 있다.

하나의 특이한 구체예에서 본 발명은 δTCR 사슬의 가변영역과 반응하는 항체에 관한다.

특별한 구체예에서 이러한 항체는 세포에서 기능적 δTCR 가변유전자 재배치를 검출하는데 사용할 수 있다.

또다른 구체예에서 본 발명은 δTCR 가변유전자 재배치를 검출하는데 사용할 수 있다.

또다른 구체예에서 본 발명은 δTCR 폴리펩티드의 일정한 영역과 반응하는 항체에 관련한다.

본 발명의 또다른 특징에서는 세포에서 γδTCR의 발현을 만드는 방법을 제공한다.

3.1. 정의

여기서 사용한 것같이 다음의 용어는 다음의 뜻을 가진다:

TCR = T 세포 항원수용체

V = 가변성

D = 다양성

J = 연결성

C = 일정한

mAb = 단일클론의 항체.

4. 도면 설명

(앞부분으로 옮김)

5. 본 발명의 자세한 기술

5.1. γδTCR 형태 2bc 폴리펩티드 및 핵산

본 발명은 형태 2bc 라 칭하는 사람 γTCR 폴리펩티드의 형태에 관한 것이다(다음의 제8 및 9항에 상세히 기술됨).

본 발명은 또한 DNA 와 RNA 와 같은 γ형태 2bc 를 인식하는 핵산 그리고 이들의 보충핵산에 관한 것이다.

형태 1 및 형태 2bc γTCR 펩티드는 사람 γTCR 의 앞서 보고한 형태이다(PCT International Publication No. WO 88/00209, published January 4,1988 참조). 형태 1 γTCR 폴리펩티드는 약 40,000 달톤의 분자량을 가진다.

형태 2bc γTCR 폴리펩티드는 약 55,000 달톤의 분자량을 가진다.

형태 2bc γTCR 사슬은 약간 더 큰 펩티드 골격을 가지고 그리고 형태 1보다 하나의 과잉의 잠재력의 N-결합된 글리칸을 포함한다.

반대로 형태 2bc인 본 발명의 γTCR 사슬은 약 40,000 달톤의 분자량을 가진다. 더욱이 형태 2bc γTCR 폴리펩티드는 약간 작은 펩티드 골격과 2-3 더 적은 N-결합된 글리칸을 소유한다.

γTCR 사슬형태 2bc는 앞에서 기술한 형태 2bc 에 비교하여 15KD (40KD 대 55KD) 이상이나 크기가 차이가 난다.

이 차이는 5KD 더 작은 폴리펩티드 골격크기(35KD 대 40KD)만큼 그리고 탄수화물(5KD 대 15KD)의 양의 감소를 계산된다.

또한 형태 2bc의 대략 35KD 폴리펩티드 골격이 이것을 형태 1 과 구별하는 역할을 하는데 형태 1은 40KD 골격크기를 가진다.

γTCR 폴리펩티드는 형태 2bc 도 또한 영역(Cγ) 유전자 단편 용도에 접촉된 형태 1 및 형태 2bc 와 상이하다.

형태 1γTCR 사슬 단일 CII 엑손을 포함하는 Cγ1 유전자 단편으로 인코드된 일정한 영역을 가진다(Krangel et al., 1987, Science 237:64-67). 형태 2abs γ 폴리펩티드는 세 개의 CII 엑손 말하자면 전사 a, 전사 b 및 전사 c 를 포함하는 Cγ2 유전자 단편에 의해서 인코드된다(Krangel et al., 1987, Science 237:64-67; Littman et al., 1987, Nature 326:85-88).

반대로 형태 2bc 는 형태 2abc의 cDNA에 존재하는 Cγ2 제 2 엑손으로 인코드된 배열순서의 하나의 전사가 결핍된다.

형태 2bc 는 두 개의 Cγ2 CII 엑손전사, 즉 전사 b 및 전사 c 를 포함한다.

형태 2bc에는 없는 CII의 전사는 막을 건네는 영역과 세포외의 일정영역 사이의 연결영역의 일부를 인코드한다.

여섯 개의 잠재력의 N-결합된 탄수화물 부착위치는 형태 2bc 폴리펩티드에 존재한다.

생화학적 데이타가 단지 2-3 N-결합된 글리칸만이 폴리펩티드 사슬에 부착된다는 것을 제의하기 때문에 이것으로 모든 잠재력 위치를 사용치 않음을 나타낸다.

특이한 구체예에서 γTCR 폴리펩티드 형태 2bc 는 MOLT-13(Loh et al., 1987, Nature 330:569-572) T 세포 배양주 또는 흉선 유발된 클론 II(Bank et al., 1986, Nature 322:179-181)의 세포에서 수득할 수 있다.

γTCR 사슬형태 2bc도 또한 이 γTCR 형태를 발현하는 사람 피검자의 T 임파구에서 수득할 수 있다.

형태 2bc γTCR 폴리펩티드는 제14도에 나타낸 γTCR 폴리펩티드의 1차 아미노산 배열순서나 또는 Cγ2 CII의 전사 a 및 전사 b 로 구성된 일정영역을 포함하는 이들의 일부를 포함한다.

본 발명은 또한 약 40,000 달톤의 분자량을 가지는 γTCR 형태 2bc 폴리펩티드를 인코드하는 핵산분자를 제공한다.

γTCR 형채 2bc 폴리펩티드의 일정영역을 세 개의 Cγ2 CII 엑손 중 단지 두 개만을 가지는 핵산 배열순서의 번역으로 얻는다.

본 발명은 또한 단지 두 개만의 CII 엑손을 가지는 Cr 2일정영역을 포함하는 핵산 배열순서에 관한다.

이 핵산은 DNA, cDNA, RNA 및 보충핵산 및 이들의 유도체일 수 있다.

본 발명의 특이한 구체예에서 DNA 분자는 제14도에 나타낸 핵산 배열순서의 최소한 일부분을 포함한다.

8항에서 거론된 실시예에서 2bc γTCR 폴리펩티드와의 그의 인코딩이 기술되어 있다.

9항에서 기술하는 실시예에서 이황화물 결합이나 그리코실화하는 γTCR 폴리펩티드의 능력은 그의 일정한 영역의 1차 배열순서로 측정한다.

5.2. γTCR 형태 2bc 를 포함하는 폴리펩티드 착화합물

본 발명은 γTCR 사슬형태 2bc 를 포함하는 폴리펩티드 착화합물에 관한 것이다.

특이한 구체예에서 폴리펩티드 착화합물은 T세포 항원수용체 이량체로 구성된다.

특별히 이러한 이량체는 헤테로 이량체(γ,δ 헤테로 이량체, γ,β 헤테로 이량체 및 α,γ 헤테로 이량체 또는 형태 2bc 또는 2bc 인 경우의 γ,γ' 헤테로 이량체를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다) 또는 호모이량체가 될 수 있다.

본 발명은 특별한 구체예에서 γTCR 형태 2bc 를 포함하는 폴리펩티드 착화합물은 γδTCR 헤테로 이량체이다.

이와 같이 δTCR 폴리펩티드는 γTCR 형태 2bc 폴리펩티드의 최소한 일부를 포함하는 정제한 착화합물을 본 발명이 제공한다.

δ폴리펩티드는 최소한 하나의 내부사슬, 공유결합의 이황화물 가교를 가질 수도 있다.

또한 이 폴리펩티드는 약 40,000 달톤의 분자량을 가지는 δTCR 폴리펩티드로 포함한다.

아래의 9항의 실시예에서 나타낸 것같이 γTCR 일정영역 CII 엑손 용도( 및 이같은 γTCR 사슬의 1차 배열순서)는 TCR γ와 δ사이의 이황화물 결합의 존재부재 뿐만 아니라 세포표면 γTCR 단백질의 크기의 차이에 크게 의존하는 γTCR 에 부착된 탄수화물의 양도 또한 측정한다.

이와 같이 본 발명은 또한 한정된 분자내 결합 (이황화물이나 비 이황화물-결합된)의 γδTCR헤테로 이량체의 발현을 만드는 방법과 δTCR 사슬을 발현하고 이 γ 유전자를 발현할 수 있는 세포속으로 특별한 γ 폴리펩티드 형태를 인코딩하는 γTCR 유전자의 삽입을 포함하는 γTCR 글리코실화의 정도를 제공한다.

본 발명은 또한 또다른 γTCR 폴리펩티드(예컨대 형태 1, 2abc, 또는 2bc)와 관련된 본 발명의 γTCR 형태 2bc 폴리펩티드를 포함하는 정제한 착화합물을 제공한다.

본 발명의 한가지 구예체에서 두 개의 γTCR 폴리펩티드가 최소한 하나의 내부사슬, 공유결합, 이황화물 결합을 통하여 서로서로 관련된다.

본 발명의 또다른 구체예에서 두 개의γTCR 폴리펩티드가 서로서로 비공유결합으로 관련된다.

본 발명의 또다른 구체예에서 두 개의 γTCR 폴리펩티드는 같은 일정한 영역을 가진다.

본 발명의 또다른 구체예에서 두 개의 γTCR 폴리펩티드는 다른 일정한 영역을 가진다.

5.3. γTCR 폴리펩티드와 반응하는 단일클론의 항체 γ 나 δ세포 항원수용체의 에피토프에 대한 단일클론의 항체(mAb)는 배양물에서 계속적 세포배양주에 의해 항체 분자를 생산하는 기술을 사용하여 제조할 수 있다.

이러한 것은 Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497)의 기술한데서 원유하는 하이브리도마 기술과 더욱 최근의 사람 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) 그리고 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.

한가지 구체예에서 단일클론의 항체는 사람 단일클론의 항체 또는 키메리 사람-쥐(또는 기타종)의 단일클론의 항체가 될 수도 있다.

사람 단일클론의 항체는 본 기술분야에서 공지된 많은 기술중 어느 것으로 만들수도 있다(e.g., Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16).

사람의 일정영역을 가지는 생쥐(또는 쥐 또는 기타종)의 항원-결합영역을 포함하는 키메리 항체 분자를 제조할 수도 있다(Morrison et al., 1984, Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 81:6851; Takeda et al., 1985, Nature 314:452).

본 발명은 또한 T세포 항원수용체와 반응하는 단일클론의 항체를 확인하는 방법에 관한 것이다.

이러한 mAb 는 T 세포 항원수용체와 CD3 착화합물의 두가지 모두를 발현하는 세포를 mAb결합시킬 때 CD3 항원을 동시조절하는 능력을 검출하여 확인할 수 있다.

예를 들면 CD3 동시조절은 이 세포에 결합된 라벨된 한-CD3 항체의 양을 측정하여 검출 할 수 있다.

이 방법은 예컨대 하이브리도마 분비 항-Vδ mAb δTCR를 확인하는데 사용하는 다음의 7.1.1 항의 실시예의 방법으로 설명한다.

하나의 γ 또는 δTCR 폴리펩티드의 에피토프에의 항체의 분자 클론은 공지의 기술로 제조할 수 있다.

재조합 DNA 방법학(예컨대 Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 참조)을 단일클론의 항체분자 또는 이들의 항체 결합영역을 인코드하는 핵산 배열순서를 구성하는데 사용할 수도 있다.

항체 분자는 예컨대 면역흡수 또는 면역친화성 크로마토그래피, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)와 같은 크로마토그래피 방법 또는 이들의 결합과 같은 공지의 기술로 정제할 수도 있다.

유전형의 분자를 포함하는 항체단편을 공지의 기술로 발생시킬 수 있다. 예를 들면 이러한 단편은 다음을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다: 항체분자의 펩신 소화로 만들 수 있는 F(ab')2 단편, 이 F(an')2 단편의 이황하물 가교를 환원시켜 발생시킬 수 있는 Fab' 단편 및 파파인과 환원제로 항체분자를 환원시켜 발생시킬 수 있는 Fab 단편.

본 발명의 한 구체예는 δTCR 사슬의 가변영역과 반응하는 단일클론의 항체에 관한 것이다.

이러한 항체는 특이성 δ 유전자 재배치로부터 발현된 에피토프를 인식하는 δTCAR-3(aka TCSδ1)(다음의 7항 참조)이다.

다음의 7.2항에서 기술한 것같이 mAbδTCAR-3은 γ,δ⁺T 임파구의 증식을 자극할 수 있다.

단일클론의 항체 δTCAR-3은 γ,δ⁺T 임파구의 세포형질이 없는 칼슘이온 농도의 증가를 자극할 수 있다.

또다른 구체예에서 본 발명은 γ 또는 δTCR 폴리펩티드의 일정한 영역과 반응할 수 있는 항체에 관한 것이다.

특이한 구체예에서 본 발명은 δTCR 사슬(다음의 6항 참조)의 일정한 영역과 반응하는 mAb TCRδ1에 관한 것이다.

또다른 특이한 구체예에서 본 발명은 γTCR 사슬의 일정한 영역과 반응하는 항-C γml에 관한 것이다(다음의 8.1.7 항 참조).

6. TCR δ 서브유닛 일정영역과 특이하게 반응하는 단일클론의 항체 항-TCRδ1의 발생

6.1 실험 방법

6.1.1. 항-TCRδ1이 있는 T 세포배양주의

사이토풀루오로 그래프 분석

δTCR 사슬 일정영역과 특이하게 반응하는 항-TCRδ1 mAb 를 다음과 같이 만들었다: 1gm의 PEER 세포를 50ml 의 0.3% CHAPS (3-[3-콜아미도프로필)디메틸-암모니오]1-프로판설포네이트) 세제에 용해시키고 그리고 1μl의 UCHT1 (Beverley, P.C., and Callard, 1981, Eur. J. Immunol. 11:329-334) 복수, 500μ 1의 mAb 187.1 배양물 상청액 및 스타필로코쿠스 아우로이스 코완(Staphylococcus aureus Cowan) I 균주(SACI)로 면역침전시켰다.

6주 간격으로 네 번의 복강 내 주사를 놓고 다음에 2% 트리톤 X-100 을 사용하여 면역착화합물로부터 γδTCR의 선택적 용출로 단리한 γδTCR(CD3 없이)를 최종 강화하였다.

출된 물질을 정맥내와 복강내의 두 방법 모두로 투여하고; 이 보강 4일후에 이 쥐를 죽여서 앞서 기술한 것 같이 용융을 실시하였다(Brenner, M.B., et al., 1987, J. Immunol. 138:1502-1509).

δTCR 세포배양주 PEER 및 IDP2 또는 αβTCR 세포배양수 HPB-MLT 및 JURKAT를 50μㅣ의 항-TCRδ1 배양물 상청액으로 착색하고 다음에 오르토-사이도풀루오로 그래프 분석물이 있는(제1도 참조).

FITC-공액된 염소 항-쥐 Ig F(ab)'2 단편으로 착색시켰다.

준은 P3X63.Ag8 하이브리도마 (P3)로 분비한 mAb 이었고 그리고 항 CD3 mAb 는 항-Leu4 이었다(Ledbetter, J.A., et al.,1981, J. Exp. Med. 153:310).

.1.2. mAb 항-TCRδ1의 특이성의 면역화학적 분석

표면 125I-라벨이된 IDP2 세포를 용해시키고 이들의 단백질은 기준 mAb P3, 항-Leu 4, 항-TCRδ1 또는 항-Cr 혈청을 사용하여 면역 침전시켰다.

전한 시료는 SDS-PAGE로 그리고 방사선 사진법으로 분석하였다.

CHAPS 세제에서 γδTCR 와 CD3 이 관련상태로 남았고 항-Leu 4 에 의해서 착화합물로서 면역침전하였다(제2도 3 및 4열).

러나 2% 트리톤 X-100 세제에 용해시킨 후 항-TCRδ1은 CD3 없는 이량체 착화합물(6열)로서 γδTCR 를 면역침전히고 그리고 항-Leu 4 는 γδTCR(5열) 없는 삼량체 착화합물로서 CD3을 면역 침전하였다.

δTCR-CD3 성분의 사슬을 분리한 후 항 TCRδ1 는 TCRδ만을 면역침전하고 한편으로 항-Cγ 혈청은 TCRγ 만을 면역침전하였다(9열).

슬분리 시험에 관하여는(7-9열).

HAP 용해된 IDP2 세포로부터 면역침전한 항-Leu 4 를 1% SDS 에서 비등시키고 다음에 2% 트리톤 X-100 의 4용적으로 희석시키고 항-TCRδ1 이나 항-Cγ 혈청으로 면역침전시켰다.

것은 앞에서 기술한 방법을 따른다(Brenner, M. B., et al., 1986, Nature 322:145).

6.1.3. TCR δ 폴리펩티드의 N-결합된 글리코실화

¹²⁵I-라벨을 한 IDP2 세포를 0.3% CHAPS 에 용해시키고 항-Leu 4 면역침전시키고 그리고 SDS-PAGE 로 용해시켰다(제3도 참조).

준열은 모의-소화된 IDP2 δTCR 폴리펩티드이다.

TCR 폴리펩티드의 N-글리카나제 소화는 다음과 같이 실시하였다: δTCR 를 겔 얇은 조각 용출시키고 다음에 N-글리카나제(Genzyme Corp.)로 용출시키고 소화 (10U/ml)는 30μl 의 0.17% SDS, 1.25% Nonidet P-40, 0.2M 인산나트륨 완충액 pH 8.6으로 37℃에서 16시간동안 실시하였다.

화되거나 또는 모의-배양된 δTCR 시료는 SDS-PAGE 로 분석하고 그리고 방사선 사진법으로 가시화하였다.

6.1.4. mAb 항-TCRδ1 에 의한 cDNA 클론

IDP20-240/38 의 시험관 내 번역생성물의 인식

pGEM3-0-240/38 을 지칭하는 플라스미드를 다음과 같이 구성시키고 시험관내 전사-번역용으로 사용하였다(제4도).

DP2 0-240/38(δTCR) cDNA 클론 1.5Kb 삽입은 조성물 그룹 D 배열순서의 코돈의 속에서 시작하고 그리고 나모지 코딩영역과 대부분의 3'비번역영역을 포함한다.

삽입은 부분적 EcoRI 소화에 의해서 λgt10 아암으로부터 단일 EcoRI 단편으로 분할되었다(내부 EcoRI 위치의 분할을 방지하기 위하여).

단편을 불루스크립트⁺전달매개체(총유전자(Stratagene)속으로 서브클론 하였다.

다음이 삽입물을 T7 촉진부위의 하류에서 pGEM-3 (Promega Bioteth) 속으로서의 방향성 클로닝을 용이하게 하면서 단일 BamH-Sa1I 단편(단부는 불루스크립트 전달매개체 다중결합체로부터)으로서 전달매개체로부터 제거하였다.

수득되는 pGEM3-0-240/38 플라스미드는 SamI 로 선형화하고 그리고 T7 RNA 중합효소를사용하여 합성 전사물로 캡프씨웠다(Krangel, M.S., et al., 1987, Science 237:64).

전사물의 완전성과 크기는 P-ATP 를 포함하는 반응혼합물의 분취량으로 추적하였다.

1.5Kb 의 단일 RNA 종을 관찰하였다.

35 S-메티오닌의 존재하에 시험관내 변역을 토끼 망상적혈구 분해질에서 실시하였다.

시험관 내 번역후에 시료를 2mM디티오트레이톨이든 1% SDS 에서 비등시키고 다음에 트리스 완충된 식염수 pH 7.5 에든 2% 트리톤 X-100 의 10 용량을 참가하였다.

시료를 기준 mAb P3 로 (제5도의 1 및 3열 )또는 항-TCRδ1 mAb(2 및 4열)로 면역침전시키고 SDS-PAGE 로 그리고 다음에 플루오로 그래피로 분석하였다(Bonner, W.J., and Laskey, R.A., 1974, Eur. J. Biochem. 46:83-88).

6.2. 실험결과

본인들은 δTCR 일정영역과 특이하게 반응하는 단일 클론의 항체(mAb), 항-TCRδ1을 발생시켰다.

PEER 세포배양주로부터의 γTCR-CD3 착화합물(Weiss, A., et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:6998-7002; Brenner, M.B., et al., 1987, Nature 325:689-694)를 항체분비 하이브리도마 세포배양주의 생성에서 임뮤노겐으로서 사용하였다.

하이브리도마는 PEER 세포단백질을 세포표면 결합(서이토풀루오로 그래피 분석)과 면역침전의 두 가지 방법 모두로 분비하고 다음에 SDS-PAGE 분석을 실시하였다.

두 개의 하이브리도마 상청액(5A6 및 4A1)이 PEER 세포의 표면에 결합하였다. 서브클로닝한 후 하나의 mAb(5A6.E9)를 다시 특징화하였다.

이 mAb는 γδTCR입파구(PEER, IDP2)의 표면에 결합하였지만 αβTCR 세포( HPB-MLT, JURKAT)또는 비-T입파구(제1도 및 데이터는 표시안됨)의 반응은 실패하였다.

비록 임뮤노겐이 γδTCR와 CD3의 착화합물로 구성되었지만 γδTCR 세포배양주 제시된 mAb에 대한 mAb의 보다 큰 친화성은 CD3 결정인자에 대항하도록 의도되어지는 않았다.

이 mAb 의 특이성은 수용체 착화합물을 포함하는 단백질의 관련에 영향을 미치는 각종 결정인자를 사용하는 면역침전 연구에서 측정하였다.

125I-라벨이된 IDP2 세포를 CHAPS 결정인자에서 용해되었지만 TCRγ 및 δ 그리고 CD3 γ,δ 및 서브유닛은 항-CD3 항체에 의해서 면역침전된 관련된착화합물의 부분이 남았다(제2도 3 및 4열).

그러나 만일 방사선 라벨을 한 IDP2 세포를 2% 트리톤 X-100 세제에 용해시키면 γδTCR와 CD3 은 크게 해리되고 그리고 항-CD3 mAb 의 사용으로 CD3의 선택적 침전이 된다(제 2 도 5열).

이러한 후자의 조건에서 mAb 5A6.E9는 관련된 CD3 없이 헤테로 이량체로서 γδTCR를 명역침전시켰다(제2도 6열).

이 관찰로서 TCRγ 및 TCR δ가 비-이황화물-결합된 헤테로 이량체로서 존재한다는 것을 증거를 처음으로 나타내는 것을 제시한다.

mAb 5A6.E9가 γTCR 사슬, δTCR 사슬 또는 결합적 결정인자와의 반응여부를 측정하기 위하여 분리된 폴리펩티드 사슬의 면역침전을 실시하였다.

방사선 라벨을 한 CHAPS-용해된 IDP2 세포로부터의 항-Leu4 면역침전물을 1% SDS 에서 비등시켜 γTCR, δTCR 및 CD3 단백질을 해리시켰다.

2% 트리톤 X-100 의 4용적으로 해리시킨 후 mAb 5A6.E9는 40KD(δTCR)종을 측이하게 면역침전시켰다(제3도 7열).

같은 면역침전물의 분자령을 환원조건에서 분석했을 때(제2도 8열) SDS0PAGE 가동성의 극적인 변화가 관찰되었다.

이 현상은 IDP2 및 PEER 세포배양주로부터의 δTCR의 특징이 된다(Brenner, M.B., et al., 1987, Nature 325:689-694). 반대로 분리한 사슬을 항-Cγ혈청으로 면역침전시켰을 때 40KD종(δTCR)이 아닌 55KD종(γTCR)이 면역침전되었다(제 2 도 9열).

이러한 생화학적 및 표면결합 연구를 근거하여 mAb 5A6.E9 가 항-TCRδ1 가 된다.

PEER 및 IDP2 이외에도 또한 항-TCRδ1 도 MOLT-13 및 PBL 배양수 2를 포함하는 다른 γδTCR 세포배양주로부터의 TCRδ 를 면역침전시켰다.

더욱이 실험으로 항-TCRδ1 이 이 TCRδ 일정(C) 유전자 단편에 의해서 인코드된 결정인자와 반응한다는 것으 나타낸다.

본인들은 TCR δ 서브유닛을 인코드하는 유전자를 나타내는 빼기의 해결법에 의해서 IDP2 세포배양주(예로 IDP2 0-240/38)로부터의 cDNA 클론을 단리하였다.

써선 블롯 실험에서 IDP2 그룹 0 cDNA 클론이 하이브리도화 하는 유전자를 γδTCR 임파구에서 발현하고 재배열 하였지만 αβTCR 세포에서는 대표적으로 발현하지 않는다(그리고 종종 제거된다).

다른 TCR 유전자와의 배열순서 비교에서 이러한 cDNA 클론은 신규의 V, D(?), J 및 C 유전자 단편으로 구성되는 것으로 나타낸다.

IDP2 그룹 I 조성물 DNA 배열순서는 두 개의 잠재력있는 아스파라긴-결합된 글리코실화 위치와 31.3 킬로달톤의 분자량을 가지는 폴리펩티드를 나타내고 길고 개방된 판독 프레임을 포함한다.

숙성 IDP2 δTCR 폴리펩티드에 존재하는 비글리코실화한 δTCR 단백질의 분자량과 아스파라긴-결합된 탄수화물의 수를 측정하기 위하여 겔 정제한 δTCR 를 N- 글리카나제나 또는 모의 배양된 것으로 처리하고 SDS-PAGE 로 분석하였다(제3도).

N-결합된 탄수화물을 제거하면 분명한 분자량에서 5KD의 감소(40KD에서 35KD로)를 가져와서 IDP2 δTCR 에 두 개(2.5-3KD)의 N-결합된 글리칸이 존재함을 제시한다. 이것으로 제5도에서 번역된 아미노산 배열순서에 의해서 나타낸 N-결합된 글리칸의 수와 잘연관된다.

단백질의 분명한 분자량은 일반적으로 3.7KD로 나타낸 것과는 상이하게 일치한다.

IDP2 세포에서 항-TCRδ1 의 반응성 δTCR 폴리펩티드에 대한 특이성 및 부분적으로 변성한 (SDS 비등한) δTCR 의 인식이 주어지면 본인들은 이러한 mAb 가 δTCR cDNA 클론에 의해서 인코드된 폴리펩티드를 직접 인식하는지의 여부를 시험하였다. 이와 같이 cDNA 클론 IDP2 0-240/38 로부터의 삽입물을 T7 촉진부위(제 4 도)의 아래의 pGEM-3 발현 전달매개체속으로 서브클론하였다.

다음에 T7 RNA 중합 효소로서 시험관에서 발생된 전사물을 토끼의 망상적혈구 분해질에서 사용하여³⁵S-메티오닌의 존재하에 단백질의 합성을 지시하였다.

시험관 내 전사-번역 다음에 반응혼합물을 1% SDS 에서 희석하고, 2% 트리톤 X-100의 10용덕로 희석하고 그리고 유선형-일치된 기준 mAb 또는 항-TCRδ1 로 면역침전시켰다.

항 -TCRδ1+ mAb 는 주요한 종(34KD)(제5도, 4열)을 특이하게 면역침전시켰다.

이러한 띠는 기준 mAb 를 사용했을 때(3열), RNA 전사물을 배제했을 때(1 및 2열) 또는 γTCR 구성물을 사용했을 때 면역침전물에서 관찰되지 않았다.

이와 같이 mAb 항-TCRδ1에 의해서 면역침전된 방사성 라벨을 한 종은 그 합성이 IDP2 0-240/38 cDNA 클론에 의해서 특이하게 지시되는 δ 폴리펩티등 상응한다.

이 폴리펩티드(34KD)는 N-그리칸 처리한 IDP2 δTCR 사슬(35KD)에 그 크기가 매우 유사하다.

IDP2 0-240/38 클론은 천연의 ATG 개시코돈은 물론 리더 배열순서도 부족하다.

이 코돈의 V 영역속에는 두 개의 잠재력 있는 내부 ATG 코도(잔기 12 및 44에)이 있다(제5도).

이러한 코돈을 합성을 개시하는데 사용하면 가능하거나 소량의 소량의 종이 표시된 것을 계산하는 하나이상의 폴리펩티드 종이 생긴다(제5도 4열).

이와 같이 클론 IDP2 0-240/38 에 의해서 인코드된 IDP2 δTCR 서브유닛의 항-TCRδ1 에 의해 직접적 혈청학적 인식이 된다.

7. TCR 델타 서브유닛 가변성영역과 특이하게 반응하는 단일클론의 항체 δTCR-3의 발생

7.1. 실험방법

7.1.1. T세포 항원수용체의 면역침전 및 SDS-PAGE 분석

δTCR 사슬의 가변성 영역과 특이하게 반응하는 δTCR-3 mAb 를 다음과 같이 발생시켰다: 한 마리의 쥐를 복강내주사로 2x10⁷Molt-13 세포를 면역시켰다.

한달후에 쥐를 후속 3일간 매일 정맥 내 주사로 1x10⁷Molt-13 세포를 보강시키고 다음에 면역 비세포를 쥐의 골수종 P3x63Ag8.653 세포로 50% 폴리에틸렌 글리콜 1500의 존재하에 용융시켰다.

하이브리도마를 유량게포계로 CD3 동시-조절을 분석하여 채질하였다.

CD3 동시-조절의 분석은 세포로 배양시켰을 때 α,β T 세포 항원수용체에 대한 항체가 CD3 착화합물의 내장화를 일으킨다는 관찰에 근거하였다(Lanier, L.L., et al., 1986, J. Immunol. 137:2286; Meuer, S.C., et al., 1983, J. Exp. Med. 157:705).

Molt-13, PEER 및 HPB-모든 세포배양주를 락토과산화효소 기술을 써서 요오드화 하였다.

¹²⁵I-βF1 라벨을 한 세포를 1% 트리톤 X-100 을 포함하는 트리스-완충된 식염수(pH 8)에 용해시켰다.

분쇄물은 δTCAR-3 항체나 또는 βF1 항체를 사용하여 면역침전시켰다.

βF1 는 TCR 사슬에 대한 뼈대 단일론의 항체이다(Brenner, M.B., et al., 1987, J. Immunol. 138:1502-1509).

모든 시료를 환원이나 또는 비-환원조건엣 SDS-PAGE로 분석하였다(제6도).

Molt-13 및 PEER 둘 모두가 CD3⁺4^-8^-WT31^-이다.

HPB는 CD3⁺4^-8^-WT31⁺이다.

제6도 에서 나타낸 것같이 δTCAR-3은 Molt-13 및 PEER 세포로부터의 비-이황화물-결합된 γ 및 δ 사슬을 면역침전시켰으며 한편으로 βF1은 HPB-모든 세포로부터의 이황화물-결합된 α 및 β 사슬을 면역침전시켰다.

δ 및 γ 사슬에 상응하는 띠사이의 방사선 사진법 강도의 차이는 이러한 두 단백질 요오드화의 정도에 차이를 나타난다,

7.1.2. δTCAR-3 항체에 의한 δTCR 사슬의 면역침전

제7도는 0.3% CHAPS (3-[3-콜라미도프로필)디메팅암모니]1-프로판술폰산염)을 포함하는 트리스-완충된 식염수(pH 8)에나 또는 1% 트이톤 X-100에 용해시켰다.

1% 트리톤 X-100 에서 γδTCR는 CD3 착화합물로부터 해리하고 한편으로 0.3% CHAPS 에서는 γδTCR 가 CD3 착화합물과 관련되어 남는다.

면역침전에 제7도의 3, 4 및 7열에서 사용한 I-라벨을 한 분해물을 SDS 를 첨가하여 최종농도가 1%가 되게한 후 68℃ 로 5분간 가열하여 변성시켰다.

각후에 요오도아세토아미드를 최종농도가 20ml 가 되게 첨가하였다.

다음에 이 혼합물을 트리스-완충된 식염수(pH 8)에든 1.5% 트리톤 X-100 의 4용적으로 희석시켰다.

이 변성과정으로 γ사슬, δ사슬 및 CD3단백질으 서로서로 완전하게 해리시킨다. 모든 시료는 환원조건(R)에 있는 4열의 시료를 제외하고는 비환원조건(N)에서 SDS-PAGE 로 분석하였다.

환원 및 비환원조건에서의 δ 사슬의 가동성의 차이를 주의한다.

항-Cγ 항혈청은 γ일정영역(잔기 117-136)으로부터의 20 아미노산 합성 펩티드로 토끼를 면역시켜 발생시켰다.

7.1.3. 유량 세포계에 의한 세포표면 착색의 분석

5x10⁵세포를 적절한 항체(NMS(정상쥐의 혈청), δTCAR-3, OKT3 또는 WT31)로서 4℃에서 30분간 배양시키고 다음에 PBS(pH 7.4)에든 0.2% BSA 로 두 번 세척하였다. 형광-용액된 염소 항-쥐 IgG로서 4℃에서 30분간 배양시킨 후 세포를 오르토사이토풀루오로 그래프에서 분석하였다(제8도).

7.1.4 δTCAR-3⁺과 OKT3⁺말초의 혈액 임파구의 2색상 사이토풀루오로 그래프 분석 말초의 혈액 임파구를 처음에 δTCAR-3으로 4℃에서 30분간 배양하였다.

세척 후에 세포를 피코에리트린(PE)-공액된 염소 항- 쥐 IgG 로서 4℃에서 추가로 30분간 배양하였다.

세척후 세포를 형광(FITC)-공액된 IKT3으로 4℃에서 30분간 배양하고 다음에 세포를 오르토 사이토풀루오로 그래프로 분석하였다(제9도).

7.1.5. 세포질 내 봉입체 Ca2⁺농도([Ca2⁺]i 대 시간의 측정

Molt-13 세포를 아세톡시메틸에스테르 형태의 Ca²+ -민감성 탐침 fura-2(디메틸술폭시드에든 1ml 스톡으로부터의 2μm, Molecular Probes, Eugene, Oregon)을 RPMI 1640 에든 107 세포/ml 와 10% 태아소의 혈청의 농도에서 37oC로 30분간 라벨을 하였다.

다음에 세포를 세척하고 Hanks 균형된 염용액 (HBSS)에든 107 세포/ml 와 5% 태아소의 혈청에서 재현탁시키고 사용할 때까지 실온에서 어두운 상태로 보관하였다.

형광측정 직전에 2x10⁶세포를 원심분리하고 다음에 2ml의 새로 만든 HBSS 에 재현탁시키고 그리고 석영 쿠베트에서 37℃로 놓고 일정하게 교반하였다.

형광을 SPF-500C 형광계(SLM Aminco, Urbana, Illinois)에서 세포현탁액에서 측정하고-340( 2) 및380( 2) nm 과 방사 사이에서 변하는 여기 파장을 510( 5) nm 에서 검출하였다.

350/380의 비를 자동적으로 계산하고 (매 2초마다 1비율), 작도하고, IBM PC AT 에서 저장하였다.

형광비율로부터의 [Ca2⁺]i 의 정량화를 Grynkiewicz et al 이 기술한 것같이 실시하였다(1985, J. Biol. Chem. 260:34400).

무관계한 항체의 첨가는 [Ca2⁺]i 를 변화시키지 않았고 반면에 세포분해는 1μm의 [Ca2⁺]i가 되었다.

7.2. 결과

본인들은 TCR δ 사슬의 여러 가지 영역에 대향토록 되고 δ 폴리펩티드를 특징화하는데 사용할 수 있는 단일클론의 항체 δTCAR-3을 발생시켰다.

이 단일클론의 항체는 γδTCAR-3 를 지니는 T 세포에 결합하고

그리고 또한 Molt-13 세포에 결합될 때 fura-2 Ca²⁺신호를 유도해낸다.

δTCAR-3 단일클론의 항체는 CD3⁺4^-8^-WT31 표현형을 가지는 Molt-13- 세포배양주로 쥐를 면역시켜 발생시켰다.

하이브리도마를 처음에 CD-동시-조절로 채질하였다.

양성의 클론을 면역침전으로 추가로 체질하였다.

¹²⁵I-라벨이된 Molt-13 및 PEER 분해생성물로부터의 γδTCR 헤테로 이량체의 δTCAR-3 면역침전을 제6도에 표시한다.

δTCAR-3은 HPB-ALL 로부터의 어떤 폴리펩티드도 면역침전시키지 않는다(제6도). 반대로 β 사슬에 특이성이 있는 뼈대의 단이클론의 항체인, βF1(Brenner, M.B., et al., 1987, J. Immunol. 138:1502-1509)는 HPB-모든 세포배양주로부터의 αβ헤테로 이량체를 면역침전시킨다(제6도, 10 및 12열).

환원 또는 비환원 조건에서 분석했을 때 Molt-13 및 PEER 세포의 두가지 모두로부터의 면역침전된 γδ수용체는 이러한 두 세포배양주에서 비-이황화물-결합된 γδTCR 를 나타내는 헤테로 이량체 구조를 보인다.

비-환원성 조건에서 관찰한 것에 비하여 환원성 조건에서는 δ 사슬의 가동성에 약간의 변화가 있는데(제6도, 1 및 3열과 5 및 7열), 이것은 IDP2 및 PEER 세포배양주에서 앞서 지적한 현상으로서(Brenner, M.B., et al., 1987, Nature 325:689-694), 내부사슬의 이황화물 결합의 존재를 제시한다.

δTCAR-3 항체가 CD3-관련된 γTCR를 인식한다는 것을 나타내기 위하여 0.3% CHAPS 세제에 용해시킨¹²⁵I-라벨이된 Molt-13 세포분해 생성물을 사용하여 면역침전을 실시하였다(제7도 1열).

이러한 조건에서 CD3 착화합물은 수용체와 연합한 상태로 남고, 그리고 γδ헤테로 이량체와 CD3 착화합물의 둘모두를 δTCAR-3으로 면역침전시켰다.

그러나¹²⁵I-라벨을 한 분해물을 γδ수용체로부터의 CD3 착화합물을 크게 해리시키는 1% 트리톤 X-100 세제에 용해시켰을 때 γδ헤테로 이량체만이 δTCAR-3으로 면역침전된다(제7도, 2열).

기준으로서 항-CD3 항체인 UCHT-1(Beverley, P.C. and Callard, R.E., 1981, Eur. J. Immunol. 11:329-334)는 CD3 착화합물만을 면역침전시키지만 γδ헤테로 이량체는 면역침전시키지 않는다(제7도, 5열).

δTCAR-3의 특이성을 γ, δTCR 및 CD3-단백질이 완전히 해리되어 있는 변성된¹²⁵I-라벨을 한 Molt-13 분해물의 면역침전물을 사용하여 더욱 분석하였다.

δTCAR-3은 비환원성 조건에서 38KD의 분명한 분자량(제7도, 3열)과 환원조건에서 40KD(제7도 4열)의 분자량을 가지는 δ사슬을 특이하게 면역침전시켰다.

항-Cγ 항혈청을 가지는 γ사슬을 면역침전시켰다(제7도, 7열).

이러한 데이터는 δTCAR-3이 δ사슬특이성인 것을 나타낸다.

δTCAR-3은 PEER 및 Molt-13 세포배양주로부터의 γ, δTCR 헤테로 이량체를 면역 침전시킬 뿐만아니라 또한 이러한 세포배양주의 표면에 그리고 IDP2 클론에 결합한다(Brenner, M., et al., 1987, Nature 325:689-694).

이것은 αβTCR-을 가지는 HPB-ALL and Jurkat 세포배양주에는 결합치 않는다(제8도) 반대로αβTCR에 대한 뼈대의 단일 클론의 항체인 WT31(Tax, W.J.M., et al.,Nature 304:445-447)는αβTCR-양성 HPB-ALL and Jurket 세포배양주와 반응하지만 γδTCR-양성 Molt-13, PEER 및 IDP2 세포*제8도)와는 반응치 않는다.

정상의 말초의 혈액 임파구(PBL)를 시험했을 때 CD3+ 임파구의 소모집단(0.9-2.4%)는 δTCAR-3에 양성이었다(제9도).

조직배양판에 고정시킨 δTCAR-3에 정상사람 PBL의 배양에 사용했을 때 이것은 γδTCR-양성 소모집단의 증식을 선택적으로 자극하였다.

배양에서 45일 후에 γδTCR 소모집단은 전체 세포 계수의 96%를 나타내었다.

αβT 세포 항원수용체에 대한 항체는 세포형질이 없는 칼슘 이온 농도 [Ca2⁺]1에 급격한 증가를 유발하였다(제10도).

더욱이 δTCAR-3은 위에서 기술한 것같이 PBL로부터 발생된 PEER 세포와 γδTCR-양성 세포배양중서 Ca2⁺플럭스를 유사하게 자극하였다.

본인들은 또한 δTCAR-3에 의한 Molt-13, PEER 및 IDP2 세포의 배양으로 CD3 단백질 착화합물의 동시-조절을 일으킨다는 것을 관찰하였다.

mAb δTCAR-3(또한 mAb TCSδ1 이라고도 한다)의 에피토프 특이성은 다음의 11.2.2. 항에 나타낸다.

8. 사람 T 세포 수용체 γδ의 세가지 형태: 선택한 건강한 개인의 한 형태의 선택적 사용

여기의 실시에서 TCRδ 사슬로 비공유결합으로 연합된 40KD TCR γ 당단백질로 구성된 새로운 형태의 사람 T 세포 수용체 γδ(γδTCR)의 구조를 제시한다. 형태 2bc라 칭하는 새롭게 확인한 γTCR 당단백질은 앞에서 기술한 비이황화물-결합된 TCR γ 형태(형태 2abc)에 비교하여 15KD(40KD 대 55KD)이상으로 크기가 상이하다.

이 차이는 5KD 더 작은 폴리펩티드 골격크기(35KD 대 40KD)에 의해서 그리고 탄수화물의 양의 감소에 의해서(5KD 대 15KD) 계산된다.

형태 2bc에 상응하는 cDNA 클론의 누클레오티드 배열순서 분석으로 형태 2bc cDNA클론이 다른 비이황화물-결합된 TCRγ서브유닛(형태 2abc)의 cDNA에 존재하는 일정한 영역(Cγ2) 제 2 엑손의 하나의 전사가 부족하다는 것을 나타낸다.

이 CII엑손 전사는 막의 건너는 영역과 세포의 일정 영역간의 연결기 영역의 부분을 인코드한다.

잠재력의 N-결합된 탄수화물 부착위치의 수와 위치가 두 개 모두의 비이황화물-결합된 형태에서 같기 때문에 본인들이 결론짓기는 연결기 영역이 어쩌면 단백질의 형성에 영향을 미쳐서 부착된 탄수화물의 양에 영향을 미친다는 것이다.

반대로 이러한 γδTCR형의 δTCR 서브유닛은 펩티드 골격크기나 또는 펩티드 설명도 작성 분석에서 변화를 보이지 않는다.

본인들은 또한 말초혈액에든 γδTCR 착화합물의 세가지 형태의 사용을 시험하였다.

형태 1 인 이황화물-결합된 형태의 거의 독접적인 사용이 어떤 건강한 피검자에게서 관찰되었다.

몇 개일에서 형태 1 은 형태 2bc 와 함께 발현하였다.

형태 2abc 는 시험한 피검자에서 확인되지 않았다.

8.1. 실험방법

8.1.1. 항체

사용한 단일클론의 한체는 항-Leu 4 (항-CD3)(Ledbetter et al., 1981,J. Exp. Med. 153:310-323), βF1(항-βTCR)(Brenner et al., 1987, J. Immunol. 138:1502-1509), 항-TCRδ1 (항-βTCR)(위의 6항에서 기술된 δTCR 사슬일정 영역과 반응하는), P3(기준)(p3xㅌ63.Ag8; 에 의해서 분비된; Koehler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497), 187.1(p3x 항-생쥐 빛사슬)(Yelto et al., 1981, Hybridoma 1:5-11), 및 WT31(αβTCR 임파구를 밝게 착색시킨다)(Spits et al., 1985, J. Immunol. 135:1922-1928). 항-Cr b 펩티드 혈청(항-γTCR)를22아미노산합성펩티드(Gln-Leu-Asp-Ala-Asp-Val-Ser-Pro-Lys-Pro-Lys-Pro-Thr-Ile-Phe-Leu-Pro-Ser-Ile-Ala-Glu-Thr-Lys-Cys)에 대항해서 발생시켰다(PCT International Publication No. WO 88/00209, published January 14, 1988).

8.1.2. 세포배양주

PEER(Weiss et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:6998-7002) 및 MOLT-13(isolated by J. Minowada, Loh et al., 1987, Nature 330:569-572)는 T 백혈병 세포배양주이다.

탯줄 혈액에서 얻은 클론 WM-14(Alarcon et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3861-3865) 및 말초혈액에서 얻은 세포배양주 IDP2(Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149; PCT International Publication No. WO 88/00209, published January 14, 1988) 그리고 흉선-유도된 클론 II(Bank et al., 1986, Nature 322:179-181)을 앞에서 기술한 것같이 배양하였다.

말초 혈액에서 얻은 세포배양주 2(PBL-L2)를 mAb WT31로 착색치 않은 말초혈액 단리한 임파구를 분류하여 단리하였다.

다음에 단리한 세포를 시험관에서 IL-2 및 10% (V/V) 조절된 배지로 보강한 RPMI 1640 배지에서 확대시키고 조사한 자지의 주입기 세포로서 매3주마다 자극시켰다.

8.1.3. 요오드화 및 면역침전

2x10⁷세포를 Ficoll-diatrizoate(Organon Teknika Corp.) 원심분리로 단리하고 1mM MgCl, 100μg의 락토과산화 효소(80-100U/mg, 시그마)를 첨가하여된 5mM 포도당 및 1mCi 의 Na I(New England Nucler)를 포함하는 인산염 완충액 식염수, pH 7.4(PBS)의 0.5ml에든 얼음에서요오드화 하였다. 10μl의 0.03% 과산화수소 용

액을 반응기간에 5분 간격으로 30분간 첨가하였다.

세포를 1mM의 불화 페닐메틸술포닐(PMSF 시그마)과 8mM 요오드세트아미드(TAA, 시그마)를 포함하는 세제 보충된 TBS(50mM 트리스-염기 pH 7.6, 140mM NaCl)에서 밤새껏 용해시켰다.

나타낸 것같이 본 연구에서 사용한 상이한 세제는 0.3%(W/V) 3-[(3-클라아미도프로필)디메틸암모니오] 1-프로판-술폰산염(CHAPS, 시그마), 1%(W/V) 디지토닌(Aldrich) 및 트리톤 X-100(TX-100, 시그마)이었다.

10,000xg 에서 20분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 후 세제 분해물을 4μl 의 정상 토끼혈청(NRS)과 400μl 의 187.1 하이브리도마 배양배지로 30분간 배양하고 다음에 고정된 스타필로 코쿠스 아우레스 코완 I(Staphylococcus aureus Cowan I)(Pansorbin, Calbiochem)의 10%(W/V) 세포현탁액을 첨가하여 사전 정제하였다.

1시간의 배양후에 판소르빈을 원심분리로 제거하였다.

특이한 침전은 각 시료에 0.25μl βF1 복수, 1μl의 1mg/ml 항-Leu4 또는 0.25μl P3 복수를 150μl 의 187.1 배양물 상청액을 첨가하고 다음에 1시간 배양하고 실시하였다.

100μl의 10%(V/V) 단백질 A-세파로스(Pharmacia)를 첨가하고 그리고 이 혼합물을 4℃에서 1시간동안 진동시켰다.

면역침전물을 TBS를 포함하는 0.1%(V/V) 트리톤 X-100으로 다섯 번 세척하고 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동법(SDS-PAGE)으로 분석하였다(Laemmli, 1970, Nature 227:680-685).

항-Cγb 펩티드 혈청에 의한 면역침전을 위하여 요오드화한 세포를 TBS 를 포함하는 1% (W/V) 도데실황산나트륨(SDS)에 용해시키고 다음에 3분간 비등시켰다. 냉각후에 PMSF 와 IAA 를 포함하는 PBS에든

2%(V/V) 트리톤 X-100의 5용적을 50mM MgCl 에든 1mg/ml 데옥시리보누클레아제(DNAse)와 0.5mg/ml RNAse의 혼합물 200μl 와 함께 첨가하였다.

위에서 기술한 것같이 187.1 mAb 를 첨가하는 것은 배제하고 사전정제와 면역침전을 실시하였다.

면역침전물은 0.5%(V/V) 트리톤 X-100, 0.5%(W/V) SDS 를 포함하는 TBS 에서 세척하였다.

8.1.4. 생체합성식 라벨화

4x10 지수식으로 생장하는 세포를 10% 투석한 태아소의 혈청(FCS)과 20mM 표진으로 보충한 메티오닌과 시스타인-없는 RPMI 1640(Select-Amine Kit, Gibco)의 4ml에 재현탁하였다.

37℃에서 30분간의 아사기간후에 1mCi의 35S-메티오닌과 1mCi의 35S-시스타인을 첨가하고 15분간의 라벨화를 허용하였다.

세포를 수거하고 2%(V/V) 트리톤 X-100, TBS에 용해시켰다.

위에서 기술한 것같이 사전정제와 면역침전은 위에서 기술한 것같이 실시하였다. 이 면역침전물을 0.5%(V/V) 트리톤 X-100, 0.5%(W/V) 데옥시콜린산, 0.05%(W/V) SDS, TBS 에서 네 번 세척하고 다음에 0.5%(V/V) 트리톤 X-100, 0.5N NaCl, 5mM EDTA, 50mM 트리스, pH 7.6 에서 세 번 세척하였다.

이 시료를 SDS-PAGE로 분석하고 표준풀루오로 그래피 방법으로 가시화하였다(Brenner and Laskey, 1974, Eur. J. Biochem. 46:83-88).

8.1.5. δTCR 단백질의 겔정제

표면 요오드화한 세포를 0.3%(W/V) CHAPS-TBS 에 용해시키고 그리고 50μl의 항-Leu4-결합된 세파로스 방울을 사용하여 면역침전시켰다.

면역침전된 종을 환원조건에서 SDS-PAGE 를 용해시키고 습윤겔을 XAR-5 필름(Kodak)에 4℃에서 24시간 노출시켜 방사선 라벨이된 δTCR 단백질을 가시화하였다.

δTCR에 상응하는 겔영역을 절개하고 시료 완충액을 포함하는 5%(V/V) 2-메르캅토에탄올에서 배양시키고 SDS-PAGE 두 번 용해시켰다.

환원시의 특징적 SDS-PAGE 가동성 변화 때문에 δTCR 단백질을 분리하고 다음에 오염물로부터 정제할 수 있었다.

TCR 단백질을 0.05%(W/V) SDS, 50mM 중탄산암모늄 완충액에서 37℃ 로 밤새

껏 배양시키고 동결건조 시켰다.

8.1.6. 엔도글리코시다제 소화

엔도글리코시다제 H (Endo H) 소화를 위하여 면역침전된 물질이나 또는 겔정제한 단백질을 0.14M 2-메르캅토에탄올을 포함하는 1%(W/V) SDS-용액 40μl 에서 30분간 비등시켰다.

냉각후에 이 혼합물을 1mM PMSF 를 포함하는 0.15M 초산염 완충약 pH 5.5 360 μl 로 희석시켰다.

5μl 의 Endo H(1U/ml-Endo-β-N-아세틸글리코스아미다제 H, Genzyme)을 위의 용액의 반으로서 37℃에서 14시간동안 배양시키고 한편으론 다른반을 모의 처리하였다.

N-글리카나제(NOGLY) 소화를 위하여 겔정제한 물질을 0.5%(W/V) SDS, 0.10M2-메르캅토에탄올의 35μl에서 3분간 비등하였다.

다음에 100μl의 0.2M 인산나트륨(pH 8.6), 1.25%(V/V) 트리톤 X-100 을 첨가하였다.

이 혼합물의 반을 1μl의 N-글리카나제(250U/ml, 펩티드-N-[N-아세틸-β-글루코스아미닐]아스파라긴 아미다제; 겔자임)로 37oC에서 16시간동안 배양시키고 한편으로 다른 절반은 모의 처리하였다.

소화후에 10μl 소의 혈청알부민을 담체로서 첨가하고 시료를 트리클로로 아세트산 침전으로 회수하였다.

단백질 펠릿을 5%(V/V) 2-메르캅토 에탄올을 포함하는 시료완충액에 취하였다.

8.1.7. 단일클론의 항체, 항-Cr ml의 생산

HPB-MLT pTγ-1 의 Cr CI 및 CII엑손의 부분을 누클레오티드 571 및 848 에 있는 BamHI 및 PstI 위치를 사용하여 단리하고(Dialynas et al., 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2619-2623) 그리고 발현 전달매개체 pRIT2T (Pharmacia) 속으로 클론하였다.

수득되는 단백질A 용융단백질을 E. coli N4830 에서 발현시켰다.

박테리아를 리소짐으로 분해시키고 용융단백질을 IgG 세파로즈 칼럼에서 정제하여 단리하였다.

쥐에 0,7 및 28일에 Freund 의 보조제에든 용융단백질 100μg를 복강내호 주사하였다.

28일후에 PBS 에든 용융단백질 100μg를 정맥내로 주사하였다.

3일후 비세포를 단리하고 기술한 것같이 하이부리도마 P3X63Ag8.653 으로 용융시켰다(Brenner et al., 1987, J. Immunol. 138:1502-1509).

하이브리도마를 ELISA 로 채질하였다.

96웰의 바닥이 폄평한 판(LINBRO, Flow Laboratories)을 PBS 에든 용융단백질이나 또는 비용융단백질 0.4μg로 밤새껏 배양하였다.

비특이성 결합위치를 50%(V/V) FCS 를 포함하는 PBS 에든 정상토끼의 IgG(시그마) 0.25mg/ml 로서 23℃ 에서 차단하였다.

50μl의 하이브리도마 상청액을 4℃ 에서 1시간동안 첨가하고 다음에 과산화효소-공액된 항-쥐 IgG(Cappel)의 5μg/ml 용액의 50μl 에서 유사한 배양을 하였다. 모든 기술된 배양물은 10%(V/V) FCS, 0.1%(W/V) BSA, PBS 를 사용하는 세척단계로 점재(intersperse)시켰다.

ELISA는 인산염-구연산염 완충액, pH 5.0로 포함하는 0.012%(W/V) 과산화수소에든 0.08%(W/V) O-페닐렌디아민(시그마)로 현상하였다.

비록 항-Cγml (IgG1)이 사이토풀루오로그래픽 분석에서 천연의 γδTCR/CD3 착화합물을 인식치 않고 또한 면역침전에서 트리톤 X-100 용해된 세포로부터의 γδTCR 헤테로 이량체를 인식치 않는다 하더라도 항-Cγml(IgG)은 CD3/γδTCR 단백질이 개개의 사슬속으로 분히된 후에 생체합성으로 라벨이된 γTCR 선구물질과 숙성γTCR 단백질을 인식한다.

이 방법으로 항-Cγml 은 TBS 에든 1%(W/V) SDS 에서 항-CD3 면역침전물을 비등하여 CD3/γδTCR 착화합물을 개개의 사슬속으로 분리한 후에 γTCR 단백질을 인식하는 것으로 표현되었다(제 12 도, 3열)

8.1.8. MOLT-13 γTCR cDNA 클론의 단리 및 배열순서

폴리(A)+ RNA 를 요서/염화리튬 침전한 다음에 올리고(dT) 셀룰로오스 친화선 크로마토그래피로서 MOLT-13 세포로부터 제조하였다.

λgt 10 cDNA 라이브라리를 헤어핀 루프(hairpin loop) 분할(McCutcham et al., 1984, Science 225:626-628)을 위하여 뭉빈 누클레아제(Mung Bean Nuclease)를 사용하는 Huynh et al., 1985의 방법(DNA Cloning, Glover, D.M. ed IRI Press, Oxfird, I:49-78)으로 폴리(A)+ RNA로부터 제조하였다.

이 cDNA 라이부라리를 E.coli 균주 C600 Hfl 에서 증폭시키고 그리고³²P-라벨을 한 PTγI(Dialynas et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:2619-2623)으로 반점 여과기 하이브리도마로 채질하였다.

양성 클론은 크기 및 제한효소 설명도를 알기 위하여 분석하고 cDNA 클론 M13K 는 배열순서를 알기 위하여 선택하였다.

M13K 의 cDNA 를 엔더누클레아제 EcoRI 로서 λgt 10 파지로부터 절개하고 적절한 제한효소로 다시 소화시켰다.

단편을 M13 전달매개체속으로 서브클론하고 수식된 T7 중합효소(Sequenase, United States Biochemical Corp.)를 사용하는 디데옥시 사슬 말단방법(Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467)에 의해서 배열순서를 정하였다.

클론 M13K는 5'의 비번역 영역의 36 누클레오티드와 3'비코딩 영역의 72 누클레오키드 (제14도)를 포함하는 프레임속에서의 전체 길이 γTCR 전사에 상응한다.

V 영역의 누클레오티드 배열순서는 상상되는 신호배열순서에서 누클레오티드 53의 C 내지 T(Ile to Val) 변화를 제외하고는 게놈 Vγ1.3 배열순서와 동일하였다

(nomenclature Lefranc et al., 1986a, cell 45:237-246; Strauss et al., 1987, Science 237:1217-1219).

J 영역은 Jγ2.3 배열순서와 같다(nomenclature based on Lefranc et al., 1986b, Nature 319:420-422; Quertermous et al., 1986b, Nature 319:420-422; Quertermous et al., 1987, J. Immunol. 138:2687-2690).

흥미로운 것은 8 누클레오티드가 게놈의 V 또는 J 배열순서에 의해서 인코드된 것으로 나타나지 않고 추측컨대 N-영역을 나타내는 V-J 접합에서 발생한다는 것이다. C 영역 배열순서는 누클레오티드 559(G 내지 C; Val 내지 Ile)와 누클레오티드 908(T 내지 C; Met 내지 Thr)를 제외하고는 상응하는 게놈 배열순서와 일치한다(Lefranc et al., 1986c, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9596-9600).

8.2. 결과

8.1.2. 신규의 γδTCR 단백질 착화합물

말초의 혈액 γδTCR임파구의 예비연구로 공지된 사람γδTCR 형태와는 상이한 CD3-관련된 착화합물의 존재를 나타낸다.

이 형태를 묘사하려는 의도로 본인들은 정상 사람 공여자오부터 얻은 다수의 세포배양주를 생성하고 특징을 지었다.

말초혈액 임파구를 잔유하는 αβTCR 임파구를 밝게 착색시키는 단일클론의 항체(mAb) WT31 로서 착색시켰다.

착색되지 않은 세포는 세포분류로서 단리하고 다음에 시험관에서 배지를 포함하는 IL-2 에서 팽창시켰다.

이 방법으로 얻은 말초의 혈액 임파구 배양주 2(PBL-L2)는 γδTCR 임파구의 세포인균질의 CD3⁺CD4^-CD8^-인 것으로 입증되었다.

PBL-L2 세포에 있는γδTCR 착화합물을 가시화하기 위하여 항-CD3 mAb 에 의한 면역침전을 CHAPS 나디지토닌에 용해된 세포표면이¹²⁵I-라벨이된 세포로부터 실시하였다.

이러한 세제에서 CD3 착화합물과 γδTCR 서브유니간의 물리적 화합이 보전된다 PBL-L2 세포로부터의 항-CD3 면역침전물의 SDS-PAGE는γTCR 일정 영역 펩티드(제 11A 도의 방법항 참조)에 대항하게 된 항혈청인 항-Cγb 혈청에 의한 γTCR 서브유닛으로서 확인된 40KD 및 44KD 단백질(40KD라 칭한다)을 용해시켰다.

PBL-L2에 있는 γTCR 단백질은 δTCR 서브유닛과 비공유결합으로 회합되고, 이것은 비환원 조건에 분석된 항-CD3 면역침전물에 든 약한 요오드화한 단백질로서 가시화된다(제11a도, 6열, 폐쇄된 화살표).

약하게 요오드화한 단백질은 PBL-l2세포에서 δTCR 서브유닛을 나타내는데 그 이유는 항-Cγb혈청으로 인식이 안되기 때문이다(제11a도, 8열).

또한 IDP2 및 PEER 세포에서 δTCR 단백질로서 알려지는 것같이 비환원 및 환원조건에서의 분석과 비교하여 같은 SDS-가동성 변화를 나타낸다(다음 참조; PCT International Publication No. Wo 88/00209, published January 14, 1988). δTCR 단백질은 환원후에 가시화가 불가능하였는데(제11a도, 3열), 그 이유는 이것이 40KD(다음 참조)의 가동성으로 유주하였고 다음에 유사한 크기의 γTCR 단백질(개방화살)로 어둡게 하였다.

이 γδTCR 형태는 정상말초의 혈액 T 임파구에서만 나타나는 것이 아니라 또한 흉선-유도한 클론 II 세포(제11d도)와 T-백혈병 세포배양주 MOLT-13(제 11E 도)에서도 관찰된다.

이러한 세가지의 세포배양주는 다른 글리코실화를 나타내어서 PBL-L2(40KD 및44KD; 제11a도 8열) 및 클론 II 세포(40KD 및 44KD; 제11d 도 8열)에서 관찰된 γTCR 단백질 쌍극 또는 MOLT-13 세포(40 내지 46KD; 제11e도 6열)에서 관찰된 확상식으로 라벨이된 γTCR 단백질 띠를 얻었다.

MOLT-13 γTCR 단백질 따의 이차원 겔분석 [비편형 pH 경사 전기영동(NEPHGE) 다음에 SDS-PAGE]로 두가지의 평형 γTCR 종(40KD 및 44KD)을 용해시켰고 이중에서 44KD γTCR 종은 40KD γTCR 종에 비하여 더 한층 높은 만노스(mannose)(또는 하이브리드)N-결합된 글리칸을 포함하였다.

이와 같이 세 개의 상이한 세포공급원(말초의 혈액, 흉선 및 백혈병)으로부터 단리한 이러한 수용체 착화합물의 γTCR 서브유닛은 δTCR 상대방 사슬과 비공유로 회합된 40KD의 세포표면 종을 나타내었다.

PBL-L2 클론 II 및 MOLT-13 세포의 γTCR 형에 대한 비교를 위하여 본인들은 IDp2 및 WM-14 세포배양주에 대한 이미 공지된 형태를 시험하였다. IDP2 세포배양주(PCT International Publication No. WO 88/00209, published January 14, 1988; Brenner et al., 1986, Nature 322:145-149)는 항-Cγb 혈청(제11b도)

으로 인식되는 더 큰 55-60KD γTCR 단백질 (55KD라 칭함)을 포함한다. 항-CD3 면역침전물을 비환원 조건에서 시험할 때 IDP2 γTCR 단백질이 그의 δTCR 상대방 사슬(제11b도 4열, 연속화살표)과 비공유로 회합된다는 것이 분명하다.

환원시 δTCR 단백질은 40KD의 분자량에 대한 SDS-PAGE 가동성에 감소를 나타낸다(제11b도 4열의 폐쇄된 화살을 제11b도 2열의 개방된 화살과 비교한다).

비공유 회합된 γδTCR 형태와는 반대로, 말초혈액-유도된 T세포 배양주, WM-14는 항-Cγ 혈청(Alarcon et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3861-3865)으로 인식된 70KD의 이황화물-결합된 TCR 이량체(제11c도 7열)를 지닌다.

또한 이 이량체는 δTCR 서브유닛(제 11C 도 5열)에 대한케된 mAb인 항-TCRδ1 으로 인식되므로 γδTCR헤테로 이량체를나타낸다. 환원조건에서의 분석으로 36KD, 40KD 및 43KD(40KD라 칭함)의 세가지 γTCR 단백질을 나타낸다.

이와같이 PBL-L2 클론 II 및 MOLT-13 세포의 CD3-회합된 착화합물은 공지의 형태와 비교하여 신규의 γTCR 헤테로 이량체를 구성하는데 그 이유는 이의TCRγ 서브유닛이 40KD(WM-14 세포에서 이황화물-결합된 Cγ1 인코드된 γTCR 단백질과 크기가 유사한)를 구성하지만 그의 상대방 사슬(IDP2 세포에서 55KD Cγ2 인코드된 γTCR 단백질과 유사한)은 아니다.

이 착화합물의 분자기준을 이해하기 위하여 γTCR 및 δTCR 서브유닛의 보다 상세한 구조적 분석을 실시예에서 처럼 MOLT-13 세포배양주를 사용하여 아래에 기술한 것같이 실시하였다.

8.2.2. MOLT-13 γTCR 서브유닛의 코아 폴리펩티드 크기

MOLT-13 세포(40KD γTCR 당단백질의 γTCR 코아 폴리펩티드의 크기를 측정하고 이것을 PEER 세포(55KD γTCR 당단백질의 크기와 비교하기 위하여 두 세포배양주를 트리톤 X-100 에 용해된 35S-메티오닌과 35S-시스타인의 존재하에 15분간 생체합성식으로 라벨을 하고 다음에 γTCR 사슬(제 13A 도, 방법항 참조)을 특이하게 인식하는 단일클론의 항체인 항-Cγml 으로 면역침전시켰다.

면역침전된 물질을 후속적으로 엔도글리코시다제 H(Endo H)로 소화시켜 비숙성 N-결합된 글리칸을 제거하였다.

MOLT-13 γTCR 폴리펩티드 골격은 35KD(제13a도 8열)의 상대 분자량을 가지며 이것은 PEER γTCR 코아폴리펩티드(40KD; 제13a도 4열) 또는 IDP2γTCR 코아 폴리펩티드(40KD; PCT International Publication No. WO 88/00209, published January 14, 1988)보다 5KD 더 작았다.

MOLT-13 세포가 그의 5KD 더 작은 크기를 기준하여 IDP2 및 PEERγTCR 코아 폴리펩티드와는 독특한 γTCR 코아 폴리펩티드로 발현한다는 결론을 내릴 수 있다. 또한 숙성 MOLT-13 γTCR 세포 표면 당단백질에서 5-11KD 의 크기만이 후-번역 과정으로 계산되고(40-46KD 표면 크기 빼기 35KD 코아 크기) 이 경우 15-20KD의 상대 분자량을 PEER 및 IDP2 γTCR당단백질(55-60KD 표면크기 빼기 40 KD 코아크기)에서의 후-번역 과정으로 계산 될 수 있다.

모든 후-번역 과정이 N-결합된 글리카이고 그리고 각 글리칸 사슬이 대략 3KD의 상대 분자량으로 계산된다고 가정하면 본인들은 2 내지 3 N-결합된 글리칸이 MOLT-13 γTCR 단백질에 부착된다는 것을 나타내고 한편으로 5N-결합된 글리칸은 PEER 및 IDP2 세포에서 폴리펩티드에 첨가된다.

세포표면 γTCR 단백질로부터 N-결합된 탄수화물을 N-글리칸제를 사용하는 실험은 코아 폴리펩트가에 첨가된 대부분의 후-번역 과정이 실제로 N-글리칸임을 나타낸다.

8.2.3. MOLT-13 γTCR 의 1차 배열순서

MOLT-13 γTCR 서브유닛을 인코딩하는 일정영역 유전자 단편의 구조를 이해하기 위하여 MOLT-13γTCR 전사에 상응하는 cDNA 클론의 배열순서를 측정하였다. MOLT-13 으로부터의 gt10 라이브러리로 유도된 폴리-A+RNA를 구성하고 그리고 사람 γTCR cDNA 클론, pTγ-1 (Dialynas et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:2619-23).

제한효소 설명도의 크기와 한정에 근거하여 하나의 클론 M13K 를 선택하고 그의 누클레오티드 배열순서를 측정하였다(제14도).

클론 M13K 는 Jγ2.3 유전자 단편에 결합된 Vγ1.3 유전자 단편을 사용하는 프레임내 γTCR 전사에서 전체길이를 나타낸다(Lefranc et al., 1986, Cell 45:237-246; Lefranc et al., 1986, Nature 319:420-422; nomenclature based on Strauss et al., 1987, Science 237:1217-1219; Quertermous et al., 1987, J. Immunol. 138:2687-2690). 일정한 영역 배열순서는 최근에 보고된 비-관능기 γTCR(Pellici et al., 1987, Science 287:1051-1055) 및 두 개의 CII엑손전사 b 및c (Lefranc et al., 1986,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9596-9600)를 포함하는 Cγ2 게놈의 배열순서와 거의 같은 것으로 판명되었다(상세한 계산을 위하여 방법항 참조). 이것은 두 개의 CII 엑손 전사를 가진 Cγ2유전자 단편을 사용하는 세포표면에서 발현된 γTCR단백질을 인코딩하는 제1의 프레임 내 전사를 나타낸다.

cDNA 클론의 상상되는 아미노산 배열순서는 위에 기술한 생화학적 데이터와 잘 일치하는 34.8KD의 폴리펩티드 골격크기를 나타낸다.

놀랍게도 여섯 개의 잠재력의 N-결합된 탄수화물 부착물 크기는 이 전사로 인코드된다.

생화학적 데이터가 단지 2 내지 3만의 N-결합된 글리칸이 폴리펩티드 사슬에 부착된다는 것을 제시하기 때문에 모든 잠재력 위치를 사용치 않는 것을 Cγ 유전자 단편의 용도를 반영하기 위하여 본인들은 형태 1로서 PBL-C1 및 WM-14에 의하여 발현된 이황화물-결합된 γδTCR 형태를 나타내었는데 그 이유는 이러한 이황화물-결합된 γTCR 사슬이 Cγ1 유전자 단편을 사용하기 때문이다(Krangel et al., 1987, Science 237:64-67). IDP2 및 PEER 세포에서 발현된 γδTCR 형태의 크고 (55KD) 비이황화물-결합된 γTCR 서브유닛은 세 개의 CII 엑선전사, 즉 전사 a, 전사 b 및 전사 c(Krangel et al., 1987, Science 237:64-67; Littman et al., 1987, Nature 326:85-88)를 포함하는 Cγ2 유전자 단편으로 인코드되며 그로므로 이 γδTCR 형태는 여기서 형태 2abc라 부른다.

따라서 MOLT-13 세포에 특징이 있는 형태는 형태 2bc라 칭한다.

8.2.4. 바람직한 Cγ유전자 단편용도

새로이 단리한 말초혈액의 이러한 세가지 γ,δTCR 형태의 존재를 측정하기 위하여 본인들은 mAb 항-TCRδ1 으로 생화학적 분석을 사용하여 10명의 건강한 피검자에게 취한 단일핵 세포를 분석하였다(위의 6항에 기술된 δTCR 일정영역과 반응하는).

이 항체는 만일 모두가 γ,δTCR 임파구가 아니면 대다수와 반응한다.

이 파넬로부터의 대표적 인결과는 제15도에 나타난다.

피검자 1에서 항-TCRδ1 면역침전물(비환원 조건에서 분석한)은 70KD 단백질피(형태 1)로서 두가지 이황화물-결합된 γδTCR 착화합물 그리고 넓은 40KD 단백질피(2abc)(제15도 2열)로서 비이황물-결합된 γ,δTCR 착화합물의 존재를 나타낸다.

이것으로 Cγ1 및 Cγ2 일정영역이 둘다 모두 이러한 개개의 발현된 γ,δTCR에 의해서 사용됨을 나타낸다.

그러나 형태 2bc의 양은 개체간에 변하였다.

두 개체에 있는 40KD 단백질띠의 강도를 비교하여(피검자 2의 2열을 피검자 1 의 2열과 비교) 피검자 2에든 형태 2bc가 피검자 1에 비하여 더 작은 유분을 주의한다.

심지어 더욱 충격적인 것은 이황화물-결합된 γ,δTCR 착화합물만이 심지어 방사선 사진법의 긴 노출후에더 시험된 열 개의 개체중 셋의 단핵세포에서 검출할 수 있었다는 것이다(피검자 3 참조).

분석한 개체의 어느 하나도 말초혈액에서 55KD 비이황물-결합된 γ,δTCR 착화합물(형태2abc)을 나타내지 않았다.

8.2.5 δTCR 서브유닛의 특징화

γTCR 단백질의 크기와 글리코실화에 있어서의 충격적인 구조적 차이에 대조적으로 다른 세포공급원에서 얻은 δTCR 서브유닛은 현저히 유사한 것으로 입증된다.

MOLT-13 세포의 δTCR 당단백질의 상대분자량은 항-δTCR mAb(제12도 4열)을 사용하여 40KD 가 되는 것으로 직접 측정하여 IDP2 세포(제11b도 2열 개방화살표)의 δTCR 당단백질에 크기가 유사한 것을 확인하였다.

또한 δTCR 폴리펩티드 골격크기를 비교하기 위하여 MOLT-13 세포에서 취한 세포표면 I-라벨된 δTCR 단백질을 N-글리카나제로 소화시켜 아스파라긴-결합된 글리칸(높음 만노스, 하이브드 및 착화합물-형태의; Tarentino et al., 1985, Biochem. 24:4665-4671; Hirani et al., 1987, Anal. Biochem. 162:485-492) 제거하였다.

MOLT-13 세포의 δTCR 코아 폴리펩티드는 IDP2 세포(35KD)(Band et al., 1987, Science 238:682-684)의 δTCR 골격과 유사한 35KD 의 상대분자량(제13b도 4열)을 가진다.

또한 엔도글리코시다제 H(Endo H, 높은 만노스와 어떤 하이브리드 N-글리칸만을 제거하는; Tarentino et al., 1974, J. Biol. Chem. 249:811-817; Trimble and Maley, 1984, Anal. Biochem. 141:514-522)에 의해 세포표면 I-라벨이된 MOLT-13 δTCR 단백질을 소화하여 하나의 탄수화물 성분의 존재와 일치하게 2.5KD(제13b도 2열)의 상대분자량을 감소시켜서 폴리펩티드에 부착된 Endo H의 215KD 상대량을 남겼다.

δTCR 일정영역(Hata, S., et al., 1987, Science 238:678-682; Loh et al., 1987, Nature 330:569-572)에 존재하는 두 개의 잠재력있는 N-글리칸 부착위치가 있기 때문에 이러한 데이터는 두가지 모두가 사용되지만 이들의 글리칸은 다르게 처리된다는 것 즉 하나는 높은 만노스 N-글리칸(Endo H-내성, 그러나 N-글리나제 민감성)으로 처리된다는 것을 나타낸다.

γTCR 폴리펩티드 사슬이 부착된 N-결합 탄수화물의 상이한 양에는 대조적으로 PEER, IDP2 및 MOLT-13 세포에 발현된 δTCR 서브유닛은 모두 같은 펩티드 코아 크기와 두 개의 N-결합된 글리칸(제13b도, 데이터는 표시 안됨)의 존재를 나타내었다.

8.3. 토의

이 실험예에서 세단백질 형태의 사람 γTCR 당단백질을 비교하였다. 말하자면 이황화물-결합된 40KD γTCR단백질(형태 1), 비이황화물-결합된 55KD γTCR 단백질(형태 2abc) 및 비황화물-결합된 40KD γTCR 단백질 (형태 2bc).

모든 세 형태는 δTCR 서브유닛과 회합된 것으로 나타낸다. 처음의 두 γTCR 형태를 나타내는 부충적 DNA 배열순서는 앞서 보고되었다(Krangel et al., 1987, Science 237:64-67; Littman et al., 1987, Nature 326:85-88).

γTCR 폴리펩티드 형태 1(PBL-C1에서의)의 일정영역을 단일의 CII 엑손을 포함하는 Cγ1 유전자 단편에 의해서 인코드되고 한편으로 γTCR 폴리펩티드 형태 2abc (IDP2 및 PEER 세포에 있는)는 CII 엑손 전사 a, 전사 b 및 전사 c를 포함하는 Cγ2 유전자 단편을 사용한다.

형태 2bc의 γTCR 사슬에 상응하는 cDNA 배열순서는 두 CII엑손전자 즉 전사 b 와 전사 c 만을 사용하는 Cγ2 유전자 단편을 포함하는 것으로 나타났다.

유사하게 클론 II 및 PBL-L2 (비이황화물-결합된, 40KD γTCR 단백질)의 γTCR 연결기 영역의 유전자 구조가 또한 말하자면 형태 2bc의 여기서 측정한 MOLT-13 구조와 같은 것으로 보인다.

사용한 δTCR 일정영역이 이러한 모든 형태에 대해서 같기 때문에(Hata, S., et al., 1987, Science 238:678-682; Loh, E.Y., et al., 1987, Nature 330:569-572), 사람에서의 세가지 γδTCR 형태의 이 구조의 완전한 비교를 이번에 실시하였다(제 16도)

두 가지 Cγ2 다형태의 게놈형태가 사람에 존재한다(Lefranc et al., Nture 319:420-422; Pellici et al., 1987, Science 237:1051-1055). 두가지 전사형태(형태 2abc와 형태 2bc)가 이러한 상이한 대립형질(allelic) 형태의 생성물일 것이다.

현재 대립형질 형태의 γTCR 폴리펩티드는 쥐에서 발견되지 않았다.

본인들이 결론짓기로는 형태 2abc(55KD) 와 형태 2bc(40KD) 사이의 γTCR 세포표면 단백질크기에 극적인 차이가 N-결합된 글리칸의 수를 가장 근접하게 반영하는 부착된 N-결합 탄수화물의 양에 의해서 주로 측정한다.

IDP2 γTCR(형태 2abc)와 MOLT-13γTCR(형태 2bc) 단백질의 골격크기는 SDS-PAGE 기준에서 각각40KD 와 35KD가 되는 것으로 측정되었으며 이는 cDNA 배열순서의 기준에서 계산한 이들의 예상치 분자량 36.6KD와 34.8KD에 각각 잘 상응한다.

16아미노산의 하나인 CII 엑손 인코드된 펩티드에 의해서 주로 계산된 골격크기의 적은 차이가 55KD와 40KD 비이황화물 결합된 γTCR 표면 형태 사이의 관찰된 분자량 차이레 기여하였지만 이를 온전히 설명할 수 없음이 분명하다.

형태 2abcγTCR 폴리펩티드는 2 내지 3의 N-결합된 글리칸을 수반하면서 하나의 추가의 잠재력 부착위치를 가지는 MOLT-13 γTCR 폴리펩티드에 반하여 모두 사용될 가망이 있는 5의 잠재력있는 N-결합된 글리칸 부착위치를 가진다.

잠재력 부착위치를 이렇게 제한하여 사용하는 이유는 알려지지 않았지만 γTCR 단백질의 구조에서 CII 엑손 인코드된 펩티드의 영향에 기인할 수도 있다.

CII 엑손 인코드된 펩티드와 이들의 이웃하는 아미노산은 플라스마막과 임뮤노글로불린-같은 일정영역의 사이 연걸기 영역을 만든다.

이들의 영역은 대부분의 N-결합된 글리칸 부착위치(제17도)를 포함한다.

본인들은 CII엑손 전사가 폴리펩티드 골격크기의 측정에 의해서 뿐만 아니라 이황화물-결합 사슬에 대한 능력을 창출하여 또한 부착된 탄수화물의 양에 영향을 미쳐서 형태를 측정하는 것으로 보인다.

IDP2 (Hata et al., 1987, Science 238:678-682)의 δTCR 부충 DNAs, PEER(Loh et al., 1987, Nature 330:569-572) 및 MOLT-13 세포의 배열순서를 정하고 가변성 및 일정영역 유전자 단편의 사이에 공간을 두는 다양성/N-영역에 대한 것을 제외하고는 동일한 것으로 판명되었다.

WM-4 세포에서의 δTCR 단백질은 43KD의 상대분자량을 가지며 이는 앞에서 기술한 δTCR 단백질(Brost et al., 1987, Nature 325:683-688; Lanier et al., 1987, J. Exp. Med. 165:1076-1094)과 유사하지만 다른 δTCR 사슬보다는 3KD 더 크다.

이러한 43KD δTCR 단백질은 상이한 가변성 영역에서 추가로 N-결합된 글리코실화 위치의 존재를 나타낼 수도 있다.

rTCR 일정영역 단편에 대해서 기술된 것들에 비교가능한 구조적 차이는 αTCR와 βTCR 유전자에 대해서 관찰되었다(Yoshikai et al., 1985, Nature 316:837-840; Toyonaga et al., 1985, Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 82:8624-8628; Royer et al., 1984, J. Exp. Med. 160:947-952; Kronenberg et al., 1985, Nature 313:614-653). 쥐의 Cr 영역에 길이로 반복하는 사람 CⅡ엑손의 수에는 구조적 유사성이 있는데 이 Cr영역중에서 CR1, Cr2 및 Cr3 일정 영역은 각각 15, 10 및 33 아미노산 연결기 영역을 인코드한다(Garman et al., 1986, Cell 45:733-742; Iwamoto et al., 1986, J. Exp. Med. 163:1203-1212).

그러나 쥐에서의 연결기 영역은 사람에서의 형태 2abc rTCR와 형태 2bs rTCR에서 보는 것같은 엑손의 중복 사용이 아닌 관련되는 엑손의 크기에서 차이를 반영한다.

또한 쥐의 rTCR는 두 개의 비이황화물 결합된 사람형태에는 대조적으로 이황화물 결합된 형태에만 존재한다.

중요한 것은 사람 r,δTCR형태는 동일하게 사용되는 것으로는 보이지 않는다.

몇몇 개체(높은 %의 r, δTCR 임파구에 대해서 선택된)에서 단일형태(형태1)가 주종을 이루어서 이 형태에 대해서 어느 양성 선택도 발생하고 또한 다른 r, δTCR 형태에 대항하는 선택도 있다는 것을 제시한다.

9. 단일의 δTCR서브유닛을 가진 독특한 트란스펙트된 rTCR 사슬의 쌍쌍에 의해서 재구성된 세가지

T 세포 수용체 r,δ유전형 형태

여기의 실시예에서 rδ헤테로 이양체의 형성에서의 rTCR 폴리펩티드의 역할을 조사했다.

본인들은 단일의 잔유 δTCR 사슬을 가진 세 개의 r δTCR 형태 (형태 1, 2anc 및 2bc)에 상응하는 r δTCR 착화합물을 트란스펙션하여 시험하였다.

rTCR 폴리펩티드의 형태 1이나 형태 2의 어느것이나 인코드 하는 rTCR DNA를 MOLT-13 세포배양주 속으로 트란스펙트하였고 이 세포배양주를 δTCR 폴리펩티드와 비공유로 회합된 형태 2bc rTCR 로 구성된 r δ 헤테로 이량체를 구조적으로 발현한다.

트란스펙트된 세포는 MOLT-13 세포배양주의 r δTCR 특징과 함께 δTCR로 비공유로 회합된 형태 2abc r TCR 나 또는 δTCR에 비공유로 결합된 형태 1 r TCR의 어느 것으로 구성된 헤테로 이량체를 발현할 수 있다.

더욱이 트란스펙트된 r TCR 유전자 생성물의 글리코실화는 이들의 천연의 세포배양주에 있는 이러한 유전자의 글리코실화와 같았다.

이와 같이 글리코실화의 정도와 이황화물 결합을 형성하는 능력은 r TCR 유전자에 의해서 측정된 성질이나 r TCR 일정영역 CII 엑손 용도는 TCR r 및 δ 폴리펩티드간의 이황화물 결합의 존재또는 부재만을 측정하는 것이 아니라 또한 r TCR 사슬에 부착된 탄수화물의 양도 측정하며 이량은 세포표면 r TCR 단백질의 크기 차이에 크게 좌우된다.

9.1. 재료와 방법

9.1.1. 세포배양주

하나의 TCR r δ⁺T 백혈병 세포배양주인 MOLT-13 (Hata, S. , et al. , 1987, Science 238:678-682; Loh, E.Y., et al., 1987, Nature 330:569-572) 및 말초혈액에서 유도된 TCR rδ⁺세포배양주 PBL C1(Brenner, M. B., et al., 1987, Nature 325:689-694) 및 IDP2(Brenner, M. B., et al., 1986, Nature 322:145-149)를 앞에서 기술한 것같이 배양하였다.

9.1.2. 항체

사용한 단일클론의 항체(mAb)는 다음과 같다: 항-Leu-4 (항-사람 CD3;IgG1)(Ledbetter, J.A.et al., 1981, J. Exp. Med. 153:310-323), 항-TCR δ1 (항-사람 TCR δ 사슬 일정영역; IgGI)(6항 참조; Band, H., et al., 1987, Science 238:682-684), 항-Ti-r A(항-Vr2; IgG2a)(Jitsukawa, S., et al., 1987, J. Exp. Med. 166:1192-1197), 항 Crm1(항-사람 rTCR 일정영역; 8.1.7 항 참조), P3(P3X5 63Ag8 골수종으로 분비된 IgG1)(Koehler, G., and Milstein, C., 1975, Nature 256:495-497) 및 187.1(쥐의 항-생쥐 k 가벼운 사슬 특이성(Yelton, D.E., et al., 1981, Hybridoma 1:5-11).

9.1.3. MOLT-13 δTCR cDNA 클론의 단리 및 배열순서

전달매개체 gt10 (Huynh, et al., 1985, in DNA Cloning, ed. Glover, D.M.(IRL Press, Oxford), Volume 1, pp. 49-78)에든 MOLT-13 폴리 A⁺RNA에서 제조한 보충적 DNA(cDNA) 라이브러리를 p-라벨이된 사람 δTCR cDNA 클론 IDP20-240/38(Hatd et al., 1987, Science 238:678-682)로 하이브리드화 하여 체질하였다.

클론을 크기 및 한정된 제한효소 설명도의 기준에서 상세분석용으로 선택하였다. 노클레오티드 배열순서를 수식된 T7 중합효소(Sequenace, United States Biochemical Copr.)(Potter et al., 19984, Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 81:7161-7165)를 사용하는 디데옥시 사슬말단 방법(Sanger et al., 1977, Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467)에 의해서 M13 전달매개체에서 측정하였다.

9.1.4. 발현 플라스미드 및 트란스펙션의 구성

제10b도에서 개략적으로 나타낸 것같이 r TCR cDNAs (PBL C1.15 and IDP2.11r)(Krangel, M.S., et al., 1987, Science 237:64-67)를 프랜드(Friend) 비장 초점 형성 비루스(SFFV) 의 긴 말단의 반복(LTR) 하류에 있는 pFneo 포유동물 발현 전달매개체(Saito, T., et al., 1987, Nature 325:125-130; Ohashi, P., et al., 1985, Nature 316:606-609)속으로 클론하였다.

플라스미드 구성물은 일렉트로포레이션(electroporation)(Potter, H., et al., 1984, Proc. Nat1. Acad. Sci. 81:7161-7165) 에 의해서 MOLT-13 세포속으로 트란스펙트 하였다.

트란스펙트물을 선택하고 2mg/ml 의 G418(생체검사에 의한 480 g/mg 고체)을 포함하는 배지에서 유지하고 그리고 희석을 제한하면서 클론하였다.

9.1.5. 요오드화 및 면역침전

락토과산화효소, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오] 1-프로판술폰산염(CHAPS; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 각종 항체에 의한 면역침전, 비평형 pH 경사겔 전기영동 (NEPHGE) 및 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하는¹²⁵I 에 의한 세포 표면 라벨링은 기술된 것같이 실시하였다(8.1.3 항 참조; Brenner, M.B., et al., 1986, Nature 322:145-149; Brenner, M.B., et al., 1987, Nature 325:689-694).

특이성 면역침전은 150 1 의 187.1 배양물 상청액과 함께 1 g 항-Leu-4, 0.1 1 항-TCR δ 1복수증 또는 1 1 P3 복수증으로 실시하였다.

항-T9-rA 에 대해서는 1 1의 복수증을 187.1 없이 사용하였다.

9.1.6. 생체합성적 라벨링

지수식으로 생장하는 세포를 메티오닌과 시스타인 없는 배지에서 30분간 배양시키고 다음에³⁵S-메티오닌과³⁵S-시스타인으로 37。C에서 15분간 맥동 라벨링을 시키고 그리고 면역침전은 위의 8.1.3. 항에서 기술한 것같이 실시하였다.

면역침전물은 엔도글리코시아제-H(Endo-H) 로 처리하거나 또는 모의-배양하고, SDS PAGE로 분리하고 그리고 풀루오로 그래피로 가시화하였다(Bonner, W.M. and Laskey, R.A., 1974, Eur. J. Biochem. 46:83-88).

9.2. 결과

본인들은 각종 rTCR 유전형 사이의 구조적 차이의 측정에서 rTCR 유전자의 그리고 특별히는 TCR CII 엑손의 역할을 나타내기 위하여 단일의 δTCR 단백질을 가진 구조적으로 독특한 rTCR 유전자 생성물의 회합으로 수득되는 생성물을 연구하였다.

이 목적으로 40KD 비이황화물-결합된 rTCR 폴리펩티드(형태 2bc)를 발현하는 T 백혈병 세포배양주인 MOLT-13을 다른 두가지 형태의 수용체(형태 1 및 2abc)에 상응하는 rTCR사슬 cDNA클론을 위한 수용체로서 사용하였다.

이러한 rTCR 사슬을 cDNA 클론의 완전한 배열순서를 제14도 (형태 2bc)와 Krangel et al., (1987, Science 237:64-67)(형태 1 및 2bc)에 기술되어 있고 그리고 이들은 제18a도에서 도식으로 나타낸다.

9.2.1. 단일의 관능기의 δTCR 사슬은 MOLT-13 세포배양주에 존재한다.

MOLT-13 세포배양주(Hata, S., et al., 1987, Science 238:678-682) 의 δTCR 유전자 재배열 연구로 단일관능기의 δTCR 유전자 생성물만이 이 세포배양수에서 발현된다는 것을 제시하였다.

그러나 δTCR을 위한 단이리 관능기의 전사를 MOLT-13 세포에서 만든다는 것을 직접 나타내기 위하여 δTCR cDNA 탐침(Hata, S., et al., 1987, Science 238:678-682)로서 가교-하이브리드화 하는 cDNA 클론을 go10에서 제조된 MOLT-13 cDNA 라이브러리로부터 단리하고 선택된 cDNA 클론의 배열순서를 측정하였다.

이 분석으로 MOLT-13 세포가 하나의 관능기로 재배열되고 하나의 변이의 재배열된 δTCR 유전자에 상응하는 전사를 발현한다는 것을 나타내었다.

관능기로 재배열과 δTCR 유전자에 상응하는 cDNA 클론은 IDP2 세포배양주 (Hata, S., et al., 1987, Science 238:678-682)에 대해서 앞서 기술한 것과 같은 V(Vδ1), J(Jδ1) 및 C 유전자 단편을 가진다.

그러나, MOLT-13 δTCR cDNA 클론은 D 단편사용 (MOLT-13은 Dδ2 만을 사용한다), 부정밀한 결합 및 V-D 및 D-J 접합에서의 N-영역다양성(Hata, S., et al., 1983, Science 240:1541-1544)로부터 야기되는 V 와 J 유전자와 단편 사이에 독특한 누믈레오티드 배열순서를 가진다.

또한 MOLT-13 δTCR cDNA 는 Cr1 유전자 단편을 사용하는 δTCR 유전자 생성물에의 이황화물 결합에 이용할 수 있는 일정한 유전자 단편의 막기부 연결기 영역속에 있는 시스타인 잔기를 나타낸다.

비록 MOLT-13 세포배양주가 비이황화물-결합된 r, δTCR 수용체를 발현한다 하더라도 그의 δTCR 사슬의 각 기부의 연결기 영역이 δTCR 서브유닛이 비이황화물-결합되거나 또는 이황화물-결합된 착화합물에 관여할 수도 있다는 가능성을 열어 놓는다.

9.2.2. δTCR 유전자 생성물은 이 형태의 수용체를 결정한다.

δTCR cDNA 구성물로 트란스펙트된 MOLT-13 세포를 M13.PBL C1r (PBL C1-유도된 r TCR cDNA 로 트란스펙트된 MOLT-13 세포에 대해서)와 M13.IDP2r (IDP2-유도된 r TCR cDNA 로 트란스펙트된 MOLT-13 세포에 대해서)로서 생략하였따.

벌크 트란스펙트된 세포배양주와 이러한 세포배양주로부터 유도된 대표적인 서브클론을 rTCR(VJC) 또는 V r 2-특이성 cDNA 탐침에 의한 노선 블속 분석법으로 분석하였다.

잔유 1.6kb MOLT-13 rTCR 전사 이외에도 약 1.8kb의 제 2 rTCR 전사 (발현된 플라스미드의 SFFV LTR 에서의 개시하는 r TCR 전사에 대해 예측된 크기)를 트란스펙트 배양주와 이들의 클론에서 관찰하였다.

Vr1.3 으로 가교-하이브리드화 하지 않는 Vr2 탐침으로 특이하게 하이브리드화 한 1.8kb 전사가 잔유의 r TCR cDNAs (Vr2 단편을 사용하는)의 전사를 나타낸다.

트란스펙트의 표면에 발현된 rTCR 단백질(들)을 생화학적으로 특징짓기 위하여 각 배양주에서 유도된 대표적인 클론을 P3(기준), 항-leu-4 (항-CD3), 항-TCRδ1(항-δTCR)또는 항-Ti-rA mAbs 로서 표면 요오드화한 세포의 면역침전에 의해서 분석하였다.

항-Ti-rA (Jitsukawa, S., et al., 1987, J. Exp. Med. 166:1192-1197)의

이들의 rTCR 사슬의 가변성 단백질로서 Vr2 유전자 단편을 사용하는 r, δTCR 세포를 특이하게 인식하는 것으로 나타낸다.

트란스펙트하지 않은 것은 물론 트란스펙트한 MOLT-13 세포(제19b도 및 제19c도)는 기대했던 근본의 rTCR(40KD; 개방화살 참조) 및 δTCR 서브유닛(별표 참조)을 발현한다.

항-Vr2-특이성 mAb (항-Ti-rA)가 잔유의 MOLT-13 rTCR사슬(제19a도 7 및 8열)과의 반응에 실패한다는 것을 주의한다.

M13.PBL C1r 트란스펙트 세포의 항-CD3면역침전물은 비환원성 조건(제19b도 3열, 화살표 참조)에서 시험했을 때 추가의 CD3-회합된 종(68KD)을 나타낸다.

PBL C1 세포(제19d도 3 및 4열)과 MOLT-13. PBL C1r 트란스펙트 세포배양주(제19b도, 3 및 4열)의 두가지 모두에서 68KD착화합물은 환원시에 40 및 36KD종을 수득하였다.)

M13.PBL C1r 트란스펙트의 경우 이러한 띠는 항-Vr2면역침전물에서 분명히 보인다. 제19b도 7 및 8열 연속 화살표 참조).

이러한 40 및 36KD종은 차등식으로 글리코실화한 rTCR 폴리펩티드를 나타낸다(Brenner, M.B., et al., 1987, Nature 325:689-694). 이러한 면역침전물에서 δTCR 사슬(40KD 환원된) 은 40KD rTCR 폴레핍티드와 함께 동시 이동하고 그러므로 보이지 않는다(그러나 다음을 참조.)

중요하게도 이러한 실험은 MOLT-13 세포배양주의 잔유 δTCR 사슬, 정상적으로는 비이황화물-결합된 착화합물의 부분이 PBL C1 rTCR 단백질과 회합하여 트란스펙트된 세포배양주의 이황화물-결합된 r, δTCR 헤테로 이량체를 형성한다.

반대로 M13.IDP2 트란스펙탄트에서 IDP2-유도된 rTCR 단백질(55KD)은 잔유의 MOLT-13 δTCR 사슬로서 비이황화물-결합된 착화합물을 형성하였다(제19c도 3 및 4열).

항-TCRδ1 mAb (δTCR 펩티드에 대해서 특이성이 있는)로 실시한 면역침전물은 내인(endogenous)의 (제19a, d 및 e도의 5 및 6열은)은 물론 이러한 세포 배양주로부터의 트란스펙트된 rTCR 사슬(제19b 및 c도의 5 및 6열)이 δTCR 사슬과 직접 회합된 것을 확인하였다.

항-Ti-rA은 M13.PBL C1 트란스펙탄트 세포(제19b도의 7 및 8열)로부터의 68KD 이황화물-결합된 r,δTCR 헤테로 이량체 그리고 M13.EDP2r 트란스펙탄트 세포(제19c도 7 및 8열)로부터의 40KD δTCR 사슬과 함께 55KD rTCR 사슬을 특이하게 면역침전시켜 이러한 착화합물의 부분인 rTCR 사슬이 트란스펙트된 PBL C1 및 IDP2-유도된 rTCR cDNAs 에 각각 상응한다는 것을 확인한다.

각종 rTCR 단백질을 생화학적으로 더욱 특징짓기 위하여 표면¹²⁵I-라벨이된 세포의 2차원의 (2D) 겔분석(NEPHGE 와 SDS-PAGE)을 실시하였다.

CD3성분의 위치에 대해서 잔유(MOLT-13) 및 트란스펙트된 (PBL C1 또는 IDP2) rTCR 사슬의 2D형태의 중첩으로 관련되는 rTCR종의 비교가 가능케 하였다.

MOLT-13 세포로부터의 면역침전물에서 rTCR 사슬은 요오드화한 종(제 20A 도 개방된 화살표 참조) 의 두 개의 불연속적 평행 계열로서 분석되었다.

PBL C1 또는 IDP2 TCR cDANs 로 트란스펙트된 MOLT-13 세포는 잔유의 MOLT-13 rTCR 폴리펩티드 계열을 나타내었지만 또한 2D 겔 형태에서 PBL C1(제20b 및 d도 비교; 제20b도에서 별표참조) 또는 IDP2(제20c 및 d 비교; 제20c에서 폐쇄된 화살표 참조) 세포의 rTCR 폴리펩티드와 동일한 방사성 라벨을 한 종을 나타내었다.

이와같이 2D 겔생화학적 분석으로 트란스펙트된 rTCR 사슬이 MOLT-13 트란스펙탄트에서와 근원의 세포배양극 PBL C1 및 IDP2에서 유사하게 발현되고 처리된 것을 확인하였다.

9.2.3. 트란스펙트된 rTCR 사슬단백질의 폴리펩티 골격크기

트란스펙트된 rTCR 사슬의 펩티드 골격크기를 신진대사식으로 맥방-라벨을 한 세포로부터 면역치전한 물질을 엔도글리코시다제-H 처리하여 측정하였다.

항-CrM1(δTCR 사슬에 특이성이 있는)로 실시한 면역침전물은 고유의 MOLT-13 rTCR 폴리펩티드를 나타내는 비트란스펙트된 MOLT-13 세포(제21도 4열)에서 35.5 및 34KD 종을 증명하였다.

작은 이러한 두 폴리펩티드(개방 화살표 참조)는 MOLT-13 rTCR 폴리펩티드의 기대한 폴리펩티드 코아 크기에 상응하며 한편으로 큰 폴리펩티드는 부분적으로 처리된 중간물질을 나타내는 것으로 보인다.

이러한 잔유의 MOLT-13 rTCR 폴리펩티드 이외에도 탈글리코실화한 크기의 41KD의 폴리펩티드를 M13.IDP2r 트란스펙탄트(제 21 도, 8열, 연속화살표 참조)로부터의 항-C r M1로 면역침전시켰다.

이러한 트란스펙탄트-특이성 rTCR 폴리펩티드의 크기는 IDP2 세포(Brenner, M.B, et al., 1987, Nature 325:689-694)에서 미리 측정한 글리코실화한 IDP2 rTCR 폴리펩티드 코아크기와 잘 일치한다.

기대한 것같이 M13.PBL C1r 트란스펙탄트 세포는 32KD의 글리코실화한 크기 (제21도 12열, 연속화살표참조)를 가진 추가의 rTCR 단백질을 나타내며 이는 PBL C1 세포배양주에 대해서 이미 보고한 rTCR 폴리펩티드 골격크기와 잘 비교된다.

이 32KD 종은 Vr2-특이성 mAb, 항-Ti-rA(제21도 3열, 연속화살표 참조)에 의해서 특이하게 면역침전하여서 이 세포배양주에서 잔유 및 트란스펙트된 rTCR 종이 분명하게 지정되게 한다.

이와같이 IDP2 및 PBL C1 세포배양주에서 유도된 트란스펙트된 rTCR 사슬의 측정한 골격크기는 이들의 근본 세포배양주의 이러한 폴리펩티드의 골격크기와 일치한다.

세포표면 단백질의 이런 것들을 가진 rTCR 폴리펩티드 코아크기를 비교하여 본인들은 MOLT-13, IDP2 및 PBL C1 유도된 rTCR 사슬이 각각 6, 14 및 8KD N-결합된 탄수화물을 수반한다고 추론한다.

9.3. 토의

세 개의 생화학적으로 독특한 형태의 사람 rδTCR 서브유닛 구조가 발생한다.

본 연구에서 본인들은 단일의 δTCR 폴리펩티드가 세 개의 수용체 형태에 각각을 나타내는 rTCR 사슬과 회합하여서 적합한 r, δTCR 헤테로 이량체를 재구성 할 수 있음을 나타낸다.

MOLT-13(형태 2bc)의 잔유의 rTCR 폴리펩티드는 40KD이고 δTCR 서브유닛과 비공유로 회합된다.

PBL C1(형태 1)의 이황화물-결합된 수용체 또는 IDP2 세포배양주(형태 2abc)의 55KD 비이황화물-결합된 수용체에 상응하는 δTCR 형태를 재구성하였다.

본 트란스펙션 연구는 이황화물 결합이 rTCR 일정단편 용도에 의해서 지시된다는 직접적인 증거를 제시하는데 그 이유는 잔유의 MOLT-13 δTCR 사슬이 PBL C1-유도된 rTCR 사슬(형태1)을 가진 이황화물-결합된 수용체와 IDP2-유도된 rTCR 사슬(형태 2abc)을 가진 비황화물-결합된 수용체 착화합물에 관여하는 것을 나타내었기 때문이다.

본인들은 55KD (형태 2abc) 와 40KD (형태 2bc) 비-이황화물-결합된 rTCR 폴리펩티드 사이의 크기의 현저한 차이가 rTCR 폴리펩티드 골격(위의 8.2.2. 항 참조) 에 부착된 N-결합된 탄수화물의 량의 차이에 주로 기인한다는 것을 나타내었다.

이와같이 N-결합된 탄수화물의 15KD(IDP2또는 PEER의 형태 2abc)의 어느것이나 또는 15KD(MOLT-13 의 형태 2bc)만이 심지어 N-결합된 글리칸 수용체 위치의 같은수(각각 다섯)가 이러한 형태의 두가지 모두에서 사용된 일정한 유전자 단편에 의해서 인코드 되어도 이러한 rTCR 폴리펩티드에 부착된다.

이러한 네 개의 N-결합된 글리코실화 위치가 CII 엑손-인코드된 연결기 영역속에나 주위에 존재한다.

여기의 실시예에서 본인들은 트란스펙트된 rTCR 단백질에 부착된 N-결합된 탄수화물의 양이 트란스펙트된 rTCR cDNA 클론의 단백질 생성물의 펙티드 코아크기로 숙성 세포표면 크기의 비교를 기준하여 이들의 근원 세포배양주에서 보이는 것과 동일하다는 것을 나타낸다.

이와같이 두 개의 Cr2 인코드된 단백질 단편의 적응이 글리코실화에서 극적인 차이를 일으키기에 충분할 정도로 차이가 나야한다.

이러한 두 형태의 Cr 단편 사이의 주요 차이는 CII 엑손의 전사 a가 형태 2abc 의 55KD rTCR 사슬에 존재하고 그리고 이것이 형태 2bc의 40KD rTCR 사슬로부터는 없다는 것이다.

이와같이 이러한 CII 엑손 전사의 존재 또는 부재가 rTCR 폴리펩티드 크기에 대해서 설명하는 글리코실화 차이에 근원이 될 수도 있다.

사람 rδTCR 유전형 형태의 구조상의 변화는 이러한 평행이 TCR에서 관찰되지 않기 때문에 T 세포 수용체 사이에서 선례가 안된다.

10. CD3와 회합되지 않은 T 세포수용체 rd 착화물이 사람 엔도메테리아

글란두라 에피테륨에서 확인된다

태반 발육의 조기단계에서 단핵세포의 침투가 어미의 뇨도 조직에 있는 나선형 동맥과 자궁내막 한선에서 많다.

이것은 알려지지 않은 기능의 T 선형세포의 비통상적 모집단을 포함한다.

많은 과대융모 영양배엽은 대부분의 체세포에서 발현된 것과는 상이한 신규형태의 1급 MHC 항원을 발현한다.

본인들은 임신 및 비임신 자궁의 TCR δ 헤테로 이량체(r δTCR) 에 단일클론의 항체의 패널을 시험하였다.

놀랍게도 r δTCR 착화합물은 백혈구에서는 검출되지 않았지만 임신 자궁으로 부터의 자궁내막의 한선 에피텔륨의 세포질에서는 국소화하였다.

이러한 항체는 또한 비-임신 자궁으로부터의 한선 에피텔륨과는 반응하였고 그 반응성은 월경싸이클의 증식단계에서보다 분비단계에서 더욱 강하였다.

그러나 r δTCR 은 CD3(OKT3,항-leu-4, UCHT-1)에 대한 세 개의 상이한 단일클론의 항체를 사용하여 면역침전물을 시험하여 나타낸 것 같이 CD3 착화합물과 회합하지 않았다.

δTCR-양성의 한선 에피텔리아 세포는 TCR에 대한 단일클론의 항체와 반응하지 않았고; 또한 이 세포는 CD4- 및 CD8-음성이었다.

더욱이 한선 에피텔리 세포는 초기 임신에서의 1급 MHC 항원을 상실한다.

이러한 데이터로서 rδTCR을 가지는 자궁내막 한성 세포가 유전자 표현의 국소적 조절에서 최소한 표현적 변화를 일으킨다고 제시한다.

11. 실시예 : 사람 δ T 세포수용체 유전자 및

A Vδ특이성 단일클론의 항체의 특징화

본인들은 사람 r δ 세포클론, AK119로부터 δTCR 와 재배열된 δTCR 유전자를 단리하였다.

이러한 DNA 클론으로부터 K δ탐침을 수득하고 그리고 13의 사람 r, δ T 세포클론과 3 r, δ 사람 T 세포 종양배양주의 다양성을 측정하는데 사용하였다.

모두 다섯 개의 상이한 재배열을 검출하였고 이들은 2내지 5의 상이한 Xδ 유전자를 사용하는 재배열에 상응하였다. 하나의 특별한 재배열이 항상 mAb TCSδ1(δTCAR-3)과 반응하는 사람 r, δ T세포에서 보였다.

또한 TCRδ1은 사람 r, δ종양 세포배양주, MOLT-13 으로부터의

δTCR 폴리펩티드를 면역침전시켰다.

본인들은 단일클론의 항체 TCRδ1이 AK119 V δ에서 인코드된 에피토프를 인식하고 또는 재배열된 AK119 유전자 Vδ-Jδ 유전자의 에피토프를 함께 인식한다는 증거를 제시한다.

11.1. 물질과 방법

11.1.1. AK119 δTCR cDNA 클론의 단리와 배열순서

cDNA 라이브러리를 Gubler and Hoffmann (Gubler and Hoffman, 1983, Gene25:263)의 방법에 의해서 PBL T 세포 클론 AK119로부터 발생시켰다.

100,000혈소판의 증폭된 라이브러리를 0-024(Hata, S., et al., 1987, Science 238:678)이라 부르는 δTCR 클론으로부터 단리한 P-라벨이 된 니크(nick)-번역된 Cδ탐침을 사용하여 선발하였다.

장 긴 하이브리드화 cDNA 클론 (1.3kb 클론 C119δ3)을 데옥시 사슬 말단 방법으로 배열순서 분석용으로 선택하였다.

11.1.2. 재배열된 δTCR 유전자의 클로닝

재배열된 Vδ유전자를 포함하는 3.5kb 게놈의 DNA 클론을 다음과 같이 AK119 세포로부터 수득하였다:

EcoRI 소화된 DNA를 제조용 한천 겔에서 크기의 분류를 하고 gt10속으로 결찰하고 포장하고 그리고 E. coli 속으로 트란스펙트 하였다.

조합 파지를 cDNA 클론, c119δ3에서 유도된³²P-라벨이 된 니크 번역된 550 bp EcoRI 단편으로 선별하였다.

.8kb HincII 단편(V 영역 특이성의) 및 1Kb HincII-EcoRI 단편(V-J 영역)을 포함하며 r119δ8 라 부르는 재배열된 클론을 단리하였다.

11.1.3. DNA 제조

태아와 신생 흉선조직을 환자의 권리와 승인에 관해 승인된 지침에 따라서 수거하였다.

세포 클론은 말초의 혈액, 능막 삼출 또는 뇌척수액으로터 수득하였다. (Hafler et al., 1985, Ann Neurol. 18:451; Van de Griend et al., 1987, J. Immunol. 138;1627). 모든 경우에 DNA 는 1% 도데실 황산나트륨에든 단백질 효소 K 로서 소화시키고 다음에 페놀/클로로포름으로 추출하고 그리고 에탄올 면역침전시켜 제조하였다.

11.1.4. 써선 블롯 분석

게놈의 DNA를 EcoRI로 소화시키고 0.9% 아가로스겔에서 크기의 분류를 하고 니트로셀룰로오스에 옮겼다.

하이브리드화는 앞에서 기술한 것같이³²P-니크 번역된 탐침으로 실시하였다(Maniatis, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, New York).

11.1.5. 사이토풀루오로 유량계 분석

자원자로부터 수득한 정상인의 말초혈액의 단일핵의 세포(PBMC)를 피콜(Ficoll)경사에서 분류로 단리하였다.

BMC 및 PBL T 세포 클론을 TCSδ1 mAb(앞에서 δTCR-3으로 참조한; 위의 7항 참조)와 형광-공액된 염소 항쥐 IgG(Becton Dickinson)을 사용하는 간접 면역형광으로 착색시키고 형광 활성화된 흐름 세포유량계에서 분석하였다.

11.2. 결과

11.2.1. δTCR 유전자 재배열의 다양성

본인들은 Cδ탐침을 사용하여 T 세포클론 AK119이 gt10 cDNA 라이브러리로부터 c119δ3 이라 하는 1.3kb δTCR cDCA 클론을 단리하였다.

119δ3의 5' 단부의 배열순서를 정하고 그리고 이미 확인한 Vδ 및Jδ 유전자의 사용을 발견하였다(Hata et al., 1987, Science 238:678; Loh et al., 1987, Nature 330:569).

V-J 접합의 배열순서로 C119δ3인 인-프레임 V-J 연결을 가지는 것을 나타내었다.

모든 가변성 및 연결영역과 일정영역의 부분을 인코드하는 550 염기쌍(bp) EcoRI 단편 (V-J-C 탐침)을 c119δ3으로부터 단리하고 AK119로부터의 EcoRI 소화된 게놈의 DNA의 써선 블롯 분석에 사용하였다.

이 탐침으로 게름라인(germline)3.2kb Vδ 및 게름라인 1.0kb Cδ 띠를 검출한다. AK119는 보충의 δTCR 재배열(described in Hata et al., 1987, Science 238:678; Loh et al., 1987, Nature 330:569)(rearrangement II in Fig. 22)와 동일한 추가 재배열 3.5kb띠를 나타내었다.

이 3.5kb 띠는 V-J-C cDNA 탐침을 사용하여 EcoRI 크기 분류된 gt10 게놈의 라이브러리로부터 클론하였다.

r119 δ1 이라 칭하며 클론되고 재배열된 δTCR유전자의 부분적 설명도는 제17도에 나타낸다.

가변성 및 연결영역의 국소화는 J 올리고누클레오티드 탐침과 가변성 영역 특이성 탐침을 사용하여 측정하였다. r119δ1로부터 1kb V-J 탐침을 HincII 및 EcoRI 효소에 의한 소화(제17도 참조)로 단리하였다.

이 V-J 탐침은 13 사람 rδTCR 양성 T-세포 클론과 3사람 r-δTCR 양성 종양 세포 배양주의 한 파넬에서 δTCR 유전자 재배열의 다양성을 측정하는데 사용하였다.

제22도에서 나타낸 것 같이 I-V 변의 5다섯개의 통상적 재배열이 폴리클론의 신생 흉선세포 시료(11열)에서 보인다.

이러한 재배열은 사람 rδT 세포 클론에 의해 사용된 대표적인 재배열이 된다.

재배열 II만이 HincII 내지 HincII Vδ 에 하이브리드화한다.

비록 본인들이 이러한 모든 재배열이 D-J 재배열이 아닌 V-D-J를 나타내는 것을 알지는 못하나, 이중 몇 개는 앞에서 특징이 지어진 Jδ 유전자 단편에 대한 새로운 가변성 영역의 재배열을 나타내어야 하는데 그 이유는 이러한 세포가 이들의 세포표면에서 관능적 δTCR 폴리펩티드를 발현하기 때문이다.

본인들은 이러한 새로운 재배열이 아직도 확인해야할 다른 Jδ 유전자에 대한 단일의 새로운 Vδ 유전자의 재배열을 나타내는 가능성을 제외시키지는 않았다.

본인들의 데이터는 δTCR 유전자 재배열에 사용할 수 있는 2-5 가변성 영역 유전자가 있어야 한다는 사실과 일치한다.

11.2.2. mAb TCS δ1의 특이성 측정

앞에서 δTCAR-3으로 나타낸 TCRδ1은 쥐의 골수종 배양주를 가진 사람 종양 r δTCR 세포배양주 MOLT-13으로 면역시킨 쥐로부터 비장세포를 용융하여 발생시켰다.

형광 활성화한 세포분류기 분석에서 사용했을 때 TCRδ1은 모든 사람 rδT세포와 반응치 않고 몇가지만 반응하였다.

결과는 표1에서 제시한다.

AK119 Vδ 유전자 (재배열 II)와 용도와 TCSδ1에 의한 양성착색에는 완전한 상관관계가 있다.

이 데이터로 δTCR1로 인식된 에피토프가 AK119 V δ 또는 재배열된 AK119 Vδ-Jδ 유전자의 조합적 에피토프에서 인코드된다는 강력한 증거를 제공한다.

12. 하이브리도마의 기탁

나타낸 단일클론의 항체를 생성하는 다음의 하이브리도마 세포 배양주는 ATCC에 기탁하고 다음의 기탁번호를 받았다:

본 발명은 기탁된 세포배양주에 의해서 범위가 국한되지 않는데 그 이유는 기탁된 예는 본 발명의 한가지 특징의 설명으로서 의도된 것이며 기능상으로 동등한 어떤세포배양주도 본 발명의 범위내에 들기 때문이다.

실제로 여기서 표시하고 기술한 것 이외에도 본 발명의 각종 변화가 앞의 명세서와 첨부도면으로부터 본기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 분명해진다.

이러한 변화는 본 발명의 청구 범위내에 포함되어야 한다.

Claims (16)

1. 사람 T세포 항원수용체의 델타사슬의 가변성 또는 재배열된 가변성-연결영역의 에피토프와 반응하는 단클론 항체.
2. 제1항에 있어서, 단클론의 항체는 하이브리도마 δTCAR-3(ATCC에 1987년 10월 29일자로 기탁되고 기탁번호가 HB 9578인)에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 TCSδ1(δTCAR-3)을 포함하는 단클론 항체.
3. 사람 T 세포 항원수용체의 델타사슬의 일정영역에 에피토프와 반응하는 단클론 항체.
4. 제3항에 있어서, 하이브리도마 5A6·EP(ATCC에 1988년 7월 27일자로 기탁되고, 기탁번호가 HB 9772인)에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 단클론 항체 항-TCRδ1으로 구성된 단클론 항체.
5. 사람 T 세포 항원수용체의 2bc 감마사슬의 일정영역의 에피토프와 반응하고 이 에피토프는 2bc 감마사슬인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
6. 하이브리도마 #3(ATCC에 1988년 7월 27일자로 기탁되고 기탁 번호가 HB 9773인)에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 단클론 항체항-Crml.
7. 제1, 2 또는 3항의 단클론 항체의 Fv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 단편.
8. 제4, 5 또는 6항의 단클론 항체의 Fv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 단편.
9. 제1 또는 2 항의 단클론 항체를 생성하는 하이브리도마(hybridoma).
10. 제3 또는 4항의 단클론 항체를 생성하는 하이브리도마.
11. 제5 또는 6항의 단클론 항체를 생성하는 하이브리도마.
12. 세포 또는 이세포의 폴리펩티드를 포함하는 시료를 재배열된 유전자에 의해서 인코드된 폴리펩티드의 에피토프와 특이하게 반응하는 단클론 항체를 접촉시키는 것을 포함하는 한 세포속에 사람델타 T 세포 항원수용체 가변성 유전자의 관능기 재배열(functional rearrangement)의 존재를 검출하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 단클론 항체는 하이브리도마 δTCAR-3(ATCC에 1987년 10월 29일자로 기탁되고 기탁번호가 HB 9578인)에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 TCSδ1(δTCAR-3)로 구성되는 방법.
14. 제1항에 있어서, CD3 항원을 동시-변조하는 능력을 특징으로 하는 단클론 항체.
15. 제3항에 있어서, CD3 항원을 동시변조하는 능력을 특징으로 하는 단클론 항체.
16. 제5항에 있어서, CD3 항원을 동시-변조하는 능력을 특징으로 하는 단클론 항체.

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