DE69028713T2

DE69028713T2 - Schimäre immunoglobuline für cd4-rezeptoren

Info

Publication number: DE69028713T2
Application number: DE69028713T
Authority: DE
Inventors: John Thorndale Pa 19372 Ghrayeb; David M. Paoli Pa 19301 Knight; James E. Timonium Md 21903 Looney
Original assignee: Centocor Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 1989-12-27
Filing date: 1990-12-27
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2010-12-28
Also published as: JPH05502586A; CA2070182A1; EP0511308A1; WO1991010722A2; DE69028713D1; EP0511308B1; WO1991010722A3; EP0511308B2; ATE143377T1; DE69028713T3; CA2070182C

Description

Grundlagen der Erfindung

Weder ist die Natur der für Autoimmunerkrankungen verantwortlichen Autoantigene noch ist der die Autoimmunantwort auslösende Prozeß bekannt. Eine Theorie basiert auf der Ähnlichkeit eines viralen Proteins zu einem Selbstantigen, das zur Bildung autoreaktiver T-Zellen oder B-Zellen führt, die ein Selbst-Antigen erkennen. Wohingegen B-Lymphocyten Antikörper produzieren, sind die vom Thymus abgeleiteten Lymphocyten oder "T-Zellen" mit Zell-vermittelten Immunfunktionen assoziiert. T-Zellen erkennen auf der Zelloberfläche präsentierte Antigene und erfüllen ihre Funktionen mit diesen "Antigen-präsentierenden" Zellen aus.
Verschieden Marker sind verwendet worden, um menschliche T-Zellpopulationen zu definieren. CD4 ist ein nichtpolymorpher Glycoprotein-Oberflächenrezeptor mit partieller Sequenz-Identität zu Immunoglobulinen. CD4- Rezeptoren definieren verschiedene Subpopulationen von reifen peripheren T-Zellen. Im allgemeinen erfüllen CD4- T-Zellen, Helferfunktionen oder regulatorische Funktionen mit B-Zellen bei Immunantworten, während T-Zellen, die das CD8 Oberflächenantigen präsentieren, als cytotoxische T-Zellen fungieren und suppressive Wirkungen bei Immunantworten besitzen. Der CD4-Rezeptor besteht aus einem Signal-Peptid, eine 370 Aminosäuren lange extracelluläre Region, die vier hintereinander liegende Immunoglobulinähnliche Domänen (V&sub1;-V&sub4;) enthält, einer membranständigen Domäne und einer geladenen intracellulären Region aus vierzig (40) Resten.
Da von T-Zellen vermutet wird, daß sie die T- Zellantwort steigern oder modulieren, stellen sie ein potentielles Ziel für immunologische Eingriffe dar. Eine Möglichkeit der Behandlung von Autoimmunerkrankungen schließt für CD4-Rezeptoren spezifische monoklonale Antikörper ein. Wie Herzog, C. et al. in Lancet, Seite 1461 (19. Dezember, 1987) publizierten, scheinen murine monoklonale anti-CD4 Antikörper für die Behandlung von rheumatischer Arthritis einsetzbar. Jedoch besitzen murine Antikörper Eigenschaften, die ihre Verwendung in der Humantherapie wesentlich einschränken können. Als Fremdproteine können murine Antikörper Immunreaktionen auslösen, die ihre therapeutische Wirksamkeit vermindern oder aufheben und/oder allergische oder hypersensitive Reaktionen in Patienten hervorrufen. Die notwendige wiederholte Verabreichung derartiger therapeutischer Heilmittel bei Autoimmunerkrankungen erhöht die Wahrscheinlichkeit dieser Immunreaktionen.
Schimäre Antikörper, die aus mit konstanten Regionen verknüpften nicht-humanen Antigen-Bindungsregionen bestehen, sind als ein Mittel zur Umgehung der Immunogenität muriner Antikörper vorgeschlagen worden.
Siehe z. B. PNAS, 81:6851 (1984) und WO-A-86/01533. Da die konstante Region weitgehend für die Immunogenität eines Antikörpermoleküls verantwortlich ist, sollten schimäre Antikörper mit konstanten Regionen menschlichen Ursprungs weniger wahrscheinlich eine anti-murine Antwort im Menschen hervorrufen. Es ist allerdings nicht vorhersehbar, ob die Verknüpfung einer menschlichen konstanten Region mit einer nichtmenschlichen Antigen-Bindungsregion einer gewünschten Spezifität die Immunreaktivität vermindert und/oder die Bindungsfähigkeiten oder die biologische Aktivität des resultierenden schimären Antikörpers ändert. Ferner kommen konstante Immunoglobulin- Regionen als eine Reihe von Isotypen vor, die für unterschiedliche Effektor-Funktionen verantwortlich sind. Deshalb hängt die biologische Aktivität eines schimären Antikörpers vom Isotyp der konstanten Region wie auch von der Natur der Antigen-Bindungsregionen ab.
Nicht alle monoklonalen anti-CD4 Antikörper binden an die gleiche CD4-Stelle oder Domäne und die Stelle, an die ein bestimmter monoklonaler Antikörper bindet, kann seine biologische Aktivität signifikant beeinflussen, z.B. seine immunmodulierende Aktivität oder beispielsweise seine Fähigkeit, die Bindung von HIV an CD4-Zellen zu blockieren.
WO 92/05274, WO 91/09966 und Reiter et al (1990), Immunobiology, 181:219-220, Abstract Nr. J.8, publizieren humanisierte monoklonale Antikörper, aber legen nicht offen, ermöglichen und/oder deuten nicht die schimären Antikörper der Ansprüche an.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft für einen CD4 Rezeptor spezifische schimäre Immunoglobuline und ermöglicht: (1) eine anhaltende Abnahme von CD4+T-Zellen zu bewirken, und/oder (2) mit dem M-T151 Mab, um die Bindung an CEM Zellen zu konkurrieren. Das Immunoglobulin dieser Erfindung umfaßt eine für den CD4-Rezeptor spezifische variable oder Antigen-Bindungsregion nicht humanen Ursprungs und eine konstante Region menschlichen Ursprungs. Die Erfindung beinhaltet ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Immunoglobuline enthalten und die Verwendung der Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen und Beschwerden, die durch CD4 positive Zellen vermittelt werden. Diese Antikörper sind als therapeutische Mittel für Autoimmunerkrankungen und andere Erkrankungen und Beschwerden, die durch CD4 positive Zellen vermittelt werden, zweckmäßig.

Kurze Beschreibung der Abbildung

Die Abbildung zeigt das Plasmid für die Expression der schimären Ketten des schimären anti-CD4-Antikörpers.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines CD4-spezifischen schimären Immunoglobulins, das eine Antigen-Bindungsregion nichthumanen Ursprungs und eine konstante Region menschlichen Ursprungs umfaßt, wobei das schimäre Immunoglobulin: (1) in der Lage ist, eine anhaltende Abnahme von CD4+ T-Zellen zu bewirken und/oder (2) mit dem M-T151 mAb um die Bindung an CEM Zellen konkurrieren kann.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein schimäres Immunoglobulin, das umfaßt:
a. mindestens eine schimäre schwere Kette, die eine Antigenbindungsregion umfaßt, die von der schweren Kette eines für den CD4-Rezeptor spezifischen nichthumanenen Immunoglobulins abgeleitet ist und mit mindestens einem Teil der konstanten Region einer humanen schweren Kette verknüpft ist, wobei die schwere Kette assoziiert ist mit:
b. mindestens einer schimären leichten Kette, die eine Antigenbindungsregion umfaßt, die von einer leichten Kette des nichthumanen Immunoglobulins abgeleitet ist und mit mindestens einem Teil der konstanten Region einer humanen leichten Kette verknüpft ist, wobei das schimäre Immunoglobulin (1) in der Lage ist, eine dauerhafte Abnahme von CD4&spplus; T-Zellen zu bewirken und/oder (2) mit dem M- T151 mAb um Bindung an CEM-Zellen konkurrieren kann.
Die konstante Region der menschlichen schweren Kette ist vorzugsweise vom IgG1 Isotyp. Die schimäre leichte Kette umfaßt eine Antigen-Bindungsregion, die von der leichten Kette des nichthumanen Antikörpers abgeleitet ist und mit einer konstanten Region einer menschlichen leichten Kette verknüpft ist. Die konstante Region der menschlichen leichten Kette ist vorzugsweise vom kappa Isotyp.
Die vorliegenden Immunoglobuline können monovalent, divalent oder polyvalent sein. Monovalente Immunoglobuline sind Dimere (HL), die aus einer schimären schweren Kette gebildet sind und über Disulfidbrücken mit einer schimären leichten Kette assoziiert sind. Divalente Immunoglobuline sind Tetramere (H&sub2;L&sub2;), die über mindestens eine Disulfidbrücke assoziiert sind. Derartige divalente Immunoglobuline werden für eine biologische Aktivität bevorzugt. Polyvalente Immunoglobuline können ebenfalls hergestellt werden, beispielsweise durch Verwendung von aggregierenden konstanten Regionen der schweren Kette (z.B. IgM schwere Ketten). Schimäre Immunoglobulin-Fragmente, wie beispielsweise Fab, Fab' oder F(ab¹)&sub2; können ebenfalls hergestellt werden und können bei einigen Anwendungen besonders zweckdienlich sein. Die nicht-humanen Antigen-Bindungsregionen des schimären Immunoglobulins sind von Immunoglobulinen abgeleitet, die für CD4-Rezeptoren spezifisch sind. Für eine für biologische Aktivität werden Antikörper der Erfindung bevorzugt, die eine hohe Bindungsaffinität zu einer CD4-Stelle zeigen, die die Reste sowohl innerhalb der V&sub1; als auch der V&sub2; Domäne umfaßt. Bevorzugt werden Antikörper dieser Erfindung, die eine hohe Bindungsaffinität an CD4 zeigen und vorzugsweise einen Ka-Wert von mindestens 10&sup8; M&supmin;¹, noch besser von mindestens 10&sup9; M&supmin;¹ besitzen.
Die schimären monoklonalen anti-CD4 Antikörper dieser Erfindung binden vorzugsweise spezifisch (mit hoher Affinität) an eine Stelle, die Reste sowohl in der extra cellulären V1 als auch V2 Domäne umfaßt, eine Stelle, die von der Leu 3a-Stelle und der OKT4-Stelle verschieden ist.
Ein bevorzugter schimärer Maus-Mensch MAb dieser Erfindung, als cM-T412 bezeichnet, und ein muriner Antikörper M-T151, publiziert in J. of Autommunity 2, 627-642 (1989), sind vermutlich gegen die im wesentlichen gleichen CD4-Bindungregionen gerichtet. Durch Kreuzblockierungsanalysen und spezifische Bindung an verkürztem rekombinanten CD4 ist die Bindungsspezifität von M-T151 für CD4 bei einem Epitop kartiert worden, das die Reste sowohl der extracellulären V&sub1; als auch V&sub2; Domänen des CD4-Proteins umfaßt. Peterson et al., Cell 54:65-72 (1988); Ashkenzi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7150-7154 (1990); Healey et al., J. Ex. Med. 172:1233- 1242 (Okt. 1990) und Sattentau et al., J. Ex. Med. 170:1319-1334 (Okt. 1989); Ryu et al., Nature 348:419-426 (1990) und Wang et al., Nature 348:411-418 (1990). Die Kartierung monoklonaler anti-CD4 Antikörper für den CD4- Rezeptor wird durch die Tatsache erschwert, daß viele wichtige CD4-Epiotope nichtlineare konformationale Epitope zu sein scheinen. Mehr Information über CD4 Epitope stammen aus Kreuzblockierungsstudien und anderen analytischen Verfahren, wobei Näheres aus den hier angeführten Quellen zu entnehmen ist.
Eine Kompetitionsuntersuchung wurde durchgeführt, um die CD4-Bindung von murinem M-T412 und murinem M-T151 zu vergleichen. Das Experiment wurde auf zwei Arten durchgeführt: (1) 1251 M-T412 konkurriert mit steigenden Konzentrationen von unmarkiertem M-T412 und M-T151; und (2) 1261 M-T151 konkurriert mit steigenden Konzentrationen von unmarkiertem M-T412 und M-T151. Die Ergebnisse zeigten, daß M-T151 und M-T412 kreuzweise im gleichen Umfang und mit ähnlichen Bindungskinetiken um die Bindung an CEM Zellen konkurrieren. Dies läßt vermuten, daß die wirksamste Hemmung aus der direkten Konkurrenz um die gleichen oder benachbarte Epitope resultiert. Sattentau et al., Science 232:1120-1123 (1986). Ältere Daten von Kreuzblockierungen mit einer Reihe monoklonaler anti-CD4 Antikörper lassen vermuten, daß die Epitope, gegen die M- T412 und M-T151 gerichtet sind, im wesentlichen die gleichen aber wahrscheinlich nicht identisch sind. Demgemäß ist ein bevorzugter schimärer Maus/Mensch anti-CD4 Antikörper dieser Erfindung ein Antikorper, der im wesentlichen ähnliche zu den murinen Klonen M-T412 oder M-T151 murine variable Regionen umfaßt, aber noch bevorzugter ein intaktes divalentes Immunoglobulin, das ebenfalls menschliche Fc-Regionen vom IgG1 Isotyp umfaßt.
Der vorliegenden cM-T412 monoklonale schimäre anti- CD4 Antikörper wird ferner als einen auf ein konserviertes CD4 Epitop gerichteter Antikörper bevorzugt. Eine Bindungsstudie von cM-T412 mit peripherem Blut von 50 gesunden Spendern, beiderlei Geschlechts und allen ethnischen Gruppen, ließ vermuten, daß cM-T412 an ein konserviertes Epitop bindet, da alle Proben das gleiche Ausmaß und gleiche Kinetiken der Immunreaktivität zeigten.
Bevorzugte schimäre monoklonale anti-CD4 Antikörper dieser Erfindung sind solche, die die Bindung an CD4- Rezeptoren eines schimären monoklonalen anti-CD4 Antikörpers kompetitiv hemmen, der im wesentlichen cM- T412 ähnelt. Der Antikörper cM-T412 als "c128" bezeichnet, ist als Referenzstandard bei Centocor, Malvern, PA, USA und bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA am 21. Dezember 1990 hinterlegt worden und erhielt die ATCC Nr. 40942. cM-T412 (c128) ist ein von der Zellinie C128A produzierter schimärer monoklonaler Antikörper. Diese Zellinie ist als eine Master Zellbank in der Centocor Cell Culture Research & Development Depository, Malvern, PA, USA und bei Centocor BV, Leiden, Niederlande hinterlegt. Der schimäre Maus/Mensch monoklonale Antikörper CM-T412 ist ein besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung. Näheres in Muller, R. (1983),"Determination of affinity and specificity of anti-hapten Antibodies by competetive radioimmunoassay", Methods in Enzymology U92:589-601 mit Bezug auf Verfahren zur Bestimmung der kompetetiven Hemmung der Bindung monoklonaler Antikörper ist in der hier angegebenen Quelle zu entnehmen.
Bevorzugte Immunoglobuline werden mit Antikörper produzierenden Zellinien hergestellt, die Hybridzellinien sein können und im Allgemein als Hybridome bekannt sind. Die Hybridzellen werden durch die Fusion einer anti-CD4 Antikörper produzierenden Zelle und einer immortalisierten Zellinie, das heißt eine Zellinie, die der Hybridzelle eine Langzeitgewebekulturstabilität verleiht, gebildet. Bei der Bildung der Hybridzellinien kann der erste Fusionspartner - die anti-CD4 Antikörper produzierende Zelle - eine Milzzelle eines Tiers sein, das gegen eine CD4 positive T-Zelle oder ein CD4 enthaltendes biologisches Präparat immunisiert ist. Wahlweise kann die anti-CD4 produzierende Zelle ein aus der Milz, Lymphknoten oder anderen Geweben gewonnener B-Lymphocyt sein. Der zweite Fusionspartner - die immortalisierte Zelle - kann eine Lymphoblastoidzelle oder eine Plasmacytomazelle sein, wie beispielsweise eine Myelomzelle, die selbst eine Antikörper produzierende Zelle ist, aber ebenfalls malignant ist.
Murine Hybridome, die CD4 spezifische monoklonale Antikörper produzieren, werden durch Fusion von Maus- Myelomzellen und Milzzellen von Mausen, die gegen menschliche CD4 positive T-Zellen, gereinigtes CD4 oder andere CD4 enthaltende biologische Präparate oder einer Komponente davon immunisiert sind, gebildet. Beispielsweise wurde ein Präparat, das eine mit menschlicher cDNS transfizierte P815 Mastocytoma Zellen umfaßt, erfolgreich in den Beispielen verwendet. Für die Immunisierung der Mäuse kann eine Reihe verschiedener Protokolle befolgt werden. Beispielsweise können Mäuse primäre und Auffrischungsimmunisierungen von CD4 positiven T-Zellen oder rekombinantem CD4 erhalten. Die Fusionen werden mit Hilfe von Standardverfahren, die dem Immunologen bekannt sind, durchgeführt. Köhler und Milstein, Nature, 256:495-497 (1975) und Kennet, Monoclonal Antibodies (Kennet et al., Eds. Seiten 365-367, Plenum Press, N.Y., 1980). Mehrere murine CD4 spezifische monoklonale Antikörper sind von Herzog, C. et al., supra; beschrieben; Herzog, C. et al. J. Autoimmunity 2:627-642 (1989) und Walker et al. J. Autoimmunity 2:643-649 (1989).
Eine andere Möglichkeit der Bildung der anti-CD4 produzierenden Zellinie ist die Transformation von Antikörper prodzierenden Zellen. Beispielsweise kann ein anti-CD4 produzierender B-Lymphocyt infiziert werden und mit einem Virus, wie beispielsweise dem Epstein-Barr Virus bei B-Lymphocyten, transformiert werden, um eine immortalisierte anti-CD4 produzierende Zelle zu erhalten. Siehe z. B. Kozbor und Roder, Immunology Today, 4(3):72- 79 (1983). Alternativ kann der B-Lymphocyt mit einem transformierenden Gen oder transformierenden Genprodukt transformiert werden.
Die CD4 spezifischen monoklonalen Antikörper werden in großen Mengen durch Injektion anti-CD4 Antikörper produzierender Hybridome in die Peritonealhöhle von Mäusen, Ernten der Aszitesflüsssigkeit, die nach einer geeigneten Zeit einen hohen Titer an homogenem Antikörpern enthält, und Isolieren des monoklonalen Antikörpers daraus hergestellt. Xenogene Hybridome sollten in bestrahlten oder thymuslosen Nacktmäusen injiziert werden. Alternativ können die Antikörper durch Kultivierung anti-CD4 produzierender Zellen in vitro und Isolierung der sezernierten monoklonalen Antikörper aus dem Kulturmedium hergestellt werden.
Die CD4 spezifischen schimären Antikörper dieser Erfindung werden durch Klonierung von DNS-Abschnitten, die die variablen Regionen der schweren und leichten Kette eines für CD4 spezifischen nichtmenschlichen Antikörpers codieren und Verknüpfen dieser DNS-Abschnitte mit entsprechenden DNS-Abschnitten, die die konstanten Regionen der leichten und schweren Kette codieren, um schimäre Immunoglobulin codierende Gene herzustellen, gebildet. Die fusionierten Genkonstrukte, die für die leichten und schweren Ketten codieren, werden in Expressionsvektoren zusammengebaut oder inseriert. Die Gene werden in eine lymphoide Empfängerzelle (z. B. eine Myelomzelle) cotransformiert, wo das Immunoglobulin- Protein synthetisiert, zusammengebaut und sezerniert werden kann. Die transfizierten Empfängerzellen werden kultiviert und die exprimierten Immunoglobuline gesammelt.
Vorzugsweise sind die Antigen-Bindungsregionen murinen Ursprungs, weil murine Antikörper gegen CD4 verfügbar sind oder ohne weiteres in murinen Organismen hergestellt werden können. Andere Tier- oder Nagerarten waren alternative Quellen für Antigen-Bindungsregionen.
Die konstanten Regionen der schimären Antikörper sind von menschlichen Immunoglobulinen abgeleitet. Die konstante Region der schweren Kette kann aus einem beliebigen der fünf Isotypen - alpha, delta, epsilon, gamma oder mu gewählt werden. Ferner sind die schweren Ketten der verschiedenen Unterklassen (wie beispielsweise die IgG Unterklassen der schweren Ketten) für verschiedene Effektor-Funktionen verantwortlich und folglich können durch Auswahl der gewünschten konstanten Region der schweren Kette schimäre Antikörper mit gewünschter Effektor-Funktion hergestellt werden. Bevorzugte konstante Regionen sind gamma 1 (IgG1), gamma 3 (IgG3) und gamma 4 (IgG4). Besonders bevorzugt ist eine Fc Region des gamma 1 (IgG1) Isotyps. Die konstante Region der leichten Kette kann vom kappa oder lambda Typ sein, ist aber bevorzugt vom kappa Typ.
Um die Wirkung des Isotyps der konstanten Region der menschlichen schweren Kette auf die Aktivität von schimären anti-CD4 Antikörpern der Erfindung abzuschätzen, wurden schimäre Maus-Mensch CD4 IgG1 und IgG4 Antikörper mit murinen variablen M-T412 Regionen und menschlichen konstanten Fc Regionen konstruiert. Die F(ab')&sub2; und Fab Fragmente des murinen (M-T412) und schimären γ1 (cM-T412) Antikörpers wurden durch Enzymverdau gebildet. Der cM-T412γ1 und dessen Fragmente behielten die Affinität ünd Spezifität des ursprünglichen murinen Antikörpers.
Die Fähigkeit vom intakten CD4-Antikörper oder Antiköperfragment eine CD4 T-Zellaktivität zu beeinflussen, wurde in in vitro Tests der Ig Produktion von Kermesbeere-Mitogen stimulierten Zellen, des Niveaus der sIL-2 Rezeptorproduktion von Phytohämagglutinin stimulierten PBMCs (mononukleäre Zellen des peripheren Bluts ) und Zellprolieferation bei Antwort auf: Tetanustoxin, anti-CD3 Antikörper und gemischte Lymphocyten Kultur beurteilt. Repräsentative Befunde wurden mit Tetanustoxin beobachtet, wo der cM-T412γ1 MAb, das intakte divalente (H&sub2;L&sub2;) Immunoglobulin des γ1 Isotyps, die Prolieferation von PBMCs zu 90% bei 0,1µ/ml inhibierte. Im Gegensatz dazu erzielte cM-T412γ4 ein Maximum von 65% Hemmung erst bei 10µg/ml, während cM-T412γ1 Fab 100 µg/ml für eine entsprechende Hemmung benötigte. Diese Daten zeigen, daß der intakte schimäre Maus-Mensch anti-CD4γ1 Antikörper dieser Erfindung eine hervorragende Verminderung der T- Zellfunktion mit einem hohen Anteil der γ1 Fc-Region zeigt. Diese Ergebnisse unterstützen die möglichen klinischen Verwendbarkeit eines divalenten schimären Maus- Mensch monoklonalen anti-CD4 γ1 Antikörpers bei Autoimmunerkrankungen und -beschwerden.
Im allgemeinen werden schimäre Antikörper durch Herstellung, für jede der Komponenten des schimären Immunoglobulins der leichten und schweren Ketten, eines fusionierten Gens, das einen ersten DNS-Abschnitt umfaßt, der mindestens den funktionsfähigen Teil der CD4-spezifischen variablen Region nichthumanen Ursprungs codiert und verknüpft ist mit (z. B. funktionsfähig rearrangierter variablen Region mit Verbindungssegment) einem zweiten DNS-Abschnitt, der mindestens einen biologisch funktionsfähigen Teil einer menschlichen konstanten Region codiert. Jedes fusionierte Gen wird in einen Expressionsvektor eingebaut oder inseriert. Empfängerzellen, die in der Lage sind, die Genprodukte zu exprimieren, werden dann mit den Genen transfiziert. Die transfizierten Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, die eine Expression der eingebauten Gene erlauben, und die exprimierten Immunoglobuline oder Immunoglobulinketten werden wiedergewonnen.
Gene, die die variable Region der leichten und schweren Ketten des Ig codieren, können aus Lymphoidzellen gewonnen werden, die die CD4-spezifischen Antikörper produzieren. Beispielweise sind die Hybridomzellinien, die Antikörper gegen CD4 produzieren, eine Quelle für die variable Region des Immunoglobulins für die vorliegenden schimären Antikörper. Weitere Nagetier- Zellinien sind erhältlich. Zellinien können durch wiederholtes Immunisieren eines Nagetiers mit einer CD4-positiven Zelle oder einer CD4 haltigen Komponente oder Fraktion einer CD4 positiven Zelle, Bildung fusionierter Hybridzellen aus Antikörper produzierenden Zellen und einer Myelom-Zellinie, Klonierung des Hybrids und Selektion der Klone, die Antikörper gegen den CD4-Rezeptor produzieren, hergestellt werden. Antikörper können ferner im Hinblick auf Epitopspezifität (Bindung mit hoher Affinität) charakterisiert werden, wie in Sattentau et al., supra beschrieben, wobei Näheres der hier angegebenen Quelle zu entnehmen ist.
Es wird erwogen, daß eine weitere "Humanisierung" der monoklonalen Antikörper dieser Erfindung durch Bildung von "Mosaik" Antikörpern, in denen menschliche Sequenzen ebenfalls in die variable Region inseriert sind, erreicht werden kann. Beispielsweise umfassen die variablen Regionen sowohl von Maus als auch von Mensch Antikörpern vier Framework-Reste (FRs). Innerhalb der FRs gibt es drei komplementaritätsbestimmende Reste (CDRs), die für die Antigen-Bindung verantwortlich sind. Ein Mensch-Maus Mosaik mit den gewünschten Bindungsmerkmalen kann durch Inserieren von Maus CDR-Sequenzen innerhalb menschlicher Framework-Reste hergestellt werden. Derartige Mosaik-Varianten werden als Äquivalente der schimären Immunoglobuline dieser Erfindung betrachtet, als partiell schimäre Immunoglobuline, z.B. in denen nur die konstante Region der schweren Kette murinen Ursprungs durch eine äquivalente Sequenz menschlichen Ursprungs oder Varianten, worin eine oder mehrere Aminosäuren durch gerichtete Mutagenese verändert worden sind, ersetzt worden sind.
Konstante Regionen können aus humane Antikörper produzierenden Zellen mit Hilfe von Standardklonierungstechniken erhalten werden. Weil Gene, die die zwei (2) Klassen der leichten Ketten und die fünf (5) Klassen der schweren Ketten repräsentieren, kloniert worden sind, sind konstante Regionen menschlichen Ursprungs aus diesen Klonen ohne weiteres alternativ verfügbar. Schimäre Antikörper bindende Fragmente, wie beispielsweise F(ab')&sub2; und Fab Fragmente können durch Herstellung einer verkürzten Form eines schimären Gens der schweren Kette hergestellt werden. Beispielsweise ein schimäres Gen, das einen F(ab')&sub2; Teil der schweren Kette codiert, würde DNS- Sequenzen umfassen, die die CH&sub1;-Domäne und Gelenkregion der schweren Kette codieren.
Die fusionierten Gene, die die schimären leichten und schweren Ketten (oder Teile davon) codieren, können in zwei verschiedene Expressionsvektoren eingebaut werden, die zur Cotransfektion einer Empfängerzelle verwendet werden können. Jeder Vektor enthält zwei (2) selektierbare Gene -- ein Gen zur Selektion in einem bakteriellen Organismus und ein Gen zur Selektion in einem eukaryontischen Organismus -- wobei jeder Vektor eine unterschiedliches Genpaar besitzt. Diese Vektoren erlauben Herstellung und Amplifikation der fusionierten Gene in bakteriellen Organismen und darauffolgende Cotransfektion eukaryontischer Zellen und Selektion der cotransfizierten Zellen. Beispiele für selektierbare Gene für den bakteriellen Organismen sind die Gene, die eine Ampicillin-Resistenz verleihen, und das Gen, das eine Chloramphenicol-Resistenz verleiht. Zwei selektierbare Gene zur Selektion eukaryontischer Transfektanten werden bevorzugt: (i) das Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Gen (gpt), und (ii) das Phosphotransferase-Gen aus Tn5 (neo genannt). Die Selektion mit gpt basiert auf der Fähigkeit des Enzyms, das von diesem Gen codiert wird, Xanthin als Substrat für die Purin-Nudeotid-Synthese zu verwenden; wozu das analoge endogene Enzym nicht in der- Lage ist. In einem Xanthin und Mycophenolsäure haltigen Medium, das die Umsetzung von Inosinmonophosphat in Xanthinmonophosphat blockiert, können nur Zellen überleben, die das gpt Gen exprimieren. Das Produkt des neo Gens blockiert die Hemmung der Proteinsynthese in eukaryontischen Zellen, die durch das Antibiotikum G418 und anderen Antibiotika dieser Klasse verursacht wird. Die beiden Selektionsverfahren können zur Selektion auf die Expression der Immunoglobulinketten-Gene, die in zwei verschiedenen DNS-Vektoren in eine eukaryontische Zelle eingeführt wurden, gleichzeitig oder nacheinander angewendet werden.
Alternativ können die fusionierten Gene, die die schimären leichten und schweren Ketten codieren, in dem gleichen Expressionsvektor eingebaut werden.
Die bevorzugte Empfängerzellinie ist eine Myelomzelle. Myelomzellen können Immunoglobuline, die von transfizierten Ig-Genen codiert werden, synthetisieren, zusammenbauen und sezernieren. Ferner besitzen Myelomzellen den Mechanismus zur Glycosylierung des Immunoglobulins. Eine besonders bevorzugte Empfängerzelle ist die Ig-nichtproduzierende Myelomzelline Sp2/0. Die Zelle produziert nur Immunoglobulin, das von den transfizierten Immunoglobulin-Genen codiert wird. Myelomzellen können in Kultur oder im Peritoneum von Mäusen, wo das sezernierte Immunoglobulin aus der Ascitesflüssigkeit gewonnen werden kann, angezogen werden. Andere Lymphoidzellen, beispielsweise B-Lymphocyten oder Hybridomzellen, können als geeignete Empfängerzellen dienen.
Es gibt verschiedene Verfahren zur Transfektion von Lymphoidzellen mit Vektoren, die die Immunoglobulin codierenden Gene enthalten. Die Elektroporation ist ein bevorzugtes Verfahren zur Einführung von DNS in Lymphoidzellen. Bei diesem Verfahren werden Empfängerzellen einem elektrischen Impuls in Gegenwart der einzubauenden DNS ausgesetzt. Siehe z. B. Potter et al., PNAS 81:7161 (1984). Ein anderer Weg DNS einzuführen ist die Protoplastenfusion. Bei diesem Verfahren wird Lysozym verwendet, um die Zellwände von Bakterien zu entfernen, die das schimäre Ig-Gen enthaltende rekombinante Plasmid tragen. Die resultierenden Sphäroplasten werden mit Myelomzellen mit Hilfe von Polyethylenglycol fusioniert. Eine weitere anwendbare Technik, um DNS in viele Zelltypen einzuführen, ist die Calciumphosphat-Präzipitation.
Die schimären Immunoglobulin-Gene können in nichtlymphoide Säugerzellen oder in Organismen, wie beispielsweise Bakterien oder Hefe, exprimiert werden. Wenn die Gene in Bakterien exprimiert werden, werden die schweren und leichten Ketten des Immunoglobulins ein Teil der Einschlußkörperchen. Folglich müssen die Ketten isoliert und gereinigt werden und dann zu funktionsfähigen Immunoglobulin-Molekülen zusammengesetzt werden.
Die schimären CD4 spezifischen Antikörper dieser Erfindung sind als therapeutische Mittel für Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis, SLE, Multiple Sklerose und Myasthenia gravis ebensowie bei anderen CD4 vermittelten Erkrankungen verwendbar. Der Antikörper wird einem Säuger, der an einer derartigen Erkrankung leidet, in einer therapeutisch wirksamen Menge, die ausreichend ist um die Erkrankung zu lindern, verabreicht.
Die schimären monoklonalen Antikörper dieser Erfindung werden normalerweise für therapeutische Zwecke als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die geeignete Träger, Hilfsstoffe und andere akzeptable pharmazeutische Bestandteile enthält, die dem Pharmazeuten bekannt sind. Ähnlich wie bei anderen proteinartigen Materialien wird ein Präparat des monoklonalen Antikörpers häufig als eine sterile, nichtpyrogene Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung formuliert; allerdings kann jeder beliebige pharmazeutisch akzeptabler Verabreichungspfad, die den aktiven Teil in Kontakt mit seinem Wirkungsort bringt, genutzt werden, wie beispielsweise im Standardwerk auf diesem Gebiet z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences beschrieben, Näheres ist der hier angegebenen Quelle zu entnehmen.
Die Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele beschrieben, worin, wenn nicht anders angegeben, alle Bruchteile und Prozentsätze auf das Gewicht bezogen sind und Temperaturen in Grad Celsius angegeben sind.

BEISPIELE

Das murine Hybridom M-T412

Ein murines Hybridom, als M-T412 bezeichnet, war eines von einer Reihe muriner monoklonaler anti-CD4 Antikörper, die von G. Riethmüller, Univ. München, München, Deutschland, zur Verfügung gestellt. Der Klon M- T412 wurde aus Milzzellen von Mäusen hergestellt, die mit CD4-cDNS transfizierten P815 Mastocytoma Zellen immunisiert worden waren. Die Mäuse erhielten zusätzlich eine Auffrischungsimpfung mit rekombinantem CD4. Der M-T412 Antikörper besaß eine hohe Affinität für CD4 Rezeptor tragende CEM-Zellen und besaß eine ähnliche Bindungsspezifität für einen murinen monoklonalen anti-CD4 Antikörper, als MT151 bezeichnet (beschrieben in den Veröffentlichungen von Herzog et al. und Walker et al. supra.). Die einzelnen Präparationsschritte des murinen Hybridoms M-T412 sind folgende: Das Hybridom, das den murinen M-T412 Antikörper produzierte, stammte von einer Fusion, die in dem Labor von Dr. Peter Rieber, Institut für Immunologie, Universität München, München, Deutschland durchgeführt wurde.
BALB/c Mäuse, die ursprünglich vom Zentralinstitut für Versuchstierzucht (Hannover, Deutschland) erhalten wurden und am Institut für Immunologie, München, Deutschland gezüchtet wurden, wurden mit P815 Zellen (erhalten von Van Pel, Ludwig Institute for Cancer Research, Brüssel, Belgien) immunisiert, die mit klonierter DNS, die eine vollständige Kopie des für menschliches CD4 codierenden Gens darstellt, transf iziert wurden. Der CD4-Klon stammte aus einer cDNS-Bibliothek, die von D. Littman (University of California, San Francisco, CA, USA) zur Verfügung gestellt wurde. Die cDNS wurde mit Xho II geschnitten, in pKSv10 kloniert und das das vollständige CD4 Gen darstellende Fragment wurde von Y. Tabaycewski und E. Weiss, Institut für Immunologie München, in P815 Zellen transfiziert.
Eine BALB/c Maus wurde intralienal mit 5 x 10&sup6; P815-CD4 Zellen immunisiert. Vierzig Tage später wurden der Maus erneut 5 x 10&sup6; P815-CD4 Zellen intralienal injiziert. Drei Tage später wurde die Maus getötet, die Milz wurde entfernt und eine Single-Cell-Suspension wurde mit Hilfe mechanischer Deaggregation, gewonnen. Die Milzzellen wurden in RPMI 1640, das 20% (v/v) fötales Rinderserum und 10% (v/v) DMSO enthielt, resuspendiert und in flüssigem Stickstoff kryokonserviert.
Später wurden die Zellen wurden aufgetaut und 3,2 x 10&sup7; Milzzellen wurden mit 2,4 x 10&sup7; P3x63Ag8.653 (0,653) Myelomzellen (von H. Lemke, Köln, Deutschland zur Verfügung gestellt) fusioniert. Die Milzzellen und 0,653 Zellen wurden gemischt und 10 min bei 1600 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und der Niederschlag wurde in 5 ml vorgewärmten serumfreien DMEM resuspendiert und 5 min bei 1200 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und 1 ml 50% (w/v) PEG 4000 in RPMI 1640 (vorgewärmt auf 37ºC) wurde tropfenweise zugegeben. Die Zellen wurden dann 1 min bei 1000 rpm zentrifugiert, anschließend erfolgte eine tropfenweise Zugabe über 5 min von 10 ml RPMI 1640 (37ºC) ohne Serum. Das Pellet wurde resuspendiert, weitere 10 ml Medium zugefügt und die Probe 10 min bei 1600 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen wurden in HAT Medium (RPMI 1640, supplementiert mit 10% (v/v) fötalem Rinderserum; 100 µ/ml Penicillin; 100 µg/ml Streptomycin; 6,4 x 10&supmin;&sup5; M Thymidin) resuspendiert. Die fusionierten Zellen wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 100 µL/Vertiefung verbracht. Fünfzigtausend (50.000) BALB/c-DBA f1 peritoneale Exsudatzellen in 100 µl wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Zellen wurden mit HT- Medium (HAT mit Aminopterin) nach 4 und 7 Tagen gefüttert und nach 10-14 Tagen getestet.
Vierhundertundfünfzig (450) Vertiefungen mit postivem Wachstum wurden gegen gesunde menschliche monoklonale periphere Blutzellen mit Hilfe der Fluoreszenz-Mikroskopie durchmustert. Aus dieser Fusion wurden 3 anti-CD4 Hybridome gewonnen und als M-T412, M-T413 und M-T414 bezeichnet.
Die M-T412 Zellinie wurde in Iscoves Modifikation des von Dulbecco modifizierten Eagles essentielles Minimalmedium (IDMEM supplementiert mit 5% (v/v) fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und Eagles nicht-essentiellen Aminosäuren) wachsen gelassen. Eine aus dieser Kultur gebildete Zellbank wurde zur Produktion des schimären anti-CD4 monoklonalen Antikörpers verwendet.

Allgemeine Strategie zur Produktion schimärer monoklonaler anti-CD4 Antikörper.

Die Strategie zur Klonierung der variablen Regionen für die Gene der schweren und leichten Ketten aus dem Hybridom M-T412 basierte auf der Verknüpfung in dem Genom, die zwischen der variablen Region und der korrespondierenden J- (Joining) Region stattfindet, um funktionsfähige rearrangierte (und exprimierte) Ig Gene zu erhalten. J-Region DNS-Sonden können verwendet werden, um genomische Bibliotheken zu durchmustern, um mit den J- Regionen verknüpfte DNS zu isolieren. DNS in der Keimbahn-Konfiguration (nicht rearrangiert) würde ebenfalls an J-Sonden hybridisieren, diese DNS ist aber nicht mit einer Sequenz einer variablen Region verknüpft und kann durch Restriktionsenzymanalyse der isolierten Klone identifiziert werden.
Deshalb war die Klonierungsstrategie, die variablen Regionen aus den rearrangierten schweren und leichten Kettengenen mit Hilfe von JH- und JK-Sonden zu isolieren. Diese Klone wurden mittels Northern-Analyse getestet, um zu sehen, ob ihre Sequenzen in dem Hybridom 412 exprimiert würden. Die Klone, die die exprimierte Sequenz enthielten) wurden in menschliche konstante Regionen enthaltende Expressionsvektoren kloniert und in Mausmyelomzellen transfiziert, um festzustellen, ob ein Antikörper produziert worden war. Die Antikörper aus produzierenden Zellen wurden dann auf Bindungsspezifität und -funktionalität getestet und mit dem murinen Antikörper 412 verglichen.

Material und Methoden

Konstruktion einer genomischen Bibliothek einer leichten Kette

Um das Gen der variablen Region der leichten Kette aus dem Hybridom 412 zu isolieren, wurde eine nach Größe selektierte genomische Bibliothek mit Hilfe des lambda Vektors Charon 27 konstruiert. Hochmolekulare DNS wurde aus den Hybridomzellen 412 isoliert und vollständig mit der Restriktionsendonuclease HindIII verdaut. Die DNS wurde dann auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt und die DNS mit einer Größe von 4-6 kb wurde aus dem Gel mittels Elektroelution direkt isoliert. Nach der Phenol/Chloroform Extraktion und Ethanolfällung wurden die 4-6 kb Fragmente mit lamda Charon 27 Armen ligiert und in vitro mit Hilfe des Gigapack Gold-Sets von Stratagene in Phagenpartikel verpackt. Diese Bibliothek wurde unmittelbar bei einer Dichte von annähernd 20.000 Plaques pro 150 mm Petrischale mit Hilfe einer 32p markierten JK-Sonde durchmustert. Die Plaque-Hybridisierungen wurden in 5 x SSC, 50% Formamid, 2 x Denhardts Reagenz, 200 µg/ml denaturierter Lachssperma DNS bei 42 Grad 18-20 Stunden durchgeführt. Abschließende Waschungen wurden in 0,5 x SSC, 0,1% SDS bei 65 Grad durchgeführt. Positive Klone wurden nach der Autoradiographie identifiziert.

Konstruktion einer genomischen Bibliothek einer schweren Kette

Um das Gen der variablen Region der schweren Kette 412 zu isolieren, wurde eine genomische Bibliothek in dem lambda Vektor EMBL-3 konstruiert. Hochmolekulare DNS wurde unvollständig mit der Restriktionsendonuclease Sau3A verdaut und auf einem 10-40% Sucrose-Dichtegradienten der Größe nach aufgetrennt. DNS-Fragmente mit einer Größe von 15-23 kb wurden mit EMBL-3 Armen ligiert und in vitro mit Hilfe des Gigapack Gold-Sets in Phagenpartikel verpackt. Diese Bibliothek wurde unmittelbar bei einer Dichte von annahernd 30.000 Plaques pro 150 mm Petrischale mit Hilfe einer JH-Sonde durchmustert. Hybridisierungs- und Waschbedingungen waren mit denen identisch, die für die Bibliothek der leichten Kette verwendet wurden.

DNS-Sonden

Die JH-Sonde der schweren Kette der Maus ist ein 2 kb BamHI-/EcoRI-Fragment, das sowohl J3- als auch J4- Segmente enthält. Die JK-Sonde der leichten Kette der Maus ist ein 2,7 kb HindIII-Fragment, das alle fünf JK- Segmente enthält. 32p markierte Sonden wurden mittels Zufallspriming mit Hilfe eines von der Firma Boehringer Mannheim erhaltenen Sets hergestellt. Freie Nudeotide wurden durch Zentrifugation über eine Sephadex G-50 Säule entfernt. Die spezifischen Aktivitäten der Sonden betrugen annähernd 10&sup9; cmp/µg.

Northern Analyse

Zehn (10) µg celluläre Gesamt-RNS wurden einer Elektrophorese auf 1% Agarose/Formaldehyd-Gelen unterzogen (Maniatis, et al., Molecular Cloning) und auf Nitrocellulose übertragen. Die Blots wurden mit zufällig geprimten DNS-Sonden in 50% Formamid, 2 x Denhardts Lösung, 5 x SSC und 200 µg/ml denaturierter Lachssperma- DNS bei 42 Grad 10 Stunden hybridisiert. Abschließendes Waschen erfolgte mit 0,5 x SSC, 0,1% SDS bei 65 Grad.

DNS-Transfektion mit Hilfe der Elektroporation.

Die zu transfizierende Plasmid-DNS wurde mit Hilfe der Gleichgewichtszentrifugation in Ethidiumbromid/Cäsiumchlorid Gradienten zweimal (2) gereinigt. Zehn (10)- 50 µg Plasmid-DNS wurden zu 10&sup7; SP2/O Zellen in Hanks Salzmedium gegeben und die Mischung in eine Biorad Elektroporationsapparatur verbracht. Die Elektroporation wurde bei 200 Volt durchgeführt, und die Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen verbracht. Eine geeignetete Selektion mit einer Substanz wurde nach 48 Stunden durchgeführt und die Substanz resistenten Zellen wurden nach 1- 2 Wochen identifiziert.

Quantifizierung der Antikörperdroduktion

Der Gewebekulturüberstand wurde auf den IgG Proteingehalt mittels Elisa Assay unter Verwendung von Eichkurven, die mit gereinigtem IgG erstellt wurden, analysiert. Die Konzentration des schimären Antikörpers 412 mit menschlichen konstanten Regionen wurde mit Hilfe von Ziege anti-Mensch IgG Fc Antikörper beschichteten Mikrotiterplatten und mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege anti-Mensch IgG Fc oder Ziege anti-Mensch IgG (H+L) Antikörper bestimmt.
Der Gewebekulturüberstand wurde auf eine Protein A- Sepharose Säule aufgetragen. Der schimäre Antikörper wurde mit einem Natriumcitrat pH-Gradienten von pH 6,5 bis pH 3,5 von der Protein A Säule eluiert. Der gereinigte Antikörper wurde mit Hilfe einer Diaflo YM100 Ultrafiltrationsmembran aufkonzentriert. Die Antikörper Konzentration wurde durch Bestimmung der Absorption bei 280 nm gemessen.

Indirekter Zellbindungstest an CEM Zellen.

Alle Proben und Standards wurden mit 0,3% Gelatine- PBS-0,2% Azid auf 100 µg/ml verdünnt. Gelatine-PBS-Azid wurde zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben; wobei die erste senkrechte Reihe der Platte leer gelassen wurde. Ein Aliquot (150 µl) jeder Probe und des Standards wurde in zweifachem Ansatz in die (leere) erste senkrechte Reihe der 96er Platte gegeben. Zwölf 1:4 Verdünnungen wurden durch Übertragen von je 40 µl durchgeführt.
¹²&sup5;I Ziege anti-Mensch F(ab')&sub2; wurde auf annähernd 300.000 cpm/100 µl (5-10 µCi/µg) mit Gelatine-PBS-Azid verdünnt.
CEM Zellen wurden mit 1000 rpm 15 min zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in Hanks gepufferter Sahne resuspendiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und eine Zellzahl-Bestimmung wurde mit Trypan Blue durchgeführt. 7 x 10&sup5; Zellen/Vertiefung wurden in eine V-Boden Polyvinylplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erreichen, wurde die Zellsuspension in ein Petrischale gegossen und die Platte vorsichtig mit einer Hand geschüttelt, während mit der anderen Hand pipettiert wurde. Die Platte wurde mit 1500 rpm 5 min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt.
Aliquote (100 µl) der Antikörperverdünnungen wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Das Pellet wurde durch vorsichtiges auf und ab pipettieren resuspendiert. Die Zellen wurden 3 Stunden bei 4ºC inkubiert, dann mit 1500 rpm 5 min abzentrifugiert, der Überstand abgesaugt und der Niederschlag in 200 µl Gelatine-PBS Azid resuspendiert. Ein zweimaliges Waschen mittels Zentrifugation wurde durchgeführt. Ein Aliquot (100 µl) des 125-I Ziege anti-Maus F(ab')&sub2; wurde zu jeder Vertiefung gegeben. Das Pellet wurde resuspendiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mittels Zentrifugation gewaschen und der Überstand abgesaugt. Jede Vertiefung wurde in einem gamma Zähler gezählt. Die gebundenen Counts pro Minute (cpm) wurden auf der Ordinate, die Antikörper-Konzentration auf der Abszisse aufgetragen, und die Konzentration bei der Hälfte der maximalen Bindung wurde bestimmt.

Ergebnisse

Klonierung der CD4-spezifischen variablen Genregionen

Mehrere positive Klone wurden aus den Bibliotheken der schweren und leichten Kette nach Durchmusterung von annähernd einer Million Plaques mit Hilfe der JH-beziehungsweise JK-Sonde isoliert. Nach den letzten drei (3) Plaque-Aufreinigungszyklen wurde die Bakteriophagen-DNS von jedem positiven Klon isoliert, entweder mit EcoRI (Klone der schweren Kette) oder HindIII (Klone der leichten Kette) verdaut und auf 1% Agarosegelen aufgetrennnt. Die DNS wurde auf Nitrocellulose übertragen und die Blots wurden mit JH- (schwere Kette) oder JK-(leichte Kette) ³²P markierten DNS-Sonden hybridisiert. Für die schwere Kette wurden mehrere Klone erhalten, die die 5,5 kb Eco RI DNS-Fragmente, die an die JH-Sonde hybridisierten, enthielten. Die JK-Sonde hybridisierte an ein in verschiedenen Klonen der leichten Kette vorhandenes 5,4 kb Fragment.
Die mit den authentischen variablen Regionen der schweren und leichten Kette aus dem Hybridom 412 übereinstimmende klonierte DNS sollte an die aus dem Hybridom isolierte mRNS hybridisieren. Nicht funktionsfähige DNS- Rearrangements entweder in den Loci der schweren oder leichten Kette sollten nicht exprimiert werden. Die subklonierten Fragmente wurden mittels Zufallspriming mit ³²P markiert und hybridisierten an Northern-Blots, die aus 653 (dem Fusionspartner von Hybridom 412) oder 412 stammende Gesamt-RNS enthalten. Das 5,5 kb EcoRI-Fragment der schweren Kette hybridisierte mit einem 2 kb EcoRI- Fragment der schweren Kette in der 412 RNS, aber nicht in der 653 RNS. Entsprechend hybridisierte das 5,4 kb HindIII-Fragment der leichten Kette mit einem 1250 der mRNS in der 412 RNS aber nicht in der 653 RNS. Dies sind die korrekten Größen für die mRNSn der schweren beziehungsweise der leichten Kette. Da die klonierten DNS- Fragmente DNS-Segmente enthalten, die in dem Hybridom 412 exprimiert wurden, lassen diese Daten vermuten, daß dies die korrekten Sequenzen der variablen Region aus dem Hybridom 412 sind. Der endgültige Funktionstest zeigt allerdings, daß diese Sequenzen, wenn sie mit geeigneten Sequenzen der konstanten Region kombiniert werden, in der Lage sind, die Synthese eines Antikörpers der eine ähnliche Spezifität und Affinität, wie der murine Antikörper 412 besitzt, zu steuern.

Vektoren und Expressionssysteme

Die aus dem Hybridom 412 klonierten mutmaßlichen V- Gene der leichten und schweren Kette wurden mit menschlichen Genen der kappa und G1 konstanten Region in Expressionsvektoren verknüpft. Das mit dem mutmaßlichen Gen der V-Region der schweren Kette von 412 übereinstimmende 5.5 kb EcoRI-Fragment wurde verwendet, um das 17-1A VH EcoRI-Fragment des zuvor beschriebenen Vektors pSV2ΔHgpt17-1AVH-hCG1 (Sun, L. et al., PNAS 84, Seite 214-218 (1987)) zu ersetzen und p412HG1apgpt zu erhalten. Für die leichte Kette wurden zwei (2) verschiedene Konstruktionen erstellt. In der ersten Konstruktion wurde das mutmaßliche 5,4 kb Fragment der leichten Kette von 412 verwendet, um das 17-1A HindIII-Fragment von pSV184- ΔHneo17-1AVKhCK zu ersetzen und p412HuKcmneo zu erhalten. In der zweiten Konstruktion wurde das 5,4 kb HindIII- Fragment von 412 in einen ähnlichen Vektor wie pSV184ΔHneo17-1AVhCk kloniert, außer daß der für Säugerzellen selektierbare Marker Ecogpt anstatt neo war. Das resultierende Plasmid wurde als p412HuKapgpt bezeichnet. Ein Plasmid, das sowohl die Gene der schweren als auch der leichten Kette im selben Plasmid enthielt, wurde ebenfalls konstruiert und wurde als p412-DP bezeichnet.
Die Expressionsplasmide für 412 sind in Abbildung 1 gezeigt.
Um die Gene der schimären leichten und schweren Kette zu exprimieren, wurden verschiedene Kombinationen der Expressionsplasmide in die nichtproduzierende Maus Myelomzellinie SP2/0 transfiziert. Der Vektor der schweren Kette wurde entweder mit der neo oder gpt Version des Vektors der leichten Kette cotransfiziert und p412-DP wurde allein transfiziert. Eine Mycophenolsäure-Selektion wurde nach 24 Stunden durchgeführt; bei Cotransfektionen mit neo und gpt Vektoren wurden zur Selektion sowohl Mycophenolsäure als auch G418 verwendet. Resistente Kolonien wurden zu stabilen Zellinien expandiert und der Gewebekulturüberstand dieser Zellinien wurde mit Hilfe eines ELISA Assays mit Ziege anti-Mensch IgG Fc-Antikörper und Ziege anti-Mensch H+L, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Jackson Laboratories), auf Antikörperproduktion getestet. Eine als JL3A3 bezeichnete Zellinie wurde für weitere Untersuchungen gewählt.
Der schimäre Antikörper 412 wurde aus dem Gewebekulturüberstand der Zellinie JL3A3 mittels Protein A Sepharose Chromatographie gereinigt. 190 ml des Überstands wurden auf 0,1 M Tris, 0,002 M EDTA, pH 8,0 eingestellt und auf eine mit 0,1 M Tris, 0,002 M EDTA, pH 8,0, äquilibrierte 12 ml Protein A-Sepharose Säule aufgetragen. Die Säule wurde gewaschen, bis der Grundwert erreicht wurde, und das IgG wurde mit einem pH Gradienten von 0,1 M Citrat pH 6,5 bis 0,1 M Citrat pH 3,5 eluiert, wobei der IgG Peak bei annähernd pH 4,0 eluierte. Der Peak wurde vereint, mit 1 M Tris neutralisiert, in PBS diafiltriert und 0,2 Micron filtriert. 5,4 mg wurden wiedergewonnen (annähernd 28 µg/ml vom Ausgangsüberstand).
Die Reinheit des IgG wurde mittels HPLC und SDS- PAGE bestimmt. Die HPLC Analyse auf GF-250 Gelfiltration zeigte einen einzigen Peak mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von annähernd 150.000. Die SDS-PAGE auf Pharmacia Phastgel 10-15% (4 ml Proben), mit Coomassie Färbung sichtbar gemacht, zeigte ebenfalls ein sauberes Präparat mit dem gleichen Molekulargewicht.
Die Immunaktivität des gereinigten IgG wurde in einem indirekten Zellbindungstest mit CEM Zellen bestimmt. CEM Zellen präsentieren den CD4-Rezeptor auf ihrer Oberfläche. Schimärer 7E3 G1, ein für, die Erfindung irrelevanter Antikörper, wurde als Negativ-Kontrolle verwendet. Die relativen Affinitätswerte wurden aus der inversen Konzentration (M) bei halbmaximaler Bindung bestimmt. Folgende Werte werden erhalten:
Die Daten zeigen, daß schimäres anti-CD4 IgG1 an CEM Zellen mit einer ähnlichen Affinität wie der murine anti-CD4 Antikörper bindet. Dies weist daraufhin, daß die murinen und schimären Antikörper eine ähnliche Affinität für den menschlichen CD4 Rezeptor besitzen.

Biologische Information

Um die Sicherheit, Pharmakokinetiken und CD4 Effekte abzuschätzen, wurde ein bevorzugter schimärer monoklonaler anti-CD4 Antikörper dieser Erfindung (cM- T412) sieben Tage mit einer Dosis von 5 mg/kg/ Tag vier Schimpansen intravenös (IV) verabreicht. Der Antikörper wurde gut vertragen und die CD4 Zellzahl im Blutkreislauf nahm deutlich von der ersten Dosisgabe an über 2-3 Wochen bis nach der letzten Dosisgabe ab. Die Anzahl der CD4 positiven Zellen stieg 3-4 Wochen nach Dosisgabe an, aber blieb in den behandelten Tieren relativ zu den mit Saline behandelten Kontrollen für 3-4 Monate verringert. Eine anti-schimäre Antikörper-Antwort wurde nicht beobachtet. Die verlängerte Abnahme CD4+ T-Zellen im Blutkreislauf ohne Auftreten entgegengesetzter Effekte oder immunogener Antworten unterstützt die mögliche klinische Anwendung derartiger schimärer monoklonaler anti-CD4 Antikörper für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise rheumatoider Arthritis und Arthritis psoriatica, MS, SLE und Myasthenia gravis.
Eine signifikannte Verbesserung der Symptome wurde ebenfalls in einer Reihe mit 15 Patienten mit refraktorischer rheumatoider Arthritis beobachtet, die mit einer einzigen IV Dosis im Breich von 1-200 mg eines bevorzug ten schimären anti-CD4 Antikörpers dieser Erfindung, CT- M412, behandelt wurden. Signifikante Abschwellungen der geschwollenen Gelenke und empfindlichen Gelenke wurden zwischen 21 beziehungsweise 90 Tagen nach der Behandlung beobachtet. Der Antikörper wurde gut vertragen, wobei in vorübergehend grippeähnliche Symptome beobachtet wurden. Eine moderate anti-Maus Antwort erfolgte bei 8 der 15 Patienten. Eine anhaltende Abnahme an CD4+ T-Zellen erfolgte in bis zu 14 Tagen nach der Behandlung und war nach 35 Tagen weniger deutlich vorhanden. CD8+ Zellen nahmen ebenfalls vorübergehend nach der Behandlung ab, aber erreichten nach 72 Stunden wieder den Gundwert. Die klinische Dosierung kann in Abhängigkeit von der Natur und Schwere des zu behandelnden Leidens, wie auch von Alter und Gewicht des Patienten und dem Vorhandensein weiterer bestehender Leiden variieren; jedoch werden einzelne IV Dosen im Bereich von 1-20 mg als klinisch sinnvoll erachtet.
Während die Bindung von M-T412 sowohl an CEM als auch an menschliche T-Lymphocyten durch M-T151 blockiert werden kann, gibt es bestimmte funktionale Unterschiede zwischen diesen Antikörpern. Ein in vivo Ergebnis schließt einen klinischen Prüfungsbericht an Patienten mit rheumatoider Arthritis ein, in denen M-T151 eine Verbesserung der Symptome mit nur einer vorübergehenden Abnahme der zirkulierenden CD4+ Zellen und einem Ansteigen der CD8+ Zellen bewirkte. Herzog et al., J. Autoimmunity 2:627-642 (1989). Im Gegensatz dazu führt eine in vivo Verabreichung des cM-T412 Antikörpers zu einer langandauernden Abnahme an CD4+ T-Zellen und auch zu einer Abnahme an CD8+ T-Zellen. Obwohl dieser Unterschied in der biologischen Aktivität zwischen dem murinen Antiköper M-T151 und dem schimären Antikörper cM-T412 teilweise von dem menschlichen Fc-Anteil des schimären Antikörpers herrühren könnte, der bessere menschliche Effektor-Funktionen erfüllen kann, lassen jedoch klinische Berichte mit schimären monoklonalen anti-leu3A Antikörper (der wie cM-T412 ein gamma 1 Isotyp ist) und auch Ergebnisse aus in vitro Tests von M-T412 und M-T151 vermuten, daß mindestens einige Unterschiede in der Epitop Spezifität beteiligt sein können. Beispielsweise bei Abschätzung der Antikörper-Effekte auf die Proliferation der peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) bei der Antwort auf Tetanustoxin war der cM-T412 effektiver als der ursprüngliche M-T412; und beide waren effektiver als der M-T151 (murin). Da sowohl M-T412 als auch M-T151 vom murinen Isotyp G2a sind, liegen die Unterschiede zwischen ihnen sehr wahrscheinlich an den Unterschieden in den Fab Regionen. Wegen seiner Fähigkeit sowohl CD4 als auch CDB T-Zell Subpopulationen zu vermindern, wird der schimäre monoklonale anti-CD4 Antikörper dieser Erfindung, als cM-T412 bezeichnet, mehr bevorzugt.
Bei cM-T412 wurde ebenfalls beobachtet, daß er sowohl aktivierende Oberflächenzellrezeptoren IL-2 als auch lösliches IL-2 vermindert.

Entsprechungen

Der Fachmann erkennt oder ist in der Lage, durch nicht mehr als übliches Experimentieren viele Entsprechungen zu den spezifischen Anwendungen der hier beschriebenen Erfindung festzustellen. Derartige Entsprechungen sind beabsichtigt, um von den folgenden Ansprüchen umfaßt zu werden.

Claims

1. Ein CD4-spezifisches schimäres Immunoglobulin, das eine Antigenbindungsregion nichthumanen Ursprungs und eine konstante Region humanen Ursprungs umfaßt, wobei das schimäre Immunoglobulin (1) in der Lage ist, eine dauerhafte Abnahme von CD4&spplus; T-Zellen zu bewirken und/oder (2) mit dem M-T151 mAb um Bindung an CEM- Zellen konkurrieren kann.

2. Ein schimäres Immunoglobulin nach Anspruch 1, worin die Antigenbindungsregion von einem murinen anti-CD4 Immunoglobulin abgeleitet ist.

3. Ein schimäres Immunoglobulin nach Anspruch 2, worin die Antigenbindungsregion von einem monoklonalen Antikörper abgeleitet ist.

4. Ein Antigen bindendes Fragment eines schimären Immunoglobulins nach Anspruch 1, das eine Antigenbindungsregion nichthumanen Ursprungs und mindestens einen Teil einer konstanten Region humanen Ursprungs umfaßt.

5. Ein schimäres Immunoglobulin, das umfaßt:

a. mindestens eine schimäre schwere Kette, die eine Antigenbindungsregion umfaßt, die von der schweren Kette eines für den CD4-Rezeptor spezifischen nichthumanenen Immunoglobulins abgeleitet ist und mit mindestens einem Teil der konstanten Region einer humanen schweren Kette verknüpft ist, wobei die schwere Kette assoziiert ist mit:

b. mindestens einer schimären leichten Kette, die eine Antigenbindungsregion umfaßt, die von einer leichten Kette des nichthumanen Immunoglobulins abgeleitet ist und mit mindestens einem Teil der konstanten Region einer humanen leichten Kette verknüpft ist, wobei das schimäre Immunoglobulin (1) in der Lage ist, eine dauerhafte Abnahme von CD4&spplus; T-Zellen zu bewirken und/oder (2) mit dem M- T151 mAb um Bindung an CEM-Zellen konkurrieren kann.

6. Ein schimäres Immunoglobulin nach Anspruch 5 vom IgG1 Isotyp, z. B. IgG1 kappa Isotyp.

7. Ein schimäres Immunoglobulin nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, worin die Antigenbindungsregion von einem murinen Antikörper abgeleitet ist.

8. Ein Antigen bindendes Fragment eines schimären Immunoglobulins gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, das ein Fab, Fab' oder F(ab)&sub2; Fragment ist, das eine für den CD4-Rezeptorkomplex spezifische murine variable Region und eine humane konstante Region umfaßt.

9. Ein schimäres Immunoglobulin gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 7 oder ein Fragment nach Anspruch 4 oder 8, das eine Bindung hoher Affinität an CD4 zeigt, zum Beispiel eine Ka von mindestens 10&sup8;M&supmin;¹ besitzt, z. B. mindestens 10&sup9;M&supmin;¹.

10. Ein fusioniertes Gen, das das schimäre Immunoglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 5 bis 7 und 9 oder Fragment nach Anspruch 4 oder 8 codiert.

11. Ein Expressionsvektor, der das fusionierte Gen nach Anspruch 10 in exprimierbarer Form enthält.

12. Das schimäre Immunoglobulin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 5 bis 7 und 9 oder Fragment nach Anspruch 4 oder 8 für die Verwendung in der Therapie, zum Beispiel bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, z. B. rheumatoider Arthritis und Arthritis psoriatica, SLE, Multiple Sklerose und Myasthenia gravis.

13. Verwendung des schimären Immunoglobulins nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 5 bis 7 und 9 oder Fragments nach Anspruch 4 oder 8, des fusionierten Gens nach Anspruch 10 oder des Expressionsvektors nach Anspruch 11 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten, z. B. rheumatoider Arthritis und Arthritis psoriatica, SLE, Multiple Sklerose und Myasthenia gravis.