DE3751827T2 - Gamma, delta t-zellenrezeptor und verfahren zum nachweis - Google Patents
Gamma, delta t-zellenrezeptor und verfahren zum nachweisInfo
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Description
- In dieser Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen durch eingeklammerte arabische Ziffern Bezug genommen. Vollständige Zitierungen dieser Literaturstellen können am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen gefunden werden. Die Offenlegungen dieser Veröffentlichungen in ihrer Gesamtheit werden hiermit unter Angabe der entsprechenden Quellen in diese Anmeldung aufgenommen, um den Stand des Wissens, auf den sich diese Erfindung bezieht, vollständiger zu beschreiben.
- Das Verständnis der Erkennung von Antigenen durch T-Zellen und die Einschränkung des Prozesses durch Antigene, die vom Haupt-Histokompatibilitäts-komplex (MHC) kodiert werden, ist ein wichtiges Ziel der Immunologie. Ein wichtiger Schritt nach vorne erfolgte mit der immunchemischen Identifizierung klonspezifischer Disulfid-verknüpfter Heterodimere auf T-Zellen, die aus Untereinheiten zusammengesetzt sind, die als T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) α und β bezeichnet werden. Die TCRα- und TCRβ-Untereinheiten haben relative molekulare Massen (Mr) von ungefähr 50 000 bzw. 40 000 Dalton (1, 2, 3). Gene, die sich während der T-Zell-Ontogenese rearrangieren und für die TCRβ- (4, 5) und die TCRα-Untereinheit (6, 7, 8) kodieren, wurden entweder durch subtraktive Hybridisierung oder mit Hilfe von Oligonukleotid-Sonden isoliert.
- Eine charakteristische Eigenschaft der humanen TCRα- und TCRβ-Untereinheiten war die beobachtete Komodulierung (2), Koimmunpräzipitation (9, 10) und die erforderliche Koexpression (11) der TCRα- und TCRβ-Moleküle mit dem T3-Glykoprotein, was nahelegte, daß diese zwei Strukturen miteinander zusammenhingen. In der Folge wurde die direkte physikalische Assoziation der beiden Proteinkomplexe durch chemische Quervernetzung der TCRα- und TCRβ- Moleküle mit dem T3-Glykoprotein und Identifizierung der Komponenten des quervernetzten Komplexes als die TCRβ-Untereinheit und das T3-Glykoprotein (Mr 28 000) gezeigt (12). Ein T3- Gegenstück ist auf ähnliche Weise mit der TCRα- und der TCRβ-Untereinheit der Maus assoziiert (13, 14).
- Ein drittes Gen, das sich in T-Zellen rearrangiert und als TCRγ bezeichnet wird, wurde in der Maus (15, 16, 17) und im Menschen (18, 19) identifiziert. Jedoch gibt es hinsichtlich der genetischen Struktur größere Unterschiede zwischen dem humanen TCRγ-Gen und dem TCRγ- Gen der Maus; z.B. ergeben sich aus der cDNA des humanen TCRγ-Gens (36) 5 potentielle Stellen für eine N-Glykosylierung des TCRγ-Genprodukts, was im Gegensatz zu der bemerkenswerten Abwesenheit derartiger Stellen im TCRγ-Gen der Maus (15) steht. Somit hat das humane TCRγ-Genprodukt ein hohes Molekulargewicht, das aus seiner genetischen Sequenz nicht vorhersagbar ist.
- Die Rearrangements des TCRγ-Gens erfolgen in Lymphozyten sowohl des Suppressor- und cytotoxischen Phänotyps als auch des Helfer-Phänotyps und können eine große Zahl an TCRγ- Ketten hervorrufen (18, 19, 20, 21, 22, 23). Die Funktion des TCRγ-Gens ist jedoch unbekannt. Weiterhin sind weder das Protein, das durch das TCRγ-Gen kodiert wird, noch seine mögliche Assoziation mit anderen Strukturen (wie sie zwischen den TCRα- und TCRβ-Untereinheiten und dem T3-Glykoprotein vorliegt) identifiziert worden. Beim Menschen machen es die multiplen Glykosylierungsstellen unmöglich, mit Genauigkeit die Art und die Größe der Struktur des TCRγ- Polypeptids vorherzusagen. Außerdem geht aus der veröffentlichten Literatur nicht hervor oder wird nicht nahegelegt, das TCRγ für eine Diagnose, eine Überwachung oder eine Stadienermittlung von Erkrankungen des Menschen zu verwenden.
- Es erscheint immer wahrscheinlicher, daß das TCRα,β-Molekül allein sowohl die Antigenerkennung als auch die MHC-Restriktion auf zumindest einigen T-Zellen bestimmt (24, 25). Jedoch ist es nicht klar, daß das TCRα,β-Molekül für den Prozeß der T-Zell-Selektion während der T-Zell- Ontogenese oder für alle antigenspezifischen Erkennungen durch reife T-Zellen verantwortlich ist. Zum Beispiel bleiben Suppressor-T-Lymphozyten ein Rätsel; in einigen Fällen verlieren sie TCRβ- Gene oder es kommt nicht zu einem Rearrangement (26, 27). Somit ist es von großer Bedeutung zu bestimmen, ob ein zweiter T-Zell-Rezeptor existiert, seine Struktur zu bestimmen (besonders im Hinblick auf die mögliche Verwendung des TCRγ-Genprodukts) und letztlich zu verstehen, welche Funktion oder Funktionen er hat.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Polypeptid bereit, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist, wobei die Kette dadurch gekennzeichnet ist, daß sie:
- (a) in einem Komplex mit dem T3-Antigen assoziiert ist, wenn sie an der Oberfläche einer T- Zelle gefunden wird;
- (b) nicht mit Antikörpern gegen den α,β-T-Zell-Antigenrezeptor reaktiv ist;
- (c) nicht mit Antikörpern gegen die Gamma-Kette des T-Zell-Antigenrezeptors reaktiv ist; und
- (d) in einem Komplex mit einem zweiten Polypeptid assoziiert ist, wenn sie an der Oberfläche einer T-Zelle gefunden wird, wobei das genannte zweite Polypeptid mit Antikörpern gegen die γ-Kette des T-Zell-Antigenrezeptors reaktiv ist.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Substanz bereit, die in der Lage ist, spezifisch einen Komplex mit wenigstens einem Polypeptid der Erfindung auszubilden, wobei diese Substanz ein Antikörper ist. Die Substanz kann in der Lage sein, einen Komplex mit einer δ-Kette oder mit mehr als einer δ-Kette auszubilden. Die Substanz kann ein monoklonaler Antikörper sein, z.B. ein monoklonaler Antikörper, der durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, ein CD3-Antigen komodulieren zu können.
- Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die eine Substanz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch einen Komplex mit wenigstens einem Polypeptid der Erfindung auszubilden, wobei diese Substanz ein Antikörper ist, zur Verwendung bei der Diagnose einer Immunsystem- Anomalie.
- Es wird auch ein Verfahren zum Nachweis von T-Zellen bereitgestellt, von denen jede ein Polypeptid der Erfindung aufweist, das das In-Kontakt-Bringen einer Probe, die T-Zellen enthält, mit einem Antikörper umfaßt, der in der Lage ist, einen Komplex mit dem Polypeptid zu bilden, so daß ein Komplex zwischen dem Antikörper und dem Polypeptid gebildet wird, wodurch derartige T-Zellen nachgewiesen werden.
- Das Polypeptid kann an der Oberfläche der T-Zellen oder im Cytoplasma der T-Zellen vorhanden sein. Das spezifische Polypeptid mag nur in Suppressor-T-Zellen vorhanden sein.
- Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in einem Individuum bereit, wobei das Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen in einer Probe von dem Individuum;
- (b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit Substanzen, die in der Lage sind, Komplexe mit wenigstens einem Polypeptid der Erfindung auszubilden, so daß ein Komplex zwischen der Substanz und dem Polypeptid gebildet wird;
- (c) Bestimmen des Prozentsatzes an T-Zellen in der Probe, die das Polypeptid aufweisen; und
- (d) Vergleichen des so bestimmten Prozentsatzes mit dem Prozentsatz von T-Zellen, die das Polypeptid in einer Probe von einem normalen Individuum, das die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist, aufweisen, wobei ein Unterschied bei den so bestimmten Prozentsätzen an T-Zellen einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt.
- Ein weiteres Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie wird durch die Erfindung bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen, die ein Polypeptid der Erfindung aufweisen, in einer Probe von dem Individuum;
- (b) Bestimmen der Menge des Polypeptids in den T-Zellen, die das Polypeptid aufweisen; und
- (c) Vergleichen der so bestimmten Menge mit der Menge an Polypeptid in einer gleichen Anzahl von T-Zellen, die das Polypeptid aufweisen, in einer Probe von einem normalen Individuum, das die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei der so bestimmten Menge einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt.
- Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in einem Individuum bereit, wobei das Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen in einer Probe des Individuums des Verhältnisses der Anzahl der T-Zellen, die ein Polypeptid der Erfindung aufweisen, verglichen mit der Anzahl an T-Zellen, die einen Oberflächenmarker aufweisen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus T3; T4; T8; und dem α,β-T-Zell-Antigenrezeptor besteht; und
- (b) Vergleichen des Verhältnisses von (a) mit dem Verhältnis, das in einer Probe eines normalen Individuums bestimmt wurde, das die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei den so bestimmten Verhältnissen einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Nukleinsäuremolekül bereit, das für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert.
- Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung bereit, das, in Form eines isolierten Komplexes, mit einem Polypeptid assoziiert ist, das wenigstens ein antigenes Fragment einer γ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist, wobei die γ-Kette dadurch gekennzeichnet ist, daß sie:
- (a) in einem Komplex mit dem T3-Antigen assoziiert ist, wenn sie an der Oberfläche einer T- Zelle gefunden wird;
- (b) nicht mit Antikörpern gegen die α- oder β-Kette des α,β-T-Zell-Antigenrezeptors reagiert; und
- (c) mit einem Antikörper gegen die γ-Kette des T-Zell-Antigenrezeptors reagiert.
- Die γ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors kann ein Molekulargewicht von etwa 55 000 Dalton, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von 5% 2-Mercaptoethanol, aufweisen.
- Die γ-Kette ist vorzugsweise die γ-Kette eines humanen T-Zell-Antigenrezeptors.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Substanz, die in der Lage ist, spezifisch einen Komplex mit einem Komplex auszubilden, wie er oben definiert wurde, wobei die Substanz spezifisch an das Polypeptid bindet, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist.
- Die Substanz kann in der Lage sein, einen Komplex mit einem γ,δ-T-Zell-Antigenrezeptor oder mit mehr als einem γ,δ-T-Zell-Antigenrezeptor auszubilden. Die Substanz ist z.B. ein Antikörper.
- Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die eine Substanz umfaßt, die in der Lage ist, einen Komplex mit einem Komplex auszubilden, wie er oben definiert wurde, für die Verwendung bei der Diagnose einer Immunsystem-Anomalie.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von T-Zellen bereit, von denen jede einen Komplex aufweist, wie er oben definiert wurde, das das In-Kontakt-Bringen von T-Zellen mit einer Substanz, die in der Lage ist, einen Komplex mit dem Komplex auszubilden, so daß ein zweiter Komplex gebildet wird, den Nachweis eines derartigen zweiten Komplexes und auf diese Weise den Nachweis solcher T-Zellen umfaßt, bei denen die Substanz spezifisch an das Polypeptid bindet, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist.
- Der erste Komplex kann auf der Oberfläche oder im Cytoplasma der T-Zellen vorliegen. Der Komplex mag nur in Suppressor-T-Zellen vorhanden sein.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in einem Individuum bereit, wobei das Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen in einer Probe des Individuums;
- (b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit Substanzen, die in der Lage sind, einen zweiten Komplex mit wenigstens einem Komplex auszubilden, wie er oben definiert wurde, so daß ein zweiter Komplex zwischen der Substanz und dem Komplex gebildet wird;
- (c) Bestimmen des Prozentsatzes an T-Zellen in der Probe, die den zweiten Komplex aufweisen; und
- (d) Vergleichen des so ermittelten Prozentsatzes mit dem Prozentsatz von T-Zellen, die den zweiten Komplex in einer Probe eines normalen Individuums, das die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist, aufweisen, wobei ein Unterschied bei den Prozentsätzen der so bestimmten T-Zellen einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt;
- wobei die Substanzen spezifisch an das Polypeptid binden, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist.
- Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in einem Individuum bereit, wobei das Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen, die einen Komplex aufweisen, wie er oben definiert wurde, in einer Probe des Individuums, wobei die Anzahl von T-Zellen, die einen Komplex aufweisen, wie er oben definiert wurde, dadurch bestimmt wird, daß man das Polypeptid in dem Komplex nachweist, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T- Zell-Antigenrezeptors ist;
- (b) Bestimmen der Menge des Komplexes in den T-Zellen, die den Komplex aufweisen, durch Bestimmen der Menge des Polypeptids in dem Komplex, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist; und
- (c) Vergleichen der so ermittelten Menge mit der Menge des Komplexes in einer gleichen Anzahl von T-Zellen, die den Komplex aufweisen, in einer Probe von einem normalen Individuum, das die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei der so ermittelten Menge einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt.
- Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in einem Individuum bereit, wobei das Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen in einer Probe des Individuums das Verhältnis der Zahl von T-Zellen, die einen Komplex aufweisen, wie er oben definiert wurde, im Vergleich mit der Zahl an T-Zellen, die einen Oberfächenmarker aufweisen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus T3; T4; T8 und dem α,β-T-Zell-Antigenrezeptor besteht; und
- (b) Vergleichen des Verhältnisses gemäß (a) mit dem Verhältnis, das in einer Probe von einem normalen Individuum bestimmt wurde, das die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei den so bestimmten Verhältnissen einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt;
- wobei die Anzahl von T-Zellen, die einen Komplex aufweisen, wie er oben definiert wurde, dadurch bestimmt wird, daß man das Polypeptid in dem Komplex nachweist, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist.
- Brenner et al. beschreiben in Nature 322 vom 10. Juli 1986 die Verwendung monoklonaler Framework-Antikörper zur Identifizierung einer Population humaner Lymphozyten, die das T3- Glykoprotein, aber nicht die T-Zell-Rezeptor-Untereinheiten α und β exprimieren. Chemische Quervernetzungsexperimente zeigten, daß diese Lymphozyten neuartige T3-assoziierte Polypeptide exprimieren. Die Autoren schlagen vor, daß eines dieser Polypeptide das Produkt des Tγ-Gens sein könnte. Die Autoren schlagen auch vor, daß die anderen Polypeptide eine vierte T-Zell-Antigenrezeptor-Untereinheit, bezeichnet als Tδ, repräsentieren könnte.
- Figur 1: Reaktivität monoklonaler Framework-Antikörper, die TCRα,β erkennen.
- A. Spur 1: Kontrollantikörper, normales Mausserum.
- Spur 2: Monoklonaler Anti-TCRα,β-Framework-Antikörper (βF1).
- B. Spur 1: Kontrollantikörper, normales Mausserum.
- Spur 2: Monoklonaler Anti-T3-Antikörper (UCHT-1).
- Spur 3: Monoklonaler Anti-TCRα,β-Framework-Antikörper (WT31).
- C. Dreidimensionale Darstellung einer durchflußcytometrischen Analyse normaler adulter peripherer Blutlymphozyten. Es wurden die rote und die grüne Fluoreszenz gemessen und mit unspezifischen FITC- und Biotin-konjugierten monoklonalen Kontrollantikörpern verglichen. Zellen, die mit keinem der monoklonalen Antikörper reagierten, waren keine T- Zellen (untere linke Ecke); Zellen, die zweifach positiv waren, d.h. sowohl mit OKT3 und βF1 reagierten, stellen die große Population an Lymphozyten im zentralen Bereich des Gitters dar; Zellen, die βF1&supmin;, aber OKT3&spplus; waren, machen eine kleine, aber klar erkennbare Gruppe von Lymphozyten aus (4% der T3&spplus;-Zellen), die längs der X-Achse beobachtet wurde.
- Figur 2: SDS-PAGE-Analyse von auf der Zelloberfläche vorkommenden T3- und T3-assoziierten (quervernetzten) Molekülen durch Immunpräzipitation aus IDP1- und IDP2-Zellinien.
- A. IDP1-Zellinie 2 (WT31&spplus;) und Zellinie 3 (WT31&supmin;).
- Spuren 1, 2, 7, 8: normales Mausserum.
- Spuren 3, 4, 9,10: Monoklonaler Anti-T3-Antikörper (UCHT-1).
- Spuren 5, 6, 11, 12: Monoklonaler Anti-TCRα,β-Framework-Antikörper (βF1).
- B. IDP2-Zellinie 7 (88% WT31&supmin;T3&spplus;).
- Spuren 1, 4, 7, 10: normales Mausserum.
- Spuren 2, 5, 8,11: Monoklonaler Anti-TCR-Framework-Antikörper (βF1).
- Spuren 3, 6, 9, 12: Monoklonaler Anti-T3-Antikörper (UCHT-1).
- ¹²&sup5;I-markierte Proben wurden mit DSP XL-quervernetzt.
- C. IDP2-Zellinie 5 (WT31&spplus;T3&spplus;) und Zellinie 7 (88% WT31&supmin;T3&spplus;).
- Spuren 1, 3: normales Mausserum.
- Spuren 2, 4: Monoklonaler Anti-T3-Antikörper (UCHT-1).
- Figur 3: Northern-Blot-Analyse von RNA, die aus IDP2-Zellinien unter Verwendung von TCRα-, TCRβ- und TCRγ-CDNA-Sonden isoliert wurde.
- A. Spur 1: IDP2-Zellinie 6 (WT31&supmin;).
- Spur 2: leukämische T-Zellinie HPB-MLT.
- B. Spur 1: IDP2-Zellinie 5 (WT31&spplus;T3&spplus;).
- Spur 2: IDP2-Zellinie 7 (88% WT31&supmin;T3&spplus;).
- Spur 3: Zellinie HPB-MLT.
- Figur 4: Immunpräzipitationen der IDP2-Zellinie 7 mit Anti-Vγ- und Anti-Cγ-Peptid-Serum.
- A. Spur 1: normales Mausserum.
- Spur 2: Anti-Vγ-Peptid-Mausserum.
- Spur 3: normales Kaninchenserum.
- Spur 4: Anti-T3-Peptid-Kaninchenserum.
- B. Spur 1: normales Mausserum.
- Spur 2: Monoklonaler Anti-T3-Antikörper (UCHT-1).
- Spur 3: normales Kaninchenserum.
- Spuren 4,5: Anti-Cγ-Peptid-Kaninchenserum.
- Figur 5: Immunpräzipitationen von TCRγ, TCRδ und T3 aus einem humanen Tumor und Zellinien peripherer Blutlymphozyten.
- Immunpräzipitationen von ¹²&sup5;I-markierten Zell-Lysaten wurden durch SDS-PAGE (10% Acrylamid) unter reduzierenden (R) oder nicht reduzierenden (N oder NR) Bedingungen analysiert. Größenmarker Mr in 1000er Einheiten.
- A. TCRγ-, TCRδ- und T3-Untereinheiten auf IDP2- und PEER-Zellen. Immunpräzipitationen wurden durchgeführt unter Verwendung von 1 µg Kontroll-mAb P3 (vom Myelom P3X63.Ag8 sezernierter mAb, Spuren 1, 3, 5 und 6); 1 µg UCHT1 (Anti-T3) (40) (Spuren 2, 4, 7 und 8); 10 µl normalem Kaninchenserum (NKS, Spur 9) und 10 µl Anti-C-Peptid- Serum (Anti-TCRγ) (Spur 10). Pfeile geben die Positionen der TCRδ-Untereinheiten an, die ihre Beweglichkeit unter R- und NR-Bedingungen verändern.
- B. TCRγ-, TCRδ- und T3-Untereinheiten auf dem Klon PBL-C1 von T-Zellen des peripheren Blutes und auf der WT31&supmin;-PBL-Linie. Die Immunpräzipitationen wurden durchgeführt unter Verwendung von Kontroll-mAb P3 (Spuren 1, 4, 9 und 12); 1 µg βF1 (Anti-TCRβ) (Spuren 2, 5, 10 und 13), NKS (Spuren 7 und 15) und Anti-C-Peptid-Serum ((Spuren 8 und 16). Der offene Pfeil markiert nicht durch Disulfidbrücken-verbundenes, T3-assoziiertes Material, das unter nicht reduzierenden Bedingungen bei der SDS-PAGE eine erhöhte Beweglichkeit aufweist (wie TCRδ in A).
- Figur 6: Northern-Blot-Analyse von RNA, die aus PBL-C1-Zellen isoliert wurde.
- Präparationen der Gesamt-RNA aus der leukämischen T-Zellinie HPB-MLT (Spur 1 für jede Sonde) und PBL-C1-Zellen (Spur 2 für jede Sonde) wurden auf Northern Blots unter Verwendung von TCRα-, TCRβ- und TCRγ-cDNA-Sonden analysiert.
- Figur 7: Zweidimensionale Gelanalyse von TCRγ-Polypeptiden und Vorläufern.
- Bilder A-D: Vergleich reduzierter (getrennter) und nicht reduzierter (dimerer) T3-assoziierter Polypeptide aus PBL-C1-Zellen. Die Zellen wurden in CHAPS lysiert und mit Anti-T3-mAb immunpräzipitiert. Die zweidimensionale Gelelektrophorese wurde unter reduzierenden Bedingungen (A, C) oder nicht reduzierenden Bedingungen (B, D) durchgeführt. Die T3γ, T3δ und T3ε-Positionen sind markiert und sowohl unter R- als auch N-Bedingungen auf ähnlichen Positionen fokussiert. Nach der Spaltung der Disulfid-Bindung wanderten die T3-assoziierten Polypeptide (40 K und 36 K) zu Fokussierungspositionen nahe den R- Bedingungen für T3γ, aber verschoben sich unter N-Bedingungen zu einer saureren Position (nahe T3δ) (wenn beide Komponenten des Dimeren anwesend waren (68 K). Größenmarker, Mr.
- Bilder E-H: Analyse glykosylierter und nicht glykosylierter TCR-Peptid-Vorläufer aus IDP2- und PBL-C1-Zellen. IDP2- und PBL-C1-Zellen wurden mit ³&sup5;S-Methionin pulsmarkiert, unter denaturierenden Bedingungen lysiert und mit Anti-C-Peptid-Serum immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden dann entweder mit Endo-H behandelt oder scheinbehandelt und durch zweidimensionale Gelelektrophorese analysiert. Glykosylierte TCRγ-Peptide sind durch offene Pfeile gekennzeichnet und nicht glykosylierte TCRγ-Peptide durch ausgefüllte Pfeile. Die scheinbaren relativen Molmassen wurden aus der Wanderung von Standards, die in den Bildern A und B verwendet wurden (nicht gezeigt) berechnet. Eine geringe Menge an verunreinigendem Aktin, das in jedem Bild durch ein Diamantsymbol markiert ist, diente als interner Marker. E, TCRγ aus IDP2-Zellen, scheinbehandelt; F, TCRγ aus IDP2-Zellen, Endo-H-behandelt; G, TCRγ aus PBL-C1-Zellen, scheinbehandelt; H, TCRγ aus PBL-C1-Zellen, Endo-H-behandelt.
- Figur 8: Rearrangement der γ- und β-Gene in T-Zellen, die das TCRγ-Polypeptid exprimieren.
- Genomische DNAs, die aus der IDP2-Zellinie, der PBL-C1-Zellen, PBL-C2-Zellen, der WT31&supmin;-PBL-Linie, aus fötalem Thymus, Neugeborenen-Thymus, PBL und einer B-Zellinie (JY für Keimbahn) isoliert worden waren, wurde durch Southern-Blot-Analyse bezüglich Rearrangements des TCRγ- (A, B) und des TCRβ-Gens (C) analysiert. Die genomischen DNAs wurden durch BamH1 (A, C) oder EcoRI (B) verdaut, auf Agarosegelen fraktioniert und zur Hybridisierung mit ³²P-markierten Jγ1,3&supmin; (A, B) oder Cβ&sub2;-Sonden (C) auf Nitrocellulosefilter übertragen. Pfeile und römische Ziffern bezeichnen TCRγ-Rearrangements. Größenmarker in kb.
- Figur 9: Cytolyse durch IDP2- und PBL-C1-Zellen.
- Bilder A,C. IDP2- oder PBL-C1-Effektorzellen wurden mit &sup5;¹Cr-markierten Targetzellen K562 (erythroide Linie), U937 (Monozytenlinie), MOLT-4, CEM (T-Leukämie-Linien), Daudi (Burkitt- Lymphom-Linie) oder allogenen oder autologen PBL (3-Tage-PHA-Blasten humaner PBL) inkubiert. Es ist die prozentuale spezifische Freisetzung von &sup5;¹Cr für jede Zielzelle gezeigt. Die gleichen Tests wurden nach einer vorherigen Bindung des Anti-T3-mAb UCHT1 an die Effektorzellen für 30 min bei 0ºC durchgeführt (+ Anti-T3).
- Bild B. Hemmung der IDP2-Cytolyse von MOLT-4-Zielzellen durch verschiedene mAbs. IDP2- Zellen und &sup5;¹Cr-markierte MOLT-4-Zellen wurden zusarnmen in einem Verhältnis von 40:1 E:T in Gegenwart verschiedener Verdünnungen des Anti-MHC-Klasse-I-mAb W6/32 (Anti- HLA-A, B, C-monomorphe Determinante) (58), Anti-HLA-A, B, C (monomorphe Determinante) (59), 4E (Anti-HLA-B- und -C-Locus) (60), 131 (Anti-HLA-A-Locus) (61) oder Anti-MHC-Klasse-II-mAb LB3.1 (anti-DR-spezifisch) (62), Anti-Leu-10 (anti-DQ- spezifisch) (63) oder Anti-T3-mAb UCHT1 inkubiert. Höhere Verdünnungen wurden für Ascites-mAbs verwendet (W6/32, 4E, 131, LB3.1 und UCHT1), und geringere Verdünnungen wurden für im Handel erhältliche mAbs (Anti-Leu-10) oder Kulturüberstand (Anti-HLA-A, B, C) verwendet.
- Figur 10. Immunpräzipitation einer TCRγ-Kette, die aus Peer-Zellen erhalten wurde.
- Die Spuren 1-8 sind verschiedene Kulturüberstände von Hybridomen des gleichen Hybridom-Fusionsexperiementes; Spur 4 ist der monoklonale Anti-γ-Kette-Antikörper 34D12; Spur 9 ist Überstand von Kontrollkulturen der P3x63Ag8.653-Zellen; Spur 10 ist normales Maus-Kontrollserum.
- Figur 11. Immunpräzipitation einer TCRδγ-Kette, die aus IDP2-Zellen erhalten wurde.
- Die Spur 1 ist Überstand von Kontrollkulturen der P3x63Ag8.653-Zellen; die Spuren 2 und 5 sind Kulturüberstände mit dem monoklonalen Antikörper 4A1; Spur 3 ist Leu 4; Spur 4 ist normales Kaninchen-Kontrollserum
- IDP2-Zellen wurden unter Verwendung von Lactoperoxidase mit ¹²&sup5;I markiert und in 2% Triton-X100 aufgelöst. Bei den Spuren 4 und 5 wurde dieses Lysat 3 min in 1% SDS gekocht, mit 4 Volumina 1% Triton -X100 verdünnt und über Nacht bei 4ºC renaturiert. Das führte zur Trennung der TCRγ- und TCRδ-Ketten. Nach dieser Kettentrennung bewirkte der monoklonale Antikörper 4A1 eine spezifische Immunpräzipitation der TCRδ-Kette (Spur 5), wie es oben beschrieben wurde.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Polypeptid bereit, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist, wobei die Kette dadurch gekennzeichnet ist, daß sie:
- (a) in einem Komplex mit dem T3-Antigen assoziiert ist, wenn sie an der Oberfläche einer T- Zelle gefunden wird;
- (b) nicht mit Antikörpern gegen den α,β-T-Zell-Antigenrezeptor reaktiv ist;
- (c) nicht mit Antikörpern gegen die γ-Kette des T-Zell-Antigenrezeptors reaktiv ist; und
- (d) in einem Komplex mit einem zweiten Polypeptid assoziiert ist, wenn sie an der Oberfläche einer T-Zelle gefunden wird, wobei das genannte zweite Polypeptid mit Antikörpern gegen die γ-Kette des T-Zell-Antigenrezeptors reaktiv ist.
- Dieses Polypeptid kann wenigstens eine ketteninterne, kovalente Disulfid-Verknüpfung aufweisen. Das Polypeptid kann eine δ-Kette umfassen mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000 Dalton, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von 5% 2-Mercaptoethanol. Das Polypeptid kann ein δ-Ketten- Polypeptid eines humanen T-Zell-Antigenrezeptors sein.
- Eine Substanz, die in der Lage ist, spezifisch einen Komplex mit wenigstens einem Polypeptid der Erfindung auszubilden, wird ebenfalls durch die Erfindung bereitgestellt. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist die Substanz in der Lage, einen Komplex mit einem δ-Ketten- Polypeptid eines T-Zell-Antigenrezeptors auszubilden. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Substanz in der Lage, einen Komplex mit mehr als einem δ-Ketten-Polypeptid eines T-Zell-Antigen-rezeptors auszubilden. Die Substanz kann ein Antikörper sein. Der Antikörper kann ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper sein.
- Es wird auch ein Verfahren zum Nachweis von T-Zellen bereitgestellt, von denen jede ein Polypeptid der Erfindung aufweist, das das In-Kontakt-Bringen einer Probe, die T-Zellen enthält, mit einem Antikörper umfaßt, der in der Lage ist, einen Komplex mit dem Polypeptid zu bilden, so daß ein Komplex zwischen dem Antikörper und dem Polypeptid gebildet wird. Diese Komplexe werden nachgewiesen und dadurch T-Zellen, von denen jede ein δ-Ketten-Polypeptid eines T- Zell-Antigenrezeptors aufweist.
- Demgemäß sind bei einer Ausführungsform der Erfindung δ-Ketten-Polypeptide des T-Zell- Antigenrezeptors auf der Oberfläche der T-Zellen vorhanden. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die δ-Ketten-Polypeptide des T-Zell-Antigenrezeptors im Cytoplasma der T- Zellen vorhanden.
- Das Verfahren kann durch das Ausbilden von Komplexen mit einem spezifischen δ-Ketten-Polypeptide des T-Zell-Antigenrezeptors durchgeführt werden. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das spezifische Polypeptid nur in Suppressor-T-Zellen vorhanden.
- Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in einem Individuum bereit. Im Rahmen dieser Anmeldung bedeutet Immunsystem-Anomalie einen Zustand eines immunologischen Ansprechens auf Antigene, der durch eine erhöhte oder erniedrigte Immunantwort im Vergleich zu einer normalen Immunantwort oder einer Standard- Immunanwort gekennzeichnet ist.
- Dementsprechend umfaßt die Immunsystem-Anomalie, ohne darauf beschränkt zu sein, Immunschwäche-Zustände und -Erkrankungen, z.B. das erworbene Immundefektsyndrom oder angeborene Immunschwächen und Hyperimmunitäts-Zustände und -Erkrankungen, z.B. Allergien und Heuschnupfen.
- Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen in einer Probe von dem Individuum;
- (b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit Substanzen, die in der Lage sind, Komplexe mit wenigstens einem Polypeptid der Erfindung auszubilden, so daß ein Komplex zwischen der Substanz und dem Polypeptid gebildet wird;
- (c) Bestimmen des Prozentsatzes an T-Zellen in der Probe, die das Polypeptid aufweisen; und
- (d) Vergleichen des so bestimmten Prozentsatzes mit dem Prozentsatz von T-Zellen, die das Polypeptid in einer Probe von einem normalen Individuum, das die Immunsystem- Anomalie nicht aufweist, aufweisen, wobei ein Unterschied bei den so bestimmten Prozentsätzen an T-Zellen einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt.
- Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist die Immunsystem-Anomalie Krebs. Bei dem Krebs kann es sich um eine Leukämie oder ein Lymphom handeln. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Immunsystem-Anomalie das erworbene Immundefektsyndrom. Bei noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Immunsystem-Anomalie die angeborene Immunschwäche. Und bei noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Immunsystem-Anomalie eine Autoimmunerkrankung.
- Das Individuum, bei dem die Immunsystem-Anomalie diagnostiziert wird, kann ein Tier sein. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das Individuum ein Mensch. Weiterhin kann die Probe von dem Individuum Blut oder Gewebe umfassen.
- Es wird noch ein weiteres Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie durch die Erfindung bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen, die ein Polypeptid der Erfindung aufweisen, in einer Probe von dem Individuum;
- (b) Bestimmen der Menge des Polypeptids in den T-Zellen, die das Polypeptid aufweisen; und
- (c) Vergleichen der so bestimmten Menge mit der Menge an Polypeptid in einer gleichen Anzahl von T-Zellen, die das Polypeptid aufweisen, in einer Probe von einem normalen Individuum, das die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei der so bestimmten Menge einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt.
- Das Individuum, bei dem die Immunsystem-Anomalie diagnostiziert wird, kann ein Tier sein. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das Individuum ein Mensch. Weiterhin kann die Probe von dem Individuum Blut oder Gewebe umfassen.
- Es wird ein weiteres Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in einem Individuum bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen in einer Probe des Individuums des Verhältnisses der Anzahl der T-Zellen, die ein Polypeptid der Erfindung aufweisen, verglichen mit der Anzahl an T-Zellen, die einen Oberflächenmarker aufweisen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus T3; T4; T8; und dem α,β-T-Zell-Antigenrezeptor besteht; und
- (b) Vergleichen des Verhältnisses von (a) mit dem Verhältnis, das in einer Probe eines normalen Individuums bestimmt wurde, das die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei den so bestimmten Verhältnissen einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt.
- Das Individuum, bei dem die Immunsystem-Anomalie diagnostiziert wird, kann ein Tier sein. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das Individuum ein Mensch. Weiterhin kann die Probe von dem Individuum Blut oder Gewebe umfassen.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Nukleinsäuremolekül bereit, das für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, das insbesondere eine δ-Kette mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000 Dalton aufweist, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von 5% 2-Mercaptoethanol. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das Molekül ein DNA-Molekül. Weiterhin wird ein Nukleinsäuremolekül bereit-gestellt, das für ein δ-Ketten-Polypeptid eines T-Zell-Antigenrezeptors der Erfindung kodiert.
- Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung bereit, das, in Form eines isolierten Komplexes, mit einem Polypeptid assoziiert ist, das wenigstens ein antigenes Fragment einer γ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist, wobei die γ-Kette dadurch gekennzeichnet ist, daß sie:
- (a) in einem Komplex mit dem T3-Antigen assoziiert ist, wenn sie an der Oberfläche einer T- Zelle gefunden wird;
- (b) nicht mit Antikörpern gegen die α- oder β-Kette des α,β-T-Zell-Antigenrezeptors reagiert; und
- (c) mit einem Antikörper gegen die γ-Kette des T-Zell-Antigenrezeptors reagiert.
- Die γ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors kann ein Molekulargewicht von etwa 55 000 Dalton, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von 5% 2-Mercaptoethanol, aufweisen. Das γ-Ketten-Polypeptid kann eine Peptidsequenz mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 31 000 bis etwa 40 000 Dalton aufweisen. Das γ-Ketten-Polypeptid kann ein γ-Ketten-Polypeptid eines humanen T-Zell-Antigenrezeptors sein.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Substanz bereit, die in der Lage ist, spezifisch einen Komplex mit einem Komplex auszubilden, wie er oben definiert wurde, wobei die Substanz spezifisch an das Polypeptid bindet, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell- Antigenrezeptors ist.
- Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist die Substanz in der Lage, spezifisch einen Komplex mit einem γ,δ-T-Zell-Antigenrezeptor auszubilden. Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Substanz in der Lage, spezifisch einen Komplex mit mehr als einem γ,δ-T-Zell- Antigenrezeptor auszubilden. Die Substanz kann ein Antikörper sein. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Substanz ein monoklonaler Antikörper.
- Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die eine Substanz umfaßt, die in der Lage ist, einen Komplex mit einem Komplex auszubilden, wie er oben definiert wurde, für die Verwendung bei der Diagnose einer Immunsystem-Anomalie.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von T-Zellen bereit, von denen jede einen Komplex aufweist, wie er oben definiert wurde, das das In-Kontakt-Bringen von T-Zellen mit einer Substanz, die in der Lage ist, einen Komplex mit dem Komplex auszubilden, so daß ein zweiter Komplex gebildet wird, den Nachweis eines derartigen zweiten Komplexes und auf diese Weise den Nachweis solcher T-Zellen umfaßt, bei denen die Substanz spezifisch an das Polypeptid bindet, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell- Antigenrezeptors ist.
- Der erste Komplex kann auf der Oberfläche oder im Cytoplasma der T-Zellen vorliegen. Der Komplex mag nur in Suppressor-T-Zellen vorhanden sein.
- Das Individuum, bei dem die Immunsystem-Anomalie diagnostiziert wird, kann ein Tier sein. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das Individuum ein Mensch. Weiterhin kann die Probe von dem Individuum Blut oder Gewebe umfassen.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in einem Individuum bereit, wobei das Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen in einer Probe des Individuums;
- (b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit Substanzen, die in der Lage sind, einen zweiten Komplex mit wenigstens einem Komplex auszubilden, wie er oben definiert wurde, so daß ein zweiter Komplex zwischen der Substanz und dem Komplex gebildet wird;
- (c) Bestimmen des Prozentsatzes an T-Zellen in der Probe, die den zweiten Komplex aufweisen; und
- (d) Vergleichen des so ermittelten Prozentsatzes mit dem Prozentsatz von T-Zellen, die den zweiten Komplex in einer Probe eines normalen Individuums, das die Immunsystem- Anomalie nicht aufweist, aufweisen, wobei ein Unterschied bei den Prozentsätzen der so bestimmten T-Zellen einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt;
- wobei die Substanzen spezifisch an das Polypeptid binden, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist.
- Das Individuum, bei dem die Immunsystem-Anomalie diagnostiziert wird, kann ein Tier sein. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das Individuum ein Mensch. Weiterhin kann die Probe von dem Individuum Blut oder Gewebe umfassen.
- Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem- Anomalie in einem Individuum bereit, wobei das Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen, die einen Komplex aufweisen, wie er oben definiert wurde, in einer Probe des Individuums, wobei die Anzahl von T-Zellen, die einen Komplex aufweisen, wie er oben definiert wurde, dadurch bestimmt wird, daß man das Polypeptid in dem Komplex nachweist, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T- Zell-Antigenrezeptors ist;
- (b) Bestimmen der Menge des Komplexes in den T-Zellen, die den Komplex aufweisen, durch Bestimmen der Menge des Polypeptids in dem Komplex, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist; und
- (c) Vergleichen der so ermittelten Menge mit der Menge des Komplexes in einer gleichen Anzahl von T-Zellen, die den Komplex aufweisen, in einer Probe von einem normalen Individuum, das die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei der so ermittelten Menge einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt.
- Das Individuum, bei dem die Immunsystem-Anomalie diagnostiziert wird, kann ein Tier sein. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das Individuum ein Mensch. Weiterhin kann die Probe von dem Individuum Blut oder Gewebe umfassen.
- Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem- Anomalie in einem Individuum bereit, wobei das Verfahren umfaßt:
- (a) Bestimmen in einer Probe des Individuums das Verhältnis der Zahl von T-Zellen, die einen Komplex aufweisen, wie er oben definiert wurde, im Vergleich mit der Zahl an T-Zellen, die einen Oberflächenmarker aufweisen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus T3; T4; T8 und dem α,β-T-Zell-Antigenrezeptor besteht; und
- (b) Vergleichen des Verhältnisses gemäß (a) mit dem Verhältnis, das in einer Probe von einem normalen Individuum bestimmt wurde, das die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei den so bestimmten Verhältnissen einen Hinweis auf die Immunsystem-Anomalie darstellt;
- wobei die Anzahl von T-Zellen, die einen Komplex aufweisen, wie er oben definiert wurde, dadurch bestimmt wird, daß man das Polypeptid in dem Komplex nachweist, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist.
- Das Individuum, bei dem die Immunsystem-Anomalie diagnostiziert wird, kann ein Tier sein. Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist das Individuum ein Mensch. Weiterhin kann die Probe von dem Individuum Blut oder Gewebe umfassen.
- Die verschiedenen, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Verfahren zur Diagnose von Anomalien und zum Nachweis von T-Zellen basieren auf den neuartigen Polypeptiden und Substanzen, die in der Lage sind, Komplexe mit diesen Polypeptiden zu bilden, wie oben ausführlicher beschrieben wurde. Die Verfahren verwenden Verfahren für den Nachweis und die Quantifizierung von T-Zellen, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf, Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und Autoradiographie, welche den Fachleuten, für welche diese Erfindung bestimmt ist, gut bekannt sind.
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
- "Triton", "Nonidet" und "Tris" sind Warenzeichen.
- Vitale Lymphozyten wurden durch Ficoll-Hypaque-Dichtezentrifugation isoliert und mit 0,5 µg eines spezifischen monoklonalen Antikörpers, z.B. WT31 (28, 29) oder OKT3, OKT4 oder OKT8 (Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan, NJ) 30 min bei 4ºC markiert. Nach dem Waschen wurden die Zellpellets erneut mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierten Ziege-Anti-Maus- IgG(ab)'&sub2;-Fragmenten markiert. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungsanalysen (FACS-Analysen) wurden auf einem Ortho-Cytofluorograph oder einem Coulter-Epics -Gerät wie kürzlich beschrieben durchgeführt (37). Spezifisch markierte positive Zellen wurden bezüglich eines negativen Kontrollprofils für jede Zellinie (markiert mit einem unspezifischen monoklonalen Antikörper als Kontrolle) bestimmt. Zellen, die Kanalnummern mit Fluoreszenz-Intensitäten aufwiesen, die oberhalb des Schnittes des negativen Kontrollprofils mit der Basislinie lagen, wurden als positiv gezählt, und der prozentuale Anteil positiver Zellen wurde bezüglich der Gesamtzahl der gezählten Zellen bestimmt.
- Alle IL-2 abhängigen Zellinien wurden in vitro in Medium gezüchtet, das aus RPMI-1640, 10% huma-nem Serum und konditioniertem Medium bestand und das 2-5 Einheiten Interleukin-2 enthielt, wie kürzlich beschrieben (34), gezüchtet.
- Alloantigen-aktivierte (allo-aktivierte) Kulturen wurden in wöchentlichen Intervallen mit bestrahlten allogenen peripheren Blutlymphozyten stimuliert. Durch Mitogen, z.B. Phytohämagglutinin (PHA), aktivierte Linien wurden mit einer 1:1000-Verdünnung von PHA (Difco, Detroit, MI) zu Beginn der Kultivierung stimuliert.
- Immunpräzipitate aus ¹²&sup5;I-markierten Lymphozyten-Lysaten wurden durch Natriumlaurylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Die radioiodierten T-Leukämie-Zellinien HPB-MLT und Jurkat, die HTLV-1 transformierte Zellinie ANITA und ruhende periphere Blutlymphozyten wurden in 1%igem Triton -X-100 (TX-100) aufgelöst und mit einem Kontrollantikörper, normalem Mausserum (NMS) oder einem Framework-Antikörper gegen TCRα,β, d.h. F1, immunpräzipitiert (54). Der monoklonale Antikörper βF1 wurde gemäß Standardprozeduren hergestellt (46, 47, 52). Milzzellen von Mäusen, die mit gereinigtem TCRα,β, wie in (28) beschrieben, immunisiert worden waren, wurden für die Fusionsexperimente verwendet. Ein positiver Klon, βF1, wurde durch Immunpräzipitation mit T-Zell-Linien und peripheren Blutlymphozyten, wie oben beschrieben, erhalten.
- ¹²&sup5;I-markierte Lymphozyten wurden in 0,1% TX-100 aufgelöst und mit NMS, dem Anti-T3- Antikörper UCHT-1 (40) und einem Framework-Antikörper gegen TCR, d.h. WT31, immunpräzipitiert. Die Effizienz der Immunpräzipitation mit WT31 war bei den niedrigeren TX-100- Konzentrationen, die hier eingesetzt wurden, verbessert, und der monoklonale Antikörper 187.1 (53) wurde als ein zweiter Antikörper verwendet.
- Eine Zweifarben-FACS-Analyse normaler adulter peripherer Blutlymphozyten wurde unter Verwendung eines monoklonalen Anti-TCRα,β-Antikörpers und eines monoklonalen Anti-T3- Antikörpers durchgeführt. Periphere Blutlymphozyten wurden zuerst mit einem FITC-konjugierten monoklonalen Anit-T3-Antikörper (OKT3) markiert und dann mit einem monoklonalen Biotinyl- anti-TCRα,β-Anti-körper (βF1), gefolgt von Phycoerythrin-konjugiertem Avidin (PE-Avidin, Becton Dickinson, Mt. View, CA).
- Vitale Lymphozyten wurden für die SDS-PAGE- und FACS-Analysen durch Ficoll-Hypaque- Dichtezentrifugation isoliert. Für die SDS-PAGE-Analyse wurden Lymphozyten mit Hilfe der Lactoperoxidase-Technik radioiodiert, in 1% TX-100 aufgelöst und unter Verwendung von 1 Mikrogramm eines spezifischen Antikörpers, d.h. des monoklonalen Antikörpers βF1 oder des monoklonalen Antikörpers UCHT-1 oder 1 µl NMS immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden dann durch 10,5%-SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Die ¹²&sup5;I- markierten Moleküle wurden durch Autoradiographie wie kürzlich beschrieben (28) sichtbar gemacht.
- Die Zweifarben-cytofluorographische Analyse wurde durchgeführt, indem zunächst mit einem monoklonalen FITC-OKT3-Antikörper 45 min bei 4ºC markiert wurde. Nach dem Waschen wurden die Lymphozyten 15 min bei 23ºC in 1% Paraformaldehyd fixiert, dann 5 min bei -20ºC in 70% Ethanol in Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen mit dem monoklonalen Biotinyl-βF1-Antikörper, gefolgt von PE-Avidin, markiert. Die Analyse wurden auf einem Ortho Cytofluorograph (Ortho Diagnostic Systems Inc., Westwood, MA) durchgeführt.
- Die IDP1-Zellinie 2 (WT31&spplus;) und die Zellinie 3 (WT31&supmin;) wurden, wie oben beschrieben, ¹²&sup5;I- markiert. Die radioiodierten intakten Lymphozyten wurden dann entweder durch Inkubation in PBS (pH 8), das 50 Mikrogramm/ml Dithio-bis-succinimidyl-propionat (DSP) enthielt, quervernetzt, oder sie wurden scheininkubiert. Die Zellen wurden dann in 1% TX-100 aufgelöst und, wie kürzlich beschrieben (12), immunpräzipitiert. T3-assoziierte Moleküle (Mr 40 000-55 000) in den Anti-T3-Immunpräzipitaten wurden in geringer Menge in den nicht quervernetzten Proben und in höherer Menge in den quervernetzten Proben nachgewiesen.
- Die IDP2-Zellinie 7 (88% WT31&supmin;T3&spplus;) wurde ¹²&sup5;I-markiert und mit DSP behandelt oder scheinbehandelt. Immunpräzipitationen wurden unter Verwendung von NMS, des monoklonalen Anti- T3-Antikörpers UCHT-1 und des monoklonalen Anti-TCR-α,β-Antikörpers βF1 durchgeführt, entweder mit einer oder ohne eine vorherige(n) Entfernung von TCRα,β-Molekülen mit dem monoklonalen Antikörper βF1. Ein geringer Anteil an radioaktiv markiertem TCR-α,β wurde in Proben gefunden, die nicht vorgereinigt worden waren, aber nicht in Proben, die mit βF1 vorgereinigt waren.
- Die IDP2-Zellinie 5 (WT31&spplus;+T3&spplus;) und die Zellinie 7 (88% WT31&supmin;T3&spplus;) wurden ¹²&sup5;I-markiert, in 1% TX- 100 aufgelöst und unter Verwendung von NMS oder des monoklonalen Anti-T3-Antikörpers UCHT-1 immunpräzipitiert. Die schwere T3-Untereinheit (Mr 27 000) erschien auf diesen zwei Zellinien ähnlich zu sein, nicht jedoch die leichten T3-Untereinheiten (Mr 19 000-25 000).
- Die ¹²&sup5;I-Markierung, das Auflösen in 1% TX-100, die Immunpräzipitation und die Sichtbarmachung nach der 10,5%-SDS-PAGE-Analyse durch Autoradiographie wurden wie kürzlich beschrieben (28) durchgeführt. Die chemische Quervernetzung wurde 30 min bei 23ºC auf intakten radioaktiv markierten Lymphozyten unter Verwendung von DSP (50 Mikrogramm/ml) in PBS (pH 8), wie kürzlich beschrieben (12), durchgeführt. Nach der Immunpräzipitation wurden alle Proben mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von 5% 2-Mercaptoethanol untersucht, wodurch sowohl die Disulfidbrücken zwischen den Proteinuntereinheiten als auch die chemische Quervernetzung durch das DSP gespalten wurden.
- Die aus der IDP2-Zellinie 6 (WT31&supmin;) und der leukämischen T-Zell-Linie HPB-MLT isolierte Gesamt-RNA (15 Mikrogramm) wurde auf einem 1,5%igem Agarosegel, das 2,2 M Formaldehyd enthielt, fraktioniert, auf Nitrocellulose übertragen und mit TCRα-, TCRβ- und TCRγ-Sonden hybridisiert.
- Die aus der IDP2-Zellinie 5 (WT31&spplus;T3&spplus;), der IDP2-Zellinie 7 (88% WT31&supmin;T3&spplus;) und HPB-MLT-Zellen isolierte Gesamt-RNA (3 Mikrogramm) wurde wie oben beschrieben analysiert.
- Die RNA-Präparation, die Elektrophorese, die Übertragung auf Nitrocellulose und die Hybridisierung mit ³²P-markierten, einer Nick-Translation unterzogenen Sonden (1-3 x 10&sup8; cpm/Mikrogramm) erfolgte wie kürzlich beschrieben (41). Sonden für die α-Ketten waren entweder die humanen cDNA-Klone pGA5 (8) oder L17α (42). Sonden für die β-Ketten waren entweder die humanen cDNA-Klone 12A1 (43) oder L17 (43). Die Sonde für die γ-Kette war ein EcoRI bis Accl-Fragment, das aus dem humanen cDNA-Klon Tγ-1 (36) stammte. Radioaktive Banden wurden durch Autoradiographie mit Empfindlichkeitserhöhung sichtbar gemacht. Alle Sonden wurden bis zu ähnlicher spezifischer Aktivität markiert, und es werden identische Expositionszeiten dargestellt.
- Die in TX-100 aufgelöste, ¹²&sup5;I-markierte IDP2-Zellinie 7 (88% WT31&supmin;T3&spplus;) wurde denaturiert (siehe unten) und dann mit NMS oder normalem Kaninchenserum und mit Anti-Vγ-Peptid-Serum oder Anti-Cγ-Peptid-Serum immunpräzipitiert. Sowohl in der Anti-Vγ- als auch der Anti-Cγ- Immunpräzipitation wurde eine spezifische Bande mit einem Mr 55 000 beobachtet. Die zusätzliche Bande bei Mr 90 000 wurde nicht reproduzierbar in den Anti-Cγ-Immunpräzipitationen beobachtet (siehe unten).
- Die mit DSP-quervernetzten nativen Lysate (1% TX-100) aus der ¹²&sup5;I-markierten IDP2-Zellinie 7 wurden mit NMS oder mit dem monoklonalen Anti-T3-Antikörper UCHT-1 immunpräzipitiert. Alternativ wurden die Lysate denaturiert (wie unten beschrieben) und entweder mit normalem Kaninchenserum oder mit Anti-Cγ-Peptid-Serum immunpräzipitiert.
- Ein zusätzliches Aliquot des Lysats wurde einer zweistufigen Immunpräzipitation unterworfen. Polypeptide wurden mit dem monoklonalen Anti-T3-Antikörper UCHT-1 immunpräzipitiert und von dem Immunabsorbens unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen eluiert, um die DSP-Quervernetzung aufzubrechen. Die Immunpräzipitation aus diesem Eluat wurde dann unter Ver-wendung des Anti-Cγ-Peptid-Serums durchgeführt.
- Die ¹²&sup5;I-Markierung, das Auflösen in 1% TX-100 und die Immunpräzipitation wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Native Lysate (1% TX-100) wurden durch Zugabe von SDS (Endkonzentration 1%) und Dithiothreitol (Endkonzentration 2 mM), gefolgt von einem Erhitzen der Mischung für 5 min bei 68ºC, denaturiert. Nach dem Abkühlen wurde Iodacetamid (Endkonzentration 20 mM) zugegeben, und die Proben wurden durch Zugabe von 4 Volumina an 1,5% TX-100 in Tris-gepufferter Saline (pH 8) verdünnt. Das zunächst erhaltene Immunpräzipitat im Experiment wurde denaturiert und anschließend teilweise renaturiert (28). Proben wurden mit 10 Mikroliter Anti-Cγ- oder Anti-Vγ-Peptid-Serum, 1 Mikrogramm UCHT-1 oder 1 Mikroliter NMS oder normalem Kaninchenserum immunpräzipitiert und durch 10,5%-SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (5% 2-Mercaptoethanol) analysiert.
- Peptide, die den abgeleiteten Aminosäuresequenzen für Vγ oder Cγ entsprachen(die Reste sind im folgenden Abschnitt "Experimentelle Ergebnisse" beziffert) wurden mit einer Beckman-990- Peptidsynthese-Apparatur gemäß dem Verfahren von Erickson und Merrifield (44) synthetisiert. Die Reinheit der Peptide wurde durch Hochdruckflüssigchromatographie bestimmt, und die Peptidsequenz wurde durch Aminosäureanalyse bestätigt. Die Peptide wurden an Lochschnecken-Hämocyanin (KLH) in einem Verhältnis von 50 Peptiden pro KLH-Molekül gekoppelt (45). Mäuse und Kaninchen wurden mit den Vγ- bzw. Cγ-Peptiden immunisiert. Die Tiere wurden in 3wöchigen Intervallen injiziert, und die Antiseren wurden hinsichtlich einer Bindungsreaktivität gegenüber Peptid-KLH- und Peptid-Rinderserumalbumin-Konjugaten untersucht, um die Anwesenheit von peptidspezifischen Antikörpern zu ermitteln.
- Monoklonale Antikörper gegen die γ-Kette wurden durch Standardverfahren, wie es in (47, 50) beschrieben wurde, hergestellt. BALB/c-Mäuse wurden mit dem KLH-gekoppelten Peptid gegen die variable Region des γ-Ketten-Peptids, das oben beschrieben wurde, mittels des Verfahrens von Erickson und Merrifield (44) immunisiert. Nach vier Immunisierungen in zweiwöchigen Abständen wurden Milzzellen mit P3-X63-AgUI-Myelomzellen fusioniert. Positive Hybridomklone wurden mittels des Enzymimmunoassays (EIA), der in (48) beschrieben wurde, gescreent und identifiziert.
- DNA-Sequenzen des TCRδ-Gens können isoliert und bestimmt werden durch Strategien, die zur Isolierung des TCRβ-Gens, wie es in (49, 50) beschrieben wurde, verwendet wurden. Kurz gesagt kann die Aminosäuresequenz des TCRδ-Gens nach der Isolierung des TCRδ-Polypeptids, die im folgenden beschrieben wird, bestimmt werden. Nach der Bestimmung der Aminosäuresequenz können kurze synthetische DNA-Sequenzen unter Verwendung einer im Handel erhältlichen DNA-Synthese-Apparatur (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) hergestellt werden. Die synthetischen DNA-Sequenzen können als Sonden für die Isolierung der kompletten Sequenz der DNA aus einer cDNA-Library von Zellinien bestimmt werden, die das TCRδ-Polypeptid enthalten. Die komplette Primärstruktur des Proteins kann dann bestimmt werden (51).
- Monoklonale Antikörper gegen das δ-Polypeptid können durch Standardverfahren (47, 50) erhalten werden. Peptide, die sich vom TCRδ-Polypeptid ableiten, können über Nukleinsäuresequenzen, die durch die oben beschriebenen Verfahren bestimmt wurden, hergestellt werden. Verfahren für die Auswahl solcher Peptide, die für eine Immunisierung nützlich sind, wurden im Detail beschrieben (55, 56, 57).
- Gegen γ,δ-Komplexe gerichtete monoklonale Antikörper können gemäß veröffentlichten Verfahren (47, 50) hergestellt werden. γ,δ-Komplexe können aus den oben beschriebenen T-Zell- Linien isoliert und zur Verwendung von Balb/c-Mäusen, wie in kürzlich veröffentlichten Verfahren (28) beschrieben wurde, verwendet werden. Alternativ können BALB/c-Mäuse mit Zellinien (z.B. der IDP1-Zellinie oder der IDP2-Zellinie) immunisiert werden.
- Methoden für die Fusion, Erzeugung und Züchtung von Hybridomzellinien wurden in großem Umfang publiziert und sind dem Fachmann gut bekannt. Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper produzieren, die gegen spezifische TCRγ,δ-Zellinien gerichtet sind, aber die nicht mit anderen T- Zell-Linien kreuzreagieren, können ausgewählt und erhalten werden.
- Vitale Lymphozyten wurden durch eine Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation isoliert, und 2 x 10&sup7; Zellen wurden mit Hilfe der Lactoperoxidasetechnik wie beschrieben (28) radioiodiert. Die markierten Zellen wurden in 5 ml TBS (10 mM Tris pH 8, 140 mM NaCl) mit 0,3% 3-[(3- Cholamidopropyl)dimethylammonium]-1-propansulfonat (CHAPS), das die TCR-T3-Assoziation intakt läßt (64) und das 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 8 mM Iodacetamid (IAA) enthielt, lysiert. Die Immunpräzipitation wurde unter Verwendung von fixierten Staphylococcus aureus Cowan-I (SACl) wie beschrieben (12) durchgeführt, und die Immunkomplexe wurden 5 x in TBS, das 0,1% Triton X-100 (TX-100) enthielt, gewaschen. Reduzierte Proben wurden in 2 mM Dithiothreitol (DTT) gekocht, und alle Proben wurden vor der Analyse durch SDS-PAGE 10 min bei 23ºC in 10 mM IAA inkubiert. Immunpräzipitationen unter Verwendung von Anti-Cγ-Serum wurden mit 1 %-TX-100-Lysaten durchgeführt, die zur Entfernung des IAA dialysiert und dann durch Zugabe eines Zehntel Volumens an Natriumlaurylsulfat (SDS), das 3 mM DTT enthielt, unter 3minütigem Kochen denaturiert. Nach teilweiser Renaturierung durch Zugabe von 4 Volumina an 1,5% TX-100 in TBS, das 30 mM IAA enthielt, wurde Anti-Cγ-Serum oder NKS zugegeben, und die Immunpräzipitate wurden vor der Analyse durch SDS-PAGE in TBS, das 0,5% TX-100, 0,5% Desoxycholat und 0,05% SDS enthielt, gewaschen. α-Ketten-spezifischer Ratten-anti-Maus-mAb 187.1 (15 µg) wurde als zweiter Antikörper zugegeben, um eine Protein-A- Bindung der IgGI-mAbs βF1, UCHT und P3 zu bewirken (53).
- Pro Spur wurden ungefähr 1,5 µg RNA geladen, die Sonden waren bis zu gleicher spezifischer Aktivität markiert, und es werden identische autoradiographische Expositionszeiten dargestellt. Die Größen der RNA-Moleküle wurden auf der Basis kürzlich veröffentlichter Längen für die TCRβ- und die TCRγ-Transkripte (36, 4) bestimmt.
- Nach der Radioiodierung mit Lactoperoxidase wurden die Lymphozyten mit 100 U Neuraminidase (Gibco) in Phosphat-gepufferter Sahne (PBS), 1 mg x ml&supmin;¹ Rinderserumalbumin und 1 mg x ml&supmin;¹ Glucose 90 min bei 23ºC inkubiert, in PBS gewaschen und in 0,3% CHAPS aufgelöst. Immunpräzipitate wurden wie in der Fig. 1 hergestellt, und NEPHGE (Ladungstrennung) wurde unter Verwendung von Ampholinen mit einem pH von 3,5-10 (LKB, Schweden) oder IEF unter Verwendung von Ampholinen mit einem pH von 3,5-10, 4-6 und 9-11 (2:15,5:1,5) durchgeführt, gefolgt von 10,5%-SDS-PAGE-Gels zur Trennung nach der Größe wie beschrieben (12). Die NEPHGE wurde durchgeführt (A, B), indem die iodierte IEF-Probe am sauren Ende aufgetragen wurde, während die IEF (C, D) 20 Stunden bei 400 V durchgeführt wurde, wobei die Probe am anderen (basischen) Ende aufgetragen wurde. Die Klammern schließen die T3-assoziierten Species ein. Die Zellen (2 x 10&sup7;) wurden 1 Stunde bei 37ºC in 4 ml Methionin-freiem RPMI 1640, dem 10% fötales Kälberserum zugesetzt waren, vorinkubiert. Es wurde ³&sup5;S-Methionin (250 µCi x ml&supmin;¹) zugegeben, und die Inkubation wurde 1 Stunde bei 37ºC fortgesetzt. Die Zellen wurden gesammelt, gewaschen und in 0,4 ml einer kochenden Lösung aus 1% SDS, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM PMSF und 10 mM IAA lysiert. Die Lysate wurden mit 1,6 ml 2,5%igem Nonidet-P40, 1% Gelatine, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 0,2 ml oder 1 mg x ml&supmin;¹ DNase, 0,5 mg x ml&supmin;¹ RNase, 0,5 M Tris-HCl (pH 7) und 50 mM MgCl&sub2; verdünnt und 2-4 Stunden bei 0ºC inkubiert. Nach einer 15minütigen Zentrifu-gation bei 12 000 x g zur Sedimentierung unlöslicher Zellbestandteile wurden Immunpräzipitationen mit Anti-γ-Serum unter Verwendung von Protein-A-Sepharose, die mit 1 % Gelatine vorinkubiert worden war, und eines Waschschrittes wie beschrieben (65) durchgeführt. Die Elution vom Immunabsorbens und die Behandlung mit Endo-H (Miles Scientific, Naperville, IL) erfolgten wie beschrieben (65). Die Proben wurden mit Antiserum durch zweidimensionale Gelelektrophorese unter Einsatz von NEPHGE in der ersten Dimension und 10%-SDS-PAGE in der zweiten Dimension, gefolgt von Fluorographie analysiert (66).
- Genomische DNA wurde wie beschrieben isoliert (BamHI oder EcoRI), auf 0,7% Agarose (BamHI-Verdau) oder 0,9% Agarose (EcoRI-Verdau) nach der Größe fraktioniert und wie beschrieben auf Nitrocellulose übertragen (67). Die Filter wurden mit einer nicktranslatierten ³²P- markierten HindIII-EcoRI-Jγ1,3-Sonde von 0,8 kb (20) oder mit einer EcoRI- HindIII-Cβ&sub2;-Sonde von 1,1 kb (68) hybridisiert. Die Filter wurden vor der Autoradiographie mit Empfindlichkeitserhöhung in 2x SSC und 0,1% SDS, gefolgt von 0,2% SSC und 0,1% SDS, bei 55ºC gewaschen.
- Die Cytolyseassays wurden in 96-Loch-Zellkulturplatten mit Rundboden durch &sup5;¹Cr-Markierung, Ernten und Berechnung der prozentualen spezifischen Freisetzung wie beschrieben (34) durchgeführt. IDP2- oder PBL-C1-Zellen wurden entweder 30 min bei 0ºC mit UCHT-1 (1: 300-Verdünnung) (+ Anti-T3) vorinkubiert und 3 x gewaschen oder scheininkubiert und mit den markierten Targetzellen zusammengegeben. Anti-HLA-Klasse-I- und -Klasse-II-mAbs und Anti-T3-mAb wurden in Löcher gegeben, die die &sup5;¹Cr-markierten MOLT4-Zellen enthielten, und nach 30 Minuten bei 0ºC wurden IDP2-Zellen in einem Verhältnis von 40:1 E:T zugegeben. Für alle Proben wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt, jedes Experiment wurde mindestens dreimal durchgeführt, und ein repräsentatives Experiment aus jeder Serie ist in der Fig. 9 dargestellt.
- Es wurde kürzlich von einem Framework-Mäuseantiserum berichtet (28), das die Mehrzahl der humanen TCRα,β-Moleküle erkennt. Später wurde ein monoklonaler Antikörper der Maus erhalten (46), der als Framework-1 (βF1) bezeichnet wurde und der reaktiv gegenüber gemeinsamen Determinanten auf der humanen TCRβ-Kette ist. Der monoklonale Antikörper βF1 reagiert mit der Mehrzahl der T3-positiven (T3&spplus;) humanen peripheren Blutlymphozyten (PBLs) und ist in der Lage, das TCRα,β-Heterodimer aus allen humanen T-Zell-Linien, die untersucht wurden und die α,β-T-Zell-Rezeptoren aufweisen und das T3-Glykoprotein exprimieren, immunzupräzipitieren. Immunpräzipitationen aus einer Reihe von T-Zell-Linien unter Verwendung dieses monoklonalen Antikörpers zeigen sowie diese Reaktivität sowie die Heterogenität der TCRα- und TCRβ-Untereinheiten von verschiedenen Rezeptoren (Fig. 1A). Wie das Framework- Antiserum (28) markiert dieser monoklonale Antikörper nicht die Oberfläche lebender T-Zellen, aber nach teilweiser Anlösung der Plasmamembran der Lymphozyten mit 70% Ethanol reagiert er spezifisch sowohl mit membranständigen als auch mit cytoplasmatischen T-Zell-Rezeptoren. Eine Doppelmarkierung humaner PBLs mit einem monoklonalen Fluorescein-Anti-T3-Antikörper und einem monoklonalen Biotinyl-βF1-Antikörper gefolgt von PE-Avidin zeigt, daß der monoklonale Antikörper βF1 95-97% der peripheren T3&spplus; Blutlymphozyten erkennt. Jedoch definiert er eindeutig eine kleine Population von T-Lymphozyten, die βF1-negativ (βF1&supmin;), aber T3&spplus; ist (Fig. 1C).
- Für einen zweiten monoklonalen Framework-Antikörper, der als WT31 bezeichnet wurde und von dem zunächst angenommen wurde, daß er das T3-Antigen erkennt (29), wurde kürzlich gezeigt, daß er mit einem gemeinsamen Epitop des humanen TCRα,β reagiert (30). Obwohl eine Doppelmarkierung mit einem monoklonalen Anti-T3-Antikörper (OKT3) und WT31 zeigte, daß jeder dieser monoklonalen Antikörper die Bindung des jeweils anderen blockiert, zeigte eine Einfarbenfluoreszenz, daß der WT31 typischerweise 1-3% weniger Zellen im peripheren Blut erkannte, als es monoklonale Anti-T3-Antikörper tun. Der monoklonale Antikörper WT31 bindet wirkungsvoll an die Oberfläche von T-Zellen (wie z.B. in FACS-Analysen) und ist in der Lage, das TCRα,β-Molekül, obwohl nicht besonders wirksam, aus radioaktiv markierten Detergenzlysaten immunzupräzipitieren (30) (Fig. 1B, Spur 3). Somit scheint es, daß der monoklonale Antikörper βF1 und der monoklonale Antikörper WT31 alle bis auf eine kleine Fraktion humaner peripherer Blutzellen, die T3&spplus; sind, erkennen, und daß sie eine Subpopulation definieren, die T3&spplus; ist, aber mit beiden dieser monoklonalen Framework-Antikörper gegen die TCRα,β-Moleküle nicht reagieren. Hinweise, daß die T3&spplus;-Lymphozyten, die nicht mit dem monoklonalen Antikörper βF1 reagieren, auch nicht mit dem monoklonalen Antikörper WT31 reagieren, werden unten gezeigt. Der WT31 wurde in erster Linie für FACS-Analysen verwendet, und der βF1 wurde in erster Linie für Immunpräzipitationsstudien verwendet.
- Bemühungen, die WT31&supmin;T3&spplus;-Population aus normalen adulten PBLs zu züchten, erwiesen sich als schwierig, da die WT31&spplus;T3&spplus;-Lymphozyten nach einer mitogenen Stimulation normalerweise die WT31&supmin;T3&spplus;-Zellen überwuchsen. Jedoch war die Züchtung der WT31&supmin;T3&spplus;-Population aus den PBLs von Patienten mit Immunschwäche erfolgreich. Der Immunschwäche-Patient 1 (IDP1) litt unter dem Lymphozytenmangel-Syndrom und zeigte keine Expression von MHC-Antigenen der Klasse II auf lymphoiden Zellen (31, 32), während der Immunschwäche-Patient 2 (IDP2) unter einem ektodermalen Dysplasie-Syndrom (33) litt und in vitro eine schwache proliferative Antwort auf Mitogene zeigte.
- Nach einer Aktivierung von PBLs des IDP1 mit Alloantigen und Kultivierung in konditioniertem Medium, das Interleukin-2 (IL-2) enthielt (34), wurde für die resultierende Zellinie gefunden, daß sie ungefähr zu 50% WT31&spplus;T3&spplus; und zu 50% WT31&supmin;T3&spplus; war (vgl. Tabelle I unten, Zellinie 1). Ein anschließendes Sortieren dieser Zellinie ergab homogene Populationen an WT31&spplus;T3&spplus;-Zellen und WT31&supmin;T3&spplus;-Zellen (vgl. Tabelle I unten, Zellinien 2 bzw. 3). TABELLE I % positiv Zellinien-Nr. Quelle Zellinienbeschreibung¹ sort frische PBL ¹Die Beschreibung der Zellinien gibt die Bedingungen der Aktivierung oder die Quelle der Lymphozyten an. Die sortierten WT31&spplus;- und WT31&supmin;-Zellen der Zellinien 2 und 3 (sort) wurden durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung der IDP1-Zellinie 1 erhalten.
- Zellinien wurden auch vom IDP2 erhalten. Für frische PBL des IDP2 zeigte sich, daß 63% der PBL T3&spplus; waren, und 1-3% weniger Zellen (61%) waren WT31&spplus;, was typisch für normale PBL ist (Tabelle I, Zellinie 4). Aktivierung dieser IDP2-PBL mit entweder Phytohämagglutinin (PHA) oder Alloantigen und Kultivierung in vitro mit konditioniertem Medium führte zu verschiedenen Zelllinien. Zu diesen gehörte eine homogene WT31&spplus;T3&spplus;-Zellinie (Tabelle I, Zellinie 5), eine homogene WT31&supmin;T3&spplus;-Zellinie (Tabelle I, Zellinie 6) und, in einem dritten Fall, eine Zellinie, die zu 88% WT31&supmin;T3&spplus; war (mit 12% kontaminierenden WT31&spplus;T3&spplus;-Zellen) (Tabelle I, Zellinie 7). Die WT31&supmin;T3&spplus;-Population enthielt sowohl T4&supmin;T8&spplus; als auch T4&supmin;T8&supmin; Zellen (Tabelle I, Zellinien 3, 6 und 7). Eine weitere Analyse des Phänotyps zeigte, daß diese Population T11&spplus; war, aber negativ für Marker natürlicher Killerzellen, wie z.B. Leu 7, Leu 11 und OKM1, und für den Marker T6 unreifer Thymozyten.
- Der monoklonale Antikörper βF1 definierte immunchemisch eine heterodimere Struktur auf der Oberfläche der ¹²&sup5;I-markierten WT31&spplus;T3&spplus;-IDP1-Lymphozyten (Fig. 2A, Spur 5), jedoch erkannte er nicht ein ähnliches Protein auf der WT31&supmin;T3&spplus;-Population des gleichen Individuums (Fig. 2A, Spur 11). Eine ähnliche Analyse von IDP2-Zellinien zeigte eine Spur von TCRα,β auf der zu 88% WT31&supmin;T3&spplus;-Zellinie 7 (Fig. 2B, Spur 2), in Übereinstimmung mit der 12%igen Kontamination mit den WT31&spplus;T3&spplus;-Zellen. Somit waren die WT31&supmin;T3&spplus;-Zellen, die anhand des Fehlens einer Reaktivität der Zelloberfläche mit dem monoklonalen Antikörper WT31 bei der FACS-Analyse identifiziert wurden, auch βF1&supmin;, wie anhand des Fehlens des TCRα,β bei der Immunpräzipitation bestimmt wurde. Alle WT31&spplus;T3&spplus;-und WT31&supmin;T3&spplus;-Zellinien exprimierten ähnliche Mengen an T3, wie durch FACS-Analyse und durch Immunpräzipitation mit einem monoklonalen Anti-T3-Antikörper festgestellt wurde (Fig. 2A, Spuren 3 und 9; Fig. 2C, Spuren 2 und 4). Jedoch war das T3-Molekül, das auf den WT31&supmin;βF1&supmin;T3&spplus;-Lymphozyten gefunden wurde, nicht identisch mit dem T3-Molekül, das auf den WT31&spplus;βF1&spplus;T3&spplus;-Zellen gefunden wurde, wie durch SDS-PAGE festgestellt wurde. Eine eindimensionale (Fig. 2C) und eine zweidimensionale Gelanalyse zeigte, daß der Unterschied der T3s auf die leichten T3-Untereinheiten beschränkt war, die reproduzierbar unterschiedliche Beweglichkeiten bei der SDS-PAGE aufwiesen (Fig. 2C, Pfeilspitze).
- Um zu bestimmen, ob die WT31&supmin;βF1&supmin;T3&spplus;-Population keine TCRα,β-Moleküle aufwies, oder ob sie alternativ TCRα,β-Moleküle exprimierte, die nicht mit diesen monoklonalen Antikörpern reagierten, wurde das Vorkommen von mRNAs, die für die TCRα- und TCR-β-Proteine kodierten, untersucht. ³²P-markierte cDNA-Klone, die für TCRα, TCRβ und TCRγ kodierten, wurden als Sonden in Northern Blots verwendet, die die gesamte zelluläre RNA aus den WT31&supmin;βF1&supmin;T3&spplus;- und WT31&spplus;βF1&spplus;T3&spplus;-IDP2-Zellinien und aus der Zellinie HPB-MLT enthielt, von der bekannt ist, daß sie mRNA für TCRα, TCRβ und TCRγ enthält. Es konnten keine TCRα- oder TCRβ-mRNA-Transkripte in der RNA aus der WT31&supmin;βF1&supmin;T3&spplus;-IDP2-Zellinie 6 gefunden werden (Fig. 3A, α-Sonde, Spur 1; oder β-Sonde, Spur 1), während eine Expression beider in der RNA aus der Zellinie HPB- MLT klar nachweisbar war (Fig. 3A, α-Sonde, Spur 2; und β-Sonde, Spur 2). Bemerkenswert ist, daß die TCRγ-mRNA in WT31&supmin;T3&spplus;-Zellen in Mengen vorhanden war, die denjenigen in der Zellinie HPB-MLT vergleichbar waren (Fig. 3A, γ-Sonde, Spuren 1 und 2). Somit enthielten die WT31&supmin;βF1&supmin;T3&spplus;-Lymphozyten keine TCRα- und TCRβ-mRNA. Anschließende Experimente mit Zellinien, die in erster Linie WT31&supmin;T3&spplus; waren, unterstützten diese Ergebnisse. Zum Beispiel ergab eine Northern- Blot-Analyse, die mit der IDP2-Zellinie 7 (88% WT31&supmin;T3&spplus;) durchgeführt und mit der IDP2-Zellinie 5 (WT31&spplus;T3&spplus;) verglichen wurde, sowie mit den HPB-MLT-Zellen nur eine Spur von TCRα- oder TCRβ-mRNA in den zu 88% WT31&supmin;T3&spplus;-Zellen (in Übereinstimmung mit der 12%igen Kontamination mit WT31&spplus;T3&spplus; Zellen) (Fig. 3B, Spur 2 für jede Sonde). Weiterhin lag die Mehrzahl der β-Transkripte, die gefunden werden konnten, bei 1,0 und nicht bei 1,3 kb und war wahrscheinlich nicht funktionell (35). Im Gegensatz dazu exprimierte die IDP2-Zellinie 5 (WT31+T3&spplus;) Mengen beider RNA-Species, die mit denen der HPB-MLT-Zellen vergleichbar waren (Fig. 3B, Spur 1 für jede Sonde). Jedoch zeigten sowohl die WT31&supmin;T3&spplus;- als auch die WT31&spplus;T3&spplus;- Zellinien, wie die WT31&supmin;T3&spplus;-Zellinie, die in der Fig. 3A gezeigt ist, Mengen an TCRγ-RNA, die mit denen der HPB-MLT-Zellen vergleichbar waren (Fig. 3B, γ-Sonde). Somit fehlten den WT31&supmin;T3&spplus;Zellen die α- und β-T-Zell-Rezeptor-mRNA (Northern Analyse) und die α- und β-T-Zell- Rezeptor-Proteine (Immunpräzipitation und FACS-Analyse). Das Vorkommen von TCRγ-mRNA in WT31&supmin;T3&spplus; Zellen, obwohl es konsistent mit einer TCRγ-Protein-Expression war, konnte nicht als starker Hinweis dafür verwendet werden, da viele humane Zellinien, die TCRγ-mRNA normaler Größe exprimieren, Transkripte der vollen Länge exprimieren können, die aufgrund einer defekten V-J-Verbindung aus dem Leseraster sind (36).
- Um zu bestimmen, ob Proteine, die den TCRα,β-Molekülen analog waren, auf den WT31&supmin;βF1&supmin;T3&spplus;- Zellen existierten, wurde die Technik der chemischen Quervernetzung verwendet. Diese Technik ist eingesetzt worden, um direkt die physikalische Assoziation der TCRα,β-Moleküle mit dem T3- Glykoprotein zu zeigen (12). Es wurde das bifunktionelle spaltbare Reagenz Dithio-bis-succinimidyl-propionat (DSP) verwendet, um ¹²&sup5;I-markierte Oberflächenproteine vitaler T-Lymphozyten querzuvernetzen. Nach der Quervernetzung wurden die Lymphozyten in einem nichtionischen Detergenz aufgelöst und mit einem monoklonalen Anti-T3-Antikörper immunpräzipitiert. Wie erwartet zeigten die WT31&spplus;βF1&spplus;T3&spplus;-Lymphozyten, daß die TCRα- und TCRβ-Ketten mit T3 quervernetzt waren. Zum Beispiel wurden TCRα,β-Moleküle und T3 in Immunpräzipitaten mit monoklonalem Anti-T3- oder βF1-Antikörper aus der quervernetzten IDP1-Zellinie 2 (WT31&spplus;T3&spplus;) (Fig. 2A, Spuren 4 und 6)) gefunden. Jedoch exprimierten sowohl die IDP1-Zellinie 3 (WT31&supmin;T3&spplus;) als auch die IDP2-Zellinie 7 (88% WT31&supmin;T3&spplus;) trotz des Fehlens einer Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper βF1 und des Fehlens von TCRα- oder TCRβ-mRNA zwei Proteinuntereinheiten (Mr 55 000 und 40 000), die spezifisch mit T3 quervernetzbar waren (Fig. 2A, Spur 10; Fig. 2B, Spur 6). Die Beweglichkeiten dieser T3-assoziierten Moleküle unterschieden sich deutlich von denjenigen der TCRα- und TCRβ-Ketten aus WT31&spplus;T3&spplus;-Zellinien (vgl. Fig. 2A, Spuren 4 und 10) oder Fig. 2B, Spuren 5 und 6).
- Da die IDP2-Zellinie 7 (88% WT31&supmin;T3&spplus;) 12% WT31&spplus;T3&spplus;-Zellen enthielt, auf die die geringen Immunpräzipitate, die mit βF1 beobachtet wurden, zurückzuführen sind (Fig. 2B, Spur 2), wurde das Lysat dieser Zellen mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers βF1 von TCRα,β-Protein vorgereinigt. Nach der Vorreinigung konnte kein restliches Material, das mit βF1 reagierte, festgestellt werden (Fig. 2B, Spuren 8 und 11). Wenn dieses mit βF1 vorgereinigte Lysat aus quervernetzten Zellen mit einem monoklonalen Anti-T3-Antikörper immunpräzipitiert wurde, konnten die Untereinheiten mit Mr 55 000 und 40 000 immer noch nachgewiesen werden (Fig. 2B, Spur 12).
- Da diese WT31&supmin;βF1&supmin;T3&spplus;-Zellinien nicht nachweisbare Mengen an TCRα- und TCRβ-mRNA aufweisen, können die Moleküle, von denen festgestellt wurde, daß sie auf ihren Zelloberflächen spezifisch mit T3 quervernetzt wurden, keine Proteine darstellen, die durch die bekannten TCRα- oder TCRβ-Gene kodiert werden.
- cDNA-Klone, die das sich umarrangierende humane TCRγ-Gen repräsentieren, würden für ein Polypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 40 000 Dalton kodieren (36). Im Gegensatz zum Mäuse-TCRγ-Gen, das keine N-Glykosylierungsstellen aufweist (15), enthält das humane TCRγ-Gen 5 potentielle Stellen för N-Glykosylierungen, von denen 4 in der konstanten Region lokalisiert sind (36). Da ein TCRγ-Protein bis jetzt nicht isoliert wurde ist es nicht bekannt, wie viele dieser potentiellen Stellen verwendet werden können. Jedoch wird ein vollständig glykosyliertes humanes TCRγ-Protein ein Mr von ungefähr 55 000 aufweisen. Die schwere Kette der nicht-α-nicht-β-T3-assoziierten Untereinheiten, die auf den WT31&supmin;βF1&supmin;T3&spplus;-IDP1- und IDP2- Zellinien nachgewiesen wurde, hat auf der SDS-PAGE eine relative Beweglichkeit von 55 000 Dalton (Fig. 2A und 2B).
- Um zu bestimmen, ob diese T3-assoziierte schwere Kette mit dem TCRγ-Protein serologisch kreuzreagierte oder mit ihm identisch war, wurden Antiseren gegen ein synthetisches Peptid gewonnen, das folgende Sequenz hatte:
- RTKSVTRQTGSSAEITC
- /was einen Abschnitt von 17 Aminosäuren der Reste 5-21 der variablen Region repräsentierte; Anti-Vγ-Peptid-Serum), sowie gegen ein synthetisches Peptid, das folgende Sequenz hatte:
- DKQLDADVSPKPTIFLPSIA
- /was einen Abschnitt von 20 Aminosäuren der Reste 117-136 der konstanten Region repräsentierte; Anti-Cγ-Peptid-Serum), der TCRγ-Aminosäuresequenz, die von einem humanen cDNA- Klon abgeleitet worden war (36). Sowohl das Anti-Cγ-Peptid-Serum als auch das Anti-Vγ-Peptid- Serum immunpräzipitierten ein Molekül mit Mr 55 000 aus dem denaturierten Lysat ¹²&sup5;I-markierter WT31&supmin;βF1&supmin;T3&spplus;-Zellen (Fig. 4A, Spuren 2 und 4). Derartige Moleküle konnten aus Lysaten ¹²&sup5;I-markierter HPB-MLT-Zellen, die nur nichtfunktionelle TCRγ-mRNA exprimieren (36), nicht immunpräzipitiert werden.
- Um zu zeigen, daß das Molekül mit 55 000 Dalton, das durch die Anti-Cγ- und Anti-Vγ-Peptid- Seren immunpräzipitiert wurde, tatsächlich die aus der schweren Kette bestehende Untereinheit war, die mit T3 quervernetzt wurde, wurde ein zusätzliches Experiment durchgeführt (Fig. 4B). Eine Probe des mit DSP quervernetzten Lysats der WT31&supmin;βF1&supmin;T3&spplus;-Zellen wurde zuerst mit einem monoklonalen Anti-T3-Antikörper immunpräzipitiert, das wiederum die Anwesenheit von Untereinheiten mit Mr 55 000 und 40 000 demonstrierte, die mit T3 assoziiert waren (Fig. 4B, Spur 2). Parallel dazu wurde ein weiteres Aliquot des quervernetzten Lysats mit einem monoklonalen Anti- T3-Antikörper immunpräzipitiert, und die immunpräzipitierten, mit T3 quervernetzten Polypeptide wurden unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, um die DSP-Quervernetzung aufzubrechen, vom Immunabsorbens eluiert. Dieses Eluat wurde dann erneut mit Anti-Cγ-Peptid- Serum präzipitiert (Fig. 4B, Spur 2). Die Untereinheit mit Mr 55 000, die mit T3 quervernetzt war, wurde mit dem Anti-γ-Peptid-Serum erneut präzipitiert (Fig. 4B, Spur 5), was deutlich machte, daß die Untereinheiten mit Mr 55 000, die durch diese beiden Ansätze definiert wurden, identisch waren.
- Immunpräzipitationen von Lysaten oberflächeniodierter IDP2-Lymphozyten unter Verwendung von Anti-T3-mAb (unter Bedingungen, die die TCR-Untereinheiten nicht vom T3 dissoziieren, vgl. Fig. 5), ergaben zwei Species (55 K und 40 K) zusätzlich zu den T3-Untereinheiten (Fig. 5A). Dieses Ergebnis ist identisch mit demjenigen, das kürzlich unter Verwendung der chemischen Quervernetzung erhalten wurde. Es zeigte sich, daß die 55-K-Species spezifisch mit Anti-Cγ- und Anti-Vγ-Peptid-Serum reagierte. Das 40-K-Polypeptid war mit diesem Anti- γ-Peptid-Serum nicht reaktiv und ist somit wahrscheinlich eine Untereinheit, die nicht aus TCRα, TCRβ oder TCRγ bestand, nämlich δ. Um zu bestimmen, ob diese Untereinheiten, wie die TCRα- und TCRβ-Untereinheiten, kovalent miteinander verbunden sind, wurden die mit T3 immunpräzipitierten Polypeptide unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen untersucht. In auffallendem Gegensatz zu den TCRα,β-Untereinheiten, die unter nicht reduzierenden Bedingungen in einer heterodimeren, durch Disulfidbrücken verbundenen Form existieren, sind die TCRγ- und TCRδ- Untereinheiten der IDP2-Zellinie nicht kovalent miteinander verbunden (Fig. 5A). Ein geringer Anstieg der relativen Beweglichkeit bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) unter nicht reduzierenden Bedingungen wurde für das diffuse, stark glykosylierte (siehe unten) TCRγ beobachtet, während ein dramatischer Anstieg der Beweglichkeit für die δ-Untereinheit beobachtet wurde, was das Vorkommen von einer oder mehreren Disulfid-Schleife(n) innerhalb der Kette nahelegte (siehe mit Pfeilen bezeichnete Species, Spuren 2 und 4).
- Weiss et al. schlugen vor, daß die Zellinie Peer möglicherweise das TCRγ-Polypeptid exprimiert, da sie keine TCR-mRNA exprimierte und trotzdem ein T3-assoziiertes Polypeptid von 55 - 60 K exprimierte (69). Bei genauerer Betrachtung stellte sich für diese Zellinie heraus, daß sie nicht mit einem mAb reagierte, der Framework-Determinanten auf der TCRβ-Kette erkannte, βF1 (Fig. 5A), und daß sie ein stark iodiertes Polypeptid von 38 K exprimierte. Das Polypeptid von 55 - 60 K wurde spezifisch durch ein Anti-Cγ-Peptid-Serum immunpräzipitiert und scheint somit ein weiteres Beispiel für das TCRγ-Protein darzustellen (Fig. 5A). Die TCRγ- und TCRβ-Polypeptide auf den Peer-Zellen waren von ähnlicher Größe wie diejenigen auf der IDP2-Zellinie und ganz ähnlich nicht über Disulfidbrücken verbunden. Wie die δ-Untereinheit auf den IDP2-Zellen erfuhr das entsprechende Molekül auf den PEER-Zellen eine deutliche Verschiebung der Beweglichkeit in der SDS-PAGE, wenn es unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen verglichen wurde (vgl. die mit Pfeilen markierten Species, Spalte 7 und 8). Somit scheinen die IDP2- und PEER-Zellinien ähnliche Typen von TCRγ,δ-T3-Komplexen zu exprimieren, bei denen die TCRγ- und TCRδ-Untereinheiten nicht kovalent miteinander verbunden sind.
- Wir wollten gerne bestimmen, ob dieses zweite TCR auch als eine Komponente der T-Zell-Population in normalem peripheren Blut exprimiert wurde. Eine Zweifarben-cytofluorographische Analyse, bei der die Markierung humaner peripherer Blutlymphozyten (PBL) mit den mAbs βF1 und OKT3 verglichen wurde, zeigte eine diskrete Population, die 2 - 5% der T3&spplus;-PBL ausmachte, die TCRα,β-negativ zu sein schien. Zur Untersuchung dieser Lymphozyten-Population wurden normale adulte PBL nach einer Markierung mit dem mAb WT31 einer cytofluorographischen Zellsortierung unterzogen. Nicht markierte PBL wurden isoliert und in vitro in IL-2-haltigem konditioniertem Medium gezüchtet, wobei zweimal in der Woche bestrahlte autologe Feederzellen und Phytohämagglutinin (PHA-P) zugegeben wurden. Die erhaltene Zellinie WT31&supmin;PBL&supmin; wurde durch limitierende Verdünnung mittels Aussäen von 0,5 Zellen pro Loch kloniert, und die klonierten Zellen wurden wie die polyklonale Zellinie gezüchtet. Es wurden verschiedene derartige T-Zell- Klone aus dem peripheren Blut erhalten, und der PBL-Klon 1 (PBL-C1) wurde genauer untersucht. Wie eine cytofluorographische Analyse ergab war dieser Klon T3&spplus;T11&supmin;, jedoch T4&supmin;T8&supmin; und WT31&supmin;. Die Expression von TCRα-, TCRβ- und TCRγ-mRNA durch die PBL-C1-Zellen wurde durch Northern-Blot-Analyse bestimmt (Fig. 6). Im Vergleich zu dem WT31&spplus;βF1&spplus;-T-Zell-Tumor HPB-MLT wurden nur sehr geringe Mengen an TCRα- und TCRβ-mRNA entdeckt. Dagegen wurde sehr viel TCRγ-mRNA festgestellt (Fig. 6, γ-Sonde). Interessanterweise war die TCRγ- mRNA geringfügig kleiner als die mRNA von 1,6 Kilobasen (kb), die in den HPB-MLT-Zellen und in der TCRγ-exprimierenden IDP2-Zellinie gefunden wurde (Fig. 6). In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen wurde bei der cytofluorographischen Analyse keine WT31-Reaktivität beobachtet (Daten nicht gezeigt), und durch Immunpräzipitation unter Verwendung des mAb βF1 wurden nur verschwindende Mengen an TCRα- und TCRβ-Polypeptiden gefunden (Fig. 5B, Spuren 2 und 5). Dagegen ist es wahrscheinlich, daß die Spurenmengen an TCRα- und TCRβ- Protein, die in PBL-C1-Zellen gefunden wurden, auf die 1-2%ige Kontamination mit bestrahlten autologen Feederzellen zurückzuführen sind, die zur Züchtung dieses Klones verwendet wurden. Zwei in großer Menge vorkommende Ketten (40 K und 36 K) wurden beobachtet, die bei der SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen mit T3 assoziiert waren (Fig. 5B, Spur 3). Anti-Cγ-Serum immunpräzipitierte beide Polypeptide aus reduzierten und denaturierten PBL-C1- Lysaten (Fig. 5B, Spur 8).
- Um zu bestimmen, ob diese TCRγ-Polypeptide von 40 K und 36 K Teil eines durch Disulfidbrücken verbundenen Dimeren waren, wurden Ko-Immunpräzipitationen mit Anti-T3 unter nicht reduzierenden Bedingungen untersucht. Es wurde eine einzige Bande mit einem Mr von 70 K beobachtet, was anzeigte, daß die PBL-C1-Zellen, im Gegensatz zu den IDP2- und PEER-Zellen, ein T3-assoziiertes TCRγ-Genprodukt exprimieren, das Teil eines durch Disulfidbrücken verbundenen dimeren Komplexes ist.
- Da ein TCRγ-Partner (δ) auf der nicht durch Disulfidbrücken verbundenen Form dieses Rezeptorkomplexes auf IDP2- und PEER-Zellen vorkam, untersuchten wir, ob die durch Disulfidbrücken verbundene Form des Rezeptors auf PBL-C1-Zellen aus einem Homo- oder einem Heterodimeren bestand. Immunpräzipitate wurden durch zweidimensionale Gelelektrophorese (Nicht- Equilibrium-pH-Gelelektrophorese, NEPHGE) untersucht, gefolgt von SDS-PAGE (Fig. 7A, B). Unter reduzierenden Bedingungen wurde für beide TCRγ-Species (40 K und 36 K) festgestellt, daß sie identische Ladungen tragen, und sie zeigten eine Heterogenität, die typisch für ein sialyliertes Glykoprotein ist. Diese Charakteristika sind denjenigen ähnlich, die kürzlich für unterschiedlich glykosylierte TCRα-Polypeptide, die das gleiche Aminosäure-Rückgrat aufweisen, beschrieben wurden. Somit können dieses Species möglicherweise unterschiedlich glykosylierte Formen des gleichen TCRγ-Peptides darstellen. Diese Schlußfolgerung wird durch die Ergebnisse der metabolischen Pulsmarkierung (siehe unten) unterstützt, die lediglich eine einzige TCRγ-VorläuferSpecies in PBL-C1-Zellen zeigten.
- Ein durch Disulfidbrücken verbundenes Dimeres aus einer oder aus beiden dieser TCRγ-Species sollte eine Fokussierungsposition aufweisen, die derjenigen einer der beiden Komponenten allein ähnlich ist, wenn es durch NEPHGE oder durch Gleichgewichts-isoelektrische Fokussierung (IEF) analysiert wird. Ein Heterodimeres, daß aus TCRγ und einem bestimmten Polypeptid zusammengesetzt ist, könnte jedoch eine andere Ladung und Fokussierungsposition aufweisen. Deshalb wurde die Position des durch Disulfidbrücken verbundenen Dimeren bestimmt, indem NEPHGE unter nicht reduzierenden Bedingungen durchgeführt wurde, gefolgt von SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen (Fig. 7B). Interessanterweise war die Position des durch Disulfidbrücken verbundenen Dimeren erheblich saurer als diejenige der TCRγ-Polypeptide, die unter reduzierenden Bedingungen untersucht wurden (vgl. die 40-K- und 36-K-Species in Fig. 7A mit der 70-K-Species in Fig. 7B). Dieses Ergebnis legt nahe, daß die TCRγ-Species kovalent mit einem Polypeptid unterschiedlicher Beweglichkeit in der NEPHGE verbunden war. Somit schienen, obwohl ein TCRγ-Partner nicht direkt sichtbar gemacht werden konnte (entweder weil er nicht ausreichend mit ¹²&sup5;I markiert war, oder weil er im hier verwendeten Fokussierungssystem nicht aufgelöst werden konnte) die TCRγ-Polypeptide auf den PBL-C1-Zellen als ein Teil eines durch Disulfidbrücken verbundenen Heterodimeren exprimiert zu werden. Experimente unter Verwendung von Gleichgewichts-IEF (statt NEPHGE) bestätigten diese Beobachtung (Fig. 3D).
- Ein weiterer Unterschied zwischen den durch Disulfidbrücken verbundenen und den nicht verbundenen Formen lag in der Größe des reifen TCRγ-Glykopeptids (55 - 60 K auf IDP2- und PEER-Zellen gegenüber 40 K und 36 K auf PBL-C1-Zellen). Um zu bestimmen, wieviel dieses enormen Größenunterschiedes auf eine unterschiedliche Glykosylierung zurückzuführen ist und wieviel auf unterschiedliche Peptidrückgrate, wurden die TCRγ-Peptide in Zellen analysiert, die mit ³&sup5;S-Methionin pulsmarkiert worden waren. Nach einer Solubilisierung unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen wurden die Lysate mit Anti-Cγ-Serum immunpräzipitiert und durch zweidimensionale Gelelektrophorese untersucht (Fig. 7E-H). Die Immunpräzipitate wurden entweder mit Endoglykosidase-H (Endo-H) behandelt, um unreife Glykane mit hohem Mannoseanteil von pulsmarkiertem Material zu entfernen, oder sie wurden scheinbehandelt. Zwei TCRγ- Polypeptide (46 K und 43 K) mit identischer Beweglichkeit in der NEPHGE wurden durch die IDP2-Zellinie synthetisiert. Die Behandlung mit Endo-H reduzierte beide Formen zu einer 40-K- Form, was nahelegte, daß die 46-K- und die 43-K-Formen unterschiedliche Mengen an Kohlenhydraten trugen und daß ein einziges TCRγ-Polypeptidrückgrat (40 K) durch die IDP2-Zellen synthetisiert wurde (Fig. 7E, F). Dagegen wurde eine basischere, glykosylierte Form von 38 K durch die PBL-C1-Zellen synthetisiert, die nach dem Endo-H-Verdau ein nicht glykosyliertes Peptidrückgrat von 31 K zeigte (Fig. 7G, H). Somit haben die TCRγ-Polypeptide der nicht durch Disulfidbrücken verbundenen (IDP2) und der durch Disulfidbrücken verbundenen (PBL-C1) Formen, die hier charakterisiert wurden, stark unterschiedliche Größen ihres Peptidrückgrats (40 K bzw. 31 K). Die Tatsache, daß die glykosylierten TCRγ-Peptide, die durch Pulsmarkierung beobachtet wurden, ein anderes Molekulargewicht aufwiesen als diejenigen, die durch Iodierung der Zelloberfläche gefunden wurden, beruht wahrscheinlich darauf, daß sie unterschiedliche Typen von Kohlenhydraten tragen, und zwar solche mit hohem Mannoseanteil gegenüber komplexen Formen.
- Als nächstes wollten wir bestimmen, ob in normalem adultem peripheren Blut sowohl eine durch Disulfidbrücken verbundene als auch eine nicht kovalent assoziierte Form vorkam. Die polyklonale periphere Blutzellinie (WT31&supmin;PBL-Linie), aus der die PBL-C1-Zellen kloniert worden waren, wurde deshalb genauer untersucht. Die WT31&supmin;PBL-Linie war homogen T3&spplus;T11&spplus; und enthielt 95% WT31&supmin;T4&supmin;T8&supmin;-Zellen mit 5% kontaminierenden WT31&spplus;-Zellen. Bei einer Untersuchung durch Immunpräzipitation aus iodierten, aufgelösten Zellen wurde eine schwache, aber nachweisbare Reaktivität mit dem mAb βF1 beobachtet (Fig. 5B, Spuren 10, reduziert, und 13, nicht reduziert), in Übereinstimmung mit den erwarteten 5% TCRα,β-positiven Lymphozyten. Im Gegensatz dazu präzipitierte der mAb Anti-T3 große Mengen sowohl an T3 als auch an assoziierten Polypeptiden von 35 - 45 K unter reduzierenden Bedingungen (Fig. 5B, Spur 11). Um zu bestimmen, welcher Anteil davon durch Disulfidbrücken verbunden war, wurde das T3- Immunpräzipitat unter nicht reduzierenden Bedingungen untersucht (Fig. 5B, Spur 14). Weniger als die Hälfte der T3-assoziierten Polypeptide waren durch Disulfidbrücken verbunden. Zu diesem Material gehörten durch Disulfidbrücken verbundene TCRα,β-Peptide, die oberhalb des offenen Pfeils lokalisiert waren (die Größe wurde anhand des Präzipitats mit βF1 identifiziert, Spur 13) sowie durch Disulfidbrücken verbundene TCRγ-Peptide geringerer Größe (offener Pfeil, Spur 14). Auffälligerweise war die Mehrzahl der T3-assoziierten Species nicht durch Disulfidbrücken verbunden und wanderte mit der gleichen Beweglichkeit sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht reduzierenden Bedingungen. Bemerkenswerterweise zeigte ein Teil dieser nicht verbundenen Species eine erhebliche Erhöhung der Beweglichkeit in der SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen, ähnlich wie das TCRδ auf den IDP2- und PEER-Zellen (vergleiche Fig. 5B, Spur 14, ausgefüllter Pfeil). Die Reaktivität mit Anti-Cγ-Serum bestätigte, daß es sich beim größten Teil des markierten Materials, das mit T3 assoziiert war und auf der WT31&supmin;PBL- Linie exprimiert wurde, um TCRγ-Genprodukte handelte (Spur 16).
- Somit erscheint das Proteinprodukt des TCRγ-Gens auf T3&spplus;-Lymphozyten in adultem peripherem Blut sowohl in durch Disulfidbrücken verbundenen als auch in nicht verbundenen molekularen Formen. Weiterhin kann die nicht durch Disulfidbrücken verbundene Form des TCRγ in glykosylierte Species von 55 - 60 K (IDP2- und PEER-Zellen) oder glykosylierte Species von 35 - 45 K (Thymus-T-Zell-Klon C11 (70) und WT31&supmin;PBL-Linie) unterteilt werden.
- Die TCRγ- und TCRβ-Gen-Rearrangements wurden in T-Zellen untersucht, von denen bekannt ist, daß sie das TCRγ-Polypeptid auf ihren Zelloberflächen exprimieren. Eine Southern-Blot- Analyse wurde unter Verwendung der humanen EcoRI-HindIII-γ1,3-Sonde von 0,8 kb durchgeführt (Nomenklatur nach Quertermous et al. (71)). Diese Sonde weist Keimbahn inienbanden von 23 kb und 12 kb in einem BamHI-Verdau genomischer DNA nach. Die 23-kb-Bande führt zu Cγ1' und die 12-kb-Bande kodiert für Cγ&sub2;. Unter Verwendung dieser Sonde zeigten IDP1-, PBL-C1- und PBL-C2-Zellen (die auch von der WT31&supmin;PBL-Linie abstammten) Rearrangements des TCRγ-Gens (sowohl die PBL-C1- als auch die PBL-C2-Zellen zeigten das gleiche Rearrangement; Fig. 8A).
- Es wurden in PBL sieben Rearrangements unter Verwendung der Jγ1,3-Sonde und EcoRI- verdauter genomischer DNA bei Southern-Blot-Analysen nachgewiesen (20). Sechs (I, II, III, IV, VII und V) dieser sieben Rearrangements sind in genomischer DANN aus PBL, fötalem Thymus und Neugeborenen-Thymus gezeigt (Fig. 8B, siehe die Pfeile und die Rearrangement-Nummern). Vier Rearrangements (I, II, VI und VII) werden entweder durch periphere Blutlymphozyten, die das TCRγ-Polypeptid exprimieren, nicht verwendet, oder Zellen, die diese aufweisen, wurden unter den Kultivierungsbedingungen, die für die WT31&supmin;PBL-Linie zum Einsatz kamen, verloren. Trotzdem wies die DNA der WT31&supmin;PBL-Linie wenigstens drei dieser Rearrangements auf (III, IV und VI) (Fig. 8B, Spur 3), und diese gleichen Rearrangements wurden durch IDP2-, PBL-C1- und PBL-C2-Zellen verwendet (die Daten für den EcoRI-Verdau sind nicht gezeigt), und alle dieser Rearrangements treten in fötalem Thymus auf.
- Das TCRβ-Gen wies in IDP2-, PBL-C1- und PBL-C2-Zellen ebenfalls Rearrangements auf. Die EcoRI-HindIII-Cβ&sub2;-Sonde von 1,1 kb weist eine Keimbahnlinienbande von 20 kb nach, die zu beiden Cβ-konstanten Bereichen in einem BamHI-Verdau genomischer DNA führt (68). Ein vorherrschendes TCRβ-Rearrangement wurde für die IDP2-Zellen und zwei identische Rearrangements wurden für die PBL-C1- und die PBL-C2-Zellen beobachtet (Fig. 8C). Es wird angenommen, daß diese TCRβ-Rearrangements nicht produktiv sind, basierend auf Immunpräzipitationen und Northern-Analysen dieser Zellinien. Da sowohl die PBL-C1- als auch die PBL-C2-Zellen die gleichen TCRγ- und TCRβ-Rearrangements aufweisen, scheinen sie klonalen Ursprungs zu sein und von der gleichen Zelle der WT31&supmin;PBL-Linie abzustammen.
- Da TCRγ-exprimierende Zellen in adultem peripherem Blut gefunden wurden, wurden funktionelle Studien durchgeführt, um zu bestimmen, ob sie als Effektoren wirken können. Wenn IDP2- und PBL-C1-Zellen in &sup5;¹Cr-Freisetzungstests bezüglich ihrer Fähigkeit zur Lyse von Targetzellen untersucht wurden, zeigte sich, daß sie spontane cytotoxische Effektor-Wirkungen hatten (Fig. 9). Obwohl die IDP2-Zellinie die Mehrzahl der natürlichen Killerzell-Targets (NK) oder PHA-Blasten allogener PBLs nicht lysierte, war sie selektiv dazu fähig, &sup5;¹Cr-markierte MOLT-4 Zellen zu lysieren (Fig. 9A oben). In zwei von sechs ähnlichen Testen wurde auch eine schwache Lyse (10 - 15% Freisetzung von &sup5;¹Cr) von K562 Targetzellen beobachtet. Die Lyse der MOLT-4 Zellen wurde durch eine Vielzahl von mAbs, die gegen monomorphe MHC-Determinanten der Klasse I (W6/32-Anti-HLA-A, -B, -C, -4E und 131) oder der Klasse II (LB3.1 und Anti-Leu-10) gerichtet waren, nicht gehemmt (Fig. 9b), obwohl wir vor kurzem gefunden haben, daß diese mAbs die Abtötung durch allospezifische CTL sowohl der MHC-Klasse I als auch der Klasse II wirksam blockieren (34). Diese Daten legen nahe, daß die Lyse der MOLT-4 Zellen unabhängig von MHC der Klasse I und der Klasse II war. Nur der Anti-T3-mAb blockierte teilweise die spezifische Lyse von MOLT-4 Zellen (Fig. 9B). Andererseits wurden &sup5;¹Cr-markierte Targetzellen, die Fc-Rezeptoren für IgG exprimieren (z.B. U937), wirksam lysiert, wenn sie durch eine vorherige Bindung von Anti- T3-mAb an IDP2-Zellen getriggert worden waren, wie kürzlich für vom Thymus abstammende CII&sup7;-Zellen gezeigt worden ware, stattgefunden hatte(Fig. 9A, +Anti-T3). Diese Abtötung konnte vollständig durch aggregiertes humanes IgG gehemmt werden, was bestätigte, daß diese T3- vermittelte Lyse durch einen Mechanismus einer verstärkten Konjugatbildung über IgG-Fc- Rezeptoren erfolgte (Daten nicht gezeigt). Die paradoxe Verstärkung der Lyse durch Anti-T3-mAb bei einigen Targetzeen (U937) und die Blockade der Lyse für spezifisch erkannte Targets (MOLT-4) resultiert möglicherweise aus den kompetitierenden Effekten des Triggerns und einer erhöhten Bildung von Konjugaten über T3 und einer gleichzeitigen sterischen Blockade der Antigenerkennung über das TCR.
- Die PBL-C1-Zellen erwiesen sich als effektivere Killerzellen als die IDP2-Zellen. Die PBL-C1- Zellen wiesen eine spontane cytolytische Aktivität gegenüber K562-Zellen (negativ für MHC der Klassen I und II) auf, die fast 50% spezifische &sup5;¹Cr-Freisetzung zeigten, wenn sie bei einem Effektor:Target-Verhältnis (E:T-Verhältnis) von 20:1 untersucht wurden (Fig. 9C oben) Außerdem lysierten die PBL-C1-Zellen auch MOLT-4 Zellen und in geringerem Umfange CEM Zellen. Es wurde keine Lyse von Daudi-Zellen, U937-Zellen oder entweder autologen oder allogenen PBL gefunden. Das Triggern mit Anti-3-mAb induzierte die PBL-C1-Zellen zur Lyse der U937-Zellinie. Weiterhin war die Lyse von K562-Zellen leicht erhöht, während diejenige von MOLT-4 Zellen teilweise gehemmt war (Fig. 9C). Zusammengenommen zeigen die spontane cytolytische Aktivität von IDP2- und PBL-C1-Zellen gegenüber Tumortargets, wie z.B. K562- und MOLT-4 Zellen, und die Unfähigkeit, diese Aktivität durch Anti-MHC-mAb zu blockieren, daß diese TCRγ-Lymphozyten nicht auf die MHC-Klasse I und Klasse II beschränkte cytotoxische T-Lymphozyten sind.
- Monoklonale Framework-Antikörper gegen die TCRα,β-Moleküle, βF1 und WT31, wurden dazu verwendet, die WT31&supmin;βF1&supmin;T3&spplus;-Lymphozytenpopulation aus den peripheren Blutlymphozyten von zwei Immunschwäche-Patienten zu identifizieren und zu isolieren. Hinsichtlich der Kriterien von sowohl einer Immunpräzipitationsanalyse mit monoklonalen Framework-Antikörpern als auch einer Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von TCRα- und TCRβ-spezifischen cDNA-Sonden konnte von polyklonalen humanen T-Zell-Linien dieses Phänotyps gezeigt werden, daß sie weder TCRα,β-mRNA-Transkripte noch Polypeptide exprimieren. Trotzdem zeigten chemische Quervernetzungsstudien unter Verwendung des spaltbaren DSP-Reagenz die Existenz eines Proteinkomplexes an, der mit dem T3-Glykoprotein auf der Oberfläche dieser Zellen assoziiert war. Die schwerere der beiden Untereinheiten, die mit dem T3 eine Quervernetzung bildeten (Mr 55 000), wurde auch mit zwei verschiedenen Antiseren immunpräzipitiert, von denen das eine gegen ein synthetisches Peptid von 17 Aminosäuren gerichtet war, das einem Teil der variablen Region der abgeleiteten Aminosäuresequenz eines rearrangierten TCRγ-Gens entsprach, während das andere gegen ein synthetisches Peptid von 20 Aminosäuren gerichtet war, das einem Teil der konstanten Region der abgeleiteten Aminosäuresequenz eines rearrangierten TCRγ-Gens entsprach (19, 36). Somit ist das Protein von Mr 55 000 das TCRγ-Protein, das vom rearrangierten TCRγ-Gen kodiert wird (15). Das Polypeptid mit Mr 40000 ist ein viertes T3- assoziiertes Protein, das als TCRδ bezeichnet wird (Fig. 2A und 2B). Die TCRγ- und TCRδ- Polypeptide bilden eine T3-assoziierte heterodimere Struktur auf diesen Zellen (Tγ,δ-T3), die dem kürzlich beschriebenen T-Zell-Rezeptorkomplex (TCRα,β) analog ist.
- Die TCRγ-Lymphozyten, die hier untersucht wurden, weisen eine nicht auf MHC beschränkte cytolytische Aktivität auf und sind möglicherweise anderen T3&spplus;-NK- ähnlichen Zellen ähnlich, deren T-Zell-Rezeptoren noch nicht definitiv charakterisiert wurden (39, 72, 73, 74). Wie NK- ähnliche Lymphozyten können sie möglicherweise an der immunologischen Abwehr maligner Erkrankungen beteiligt sein. Die beobachtete Spezifität der Lyse legt die Möglichkeit einer TCRγ- vermittelten Antigen-spezifischen Erkennung einiger, aber nicht aller Tumortargets nahe. Da der Anti-T3-mAb eine unspezifische Lyse einiger Zielzellen triggern konnte oder alternativ die spezifische Lyse anderer Ziele blockieren konnte, scheint es, daß das T3-Molekül auf diesen Zellen funktionell ist.
- Die Peer-Zellinie, die oben beschrieben wurde, wurde in vitro in einem Medium kultiviert, das aus RPMI 1640, 10% fötalem Kälberserum, Penicillin/Streptomycin und L-Glutamin zusammengesetzt war. Die Kultur wurde zweimal pro Woche gefüttert und bei 37ºC in einem Inkubator mit befeuchteter Atmosphäre und 5% CO&sub2; gehalten.
- Eine BALB/c Maus wurde intraperitoneal (i.p.) mit 2 x 10&sup7; Peer-Zellen&sub1; die in 0,2 ml Phosphat- gepufferter Saline (PBS) suspendiert waren, immunisiert. Die Maus wurde mittels i.p.-Injektion alle 10 Tage mit 2x10&sup7; Peer Zellen, insgesamt 20 Injektionen, geboostert. Drei Tage vor der Fusion wurde die Maus durch intravenöse (i.v.) Injektion von 2x10&sup7; Peer-Zellen an drei aufeinanderfolgenden Tagen geboostert. Bei der letzten i.v.-Injektion wurde die Maus getötet, und die Milz wurde entnommen. Immunzellen der Milz wurden mit P3x63Ag8.653 Maus-Myelomzellen in Gegenwart von Polyethylenglykol 1500 in einem Verhältnis von 5:1 mittels Standardverfahren fusioniert. Nach der Fusion wurden die Zellen in Kulturmedium suspendiert, das Hypoxanthin (1 x 10&supmin;&sup4; M), Aminopterin (8 x 10&supmin;&sup8; M) und Thymidin (1,6 x 10&supmin;&sup5; M) enthielt und in einer Dichte von 2 x 10&sup5; Zellen pro Loch in Mikrotiterplatten ausgesät, die pro Loch 2 x 10&sup5; BALB/c-Thymozyten als Feederzellen enthielten. Die Kulturen wurden mit dem gleichen Medium am 7. Tag gefüttert. Beginnend mit dem Tag 14 wurden die Kulturen mit dem gleichen Medium, das kein Aminopterin enthielt, gefüttert.
- Da sowohl die γ- als auch die δ-Ketten des T-Zell-Antigenrezeptorproteins auf Peer-Zellen mit dem CD3-Antigen komplexiert sind, sollten Antikörper gegen den T-Zell-Antigenrezeptor der Peer-Zellen in der Lage sein, diese Oberflächenproteine mit einem monoklonalen Anti-CD3- Antikörper, wie z.B. dem Antikörper OKT3 (2), zu komodulieren. Eine derartige Komodulation wurde als das primäre Auswahlkriterium der erwünschten Hybridomzellen wie folgt eingesetzt. Die einzelnen Überstände der Hybridomkulturen wurden geerntet und bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, die Oberflächen-CD3-Proteinkomplexe mit einem monoklonalen Anti-CD3-Antikörper zu komodulieren. Einhundert Mikroliter eines Kulturüberstandes wurden zu jedem Loch einer 96- Loch-Mikrotiterplatte gegeben, die 5 x 10&sup5; Peer-Zellen pro Loch enthielt. Nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht wurde Fluorescein-Isothiocyanat konjugierter OKT3 zu jedem Loch gegeben, und die Kultivierung wurde 30 min bei 0ºC fortgesetzt. Proben wurden dann durch Durchflußcytometrie untersucht. Überstände, die eine signifikante Abnahme der Fluoreszenzintensität hervorriefen, wurden ausgewählt und weiter durch die Immunpräzipitationsverfahren, die unten beschrieben werden, charakterisiert. Die Zellen in ausgewählten Löchern, die Antihumaner-T-Zell-Antigenrezeptor-Protein sezernierten, wurden anschließend durch das Verfahren der limitierenden Verdünnung kloniert.
- Peer-Zellen wurden mit ¹²&sup5;I radioaktiv markiert und in Tris-gepufferter Saline (TBS), die 1% Nonidet-P40 enthielt, wie oben beschrieben lysiert. Die Immunpräzipitation wurde durchgeführt, indem ¹²&sup5;I-markierte Peer-Zell-Lysate mit allen ausgewählten Überständen unter reduzierenden Bedingungen inkubiert wurden. Nach der Immunpräzipitation wurden die Proben durch 10%- Natriumlaurylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Die Gele wurden getrocknet und einer Autoradiographie unterzogen, und die Molekulargewichte der Proteine wurden durch Vergleich mit Molekulargewichtstandards bestimmt (75).
- Monoklonale Antikörper wurden durch Immunisieren von BALB/c-Mäusen mit immunpräzipitiertem TCRγ,δ-CD3 von der Peer-Zellinie hergestellt. Es wurden, kurz gesagt, 1 Gramm Peer-Zellen in 0,3% CHAPS-Detergenz aufgelöst und mit 5 Mikrolitern UCHT1-Ascites und fixierten Staphylococcus-aureus-Bakterien des Stammes Cowan-I als Immunabsorbens immunpräzipitiert, ähnlich wie bei dem Verfahren, das in (46) beschrieben wird. Die gewaschenen Immunkomplexe wurden intraperitoneal in 4wöchigen Intervallen injiziert, insgesamt wurden 5 Immunisierungen durchgeführt (46). Dann wurden die Mäuse getötet, und die Milzzellen wurden mit P3x63Ag8.653- Myelomzellen fusioniert. Die Hybridome wurden unter Selektion mit HAT kultiviert und mittels Immunpräzipitation auf ¹²&sup5;I-markierten Peer-Zellen und anderen Zellen, wie in (75) beschrieben, gescreent und charakterisiert.
- Wie in der Fig. 10, Spur 4 gezeigt ist, präzipitierte der Antikörper im Überstand des Hybridoms 34D12 unter reduzierenden Bedingungen ein Protein von 55 kd und ein Protein von 20 kd aus dem iodierten Lysat von Peer-Zellen. Dieses 55-kd-Protein entspricht der γ-Kette des T-Zell-Antigenrezeptors und das 20-kd-Protein dem T3-Protein auf den Peer-Zellen.
- In einem anderen Experiment wurde ein monoklonaler Antikörper gegen die δ -Kette des T-Zell- Antigenrezeptors, d.h. 4A1, hergestellt und charakterisiert. Wie in der Figur 11, Spur 5, gezeigt ist, immunpräzipitierte der 4A1 spezifisch eine δ -Kette (40 kd) des T-Zell-Antigenrezeptors von IDP2-Zellen (75). Für 4A1 wurde auch gezeigt, daß er den T-Zell-Antigenrezeptor-γ,δ-Komplex von verschiedenen anderenT-Zell-Antigenrezeptor-γ,δ-positiven Zellinien, einschließlich der IDP2- und Molt-13-Zellen und der PBL-Linie 2, immunpräzipiert.
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Claims (40)
1. Ein isoliertes Polypeptid, das wenigstens ein antigenes
Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors
ist, wobei die Kette dadurch gekennzeichnet ist, daß
sie:
(a) in einem Komplex mit dem T3-Antigen assoziiert
ist, wenn sie an der Oberfläche einer T-Zelle
gefunden wird;
(b) nicht mit Antikörpern gegen den
α,β-T-Zell-Antigenrezeptor reaktiv ist;
(c) nicht mit Antikörpern gegen die γ-Kette des T-
Zell-Antigenrezeptors reaktiv ist; und
(d) in einem Komplex mit einem zweiten Polypeptid
assoziiert ist, wenn sie an der Oberfläche einer
T-Zelle gefunden wird, wobei das genannte zweite
Polypeptid mit Antikörpern gegen die γ-Kette des
T-Zell-Antigenrezeptors reaktiv ist.
2. Polypeptid nach Anspruch 1, das wenigstens eine
ketteninterne, kovalente Disulfid-Verknüpfung aufweist.
3. Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem die δ-Kette ein
Molekulargewicht von etwa 40.000 Dalton, bestimmt durch
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden
Bedingungen unter Verwendung von 5% 2-Mercaptoethanol,
aufweist.
4. Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem die δ-Kette eine δ-
Kette eines humanen T-Zell-Antigenrezeptors ist.
5. Eine Substanz, die in der Lage ist, spezifisch einen
Komplex mit wenigstens einem Polypeptid auszubilden,
wie es in Anspruch 1 beansprucht wird, wobei diese
Substanz ein Antikörper ist.
6. Substanz nach Anspruch 5, die in der Lage ist,
spezifisch einen Komplex mit einer δ-Kette auszubilden.
7. Substanz nach Anspruch 5, die in der Lage ist, einen
Komplex mit mehr als einer δ-Kette auszubilden.
8. Substanz nach Anspruch 5, bei der der Antikörper
polyklonal ist.
9. Substanz nach Anspruch 5, bei der der Antikörper
monoklonal ist.
10. Substanz nach Anspruch 9, bei der der monoklonale
Antikörper durch die Fähigkeit charakterisiert ist, ein
CD3-Antigen komodulieren zu können.
11. Zusammensetzung mit einer Substanz nach Anspruch 5 zur
Verwendung bei der Diagnose einer Immunsystem-Anomalie.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die
Immunsystem-Anomalie aus der Gruppe ausgewählt ist, die
besteht aus Krebs, Leukämie, Lymphom,
Immundefektsyndrom, ererbtem Immundefekt, Autoimmunerkrankung und
Hyperimmunitäts-Zuständen und -Erkrankungen.
13. Verfahren zum Nachweis von T-Zellen, von denen jede ein
Polypeptid aufweist, wie es in Anspruch 1 beansprucht
wird, das das In-Kontakt-Bringen einer Probe, die T-
Zellen enthält, mit einem Antikörper umfaßt, der in der
Lage ist, einen Komplex mit dem Polypeptid zu bilden,
so daß ein Komplex zwischen dem Antikörper und dem
Polypeptid gebildet wird, wodurch derartige T-Zellen
nachgewiesen werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Polypeptid an
der Oberfläche der T-Zellen vorhanden ist.
15. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Polypeptid im
Cytoplasma der T-Zellen vorhanden ist.
16. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das spezifische
Polypeptid nur in Suppressor-T-Zellen vorhanden ist.
17. Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in
einem Individuum, das umfaßt:
(a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen in einer Probe
von dem Individuum;
(b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit Substanzen, die
in der Lage sind, Komplexe mit wenigstens einem
Polypeptid auszubilden, wie es in Anspruch 1
beansprucht wird, so daß ein Komplex zwischen der
Substanz und dem Polypeptid gebildet wird;
(c) Bestimmen des Prozentsatzes an T-Zellen in der
Probe, die das Polypeptid aufweisen; und
(d) Vergleichen des so bestimmten Prozentsatzes mit
dem Prozentsatz von T-Zellen, die das Polypeptid
in einer Probe von einem normalen Individuum, das
die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist,
aufweisen, wobei ein Unterschied bei den so
bestimmten Prozentsätzen an T-Zellen einen Hinweis auf
die Immunsystem-Anomalie darstellt.
18. Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in
einem Individuum, das umfaßt:
(a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen, die ein
Polypeptid, wie es in Anspruch 1 beansprucht wird,
aufweisen, in einer Probe von dem Individuum;
(b) Bestimmen der Menge des Polypeptids in den
T-Zellen, die das Polypeptid aufweisen; und
(c) Vergleichen der so bestimmten Menge mit der Menge
an Polypeptid in einer gleichen Anzahl von
T-Zellen, die das Polypeptid aufweisen, in einer Probe
einem normalen Individuum, das die Immunsystem-
Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei
der so bestimmten Menge einen Hinweis auf die
Immunsystem-Anomalie darstellt.
19. Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in
einem Individuum, das umfaßt:
(a) Bestimmen in einer Probe des Individuums des
Verhältnisses der Anzahl der T-Zellen, die ein
Polypeptid aufweisen, wie es in Anspruch 1 beansprucht
wird, verglichen mit der Anzahl an T-Zellen, die
einen Oberflächenmarker aufweisen, der aus der
Gruppe ausgewählt ist, die aus T3; T4; T8; und
α,β-T-Zell-Antigenrezeptor besteht; und
(b) Vergleichen des Verhältnisses von (a) mit dem
Verhältnis, das in einer Probe eines normalen
Individuums bestimmt wurde, das die Immunsystem-
Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei
den so bestimmten Verhältnissen einen Hinweis auf
die Immunsystem-Anomalie darstellt.
20. Ein Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid
kodiert, wie es in Anspruch 1 beansprucht wird.
21. Ein Nukleinsäuremolekül, wie es in Anspruch 20
beansprucht wird, das eine DNA ist.
22. Ein Nukleinsäuremolekül, das zu einem
Nukleinsäuremolekül, wie es in Anspruch 20 beansprucht wird,
komplementär ist.
23. Polypeptid nach Anspruch 1, das, in Form eines
isolierten Komplexes, mit einem Polypeptid assoziiert ist, das
wenigstens ein antigenes Fragment einer γ-Kette eines
T-Zell-Antigenrezeptors ist, wobei die γ-Kette dadurch
gekennzeichnet ist, daß sie:
(a) in einem Komplex mit dem T3-Antigen assoziiert
ist, wenn sie an der Oberfläche einer T-Zelle
gefunden wird;
(b) nicht mit Antikörpern gegen die α- oder β-Kette
des α,β-T-Zell-Antigenrezeptors reagiert; und
(c) mit einem Antikörper gegen die γ-Kette des T-Zell-
Antigenrezeptors reagiert.
24. Komplex nach Anspruch 23, bei dem die γ-Kette ein
Molekulargewicht von etwa 55.000 Dalton, bestimmt durch
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden
Bedingungen unter Verwendung von 5% 2-Mercaptoethanol,
aufweist.
25. Komplex nach Anspruch 23, bei dem die γ-Kette eine γ-
Kette eines humanen T-Zell-Antigenrezeptors ist.
26. Eine Substanz, die in der Lage ist, spezifisch einen
Komplex mit einem Komplex auszubilden, wie er in
irgendeinem der Ansprüche 23 bis 25 beansprucht wird,
wobei die Substanz spezifisch an das Polypeptid bindet,
das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette
eines T-Zell-Antigenrezeptors ist.
27. Substanz nach Anspruch 26, die in der Lage ist,
spezifisch einen Komplex mit einem
γ,δ-T-Zell-Antigenrezeptor auszubilden.
28. Substanz nach Anspruch 26, die in der Lage ist, einen
Komplex mit mehr als einem γ,δ-T-Zell-Antigenrezeptor
auszubilden.
29. Substanz nach Anspruch 26, die einen Antikörper umfaßt.
30. Substanz nach Anspruch 29, bei der der Antikörper
polyklonal ist.
31. Substanz nach Anspruch 29, bei der der Antikörper
monoklonal ist.
32. Eine Zusammensetzung, die eine Substanz, wie sie in
Anspruch 26 beansprucht wird, umfaßt, für die
Verwendung bei der Diagnose einer Immunsystem-Anomalie.
33. Zusammensetzung nach Anspruch 32, bei der die
Immunsystem-Anomalie aus der Gruppe ausgewählt ist, die
besteht aus Krebs, Leukämie, Lymphom,
Immundefekt-Syndrom, ererbtem Immundefekt, Autoimmunerkrankung und
Hyperimmun-Zuständen und -Erkrankungen.
34. Verfahren zum Nachweis von T-Zellen, von denen jede
einen Komplex aufweist, wie er in irgendeinem der
Ansprüche 23 bis 25 beansprucht wird, das das In-Kontakt-
Bringen von T-Zellen mit einer Substanz, die in der
Lage ist, einen Komplex mit dem Komplex auszubilden, so
daß ein zweiter Komplex gebildet wird, den Nachweis
eines derartigen zweiten Komplexes und auf diese Weise
den Nachweis solcher T-Zellen umfaßt, bei denen die
Substanz spezifisch an das Polypeptid bindet, das
wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette eines T-
Zell-Antigenrezeptors ist.
35. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem der Komplex, wie er
in irgendeinem der Ansprüche 23 bis 25 beansprucht
wird, an der Oberfläche der T-Zellen vorliegt.
36. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem der Komplex, wie er
in irgendeinem der Ansprüche 23 bis 25 beansprucht
wird, im Cytoplasma der T-Zellen vorliegt.
37. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem der spezifische
Komplex nur in Suppressor-T-Zellen vorhanden ist.
38. Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in
einem Individuum, das umfaßt:
(a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen in einer Probe
des Individuums;
(b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit Substanzen, die
in der Lage sind, einen zweiten Komplex mit
wenigstens einem Komplex auszubilden, wie er in
irgendeinem der Ansprüche 23 bis 25 beansprucht wird, so
daß ein zweiter Komplex zwischen der Substanz und
dem Komplex gebildet wird;
(c) Bestimmen des Prozentsatzes an T-Zellen in der
Probe, die den zweiten Komplex aufweisen; und
(d) Vergleichen des so ermittelten Prozentsatzes mit
dem Prozentsatz von T-Zellen, die den zweiten
Komplex in einer Probe eines normalen Individuums,
das die Immunsystem-Anomalie nicht aufweist,
aufweisen, wobei ein Unterschied bei den
Prozentsätzen der so bestimmten T-Zellen einen Hinweis
auf die Immunsystem-Anomalie darstellt;
wobei die Substanzen spezifisch an das Polypeptid
binden, das wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-
Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors ist.
39. Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in
einem Individuum, das umfaßt:
(a) Bestimmen der Anzahl von T-Zellen, die einen
Komplex aufweisen, wie er in irgendeinem der
Ansprüche 23 bis 25 beansprucht wird, in einer Probe
des Individuums, wobei die Anzahl von T-Zellen,
die einen Komplex aufweisen, wie er in irgendeinem
der Ansprüche 23 bis 25 beansprucht wird, dadurch
bestimmt wird, daß man das Polypeptid in dem
Komplex nachweist, das wenigstens ein antigenes
Fragment einer δ-Kette eines T-Zell-Antigenrezeptors
ist;
(b) Nachweisen der Menge des Komplexes in den
T-Zellen, die den Komplex aufweisen, durch Nachweisen
der Menge des Polypeptids in dem Komplex, das
wenigstens ein antigenes Fragment einer δ-Kette
eines T-Zell-Antigenrezeptors ist; und
(c) Vergleichen der so ermittelten Menge mit der Menge
des Komplexes in einer gleichen Anzahl von
T-Zellen, die den Komplex aufweisen, in einer Probe von
einem normalen Individuum, das die Immunsystem-
Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei
der so ermittelten Menge einen Hinweis auf die
Immunsystem-Anomalie darstellt.
40. Verfahren zur Diagnose einer Immunsystem-Anomalie in
einem Individuum, das umfaßt:
(a) Bestimmen in einer Probe des Individuums das
Verhältnis der Zahl von T-Zellen, die einen Komplex
aufweisen, wie er in irgendeinem der Ansprüche 23
bis 25 beansprucht wird, im Vergleich mit der Zahl
an T-Zellen, die einen Oberflächenmarker
aufweisen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
T3; T4; T8 und α,β-T-Zell-Antigenrezeptor besteht;
und
(b) Vergleichen des Verhältnisses gemäß (a) mit dem
Verhältnis, das in einer Probe von einem normalen
Individuum bestimmt wurde, das die Immunsystem-
Anomalie nicht aufweist, wobei ein Unterschied bei
den so bestimmten Verhältnissen einen Hinweis auf
die Immunsystem-Anomalie darstellt;
wobei die Anzahl von T-Zellen, die einen Komplex
aufweisen, wie er in irgendeinem der Ansprüche 23 bis 25
beansprucht wird, dadurch bestimmt wird, daß man das
Polypeptid in dem Komplex nachweist, das wenigstens ein
antigenes Fragment einer δ-Kette eines
T-Zell-Antigenrezeptors ist.
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