JPH02491A - 抗−Ｔ細胞レセプターγ鎖モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明の抗−γ鎖モノクローナル抗体は、研究用試薬と
して、Ｔ細胞の分化や機能の解析に有用である。

従来技術 免疫系においてＴ細胞は免疫応答の調節や細胞性免疫に
重要な役割を果たしている。その機能の発現には、Ｔ細
胞表面の膜に存在するレセプターが関与しており、これ
をＴ細胞レセプターと呼んでいる。クローン化したＴ細
胞をマウスに免疫して得たモノクローナル抗体を用いた
Ｔ細胞レセプターの構造についての研究により、Ｔ細胞
レセプターはα鎖、β鎖の２本のポリペプチド鎖からで
きていることが明らかとなり、さらに分子遺伝学的な解
析により、各鎮を指令している遺伝子も決定された。利
根用らは、α、β鎖を指令している遺伝子の他に、γ鎖
を指令している遺伝子を発見したが、Ｔ細胞の機能にお
けるγ鎖の役割は不明である。また、γ鎖の他にも、γ
鎖と結合して存在しているδ鎖の存在も報告されている
〔ネイチ＋　−０１ａｔｕｒｅ）　３２２．１４５−１
４９　（１９８６）　ｌ）。

このγ鎖の機能を解明するためには、γ鎖と特異的に反
応する抗体が必要である。γ鎖に対するウサギ抗血清に
ついては既に報告がある〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ
）　３２５．７２０−７２３　（１９８７＞　３が、モ
ノクローナル抗体は知られていない。

発明が解決しようとする課題 Ｔ細胞の分化や機能におけるＴ鎮の意義を解明するため
には、ｒ＆Ｊｌと特異的に反応する抗体が必要である。

前述のとおり、マウス由来のγ鎖に対する抗−γ鎖ウサ
ギ抗血清については報告があるが、γ鎖のより詳細かつ
広汎な研究をするためには、均一で特異性の高いモノク
ローナル抗体が必要である。しかしながら、現在、免疫
原として使用可能なマウス由来のｒ鎮ポリペプチドがも
ともとＢＡＬＢ／ｃマウス由来のものであるため、通常
ハイブリドーマの作製のための免疫動物として使用する
ＢΔＬＢ／ｃマウスには免疫がかかりにくく、γ鎖に対
するモノクローナル抗体を得ることが困難であった。

課題を解決するだめの手段 本発明者らは、組換えＤＮＡ技術により大腸菌で発現さ
れたｒ鎮（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来）をＤ　Ｂ　Ａ　／
２マウスに免疫して得られる脾細胞とマウスの骨髄腫細
胞とを通常の方法で融合させて得られるハイブリドーマ
が、該γ鎖に対して反応するモノクローナル抗体を産生
ずることを見出し本発明を完成した。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、マウスγ鎖に対する抗−γ鎖モノクローナル
抗体を提供する。

本発明のモノクローナル抗体は、γ鎖でマウスを免疫し
て得られる脾細胞とマウスの骨髄腫細胞とを通常の方法
で融合させ、得られるハイブリドーマを培地に培養する
か、またはマウスの腹腔内に移植して復水癌化すること
により、培養液中または複水中に抗−ｒｔＪ４モノクロ
ーナル抗体を蓄積させ、該培養液または腹水から該モノ
クローナル抗体を採取することにより得られる。

本発明のモノクローナル抗体の製造は次のとおりに行う
。

〔１）免疫化動物細胞の調製 ＤＢＡ／２マウス（静岡実験動物農業協同組合）をγ鎖
で免疫して、その動物の牌、リンパ節又は、末梢血中の
抗体産生細胞を調製する。

γ鎖は、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来のＴ細り包よりクロー
ン化されたｃＤＮＡ配列にもとずき組換えＤＮＡ技術で
大腸菌で製造したもの〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）
　３１３．７５２−７５５　（１９８５）　）を使用す
る。

免疫の方法は、８〜１０週令の退会Ｂ　Ａ　／２マウス
の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュ
バント〔例えばフロイントの完全アジュバント　（Ｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）
あるいは、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン
など〕とともに該γ鎮１１０１ｔ〜１００爬／匹を投与
する。以後１〜２週間おきに、該Ｔ釦を２〜１０回投与
する。

各免疫後１週間で、眼底静脈叢より採血し、血清中の抗
−Ｔ鎖抗体価を以下に示す固相法による酵素免疫測定法
で調べる。

抗体価の測定法は、固相酵素免疫測定法（酵素免疫測定
法；医学書院列１９７６年）によった。

９６大のＥＴＡ用プレートＣＦｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ社（米）製〕に、特異抗原Ｃｒ　１１が１０Ｊｉ
ｇ／ｍｌとなるようフォスフェートバッファー・セイラ
イン（ＰＢＳ）（リン酸２ナトリウム１．８３ｇ。

リン酸１カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水
Ｂ、ｐＨ７，２）で希釈した溶液、交差反応をみる場合
には、γ鎮のかわりに他の抗原あるいは１％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ溶液（Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ
　Ｂ　Ｓ溶液）を用いる〕を１００■／穴ずつ分注し、
４℃で一晩放置して抗原をプレート穴底面にコートさせ
、その後Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ　Ｂ　Ｓ溶液２００ｍ／穴を分
注し、４℃で一晩放置して、プレート底面上の蛋白質結
合性残基をＢＳＡでブロック（ブロッキング）する。上
記プレートをＰＢＳでよく洗浄後、第１抗体として、段
階希釈した試料（マウス抗血清、ハイブリドーマ培養上
清、精製抗体）を５０ＡＩｌ／大分注し、４℃で一晩ま
たは室温で３〜４時間放置する。ＰＢＳで６回洗浄した
後、第２抗体として、ウサギの抗マウスイムノグロブリ
ン−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ（ＤＡＫＯ）社製、
販売：協和メデックス〕の４００倍希釈液をｌＱＯｍ／
穴分注し、室温で２時間放置する。ＰＢＳで洗浄後、Ａ
ＢＴＳ基質液Ｃ２，２’　−アジノビス（３−エチルベ
ンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ニアンモニウム５５
０■を０．１Ｍクエン酸１衝液（ｐＨ４，２）ｉｌに溶
カシタ溶液に、使用直前に過酸化水素１β／ｍｌを加え
た溶液）１００ＩｔＩｌを加え、発色をＱＤ４１ｓｎｍ
で測定する。Ｔ鎖に対する抗体価が、正常マウス血清の
１０３倍以上（４１５ｎｍでのＯＤ値）になったマウス
を免疫化動物細胞の供給源として使う。

細胞融合に供するために、免疫マウスに融合処理の３〜
４日前にＴ鎗を１０〜１１００Ｊ１／匹腹腔内投与し、
追加免疫後、膵臓を摘出し、脾細胞を調製する。膵臓を
ＭＥＭ（日永製薬社製）中で細断し、ビンセットでほぐ
し、ｌ　２０　Ｏｒｐｍ。

５分間遠心分離にかけ、上清を捨て、トリス塩化アンモ
ニウム１Ｊｉｔｉ液（ｐＨ７，６５）で１〜２分間処理
し、赤血球を除去し、ＭＥＭで３回洗浄して融合用脾細
胞として提供する。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３　　Ａｇ８−
Ｕｌ　（Ｐ３−Ｕｌ）〔カレント・トピックス・イン・
ミクロバイオロジイーアンドーイムノロジー（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　８１１−７（１９
７８））、　　Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４．１　　（Ｎ
Ｓ−１）（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イム１０
シイ　（εｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ＞　６．５１１５１９　（１９７６）　）、　　ＳＰ
２１０−Ａｇ　１４　（ＳＰ−２）〔ネイチャー　（Ｎ
ａｔｕｒｅ）　２７６、２６９−２７０（１９７８）］
、　　Ｐ　３−Ｘ　６３−Ａｇ３．６５３　（６５３）
〔ジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｊ、　１ｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ）１２３、１５４８−１５５０　（１９７９
）　）　、　　Ｐ　３−　Ｘ　６３Ａｇ８　　（Ｘ６３
）Ｃネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６゜４９５−
４９７　（１９７５））などが用いられる。これらの細
胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭ　Ｉ　−１６４
０培地にグルタミン（１，５ｍＭ）、２−メルカプトエ
タノール（５Ｘ　１０−’Ｍ）　、　　ジェンタマイシ
ン（１０ｕ／ｍｌ　）および牛胎児血清＜Ｆｅ２）（Ｃ
３Ｌ社製、１０％）を加えた正常培地に、さらに８−ア
ザグアニン（１５ｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代する
が、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当
日２Ｘ１０’以上の細胞数を確保する。

（３）細胞融合 （１）で免疫したマウスにγｔｉＪ　ｌ　０〜１００４
７匹を腹腔的投与し、３〜４日後に膵臓を摘出し、脾細
胞を調製する。この脾細胞と（２）で得られる骨髄腫細
胞をＭＥＭ培地（日永製薬社製）またはＰＢＳでよく洗
浄し、細胞数が、牌細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：ｌに
なるように混合し、遠心分離にかける。上清を捨て、沈
殿した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながらポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ−１０００〜４０００）１〜４
ｇ、ＭＥＭ培地１〜４ｎ＋１．ジメチルスルホキシド（
Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄａ）　Ｑ、５〜１．
　Ｑｍｌの混液０．１〜１．０＋ｎｌ／　１０”牌細胞
を加え、０，５〜１０分後にＭ　Ｅ　Ｍ培地０．５〜３
ｍｌを加える。

その後０．５〜２分毎にＭＥＭ培地０．５〜３ｍｌを数
回加えた後、ＭＥＭ培地を３０〜５　Ｑｍｌ加える。遠
心後、上清を揄で、ゆるやかに細胞をほぐした後、正常
培地（１０％ＦＣ３，１，５ｍＭグルタミン、　　５　
ｘ　ｌ　Ｑ−’Ｖｉ、　　２−メルカプトエタノール含
有ＲＰＭＩ−１６４０培地）５０〜２０　Ｑｍｌを加え
、メスピペットでゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁
液を培養用プレートに半容量／穴ずつ分注し、３〜７％
ＣＯ２インキ二ベーター中、３５〜４０℃で１０〜３０
時間培養する。培養プレートに半容量／穴のＨＡＴ培地
〔正常培地にヒポキサンチン（１０−’〜１０−’Ｍ）
　、チミジン（１０−”〜１０〜’Ｍ）およびアミノプ
テリン（１０−’〜１０−’Ｍ）を加えた培地〕を加え
、さらに１０〜３０時間培養する。以後１〜３日間日間
１０註３０ 培養上清半容量を揄で、新たに同量のＨＡＴ培地を加え
、ＣＯ，インキュベーター中、３５〜４０℃でｌθ〜１
４日間培養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清半容量を捨て、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、以後１〜３日
間日間１０註３０ＨＴ培地で３〜４日培養後、培養上清
の一部をきり上記の酵素免疫測定法により、抗−ｒｌｉ
ｌ抗体価を測定する。

抗体価の認められた穴について、限界希釈法によりクロ
ーニングを２〜４回繰り返し、安定して抗体価の認めら
れたものを、抗−Ｔ鎮モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマ株として選択する。

（４）モノクローナル抗体の調製 ブリスクン処理した８〜ｉｌｌ令ヌードマウス（Ｂ　Ａ
　Ｌ　Ｂ／　ｃ　ｎｕ／ｎｕ，　雌）に（３）で得られ
た抗−ｒ＆１４モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
細胞２〜４　Ｘ　１　０’個／匹を腹腔的注射する。

１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。

このマウスから腹水を採取し、遠心して固形分を除去後
、５０％硫安塩折，４０％硫安塩析をし、Ｐｆ３Ｓ　（
ｐＨ７．２）で１〜２日間透析する。

この透析画分を粗精製モノクローナル抗体として分離し
、定量用に供することができる。

さらに精製が必要な場合には、ＤＥＡＥ−セファロース
カラム、プロティンＡ−セファロースカラムなどに通塔
し、ＩｇＧ画分を集める。

抗体のイソタイプ、サブクラスの決定は、オクタｏ＝　
−　（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法（免疫学実験入門。

生物化学実験法１５．学会出版センター刊．　　ｐ７４
。

１９８１年）によって行う。

蛋白質の定量は、フォーリン法および２８０ｎｔｎでの
吸光度Ｃ　１．　４　（Ｏ　Ｄｉｅｏ）　！＝ｉイムノ
グロブリンｌ印ｇ／ｌＴｌ１〕より算出する。

かくして、ＫＭ−３　６　７．　ＫＭ−３　６　５およ
びＫＭ−３　６　９と命名したハイプリドーマ株から得
られるモノクローナル抗体ＫＭ−　３　６　７およびＫ
Ｍ−３　６　５およびＫＭ−３　６　９はそれぞれＩ　
ｇ　Ｇ＋　、　　Ｉ　ｇ　Ｇ２ｂおよびＩｇＧ．に属す
ることを同定した。

ＫＭ−３　６　７，　ＫＭ−３　６　５およびＫＭ−３
６９は、γ鎖に対して特異性を有している。

従って、ＫＭ−３　６　７，　ＫＭ−３　６　５および
ＫＭ−３　６　９は、Ｔ細胞レセプターＴ１１Ｊの機能
の解明のための研究用試薬として有用である。

ＫＭ−３　６　５およびＫＭ−３　６　９は、γ鎖およ
びδ鎖を発現している胎児胸腺細胞の破砕液中のγ鎖に
反応性を有している。

ＫＭ−３６９は、γ鎖およびδ鎖を発現しているエタノ
ール固定したマウスＴ［ａハイブリドーマに対して反応
性を有している。

なお、実施例で用いるウェスタン・プロッティング法は
、トーヴインらの方法〔プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイｘンｘ　（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）７６、４３５４
　（１９７９）　）の変法を用いた。すなわち、各種タ
ンパクをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で泳動
し、得られたゲルをニトロセルロース膜と重ね合わせ、
電気泳動トランスファー・プロッティング装置（アト−
社製）を用いて緩衝液（３ｇ／ｊ！）リス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン、１４．４ｇ／ｆグリシン、２０
％メタノール、ｐＨ８，３）中で１０℃以下、４０Ｖ、
６００ｍＡで通電し、タンパクを膜に転写スル。ニトロ
セルロース膜は風乾後、３％ゼラチン溶液でブロック（
ブロッキング）した。

ＰＢＳで洗浄後、抗−γ鎖ハイブリドーマ培養上清に浸
し、室温で２時間反応させる。さらにウサギ抗マウスイ
ムノグロブリンＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ
（ＤＡＫＯ）社製。

販売：協和メデックス〕に浸し、室温で、２時間反応さ
せる。洗浄後、ペルオキシダーゼ発色液（１００ｏ＋１
のトリス・塩酸バッファー・セイーフイ７　（ＴＢＳ）
Ｃ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン２．４２ｇ
、食塩２９．２４ｇ、蒸留水１ｊ！、ｐＨ７，５）に３
０％過酸化水素を６０４加えた溶液と、冷却したメタノ
ール２０ｍ１に遮光下、ＨＲＰカラーディベロップメン
ト・リーエイジエイント（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）６０■
を加えた溶液とを室温で混合したもの）に浸して発色さ
せ、冷水で反応を停止させる。

免疫沈降の電気泳動法は、ナカニシらの方法（ネイチ＋
　−（Ｎａｔｕｒｅ）　３２５．７２０　（１９８７）
　　〕に従った。即ち、妊娠後１７日目のＣ５７ＢＬ／
６マウスまたは、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの胎児
胸腺細胞をラクトペルオキシダーゼ法〔メソツズ・オブ
・イムノロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ）１７８　（１９７７））を用イテ１２ｓ■テ
標識した。非還元化条件下の免疫沈降を行う場合は、Ｐ
ＢＳで３回洗浄後、冷却したＮＰ４０緩衝液［：１０ｍ
Ｍトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７，５に１ｍＭフェニルメ
チルスルフォニル・フルオリド、１０％Ｎｏｎ１ｄｅｔ
　　４０　　（パーティクル・データ・ラボラトリーズ
社製）を加えたもの〕中に懸濁し、激しく振盪させ、破
砕する。破砕液に抗−γ鎖モノクローナル抗体ＫＭ−３
６７，ＫＭ−３６５およびＫＭ−３６９をおのおの加え
、免疫沈殿を行う。還元化条件下での免疫沈降を行う場
合は、上記ＮＰ４０緩衡液に５％２−メルカプトエタノ
ールを加えた溶液中に細胞を懸濁し、以下、非還元化条
件下の場合と同様に細胞を破砕し、抗−Ｔ鎖モノクロー
ナル抗体を加え、免疫沈降を行う。

一次元の電気泳動を行う場合は、還元化条件下で免疫沈
降させた沈殿画分を１２％ポリアクリルアミドゲルを用
いて、レムリの方法〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　
２２７．６８０　（１９７０）　：ｌに従って電気泳動
を行う。

二次元の電気泳動を行う場合は、非還元化条件下で免疫
沈降させた沈殿画分を内径１．５ｍｍのガラス管内に作
製した１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて一次元目
の電気泳動を行う。泳動後、ゲルをガラス管より取り出
し、５％２メルカプトエタノールを含む緩衝液中で室温
３０分間反応させた後、１２％スラブゲルにのせて、２
次元目の電気泳動を行う。

エタノール処理した細胞の蛍光抗体法はプレンナー（Ｂ
ｒｅｎｎｅｒ）らの方法〔ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ
）３２２、１４５　（１９８６）　）に従って以下のと
おり行う。

Ｔ細胞受容体Ｔ鋼、δ鎮を細胞膜表面に発現しているマ
ウスＴ細胞ハイブリドーマ株ＫＮ６及びＴ細胞受容体α
鎖、β鎮を発現しているマウスＴ細胞ハイブリドーマ株
ＫＮ３及び対照として、ＫＭ３．ＫＭ６の親株であり、
α鎖、β鎮。

γ鎖、δ鎮のいずれも発現していないマウスＴ細胞白血
病株ＢＷ５１４７（ジャーナル・オブ・イムノロジー（
Ｊ　Ｔｍｍｕｎｏｌ、）　１１０．１４７０　（１９８
３））をそれぞれＰＢＳ　（ｐＨ７，２＞中に浮遊させ
、１０１個／１８０ＩＪｉ！に調製する。−２０℃にお
いて細胞浮遊液に９５％エタノールを含むＰＢＳ溶液を
１４０ｍ加え、エタノールの最終濃度を７０％とし、さ
らに４℃で１０分間反応させる。

反応後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＫＭ−３６９の培
養上清を加え、４℃で３０分間反応させる。反応後、細
胞を０．１％ＢＳＡ及び０．１％Ｎ　ａ　Ｎ　ｓを含む
ＰＢＳ溶液で３回洗浄し、同じ組成のＰＢＳ溶液で１５
倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗マウスイムノグロブリ
ン血清（Ｋｉｒｋｇａａｒｄ　Ｔｅｒｒｙ社製）を３０
μ加え、４℃で３０分間反応させる。反応後、細胞を０
．１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ溶液で
３回洗浄し、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒ　１ｎｅ−３ｔｒ
ｅｐｔａｖ　ｉｄ　１ｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ社製）を２０４加え、４℃で３０分間反応させ
る。反応後、細胞を０．１％ＢＳΔ及び０．１％Ｎ　ａ
　Ｎ　３を含むＰＢＳ溶液で３回洗浄後、０．１％Ｎａ
Ｎ５を含むＰＢＳ溶液２００度中に浮遊させ、セルソー
ク−（日本分光、Ｆｅ２−１＞により細胞の蛍光強度を
測定し、細胞に結合した抗体量を測定する。

ここで用いるマウスＴ細胞ハイブリドーマ株ＫＮ３及び
ＫＮ６は、それぞれ昭和６３年４月１４日付で、工業技
術院微生物工業技術研究所に、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１８
５４およびＦＥＲＭＢＰ−１８５３として、寄託しであ
る。

実施例１゜ （１）　　免疫マウス牌細胞の調製 ８週令のＤＢＡ／２雌マウス（静岡実験動物農業協同組
合）５匹にアジュバントとして水酸化アルミニウムゲル
２ｍｇ／匹および百日咳菌死菌ワクチン（千葉系血清研
究所）ＩＸＩＯ’細胞／匹と抗原としてγ鎖１００ｇ／
匹を腹腔内投与し免疫した。

以後、２週問おきに、該Ｔ鎖１００ｇ／匹を腹腔内に投
与し、２回目以降の免疫をかけた。

３回目の免疫以降、免疫の５〜７日後に眼底静脈叢より
採血し、血清中の抗−Ｔ鎖抗体価を前記の固相法による
酵素免疫測定法で調べた。

３回免疫以降５匹全例で抗体価が認められたが、抗−Ｔ
鎖モノクローナル抗体を効率よく得るために、総計５回
の免疫を行った。

５回目の免疫後、Ｔ鎖１００ｘｒ／匹を腹腔内投与して
追加免疫し、３日後このマウスから牌ｍ抱を調製して細
胞融合に用いた。

（２）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｕｌを正
常培地〔ＲＰＭＩ−１６４０にグルタミン１．５ｍＭ、
２−メルカプトエタノール５Ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍ、　　ジ
ェンタマイシンＩ（ｌｘ／ｍｌおよびこれに牛胎児血清
（Ｆｅ２）（１０％）を加えた培地〕で培養し、４日後
に２Ｘ１０’個以上の細胞を得た。

（３）ハイブリドーマの作製 ＭＥＭ　（日永製薬社製）でよく洗浄した免疫マウス牌
細胞ｌＸｌ０”ｉとマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｕｌ　　２
ＸＩＯ’個を混合し、１．２０　Ｏｒｐｍで５分間遠心
分離にかけた。

沈殿として得られた脾細胞とＰ　３−Ｕ　ｌの混合した
細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら３７℃で、ポリ
エチレングリコール−１，０００（ＰＥＧ　−１０００
）　２　ｇ、　ＭＥＭ２ｍｌおよびＤＭＳｏ　　０．７
ｍｌの混液０．５ｍｌ／４０’抗体産生細胞を加え、１
分後にＭ　Ｅ　Ｍ　１　＋１１１を加えた。

その後ＭＥＭ１ｍｌを１分毎に５回加えた後、ＭＥＭを
全容１が５　Ｑｍｌとなるように加えた。

９００ｒｐｍ、　５分間遠心分離後、上清を捨て、ゆる
やかに細胞をほぐした後、正常培地１０　Ｑｍｌを加え
、１０…１メスピペツトでゆるやかに！ｆｆｉ抱を懸濁
した。

懸濁液を２４穴培養用プレ一トＣＦｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ社（米）製〕に１＋＋＋ｌ／穴ずつ分注し、
５％ＣＯ２インキニベーター中、３７℃で２４時間培養
した。培養プレートに１ｍｌ／穴のＨＡＴ培地〔上記正
常培地にヒポキサンチンＩ　Ｏ−’Ｍ、チミジン１．５
　Ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍおよびアミノプテリン４　Ｘ　１０
−’Ｍを加えた培地〕を加え、さらに２４時間培養した
。培養上清１ｍｌを楡で、あらたにＨＡＴ培地培地１奢
ｌえ、３７℃でさらに２４時間培養した。培養上清１＋
ｙ＋ｌを捨て、ＨＡＴ培地培地１奢ｌえ、３７℃でさら
に１０〜１４日間培養した。

コロニー状に生育してきた融合細胞のみられる穴につい
て、上清１ｍｌを捨て、ＨＴ培地〔上記ＨへＴ培地より
アミノプテリンを除いた培地〕を１ｍｌ加えて３７℃で
培養した。以後２日間同様にＨＴ培地への交換を行い、
培養を続け４日後、培養上清の一部を採取し、抗−γ鎖
抗体価を上記の同相酵素免疫測定法により測定した。

抗体価の認められた穴については、限界希釈法によりク
ローニングを２回繰り返し、安定して抗体価の認められ
たクローンを抗−Ｔ鎖モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマ株としてＫＭ−３６７，ＫＭ−３６５およびＫＭ
−３６９を選択した。ハイプリドーマ株ＫＭ−３６７゜
ＫＭ−３６５およびＫＭ−３６９はそれぞれ英国εｕｒ
ｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ＾ｎｉｍａｌ
　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓにＥＣＡＣＣＮα８７０
４１６０４．　Ｎα８７０５２１０１およびＮα８７０
８０６０１として昭和６２年４月１６日、同６２年５月
２１日および同６２年５月２日イ寸でそれぞれ寄託しで
ある。

（４）モノクローナル抗体の部分精製 プリスタン処理（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカ７（２，５，１（１，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔ
ｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）０．５１１１１／匹を
復腔内投与し、２週間飼育する。〕した８週令タードマ
ウス（Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　ｎｕ／ｎｕ。

雌）に上記で得られたハイプリドーマ株各４×１０６細
胞／匹を腹腔的注射した。１０〜２１日後にハイプリド
ーマ株は腹水癌化する。１０〜２１日後に腹水のたまっ
たマウスから腹水（４〜ｌＱｍｌ）を採取し、３．００
　Ｏｒｐｍ、　５分間遠心分離して固形分を除去した。

上清を５０％硫安塩析＄よび４０％硫安塩析し、ＰＢＳ
（ｐＨ７，２）で２日間透析した。これを粗精製モノク
ローナル抗体ＫＭ−３６７，ＫＭ−３６５およびＫＭ−
３６９とした。

（５）粗精製モノクローナル抗体の抗原特異性固相酵素
免疫測定法により粗精製モノクローナル抗体の抗原特異
性を測定した。抗原としては、大腸菌によって生産され
たｒｍのほかに宿主大膓菌由来夾雑タンパクおよび牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）（生化学工業社製）を用いた。

結果を第１表に示す。

正常マウス血清 第 表 ｌ０−２ ０、ＯＯ，１ ｏ、　ｏｏ。

０、１３０ 粗精製モノクローナル抗体をＤＥＡＥセファロースカラ
ム（ワットマン社製、ベツドボリューム１ｍ１）に通塔
後溶出し、ＩｇＧ画分を集め精製モノクローナル抗体と
した。

（６）モノクローナル抗体の分類 オフタロニー（口ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法でＫＭ−３
６７゜ＫＭ−３６５およびＫＭ−３６９の抗体のイソタ
イプを調べたところ、抗体がＩｇＧクラスに属するモノ
クローナル抗体であり、さらにＫＭ−３６７およびＫＭ
−３６９はＩ　ｇ　Ｇ＋、　ＫＭ３６５はＩｇＧ２ｂサ
ブクラスの抗体であると同定された。

実施例２゜ 前記のウェスタン・プロッティング法によりＫＭ−３６
７の大腸菌によって生産されたγ鎖に対する反応性を調
べた。その結果を第１図に示した。ＫＭ−３６７は、γ
鎖と特異的に反応した。

ＫＭ−３６５およびＫＭ−３６９についても同様の結果
が得られた。

実施例３゜ 前記の方法に従い、免疫沈降の１次元及び２次元電気泳
動法により、Ｔ鎮を発現している妊娠１７日口のＣ５７
ＢＬ／６マウスの胎児胸腺細胞に対するＫＭ−３６５の
反応性を調べた。２次元電気泳動の結果を第２図に示し
た。ＫＭ−３６５による沈殿物中には、γ鎖（３５ｋｄ
）およびδ鎮（４５ｋｄ）が含まれていた。

１次元の電気泳動の結果、ＫＭ−３６５は、還元化条件
下でＴ鎮を免疫沈降させ、β鎖を免疫沈降させなかった
。

以上の結果は、ＫＭ−３６５がγ鎖に対して特異的に反
応し、β鎖には反応せず、β鎖は、γ鎖にジスルフィド
結合していることを示している。

ＢＡＬＢ／Ｃマウスの胎児胸腺細胞に対しても、同様の
結果が得られた。

ＫＭ−３６９についてもＫＭ−３６５と同様に胎児胸腺
細胞のγ鎖に対して反応性を有していたが、ＫＭ−３６
７については、該反応性は得られなかった。

実施例４゜ 前記の方法に従い、細胞をエタノール固定処理後、蛍光
抗体法により細胞膜上にγ鎖およびδ鎮を発現している
マウスＴ細胞ノ＼イブリドーマ株ＫＮ６およびγ鎖およ
びβ鎖を発現せず、α鎖およびβ鎖を発現しているマウ
スＴ細胞ノ１イプリドーマ株ＫＮ３、および対照として
、ＫＭ３．ＫＭ６の親株でα鎖、β鎖、γ鎖、β鎖のい
ずれも発現していないマウスＴＩＢｌａ白血病株ＢＷ５
１４７に対するＫＭ−３６９の反応性を調べた。その結
果を第３図に示した。ＫＭ３の相対蛍光強度は、対照の
ＢＷ５１４７の相対蛍光強度と一致し、ＫＮ−３６９は
γ鎖を発現していないＫＭ３には反応しないことが示さ
れた。ＫＭ６の相対蛍光強度は、対照のＢＷ５１４７と
比較するとピークの位置が右側（蛍光強度強）に移動し
ており、ＫＭ−３６９はγ鎖を発現しているＫＭ６に反
応していることが示された。

以上の結果から、実施例３で細胞破砕液中のγ鎖に反応
することが示されたＫＭ−３６９はγ鎖を発現している
エタノール固定処理細胞に選択的に反応することが示さ
れた。

ＫＭ−３６９の代わりに、ＫＭ−３６７とＫＭ３６５お
のおのを用いて、同様に蛍光抗体法によりエタノール固
定処理細胞に対する反応性を調べたが、該反応性は得ら
れなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２のウェスタン・プロッティング法に
よりＫＭ３６７の特異性を調べた結果を示す。Ａ）　は
アミドブラック染色、Ｂ）はＫＭ−３６７による免疫染
色である。Ａ）、　Ｂ）　とも■は分子量マーカー（１
４，４ｋｄ：リゾチーム。 ２１．５ｋｄ：ソイビーン・トリプシン・インヒビター
、３１ｋｄ：カーボニック・アンヒドラーゼ。 ４５ｋｄ：オボアルブミン、６６．２ｋｄ：ＢＳＡ。 ９２．５ｋｄ：ホスホリラーゼｂ）、■はγ鎖、■は宿
主大腸菌由来夾雑タンパクを示す。 第２図は、実施例３の免疫沈降の２次元電気泳動の結果
を示す。１次元目（横方向）は非還元条件下、２次元目
（縦方向）は還元条件下で泳動を行った。左端は分子量
マーカー（１４ｋｄ：’Ｊゾチーム、１３ｋｄ：β−ラ
クトグロブリン、２６ｋｄ：α−キモトリプシノーゲン
、４３ｋｄ：オポアルブミン、６９ｋｄ：ＢＳＡ、９２
ｋｄ：ホスホリラーゼｂ、２００ｋｄ：ミオンン重鎮）
を示す。 第３図は、実施例４の蛍光抗体法の結果を示す。 （ａ）は、ＫＭ−３６９のＢＷ５１４７に対する反応性
、（ｂ）は、ＫＭ−３６９のＫＭ３に対する反応性、（
Ｃ）は、ＫＭ−３６９のＫＭ６に対する反応性を示す。 第 図 第 ユ 図 −〉 井３Ｘ九色骨

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）マウスＴ細胞レセプターγ鎖（以下γ鎖と略記す
   る。）に対する抗−γ鎖モノクローナル抗体。
2. （２）サブクラスがＩｇＧ＿１に属する請求項（１）記
   載のモノクローナル抗体。
3. （３）サブクラスがＩｇＧ＿２＿ｂに属する請求項（１
   ）記載のモノクローナル抗体。
4. （４）該抗体を生産するハイブリドーマが、ＫＭ−３６
   ７（ＥＣＡＣＣＮｏ．８７０４１６０４）である請求項
   （２）記載のモノクローナル抗体。
5. （５）該抗体を生産するハイブリドーマが、ＫＭ−３６
   ９（ＥＣＡＣＣＮｏ．８７０８０６０１）である請求項
   （２）記載のモノクローナル抗体。
6. （６）該抗体を生産するハイブリドーマが、ＫＭ−３６
   ５（ＥＣＡＣＣＮｏ．８７０５２１０１）である請求項
   （３）記載のモノクローナル抗体。
7. （７）γ鎖でマウスを免疫して得られる脾細胞とマウス
   の骨髄腫細胞とを通常の方法で融合させ、得られるハイ
   ブリドーマを培地に培養するか、またはマウスの腹腔内
   に移植して腹水癌化することにより、培養液中または腹
   水中に抗−γ鎖モノクローナル抗体を蓄積させ、該培養
   液または腹水から該モノクローナル抗体を採取すること
   を特徴とする抗−γ鎖モノクローナル抗体の製造法。
8. （８）請求項（１）記載のモノクローナル抗体を生産す
   るハイブリドーマ。
9. （９）ハイブリドーマＫＭ−３６７（ＥＣＡＣＣＮｏ．
   ８７０４１６０４）
10. （１０）ハイブリドーマＫＭ−３６５（ＥＣＡＣＣＮｏ
    ．８７０５２１０１）
11. （１１）ハイブリドーマＫＭ−３６９（ＥＣＡＣＣＮｏ
    ．８７０８０６０１）