FR2656532A1 - Proteine antigenique presente sur des cellules sat, anticorps correspondants et leurs applications. - Google Patents
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- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
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Abstract
La présente invention concerne une protéine antigénique caractérisée en ce qu'il s'agit de la protéine gammadelta 1 ou d'un dérivé de cette protéine, à savoir la protéine gammadelta 1 non glycosylée ou comportant des glycosylations non naturelles ou un fragment de la protéine gammadelta 1 ayant les sites antigéniques essentiels de la protéine gammadelta 1, glycosylé ou non glycosylé, la protéine gammadelta 1 étant: - une glycoprotéine de 110+- 10 kDa, - exprimée sur certaines cellules T portant l'hétérodimère gammadelta. Elle concerne également les anticorps dirigés contre cette protéine, les trousses de diagnostic comportant ladite protéine ou les anticorps et un médicament comportant à titre de principe actif la protéine selon l'invention ou les anticorps correspondants.
Description
La présente invention concerne notamment une protéine
antigénique présente sur des cellules sTA, ainsi que les anticorps
correspondants et leurs applications.
antigénique présente sur des cellules sTA, ainsi que les anticorps
correspondants et leurs applications.
Ces cellules sTA constituent un sous groupe des lymphocytes T
CD3+ portant un type particulier de récepteur antigénique (TcR). Les TcR
sont des glycoprotéines hétérodimériques associées de façon non covalente
au complexe CD3. La plupart des lymphocytes T du thymus et des tissus
lymphoîdes périphériques expriment un TcR de 90 kDa composé de deux
sous-unités a et ss . Mais un petit pourcentage de thymocytes, cellules
spléniques et lymphocytes sanguins périphériques présente une forme de
TcR alternative yd, de spécificité mal connue.
CD3+ portant un type particulier de récepteur antigénique (TcR). Les TcR
sont des glycoprotéines hétérodimériques associées de façon non covalente
au complexe CD3. La plupart des lymphocytes T du thymus et des tissus
lymphoîdes périphériques expriment un TcR de 90 kDa composé de deux
sous-unités a et ss . Mais un petit pourcentage de thymocytes, cellules
spléniques et lymphocytes sanguins périphériques présente une forme de
TcR alternative yd, de spécificité mal connue.
Jusqu'à présent les sous-populations de lymphocytes Tyd ont été
définies par des Ac monoclonaux contre des régions variables du TcR ou
parcaractérisation biochimique de la forme moléculaire du TcR. Mais on n'a
pas rapporté d'Ac caractérisant fonctionnellement un sous-ensemble de
cellules TcR yd spécialisées.
définies par des Ac monoclonaux contre des régions variables du TcR ou
parcaractérisation biochimique de la forme moléculaire du TcR. Mais on n'a
pas rapporté d'Ac caractérisant fonctionnellement un sous-ensemble de
cellules TcR yd spécialisées.
C'est pourquoi, la présente invention concerne plus particulière
ment une protéine appelée yd 1.
ment une protéine appelée yd 1.
Cette protéine est portée par une fraction de cellules T qui ne
répondent pas vigoureusement à une stimulation par CD3. Ces cellules sTA
se trouvent dans le sang d'individus normaux, mais sont surtout isolées de
sang de patients, soit ayant subi une transplantation de moelle osseuse, soit
de leucémiques en rémission complète.
répondent pas vigoureusement à une stimulation par CD3. Ces cellules sTA
se trouvent dans le sang d'individus normaux, mais sont surtout isolées de
sang de patients, soit ayant subi une transplantation de moelle osseuse, soit
de leucémiques en rémission complète.
La présente invention concerne plus particulièrement une
protéine antigénique caractérisée en ce qu'il s'agit de la protéine ydl ou
d'un dérivé de cette protéine à savoir la protéine ydl non glycosylée ou
comportant des glycosylations non naturelles ou un fragment de la protéine yd 1 ayant les sites antigéniques essentiels de la protéine Y6l, glycosylé ou
non glycosylé, la protéine yd 1 étant
- une glycoprotéine de 110 + 10 kDa,
- exprimée sur certaines cellules T portant l'hétérodimère y
Cette protéine est un Ag d'activation produit par un sous-ensemble de cellules à un stade (jour 4) du cycle de stimulation, ces cellules ayant sans doute une activité cytotoxique, stimulables par IL2.
protéine antigénique caractérisée en ce qu'il s'agit de la protéine ydl ou
d'un dérivé de cette protéine à savoir la protéine ydl non glycosylée ou
comportant des glycosylations non naturelles ou un fragment de la protéine yd 1 ayant les sites antigéniques essentiels de la protéine Y6l, glycosylé ou
non glycosylé, la protéine yd 1 étant
- une glycoprotéine de 110 + 10 kDa,
- exprimée sur certaines cellules T portant l'hétérodimère y
Cette protéine est un Ag d'activation produit par un sous-ensemble de cellules à un stade (jour 4) du cycle de stimulation, ces cellules ayant sans doute une activité cytotoxique, stimulables par IL2.
Cette glycoprotéineydl est caractérisée par un poids moléculaire de 110 + 10 kDa, déterminé en conditions réductrices. En conditions non réductrices, sa masse apparente déterminée par immunoprécipitation et migration en SDS est de 103 kDa. Elle est différente de la molécule CD26 précédemment décrite, ainsi que de CD30, CD3I.
ydl peut être obtenu par l'action d'un Ac spécifique sur le surnageant de culture de cellules sTA. L'invention concerne également les anticorps, notamment les anticorps monoclonaux dirigés contre cette protéine, et particulièrement l'Ac monoclonal spécifique de y 6 1 décrit dans les exemples, obtenu par immunisation de souris BALB/c de 6 semaines par voie I.P. et I.V. (voir matériel et méthodes) par le clone de cellules DS6 et par la technique des hybridomes. Cet Ac est une IgGl.
L'invention concerne également l'expression de cette protéine par des techniques d'ADN recombinant chez les eucaryotes ou les procaryotes.
Elle concerne également l'obtention de cette protéine par purification à partir de cellules productrices, par des techniques d'immunoprécipitation ou d'autres techniques.
L'invention concerne également l'emploi de cette protéine ou des anticorps correspondants à titre de médicament pour le traitement notamment dans des processus tumoraux, éventuellement en coopération avec d'autres produits anticancéreux.
L'invention concerne également l'emploi de la protéine ou de l'Ac correspondant dans un but diagnostic d'états pathologiques.
Elle concerne également l'emploi de ces molécules dans le suivi du traitement d'affection ou comme voyant d'apparition de ces affections.
Les exemples ci-après permettront de mieux comprendre les autres - avantages et caractéristiques de la présente invention.
Sur les dessins annexés, - la figure 1 représente la cinétique d'expression de la molécule γ# t sur
des clones de cellules T, DS6, L10 et D1, stimulés par PHA et des
cellules nourricières ; les études ont été pratiquées par analyse par tri
des cellules activées par fluorescence ; DS6 et D1 sont des clones
exprimant les TcRyG et TcRciB liés par liaison disulfure, provenant du
sang d'un patient après transplantation de moëlle osseuse ;L10 est un
clone exprimant le TcRy lié par liaison disulfure, provenant du sang
d'un individu normal - la figure 2 représente t'analyse SDS-PAGE d'immunoprécipités d'anti
γ# 1 provenant de lysat de cellules DS6 ; le lysat de cellules marquées
à l'iode-l 25 utilisé pour l'immunoprécipitation est un lysat à 1 % de
NP40 provenant de cellules DS6 ; les anticorps utilisés pour l'immuno
précipitation sont des anti-ydl (lignes 1 et 2) et CD26 "TA1" (lignes 3
et 4) ; les immunoprécipités ont été réalisés en conditions réductrices
(lignes 1 et 3) ou non réductrices (lignes 2 et 4) sur SDS-PAGE 7,5 %
des marqueurs Mr(10-3) sont indiqués sur la gauche du gel.
des clones de cellules T, DS6, L10 et D1, stimulés par PHA et des
cellules nourricières ; les études ont été pratiquées par analyse par tri
des cellules activées par fluorescence ; DS6 et D1 sont des clones
exprimant les TcRyG et TcRciB liés par liaison disulfure, provenant du
sang d'un patient après transplantation de moëlle osseuse ;L10 est un
clone exprimant le TcRy lié par liaison disulfure, provenant du sang
d'un individu normal - la figure 2 représente t'analyse SDS-PAGE d'immunoprécipités d'anti
γ# 1 provenant de lysat de cellules DS6 ; le lysat de cellules marquées
à l'iode-l 25 utilisé pour l'immunoprécipitation est un lysat à 1 % de
NP40 provenant de cellules DS6 ; les anticorps utilisés pour l'immuno
précipitation sont des anti-ydl (lignes 1 et 2) et CD26 "TA1" (lignes 3
et 4) ; les immunoprécipités ont été réalisés en conditions réductrices
(lignes 1 et 3) ou non réductrices (lignes 2 et 4) sur SDS-PAGE 7,5 %
des marqueurs Mr(10-3) sont indiqués sur la gauche du gel.
MATERIELS ET METHODES Production d'anticorps anti-y 6 1.
Une souris BALB/c ayant 6 semaines est immunisée par voie intrapéritonéale avec 20 x l o6 cellules du clone cellulaire DS6 T déjà décrit (19). Deux semaines plus tard, une seconde injection intrapéritonéale de 20 x 106 cellules est effectuée, et une semaine plus tard 10 x 106 cellules sont injectées par voie intrapéritonéale et 20 x 106 cellules sont injectées par voie intraveineuse. Quatre jours après la dernière immunisation, les cellules sont collectées à partir de la rate et sont fusionnées avec des cellules de myelome NS-I. Les cultures d'hybridomes sont effectuées en suivant les protocoles connus.
Les surnageants d'hybridomes sont testés pour leur réactivité sélective avec les cellules DS6 en utilisant l'immunofluorescence Indirecte et une cytométrie de flux.
Le surnageant de l'une des 822 cultures d'hybridomes réagit violemment avec les cellules DS6 et ne marque pas 5 clones de cellules T exprimant TcRc. Cette culture dénommée anti-ydl est clonée deux fois par la technique de dilution en limite. Les hydridomes clonés sont passés à plusieurs reprises par injection intrapéritonéale dans des souris BALB/c (primées avec du pristane). Les ascites sont collectées, ultracentrifugées et purifiées par affinité sur une colonne de protéine A sepharose. L'anticorps est un IgGl.
Isolement de population cellulaire
Des cellules mononuclées de sang périphérique humain (PBMC) sont préparées par centrifugation en gradient de densité Ficoîl-Isopaque. La population non fractionnée est séparée entre populations négative au test rosette (E-) et positive au test de rosette (E+), ceci par test de rosette sur des erythrocytes de mouton à 5 %. Le mélange de test est étalé sur Ficoîl-Isopaque et les populations E et E+ sont séparées par centrifugation.
Des cellules mononuclées de sang périphérique humain (PBMC) sont préparées par centrifugation en gradient de densité Ficoîl-Isopaque. La population non fractionnée est séparée entre populations négative au test rosette (E-) et positive au test de rosette (E+), ceci par test de rosette sur des erythrocytes de mouton à 5 %. Le mélange de test est étalé sur Ficoîl-Isopaque et les populations E et E+ sont séparées par centrifugation.
Les cellules E sont récupérées à partir de l'interface, tandis que les cellules E + sont obtenues sous forme de culot après lyse hypotonique des erythrocytes de mouton. Les cellules du sang périphérique CD3/TcRyd sont obtenues par sélection en utilisant t'immunofluorescence directe et le microfluoromètre Facstar (Becton Dickinson Mountain View, CA). Les monocytes sont obtenus à partir des cellules E par adhérence sur du verre une nuit. Les lymphocytes granulaires de grande taille sont obtenus par gradient percoll. Environ 108 PBMC sont étalés sur un percoll 7-étapes (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden). Le gradient discontinu contenant des couches de 1,5 ml donne 42,5, 45,0, 47,5, 50,0, 52,5, 55,0 et 66,7 % de Percoll ajusté à 285 mOsm/kg H20 avec 10 x PBS, pH 7,3, avant utilisation. L'analyse FACS montre que les fractions correspondantes au
LGL ne réagissent pas avec des anticorps monoclonaux OKT3 mAb. Les cellules thymiques sont isolées selon la procédure standard (Gelin C. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:4912). Les lignées cellulaires leucémiques et les lignées de cellules B transformés par EBV sont exempts de mycoplasme et maintenus en croissance logarithmique dans un milieu
RPMI-1640 contenant 15 % de sérum de veau foetal et des antibiotiques.
LGL ne réagissent pas avec des anticorps monoclonaux OKT3 mAb. Les cellules thymiques sont isolées selon la procédure standard (Gelin C. et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:4912). Les lignées cellulaires leucémiques et les lignées de cellules B transformés par EBV sont exempts de mycoplasme et maintenus en croissance logarithmique dans un milieu
RPMI-1640 contenant 15 % de sérum de veau foetal et des antibiotiques.
Des échantillons de sang cryoconservés provenant de patients ayant une leucémie lymphocytaire aigüe et une leucémie myelocytaire aigüe, ainsi que des échantillons de moelle osseuse cryoconservée provenant de donneurs volontaires sains, ont été fournis par la banque du sang de l'Hôpital Saint Louis.
Clones de cellules T humaines.
Les cellules T clonées sont obtenues à partir du sang de patients présentant un immunodéficit prolongé après une transplantation de moelle osseuse allogénique (Vilmer E. et al., 1988, J. Clin. Invest. 82:755), ou de patients présentant une leucémie lymphoblastique aigue non-T, non-B en complète rémission (Bensussan A. et al., Blood (sous presse)). En plus, les clones TcRyd sont également dérivés à partir du sang d'individus normaux et sont obtenus en suivant le procédé déjà décrit précédemment (David V.
et al. Scand. J. Immunol. 27:473). Des clones de cellules T portant TcRa(3 et TcRyd sont isolées de chaque individu. Les cellules T clonées sont obtenues par la technique de dilution limite dans laquelle les PBMC sont étalées à une concentration de 0,3 cellule par puits dans une plaque à 96 puits ayant un fond en V (Greiner, Nürtingen, FRG). Les plaques sont tout d'abord alimentées avec des couches nourricières contenant du matériau autologue irradié (6x104 cellules par puits) dans un milieu complet contenant 25 U/ml de rIL2 (Roussel Uclaf, Romainville, France) et 1 ,ug/ml de PHA (Wellcome,
Beckenham, UK).Le milieu de culture utilisé est RPMI 1640 (GIBCO,
Paisley, Scotland) auquel on a ajouté 10 % de sérum AB humain inactivé par la chaleur, avec 2 mmol/l de L-glutamine et de la pénicilline (100 U/ml) streptomycine (100 lug/ml). Après 72 heures, le milieu de culture est remplacé et les clones sont soumis à un milieu contenant rIL2 et les cellules en croissance sont expansées comme cela était décrit précédemment (David V. et al., 1987, J. Immunol. 138:2831). Le sous-clonage est effectué dans les mêmes conditions de culture à 0,3 cellules par puits. Les cellules reclonées sont restimulées chaque 12 jours en présence de couches nourricières dans une plaque à 96 puits présentant un fond en V (5 x 104 cellules clonees sont étalées avec 5 x 104 PBMC irradié dans chaque puits).
Beckenham, UK).Le milieu de culture utilisé est RPMI 1640 (GIBCO,
Paisley, Scotland) auquel on a ajouté 10 % de sérum AB humain inactivé par la chaleur, avec 2 mmol/l de L-glutamine et de la pénicilline (100 U/ml) streptomycine (100 lug/ml). Après 72 heures, le milieu de culture est remplacé et les clones sont soumis à un milieu contenant rIL2 et les cellules en croissance sont expansées comme cela était décrit précédemment (David V. et al., 1987, J. Immunol. 138:2831). Le sous-clonage est effectué dans les mêmes conditions de culture à 0,3 cellules par puits. Les cellules reclonées sont restimulées chaque 12 jours en présence de couches nourricières dans une plaque à 96 puits présentant un fond en V (5 x 104 cellules clonees sont étalées avec 5 x 104 PBMC irradié dans chaque puits).
Analyse phénotypique des antigènes de surfaces cellulaires
L'analyse phénotypique est effectuée par immunofluorescence indirecte avec un F(ab')2lgG de chèvre anti-souris conjugué avec la fluorescéine. Des échantillons sont analysés sur un cytofluorographe (Facstar, Becton-Dickinson, Mountain View, CA). 104 cellules sont analysées dans chaque échantillon. Les ascites dérivées d'un hybridome non réactif sont utilisées comme témoin négatif pour déterminer la fluorescence correspondant à un bruit de fond. Les anticorps monoclonaux WT31 et BMA031, qui réagissent avec les déterminants partagés sur les molécules humaines constantes Ti ass ont été respectivement fournis par le Docteur
J.E. de Vries (Unicet Laboratories, Dardilly, France) et le Docteur A.
L'analyse phénotypique est effectuée par immunofluorescence indirecte avec un F(ab')2lgG de chèvre anti-souris conjugué avec la fluorescéine. Des échantillons sont analysés sur un cytofluorographe (Facstar, Becton-Dickinson, Mountain View, CA). 104 cellules sont analysées dans chaque échantillon. Les ascites dérivées d'un hybridome non réactif sont utilisées comme témoin négatif pour déterminer la fluorescence correspondant à un bruit de fond. Les anticorps monoclonaux WT31 et BMA031, qui réagissent avec les déterminants partagés sur les molécules humaines constantes Ti ass ont été respectivement fournis par le Docteur
J.E. de Vries (Unicet Laboratories, Dardilly, France) et le Docteur A.
Musitelli (Behring, Rueil, France). L'anticorps monoclonal anti-TCRG 1 est réactif avec un épitope constant de la chaîne TcRd (les ascites ont été communiquées par le Dr. M. Brenner, DFCI, Boston MA). L'anticorps monoclonal BB3 qui détecte Vd 2 était communiqué par le Dr. A. Moretta (INRC, Gêne, Italie et TCS1 qui réagit avec Vd 1 a été acheté chez T Cell
Science, Cambridge, Ma. CD4, CD8 et CD3 ont été produits dans notre laboratoire.
Science, Cambridge, Ma. CD4, CD8 et CD3 ont été produits dans notre laboratoire.
Etudes biochimiques
Les protéines de surface cellulaire ont été marquées par iodination catalysée à la lactoperoxidase comme cela a été décrit par
Hubbard A.L. et Cohn Z.A., 1976 In Biochemical analysis of membranes.
Les protéines de surface cellulaire ont été marquées par iodination catalysée à la lactoperoxidase comme cela a été décrit par
Hubbard A.L. et Cohn Z.A., 1976 In Biochemical analysis of membranes.
A.H. Maddy, ed. Chapman & Hall, London, p. 427. Les cellules sont alors lysées (2xlO7/ml) par maintien pendant 15-30 mn à 0 C dans un tampon de lyse (lOmM Tris-HCl, pH 7,4, contenant 1 % (poids/volume) Nonidet P40, 0,15 M Nacl, 1 mg/ml d'albumine de sérum bovin (BSA) et 2 mM de fluorure de phényl-méthylsulphonyle, 20mM d'iodoacétamide et de l'aprotînine 1 unité internationale (Sigma) comme inhibiteur de protéase). Les noyaux sont éliminés par centrifugation pendant 10 mn à 2000 g et le surnageant est centrifugé pendant 30 mn à 100 000 g 4"C. Après centrifugation, tes lysats sont dialysés à 4"C pendant une nuit pour éliminer le matériel radioactif dialysable.Les lysats cellulaires sont préclarifiés de façon très
importante avec des billes de protéines A sepharose 4B liées à CD18. Des
aliquots des lysats préclarifiés sont absorbés séquentiellement soit par anti γ#1 ou anti-Tal (les ascites ayant été communiquées par Dr. E. Reinherz
DFCl, Boston, MA) ces anticorps étant réticulés sur de la protéine
A-sepharose (5 à 10 mg d'anticorps purifiés par ml de gel) en utilisant le
diméthylpimelimidate -Hcl comme cela est décrit (Schneider C. et al., 1982,
J. Biol. Chem. 257:766). Les aliquots de lysats spécifiquement appauvris
sont alors immunoprécités soit par des anti-Tal soit par des anti-γ#1. Les
précipités immuns sont lavés, élués en conditions réductrice et non
réductrice et analysés sur 7,5 % SDS-PAGE.L'autoradiographie des plaques
de gel séchées est effectuée à -700C. Les poids moléculaires sont calculés
par référence à la mobilité de protéines standards.
importante avec des billes de protéines A sepharose 4B liées à CD18. Des
aliquots des lysats préclarifiés sont absorbés séquentiellement soit par anti γ#1 ou anti-Tal (les ascites ayant été communiquées par Dr. E. Reinherz
DFCl, Boston, MA) ces anticorps étant réticulés sur de la protéine
A-sepharose (5 à 10 mg d'anticorps purifiés par ml de gel) en utilisant le
diméthylpimelimidate -Hcl comme cela est décrit (Schneider C. et al., 1982,
J. Biol. Chem. 257:766). Les aliquots de lysats spécifiquement appauvris
sont alors immunoprécités soit par des anti-Tal soit par des anti-γ#1. Les
précipités immuns sont lavés, élués en conditions réductrice et non
réductrice et analysés sur 7,5 % SDS-PAGE.L'autoradiographie des plaques
de gel séchées est effectuée à -700C. Les poids moléculaires sont calculés
par référence à la mobilité de protéines standards.
Essais de calcium ionisé intracellulaire
La procédure utilisée pour la mesure de [Ca2 Ji dans des cellules
uniques a été décrit par Rabinovitch P.S. et al., 1986, J. Immunol. 137:952).
La procédure utilisée pour la mesure de [Ca2 Ji dans des cellules
uniques a été décrit par Rabinovitch P.S. et al., 1986, J. Immunol. 137:952).
Exemple I
Spécificité des anticorps monoclonaux anti-y I
De façon à obtenir des anticorps monoclonaux contre les structures de surface TcRγ#des cellules, on immunise des souris avec des cellules portant les structures TcRyScomme cela était décrit précédemment,
puis on compare les surnageants des différents hybridomes par capacité à
se lier avec les cellules ayant servi à t'immunisation et à ne pas se lier
avec des clones de cellules T autologue exprimant l'hetérodimèriqueagcR.
Spécificité des anticorps monoclonaux anti-y I
De façon à obtenir des anticorps monoclonaux contre les structures de surface TcRγ#des cellules, on immunise des souris avec des cellules portant les structures TcRyScomme cela était décrit précédemment,
puis on compare les surnageants des différents hybridomes par capacité à
se lier avec les cellules ayant servi à t'immunisation et à ne pas se lier
avec des clones de cellules T autologue exprimant l'hetérodimèriqueagcR.
L'anticorps correspondant est nommé anti-y31 et purifié à partir des fluides
d'ascites pour des expériences complémentaires.
d'ascites pour des expériences complémentaires.
Le tableau I rassemble les résultats observés avec les anti-y6 I
purifiés et montre qu'ils reconnaissent une structure exprimée par la
majorité des clones TcRy
Parmi les cellules clonées exprimant TcRaa seuls 3 des 18 clones
CD4 CD8, et un des deux clones CD4 CD8 sont marqués par l'anti-y31.
purifiés et montre qu'ils reconnaissent une structure exprimée par la
majorité des clones TcRy
Parmi les cellules clonées exprimant TcRaa seuls 3 des 18 clones
CD4 CD8, et un des deux clones CD4 CD8 sont marqués par l'anti-y31.
En tout état de cause, aucun des 20 CD4 CD8 ne réagit avec
l'anticorps et en accord avec ces dernières observations, les lymphocytes de sang périphérique de différents individus, y compris les donneurs des clones de cellules Tyd1 stimulés avec la PHA aussi bien que les cellules PB non T stimulées avec PWM sont trouvés comme n'étant pas réactifs avec les anti-yd 1 à différents stades après la stimulation. L'analyse de l'expression de yd 1 par des clones NK CD3 montre que l'un des 5 clones est réactif avec l'anti- y3 1.
l'anticorps et en accord avec ces dernières observations, les lymphocytes de sang périphérique de différents individus, y compris les donneurs des clones de cellules Tyd1 stimulés avec la PHA aussi bien que les cellules PB non T stimulées avec PWM sont trouvés comme n'étant pas réactifs avec les anti-yd 1 à différents stades après la stimulation. L'analyse de l'expression de yd 1 par des clones NK CD3 montre que l'un des 5 clones est réactif avec l'anti- y3 1.
L'absence de la réactivité anti-yd 1 sur des cellules de sang périphérique au repos, grands lymphocytes granuleux, les thymocytes, les cellules de rate et les cellules de moelle osseuse, les cellules de lignées de cellules B et les populations tumorales, affirme que l'anti-ydl définit une structure exprimée sur des cellules d'une population très restreinte. En outre, des cellules TcRyd au repos ne se marquent pas avec des anti-ydl, ce qui confirme que cet anticorps monoclonal est uniquement réactif avec une sous-population de cellules activées.En outre, il est intéressant de noter qu aucune des 7 lignes tumorales, incluant la lignée cellulaire Peer, exprimant le TcR y3 ne montre de réactivité avec l'anti- y3 1. Ainsi, la croissance continue des cellules in vitro n'induit pas Itexpression yd 1.
Exemple 2
Cinétique d'expression de γ# 1 pendant le cycle de stimulation des clones de cellules T.
Cinétique d'expression de γ# 1 pendant le cycle de stimulation des clones de cellules T.
L'anti-γ#1 ne marque pas les cellules TcRy3qui viennent d'être isolées du sang périphérique, mais apparaît après un un temps d'activation assez long dans les populations de cellules clonées.
La figure 1 montre l'expression de γ# 1 sur trois clones de cellules T représentatives à différents intervalles après leur stimulation avec la PHA.
L'intensité de la réaction anti-ybl sur les clones γ#1 positifs est maximale 4 jours après la stimulation et décroît de façon significative au jour 10 ou 12.
Le niveau de l'expression γ#1 varie suivant les clones mais est indépendant de la nature du stimulus appliqué puisque les résultats sont obtenus de la même façon lorsque l'on utilise d'autres modes de stimulation.
Exemple 3
Caractérisation biochimique des clones cellulaires T DS6 portant γ# 1.
Caractérisation biochimique des clones cellulaires T DS6 portant γ# 1.
De façon à caractériser la structure moléculaire reconnue par l'anticorps anti-y31 des cellules DS6 sont marquées en surface avec de l'iode 125 et la lactoperoxydase.
Comme cela est indiqué dans la figure 2, les anticorps monoclonaux anti-y # 1 immunoprécipitent une bande unique ayant une masse moléculaire apparente de 103 kDa en condition non réductrice (ligne 2). Cette bande n'est pas présente dans t'immunoprécipité de contrôle.
En condition réductrice, la bande se déplace et apparaît à un poids moléculaire de 110 kDa (ligne 1). Compte tenu du fait que y3 1 est présent sur certaines cellules activées, il est important de comparer cette molécule à des structures déjà décrites de 103-105 kDa ayant une distribution moléculaire analogue et dénommée molécule CD26 et qui sont reconnues par l'anticorps monoclonal Tal. Les essais effectués montrent que la molécule CD26 et y31 sont des molécules différentes.
Tableau 1
Réactivité d'anti- γ#1 avec des cellules humaines hématopolétiques variées
Cellules testées Nombre de positives (*)/nombre de testées
A. Clones de cellules dépendantes de rIL2
CD3/TcR γ#+, CD4- et CD8- 16/27
CD3/TcR γ#+, CD4- et CD8+ 4/6
CD3/TcR αss+, CD4+ et CD8- 0/20
CD3/TcR αss+, CD4- et CD8+ 3/18
CD3/TcR αss+, CD4- et CD8- 1/2
CD3/TcR- 1/5
B. Populations de cellules hématopoïétiques normales 0/5
cellules du sang périphérique E+, cellules de sang
périphérique E-, grands lymphocytes granuleux, cellules
de sang périphérique CD3/TcR γ#+, monocytes, thymocytes,
cellules spléniques et cellules de moëlle osseuse
C. Lignées de cellules leucémiques 0/7
Rex, Jurkat, CEM, K562, Peer, U937 et HL60
D. Cellules malignes 0/4
leucémie aiguë lymphocytaire (T, B ou non-T, non-B)
leucémie aiguë myélocytaire
E. Lignée de cellules B 0/10
lignée de cellules B transformées par le virus EB (*) Réactivité de différentes populations cellulaires analysée par cytométrie de flux: + = > 50% et - = < 10%
Réactivité d'anti- γ#1 avec des cellules humaines hématopolétiques variées
Cellules testées Nombre de positives (*)/nombre de testées
A. Clones de cellules dépendantes de rIL2
CD3/TcR γ#+, CD4- et CD8- 16/27
CD3/TcR γ#+, CD4- et CD8+ 4/6
CD3/TcR αss+, CD4+ et CD8- 0/20
CD3/TcR αss+, CD4- et CD8+ 3/18
CD3/TcR αss+, CD4- et CD8- 1/2
CD3/TcR- 1/5
B. Populations de cellules hématopoïétiques normales 0/5
cellules du sang périphérique E+, cellules de sang
périphérique E-, grands lymphocytes granuleux, cellules
de sang périphérique CD3/TcR γ#+, monocytes, thymocytes,
cellules spléniques et cellules de moëlle osseuse
C. Lignées de cellules leucémiques 0/7
Rex, Jurkat, CEM, K562, Peer, U937 et HL60
D. Cellules malignes 0/4
leucémie aiguë lymphocytaire (T, B ou non-T, non-B)
leucémie aiguë myélocytaire
E. Lignée de cellules B 0/10
lignée de cellules B transformées par le virus EB (*) Réactivité de différentes populations cellulaires analysée par cytométrie de flux: + = > 50% et - = < 10%
Claims (6)
1) Protéine antigénique caractérisée en ce qu'il s'agit de la protéine γ#1 ou d'un dérivé de cette protéine, à savoir la protéineydl non glycosylée ou comportant des glycosylations non naturelles ou un fragment de la protéineydl ayant les sites antigéniques essentiels de la protéineydl, glycosylé ou non glycosylé, la protéine γ#1 étant - une glycoprotéine de 110 + 10 kDa, - exprimée sur certaines cellules T portant t'hétérodimère y6.
2) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte un marquage permettant son dosage in vitro ou sa localisation in vivo ou ex vivo.
3) Anticorps dirigé contre une protéine antigénique selon l'une des revendications 1 et 2.
4) Anticorps selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comporte un marquage permettant son dosage in vitro ou sa localisation in vivo ou ex vivo.
5) Trousse de diagnostic comportant une protéine ou un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4.
6) Médicament comportant à titre de principe actif une protéine ou un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8917443A FR2656532A1 (fr) | 1989-12-29 | 1989-12-29 | Proteine antigenique presente sur des cellules sat, anticorps correspondants et leurs applications. |
| PCT/FR1990/000948 WO1991009620A1 (fr) | 1989-12-29 | 1990-12-27 | PROTEINE ANTIGENIQUE sTA PRESENTE SUR DES CELLULES, ANTICORPS CORRESPONDANTS ET LEURS APPLICATIONS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8917443A FR2656532A1 (fr) | 1989-12-29 | 1989-12-29 | Proteine antigenique presente sur des cellules sat, anticorps correspondants et leurs applications. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2656532A1 true FR2656532A1 (fr) | 1991-07-05 |
Family
ID=9389141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8917443A Withdrawn FR2656532A1 (fr) | 1989-12-29 | 1989-12-29 | Proteine antigenique presente sur des cellules sat, anticorps correspondants et leurs applications. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2656532A1 (fr) |
| WO (1) | WO1991009620A1 (fr) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9117522D0 (en) * | 1991-08-14 | 1991-10-02 | Medical Res Council | Ligands for dendritic cells, their uses and production |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988000209A1 (fr) * | 1986-07-03 | 1988-01-14 | T Cell Sciences, Inc. | RECEPTEURS gamma, delta DE CELLULES T ET PROCEDES DE DETECTION |
| FR2621127A1 (fr) * | 1987-09-30 | 1989-03-31 | Roussy Inst Gustave | Anticorps monoclonal reconnaissant un epitope de la chaine gamma des recepteurs de surface des cellules t humaines, lignee de cellules d'hybridomes produisant cet anticorps, et utilisation de cet anticorps monoclonal |
-
1989
- 1989-12-29 FR FR8917443A patent/FR2656532A1/fr not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-12-27 WO PCT/FR1990/000948 patent/WO1991009620A1/fr active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988000209A1 (fr) * | 1986-07-03 | 1988-01-14 | T Cell Sciences, Inc. | RECEPTEURS gamma, delta DE CELLULES T ET PROCEDES DE DETECTION |
| FR2621127A1 (fr) * | 1987-09-30 | 1989-03-31 | Roussy Inst Gustave | Anticorps monoclonal reconnaissant un epitope de la chaine gamma des recepteurs de surface des cellules t humaines, lignee de cellules d'hybridomes produisant cet anticorps, et utilisation de cet anticorps monoclonal |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1991009620A1 (fr) | 1991-07-11 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |