WO1991009620A1 - PROTEINE ANTIGENIQUE sTA PRESENTE SUR DES CELLULES, ANTICORPS CORRESPONDANTS ET LEURS APPLICATIONS - Google Patents

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WO1991009620A1
WO1991009620A1 PCT/FR1990/000948 FR9000948W WO9109620A1 WO 1991009620 A1 WO1991009620 A1 WO 1991009620A1 FR 9000948 W FR9000948 W FR 9000948W WO 9109620 A1 WO9109620 A1 WO 9109620A1
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sta
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antigenic
glycosylated
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PCT/FR1990/000948
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Armand Bensussan
Laurence Boumsell
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • ANTIGENIC PROTEIN IS PRESENT ON CELLS, CORRESPONDING ANTIBODIES AND THEIR APPLICATIONS
  • the present invention relates in particular to an antigenic protein, present on cells, called sTA, as well as the corresponding antibodies and their applications.
  • TcR antigen receptor
  • T f6 lymphocytes have been defined by monoclonal Ab against variable regions of TcR or by biochemical characterization of the molecular form of TcR.
  • no Ac has been reported functionally characterizing a subset of specialized TcR ⁇ £ cells.
  • the present invention relates more particularly to a protein called sTA.
  • This protein is carried by a fraction of T cells which do not respond vigorously to stimulation by CD3. These cells that carry the sTA molecule are found in the blood of normal individuals, but are mainly isolated from the blood of patients, either having undergone a bone marrow transplant, or leukemia in complete remission. This sTA molecule was initially found on a population of £ lymphocytes, but it also exists on other cells in smaller quantities and therefore difficult to detect by conventional techniques.
  • the present invention relates more particularly to an antigenic protein characterized in that it is the sTA protein or a derivative of this protein, namely the non-glycosylated sTA protein or comprising non-natural glycosylations or a fragment of the sTA protein.
  • the sTA protein having the essential antigenic sites of the sTA protein, glycosylated or non-glycosylated, the sTA protein being: a glycoprotein of 1 10 + _ 10 kDa, expressed on certain T cells carrying the heterodimer ⁇ -S
  • This protein is an activating Ag produced by a subset of cells at one stage (day) of the stimulation cycle, these cells probably having cytotoxic activity, which can be stimulated by IL2.
  • This sTA glycoprotein is characterized by a molecular weight of 1 10 f 10 kDa, determined under reducing conditions. Under non-reducing conditions, its apparent mass determined by immunoprecipitation and migration to SDS is 103 kDa. It is different from the CD26 molecule previously described, as well as from CD30, CD31. sTA can in particular be obtained by the action of a specific Ab on the culture supernatant of TCR ⁇ cells.
  • the invention also relates to the antibodies, in particular the monoclonal antibodies directed against this protein, and in particular the specific monoclonal Ac of sTA described in the examples, obtained by immunization of 6-week-old BALB / c mice by the I.P. and IN route. (see material and methods) by the DS6 cell clone and by the hybridoma technique. This Ac is an IgGl.
  • the sTA molecule detected by the monoclonal antibody when it interacts with its ligand, transduces a cell activation signal. This signal acts only in synergy with the main activation induced by the specific T cell receptor.
  • the invention also relates to the expression of this protein by recombinant DNA techniques in eukaryotes or prokaryotes.
  • the invention also relates to the use of this protein or of the corresponding antibodies as a medicament for the treatment in particular in tumor processes, possibly in cooperation with other anticancer products.
  • the invention also relates to the use of the corresponding protein or cAP for the purpose of diagnosing pathological conditions.
  • FIG. 1 represents the kinetics of expression of the sTA molecule on clones of T, D56, L10 and Dl cells, stimulated by PHA and of feeder cells; the studies were carried out by analysis by sorting of the cells activated by fluorescence; DS6 and D l are clones expressing TcR ⁇ and Tc ol ⁇ linked by disulfide bond, originating from the blood of a patient after bone marrow transplantation; L10 is a clone expressing TcRjf-S linked by disulfide bond, originating from the blood of a normal individual; Figure 2 shows the SDS-PAGE analysis of anti-sTA immunoprecipitates from DS6 cell lysate; the iodine-125 labeled cell lysate used for immunoprecipitation is a 1% NP 0 lysate from DS6 cells; the antibodies used for immunoprecipitation are anti-sTA (lines 1 and 2) and CD26 "TA1"
  • a 6-week-old BALB / c mouse is immunized intraperitoneally with 20 x 10 cells of the cell clone DS6 T already described (19). Two weeks later, a second intraperitoneal injection of 20 x 10 cells is made, and a week later 10 x 10 cells are injected intraperitoneally and 20 x 10 cells are injected intravenously. Four days after the last immunization, the cells are collected from the spleen and are fused with NS-1 myeloma cells. Hybridoma cultures are carried out according to known protocols.
  • the hybridoma supernatants are tested for their selective reactivity with DS6 cells using indirect immunofluorescence and flow cytometry.
  • the supernatant from one of the 822 hybridoma cultures reacts violently with DS6 cells and does not label 5 T cell clones expressing TcR ⁇ .
  • This culture called anti-sTA, is cloned twice by the limit dilution technique.
  • the cloned hydridomes are passed repeatedly by intraperitoneal injection into BALB / c mice (primed with pristane).
  • the ascites are collected, ultracentrifuged and affinity purified on a column of protein A sepharose.
  • the antibody is an IgGl. Isolation of cell population
  • PBMC Human peripheral blood mononuclear cells
  • CD 3 / TcR jf "* -" peripheral blood cells are obtained by selection using direct immunofluorescence and Facstar microfluorometer (Becton Dickinson Mountain View, CA). Monocytes are obtained from E ⁇ cells by adhesion to glass. overnight. Large granular lymphocytes are obtained by percoll gradient. Approximately 108 PBMC are spread on a 7-step percoll.
  • Leukemic cell lines and B cell lines transformed with EBV are free of mycoplasma and maintained in logarithmic growth in RPMI-1640 medium containing 15% fetal calf serum and antibiotics.
  • T cells are obtained from the blood of patients with prolonged immunodeficiency after allogeneic bone marrow transplantation (Vilmer E. et al., 1988, 3. Clin. Invest. 82: 755), or patients with leukemia non-T, non-B acute lymphoblastic in complete remission (Bensussan A. et al., Blood (in press)).
  • the TcR ⁇ f ⁇ S clones are also derived from the blood of normal individuals and are obtained by following the method already described previously (David V. et al. Scand. 3. Immunol. 27: 473).
  • T cell clones carrying TcRo ( ⁇ and TcR) f ⁇ S are isolated from each individual.
  • the cloned T cells are obtained by the limiting dilution technique in which the PBMCs are spread at a concentration of 0.3 cells per well in a 96-well plate having a V-bottom (Greiner, N ⁇ rtingen, FRG).
  • the plates are firstly fed with feeder layers containing irradiated autologous material (6 ⁇ 10 cells per well) in a complete medium containing 25 U / ml of rIL2 (Roussel Uclaf, Romainville, France) and 1 ⁇ g / ml of PHA (Wellcome, Beckenham, UK).
  • the culture medium used is RPMI 1640 (GIBCO, Paisley, Ontariond) to which 10% heat-inactivated human AB serum was added, with 2 mmol / 1 L-glutamine and penicillin (100 U / ml) streptomycin (100 ⁇ g / ml). After 72 hours, the culture medium is replaced and the clones are subjected to a medium containing rIL2 and the growing cells are expanded as described above (David V. et al., 1987, J. Immunol. 138: 2831). The subcloning is carried out under the same culture conditions at 0.3 cells per well.
  • the recloned cells are restimulated every 12 days in the presence of feeder layers in a 96-well plate having a V-bottom (5 ⁇ 10 cloned cells are spread with 5 ⁇ 10 PBMC irradiated in each well). Phenotypic analysis of cell surface antigens
  • Phenotypic analysis is carried out by indirect immunofluorescence with an F (ab ') _ anti-mouse goat IgG conjugated with fluorescein. Samples are analyzed on a cytofluorograph (Facstar, Becton-Dickinson, Mountain View, CA). 10 cells are analyzed in each sample. Ascites derived from a non-reactive hybridoma are used as a negative control to determine the fluorescence corresponding to background noise.
  • the monoclonal antibodies WT31 and BMA031, which react with the shared determinants on the constant human molecules Ti-s-tf - * - were respectively supplied by Doctor JE de Vries (Unicef Laboratories, Dardilly, France) and Doctor A.
  • the anti-TCR-S 1 monoclonal antibody is reactive with a constant epitope of the TcR chain (the ascites were communicated by Dr. M. Brenner, DFCI, Boston MA).
  • the monoclonal antibody BB3 which detects V £ 2 was communicated by Dr. A. Moretta (INRC, Genoa, Italy and TCS1 which reacts with V ⁇ 1 was purchased from T Cell Science, Cambridge, Ma. CD4, CD8 and CD3 have have been produced in our laboratory Biochemical studies Cell surface proteins have been labeled by iodination catalyzed by lactoperoxidase as described by Hubbard AL and Cohn ZA, 1976 In Biochemical analysis of membranes.
  • AH Maddy ed. Chapman & Hall, London, p. 427.
  • the cells are then lysed (2x10 / ml) by holding for 15-30 min at 0 ° C in a lysis buffer (l OmM Tris-HCl, pH 7.4, containing 1% (weight / volume) Nonidet P40 , 0.15 M Nacl, 1 mg / ml bovine serum albumin (BSA) and 2 mM phenyl-methylsulphony fluoride, 20 mM iodoacetamide and Paprotinin 1 international unit (Sigma) as protease inhibitor).
  • BSA bovine serum albumin
  • the nuclei are removed by centrifugation for 10 min at 2000 g and the supernatant is centrifuged for 30 min at 100,000 g at 4 ° C. After centrifugation, the
  • lysates are dialyzed at 4 ° C overnight to remove the dialysable radioactive material.
  • the cell lysates are very much preclarified with protein A sepharose 4B beads linked to CD 18.
  • Aliquots of the preclarified lysates are absorbed sequentially either by anti-sTA or anti-Tal (the ascites having been communicated by Dr. E. Reinherz l ** - 1 DFC1, Boston, MA) these antibodies being crosslinked on protein A-Sepharose (5 to 10 mg of purified antibodies per ml of gel) using dimethylpimeiimidate -Hcl as described (Schneider C . et al., 1982, 3. Biol. Chem. 257: 766). The aliquots of specifically depleted lysates are then immunoprecipitated either by anti-Tal or by anti-sTA.
  • the aliquots of specifically depleted lysates are then immunoprecipitated either by anti-Tal or by anti-s
  • mice are immunized with cells carrying the TcRJj structures As described above,
  • the supernatants of the various hybridomas are compared by the ability to bind with the cells used for immunization and not to bind with clones of autologous T cells expressing the heterodimer ⁇ TcR.
  • the corresponding antibody is named anti-sTA and purified from ascites fluids for additional experiments.
  • Table I collates the results observed with the purified anti-sTAs and shows that they recognize a structure expressed by the majority of the TcR tfS clones.
  • the anti-sTA does not mark the TcRfê cells which have just been isolated from the peripheral blood, but appears after a fairly long activation time in the populations of cloned cells.
  • Figure 1 shows the expression of sTA on three representative T cell clones at different intervals after their stimulation with PHA.
  • the intensity of the anti-sTA reaction on the positive sTA clones is maximum 4 days after stimulation and decreases significantly on day 10 or 12.
  • the level of sTA expression varies according to the clones but is independent of the nature of the stimulus applied since the results are obtained in the same way when other stimulation modes are used.
  • Example 3 Biochemical characterization of T DS6 cell clones carrying sTA.
  • DS6 cells are labeled on the surface with iodine 125 and lactoperoxidase.
  • the anti-sTA monoclonal antibodies immunoprecipitate a single band having an apparent molecular mass of 103 kDa under non-reducing conditions (line 2). This band is not present in the control immunoprecipitate.
  • E + peripheral blood cells E- peripheral blood cells, large granular lymphocytes, CD3 / TcRtfS + peripheral blood cells, monocytes, thymocytes, spleen cells and bone marrow cells
  • T Malignant cells 0/4 acute lymphocytic leukemia (T, B or non-T, non-B) acute myelocytic leukemia

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Abstract

La présente invention concerne une protéine antigénique caractérisée en ce qu'il s'agit de la protéine sTA ou d'un dérivé de cette protéine, à savoir la protéine sTA non glycosylée ou comportant des glycosylations non naturelles ou un fragment de la protéine sTA ayant les sites antigéniques essentiels de la protéine sTA, glucosylé ou non glycosylé, la protéine sTA étant: une glycoprotéine de 110 U 10 kDa, exprimée sur certaines cellules T portant l'hétérodimère gammadelta. Elle concerne également les anticorps dirigés contre cette protéine, les trousses de diagnostic comportant ladite protéine ou les anticorps et un médicament comportant à titre de principe actif la protéine selon l'invention ou les anticorps correspondants.

Description

PROTEINE ANTIGENIQUE sTA PRESENTE SUR DES CELLULES, ANTICORPS CORRESPONDANTS ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention concerne notamment une protéine antigénique, présente sur des cellules, appelée sTA, ainsi que les anticorps correspondants et leurs applications.
Les cellules qui portent la molécule sTA ont d'abord été identifiées à un sous groupe des lymphocytes T CD3+ portant un type particulier de récepteur antigénique (TcR). Les TcR sont des glycoprotéines hétérodimériques associées de façon non covalente au complexe C D3. La plupart des lymphocytes T du thymus et des tissus ly phoîdes périphériques expriment un TcR de 90 kDa composé de deux sous-unitésoi et f . Mais un petit pourcentage de thymocytes, cellules spléniques et lymphocytes sanguins périphériques présente une forme de TcR alternative ξ> , de spécificité mal connue.
Jusqu'à présent les sous-populations de lymphocytes T)f6 ont été définies par des Ac monoclonaux contre des régions variables du TcR ou par caractérisation biochimique de la forme moléculaire du TcR. Mais on n'a pas rapporté d'Ac caractérisant fonctionnellement un sous-ensemble de cellules TcRγ£ spécialisées.
C'est pourquoi, la présente invention concerne plus particulière¬ ment une protéine appelée sTA. Cette protéine est portée par une fraction de cellules T qui ne répondent pas vigoureusement à une stimulation par CD3. Ces cellules qui portent la molécule sTA se trouvent dans le sang d'individus normaux, mais sont surtout isolées de sang de patients, soit ayant subi une transplantation de moelle osseuse, soit de leucémiques en rémission complète. Cette molécule sTA a été initialement trouvée sur une population de lymphocytes £ , mais elle existe également sur d'autres cellules à des quantités moindres et donc difficilement détectable par les techniques classiques. La présente invention concerne plus particulièrement une protéine antigénique caractérisée en ce qu'il s'agit de la protéine sTA ou d'un dérivé de cette protéine à savoir la protéine sTA non glycosylee ou comportant des glycosylations non naturelles ou un fragment de la protéine sTA ayant les sites antigéniques essentiels de la protéine sTA, glycosylé ou non glycosylé, la protéine sTA étant : une glycoprotéine de 1 10 +_ 10 kDa, exprimée sur certaines cellules T portant l'hétérodimère ^-S
Cette protéine est un Ag d'activation produit par un sous-ensemble de cellules à un stade (jour ) du cycle de stimulation, ces cellules ayant sans doute une activité cytotoxique, stimulables par IL2.
Cette glycoprotéine sTA est caractérisée par un poids molé¬ culaire de 1 10 f 10 kDa, déterminé en conditions réductrices. En conditions non réductrices, sa masse apparente déterminée par immunoprécipitation et migration en SDS est de 103 kDa. Elle est différente de la molécule CD26 précédemment décrite, ainsi que de CD30, CD31. sTA peut notamment être obtenu par l'action d'un Ac spécifique sur le surnageant de culture de cellules TCR^ . L'invention concerne également les anticorps, notamment les anticorps monoclonaux dirigés contre cette protéine, et particulièrement l'Ac monoclonal spécifique de sTA décrit dans les exemples, obtenu par immunisation de souris BALB/c de 6 semaines par voie I.P. et IN. (voir matériel et méthodes) par le clone de cellules DS6 et par la technique des hybridomes. Cet Ac est une IgGl.
La molécule sTA détectée par l'anticorps monoclonal, lorsqu'elle interagit avec son ligand, transduit un signal d'activation cellulaire. Ce signal agit uniquement en synergie avec l'activation principale induite par le récepteur spécifique des lymphocytes T.
L'invention concerne également l'expression de cette protéine par des techniques d'ADN recombinant chez les eucaryotes ou les procaryotes.
Elle concerne également l'obtention de cette protéine par purification à partir de cellules productrices, par des techniques d'immuno- précipitation ou d'autres techniques.
L'invention concerne également l'emploi de cette protéine ou des anticorps correspondants à titre de médicament pour le traitement notamment dans des processus tumoraux, éventuellement en coopération avec d'autres produits anticancéreux. L'invention concerne également l'emploi de la protéine ou de PAc correspondant dans un but diagnostic d'états pathologiques.
Elle concerne également l'emploi de ces molécules dans le suivi du traitement d'affection ou comme voyant d'apparition de ces affections.
Les exemples ci-après permettront de mieux comprendre les autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
Sur les dessins annexés, la figure 1 représente la cinétique d'expression de la molécule sTA sur des clones de cellules T, D56, L10 et Dl, stimulés par PHA et des cellules nourricières ; les études ont été pratiquées par analyse par tri des cellules activées par fluorescence ; DS6 et D l sont des clones exprimant les TcR < et Tc olβ liés par liaison disulfure, provenant du sang d'un patient après transplantation de moelle osseuse ; L10 est un clone exprimant le TcRjf-S lié par liaison disulfure, provenant du sang d'un individu normal ; la figure 2 représente l'analyse SDS-PAGE d'immunoprécipités d'anti- sTA provenant de lysat de cellules DS6 ; le lysat de cellules marquées à l'iode-125 utilisé pour l'immunoprécipitation est un lysat à 1 % de NP 0 provenant de cellules DS6 ; les anticorps utilisés pour l'immuno¬ précipitation sont des anti-sTA (lignes 1 et 2) et CD26 "TA1" (lignes 3 et ) ; les immunoprécipités ont été réalisés en conditions réductrices
(lignes 1 et 3) ou non réductrices (lignes 2 et 4) sur SDS-PAGE 7,5 % ; des marqueurs Mr( 10 -3 ) sont indiqués sur la gauche du gel.
MATERIELS ET METHODES Production d'anticorps anti-^iS !•
Une souris BALB/c ayant 6 semaines est immunisée par voie intraperitoneale avec 20 x 10 cellules du clone cellulaire DS6 T déjà décrit (19). Deux semaines plus tard, une seconde injection intraperitoneale de 20 x 10 cellules est effectuée, et une semaine plus tard 10 x 10 cellules sont injectées par voie intraperitoneale et 20 x 10 cellules sont injectées par voie intraveineuse. Quatre jours après la dernière immuni¬ sation, les cellules sont collectées à partir de la rate et sont fusionnées avec des cellules de myelome NS-1. Les cultures d'hybridomes sont effectuées en suivant les protocoles connus.
Les surnageants d'hybridomes sont testés pour leur réactivité sélective avec les cellules DS6 en utilisant Pimmunofluorescence indirecte et une cytométrie de flux.
Le surnageant de l'une des 822 cultures d'hybridomes réagit violemment avec les cellules DS6 et ne marque pas 5 clones de cellules T exprimant TcR< . Cette culture dénommée anti-sTA est clonée deux fois par la technique de dilution en limite. Les hydridomes clones sont passés à plusieurs reprises par injection intraperitoneale dans des souris BALB/c (primées avec du pristane). Les ascites sont collectées, ultracentrifugées et purifiées par affinité sur une colonne de protéine A sepharose. L'anticorps est un IgGl. Isolement de population cellulaire
Des cellules mononuclées de sang périphérique humain (PBMC) sont préparées par centrifugation en gradient de densité Ficoll-Isopaque. La population non fractionnée est séparée entre populations négative au test rosette (E~) et positive au test de rosette (E ), ceci par test de rosette sur des erythrocytes de mouton à 5 %. Le mélange de test est étalé sur Ficoll-Isopaque et les populations E~ et E sont séparées par centrifugation. Les cellules E~ sont récupérées à partir de l'interface, tandis que les cellules E+ sont obtenues sous forme de culot après lyse hypotonique des erythrocytes de mouton. Les cellules du sang périphérique CD 3 /TcR jf"*-» sont obtenues par sélection en utilisant Pimmunofluorescence directe et le microfluoromètre Facstar (Becton Dickinson Mountain View, CA). Les monocytes sont obtenus à partir des cellules E~ par adhérence sur du verre une nuit. Les lymphocytes granulaires de grande taille sont obtenus par gradient percoll. Environ 108 PBMC sont étalés sur un percoll 7-étapes
(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden). Le gradient discontinu contenant des couches de 1,5 ml donne 42,5, 45,0, 47,5, 50,0, 52,5, 55,0 et 66,7 % de Percoll ajusté à 285 mOsm/kg H20 avec 10 x PBS, pH 7,3, avant utilisation. L'analyse FACS montre que les fractions correspondantes au LGL ne réagissent pas avec des anticorps monoclonaux OKT3 mAb. Les cellules thymiques sont isolées selon la procédure standard (Gelin C. et ai., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81 :4912). Les lignées cellulaires leucémiques et les lignées de cellules B transformés par EBV sont exempts de mycoplasme et maintenus en croissance logarithmique dans un milieu RPMI-1640 contenant 15 % de sérum de veau foetal et des antibiotiques. Des échantillons de sang cryoconservés provenant de patients ayant une leucémie lymphocytaire aigϋe et une leucémie myeiocytaire aiguë, ainsi que des échantillons de moelle osseuse cryoconservée provenant de donneurs volontaires sains, ont été fournis par la banque du sang de l'Hôpital Saint Louis. Clones de cellules T humaines.
Les cellules T clonées sont obtenues à partir du sang de patients présentant un immunodéficit prolongé après une transplantation de moelle osseuse allogénique (Vilmer E. et al., 1988, 3. Clin. Invest. 82:755), ou de patients présentant une leucémie lymphoblastique aiguë non-T, non-B en complète rémission (Bensussan A. et al., Blood (sous presse)). En plus, les clones TcR }f<S sont également dérivés à partir du sang d'individus normaux et sont obtenus en suivant le procédé déjà décrit précédemment (David V. et al. Scand. 3. Immunol. 27:473). Des clones de cellules T portant TcRo(β et TcR)f<S sont isolées de chaque individu. Les cellules T clonées sont obtenues ar la technique de dilution limite dans laquelle les PBMC sont étalées à une concentration de 0,3 cellule par puits dans une plaque à 96 puits ayant un fond en V (Greiner, Nϋrtingen, FRG). Les plaques sont tout d'abord alimentées avec des couches nourricières contenant du matériau autologue irradié (6x 10 cellules par puits) dans un milieu complet contenant 25 U/ml de rIL2 (Roussel Uclaf, Romainville, France) et 1 μg/ml de PHA (Wellcome, Beckenham, UK). Le milieu de culture utilisé est RPMI 1640 (GIBCO, Paisley, Scotiand) auquel on a ajouté 10 % de sérum AB humain inactivé par la chaleur, avec 2 mmol/1 de L-glutamine et de la pénicilline (100 U/ml) streptomycine (100 μg/ml). Après 72 heures, le milieu de culture est remplacé et les clones sont soumis à un milieu contenant rIL2 et les cellules en croissance sont expansées comme cela était décrit précédem¬ ment (David V. et al., 1987, J. Immunol. 138:2831). Le sous-clonage est effectué dans les mêmes conditions de culture à 0,3 cellules par puits. Les cellules reclonées sont restimulées chaque 12 jours en présence de couches nourricières dans une plaque à 96 puits présentant un fond en V (5 x 10 cellules clonées sont étalées avec 5 x 10 PBMC irradié dans chaque puits). Analyse phénotypique des antigènes de surfaces cellulaires
L'analyse phénotypique est effectuée par immunofluorescence indirecte avec un F(ab')_IgG de chèvre anti-souris conjugué avec la fluorescéine. Des échantillons sont analysés sur un cytofluorographe (Facstar, Becton-Dickinson, Mountain View, CA). 10 cellules sont analysées dans chaque échantillon. Les ascites dérivées d'un hybridome non réactif sont utilisées comme témoin négatif pour déterminer la fluorescence correspondant à un bruit de fond. Les anticorps monoclonaux WT31 et BMA031, qui réagissent avec les déterminants partagés sur les molécules humaines constantes Ti-s-tf-*- ont été respectivement fournis par le Docteur J.E. de Vries (Unicef Laboratories, Dardilly, France) et le Docteur A. Musitelii (Behring, Rueil, France). L'anticorps monoclonal anti-TCR-S 1 est réactif avec un épitope constant de la chaîne TcR (les ascites ont été communiquées par le Dr. M. Brenner, DFCI, Boston MA). L'anticorps monoclonal BB3 qui détecte V£ 2 était communiqué par le Dr. A. Moretta (INRC, Gêne, Italie et TCS1 qui réagit avec Vδ 1 a été acheté chez T Cell Science, Cambridge, Ma. CD4, CD8 et CD3 ont été produits dans notre laboratoire. Etudes biochimiques Les protéines de surface cellulaire ont été marquées par iodination catalysée à la lactoperoxidase comme cela a été décrit par Hubbard A.L. et Cohn Z.A., 1976 In Biochemical analysis of membranes. A. H. Maddy, éd. Chapman & Hall, London, p. 427. Les cellules sont alors lysées (2x10 /ml) par maintien pendant 15-30 mn à 0°C dans un tampon de lyse ( l OmM Tris-HCl, pH 7,4, contenant 1 % (poids/volume) Nonidet P40, 0,15 M Nacl, 1 mg/ml d'albumine de sérum bovin (BSA) et 2 mM de fluorure de phényl-méthylsulphonyie, 20mM d'iodoacétamide et de Paprotinine 1 unité internationale (Sigma) comme inhibiteur de protéase). Les noyaux sont éliminés par centrifugation pendant 10 mn à 2000 g et le surnageant est centrifugé pendant 30 mn à 100 000 g 4°C. Après centrifugation, les
10 lysats sont dialyses à 4°C pendant une nuit pour éliminer le matériel radioactif dialysable. Les lysats cellulaires sont préclarifiés de façon très importante avec des billes de protéines A sepharose 4B liées à CD 18. Des aliquots des lysats préclarifiés sont absorbés séquentiellement soit par anti- sTA ou anti-Tal (les ascites ayant été communiquées par Dr. E. Reinherz l **-1 DFC1, Boston, MA) ces anticorps étant réticulés sur de la protéine A-sepharose (5 à 10 mg d'anticorps purifiés par ml de gel) en utilisant le diméthylpimeiimidate -Hcl comme cela est décrit (Schneider C. et al., 1982, 3. Biol. Chem. 257:766). Les aliquots de lysats spécifiquement appauvris sont alors immunoprécités soit par des anti-Tal soit par des anti-sTA. Les
20 précipités immuns sont lavés, élues en conditions réductrice et non réductrice et analysés sur 7,5 % SDS-PAGE. L'autoradiographie des plaques de gel séchées est effectuée à -70°C. Les poids moléculaires sont calculés par référence à la mobilité de protéines standards. Essais de calcium ionisé intracellulaire 5 La procédure utilisée pour la mesure de [Ca ]. dans des cellules uniques a été décrit par Rabinovitch P.S. et al., 1986, 3. Immunol. 137:952). Exemple 1 Spécificité des anticorps monoclonaux anti-sTA
De façon à obtenir des anticorps monoclonaux contre les structures de surface TcR)f<£ des cellules, on immunise des souris avec des cellules portant les structures TcRJjScomme cela était décrit précédemment,
5 puis on compare les surnageants des différents hybridomes par capacité à se lier avec les cellules ayant servi à l'immunisation et à ne pas se lier avec des clones de cellules T autologue exprimant Phétérodimèrique^TcR. L'anticorps correspondant est nommé anti-sTA et purifié à partir des fluides d'ascites pour des expériences complémentaires.
Le tableau I rassemble les résultats observés avec les anti-sTA purifiés et montre qu'ils reconnaissent une structure exprimée par la majorité des clones TcR tfS .
Parmi les cellules clonées exprimant TcRe;^, seuls 3 des 18 clones CD4 CD8 , et un des deux clones CD4~CD8 sont marqués par Panti-sTA.
En tout état de cause, aucun des 20 CD4 CD8~ ne réagit avec l'anticorps et en accord avec ces dernières observations, les lymphocytes de sang périphérique de différents individus, y compris les donneurs des clones de cellules TsTA stimulés avec la PHA aussi bien que les cellules PB npn T stimulées avec PWM sont trouvés comme n'étant pas réactifs avec les anti-sTA à différents stades après la stimulation. L'analyse de l'expression de sTA par des clones NK CD3~ montre que l'un des 5 clones est réactif avec Panti-sTA.
L'absence de la réactivité anti-sTA sur des cellules de sang périphérique au repos, grands lymphocytes granuleux, les thymocytes, les cellules de rate et les cellules de moelle osseuse, les cellules de lignées de cellules B et les populations tumorales, affirme que Panti-sTA définit une structure exprimée sur des cellules d'une population très restreinte. En outre, des cellules TcRtf-î au repos ne se marquent pas avec des anti-sTA, ce qui confirme que cet anticorps monoclonal est uniquement réactif avec une sous-population de cellules activées. En outre, il est intéressant de noter qu'aucune des 7 lignes tumorales, incluant la lignée cellulaire Peer, exprimant le TcR (£ ne montre de réactivité avec Panti-sTA. Ainsi, la croissance continue des cellules in vitro n'induit pas l'expression sTA. Exemple 2
Cinétique d'expression de sTA pendant le cycle de stimulation des clones de cellules T.
L'anti-sTA ne marque pas les cellules TcRfê qui viennent d'être isolées du sang périphérique, mais apparaît après un un temps d'activation assez long dans les populations de cellules clonées.
La figure 1 montre l'expression de sTA sur trois clones de cellules T représentatives à différents intervalles après leur stimulation avec la PHA.
L'intensité de la réaction anti-sTA sur les clones sTA positifs est maximale 4 jours après la stimulation et décroît de façon significative au jour 10 ou 12.
Le niveau de l'expression sTA varie suivant les clones mais est indépendant de la nature du stimulus appliqué puisque les résultats sont obtenus de la même façon lorsque l'on utilise d'autres modes de stimulation. Exemple 3 Caractérisation biochimique des clones cellulaires T DS6 portant sTA.
De façon à caractériser la structure moléculaire reconnue par l'anticorps anti-sTA des cellules DS6 sont marquées en surface avec de l'iode 125 et la lactoperoxydase.
Comme cela est indiqué dans la figure 2, les anticorps monoclonaux anti-sTA immunoprécipitent une bande unique ayant une masse moléculaire apparente de 103 kDa en condition non réductrice (ligne 2). Cette bande n'est pas présente dans l'immunoprécipité de contrôle.
En condition réductrice, la bande se déplace et apparaît à un poids moléculaire de 1 10 kDa (ligne 1). Compte tenu du fait que sTA est présent sur certaines cellules activées, il est important de comparer cette molécule à des structures déjà décrites de 103-105 kDa ayant une distribution moléculaire analogue et dénommée molécule CD26 et qui sont reconnues par l'anticorps monoclonal Tal. Les essais effectués montrent que la molécule CD26 et sTA sont des molécules différentes. Tableau 1 Réactivité d'anti-sTA avec des cellules humaines hematopoYetiques variées
Cellules testées Nombre de positives (*)/nombre de testées
A. Clones de cellules dépendantes de rIL2 CD3/TcR fi +, CD4" et CD8" 16/27
CD3/TcRï4 +, CD4- et CD8 + 4/6 CD3/TcRΛfc +, CD4+ et CD8- 0/20 CD3/TcR*6 +, CD4- et CD8+ 3/18 CD3/Tc αp +, CD4- et CD8- 1 /2
CD3/TcR- 1 /5
B. Populations de cellules hématopoïétiques normales 0/5 cellules du sang périphérique E+, cellules de sang périphérique E-, grands lymphocytes granuleux, cellules de sang périphérique CD3/TcRtfS +, monocytes, thymocytes, cellules spléniques et cellules de moelle osseuse
C. Lignées de cellules leucémiques 0/7
Rex, 3urkat, CEM, K562, Peer, U937 et HL60
D. Cellules malignes 0/4 leucémie aiguë lymphocytaire (T, B ou non-T, non-B) leucémie aiguë myélocytaire
E. Lignée de cellules B 0/10 lignée de cellules B transformées par le virus EB
(*) Réactivité de différentes populations cellulaires analysée par cytometrie de f lux : + = 50% et 10%

Claims

REVENDICATION
1 ) Protéine antigénique caractérisée en ce qu'il s'agit de la protéine sTA ou d'un dérivé de cette protéine, à savoir la protéine sTA non glycosylee ou comportant des glycosylations non naturelles ou un fragment de la protéine sTA ayant les sites antigéniques essentiels de la protéine sTA , glycosylé ou non glycosylé, la protéine sTA étant : une glycoprotéine de 1 10 _+_ 10 kDa, exprimée sur certaines cellules T portant l'hétérodimère $& .
2) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comporte un marquage permettant son dosage in vitro ou sa localisation in vivo ou ex vivo.
3) Anticorps dirigé contre une protéine antigénique selon l'une des revendications 1 et 2.
4) Anticorps selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comporte un marquage permettant son dosage in vitro ou sa localisation in vivo ou ex vivo.
5) Trousse de diagnostic comportant une protéine ou un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4.
6) Médicament comportant à titre de principe actif une protéine ou 'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 4.
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FR2621127A1 (fr) * 1987-09-30 1989-03-31 Roussy Inst Gustave Anticorps monoclonal reconnaissant un epitope de la chaine gamma des recepteurs de surface des cellules t humaines, lignee de cellules d'hybridomes produisant cet anticorps, et utilisation de cet anticorps monoclonal

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