JPH05504621A - ヒトｔ細胞表面抗原の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＴ細胞表面抗原の定量法 関連出願 この出願は、１９８９年１１月１５日付出願のアメリカ特許出願連続番号第４３ ７，３７０号の一部継続にかかる。

発明の分野 この発明は、病的状態の疑いのある患者から採取された材料中の特異的Ｔ細胞サ ブタイプの分析または定量を通した病的状態の診断法に関する。特に、特異的Ｔ 細胞サブタイプ特有のＴ細胞の細胞表面抗原の定量に関する。

８１１〜８１３　（１９８９年５月１９日）、カプラー他（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２ ４４：　８１１−８１３　（Ｍａｙ　１９．１９８９））に紹介されており、そ の発明者の発表および開示に言及することて本書に取り入れる。

背景および従来の技術 近年、ヒトやマウス等のホ乳類の免疫系か、自己免疫疾患と関連して、感染、異 種抗原、そしていわゆる「自己抗原」に反応するメカニズムか解明され始めた。

これに関しては、サイエンティフィック・アメリカン２６１（５）：５６〜６４ 　（１９８９）のグレイ他（Ｇｒｅｙ、　ｅｔ　ａｌ、。

ト・カンパニー、１９８７）のメイル他（Ｍａｌｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｄｖａｎｃｅ＋ｊ　ｉｎ＋ｍｕｎｏｉｏｇｙ　ＣＪ、Ｐ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ ｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８７）の特に６〜１０章を参照されたい。

「免疫グロブリン」、または、さほど正確でなく古い「γ−グロブリン」と時々 呼ばれる抗体の感染に対する反応における役割は、当業者にも一般の人にもよく 知られている。抗体は感染に対してＢ細胞によって作られるたんばく分子である 。これらの抗体が、感染と戦う過程で感染を「無力化」ないし不活性化する作用 を持つことは周知である。

しかし、抗体か作られるためには、抗体を産生ずるＢ細胞の刺激に至る先行事象 が生じなければならない。抗体生成に至るプロセスにおける重要な事象のひとつ に抗原認識かある。免疫反応のこの面はいわゆる「Ｔ細胞」の関与を必要とし、 上記の抗体反応はと周知ではない。

大体のことを簡単に述べると、抗原認識は「抗原提示細胞」、［処理抗原Ｊおよ びＴ細胞の相互作用を必要とする。上記のグレイおよびメイルを参照されたい。

感染における「処理抗原」は、免疫系の一部である他の細胞によって扱われた、 つまり「処理された」病原体特有の分子である。処理抗原は提示された表面のレ セプターと、鍵穴にはまる錠のような、あるいはもっと適切に云えばジグソーパ ズルの２つのピースのように相互作用する。

処理抗原と抗原提示細胞上のレセプターとの四合体の形状かＴ細胞の関与を可能 にする。Ｔ細胞は、処理抗原か抗原提示細胞上のレセプターにはまり込まない限 り、複合体に結合しない。以下、このレセプターをその科学名である主要組織適 合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）またはヒト白血球抗原（ＨＬ　Ａ）と呼ぶ。一般に 、げっ歯頚の系にＭＨＣが使用され、ヒトにＨＬＡが使用される。

これらのレセプターは２クラスに分類される。ＭＨＣ−Ｉ　Ｉは病原体に対する ほとんどの反応に関与する分子である。

これに対して、ＭＨＣ−１分子は病原体がウィルスの場合、あるいは悪性細胞か 関連する場合に関与する。ＭＭＣ−Ｉが関与すると抗体の刺激は生じず、ＭＨＣ −Ｉ、処理抗−原およびＴ細胞の相互作用か病原体に感染した細胞を溶解する。

以上は、「感染」つまり生体中の病原性異物の存在に対する反応に関連する事象 に焦点を合わせたものである。

自己免疫性疾患にも同様なメカニズムが関係する。これらの状態で、生体は自己 の分子を異物つまり「自己抗原」として扱う。生体自体に抗体反応が及ぶと、上 記と同様な複合化か起こる。これが要因となる疾患には、関節リウマチ、糖尿病 、全身性エリテマトーデス等がある。

Ｔ細胞か処理抗原およびＭＨＣ／ＨＬＡ複合体と複合化する能力は、Ｔ細胞抗原 レセプターと呼ばれるもの、以下「ＴＣＲ」と呼ぶ、に依存する。ＴＣＲは、ア ルファ（α）およびベータ（β）連鎖で構成されたヘテロダイマーとして認識さ れている。ジャームラインＤＮＡによってコードされ、「Ｖα、Ｊα、Ｖβ、Ｄ βおよびＪβ」として知られる５個の可変因子と非ジャームラインコード化アミ ノ酸がＴＣＰに寄与する。これについては、イミュノル・トウディ９　：　３０ ８〜３１５　（１９８８）の１４１〜１５２　（１９８２）のヘントリック他（ Ｍａｒｒａｃｋ。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ　９：　３０８−３１５　（１ ９８８）：　Ｔｏｙｏｎａｇａ。

処理抗原およびＭＨＣとの結び付きについては、ネイチャー３１７：３５９〜３ ６１（１９８５）のバビット他、（１９８７）のビョークマン他（Ｂａｂｂｉｔ ｔ、　ｅｔ　ａｌ、。

５１２　（１９８７））を参照されたい。

通常、α、βサブユニットとも、処理抗原とＭＭＣ／ＨＬＡ分子によって形成さ れる配位子の認識に関与する。

しかし、これは必ずしもそうではなく、いわゆる「超抗原」が、他の因子にかか わらず、特異的Ｖβ因子を持つ７９６〜８０１（１９８８）のバルン他、ネイチ ャー３３２：３５〜４０　（ｔ９ｓ８）のカップラー他、ジェイ・イミ３１９４ 　（１９８８）のバーコツ他、およびサイエンス上記の「超抗原」は、Ｖβ因子 を持つ限り、通常、Ｔ細胞を刺激するか、活性化Ｔ細胞に存在するＶβ成分の特 異形状に関して少し特徴かある。この特徴か発明の一面、つまりＴ細胞の特異的 サブタイプまたはサブクラスを、これらサブクラスによって提示される細胞表面 抗原に基ついて分析する能力である。

（リーマン・アンド・ブライアン、ニド、アカド・プレス、エヌ・ワイ）の４４ ３〜４９４ページ（１９７９）（Ｂｅｒｇｄｏｌｌ、　ｉｎ　Ｆｅｅｄ　Ｂｏｕ ｒｎｅ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｉｎｔｏｘｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒｉｅ ｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｂｒｙａｎ、　ｅｄ、、　Ａｃａｄ、　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、 Ｙ、）　ｐｐ、　４４３−４９４　（１９７９））を参照されたい。黄色ブドウ 球菌によって与えられる種々の毒素は、大抵の食中毒、重度のショック、その他 の危険な病的状態を引き起こす。黄色ブドウ球菌と関連づけられた毒素の作用の メカニズムは分かっていない。毒素の一次構造は関連性を示すか、かなりの相違 も示している。ジェイ・バクチリオール１７０：３４〜４１（１９８８）のベラ トリー他、ジエイ・バク１５７８３〜１５７８６　（１９８６）のプロムスター ハ１５７８６　（１９８６））を参照されたい。当面、種々の黄色ブドウ球菌は 、それか起こす免疫反応に関して同様に作用するかどうか、確信を持って言うこ とはできない。

ＭＨＣ−ＩＩ型分子を担ったマウスの細胞の存在する６１〜８８　（１９８９） のジエーンウエイ他（Ｃａｒｌｓｏｎ。

ｅｔ　ａｔ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４０−２８４８（１９８８）；　Ｗｈ ｉｔｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ　５６２７−３５　（１９８９）；　Ｊａｎｅｗａｙ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ。

１０７：　６１−８８　（１９８９））に教示されている。ホワイト他とジエー ンウエイ他は、これらのタンパクのひとつが、特異的Ｖβ因子を持つマウスの細 胞を選択的に刺激することから、存糸分裂促進性を持たないことを示した。しか し、これらの論文は研究をヒトの細胞まで広げたものでない。しかし、ある種の 抗原がヒトのＴ細胞の特定のＶβサブクラスを選択的に刺激することで、特異的 Ｖβサブタイプを分析することによる病的状態の診断を可能にすることか分かっ た。

従って、この発明の目的は、被検査体から得た生物材料を分析して、特異的Ｖβ サブタイプのレベルを調べることにより、ヒトの病的状態を診断するための方法 を記述することにある。そして、これらのレベルは正常レベルと比較され、両者 の相違か病的状態を示すことになる。

この発明の別の目的は、特異的Ｖβサブタイプに特有の抗体を使用して分析を行 うことにある。特に、モノクローナル抗体か適している。

この発明の更に別の目的は、特定Ｖβ分子のＤＮＡコードを定量することによっ て上記分析を行うことにある。

これは、例えばポリメラーゼ連鎖反応を利用して行うことかできる。

この発明のこれらの、そして他の目的か達成される様子は、以下の開示に詳細に 述べられている。

図２は毒素によるＴ細胞の■β特有の刺激か提供者依存性であることを示す研究 を図示する。

図３は特異的Ｖβを混成個体群中に保有するＴ細胞のパーセンテージに対するポ リメラーゼ連鎖反応値（ＰＣＲ）を正常化するのに使用する基準曲線を図示する 。

図４は抗ＣＤ３抗体または黄色ブドウ球菌毒素で刺激した後のヒトＴＣＰ転写の 共増強ｃＤＮＡのオートラジオグラムを示す。

図５は３つの個体における黄色ブドウ球菌毒素によって誘発されたＶβ特育の刺 激を棒グラフで示す。

図６は患者１　（Ｐ）と正常人（Ｃ）の細胞からのポリメラーゼ連鎖反応によっ て増強されたＴ細胞レセプター転写のオートラジオグラムを示す。

図７は毒性ショック症候群後に順次検査した２人の患者におけるＴ細胞種目の経 時変化を示す。

好適実施例の詳細な説明 １１８７　（１９８６）のイッセル他、ジェイ・イミュノル１３９　：１９５２ 　（１９８７）のポースト他、ブロク・ナトル・アカド・サイ・ニーニスエイ８ ３　：　７８８８（１９８６）のボスネット他、ニー〇・ジエイ・イミュノル１ ６：６４９　（１９８６）のキャレル他、およびジェイ・エクスプ・メト１５８ 　：　１０００　（１９８３）の（１９８７）：　Ｐｏ５ｎｅｔｔ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｔＪｓＡ　８３：　７８８８（１９８６）：　Ｃａｒｒｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、、 Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１１６：　６４９　（１９８６）、　ａｎｄ　Ｂｉ ｇｌｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ。

１５８：　ｔｏｏｏ　（１９８３））　＋：教示されたような、ＶＢ５、ＶＢ２ 、ＶＢ８およびＶＢ１２に対するモノクローナル抗体を使用した。

ヒト個体のＴ細胞を、先ずその個体の末梢血液から分離した。そして、（ｉ）抗 ＣＤ３抗体、（ｉ　１）ＳＥＣ２、（ｉ　ｉ　１）ＳＥＤ、または（ｉｖ）ＳＥ Ｅのうちのひとって刺激する前と後で、これらのＴ細胞を検査した。項目（ｉｉ ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、毒素として作用する既知の黄色ブドウ球菌分 子である。

抗ＣＤ３抗体は、プラスチックのビンに接着させることによって前もって刺激性 にしてあった。そのタンパクをプラスチック表面上で８時間、４°Ｃで培養した 。よく洗浄して非接着抗体を除去した。その後、接着抗体または黄色ブドウ球菌 抗体を使用して末梢血液Ｔ細胞を刺激した。

（１９８１））を言及することで本書に取り入れるが、そこに記載されたような 被照射自己非Ｔ細胞のあるところで刺激か行われた。

刺激の３日後、生きた細胞を集め、組換え型ヒトＩＬ−２（２５ユニット／ｍ１ ）中で２４時間培養した。これは、潜在的改変レセプターの再生を可能にする。

残存細胞の約１０％が真の芽球細胞であった。

そして、芽球細胞の一部を（ｉ）ＣＤ３に対する、またはモノクローナル抗体を 持った精製抗体、（ｉｉ）ＶＢ２（ｍＡｂ　ＩＣＩ）、（ｉ　ｉ　ｉ）　ＶＢ２ 　（ｍＡｂ１５０Ｔ　１４５）、（ｉｖ）ＶＢ２　（ｍＡｂ　ＭＸ６）、（ｖ） ＶＢ１２　（ｍＡｂ　Ｓ５１１）の内のひとって反応させた。ｍＡｂで培養した 後、セル４９　：１７３　（１９８７）のカップラー他（Ｋａｐｐｌｅｒ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　４９：　１７３　（１９８７））に従って、フルオロ セイン共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｄ　ｇｏａｔａｎｔｉ　ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ）て細胞を染色した。そして、染色 パターンをＥＰＩＣ８Ｃ装置で検査したか、その際、正角および９０度の光散乱 パターンを使用して、小さいリンパ球と容易に区別でき、培養中の全残存細胞の ５０％以上を占める大きな芽球を選び出した。

染色パターンの結果を図１に示す。パネルＡ−Ｄは刺激前にｍＡｂを使用して染 色した程度を示す。パネルＥ−Ｈは抗ＣＤ３て刺激した後のそれを示す。最後に 、パネルＩ−Ｌは５ＥＤＳＳＥＥおよび５ＥＣ２で刺激した後のパターンを示す 。

各抗Ｖβは、このドナーからの刺激されていない末梢Ｔ細胞の一定のパーセンテ ージを染色した（図１）。染色されたパーセンテージは抗Ｖβ６による５、２％ から抗■β１２による１、５％までの範囲であった（図１、Ａ−Ｄ）。抗ＣＤ３ とＩＬ−２を持った培養は、各抗Ｖβて染色されたパーセンテージがほとんど変 わらなかった（図１、Ｅ−Ｈ）が、このことはＴ細胞刺激のこの組合せが、異な るαβレセプターを担うＴ細胞に同様に影響したことを示す。毒素を持った培養 は、各抗Ｖβで染色されたＴ細胞のパーセンテージに種々の結果を生じた（図１ 、Ｉ−Ｌ）。例えばブドウ球菌腸毒素（ＳＥ）Ｄは、芽球個体群にＶＢ２を担う Ｔ細胞のパーセンテージを大きく高め、ＶＢ６を担う細胞をほとんど除外した。

これに対して、５ＥＣ２で刺激されたＴ細胞の芽球は、ＶＢ２およびＶＢ２を担 うＴ細胞か激減し、ＶＢ１２を担うＴ細胞か非常に増した。最後に、ＳＥＥは、 ＶＢ１２を担う細胞を除外しながら、ＶＢ８”Ｔ細胞を刺激した。結果として生 じ、芽球個体群を汚染するＴ細胞を、Ｖβの使用のために分析すると、各毒素の 相互的結果が出ていた。例えばＳＥＥ刺激の後、Ｔ細胞はＶβ８゛細胞か選択的 に激減した。この結果は、毒素か、適当なＶβを担うＴ細胞のほとんどを刺激し 、これら細胞の少数個体群を刺激しないことを示している。

実験に５人の異なるドナーか使用された。これらのドナーは標準血清学的技術で ＨＬＡ−タイプとされ、彼らの刺激されていない末梢Ｔ細胞が抗ＣＤ３と抗Ｖβ て染色された。各抗Ｖβが各個体からの、低いが定量可能なパーセンテージの末 梢血液Ｔ細胞と反応した（表１）。

特定の個体について、これらのパーセンテージは、ある日から別の日になっても 再現性が極めて高い。異なるＶβを担うＴ細胞のパーセンテージは個体間で幾分 異なっていた。

表Ｌ　非１１Ｌ＃ヒト未消Ｔ４５１胞におけるＶβ兜現ＡＢＣＤＲＤＱ　￥３５ 　ｖｐ６　￥３８　ｖｐ、１２異なるドナーからの細胞を抗ＣＤ３またはブドウ 球菌毒素で刺激し、ＣＤ３とＶβの発現の分析を行った（図２）。各個体につい て、刺激後に特異的Ｖβを担うＴ細胞芽球のパーセンテージを、刺激前にその■ βを担っていたＴ細胞のパーセンテージで割り算したものとして結果を出した。

この計算は、■β発現が個人間で異なることに対する較正のためである。従前の ように、抗ＣＤ３は異なるＶβを担うＴ細胞を均等に刺激した。つまり、ＣＤ３ 刺激の前後で特異的Ｖβを担うＴ細胞の比率はｌに近かった。これに対して、ブ ドウ球菌毒素は、異なるＶβを担うＴ細胞を刺激する能力か著しく変動した。例 えば、ＶＢ２とＶＢ１２を担うＴ細胞は５ＥＣ３の関与によって芽球かかなり多 く作られ、ＶＢ８を担うＴ細胞は５ＥＣ３の芽球からはっきり除外された。ひと つ以上の毒素か、各Ｖβファミリーについて（ＶＢ２については弱いか）陽性を 示すＴ細胞の刺激体であり、これは各Ｖβファミリーについて毒素超抗原（ｔｏ ｘｉｎ　５ｕｐｅｒ−ａｎｔ　ｉｇｅｎ）か特定されたことを示す。逆に、各Ｖ βを担うＴ細胞を刺激することか特にできなかった毒素を特定することかてきる 。

はとんどの各毒素について特徴的な刺激パターンが特定できることは注目に値す る。例えば、５ＥＣ２はＶＢ１２を担うＴ細胞を刺激したか、他の３つのファミ リーのＶβを担う細胞を除外した。このパターンは他のいかなる毒素の場合にも 見られない。ＳＥＤはＶＢ５とＶＢ１２を担うＴ細胞を刺激し、ＶＢ２を担うＴ 細胞に対しては影響か小さく、モしてＶＢ２を担う細胞を除外した。

このパターンもこの毒素特有のものである。

ある一定の腸毒素で刺激すると、当初の個体群と比較して、ある一定のＶβの発 現のために増減しない芽球を現出する場合もあった。ＶＢ２を担う細胞の当初お よび終了時のパーセンテージは、例えば毒性ショック毒素（ＴＳＳＴ）に対する 反応において同等であった。そのような結果は、ＶＢ２を担う細胞の一部のみか ＴＳＳＴに刺激されることを示すのかも知れない。レセプターの他の可変成分、 Ｖα、Ｊα、あるいはＪβ、は、この毒素のＶＢ２との相互作用をしばしば妨げ るといった、超抗原のマウスＴ細胞レセプターＶβとの反応で以前に注目された 現象を生じるのかも知れない。あるいは、ＴＳＳＴはＶβファミリーのひとつの メンバーとのみ反応するのかも知れない。従って、ＴＳＳＴとの反応で、このメ ンバーを担う芽球の増加はファミリーの他のメンバーを担うＴ細胞の消滅によっ て相殺され得るか、ＩＣＩとも反応する。Ｖβファミリーの異なるメンバー間の 超抗原による識別はマウスでも見られ、その場合、自己超抗原Ｍｌｓ−１がＶＢ ２．１のために陽Ｔ細胞を刺激するが、ＶＢ２．２やＶＢ２．３を担う陽Ｔ細胞 は刺激せず（ネイチャー３３２：３５（１９８８）のカップラー他（Ｋａｐｐｌ ｅｒ、ｅｔ　ａｔ、　Ｎａｔｕｒｅ３３２：　３５　（１９８８））　’）　、 また、５ＥＣｉ（ＶＢ２．２を担うＴ細胞を刺激するか、ＶＢ２．１やＶＢ２． ３を担う陽Ｔ細胞は刺激しない。

いくつかの実験で、抗ＣＤ４または抗ＣＤ９て染色したＴ細胞のパーセンテージ を刺激の前後で調へた。当初のパーセンテージか毒素刺激によって実質的には変 化しなかった。例えば、あるドナーからのＴ細胞は当初７８％ＣＤ４＋と２３％ ＣＤ８“てあった。９つの異なる毒素を使用した刺激後、ＣＤ４”細胞の芽球の パーセンテージは７４％から７９％の範囲になり、ＣＤ８＋のそれは２０％から ２５％の範囲になり、これらすへての刺激かＣＤ４およびＣＤ８細胞を同等に影 響することを示唆した。発現をクラスＩＩのＭＨＣに依存する毒素がＣＤ４”細 胞を優先的に刺激したと思われるかも知れないが、実際はそうではない。

図２のデータの最も顕著な特徴のひとつは、結果か個体間で一貫している点であ る。つまり、ＨＬＡタイプが異なり、種々のＶβを担うＴ細胞の当初パーセンテ ージが異なる５人が検査を受けたか（表１）、各毒素によって刺激される芽球の Ｖβ発現の比例変化が個体間でほとんと同しである。超抗原は提示にクラスＩＩ のＭＭＣを必要とするか、クラスＩＩの対立形質は、超抗原提示に対する影響か 、Ｔ細胞による従来の抗原プラスＭＨＣの認識に対する影響よりずっと少ない。

これらの結果は、ブドウ球菌毒素がヒトのＴ細胞に対する無差別のミトゲンてな く、実際、Ｖβの特異的なものであることを示している。この結果か、そのよう な毒素の既に述へたクローン特異性を説明している。各毒素はヒトのすへてのＴ 細胞のサブポピユレーションのみしか刺激することかできないか、低濃度で活性 を有する強力なＴ細胞刺激物である。ヒトのこれらタンパクの毒性影響の一部ま たは全てが、ヒトの多数のＴ細胞を刺激する能力によって調整され得る。例えば 、これら毒素の大量のリンホカインの分泌を促す能力は、恐らく、かなりのパー センテージのＴ細胞をＶβ特異のやり方で刺激する能力に比べて二次的なもので あろう。これらの、そして他の微生物由来の超抗原の特異なＶβを担うＴ細胞の 個体群を刺激する能力か、これら毒素の影響に対する異なる個体の異なる耐性と 、ある個体に自己免疫等の免疫結果を引き起こす微生物攻撃の能力とに関係する 可能性もある。

例３ 上記実験例は、特異的細胞表面表現型を持つＴ細胞サブセットを、抗体を使用し て数量化する方法を示している。この方法論は抗体とその結合相手であるＶβ分 子、つまり細胞表面抗原、との相互作用を必要とする。

７３分子の存在の促進は、特異的な分子のＤＮＡコードの促進された表現型があ ったことを意味する。従って、以下の実験は、特異のＶβサブタイプを表現する ＤＮＡの分析を通して、上記Ｔ細胞サブセットの定量を扱う。

当業者かＤＮＡの分析に利用できる方法には、以下、本書てｒＰｃＲｌ　と呼ぶ 、いわゆるポリメラーゼ連鎖反応かある。ＰＣＲ方法論は、例えばアメリカ特許 第４．６８虱±四号、第４．６８３．２０２号および第４．８００．２５９号と 、す（１９８８））に見られるように、この分野で周知である。

ＰＣＲ方法論が公知であるので、使用される技術に対する改良のみを詳述する。

全ＲＮＡが、上記のような抗ＣＤ３で刺激された末梢Ｔ細胞から作られた。全Ｒ ＮＡの２μｇが、逆転写酵素（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とランダム・ヘキサヌクレオ チドを使用した１本鎖のｃＤＮＡの合成に使用される。反応は、９５°Ｃて５分 間加熱することにより、ポリメラーゼ連鎖反応前に止められる。

各ｃＤＮＡサンプルの２０分の１を、表２に記載したようなＣβプライマーと２ つのＣαプライマーと共にＶβ特異のプライマーを使用して、共増強し、各反応 の最終濃度を０．３μＭにした。増強は、タフ・ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ− Ｅｌｍｅｒ）　２　、　５　Ｕと、セタス・パーキン・エルマー・サーモサイク ラ−（Ｃｅｔｕｓ　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）に より、以下の条件で行った。９５°Ｃ溶融、５５°Ｃアニール、そして７２°Ｃ 拡張、各１分間。増強生成物の定量のため、５’　３２ｐラベルの逆プライマー （それぞれ約５Ｘ１０５ｃｐｍ）で共増強を行った。増強品は２％アガロースゲ ルで分離し、乾燥し、Ｘ線フィルムに照射した。

オートラジオグラムを使用してＶβ−ＣβおよびＣαバンドを特定、切断した。

各バンドは液体シンチレーションカウンタで計数した。コントロール実験では、 基本的に上記チェリー他（Ｃｈｅｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ、）に記載された通りに相 対増強効率を算出した。

表２の注記 Ｖβおよび３°　Ｃβプライマーによる増強品（Ｖβバンド）のサイズは１７０ 〜２２０ｂｐの範囲であった。

５’　Ｃαおよび３″　Ｃαプライマーによる増強品（Ｃαバンド）のサイズは 約６００ｂｐてあった。この研究で使用された３’　ＣβプライマーはＣβ１お よびＣβ２ＤＮＡと正確にマツチする。Ｖβ、ＣβおよびＣαの配列は以前に発 表されたレポートにもとづく。

対応プライマーとシーケンス（配列）が同一である各Ｖβファミリーの４メンバ ーが列記されている。

”Ｖβｉ３．ｘ、ｃＶβ１３．２および１Ｖβ１４．１５〜３８３　（１９８７ ）のキムラ他（Ｔｏｙｏｎａｇａ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｊｍｍｕｎｏｌ、　５：　５８５−８２０　（１９８７） 、　Ｋｉｍｕｒａ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｅｕｒ、　Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．ユニ３７５−３８３　（１９８７）　’）によ って、ＶＢ１２．３．１２，４および３．３とも呼ばれている。

表２　ＰＣＨに用いられるプライマーのシーケンスヒトのＶβ遺伝子の少なくと も２０の異なるファミリーのうち、これらファミリーの少なくとも４６の異なる メンバーが、上記トヨナガ他、ブロク・ナトル・アカド・（１９８８）のレイ他 （Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

クローン化され、配列された。ヒトＴ細胞Ｖβの使用を分析するために、ＰＣＲ 用の５′センスプライマー（ｓｅｎｓｅ　ｐｒ　ｉｍｅｒｓ）としての使用に、 ２２の異なるＶβ特異のオリゴヌクレオチドを合成した。その配列と、それらが 増強するべきＶβか表２に示されている。増強済みとして示された全てのＶβは 、対応プライマーと正確にマツチする配列を持つ。これらのプライマーで増強さ れる他のＶβ遺伝子もあったかも知れない。

例えば、Ｖβ６プライマーは１つのヌクレオチドを除いて■β６．４にマツチし 、このプライマーを使用してＶＢ２．４が増強されるかを判定するためには更に 実験が必要になる。総じて、これら全てのプライマーが、４６の配列化ヒト遺伝 子の少なくとも３９個をカバーすることが期待される。各Ｖβ特異オリゴマーが 、大体同じＧ＋Ｃ内容を持ち、■β内の比較的同じ位置に位置つけされるよう選 択された。

例４ 全ＲＮＡが、上記実験例で記載したように、抗ＣＤ３抗体または異なる５つの黄 色ブドウ球菌毒素（ＳＥＢ、５ＥＣ２、ＳＥＥ、剥離毒素（ＥｘＴ）、および毒 性ショック症候群毒素１　（ＴＳＳＴ）のひとって刺激されたヒトの末梢Ｔ細胞 から作られた。分析時に、フローサイトメータによる分析で判定したところ、こ れらの個体群は５０〜９０％のＴ細胞芽球を含んでいた。サイエンス２３５　： １３５３〜１３５８　（１９８７）のブウス他、て、メツセンジャーＲＮＡの表 現型用に一本鎖の相補的ＤＮＡを作り、各材料のｃＤＮＡの一部を２２５’Ｖβ 特異的センスプライマーと３’　Ｃβ特異的アンチセンスプライマーの夫々で増 強した。内部制御として、ＴＣＲα連鎖ｍＲＮＡを同じチューブ内で共増強した 。増強は２５サイクルで行ったか、この限定数の使用は合成物の量を当初の調合 中の７３ｍＲＮＡの量に比例させるためである。各Ｖβ特異的プライマーの特異 性は、増強生成物のサイズと、特異プローブ（図外）の増強生成物に対するハイ ブリダイゼーションとから判定した。４つのプライマーセット（５′Ｃα−３′ α、ＶＢ２．３、および８−３’　Ｃβ）の増強効率は上記チェリー他（Ｃｈｅ ｌ、１ｙ。

ｅｔａｌ、）に記載された通りに行った。平均効率は約４６〜４８％であった。

各材料について、Ｖβバンド中のカウント数をＣαバンド中のそれに正準化した 。

このＰＣＲ反応への相対取り込みが、特異的Ｖβ因子を表す反応個体群中の細胞 数に比例するかどうかを調べる必要があった。しかし、考え得る２つの誤差原因 を考慮しなければならなかった。そのうちの第一は非刺激Ｔ細胞の影響である。

Ｔ細胞芽球と比べて、非刺激Ｔ細胞中でのｍＲＮＡレベルが極めて低いので、非 刺激細胞と比へて、特異的Ｖβを表す芽球の比率が非常に低いときだけ非刺激細 胞の影響が問題になる、と考えられた。第二に、全てのＴ細胞が両方の染色体上 てβ軌跡を再配列する可能性を持つから、Ｔ細胞の少なくとも一部における非生 産的に再配列された染色体からの７３ｍＲＮＡの転写が分析を混乱させ得る。非 機能的ｍＲＮＡはその不安定さのため低レベルであろうから、このｍＲＮＡは、 芽球個体群において特異的Ｖβ因子の発現か低いときだけ問題になると考えられ た。

これらの仮説をテストするため、種々の材料てＶＢ２，２／３、ＶＢ２およびＶ Ｂ１２を発現するＴ細胞芽球の実際のパーセンテージをフローサイトメータで、 そして抗Ｖβモノクローナル抗体を、ｍＲＮＡ作成前に調へた。これら材料のＶ Ｂ２．２／３．８および１２への正準化ＰＣＲ取り込みを、これらの抗Ｖβモノ クローナル抗体で染色したＴ細胞芽球のパーセンテージに対して、対数／対数プ ロットでプロットしたところ、３つの異なる実験のデータの間で区別のつかない 直線関係が得られた（図３）。

この関係は１％を超える値で特に明白であった。大体１％以下のＶβ発現または 約３０の正準化ＰＣＲ取り込みでは相関関係が失われていた。従って、非刺激Ｔ 細胞と非生産的に再配列されたβ遺伝子の影響は、芽球のＶβ発現か１％を超え る場合に無視てきるとの結論に達した。

従って、図４にプロットされたデータか、正準化ＰＣＲ取り込みからのパーセン トＶβ発現を推定して、抗体か使用されないＶβ発現分析用の標準曲線として使 用された。

例５ 種々の毒素で刺激された正常の末梢Ｔ細胞におけるＶＢ２．２／３、ＶＢ２、Ｖ Ｂ１２、その他１９のＶβファミリーの発現をＰＣＲ法を使用して分析した。抗 ＣＤ３による刺激によって、特異的Ｖβを担うＴ細胞のパーセンテージか当初個 体群中のそれからたいして変化しないことを実験例１および２か示すので、抗Ｃ Ｄ３で刺激したＴ細胞を対照として使用した。結果を図４に示す。単一個体から のＴ細胞の、異なる５つの黄色ブドウ球菌毒素に対する反応の完全分析の結果を 表３に要約して示す。

正常末梢Ｔ細胞によって一部Ｖβファミリーか他より大量に使用された。ＶＢ２ ．３．６．７および８フアミリーのメンバーとＶＢ１３．１は全Ｔ細胞の５０％ 以上に発現した。そのような知見は大Ｖβファミリーの一部であるＶＢ６やＶＢ ２では予期されなかったかも知れない（Ｖβ６オリゴヌクレオチドはＶβ６フア ミリーの９メンバー中恐らく３つのみをプライムするだけであるカリか、ＶＢ１ ３．１の場合はもっと意外で、これは単一遺伝子の生成物に思える。ヒトの末梢 Ｔ細胞による不均一のＶβ発現は、検査を受けた親戚でない他の２人のドナーに も同様な頻度か見られたので、この個人の特異性やＭＨＣによるものではないと 考えられる（以下の記載と図５を参照）。

ヒトＴ細胞しセプターＶβ遺伝子の２０フアミリーすへてのｍＲＮＡの発現の完 全分析は、すべての毒素か特異的Ｖβを発現するＴ細胞を優先的に刺激し、更に 各毒素の刺激パターンか異なることをはっきり示している。

いくつかの顛著な新しい関係が見つかった。最も劇的なのは、ＶＢ２を担う細胞 かＴＳＳＴによる刺激で非常に増加したことである。ＴＳＳＴで刺激されたＴ細 胞芽球のＴ細胞の約５０％がＶＢ２を持っていた。上記のように、ＳＥＢはＶＢ １２を担うＴ細胞を刺激するか、ＶＢ３、Ｖ１３１４、ＶＢ１５、ＶＢ１７、そ して恐らくＶＢ２０を担うＴ細胞のＳＥＢによる刺激もこの分析から明らかにな った。関連毒素５ＥＣ２もＶＢ１２、ＶＢ１４、ＶＢ１５、ＶＢ１７、そしてＶ Ｂ２０を発現するＴ細胞を刺激したが、ＶＢ３を発現するものは刺激しなかった 。

既に述べたように、ＳＥＥはＶβ８ファミリーのメンバーを担うＴ細胞を刺激し たが、ＶＢ２．５°、ＶＢ２．１−３０、およびＶβ１８３細胞の比率も増大さ せた。

この方法を使用して、ある一定のヒト細胞個体群での全てのＴ細胞のパーセンテ ージの大体を、定量された異なるＶβを担うものを合計することによって推定で きる。

表３に示すように、このパーセンテージは抗ＣＤ３で刺激されたＴ細胞の場合約 ９０％であり、■βオリゴヌクレオチドか４６のヒトＶβ遺伝子の３９でコード されたｍＲＮＡの発現のためプライムすることが、特に規模の面で誇張でないこ とを示唆している。このことは、４６の既知のＶβ配列かヒトの遺伝子の大半を 恐らくカバーすることを示唆する。量的ＰＣＲか、毒素の一部、特にＥｘＦ、に よって刺激される芽球の低パーセンテージの理由になっている。この毒素は、リ ストされたプライマーによってカバーされないＶβを担うＴ細胞を主として刺激 する可能性かある。

現象の普遍性を調へるために、表３における非常に劇的な組合せのいくつかを更 に２人にテストしてみた（図５）。刺激実験および算定は上記と同一にした。こ れらの毒素に対して３人ともほとんど同じ反応を示した。例えば、Ｖβ２°Ｔ細 胞はＴＳＳＴによって、どのケースもほぼ同レベルの４５％に増加した。同様に 、３人すべての場合、ＳＥＢがＶＢ３を担うＴ細胞を刺激し、ＳＥＥかＶＢ２を 担うＴ細胞を刺激した。

例に れら毒素に対するＴ細胞の反応のマウスとヒトとの類似性は旺著である。両ケー スとも、特異性Ｖβを担うＴ細胞が各毒素に対する反応を支配する。両ケースと も、毒素の判別力か特に目立つ。例えば、ヒトでは、ＶＢ５．ビＴ細胞ＳＥＥに 反応するか、ＶＢ５．２／３を担う細胞は反応しなかった。同様に、発明者は、 マウスで、いくつかの毒素がＶβ８ファミリーのメンバーを判別できることを観 察している。超抗原に対するこのメンバー特異性反応は、ＶＢ２．１を担うＴ細 胞を刺激するか、ＶＢ２．２またはＶＢ２．３を発現するものを刺激しない内因 性超抗原Ｍｉｓ−１ａに関してマウスに見られる。ネイチャー３３２：３５〜４ ０　（１９８８）のカップラー他（Ｋａｐｐｌｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔ ｕｒｅ　３３２：　３５−４０　（１９８８））を参照されたい。

マウスとヒトのＶβ遺伝子の広範な配列分析は、−次配列とＶβ遺伝子複合体中 での相対位置とによって、いくつかの同族体かあることを示している。アン・レ ブ・イミュノル５：５８５〜６２０（１９８７）のトヨナガ他、ブロク・ナトル ・アカド・サイ・ニーニスエイ囲：６５９８〜６６０２　（１９８６）のコンキ ャノン他、ネイチャー３３１：５４３〜５４６　（１９８８）のレイ他（Ｔｏｙ ｏｎａｇａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５：　 ５８５−６２０（１９８７）、　Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（１９８９）のホワイト他（Ｗｈｉｔｅ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ　５６： ２７−３５　（１９８９））に従って、これら同族体の異なった毒素による刺激 パターンを、毒素によるマウスＶβ刺激のデータを使用して比較した。表４に示 すように、同族Ｖβを担うＴ細胞が毒素に対する同様な反応パターンを示すケー スもあった。例えば、ＥｘＴ、特にＴＳＳＴ、はヒトＶβ２を担うＴ細胞と、非 常に類似したＶβ１５を担うマウスＴ細胞を刺激した。Ｖβ１２．１４．１５お よび１７フアミリーのメンバーを発現するヒトＴ細胞はすべてＳＥＢおよびＳ　 Ｅ　Ｃ２＋、：反応するが、ＥｘＴやＴＳＳＴには反応しない傾向を示した。こ の性質は、その最も近いマウスの同類であるマウスＶβ８．Ｌ　８．２および８ ．３にも見られた。しかし、同族Ｖβを担うＴ細胞の同様な反応パターンは常に 見られたわけではない。例えば、マウスＶβ３を担うＴ細胞はこれら毒素のほと んどに反応したか、最も近いヒト同類であるＶβ１ｏを担うものは反応しなかっ た。この情報かすべて得られたとしても、ヒトおよびマウスＶβ因子の一部アミ ノ酸配列の綿密な検査から、毒素特異性の原因である残基を未だ見いだせていな い。従って、残念ではあるか、マウスの系からヒトの系（ＭＨＣからＨＬＡ）へ の完全な一般論は表４　黄色ブドウ球菌毒素に反応するマウスとヒトの■用１Ｍ ｖ）相互関係マウスとヒトを比較すると、我々のこれまでの研究で明らかになっ た最も顕著な相違は、Ｖβの発現を制限するメカニズムかヒトにはないと思われ る点である。マウスの場合、種全体として２０を超えるＶβ因子の発現の可能性 に拘らず、個々のマウスで種々のメカニズムがＶβの発現を制限する。大量の遺 伝子削除がＶβ遺伝因子の約半分を除去した種もある。例えば、ブロク・ナトル ・アカド・サイ・ニーニスエイ８３ニア６７〜７７１（１９８６）のベールヶ他 （Ｂｅｈｌｋｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ＪＳＡ　８３：　７６７−７７１　（１９８６））を 参照されたい。

他のＶβ遺伝因子は点突然変異によってしばしば不活性化される。ジエイ・イミ ュノル１４１　：２１６５〜２工６７（１９８８）のウエード他（Ｗａｄｅ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１４１：　２１６５−２１６７　（１９８８））を参照されたい。非常に巧妙な ことに、マウスの多くの種で、Ｔ細胞の発達時に発現した自己超抗原か自己耐性 の確立時に特異的Ｖβ因子を担うＴ細胞の除去をもたらした。これに関しては、 セル１旦：２７３〜２８０（１９８７）のカップラー他、セル土旦・２６３〜２ ７１（１９８７）のカップラー他、ネイチャー３３２：４０〜４５（１９８８） のマクドナルド他、ネイチャー３３５ニア９６〜８０１　（１９８８）のバルン 他、ネイチャー３３２：３５〜４０　（１９８８）のカップラー他、ジエイ・イ ミュノル１４０：４１３２〜４１３８　（１９８８）のアベ他（Ｋａｐｐｌｅｒ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌたい。個々のマウスにおける制限されたＶβ発現 をもたらすこれらのメカニズムは、バクテリア系毒素からの圧力に対する保護的 進化上の反応かも知れず、マウスのポピユレーションの内の個々が特定の毒素超 抗原の影響に比較的抵抗力があると考えられる。これまでの限られた数の個人検 査からは、同様なメカニズムが広くヒトに見られるという証拠か得られていない 。従って、大量の遺伝子削除は見られず、特異的Ｖβを担うＴ細胞の除去を生じ る自己超抗原も観察されていない。これらのメカニズムの一部がヒトに作用する のを観察するには、Ｖβファミリーの個々のメンバーと、より大きなヒトの人口 、特に若いうちにこの種の毒素にずっと広範にさらされる患者（全部で９人）す べてか、夫々のかかりっけの医者に毒性ショック症候群を示すと診断された。病 気管理センター（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）と 数人の調査員によって共同で定められた重度毒性症候群の定義に該当する者を選 抜した。シリン・マイクロパイオル・レブ４３２−４６６　（１９８８）：　Ｒ ｅｉｎｇｏｌｄ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ。

断上の重要な基準（すべて必要）は、発熱（２３９，８°Ｃ）、発疹（剥脱性紅 皮症に至る広汎性紅皮症）、および低血圧（成人で９０ｍｍＨｇを下回る収縮血 圧および／または起立性失神）を含む。マイナーな診断基準（３つ必要）は、下 痢および／または嘔吐、筋肉異常、粘膜充血、腎機能低下または膿尿症、肝酵素 増加、１００．　ＯＯＯ／ｍｍ”に満たない血小板数、および見当識障害または 意識変調を含む。検査したすべての患者が黄色ブドウ球菌感染の主患部らしいも のも少なくともひとつ持っていた。対照変異種にュー・インク・ジエイ・メト３ ２１：ｌ〜７（１９８９）のスティーブンズ他（Ｓｔｅｖｅｎｓ、　ｅｔ　ａｔ 、。

Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、３２１：　１−７　（１９８９））と関連し た重度毒性ショック症候群を持った患者１人を検査した。

４人の患者の疾患は月経とタンポン使用に関係かあるように思えた。

ブドウ球菌膣感染に関係があるように思えた。患者４の疾患は黄色ブドウ球菌が 培養された副鼻腔炎と関連づけられた。２人の子供（患者７および８）のＥｐｏ ｓｉｄｅｓはそれぞれ臀部皮下膿瘍とへん桃周囲蜂巣炎と関連づけられた。両方 の主患部から黄色ブドウ球菌を培養し、これらの分離物が生体外（ｉｎ　ｖｉｔ ｒｏ）でＴＳＳＴ−１と腸管前ＡおよびＣを生成した。患者３は黄色ブドウ球菌 による上部呼吸器系および洞の感染に関係すると考えられる毒性ショック症候群 の１０を超える徴候を以前に経験していた。ジクロキサシリンで予防的に治療を 受けたが、彼女はここでの研究対象である毒性ショック症候群の臨床的徴候のた め入院が必要であった。入院時に鼻咽腔の培養は黄色ブドウ球菌に関して陰性で あった。従って、この後者の患者を考え得る例外として、検査した９人の患者の 毒性ショック症候群は黄色ブドウ球菌感染の主患部に関係かあると考えられる。

急性の症状の発生から、そして（抗生物質を含む）治療の開始からＴ細胞サブセ ット変化の分析用にサンプルを採った時までの時間を、表５に列記する。研究の 開始時には、Ｔ細胞サブセットの異常か毒性ショック症候群後どのくらい長く持 続するか明かでなく、この可変要素に制限は加えられなかった。

表５　被検症例の臨床特性 １　．３２１Ｆ　Ｉｇ、Ｒ１全Ｂ　人、Ｂ、Ｃ１Ｄ、　ＮＤ　５　１４／１０２ 　１＆ＩＦ　ｆｉ、ＪｕｌＩＱ　全Ｂ　人、Ｂ、Ｃ，Ｄ、　ＮＯ５９ｎ３　２１ ／Ｆ　すＬ’　全ｚ　Ａ、［ｌ、ＣＮｃ；’　ＧＩ５４　２６／Ｆ　Ｍ　全Ｂ　 Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、黄色７トウ球１１　１５２／１５０Ｆ、Ｇ　培ビ ５　Ｉ３／Ｆｆｌ！、同曲　全部　ＢＣＥ　１２色７＋”４１ｍ　＋３／ＩＩ６ 　２３／Ｆ　ｆｆｉ、術１＆　全”　Ｃ，Ｄ、Ｇ　Ｍ色７ドウ球国　１７　１６ １Ｍ　２部全部Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、ｊ１色ブドウ４１１　４／３＠１１　Ｅ　ＴＳ ＳＴ−１，Ａ、Ｃ ９＋（ｔ／Ｆ　摺１月峰関遅　全部　＾、ｑＤ　黄色ブドウ球＠　’　４／３０ 重要な基準は、発熱（＞　１０２ｏＦ）　、後で剥離症になる特徴的な紅皮症、 および低血圧症を含む。

゛マイナーな基準は、Ａ、胃腸症状（おう吐または下痢）；Ｂ、筋肉障害（ＣＰ Ｋ裂開または重度の筋痛症）；Ｃ１粘膜の充血；Ｄ、腎機能の低下または膿尿； Ｅ、肝機能障害の試験証拠；Ｆ１血小板減少く血小板数く１００・００／ｍｍ” ）およびＧ、見当識障害または意識変調を含む。

１患者３は毒性ショック症候群の徴候を少なくとも１０回以前に経験していた。

これらのいくつかは洞炎と関連予防的に治療を受けており、入院時に鼻咽腔のす べての培養は黄色ブドウ球菌に関して陰性であった。

Ｏ後者の患者の一部について、感染源を培養し、腸管前Ａ、Ｂ、ＣＩ、Ｃ２、Ｃ ３、ＤおよびＥ、とＴＳＳＴ離物をテストした。

患者から採った末梢血液単核細胞を、フィニル・ハイベーク・グラジェント（Ｆ ｉｃｏｌｌ　ｈｙｐａｑｕｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）遠心分離の後、ヘパリン処理 済みの血液から分離した。既に述べたように精製された抗ＣＤ３抗体でコーティ ングされたプラスチックのフラスコ内でＴ細胞のシミュレーションを達成した。

グルタミン２ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ緩衝液１０　ｍ　Ｍ　ｓペニシリン１００ｕ／ｍ ｌ、ストレプトマイシン１１００ｕ／ｍｌ、そして仔ウシ胎児血清１０％を補充 したＲＰＭＩ　１６４０を含有した培養液中で、細胞をｍｌに対して１ｘ１０６ の割合で培養した。培養３日後に生きた細胞を取り出し、２５μ／ｍｌのりコン ビナンド・ヒトＩＬ−２中で更に２４時間培養して、潜在的に活性化したＴ細胞 レセプターの再生を許しながら、ＩＬ−２のレセプターを発現する細胞を拡張し た。そして、細胞を取り出し、洗浄してから、間接免疫蛍光染色法に使用するか 、後続のＲＮＡ抽出用に液体窒素で急速凍結した。

間接免疫蛍光染色法は、上記のように、飽和量のモノクローナル抗体で細胞を培 養した後、蛍光色素結合ヒツジ抗マウスＩｇ（カリフォルニア、バーリンガム、 ターボ・インク（Ｔａｇｏ、　Ｉｎｃ、、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）） で染色することによって実行した。対象サンプルは次段階試薬だけて染色した細 胞を含み、バックグランド値を減算した。

正角および９０°Ｃ光散乱パターンを使用して、小さいリンパ球と容易に区別で き、全生存可能細胞の大半を占める大きな芽球を選び出した。蛍光強度はＥｐｉ ｃｓ　Ｃｃｅｌｌソーターを使用して設定した。染色試薬として使用したモノク ローナル抗体は、既に述べたように、ＣＤ４およびＣＤ８と、ＶＢ２、ＶＢ６、 ＶＢ８およびＶ／３１２を担うＴ細胞レセプター上のエピトープに適用された。

全ＲＮＡが、既に述べたように、抗ＣＤ３で刺激された細胞から作られ、全ＲＮ Ａが逆転写酵素を使用した１本鎖のｃＤＮＡの合成に使用された。同様に、ｃＤ ＮＡか実験例３で述べたようにＰＣＲを使用して増強された。

実験例１〜６と同様に、末梢血液中の単核細胞を患者と対照から分離し、Ｔ細胞 を抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２で培養中で刺激した。Ｔ細胞芽球から分離した全ＲＮ Ａと量的ＰＣＲを使用して、Ｔ細胞レセプター遺伝子セグメントコードＶＢ２、 ＶＢ２　（５，２と５．３）、Ｖｉａ（８，１と８．２）、およびＶＢ１２を増 強し、定量した。Ｔ細胞レセプターｍＲＮＡの量と反応速度の変動をコントロー ルするために、Ｃα遺伝子セグメントも反応ごとに増強した。図６は、患者ｌと 付随して検査した健常者のＴ細胞から得た結果を示す。対照と比較して患者の増 強Ｖβ２ＤＮＡは著しく増加しているが、Ｃα生成物には違いがあまり見られな い。特に各反応で増強されたＣαの相対量に正準化した場合、ＶＢ２、ＶＢ８お よびＶＢ１２の量に関しても患者と対照との間にあまり相違がない。

表６のデータは、同じ反応で増強されたＣαＤＮＡに対するＶβＤＮＡの比率と して表している。すべての対照（患者と付随して検査を受けた）のＶβ２／Ｃα 比率が０．１０以下であったが、９人の患者のうち５人の当初サンプルが０．１ ７（フィッシャーの正確テストによるｐ＝０．０３）を超える比率で、うち１人 、患者１１は０．７８もあった。異常なＶβ２／Ｃα比率は、月経関連疾患の患 者４人中３人、非月経ケースの５人中２人に見られた。ＶＢ２と対照的に、他の Ｖβ／Ｃα比率は、どれも対照値から２３Ｄ以上増加しなかったが、これは毒性 ショック症候群におけるＶβ２拡張の選択的性質を示している。増加したＶβ２ ／Ｃα比率を示さない患者（患者４．６．８．９）のうち１人（患者４）は急性 疾患後、比較的長期にわたって検査を受け、増加レベルを見落とす可能性はなか ったことに留意されたい。

表６　中毒ショック庁候群の症例からの末消血汲Ｔ細胞における■β発現 Ｖβ／Ｃα比゛ 抑制斎１（Ｎ＝７） ゛　データは、各症例がら得られた初期サンプル用に挙げられた（表１参照）。

＊データは各症例から得られた初期サンプル用に挙げられた（表１参照）。

＋Ｖβ５．２及びＶＢ２．３の同族要素に共通のシーケンス専用プライマーか用 いられた。

＃Ｖβ８．１及びＶＢ２．２の同族要素に共通のシーケンス専用プライマーが用 いられた。

患者と対照から分離したＴ細胞は、間接免疫蛍光染色法とサイトフルオログラフ ィー分析によるサブセット変化の分析にも付された。著しく高くなったＶβ２レ ベルの患者でも、ＣＤ４＋とＣＤ８＋のＴ細胞のパーセンテージの一貫した変化 は見られなかった。患者のＣＤ４”とＣＤ８＋のＴ細胞のパーセンテージの範囲 は、対照用個人の平均（±ＳＥ）値である６４±５．１％および２９±４．６％ に対して、それぞれ３０〜８４％と１４〜６０％であった。ＶＢ２、ＶＢ２、Ｖ Ｂ２およびＶＢ１２の発現を調べるため、患者のうち７人から採った細胞を染色 した。量的ＰＣＲ技法による上記分析と食い違うことなく、これら非Ｖβ１２Ｔ 細胞サブセットの正常範囲外の値は見られなかった。患者対対照の平均±ＳＥ値 （Ｎ＝１２）は、ＶＢ５．２．４＋０．２５対３．１±０．３０．ＶＢ２．４． ３±０．６３対３７±０゜５０、　ＶＢ２．３．０±０４６対３．４±０．４１ ；ＶＢ１２．１．６±０．１４対１．５±０．０９であった。

実験例１〜６は、Ｖβ２増強かＶＢ２およびＶＢ２のそれと同様であることを示 し、ＰＣＲ法によるＶＢ２か発現する循環Ｔ細胞のパーセンテージ推定の妥当性 を裏付けている。この結果は、健常者のＶβ２陽性Ｔ細胞が末梢血液Ｔ細胞ポピ ユレーションの約ｌＯ％であることを示唆している。これに対して、患者１およ び２のピーク値はそれぞれ７０％および３０％にもなり得、患者によってはＶβ ２＋Ｔ細胞の顕著な刺激か生じることを浮き彫りにしている。

グループＡ連鎖球菌と関連した重度毒性ショック症候群患者１人も検査した。毒 性ショック症候群の定義のすへての主要およびマイナーな基準が該当し、患者は 入院から２週間後に死亡した。症状発生から１週間以内に患者を検査したところ 、Ｖβ２／Ｃα比率は０．０８で明らかに正常範囲内であった。

例８ ２人の患者から連続したサンプルを採って、急性疾患後のＶＢ２か発現するＴ細 胞の経時変化を調へた。患者（症例）１のＶβ２陽性Ｔ細胞のパーセンテージは 最初の検査後２週間以内に半減し、急性疾患発病後６０日後までにはほとんど正 常になっていた（図７−上のパネル）。

患者（症例）２は、急性徴候後４５日以内にＶβ２レベルかほぼ正常化していた （図７−下のパネル）。これらの連続した研究も他のＶβセグメントか発現する Ｔ細胞サブセットで経時変動か比較的少ないことをはっきりさせ、また、健常者 についても観察したか、その一部は既に述へた。

上記実験例は、感染等の病的状態か、患者から採ったサンプルを分析してサンプ ル中の特異的Ｖβ分子のレベルを判定することによって診断できることを示して いる。

結果か示すように、特定のサブタイプのレベル増加は特異的抗原に結び付くこと か判明した。

本書て使用する「病的状態」は感染に限らず、異常な免疫反応か生じるいかなる 状態をも意味する。これは、例えば、既に述へたように、特定のＶβ型分子が不 自然に存在したり、健常者と比べて多量に存在する自己免疫疾患を含む。

■β量の増加はこの発明による唯一の病的状態診断法ではない。Ｔ細胞レベルか 正常値より低いＨＩＶ感染等の種々の疾患や病的状態はこの分野で周知である。

特異的Ｖβタイプと、Ｔ細胞の減少に特徴づけられる状態との相関関係も本書の 範囲内である。

実験例７および８は、ＶＢ２が発現する循環Ｔ細胞の選択的増加が毒性ショック 症候群と結び付くことか多いことを示している。ＶＢ５、ＶＢ８およびＶＢ１２ を含む他のＴ細胞サブセットは正常レベル異常に増加せず、経時変動もなかった 。従って、末梢血液中でＶＢ２を発現するＴ細胞の割合の定量は、この疾患の診 断テストとして使用できる。非特異的Ｔ細胞の活性化をもたらす疾患は、ＶＢ２ ”Ｔ細胞の選択的増加に至らないはずである。ＴＳＳＴ−１等の黄色ブドウ球菌 腸毒素は、特異的Ｖβセグメントを担うＴ細胞を、これら細胞上の残りのＴ細胞 レセプター組成にほとんど拘らず刺激することも強調されるべきである。他の可 変因子（Ｄβ、Ｊβ、Ｖα、Ｊα）は、普通の抗原の場合と異なり、これらのＶ β特有の超抗原の認識にあまり寄与しないようである。従って、ＶＢ２か発現す るＴ細胞のサブセットを普通の抗原か刺激する場合もあり得るが、反応するＴ細 胞の頻度は１００分の１よりずっと少なく、この反応の強さはＴＳＳＴ−１の刺 激と比べて微々たるものである。そのような反応かＶＢ２”Ｔ細胞の循環レベル を変えるとは考えられない。

この研究での毒性ショック症候群患者全員か高いＶβ２レベルを示したとは思え ない。１人の患者を急性疾患後５ケ月近く検査し、高レベルを見落とすはずはな い。この可能性は、２人の患者か提示後１，２ケ月以内にほぼ正常レベルに戻っ たというシリアルな変化によって確証胞の他のセットはＶβ特有のかたちで刺激 することを示した。従って、ＶＢ２が発現するＴ細胞に焦点を当てた実験例７お よび８は、ＴＳＳＴ−１介入疾患のみの異常を検出できると考えられる。これら 他の毒素によって増強され勝ちなＴ細胞サブセットの定量を含む更なる研究は、 ポジティブテストの頻度を増すことか考えられる。

予言されたように、グループＡ連鎖球菌と関連した致命的ショック症候群の患者 は循環Ｖβ２陽性Ｔ細胞レベルか高くなかった。

本書のデータは、毒性ショック症候群の間、Ｔ細胞刺激は普通の抗原に対する反 応で見られないスケールで発生することを示し、この大きなＴ細胞活性化が疾患 の進行における重大な事象であると考える。これらの活性化Ｔ細胞は、ＩＬ−２ 、γインターフェロン、リンホトキシン（ＴＮＦ−β）、その他種々の特徴の少 ないリンホカインを放つ可能性か高い。イミュノロジー５８：２０３〜８（１９ ８６）のマイカサン他（Ｍｉｃｕｓａｎ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　５８：　２０３−８　（１９８６））を参照されたい。

また、アシ・インド・メト１０６：８１７〜２２（１９８７）、アン・インド・ メト１０９：９５３〜８（１９８８）のベルブグラン他（Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｉｎｔ、　Ｍｅｄ。

１０６：　８１７−２２　（１９８７）；　Ａｎｎ、　Ｉｎｔ、　Ｍｅｄ、　１ ０９：　９５３−８　（１９８８））に教示されたように、ＩＬ−２注入は低血 圧の頻発と結び付けられてきた。Ｔ細胞活性化プロセスおよび／またはＩＬ−２ の解放は、マクロファージによるＩＬ−１とＴＮＦの解放をも非常に促進するか 、それに必要であり２４９２−７　（１９８５））。Ｔ細胞活性化が毒性ショッ ク症候群の発現に必要なら、Ｔ細胞の減少または機能上の不活性化か黄色ブドウ 球菌毒素介入疾患の事象の連続を中断させるはずである。このことは、疾患進行 の早期にコルチコステロイドの投与か、患者によっては有効であり得ることを示 唆する研究によって部分的にサポートされよう。

を参照されたい。

この当初の研究では、初期提示時に患者か検査されなかった。従って、動態研究 は、ＶＢ２”Ｔ細胞のパーセンテージの初期の増加後のＴ細胞種目の変化の追跡 に限られた。このサブセットの正常レベルへの復帰は、連続して検査した２人の 患者の場合驚異的な早さだった。レベルか正常に戻るという事実は、Ｖβ２Ｔ細 胞の増加か毒性ショック症候群の発生後に生じ、り急性に影響する要因ではない ことを示している。循環Ｖβ陽性Ｔ細胞を経時的に減少させるメカニズムは不明 である。免疫性を与えられたげっ書類動物の研究は、活性化と増加後の抗原特異 的Ｔ細胞かリンパ組織（抗原活性化箇所）から循環プール（つまり胸管リンパ） へ移動することを示して４０（１９７６）のウィルソン他（Ｓｐｒｅｎｔ、　ｅ ｔ　ａｌ、。

れらの細胞は、恐らくリンパ組織への自らの復帰および／または循環プールへの 他の抗原活性細胞の連続した流入を反映して、時間と共に徐々に減少する。

使用した用語や表現は限定ではなく記述用のもので、そのような用語や表現の使 用によって、開示された特徴またはその一部の均等物を除外する意図はなく、発 明の範囲内で種々の改変か可能であること・を認識されたい。

相対蛍光性 ■細胞の％ Ｔ細胞の％ ＣＰＣＰＣＰＣＰ 日数 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトの病的状態を診断する方法であって、患者の体液サンプルを分析して前 記病的状態に特徴的なＴ細胞サブタイプのレベルを判定し、判定されたレベルを 比較対照となる体液サンプルの正常レベルと比較して、前記Ｔ細胞サブタイプの レベルの変動が前記病的状態の指標となる方法。 ２．前記病的状態がブドウ球菌感染である請求項１の方法。 ３．前記病的状態が自己免疫疾患である請求項１の方法。 ４．前記体液サンプルを、前記Ｔ細胞サブタイプ特有の細胞表面抗原と特異的に 結合する抗体と接触させることによって分析する請求項１の方法。 ５．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項４の方法。 ６．前記モノクローナル抗体が、Ｖβ５、Ｖβ６、Ｖβ８およびＶβ１２からな るグループから選択されたＴ細胞表面抗原に特異的なモノクローナル抗体である 請求項５の方法。 ７．前記Ｔ細胞サブタイプを特徴付ける細胞表面抗原をコードするＤＮＡの存在 量を判定することによって、前記体液サンプルを分析する請求項１の方法。 ８．前記ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応で判定する請求項７の方法。 ９．前記細胞表面抗原が、Ｖβ１、Ｖβ２、Ｖβ３、Ｖβ４、Ｖβ５．１、Ｖβ ５．２、Ｖβ５．３、Ｖβ６．１、Ｖβ６．２、Ｖβ６．３、Ｖβ７、Ｖβ８、 Ｖβ９、Ｖβ１０、Ｖβ１１、Ｖβ１２、Ｖβ１３．１、Ｖβ１３．２、Ｖβ１ ４、Ｖβ１５、Ｖβ１６、Ｖβ１７、Ｖβ１８、Ｖβ１９およびＶβ２０からな るグループから選択される請求項７の方法。 １０．毒性ショック症候群を診断する方法であって、患者の体液サンプルを分析 して前記体液サンプル中のＶβ２サブタイプＴ細胞のレベルを判定し、前記レベ ルを比較対照となる体液サンプルの正常レベルと比較し、前記Ｖβ２サブタイプ レベルの増加が毒性ショック症候群の指標となる方法。