JP2735555B2 - γ，δＴ細胞レセプターおよび検出方法 - Google Patents
γ，δＴ細胞レセプターおよび検出方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
背景技術
本件出願においていくつかの刊行物をかっこ内のアラ
ビア数字にて参照する。 該参考文献に関する全引用文を本明細書の最後、請求
の範囲の直前に記載する。 該刊行物の全体の開示をここに本発明が関連する技術
分野をより十分に記載するために本出願に関連技術とし
て取り入れる。 抗原のＴ細胞認識および主要組織適合性複合体（MH
C）コード化抗原によるプロセスの制限を理解すること
は、免疫学における重要な目標となっている。主要段階
は、Ｔ細胞抗原レセプター（TCR）αおよびβと命名さ
れるサブユニットからなるＴ細胞上のクローン特異性ジ
スルフィド結合ヘテロダイマーの免疫化学的同定ととも
に進められている。TCRαおよびβサブユニットは、相
対分子質量（Mr）約50,000および40,000ダルトンを有す
る、各々文献（1,2,3）。Ｔ細胞個体発生時に再配列し
かつTCRβ、文献（4,5）、およびTCRα、文献（6,7,8）
サブユニットをコード化する遺伝子は、サブトラクティ
ブハイブリダイゼーションまたはオリゴヌクレオチドで
の精査（probing）のいずれかにより単離された。 ヒトTCRα，βの独特の特徴は、共転形（comodulatio
n）、文献（２）、免疫共沈（coimmunoprecipitatio
n）、文献（9,10）により観察され、またTCRα，β分子
のT3糖タンパクとのコエクスプレッション（coexpressi
on）を必要とし、文献（11）、該２つの構造が関連した
ことが提案された。続いて、２つのタンパク質複合体の
直接物理的会合がTCRα，β分子をT3糖タンパクに化学
的に架橋し、架橋複合体の成分をTCRβサブユニットお
よびT3糖タンパク（Mr 28,000）として同定することに
よって示された、文献（12）。T3複製は、同様にマウス
TCRα，βと会合される、文献（13,14）。 TCRγと命名されるＴ細胞において再配列する第３遺
伝子は、マウス、文献（15,16,17）およびヒト、文献
（18,19）において同定されている。しかしながら、そ
の遺伝子構造に関してヒトおよびマウスTCRγ遺伝子の
間の主要な相違がある。すなわち、例えば、ヒトTCRγ
遺伝子のcDNAは、TCRγ遺伝子産生物におけるＮ結合グ
リコシル化に関する５つの可能部位を示し、マウスTCR
γ遺伝子における該部位の実質的不存在と対照的であ
る。従って、ヒトTCRγ遺伝子産生物は、遺伝子配列か
ら予想不能な高分子量を有する。 TCRγ遺伝子再配列は、サプレッサー細胞毒でリンパ
球において並びにヘルパー表現型でリンパ球において生
じ、また多数のTCRγ鎖を産生し得る、文献（18,19,20,
21,22,23）。しかしながら、TCRγ遺伝子の機能は、未
知である。さらに、TCRγによりコード化されたタンパ
ク質および他の構造とのその可能な会合（TCRα，βお
よびT3糖タンパクで生じる際の）のいずれも明らかにさ
れていない。ヒトにおいて、多数の糖タンパク質のため
正確にTCRγポリペプチド構造の性質および寸法を予想
するのは、不可能である。加えて、発行された文献は、
ヒト疾病を診断し、監視しまたは段階づけ（staging）
することに関してTCRγの有効性を教示または示唆して
いない。 TCRα，β分子のみが少なくともいくつかのＴ細胞上
における抗原認識とMHC制限との両方を決定することは
いよいよ実現しそうである、文献（24,25）。しかしな
がら、TCRα，βＴが細胞個体発生の際、Ｔ細胞選択の
プロセスを示すかあるいは成熟Ｔ細胞により全ての抗原
特異性認識を示すということは、明らかでない。例え
ば、サプレッサーＴリンパ球は、なぞが残る。すなわ
ち、いくつかの場合において、該サプレッサーＴリンパ
球は、TCRβ遺伝子を再配列することを削除（delete）
または失敗する、文献（26,27）。従って、第2T細胞レ
セプターが存在するかかどうかを決定し、その構造を定
義し（特にTCRγ遺伝子産生物の可能な用途に関して）
およびひいてはこれがどんな機能を提供するかを理解す
ることは、非常に重要である。 発明の開示 本発明は、少なくともδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドの部分からなる純化ポリペプチドを提供する。加え
て、少なくとも１つのδＴ細胞レセプターポリペプチド
と複合体を特異的に形成し得る物質を提供する。 また、Ｔ細胞の各々がδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するＴ細胞を検出する方法を提供する。この方法
は、Ｔ細胞を含有するサンプルをδＴ細胞レセプターポ
リペプチドと複合体を形成することができる物質と接触
させ、該物質とδＴ細胞レセプターポリペプチドとの細
胞性複合体を形成することからなる。該細胞性複合体を
検出することにより、各Ｔ細胞がδＴ細胞レセプターポ
リペプチドを有するＴ細胞が検出される。 本発明は、さらに被験者における免疫系異常を診断す
る方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプル
におけるＴ細胞の数を決定し、サンプルを少なくとも１
つのδＴ細胞レセプターポリペプチドと複合体を形成し
得る物質と接触させ、該物質とＴ細胞レセプターポリペ
プチドとの細胞性複合体を形成することからなる。δＴ
細胞レセプターポリペプチドを有するサンプルにおける
Ｔ細胞のパーセンテージは、決定され、免疫系異常を示
さない正常被験者からのサンプルにおけるδＴ細胞レセ
プターポリペプチドを有するＴ細胞のパーセンテージと
比較される。このようにして決定されたＴ細胞のパーセ
ンテージの相異は、免疫系異常の表示である。 本発明は、被験者における免疫系異常を診断する別の
方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプルに
おけるδＴ細胞レセプターポリペプチド支持（bearin
g）Ｔ細胞の数を決定し、δＴ細胞レセプターポリペプ
チド支持Ｔ細胞におけるδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドの量を決定することからなる。このようにして決定さ
れたδＴ細胞レセプターポリペプチドの量は、免疫系異
常を示さない正常被験者からのサンプルにおける同数の
δＴ細胞レセプターポリペプチド支持Ｔ細胞におけるδ
Ｔ細胞レセプターポリペプチドの量と比較される。この
ようにして決定された量の相異は、免疫系異常の表示で
ある。 被験者における免疫系異常を診断するさらに別の方法
を提供する。この方法は、被験者からのサンプルにおい
てδＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の数
および表面マーカーT4,T8およびα，βＴ細胞レセプタ
ーのひとつを有するＴ細胞の基からなるＴ細胞の数を決
定することからなる。このようにして決定されたＴ細胞
の数は、免疫異常を示さない被験者からのサンプルにお
けるδＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の
数および被験者からのサンプルにおいて決定されたＴ細
胞の基と同一の表面マーカーを有する基におけるＴ細胞
の数と比較される。このようにして決定された基におけ
るＴ細胞の数と比較するδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するこのようにして決定されたＴ細胞の数の相異
は、免疫系異常の表示である。 本発明はまた、少なくともγＴ細胞レセプターポリペ
プチドの部分からなる純化ポリペプチドを提供する。加
えて、少なくとも１つのγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドと複合体を特異的に形成し得る物質を提供する。さら
にまた、Ｔ細胞の各々がγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するＴ細胞を検出する方法を提供する。この方法
は、Ｔ細胞を含有するサンプルをγＴ細胞レセプターポ
リペプチドと複合体を形成することができる物質と接触
させ、該物質とγＴ細胞レセプターポリペプチドとの細
胞性複合体を形成することからなる。該細胞性複合体を
検出することにより、各Ｔ細胞がγＴ細胞レセプターポ
リペプチドを有するＴ細胞が検出される。 本発明は、さらに被験者における免疫系異常を診断す
る方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプル
におけるＴ細胞の数を決定し、サンプルを少なくとも１
つのγＴ細胞レセプターポリペプチドと複合体を形成し
得る物質と接触させ、該物質とＴ細胞レセプターポリペ
プチドとの細胞性複合体を形成することからなる。γＴ
細胞レセプターポリペプチドを有するサンプルにおける
Ｔ細胞のパーセンテージは、決定され、免疫系異常を示
さない正常被験者からのサンプルにおけるγＴ細胞レセ
プターポリペプチドを有するＴ細胞のパーセンテージと
比較される。このようにして決定されたＴ細胞のパーセ
ンテージの相異は、免疫系異常の表示である。 本発明は、被験者における免疫系異常を診断するさら
に別の方法を提供する。この方法は、被験者からのサン
プルにおけるγＴ細胞レセプターポリペプチド支持（be
aring）Ｔ細胞の数およびγＴ細胞レセプターポリペプ
チド支持Ｔ細胞におけるγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドの量を決定することからなる。このようにして決定さ
れたγＴ細胞レセプターポリペプチドの量は、免疫系異
常を示さない正常被験者からのサンプルにおける同数の
γＴ細胞ポリペプチド支持Ｔ細胞ポリペプチド支持Ｔ細
胞におけるγＴ細胞レセプターポリペプチドの量と比較
される。このようにして決定された量の相異は、免疫系
異常の表示である。 本発明は、被験者における免疫系異常を診断するさら
に別の方法を提供する。この方法は、被験者からのサン
プルにおいてγＴ細胞レセプターポリペプチドを有する
Ｔ細胞の数および表面マーカーT4,T8およびα，βＴ細
胞レセプターのひとつを有するＴ細胞の基からなるＴ細
胞の数を決定することからなる。このようにして決定さ
れたＴ細胞の数は、免疫異常を示さない被験者からのサ
ンプルにおけるγＴ細胞レセプターポリペプチドを有す
るＴ細胞の数おび被験者からのサンプルにおいて決定さ
れたＴ細胞の基と同一の表面マーカーを有する基におけ
るＴ細胞の数と比較される。このようにして決定された
基におけるＴ細胞の数と比較するγＴ細胞レセプターポ
リペプチドを有するこのようにして決定されたＴ細胞の
数の相異は、免疫系異常の表示である。 本発明はさらにまた、少なくともδＴ細胞レセプター
ポリペプチドの部分および少なくともγＴ細胞レセプタ
ーポリペプチドの部分からなる純化複合体を提供する。
また、少なくとも１つのγ，δＴ細胞レセプター複合体
と複合体を特異的に形成し得る物質を提供する。さら
に、Ｔ細胞の各々がγ，δＴ細胞レセプター複合体を有
するＴ細胞を検出する方法を提供する。この方法は、Ｔ
細胞を含有するサンプルをγ，δＴ細胞レセプター複合
体と複合体を形成することができる物質と接触させ、該
物質とγ，δＴ細胞レセプター複合体との細胞性複合体
を形成することからなる。該細胞性複合体を検出するこ
とにより、各Ｔ細胞がγ，δＴ細胞レセプター複合体を
有するＴ細胞が検出される。 本発明は、さらに被験者における免疫系異常を診断す
る方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプル
におけるＴ細胞の数を決定し、サンプルを少なくとも１
つのγ，δＴ細胞レセプター複合体と複合体を形成し得
る物質とを接触させ、該物質とγ，δＴ細胞レセプター
複合体との細胞性複合体を形成することからなる。γ，
δＴ細胞レセプター複合体を有するサンプルにおけるＴ
細胞のパーセンテージは、決定され、免疫系異常を示さ
ない正常被験者からのサンプルにおけるγ，δＴ細胞レ
セプター複合体を有するＴ細胞のパーセンテージと比較
される。このようにして決定されたＴ細胞のパーセンテ
ージの相違は、免疫系異常の表示である。 本発明は、被験者における免疫系異常を診断するさら
に別の方法を提供する。この方法は、被験者からのサン
プルにおけるγ，δＴ細胞レセプター複合体支持（bear
ing）Ｔ細胞の数およびγ，δＴ細胞レセプター複合体
支持Ｔ細胞におけるγ，δＴ細胞レセプター複合体の量
を決定することからなる。このようにして決定された
γ，δ細胞レセプター複合体の量は、免疫系異常を示さ
ない正常被験者からのサンプルにおける同数のγ，δＴ
細胞複合体支持Ｔ細胞レセプター複合体支持Ｔ細胞にお
けるγ，δＴ細胞レセプター複合体の量と比較される。
このようにして決定された量の相異は、免疫系異常の表
示である。 本発明により被験者における免疫系異常を診断するさ
らに別の方法が提供される。この方法は、被験者からの
サンプルにおいてγ，δＴ細胞レセプター複合体を有す
るＴ細胞の数および表面マーカーT4,T8およびα，βＴ
細胞レセプター複合体のひとつを有するＴ細胞の基から
なるＴ細胞の数を決定することからなる。このようにし
て決定されたＴ細胞の数は、免疫異常を示さない被験者
からのサンプルにおけるγ，δＴ細胞レセプターの数お
よび被験者からのサンプルにおいて決定されたＴ細胞の
基と同一の表面マーカーを有する群におけるＴ細胞の数
と比較される。基におけるＴ細胞の数と比較するγ，δ
Ｔ細胞レセプター複合体を有するこのようにして決定さ
れたＴ細胞の数は、免疫系異常の表示である。 図面の簡単な説明 第１図:TCRα，βを認定する基質モノクローナル抗体の
反応性。 A.レーン1:対照抗体、正常マウス血清。 レーン2:抗基質TCRα，βモノクローナル抗体（βF
1）。 B.レーン1:対照抗体、正常マウス血清。 レーン2:抗T3モノクローナル抗体（UCHT−１）。 レーン3:抗基質TCRα，βモノクローナル抗体（WT3
1）。 C.正常成人末梢血リンパ球の流動血球計算分析の３次
元表示。緑色および赤色蛍光を非特異対照FITC−および
ビオチン接合モノクローナル抗体に比較して測定した。
いずれかのモノクローナル抗体と反応性のない細胞は、
非Ｔ細胞であった（左下隅）;2重陽性、すなわちOKT
３およびβF1の両方と反応した細胞は、格子の中央にお
けるリンパ球と多数の個体を構成する；βF1と反応しOK
T 3+と反応しなかった細胞は、Ｘ軸にそって観察され
た少ないが識別可能なリンパ球の基（４％のT3+細胞）
からなる。 第２図：細胞表面T3およびIDP1およびIDP2細胞系による
T3会合（架橋）分子のSDS−PAGE分析。 A.IDPI細胞系２（WT31+）および細胞系３（WT31-）。 レーン1,2,7および8:正常マウス血清。 レーン3,4,9および10:抗T3モノクロナール抗体（UC
HT−１）。 レーン5,6,11および12:抗基質TCRα，βモノクロナ
ール抗体（βF1）。 B.IDP2細胞系７（88％WT31-T3+） レーン1,4,7および10:正常マウス血清。 レーン2,5,8および11:抗基質TCRモノクローナル抗
体（βF1）。 レーン3,6,9および12:抗T3モノクローナル抗体（UC
HT−１）。 DSPと架橋した125I標識化試料XL。 C.IDP2細胞系５（WT31+T3+）および細胞系７（88％WT
31-T3+） 第３図:TCRα,TCRβおよびTCRγcDNAプローブを用いてI
DP2細胞系から単離されたRNAのノーザンブロット分析。 A.レーン1:IDP2細胞系６（WT31-） レーン2:T白血病細胞系 HBP−MLT。 B.レーン1:IDP2細胞系５（WT31+T3+）。 レーン2:IDP2細胞系７（88％WT31-T3+）。 レーン3:細胞系 HPB−MLT。 第４図:IDP2細胞系７からの抗Ｖγおよび抗Ｃγペプチ
ド血清免疫沈降。 A.レーン1:正常マウス血清。 レーン2:抗Ｖγペプチドマウス血清。 レーン3:正常ラビット血清。 レーン4:抗Ｃγペプチドラビット血清。 B.レーン1:正常マウス血清。 レーン2:抗T3モノクローナル抗体（UCHT−１）。 レーン3:正常ラビット血清。 レーン4,5:抗Ｃγペプチドラビット血清。 第５図：ヒト腫瘍および末梢血リンパ球系からのTCR
γ，δおよびT3の免疫沈降。 125I標識化細胞溶解産物からの免疫沈降は、還元（re
ducing）（Ｒ）または非還元（ＮまたはNR）条件下SDS
−PAGE（10％アクリルアミド）によって分析された。サ
イズマーカー、Mr,1000。 A.IDP2およびPEER細胞上のTCRγ，δおよびT3サブユニ
ット。免疫沈降は、１μｇ対照mAb P3（P3X63.Ag8骨髄
腫により分泌されたmAb,レーン1,3,5および６）;1μgUC
HTI（抗T3）（文献40）（レーン2,4,7および８）;10μ
正常ラビット血清（NRS,レーン９）および10μ抗Ｃ
ペプチド血清（抗TCRγ）（レーン10）を用いて実行さ
れた。矢印は、ＲおよびNR条件下、移動度を変化するTC
Rδサブユニットの位置を示す。 末梢血Ｔ細胞クローン、PBL C1およびWT31-PBL系上
のTCRγ，δおよびT3サブユニット。免疫沈降は、対照m
Ab P3（レーン1,4,9および12）、１μｇ βF1（抗TCR
β）（レーン2,5,10および13）、NRS（レーン７および1
5）および抗ペプチド血清（レーン８および16）を用い
て実行された。白抜き矢印は、ジスルフィド結合F1およ
び未反応性T3会合種、黒塗り矢印は、非ジスルフィド結
合、悲還元条件下増加SDS−PAGE移動度を表示するT3会
合物質（ＡにおけるTCRδ等）を示す。 第６図:PBL C1から単離されたRNAのノーザンブロット
分析。 Ｔ白血病細胞系HPB−MLT（各プローブに関してレーン
１）およびPBL C1（各プローブに関してレーン２）か
らの総RNA組織標本は、TCRα,TCRβおよびTCRγプロー
ブを用いノーザンブロットが分析された。 第７図:TCRγポリペプチドおよび前駆体の二次元ゲル分
析。 パネルＡ〜Ｄ PBL C1細胞からの還元（分離）および
非還元（二量性）T3−会合ポリペプチドの比較をCHAPS
に溶解し、抗T3mAbで免疫沈降した。二次元ゲル電気泳
動を還元条件下（A,C）あるいは非還元条件下（B,D）を
行った。T3γ，δおよびε部位を標識化し、ＲおよびＮ
の両方の条件下、同位置に電気泳動させた。ジスルフィ
ド結合の開裂後、T3会合ポリペプチド（40Kおよび36K）
は、Ｒ条件下、T3γの近くの電気泳動部位に移動したが
Ｎ条件下（二量体の両組成物が存在する際（68K））、
より酸性部位にシフトした。サイズマーカー、Mr. パネルＥ〜Ｈ グリコシル化および未グリコシル化IDP2
およびPBL C1 TCRペプチド前駆体の分析。IDP2および
PBL C1細胞は、35S−メチオニンでパルス標識化され、
変性条件下、溶解され、抗Ｃγペプチド血清で免疫沈降
された。免疫沈降は、ついでエンド−Ｈで処置、または
模擬処理され、２次元ゲル電気泳動により分析された。
グリコシル化TCRγペプチドを白抜き矢印で、未グリコ
シル化TCRγを黒塗り矢印で示す。見かけ相対分子質量
をパネルＡおよびＢ（図示せず）に用いた標準の移動か
ら計算した。各パネルにおけひし形で示される小量の汚
染アクチンは、内部マーカーとして作用した。E,IDP2
TCRγ、模擬培養、F,IDP2 TCRγ，エンド処置;G,PBL
C1 TCRγ模擬培養、H,PBL C1 TCRγエンド処理。 第８図:TCRγポリペプチドを発現するＴ細胞におけるγ
およびβ遺伝子の再配列。 IDP2細胞系、PBL C1,PbL C2,WT31-PBL系、胎児胸
腺、新生児胸腺,PBLおよびＢ細胞系（胚子系（germlin
e）に関してJY）から単離されたゲノムDNAをTCRγ（A,
B）およびTCRβ（Ｃ）遺伝子再配列に関してサザンブロ
ット分析を行った。ゲノムDNAは、アガロースゲル上に
分画されたBamH I（A,C）またはEcoR I（Ｂ）で消化さ
れ、32P−標識化Ｊγ1,3（A,B）またはＣβ２プローブ
（Ｃ）でのハイブリダイゼーションのためニトロセルロ
ースフィルターに写された。矢印およびローマ数字はTC
Rγ再配列を示す。サイズマーカーKb. 第９図:IDP2およびPBL C1細胞による細胞溶解。 パネルA,C IDP2またはPBL C1エフェクター細胞を（表
示されたエフェクター：ターゲット（E:T）比で）51Cγ
−標識化ターゲット細胞K562（白血球系）、U937（単核
細胞系）、MOLT−4,CEM（Ｔ白血病系）、ダウディ（Dau
di）（バーキットリンパ腫系）または同種異系または自
系PBL（ヒトPBLの３日PHAブレスト（blasts））で培養
した。各ターゲットに対する51Cγの特異放出％を示
す。抗T3 mAb UCHIを30分間０℃でエフェクター細胞
（＋抗T3）に予備結合した後に同様の検定を行った。 パネルＢ 種々のmABによるMOLT−４ターゲット細胞のI
DP2細胞溶解の禁止。IDP2および51Cγ標識化MOLT−４細
胞を種々の希釈度の抗MHCクラス1mAb W6/32（抗HLA−
A,B,C単系性決定因子）、（文献58）、抗HLA−A,B,C
（単系性決定因子）、（文献59）、4E（抗−HLA−Ｂお
よびＣ部位）、（文献60）、131（抗HLA−Ａ部位）、
（文献61）または抗MHC（クラスII mAB LB3.1（抗DR特
異性）、（文献62）、抗Leu 10（抗DQ特異性）、（文
献63）、または抗T3 mAB UCHTIの存在下、40:1のE:T
比でお互いに培養した。高稀釈度は、腹水とししてmAb
用に用いられ（W6/32,4E,131,LB3.1およびUCHTI）、ま
たは低稀釈度は、市販mAb用（抗Leu 10）または培養上
澄液用（抗HLA−A,B,C）に用いられた。 第10図：ピーア（peer）細胞から誘導されたTCRγ鎖の
免疫沈降。 レーン１〜18は、同一ハイブリドーマ融合実験からの
種々のハイブリドーマ培養上澄液（spurnatates）であ
る。レーン４は、抗γ鎖モノクローナル抗体34D12であ
り、レーン９は対照P3×63Ag8.653培養上澄液であり、
またレーン10は、対照正常マウス血清である。 第11図:IDP2細胞からのTCRδ鎖の免疫沈降。 レーン１は、対照P3×63Ag.8.653は培養上澄液、レー
ン２および５は、モノクローナル抗体4A1培養上澄液、
レーン３は、Leu4,またレーン４は、対照正常ラビット
血清である。 IDP2細胞は、ラクトペルオキシターゼを用いて125I標
識化し、２％トリトンX100（Triton X100）に可溶化し
た。レーン４および５において、この溶解産物を１％ト
リトンX100 ４容量で稀釈した１％SDS中、３分間煮沸
し、４℃で１晩変性した。これによりTCRγおよびδ鎖
の分離をした。このような鎖分離の後、モノクローナル
ネ抗体4A1は、上述のごとく、TCRδ鎖（レーン５）を免
疫沈降した。 発明の詳細な説明 しかして、本発明は、少なくともδＴ細胞レセプター
の部分からなる純化ポリペプチドを提供するものであ
る。このポリペプチドは、少なくとも内部鎖、共有結
合、ジスルフィド架橋を有し得る。加えて、ポリペプチ
ドは、分子量約40,000ダルトンのδＴ細胞レセプターポ
リペプチドからなり得る。さらに、δＴ細胞レセプター
ポリペプチドは、ヒトδＴ細胞レセプターポリペプチド
であり得る。 少なくとも１つのδＴ細胞レセプターポリペプチドと
複合体を特異的に形成し得る物質もまた、本発明によっ
て提供される。この発明の一実施例態様において、該物
質は、１つのδＴ細胞レセプターポリペプチドと複合体
を特異的に形成できる。この発明の他の実施態様におい
て、該物質は、１以上のδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドと複合体を特異的に形成できる。この発明の他の実施
態様において、該物質は、１以上のδＴ細胞レセプター
ポリペプチドと複合体を特異的に形成できる。該物質
は、抗体であり得る。該抗体は、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体であり得る。 また、Ｔ細胞の各々がδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するＴ細胞を検出する方法を提供する。この方法
は、Ｔ細胞を含有するサンプルをδＴ細胞レセプターポ
リペプチドと複合体を形成することができる物質と接触
させ、該物質とδＴ細胞レセプターポリペプチドとの細
胞性複合体を形成することからなる。該細胞性複合体を
検出することにより、各Ｔ細胞がδＴ細胞レセプターポ
リペプチドを有するＴ細胞が検出される。 従って、この発明の一実施態様において、δＴ細胞レ
セプターポリペプチドは、Ｔ細胞上の表面上に存在す
る。この発明の別の実施態様において、δＴ細胞レセプ
ターポリペプチドは、δＴ細胞の細胞質内に存在する。 該方法は、特異δＴ細胞レセプターポリペプチド複合
体を形成することによって行なわれる。この発明の一実
施態様において、特異δＴ細胞レセプターポリペプチド
は、サプレッサーＴ細胞内のみに存在する。 本発明は、さらに被験者における免疫系異常を診断す
る方法を提供する。本明細書において、免疫系異常と
は、正常または標準免疫応答と比較して上昇または減少
免疫応答であることを特徴とする抗原に対する免疫学的
応答性の状態を意味するものである。従って、免疫系異
常としては、これに限定されるものではないが、免疫不
全状態、例えば後天性免疫不全症候群および先天性免疫
不全症等、高免疫状態および高免疫症、例えばアレルギ
ーおよび枯草熱等が挙げられる。本発明の方法は、被験
者からのサンプルにおけるＴ細胞の数を決定し、サンプ
ルを少なくとも１つのδＴ細胞レセプターポリペプチド
と複合体を形成し得る物質と接触させ、該物質とδＴ細
胞レセプターポリペプチドとの細胞性複合体を形成する
ことからなる。δＴ細胞レセプターポリペプチドを有す
るサンプルにおけるＴ細胞のパーセンテージは、決定さ
れ、免疫系異常を示さない正常被験者からのサンプルに
おけるδＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞
のパーセンテージと比較される。このようにして決定さ
れたＴ細胞のパーセンテージの相異は、免疫系異常の表
示である。 この発明の一実施態様において、免疫系異常は、癌で
ある。癌は、白血病またはリンパ腫であり得る。この発
明の他の実施態様において、免疫系異常は、後天性免疫
不全症候群である。この発明の別の実施態様において、
免疫系異常は、先天性免疫不全症である。この発明のさ
らに別の実施態様において、免疫系異常は、自己免疫疾
患である。 免疫系異常が診断される被験者は、動物であり得る。
この発明の一実施態様において、被験者は、ヒトであ
る。さらにまた被験者からのサンプルは、血液または組
織からなることができる。 本発明は、被験者における免疫系異常を診断する別の
方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプルに
おけるδＴ細胞レセプターポリペプチド支持Ｔ細胞の数
およびδＴ細胞レセプターポリペプチド支持Ｔ細胞にお
けるδＴ細胞レセプターポリペプチドの量を決定するこ
とからなる。このようにして決定されたδＴ細胞レセプ
ターポリペプチドの量は、免疫系異常を示さない正常被
験者からのサンプルにおける同数のδＴ細胞レセプター
ポリペプチド支持Ｔ細胞におけるδＴ細胞レセプターポ
リペプチドの量と比較される。このようにして決定され
た量の相異は、免疫系異常の表示である。この発明の一
実施態様において、シグナルδＴ細胞レセプターポリペ
プチドの量が決定される。 被験者における免疫系異常を診断するさらに別の方法
を提供する。この方法は、被験者からのサンプルにおい
てδＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の数
および表面マーカーT4,T8およびα，βＴ細胞レセプタ
ーのひとつを有するＴ細胞の基からなるＴ細胞の数を決
定することからなる。このようにして決定されたＴ細胞
の数は、免疫異常を示さない被験者からのサンプルにお
けるδＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の
数および被験者からのサンプルにおいて決定されたＴ細
胞の基と同一の表面マーカーを有する基におけるＴ細胞
の数と比較される。このようにして決定された基におけ
るＴ細胞と比較するδＴ細胞レセプターポリペプチドを
有するこのようにして決定されたＴ細胞の数の相異は、
免疫系異常の表示である。 本発明はまた、分子量約40,000ダルトンのδＴ細胞レ
セプターをコード化する核酸分子を提供する。この発明
の一実施態様において、該分子は、DNA分子である。さ
らにまた、δＴ細胞レセプターポリペプチドをコード化
する核酸分子と相補性である核酸分子が提供される。 少なくともγＴ細胞レセプターの部分からなる純化ポ
リペプチドもまた、本発明によって提供される。該ポリ
ペプチドは、分子量約55,000ダルトンのγＴ細胞レセプ
ターからなり得る。この発明は、一実施態様において、
該ポリペプチドは、分子量約31,000ダルトン〜約40,000
ダルトンを有するペプチド配列を有する。加えて、該ポ
リペプチドヒトγＴ細胞ポリペプチドであり得る。 本発明はさらに、お互い会合された２つの本発明のγ
Ｔ細胞レセプターポリペプチドからなる純化複合体を提
供する。この発明の一実施態様において、該２つのγＴ
細胞レセプターポリペプチドは、少なくとも１つの内部
鎖、共有結合、ジスルフィド結合によりお互い会合され
る。この発明の他の実施態様において、該２つのγＴ細
胞レセプターは、お互い非共有結合的に会合される。こ
の発明の別の実施態様において、該２つのγＴ細胞レセ
プターは、同一の一定ドメインを有する。この発明のさ
らに別の実施態様において、該２つのγＴ細胞レセプタ
ーポリペプチドは、異なる一定ドメインを有する。 本発明はまた、少なくとも１つのγＴ細胞レセプター
ポリペプチドと複合体を特異的に形成し得る物質を提供
する。この発明の一実施例態様において、該物質は、１
つのγＴ細胞レセプターポリペプチドと複合体を特異的
に形成できる。この発明の他の実施態様において、該物
質は、１以上のγＴ細胞レセプターポリペプチドと複合
体を特異的に形成できる。該物質は、抗体であり得る。
この発明の一実施態様において該抗体は、ポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。 また、Ｔ細胞の各々がγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するＴ細胞を検出する方法を提供する。この方法
は、Ｔ細胞を含有するサンプルをγＴ細胞レセプターポ
リペプチドと複合体を形成することができる物質と接触
させ、該物質とγＴ細胞レセプターポリペプチドとの細
胞性複合体を形成することからなる。該細胞性複合体を
検出することにより、各Ｔ細胞がγＴ細胞レセプターポ
リペプチドを有するＴ細胞が検出される。この発明の一
実施態様においてγＴ細胞レセプターポリペプチドは、
Ｔ細胞表面上に存在する。この発明の他の実施態様にお
いて、γＴ細胞ポリペプチドは、γＴ細胞の細胞質内に
存在する。この発明の別の実施態様において、該物質
は、特異γＴ細胞ポリペプチドと複合体を形成し得る。
この該特異γＴ細胞レセプターポリペプチドは、サプレ
ッサーＴ細胞内のみに存在し得る。さらにまた、該γＴ
細胞レセプターポリペプチドは、別のγＴ細胞レセプタ
ーポリペプチドと会合され得る。この発明の一実施態様
において、該γＴ細胞レセプターポリペプチドは、別の
γＴ細胞レセプターポリペプチドと会合される。この発
明の他の態様において、該γＴ細胞レセプターポリペプ
チドは、非主要の組織適合制限細胞毒Ｔリンパ球のみに
おいて別のγＴ細胞レセプターポリペプチドと会合され
る。さらにまた、該非主要の組織適合制限細胞毒Ｔリン
パ球は、Ｔキラー細胞または天然キラー様細胞であり得
る。 本発明は、さらに被験者における免疫系異常を診断す
る方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプル
におけるＴ細胞の数を決定し、サンプルを少なくとも１
つのγＴ細胞レセプターポリペプチドと複合体を形成し
得る物質と接触させ、該物質とγＴ細胞レセプターポリ
ペプチドとの細胞性複合体を形成することからなる。γ
Ｔ細胞レセプターポリペプチドを有するサンプルにおけ
るＴ細胞のパーセンテージは、決定され、免疫系異常を
示さない正常被験者からのサンプルにおけるγＴ細胞レ
セプターポリペプチドを有するＴ細胞のパーセンテージ
と比較される。このようにして決定されたＴ細胞のパー
センテージの相異は、免疫系異常の表示である。この発
明の一実施態様において、免疫系異常は、癌である。癌
は、白血病またはリンパ腫であり得る。この発明の他の
実施態様において免疫系異常は、後天性免疫不全症候群
である。この発明の別の実施態様において、免疫系異常
は、先天性免疫不全症である。この発明のさらに別の実
施態様において、免疫系異常は、自己免疫疾患である。 免疫系異常が診断される被験者は、動物であり得る。
また免疫系異常が診断される被験者は、ヒトであり得
る。さらにまた、γ,T細胞レセプターポリペプチドを有
するＴ細胞のパーセンテージが決定されるサンプルは、
血液または組織からなることができる。 被験者における免疫系異常を診断するさらに別の方法
は、本発明によって提供される。この方法は、被験者か
らのサンプルにおけるγＴ細胞レセプターポリペプチド
支持Ｔ細胞の数およびγＴ細胞レセプターポリペプチド
支持Ｔ細胞におけるγＴ細胞レセプターポリペプチドの
量を決定することからなる。このようにして決定された
γＴ細胞レセプターポリペプチドの量は、免疫系異常を
示さない正常被験者からのサンプルにおける同数のγＴ
細胞ポリペプチド支持Ｔ細胞におけるγＴ細胞レセプタ
ーポリペプチドの量と比較される。このようにして決定
された量の相異は、免疫系異常の表示である。この発明
の一実施態様において、シグナルγＴ細胞レセプターポ
リペプチドの量が決定される。 被験者における免疫系異常を診断するさらに別の方法
を提供する。この方法は、被験者らかのサンプルにおい
てγＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の数
および表面マーカーT4,T8およびα，βＴ細胞レセプタ
ーのひとつを有するＴ細胞の基からなるＴ細胞の数を決
定することからなる。このようにして決定されたＴ細胞
の数は、免疫異常を示さない被験者からのサンプルにお
けるγＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の
数および被験者からのサンプルにおいて決定されたＴ細
胞の基と同一の表面マーカーを有する基におけるＴ細胞
の数と比較される。このようにして決定された基におけ
るＴ細胞の数と比較するγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するこのようにして決定されたＴ細胞の数の相異
は、免疫系異常の表示である。 さらに、少なくともδＴ細胞レセプターポリペプチド
の部分および少なくともγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドの部分からなる純化複合体が、本発明によって提供さ
れる。この複合体は、分子量約40,000ダルトンのδＴ細
胞レセプターポリペプチドおよび分子量約50,000ダルト
ンのγＴ細胞レセプターポリペプチドからなることがで
きる。また、δＴ細胞レセプターポリペプチドは、ヒト
γＴ細胞ポリペプチドであり得、γＴ細胞レセプターポ
リペプチドは、ヒトγＴ細胞ポリペプチドであり得る。
さらにまた、δＴ細胞レセプターポリペプチドおよびγ
Ｔ細胞レセプターポリペプチドは、少なくとも１つの内
部鎖、共有結合、ジスルフィド結合によりお互い会合し
得、あるいはお互い非共有結合的に会合できる。 また、少なくとも１つのγ，δＴ細胞レセプター複合
体と複合体を特異的に形成し得る物質が本発明によって
提供される。この物質は、１つのγ，δＴ細胞レセプタ
ー複合体と複合体を形成できる。さらに、この物質は、
１以上のγ，δＴ細胞レセプター複合体と複合体を形成
できる。 この発明の一実施態様において、該物質は、抗体であ
る。この発明の他の実施態様において、該物質は、ポリ
クローナル抗体である。この発明の別の実施態様におい
て、該物質は、モノクローナル抗体である。 本発明はさらに、Ｔ細胞の各々がγ，δＴ細胞レセプ
ター複合体を有するＴ細胞を検出する方法を提供する。
この方法は、Ｔ細胞を含有するサンプルをγ，δＴ細胞
レセプター複合体と複合体を形成することができる物質
と接触させ、該物質とγ，δＴ細胞レセプター複合体と
の細胞性複合体を形成することからなる。該細胞性複合
体を検出することにより、各Ｔ細胞がγ，δＴ細胞複合
体を有するＴ細胞が検出される。この発明の一実施態様
においてγ，δＴ細胞レセプター複合体は、Ｔ細胞の表
面上に存在する。この発明の別の実施態様において、
γ，δＴ細胞レセプター複合体は、Ｔ細胞の細胞質内に
存在する。この発明のさらに別の実施態様において、該
物質は、特異γ，δＴ細胞レセプター複合体と複合体を
形成することができる。該特異γ，δ細胞複合体は、サ
プレッサーＴ細胞のみに存在し得る。 さらに、被験者における免疫系異常を診断する方法
が、本発明によって提供される。この方法は、被験者か
らのサンプルにおけるＴ細胞の数を決定し、サンプルを
少なくとも１つのγ，δＴ細胞レセプター複合体と複合
体を形成し得る物質と接触させ、該物質とγ，δＴ細胞
レセプター複合体との細胞性複合体を形成することから
なる。γ，δＴ細胞レセプター複合体を有するサンプル
におけるＴ細胞のパーセンテージは、決定され、免疫系
異常を示さない正常被験者からのサンプルにおけるγ，
δＴ細胞レセプター複合体を有するＴ細胞のパーセンテ
ージと比較される。このようにして決定されたＴ細胞の
パーセテージの相異は、免疫系異常の表示である。この
発明の一実施態様において、免疫系異常は、癌である。
癌は、白血病またはリンパ腫であり得る。この発明の他
の実施態様において、免疫系異常は、後天性免疫不全症
候群である。この発明の別の実施態様において、免疫系
異常は、先天性免疫不全症である。この発明のさらに別
の実施態様において、免疫系異常は、自己免疫疾患であ
る。 免疫系異常が診断される被験者は、動物であり得る。
さらに、免疫系異常が診断される被験者は、ヒトであ
る。さらにまた、γ，δＴ細胞レセプター複合体を有す
るＴ細胞のパーセンテージが決定されるサンプルは、血
液または組織からなることができる。 本発明により被験者における免疫系異常を診断するさ
らに別の方法が提供される。この方法は、被験者からの
サンプルにおけるγ，δＴ細胞レセプター複合体支持Ｔ
細胞の数およびγ，δＴ細胞レセプター複合体支持Ｔ細
胞におけるγ，δＴ細胞レセプターの量を決定すること
からなる。このようにして決定されたδＴ細胞レセプタ
ー複合体の量は、免疫系異常を示さない正常被験者から
のサンプルにおける同数のγ，δＴ細胞レセプター複合
体支持Ｔ細胞におけるγ，δＴ細胞レセプター複合体の
量と比較される。このようにして決定された量の相異
は、免疫系異常の表示である。この発明の一実施態様に
おいて、シグナルγ，δＴ細胞レセプター複合体の量が
決定される。 被験者における免疫系異常を診断するさらに別の方法
を提供する。この方法は、被験者からのサンプルにおい
てγ，δＴ細胞レセプター複合体を有するＴ細胞の数お
よび表面マーカーT4,T8およびα，βＴ細胞レセプター
のひとつを有するＴ細胞の基からなるＴ細胞の数を決定
することからなる。このようにして決定されたＴ細胞の
数は、免疫異常を示さない被験者からのサンプルにおけ
るγ，δＴ細胞レセプター複合体を有するＴ細胞の数お
よび被験者からのサンプルにおいて決定されたＴ細胞の
基と同一の表面マーカーを有する基におけるＴ細胞の数
と比較される。このようにして決定された基におけるＴ
細胞の数と比較するγ，δＴ細胞レセプター複合体を有
するこのようにして決定されたＴ細胞の数は、免疫系異
常の表示である。 本発明によって提供される種々の異常を診断する方法
およびＴ細胞を検出する方法は、以下に詳述する新規ポ
リペプチド類および該ポリペプチド類と複合体を形成す
る物質に基づく。該方法は、これに限定されるものでは
ないが本発明に関して当業者に公知の活性化細胞餞別お
よびオートラジオグラフィ等、Ｔ細胞を検出し、定量す
る方法を利用する。 実施例 実施例１ 物質および方法 リンパ球培養株および細胞個体群分析 生育可能なリンパ球をフィコール−ハイパーク高密度
遠心分離により単離し、特異モノクローナル抗体、例え
ばWT31（文献28,29）、またはOKT 3,OKT ４またはOKT
８［オルソー・ダイアグノスティック・システムズ・
インコーポレーテッド、ラーリトン・ニュージャーシー
州（Ortho Diagnostic Systems,Inc.,Raritan,NJ）］、
を30分間４℃で染色した。洗浄後、細胞ペレットをさら
にフルオレセインイソチオシアネート（FITC）接合ヤギ
抗マウスIgC（ab）′２フラグメントで染色した。フル
オレセイン活性化細胞選別（FACS）分析を先に記載のご
とく（文献37）オルソーサイトフルオログラフ（cytofl
uorograph）またはコールター・エピシス（Coulter Epi
cs）で行った。特異的に染色された陽性細胞は、各細胞
系（非特異対照モノクローナル抗体で染色）に関する陰
性対照プロフィールと比較して決定された。基線での陰
性対照プロフィールの妨害より大きいフルオレセイン強
度チャンネル数を有する細胞を陽性とし、陽性％を合計
総細胞数と比較して計算した。 全IL−２依存細胞を先に記載のごとく（文献34）、PR
MI 1640、10％ヒト血清および２〜５ユニットのインタ
ーロイキン−２活性含有条件培地からなる培地中生体外
生殖した。 同種抗原（allo）活性化培養株を１週間間隔で照射同
種異系末梢血リンパ球で刺激した。マイトジェン、すな
わちフィトヘムアグルチニン（PHA）活性化系を培養開
始時に1:1000稀釈PHA［ディフコ、デトロイト、ミシガ
ン（Difco,Detroit,MI）］で刺激した。 モノクローナル抗体を用いた細胞培養株の反応性および
特徴づけ 125I標識化リンパ球溶解産物からの免疫沈降物をドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）で分析した。放射性ヨウ素化白血病細胞
系HPB−MLTおよびジャーカット（Jurket）、HTLV−１形
質転換細胞系ANITAおよび休止末梢血リンパ球を１％ト
リトン−Ｘ−100（TX−100）に可溶化し、対照抗体、正
常マウス血清（MMS）またはTCRα，βに対する基質抗
体、すなわちF1（文献54）で免疫沈降した。βF1モノク
ローナル抗体を標準方法で調製した（文献46,47,52）。
文献（28）に記載のごとく純化TCRα，βで免疫化した
マウスからの脾臓を融合実験用に用いた。陽性クロー
ン、βF1,が上述のごとくＴ細胞系および末梢血リンパ
球での免疫沈降により得られた。 125I標識化リンパ球を0.1％TX−100に可溶化し、NM
S、抗T3抗体UCHT−１（文献40）およびTCRに対する基質
抗体、すなわちFWT31で免疫沈降した。WT31での免疫沈
降の効率をここに用いられるTX−100低濃度で改善し、
またモノクローナル抗体187.1（文献53）を第２抗体と
して用いた。 正常末梢血リンパ球の２色FACS分析を抗TCRα，βモ
ノクローナル抗体および抗T3モノクローナル抗体を用い
て行った。末梢血リンパ球は、最初にFITC接合抗モノク
ローナル抗体（OKT ３）で染色し、ついでビオチニル
抗TCRα，βモノクローナル抗体（BF1）で染色し、ひき
つづき藻紅素接合アビジン［PE−アビジン、ベクトン・
ディッケンソン、マウント・ビュー，カリフォルニア州
（Becton Dickenson,Mt.View,CA）］で染色した。 生育可能なリンパ球をSDS−PAGEおよびFACS分析のた
めにフィコール−ハイパーク高密度遠心分離により単離
した。SDS−PEGE分析に関して、リンパ球は、ラクトペ
ルオキシターゼ技術により放射性ヨウ素化され、１％TX
−100に可溶化し、そして１マイクログラムの特異抗
体、すなわちモノクローナル抗体βF1またはモノクロー
ナル抗体UCHT−１、または１マイクロ力価のNMSを用い
て免疫沈降した。免疫沈降物をついで還元条件下10.5％
SDS−PAGEにより分析した。125I標識化分子は、先に記
載のごとく（文献28）オートラジオグラフィーにより可
視化した。 ２色サイトフルオログラフィー分析は、まず第１にFI
TC−OKT ３モノクローナル抗体で45分間４℃にて染色
することによって行なわれた。洗浄後、リンパ球を１％
パラホルムアルデヒドに15分間23℃にて固定し、ついで
70％エタノールリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中５分間
−20℃にて培養した。さらに洗浄後、細胞をビオチニル
−βF1モノクローナル抗体で染色し、ついでPE−アジビ
ンで染色した。分析は、オルソーサイトフルオログラフ
（オルソー・ダイアゴスティック・システムズ、インコ
ーポレーション.,ウエウト ウッド、マサチューセッツ
州）で行なわれた。 IDP1およびIDP2細胞系上のT3分子と会合された細胞表面
分子の分析 IDP1細胞系２（WT31+）および細胞系（WT31-）を上述
のごとく125I−標識化した。放射性ヨウ素化された無傷
のリンパ球をついでジチオビスサクシニミジルプロピオ
ネート50マイクログラム/ml含有PBS（pH8）中の培養に
より架橋を行うかまたは模擬培養をした。細胞をついで
１％TX−100中に可溶化し、先に記載のごとく（文献1
2）免疫沈降した。抗T3免疫沈降におけるT3会合分子（M
r 40,000〜55,000）は、未架橋サンプルにおいて低レ
ベルでまたは架橋サンプルにおいて高レベルで検出され
た。 IDP2細胞系７（88％WT31-T3+）を125I−標識化しかつ
DSPで処理したかあるいは模擬培養した。免疫沈降をモ
ノクローナル抗体βF1でのTCRα，β分子の予備洗浄な
しまたはありのいずれかでNMS,抗T3モノクローナル抗体
および抗TCRα，βモノクローナル抗体βF1を用いて行
った。少フラクションの放射性標識化TCRα，βは、予
備洗浄されないサンプル中に検出されたが、βF1で予備
洗浄されたサンプル中には検出されなかった。 IDP2細胞系５（WT31+T3+）および細胞系７（88％WT31
-T3+）を125I標識し、１％TX−100に可溶化し、そしてN
MSまたは抗T3モノクローナル抗体UCHT−１を用いて免疫
沈降した。T3ヘビーサブユニット（Mr27,000）は、これ
ら２つの細胞系に同様に表われ、一方T3ライトサブユニ
ット（Mr19,000〜25,000）は、表われなかった。 オートラジオグラフィーによる10.5％SDS−PAGE分析
後、125I−標識化、１％TX−100中への可溶化、免疫沈
降および可視化を先に記載のごとく（文献28）行った。
化学的架橋を先に記載のごとく（文献28）DPS（50マイ
クログラム/ml）PBS溶液（pH8）を用いて無傷の放射性
標識化リンパ球上に23℃で30分間行った。免疫沈降後、
全サンプルをタンパク質サブユニット間のジスルフィド
結合よおびDSP化学的架橋の両者を解裂する５％２−メ
ルカプトエタノールを用いてて還元条件下SDS−PAGEに
より検査した。 TCRα,TCRβおよびTCRγcDNAプローブを用いてIDP2細胞
系から単離されたRNAのノーザンブロット検定 IDP2細胞系６（WI31-）からおよびＴ白血病細胞系HBP
−MLTから単離された総RNA（15マイクログラム）を2.2M
ホルムアルデヒド含有1.5％アガロースゲル上に分画
し、ニトロセルロースに形質転換し、そしてTCRα,TCR
β，およびTCRγプローブとハイブリダイゼーションし
た。 IDP2細胞系５（WT31+T3+）,IDP2細胞系７（88％WT31-
T3+）およびHPB−MLTから単離された総RNA（３マイクロ
グラム）を上述のごとく分析した。 RNA調製、電気泳動、ニトロセルロースへの形質およ
び32P標識化ニック翻訳されたプローブ（１〜３×108cp
m/マイクログラム）とのハイブリダイゼーションは、先
に記載のとおりであった（文献41）。α鎖プローブは、
ヒトcDNAクローンpG45（文献８）またはL17α（文献4
2）のいずれかであった。γ鎖プローブは、ヒトDNAクロ
ーンＴγ−１から誘導されたAcc Iに対するEcoR Iであ
った。放射線活性バンドは、強化スクリーンを用いてオ
ートラジオグラフィーで可視化された。全プローブは、
ほぼ同一の特異的活性に標識化され同一曝露時間を与え
る。 抗γ抗血清を用いたIDP2細胞系表面分子の免疫沈降 TX−100可溶化125I標識化IDP2細胞系７（88％WT31-T3
+）を変性し（下記参照）、ついでNMSまたは正常ラビッ
ト血清でおよび抗Ｖγペプチド血清または抗Ｃγペプチ
ド血清で免疫沈降した。特異的バンドは、抗Ｖγペプチ
ド血清および抗Ｃγ免疫沈降物の両者においてMr55,000
にて観察された。Mr90,000における補足的バンドは、抗
Ｃγ免疫沈降において再限的には観察されなかった（下
記参照）。 125I標識化IDP2細胞系７からのDSP架橋個有溶解産物
（１％TX100）をNMSでまたは抗T3モノクローナル抗体UC
HT−１で免疫沈降した。別に、該溶解産物を変性し（下
記参照）、ついで正常ラビット血清または抗Ｃγペプチ
ド血清のいずれかで免疫沈降した。 補足的アリコートの溶解産物を２段階免疫沈降した。
ポリペプチドを抗T3モノクローナル抗体UCHT−１で免疫
沈降し、ついでDSP架橋を切断するために変性および還
元条件下免疫吸収剤から溶離した。ついで、この溶離物
からの免疫沈降を抗Ｃγペプチド血清を用いて行った。 125I標識化、１％TX−100中への可溶化および免疫沈
降を上述のごとく行った。個有溶解産物（１％TX−10
0）をSDS（最終濃度１％）およびジチオスレイトール
（dithiothreitol）（最終濃度2mM）を添加しつづいて6
8℃で５分間該混合物を加熱することにより変性した。
冷却句後、ヨードアセタミドを添加し（最終濃度20mM、
サンプルを４容量の1.5％TX−100トリス緩衝生理食塩水
（pH8）で溶離した。該実験における初期免疫沈降物を
変性し、つづいて部分的に再生（renatured）した（文
献28）。サンプルを10マイクロリットルの抗Ｃγまたは
抗Ｖγペプチド血清、１マイクログラムのUCHT−１また
は１マイクロ力価のNMSまたは正常ラビット血清で免疫
沈降し、ついで還元条件下（５％２−メルカプトエタノ
ール）、10.5％SDS−PAGEで分析した。 推定ＶγまたはＣγアミノ酸配列に相当するペプチド
（残基数は、下記の実験結果の節に記載）は、エリクソ
ン（Erickson）およびメァリーフィールド（Merrifiel
d）の方法（文献44）を用いてベックマン990ペプチドシ
ンサセイザー（Beckman 990 peptide synthesizer）で
合成された。ペプチド純度は、高圧液体クロマトグラフ
ィーで評価され、ペプチド配列は、アミノ酸分析で確認
された。ペプチドは、キーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（Keyhole limpet hemocyanin）（KLH）と1KLP分
子につき50プペチドの比率でカップルした（文献45）。
マウスおよびラビットは、各々ＶγペプチドまたはＣγ
ペプチドで免疫化された。動物は、３週間間隔で接種さ
れ、血清をペプチド−KLHおよびペプチド−ウシ血清ア
ルブミン接合に対する反応性をバインドするためスクリ
ーニングし、ペプチド−特異抗体の存在を確認した。 γ鎖に対するモノクローナル抗体は、文献（47,50）
に記載された標準方法により発生された。BALB/cマウス
は、エリクソンおよびメァリーフィールドの方法（文献
44）を用いて上述の有効領域γ鎖ペプチドへのKLHカッ
プルペプチドで免疫化した。２週間間隔での４回の免疫
処理後、脾臓細胞をD3−X63−Ag8U1骨髄腫細胞と融合し
た。陽性ハイブリードマクローンをスクリーニングし、
文献（48）に記載の酵素免疫検定法（EIA）により同定
した。 純化タンパク質からのδポリペプチドのDNA配列の単離 TCRδ遺伝子のDNA配列は、単離され得、また文献（4
9,50）に記載のごとくTCRβ遺伝子を単離するのに利用
される方法により決定され得る。簡単に言うと、TCRδ
遺伝子のアミノ酸配列は、以下に記載されるTCRδ遺伝
子の単離に従って決定され得る。アミノ酸配列を決定し
た後、短い合成DNA配列は、市販DNAシンセサイザー［ア
プライド・バイオシステムズ、インコーポレーテッド、
フォースター・シティー，カリフォルニイ州（Applied
Biosystems,Inc.,Foster City,CA）］を用いて調製され
る。該合成DNA配列は、TCRポリペプチド含有細胞系のcD
NAライブラリーからのDNAの完全配列の単離用プローブ
として用いられる。タンパク質の腫瘍構造は、ついで決
定される（文献51）。 δポリペプチドに対するおよびγ、δ複合体に対するモ
ノクロナール抗体の調製 δポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、標準
方法（文献47,50）により発生され得る。TCRδポリペプ
チドから誘導されるペプチドは、上述の方法により決定
された核酸配列から調製され得る。免疫処置に有効なこ
のようなペプチドを選択する方法は、詳細に記載されて
いる（文献55,56,57）。 γ，δ複合体に対して誘導されるモノクローナル抗体
は、刊行物記載方法（文献47、50）に従って調製され得
る。γ，δ複合体は、上述のＴ細胞系から単離され得、
また先の刊行物の記載の方法（文献28）に記載のごとく
BALB/cマウスを免疫化するのに用いられ得る。別に、BA
LB/cマウスは、細胞系、例えばIDP1細胞系またはIDP2細
胞系で免疫化され得る。 ハイブリドーマ細胞系の融合、発生および保守管理方
法は、広く刊行物に記載され当業者に公知である。特異
TCRγ，δ細胞系に対して誘導されるが他のＴ細胞系と
架橋反応（cross react）しないモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞は、選択され回収される。 ヒト腫瘍および末梢血リンパ球からのTCRγ，δおよびT
3の免疫沈降 生育可能なリンパ球をフィコールーハイパーク密度傾
斜遠心分離により単離し、２×107細胞を文献（28）に
記載のごとくラクトペルオキシターゼ技術によって放射
性ヨウ素標識化した。標識化細胞は、2mMフェニルメチ
ルスルフォニルフルオロイド（PMSF）および8mMヨード
アセタミド（IAA）を含有するTCR−T3会合を保護する
（文献64）0.3％３−［（３−コラミドプロピル）ジメ
チルアンモニノ］−１−プロパン−スルフォネート（CH
APS）とともに5mlのTBS（10mlトリスpH8、140mM Nac
l）に溶解された。文献（12）に記載の固定スタフィロ
コッカスアウレウス（Staphylococcus aureus）コーワ
ンＩ（Cowan I）（SACI）を用いて免疫沈降を行い、免
疫複合体を0.1％トリトンＸ−100（TX−100）含有TBS中
５度洗浄した。還元サンプルを2mMジチオスレイトール
（DTT）中煮沸し、全サンプルをSDS−PAGEによる検定の
前、10mA IAA中23℃にて10分間培養した。抗Ｃγ血清
を用いた免疫沈降は、IAAを除去するために透析された
１％TX−100溶解産物で行なわれ、ついで３分間煮沸し
ながら3mM DTT含有ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）10
分の１の容量の添加により変性された。４容量の30mM
IAA含有TBS中の1.5％TX−100による部分再生の後、抗Ｃ
γ血清またはNRSを添加し、免疫沈降物をSDS−PAGEによ
る分析の前、0.5％ TX−100、0.5％デオキシコレート
および0.05％SDS含有TBS中で洗浄した。ラット抗マウス
α鎖特異mAb187.1（15Mg）を第２抗体として加えて、Ig
GImAbβF1、UCHTおよびP3の結合タンパク質Ａを産生し
た（文献53）。 PBL C1から単離されたRNAのノーザンブロット検定 １レーンにつき約1.5MgRNAを載せ、プローブを同様な
特異活性にまで、標識化し、同一オートラジオグラフィ
暴露を与えた。RNAサイズは、TCRBおよびTCRγ転写体に
関する先に記載された長さ（文献36、４）に基づいて決
定された。 TCRγポリペプチドおよび前駆体の２次元ゲル分析 ラクトペルオキシターゼでの放射性ヨード化の後、リ
ンパ球をリン酸緩衝食塩水（PBS）1mg/mlウシ血清アル
ブミン、1mg/mlグルコース中の100Uのニューラミニター
ゼ［ジブコ（Gibco）で90分間23℃にて処置し、PBS中洗
浄し、ついで0.3％CHAPSに可溶化した。免疫沈降物を第
１図のごとく調製し、NEPHGE（電荷分離）をpH3.5〜10
アンフォリン（LKB,スウェーデン）、を用いるあるいは
pH3.5〜10,4〜6,9〜11アンフォリン（2:15.5:1.5）を用
いたIEFを用いて、つづいて文献（12）に記載のごとく
サイズ分離のため10.5％ SDS−PAGEゲルを用いて行っ
た。NEPHGEは、酸性末端にヨウ素化IFFサンプルを適用
して行われ（A,B）、一方IEFC C,D）は、40Vにて20時
間他の（塩基性）末端にサンプルを適用して行った。ブ
ラケットは、T3会合種を含む。 細胞（２×107）は、10％胎児ウシ血清で補足された4
mlメチオニン遊離RPMI1640中37℃にて１時間予備培養さ
れた。35S−メチオニンを250μCi/mlまで加え、培養を3
7℃で１時間続けた。細胞を回収、洗浄し、１％SDS、10
mMトリスHCl（pH8.0）、0.1mM PMSFおよび10mM IAAの
煮沸溶液0.4に溶解した。溶解産生物を2.5％ ノニデッ
ドP40（Nonidet−P40）、１％ゼラチン、10mlトリス−H
Cl（pH8）2mlおよび1mg/ml DNアーゼ、0.5mg/ml RNア
ーゼ、0.5Mトリス−HCl（pH7）、50mM MgCl20.2mlで希
釈し、０℃にて２〜４時間培養した。ペレット不溶性片
まで12,000×ｇで15分間遠心分離後、１％ゼラチンで予
め沈降されたタンパク質Ａセファロースを用い、ついで
洗浄し抗γ血清での免疫沈降を文献（65）に記載のごと
く行った。免疫吸収剤からの溶離およびエンド−Ｈ［ミ
レス、サンヘンティフィック、ナパービレ、イリノイ州
（Miles Scientific,Naperville,IL）］での処置は、文
献（65）に記載されている。サンプルは、第１次元にNE
PHGEおよび第２次元に10％SDS−PAGEを利用する２次元
ゲル電気泳動、ひきつづきフルオログラフィーにより抗
血清で分析した（文献66）。 TCRγポリペプチドを発現するＴ細胞におけるγおよび
βおよび遺伝子の再配列 ゲノムDNAは、記載のごとく（BamH IまたはEcoR I）
単離し、0.7％アガロース（BamH I消化）または0.9％ア
ガロース（EcoR I消化）上にサイズ分画し、ついで文献
（67）に記載のごとくくニトロセルロースに形質転換し
た。フィターをニック翻訳された32P−標識化0.8Kb Hi
nd III−EcoR I Ｊγ1,3プローブ（文献20）または1.1
Kb EcoR I−Hind III Cβ２プローブ（文献68）にハイ
ブリダイゼーションした。強化スクリーンでのオートラ
ジオグラフィーの前、フィルターを２％SSCおよび0.1％
SDS中で洗浄し、つづいて55℃で0.2％SSCおよび0.1％SD
S中で洗浄した。 IDP2およびPBL C1細胞による細胞分解 細胞溶解検定を文献（34）に記載のごとく51Cr−標識
化、回収および％特異放出の計算により丸底96ウェル組
織培養プレートにて行った。IDP2およびPBLC1細胞をUCH
T1（1:300稀釈度）（＋抗T3）で０℃にて30分間予め培
養し、３回洗浄するか、あるいは模擬培養し、標識化タ
ーゲット細胞とお互い取り代えた。抗HLAクラスＩおよ
びクラスII mAb抗T3mAbを51CR標識化MOLT4細胞含有ウェ
ルに０℃にて30分間配置し、ついでIDP2細胞を40:1のE:
T比で加えた。全サンプルを３回検定し、各実験を少な
くとも３回行った。各々の代表的実験の１つを第９図に
示す。 実験結果 多数のヒトTCRα，β６を認識するマウス基質抗血清
は、先に報告されている（文献28）。つづいてヒトβ鎖
における割り当てられた決定因子と反応性であるマウス
モノクローナル抗体、消化基質１（βF1）が得られた
（文献46）。βF1モノクローナル抗体は、多数のT3陽性
（T3+）ヒト末梢血リンパ球（PBL）と反応し、またα，
βＴ細胞レセプターを有し、かつT3糖タンパクを発現す
る試験された全ヒトＴ細胞系からのTCRα，βヘテロダ
イマーを免疫沈降できる。このモノクローナル抗体を用
いたＴ細胞系のパネルからの免疫沈降は、この反応性並
びに異なるレセプターからのTCRαおよびTCRβサブユニ
ットの異質性を示す（第１図）。基質抗血清（文献28）
と同様に、このモノクローナル抗体は、生体Ｔ細胞の表
面を染色しないが、70％エタノールでのリンパ球血漿膜
の部分解離（solution）後、膜および細胞形質Ｔ細胞レ
セプターの両者と特異的に反応するであろう。フルオレ
セイン抗T3モノクローナル抗体およびビオチニル−β−
F1モノクローナル抗体つづいてアジビンでのヒトPBLSの
２重染色は、βF1モノクローナル抗体が95〜97％の末梢
血T3+リンパ球を認識することを明らかにする。しかし
ながら、これはβF1陰性（βF1-）さらにはT3+である小
個体群のＴ細胞を明らかに限定する（第1C図）。 T3抗体を認識することが初期に考えられたW31と命令
されたされた第２基質モノクローナル抗体（文献29）
は、最近、TCRα，βの共通のエピトープと反応するこ
とが示されている（文献30）。抗T3モノクローナル抗体
（OKT・３）およびWT31での二重染色は、各該モノクロ
ーナル抗体が他の結合をクロスブロックすることを明ら
かにしたが、１色螢光は,WT31が抗T3モノクローナル抗
体がするよりも末梢血において１〜３％少ない細胞を代
表的に認識することを示した。WT31モノクローナル抗体
は、Ｔ細胞の表面に効率的に結合し（FACS分析等参
照）、また放射性標識化洗浄溶解産物からは非効率的で
あるがTCRα，βを免疫沈降できる（文献30）（第1B
図、レーン３）。従って、βF1モノクローナル抗体およ
びWT31モノクローナル抗体は、少フラクションのヒト末
梢血T3+細胞を除いて全てを認識し、またT3+であるがTC
Rα，β分子に対するこれらの基質モノクローナル抗体
の両方と未反応性である亜個体群を決定するらしい。モ
ノクローナル抗体βF1と未反応性であるT3+リンパ球も
またモノクローナル抗体WT31と未反応性であるという証
拠を以下に示す。WT31は、主にFACS分析に用いられてい
て、またβF1は主に免疫沈降研究に用いられていた。正
常成人PBLからのWT31-T3+個体群の生長に対する成果
は、WT31+T3+リンパ球がマイトジェン刺激に伴うWT31-T
3+細胞が通常生長しすぎるので困難であることが判明し
た。しかしながら、免疫不全症患者のPBLからのWT31-T3
+個体群の生長は、良好であった。免疫不全症患者１（I
DP1）は、裸リンパ球症候群（bare lympocyte syndrom
e）に病み、リンパ系細胞におけるるクラスII MHC抗原
を欠いており（文献31,32）、一方免疫不全症患者２（I
DP）は、外胚芽形成異常症候群に病み、マイトジェンに
対する少ない生体内Ｔ細胞繁殖性応答を示した。 同種抗原でのIDP1からのPBLの活性化およびインター
ロイキン−２（IL−２）活性含有条件地における繁殖
後、得られた細胞系は、約50％WT31+T3+および50％WT31
-T3+であることが観察された（下記第１表参照、細胞系
１）。ひきつづきこの細胞の選別によりWT31+T3+細胞お
よびWT31-T3+細胞の均質個体群を得た（下記第１表参
照、各々細胞系２および３）。 細胞系はまたIDP2からも得られた。IDP2からの新鮮PB
Lは、63％のPBLがT3+であり、１〜２％少ない細胞（61
％）が代表的な正常PBLであるWT31+であったことを明ら
かにした（第１表，細胞系４）。フィトヘムアグルチニ
ン（PHA）または同種抗原でのこれらIDP2PBLの活性化お
よび条件培地での生体外繁殖はいくつかの細胞系となっ
た。該細胞系としては、均質WT31+T3+細胞系（第１表、
細胞系５）、均質WT31-T3+細胞系（第１表，細胞系６）
および第３の場合、88％WT31-T3+（12％不純WT31+T3+細
胞（第１表細胞系）であった。WT31-T3+固体群は、T8+
およびT4-T8-細胞の両方を含んだ（第１表、細胞系3,6
および７）。さらにに表現型分析は、この個体群がT11+
であったがLeu7、Leu11およびOKM1等の天然キラー細胞
マーカーおよび未熟胸腺細胞マーカーT6に対しては陰性
であったことを現わした。 βF1モノクローナル抗体は、125I標識化WT31+T3+IDP1
リンパ球の表面上のヘテロダーマー構造を免疫化学的に
決定したが（第2A図、レーン５）、この同一個体からの
WT31-T3+個体群上の同様なタンパク質を確認できなかっ
た（第2B図、レーン11）。IDP2細胞系の同様な分析は、
WT31+T3+細胞での12％染色と一致する88％WT31-T3+細胞
系７上のTCRα，βのトレースを表わした（第2B図、レ
ーン２）。従って、FACS分析におけるWT31-T3+モノクロ
ーナル抗体との細胞表面反応性の欠乏によって、同定さ
れたWT31-T3+細胞はまた、免疫沈降においてTCRα，β
の欠乏によって決定されたとおりβF1-であった。全WT3
1+T3+およびWT31-T3+細胞系は、FACS分での免疫沈降に
より同様な量のT3を発現した（第2A図レーン３および9;
第2C図、レーン２および４）。しかしながら、WT31-βF
1-T3+リンパ球に見い出されたT3分子は、SDS−PAGEによ
りWT31+βF1+T3+細胞に見い出されたT3分子とは同一で
なかった。１次元（第2C図）および２次元ゲル分析は、
T3の相異が異なるSDS−PAGE移動度を再限的に示したラ
イトT3サブユニットに制限されたことを示した（第2C
図、矢印）。 WT31-βF1-T3+個体群がTCRα，β分子を欠いたか、ま
たは別に、これらのモノクローナル抗体と反応しそこな
ったTCRα，βを発現したかどうかを決定するために、T
CRαおよびβタンパク質をコード化するmRNAの存在が研
究された。TCRα，βおよびTCRγをコード化する32P標
識化cDNAクローンは、WT31-βF1-T3+およびWT31+βF1+T
3+IDP2細胞系からのおよびTCRα,TCRβおよびTCRγに対
するnRNAを含有することが知られたHPB−MLTからの全細
胞RNAを含有するノーザンブロットを詳しく調べるのに
用いられた。TCRαまたはTCRβ、mRAN転写体は、WT31-
βF1-T3+IDP2細胞系６からのRNAにおいては検出できな
かったが（第3A図α−プローブ、レーン1;またはβ−プ
ローブ，レーン１）、両者の発現は、HPB−MLTからのRN
Aにおいて明らかに検出可能であった（第３図、α−プ
ローブ、レーン2;およびβ−プローブ、レーン２）。明
らかに、TCRγmRNAは、HPB−MLTにおけるレベルに匹敵
するレベルでWT31-T3+細胞に存在した（第３図，γ−プ
ローブ，レーン１および２）。従って、WT31-βF1-T3+
リンパ球は、TCRαおよびβmRNAを欠いた。ほとんどWT3
1-T3+である細胞系に対する次の実験は、これらの結果
を確認した。例えば、IDP2細胞系７（88％WT31-T3+）に
対して行なわれ、IDP2細胞系５（WT31+T3+）並びにHPB
−MLT細胞と比較されたノーザンブロット分析は、ほん
のトレースの85％WT31-T3+細胞（12％WT31-T3+細胞での
汚染と一致する）におけるTCRαまたはTCRβmRNAを現わ
した（第3B図、各プローブに対するレーン２）。さらに
検出できた多数のβ転写体は、1.0であり1.3Kbでなくま
たおそらく機能的でなかった（文献35）。これに対し
て、IDP2細胞系５（WT31+T3+）は、HBP−MLTに匹敵する
RNA種の両方のレベルを発現した（第3B図、各プローブ
に対するレーン）。しかしながら、第3A図に示すWT31-T
3+細胞系と同様に、WT31-T3+およびWT31+T3+細胞系の両
者は、HLB−MLTに匹敵するTCRγRNAレベルを示した。従
って、WT31-T3+細胞は、αおよびβＴ細胞レセプターmR
NA（ノーザンブロット検定）およびαおよびβＴ細胞レ
セプタータンパク質（免疫沈降およびFACS分析）を欠い
た。Ｔαタンパク質発現に一致するが、WT31-T3+におけ
るＴγmRNAの存在は、正常サイズのＴγmRNAを発現する
多くのヒト細胞系が不完全Ｖ−Ｊ結合のため構造外であ
る十分な長さの転写体を発現し得るので（文献36）、強
力な証拠とならなかった。 TCRα，β分子に類似するタンパク質がWT31-βF1-T3+
細胞上に存在するかどうかを決定するために、化学的架
橋技術が利用された。この方法は、T3糖タンパク質との
TCRα，β分子の物理的会合を直接示すのに用いられて
いる（文献12）。２官能性、分割性指示薬、ジチオビス
サクシミジルプロピオネート（DSP）が、生育可能Ｔリ
ンパ球の125I標識化表面タンパク質を架橋するのに利用
された。架橋後、リンパ球は、非イオン性洗浄剤に可溶
化され、抗T3モノクローナル抗体で免疫沈降された。期
待されたとおり、WT31+βF1+T3+リンパ球は、TCRαおよ
びβ鎖がT3と架橋されたことを表わした。例えば、TCR
α，β分子およびT3は、架橋IDP1細胞系２（WT31+T3+）
からの抗T3またはβF1モノクローナル抗体中に見い出さ
れた。（第2A図、レーン４および６）。しかしながら、
βF1モノクローナル抗体との反応性の欠如およびTCRα
またはTCRβmRNAの欠如にもかかわらず、IDP1細胞系３
（WT31-T3+）およびIDP2細胞系７（88％WT31-T3+）は、
T3と特異的に架橋した２つのタンパク質（Mr55,000およ
び40,000）を両方とも発現した（第2A図，レーン10;第2
B図，レーン６）。これらT3会合分子の移動度は、WT31+
T3+細胞系からのTCRαおよびβ鎖からのものと明らかに
異なった（第2A図、レーン４および10;または第2B図レ
ーン５および６と比較対照）。 IDP2細胞系７（88％WT31-T3+）が（第2B図、レーン
２）に示された弱いβF1免疫沈降物を示す12％のWT31+T
3+を含有したので、これらの細胞からの溶解産物は、β
F1モノクローナル抗体を用いてTCRα，βタンパク質を
予め除いた。予め除いた後、残基βF1反応性物質は、検
出されなかった（第2B図、レーン８および11）。架橋細
胞からの溶解産物を予め除かれたβF1-は、抗T3モノク
ローナル抗体で免疫沈降され、Mr55,000および40,00サ
ブユニットがさらに検出された（第2B図、レーン12）。 これらの細胞溶解産物が検出可能レベルのTCRαおよ
びTCRβmRNAを示すので、該細胞表面においてT3と特異
的に架橋されたことが見い出された分子は、既知TCRα
またはTCRβ遺伝子によってコード化されたタンパク質
を与えることができない。 再配列ヒトTCRγ遺伝式を表わすcDNAクローンは、予
想分子量40,000ダルトンでポリペプチドをコード化する
であろう（文献36）。しかしながら、Ｎ結合グルコシル
化部位を表わさないマウスTCRγ遺伝子（文献15）とは
異なって、ヒトTCRγ遺伝子は、Ｎ結合グリコシル化に
対する５つの部位を表わす。すなわち、そのうち４つ
は、一定領域に位置する（文献36）。TCRγタンパク質
は、今まで単離されていないので、これらの可能部位の
いくつが利用され得るかは、わからない。しかしなが
ら、十分にグリコシル化されたヒトTCRγタンパク質
は、Mr約55,000を有し得る。WT31-βF1-T3+IDP1およびI
DP2細胞系上同定された非α−非βT3会合サブユニット
の重鎖は、55,000ダルトンのSDSPAGEにおける相体移動
度を示す（第2A図および第2B図）。 このT3会合重鎖が血清学的にTCRαタンパク質と架橋
またはTCRγタンパク質と同一であるかどうかを決定す
るために、抗血清にヒトcDNAクローンから推定されたTC
Rγアミノ酸配列（文献36）の配列： RTKSVTRQTGSSAEITC （有効領域からの残基５〜12の17アミノ酸範囲を示
す；抗Ｖγペプチド血清）を有する合成ペプチドおよび
配列： DKQLDADVSPKPTIFLDSIA （一定領域からの残基117〜136の20アミノ酸範囲を示
す；抗Ｃγペプチド血清）を有する合成ペプチドを与え
る。抗Ｃγペプチド血清および抗Ｖγペプチド血清の両
者は、125I−標識化されたWT31-βF1-T3+細胞の変性溶
解産物からMr55,000の分子を免疫沈降した（第4A図、レ
ーン２および４）。該分子は、非機能的TCRγmRNAのみ
を発現する125I標識化HPB−MLT細胞の溶解産物から免疫
沈降されなかった（文献36）。 抗ＣγおよびおよびＶγペプチド血清によって免疫沈
降された55,000ダルトン分子が実際にT3に架橋された重
鎖サブユニットであることを示すために、補足的実験を
行った（第4B図）。WT31-βF1-T3+細胞からのDSP架橋溶
解産物のサンプルを最初に抗T3モノクローナルで免疫沈
降し、再びT3と会合されたMr55,000および40,000サブユ
ニットの存在を示した（第4B図、レーン２）。平行し
て、架橋溶解産生物の別のアリコートを抗T3モノクロー
ナル抗体で免疫沈降し、ついで免疫沈降T3架橋ポリペプ
チドをDSP架橋を切断するために変成および還元条件下
免疫吸収剤からら溶離した。この溶離物をついで抗Ｃγ
ペプチド血清と再び沈降した。T3と架橋したMr55,000サ
ブユニットを抗γペプチド血清により再び沈降し（第4B
図、レーン５）、これらの２つのアプローチにより特定
されたMr55,000サブユニットが同一であることを示し
た。 抗T3mAbを用いた（T3からのTCRサブユニットが解離し
ない条件で、第５図参照）表面ヨウ素化IDP2リンパ球の
溶解産物からの免疫沈降は、T3サブユニット（第5A図）
に加えて２つの種（55Kおよび40K）をもたらした。この
結果は、化学的架橋を用いた先に報告されたものと一致
した。55K種は、抗Ｃγおよび抗Ｖγペプチド血清と特
異的に反応することが見い出された。40Kポリペプチド
は、該抗γペプチド血清と反応性がなく、従って非TCR
α，βまたはγサブユニット、すなわちδを表わすよう
である。これらのサブユニットがTCRαおよびβサブユ
ニットのように共有結合されているかどうかを決定する
ためにT3免疫共沈ポリペプチドを還元および非還元下、
調べた。非還元条件下ヘテロダイマージスルフィド結合
形態にて存在するTCRα，βサブユニットと明らかに対
照して、IDP2細胞系上のTCRγおよびδサブユニット
は、共有結合されいなかった（第5A図）。非還元条件下
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）におけ
る相対移動の少しの増加が拡散、重グリコシル化（下記
参照）TCRγに関して観察されたのに対して、移動度の
劇的な増加がδサブユニットに関して観察され、これは
１以上の内部鎖ジスルフィドループの存在を提唱する
（レーン２および４の矢印における種参照）。 ウェイスら（Weiss,et al）は、PEER細胞系がTCRγmR
NAの発現を欠くがT3−会合50〜60Kポリペプチドを発現
できるので、TCRγポリペプチドを発現できることを提
案した（文献69）。さらなる実験において、この細胞系
は、TCRβ鎖、βF1上の基質決定因子を認識するmAbとの
反応性に欠け（第5A図）、また強くヨウ素化された38K
ポリペプチドを発現することが見い出された。55K〜60K
ポリペブチドは、抗Ｃγペプチド血清と特異的に免疫沈
降され、従ってTCRγタンパク質の別の例を示すようだ
（第5A図）。PEER上のTCRγおよびδポリペプチドは、I
DP2細胞系上のものと同様なサイズであり、同様にジス
ルフィド結合されていない。IDP2細胞上のδサブユニッ
トと同様に、PEER上の複製分子は、還元および非還元条
件下比較された際（レーン７および８の矢印における種
比較対照）、SDS−PEGE移動度において著しいシフトを
受けた。従って、IDP2およびPEER細胞系は、同様のタイ
プのTCRγおよびδサブユニットが共有結合されていな
いTCRγ，δT3複合体を発現するらしい。 本発明者らは、この第２抗体もまた正常末梢血におけ
るＴ細胞個体群の成分として発現するかどうかを決定し
ようとした。mAbβF1およびOKT ３でのヒト末梢血リン
パ球（PBL）の染色を比較する２色サイトフルオログラ
フ分析は、TCRα、β陰性であるらしい２〜５％のT3+PB
Lを示す分離個体群を示した。このリンパ球個体群を検
査するために、正常成人PBLをmABWT31での染色後、サイ
トフルオログラフ細胞選別した。未染色PBLを単離し、
放射性化自系飼育細胞およびフィトヘムアグルチニン
（PHA−Ｐ）の添加を２週間受けるIL−２含有条件培地
中生体外培養した。細胞系誘導WT31-PBL-系を0.5細胞ウ
ェルでプレートすることでの希釈を制限することによっ
てクローンし、クローン細胞をポリクローナル細胞系と
して培養した。いくつかのこのような末梢血誘導Ｔ細胞
クローンが得られ、PBLクローン１（PBL C1）を詳細に
研究した。サイトフルオログラフ分析により、このクロ
ーンは、T3+T11-であったが、T4-T8-およびWT31-でなか
った。PBL C1からのTCRα，βおよびγmRNAの発現は、
ノーザンブロット分析により決定された（第６図）。WT
31+βF1+T細胞腫瘍HPB−MLTと比較すると、ほんの低レ
ベルのTCRαおよびβmRNAが検出された。これに対し
て、豊富なTCRγmRNAが示され（第６図、γプロー
ブ）；興味深いことに、TCRγmRNAは、HPB−MLTにおよ
びTCRγ発現IDP2細胞系に見い出された1.6キロベース
（Kb）メッセージよりわずかに少なかった（第６図）。
これらの観察と一致して、WT31反応性は、サイトフルオ
ログラフ分析において検出されず（データ示さず）、ま
たほんの限られたレベルのTCRαおよびβポリペプチド
がmAbβF1を用いた免疫沈降により見い出された（第5B
図、レーン2,5）。これに対して、PBLC1において検出さ
れるトレースレベルのTCRαおよびβタンパク質は、こ
のクローンの培養に用いられる放射化自系飼育細胞での
１〜２％染色によって説明される。２つの豊富な鎖（40
Kおよび36K）は、SDS−PAGE分析において還元条件下T3
と会合されることが観察された（第5B図、レーン３）、
抗Ｃγ血清は、還元および変性PBLC1溶解産物からこれ
らのポリペプチドの両方を免疫沈降した（第5B図、レー
ン８）。 これら40Kおよび36KTCRγポリペプチドがジスルフィ
ド結合ダイマーの一部かどうかを決定するために、抗T3
との免疫共沈が非還元条件下行われた。Mr（70K）の単
一バンドが観察され、これは、IDP2およびPEER細胞と異
なり、PBLC1がジスルフィド結合ダイマー性複合体の部
分であるT3会合TCRγ遺伝子産生物を発現することを示
す。 TCRγパートナー（δ）は、IDP2およびPEER細胞上の
このレセプター複合体は非ジスルフィド結合形態得に存
在したので、本発明物らは、PBLC1上のレセプターのジ
スルフィド結合形態がホモまたはヘテロダイマーからな
るかどうかを検査した。免疫沈降物は、２次元ゲル電気
泳動（非平衡pHゲル電気泳動（NEPHGE）につづいてSDS
−PAGE;第7A図、第7B図）により検定された。還元条件
下、両方のTCRγ種（40Kおよび36K）は、同一帯電量を
有することが見い出され、またシアリル化糖タンパクに
関して代表的な不均質性を示した。これらの特徴は、同
一アミノ酸骨組みを有するTCRγペプチドの特異的にグ
ルコシル化された形態に関して先に記載されたもの同様
である。従って、これらの種は、同一TCRγペプチドの
特異的にグリコシル化された形態を示すであろう。この
結果は、PBLC1において単一前駆体のみを現わす代謝性
パレス標識の結果（下記）によって支持される。 これらのTCRγ種の１つおよび両方からなるジスルフ
ィド結合ダイマーは、NEPHGEまたは平衡等電点電気泳動
（IEF）により分析された際、２つの成分のいずれか一
つのみと同様な電気泳動位置を有するべきである。しか
しTCRγからなるヘテロダイマーおよび個々のポリペプ
チドは、異なる帯電量および電気泳動位置を有するかも
しれない。ジスルフィド結合ダイマーの位置は、それ
故、非還元条件下NEPHGEを行い、つづいて非還元条件下
SDS−PAGEを行うことによって検査された（第7B図）。
著しく、ジスルフィド結合ダイマーの位置は、還元条件
下検査されたTCRγポリペプチドのものより実質的によ
り酸性であった（第7A図における40Kおよび36K種を第7B
図における70K種と比較参照のこと）。この結果は、TCR
γ種が別個のNEPHGE移動度のポリペプチドに共有結合さ
れたことを提案する。従って、TCRγパートナーが（125
Iで不十分に標識化されたかあるはここに用いられる電
気泳動系において分解されなかったかのいずれかのた
め）直接可視化され得なかったけれど、PBLC1上のTCRγ
ポリペプチドは、ジスルフィドヘテロダイマーの一部と
して発現されたらしい。平衡IEF（NEPHGEよりむしろ）
を用いた実験は、この観察を確認した（第3D図）。 ジスルフィド結合と非結合形態とのさらなる識別は、
成熟TCRγ糖タンパクのサイズであった（IDP2およびPEE
R上の50〜60K対PBLC1上の36K）。このラジカルサイズ相
異のいくつが特異グリコシレーションによるのかおよび
いくつが異なるペプチド骨組みによるのか評価するため
に、TCRγペプチドは、35S−メチオニンでパルス標識化
された細胞において分析された。還元条件下および変性
条件下における可溶化の後、溶解産物は、抗Ｃγ血清で
免疫沈降され、そし２次元ゲル電気泳動により検査され
た（第7E〜Ｈ図）。免疫沈降物は、パルス標識化物質よ
り未熟高マンノースグリカン類を除くためエンドグリコ
シダーゼＨ（endo−Ｈ）で処置されるかまたは模擬処置
された。同一NEPHGE移動度のTCRγポリペプチド（48Kお
よび43K）は、IDP2細胞系により合成された。エンド−
Ｈでの処置は、40K形態まで両形態を減じ、これは、46K
および43K形態が、異なる数の炭水化物を運び、また単
一TCRγポリペプチド骨組み（40K）が、IDP2によって合
成されることを提案する（第7E、7E図）。これに対し
て、より塩基性の38Kグリコシル化形態は、エンド−Ｈ
消化が非ギリコシル化31K骨組みを示した後、PBLC1によ
って合成される（第7G,H図）。従って、本明細書に特徴
ずけられた非ジスルフィド結合（IDP2）およびジスルフ
ィド結合PBLC1）形態上のTCRγポリペプチドは、ラジカ
ル的に相異する骨組みサイズを示す（各々、40Kおよび3
1K）。パルス標識することにより観察されるTCRγペプ
チドが細胞表面ヨウ素化により見い出されるものと相異
する分子量のものであるという事実は、これらの運ぶ相
異する炭水化物すなわち高マンノース対複合体から生じ
る。 本発明者らは、ついでジスルフィド結合および非共有
結合の両者が正常成人末梢血に生ずるかどうかを決定し
ようとした。それ故、PBLC1がクローンされたポリクロ
ーナル末梢血細胞系（WT31-PBL系）を非常に詳細に研究
した。WT31-PBL系は、均質にT3+T11+であり５％汚染WT3
1+細胞とともに95％WT31-T4-T8-を含有した。ヨウ素化
可溶化細胞からの免疫沈降により検査した際、弱いが検
出可能なmAbβＦとの反応性が期待された５％TCRα、β
陽性リンパ球と一致して観察された（第5B図、レーン10
還元および13非還元）。これに対して、抗T3mAbは、還
元条件下多量のT3および35〜45Kの会合ポリペプチドの
両者を免疫沈降した（第5B図、レーン11）。これらの分
画のなにがジスルフィド結合したのかを決定するため
に、T3免疫沈降物が非還元条件下検査された（第5B図、
レーン14）。T3会合ポリペプチドの半分未満がジスルフ
ィド結合された。この物質は、レーン14の白抜き矢印の
上に位置されたジスルフィド結合α，βペプチド（サイ
ズは、βF1沈降物により同定された、レーン13）および
より小さいサイズのジスルフィド結合TCRγ（白抜き矢
印，レーン14）を含有した。著しく、多数のT3会合種
は、ジスルフィド結合されず、還元および非還元の両方
の条件下、同一移動度で移動された。特に、これら非結
合種の分画は、IDP2およびPEER細胞上のTCRδと同様にS
DS−PAGE移動度の著しい増加を示した（第5B図、レーン
14、黒塗り矢印参照）。抗Ｃγ血清との反応性は、WT31
-PBL系上に発現されたT3と会合された標識化物質のほと
んどがTCRγ遺伝子産生物であることを確認した（レー
ン16）。 従って、TCRγ遺伝子のタンパク質産生物は、ジスル
フイド結合および未結合分子形態の両方で成人末梢血に
おけるT3+リンパ球上に生じた。また、TCRγの非ジスル
フィド結合形態は、55〜60Kグリコシル化（IDP2およびP
EER）または35〜45グルコシル化（胸腺Ｔ細胞クローンC
11（文献70）およびWT31-PBL系）種にさらに分割され得
る。 TCRγおよびβ遺伝子再配列は、その細胞表面上にTCR
γポリペプチドを発現することが知られているＴ細胞に
おいて検査された。サザンブロッド分析は、0.8Kb Eco
R I−Hind IIIヒトＪγ1,3プローブ［クェアーターモス
ら（Quertermous et al.）（文献71）による学名］を用
いて行なわれた。このプローブは、ゲノムDNAのBamH I
消火物における23Kbおよび12Kbの胚子系（germline）バ
ンドを検出する。23Kbバンドは、Cr1を包含し、12Kbバ
ンドは、Cr2をコード化する。このプローブを用いてIDP
1,PBLC1およびPBLC2（WT31-PBL系から誘導されたもの
も）、TCRγ遺伝子の再配列を示した（PBLC1およびPBLC
2の両者、同一再配列を示した；第8A図）。 サザンブロット分析におけるＪγ1,3プローおよびEco
R I消化ゲノムDNAを用いてPBLにおける７つの再配列が
検出されている（文献20）。これら７つの再配列のうち
６（I,II,III,IV,VIIおよびＶ）をPBL胎児胸腺および新
生児胸腺ゲノムDNAに示した（第8B図；矢印および再配
列番号参照）。４つの再配列（I,II,IV,およびVII）
は、TCRγポリペプチドを発現する末梢血リンパ球によ
って用いられないかまたはこれを示す細胞はWT31−PBL
系に用いられる培養条件下に失われた。それにもかかわ
らず、WT31-PBL系DNAは、少なくともこれらの再配列の
うち３つ（III,IVおよびVI）を現わし（第8B図、レーン
３）、またこれら同一再配列は、IDP2、PBLC1およびPBL
C2によって用いられ（EcoR I消化物に関してデータを示
さず）、またこれらの再配列の全てを胎児胸腺に示し
た。 TCRβもまた、IDP2、PBLC1およびPBLC2細胞において
再配列した。1.1KbEcoR I−Hind III Cβ２プローブ
は、ゲノムDNAのBam I消化物におけるＣβ一定領域の両
方を包含する20Kbの胚系バンドを検出する（文献68）。
IDP2に関する１つの優位なTCRβ再配列およびPBLC1およ
びPBLC2に関する２つの同一な再配列が観察された（第8
C図）。これは、TCRβ再配列がこれらの細胞系に関する
免疫沈降ならびにノーザンブロット分析に基づいて非保
護的であることが推定される。PBLC1およびPBLC2の両者
が同一のTCRαおよびβ再配列を有するので、これらは
クローン性でありまたWT31-PBL系内の同一細胞から誘導
されるらしい。 TCRγ発現細胞が成人抹消血に見い出されたので、機
能的研究を行いこれがエフェクター能を有するかどうか
を決定した。IDP2およびPBLC1がその51Cr放出検定にお
いてターゲット細胞を溶解する能力に関して検査された
際、これらが自発性エフェクター細胞毒能力を有するこ
とを証明した（第９図）。IDP2細胞は、多数の天然キラ
ー（NK）ターゲットまたは同種系PBLのPHA芽細胞を溶解
しないが、これらは、51Cr標識化MOLT−４細胞を選択的
に溶解することができた（第9A図上部）。６つの同様な
検定のうち２つにおいて、K562ターゲットの弱い溶解
（10〜15％51Cr放出）もまた観察された。MOLT−４細胞
の溶解は、本発明者らがこれらmAbがMHCクラスＩおよび
クラスII同種特異性CTLにより殺生を閉塞することを先
に見い出したが［文献（34）］、単系性クラスＩ（W6/3
2抗HLA−A,B,C,4Eおよび131）またはクラスII（LB3.1お
よび抗Lev10）決定因子に対して導かれる種々のmAbによ
って禁止されなかった（第9B図）。これらのデータは、
MOLT−４細胞の溶解がMHCクラスＩおよびIIが独自であ
ることを提唱する。抗T3mAbのみがMOLT−４細胞の特異
性溶解を部分的にブロックした（第9B図）。一方抗T3mA
bのIDP2への予備結合によって誘発した際、胸腺誘導C I
I7に関して先に報告されているとおりIgGに関するFcレ
セプターを発現する51Cr標識化ターゲット細胞（例え
ば、U937）は、効率的に溶解された（第9A図、＋抗T
3）。このような殺生は、凝集ヒトIgGによって完全に禁
止でき、このことはこのT3−媒介溶解がIgGFcレセプタ
ーを経て増強された接合形態により生じたことを確認し
た（データ示さず）。いくつかのターゲット（U937）に
関する抗T3mAbによる溶解の逆接的増量および特異的に
認識されたターゲット（MOLT−４）に関する溶解のブロ
ックは、誘発の競合効果およびT3を介する接合形態の増
加から生じるがTCRを介する立体的ブロック抗原認識に
よるものではない。 PBLC1は、IDP2よりより効率的キラー細胞であること
を立証した。PBLC1は、エフェクター；ターゲット比
（E:T）20:1で検査された際、K562（MHCクラスＩおよび
II陰性）に対して自動性細胞溶解性活性を示した（第9C
図上部）。さらに、PBLはまた、MOLT細胞およびより少
ない範囲でCEM細胞を溶解した。ダウティ（Daudi）、U9
37または同種系または同種異系PBLのいずれの溶解も検
出されなかった。抗T3mAbでの誘発は、PBLC1を誘導し、
U937細胞系を溶解した。さらに、K562の溶解がわずかに
増大されたがMOLT−４の溶解は部分的に禁止された（第
9C図）。合わせると、K562およびMOLT−４等の腫瘍ター
ゲット上のIDP2およびPBLC1の自発性細胞溶解活性およ
びこれらのTCRγリンパ球が非MHCクラスＩおよびクラス
IIであることを示すMHCmAbによる該活性をブロックする
ことの失敗は、細胞毒Ｔリンパ球を制限した。 検討 TCRα、β分子に対する基質抗体、βF1およびWT31
は、２例の免疫不全症患者の未梢血リンパ球からWT31-
βFI-3+リンパ球個体群を固定し、単離するのに用いら
れた。基質モノクローナル抗体での免疫沈降およびTCR
αおよびTCRβ特異性CDNAプローブを用いるノーザンブ
ロット検定の両方の診断基準によって、この表現型のポ
リクローナルヒトＴ細胞系は、TCRα、βmRNA転写体お
よびポリペブチドのいずれも発現しないことが示され
た。とはいっても、解裂性DSP指示薬を用いた化学的架
橋の研究は、これらの細胞上のT3糖タンパク質と会合さ
れたタンパク質複合体の存在を表わした。T3と架橋した
２つのサブユニットの重い方（Mr55,000）は、２つの異
なる抗血清、すなわち一方は、有効領域の部分に相当す
る17アミノ酸合成ペプチドに対して発生し、他方は再配
列TCRγ遺伝子の推定アミノ酸配列の一定領域の一部分
に相当する20アミノ酸合成ペプチドに対して発生する抗
血清によっても免疫沈降された（文献19,36）。従っ
て、Mr55,000タンパク質は、TCRγ遺伝子を再配列する
ことによってコード化されたTCRγタンパク質であった
（文献15）。Mr40,000ポリペプチドは、1/4T3会合タン
パク質消化TCRσである（第2A図および第2B図）。TCRγ
およびδポリペプチドは、前述のＴ細胞レセプター複合
体（TCRα、β）に類似したこれらの細胞（Ｔγ、δ−T
3）上のT3会合ヘテロダイマー性構造を形成する。 本明細書で検査されたTCRγリンパ球は、非MHC制限細
胞溶解合活性を示し、またＴ細胞レセプターが明確に特
徴づけられていない他のT3+NK様細胞と同様であり得る
（文献39、72、73、74）。NK様リンパ球として、これら
は、悪性腫に対する宿主免疫監視において関与し得る。
観察された溶解の特異性は、TCRγの可能性が全てでは
ないがいくつかの抗体特異性認識を媒介したことを提唱
する。抗T3mAbがいくつかのターゲット細胞の非特異性
溶解を誘発できたので、または別に他のターゲットの特
異性溶解をブロックできたので、これらの細胞上のT3分
子は、機能的であるようだ。 実施例２ 物質および方法 培養方法 前述のPEER細胞系をRPMI 1640、10％胎児ウシ血清、
ペニシリン−ストレプトマイシン（Penicillin−strept
omyin）、およびＬ−グルタミンからなる培地中生体外
培養した。培養株は、週に２度飼育され５％CO2で湿さ
れたインキュベータ中37℃で保持された。 TCRγ鎖に対して特異なモノクローナル抗体に関するハ
イプリドーマ産生 BALB/cマウスを0.2mlリン酸緩衝食塩水（PBS）に懸濁
された２×107PEER細胞で腹腔内（I.P）免疫化された。
マウスを全20接種に対して２×107PEER細胞での10日ご
とのI.P.接種により補助注射した。融合前３日、マウス
を３日連続静脈（I.V.）接種のため２×107PEER細胞で
のI.V.接種により補助接種した。マウスを殺し、脾臓を
最終I.V.接種時除いた。免疫脾臓細胞を標準方法により
マウス骨髄腫細胞P3×63Ag8.653でポリエチレングリコ
ール1500の存在下5:1比で融合した。融合後、細胞をヒ
ポキサンチン（１×10-4）、アミノプテリン（８×10-8
M）およびチミジン（1.6×10-5M）含有培養培地中に懸
濁し、飼育細胞として２×105BALB/c胸腺細胞を含有す
るマイクロタイタープレートに１ウェルにつき２×10-5
細胞でプレートした。培養株を、７日において同一培地
で飼育した。開始14日、培養株をアミノプテリンを欠く
同一培地で飼育した。 TCRγ鎖に特異なモノクローナル抗体に関するハイブリ
ドーマスクリーニング PEER細胞上のＴ細胞抗原レセプターのγおよびσ鎖の
両者がCD3抗原と複合されるので、Ｔ細胞抗原レセプタ
ーに対する抗体は、OKT ３等の抗CD3モノクローナル抗
体とこれら表面タンパク質と共転形し得るべきである
（文献２）。このような共転形は、次のとおり所望のハ
イブリドーマの主要スクリーニングとして利用された。
ハイブリドーマ培養上澄液の各々を生育させ、その抗CD
3モノクローナル抗体と表面CD3タンパク質複合体を共転
形する能力に関してスクリーニングした。100マイクロ
力価の培養上澄液を１ウェルにつき５×105PEER細胞含
有96ウェルマイクロ力価プレートの各ウェルに加えた。
37℃での一晩の培養後、フルオレセインイソチオシアネ
ート接合OKT ３を各ウェルに加え、さらに０℃で30分
間培養した。サンプルをついで流動細胞計測法で分析し
た。蛍光強度の著しい減少を誘いた上澄液を選択し、さ
らに以下に記載する免疫沈降法により特徴づけした。抗
ヒトＴ細胞抗体レセプタータンパク質を分泌した選択ウ
ェルにおける細胞をついで制限希釈度法によりクローン
した。 免疫沈降 PEER細胞は、125Iで放射性標識化され、上述の１％ノ
ニデットＰ−40含有トリス緩衝食塩水（TBS）中に可溶
化した。免疫沈降は、還元条件下各選択上澄液での125I
標識化PEER細胞溶解産物を培養することにより実施され
た。免疫沈降後、サンプルは、10％ドデシル硫酸ナトリ
ウウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAG
E）により分析された。ゲルを乾燥し、オートラジオグ
ラフ化し、そしてタンパク質の分子量を分子量標準との
比較により決定した（文献75）。 TCRδ鎖に特異なモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマの産生およびスクリーニング モノクローナル抗体は、BALB/cマウスをピーPEERから
の免疫沈降TCRγ、σCD3で免疫化することにより作成さ
れた。簡単に言うと、文献（46）に記載された方法と同
様に１グラムのピーア細胞を0.3％CHAPSに可溶化しつい
で５マイクロタイターのUCHT1腹水と固定スタフィロコ
ッカスアウレアスコウンＩ（Staphylococcus aureas Co
wn I）株で免疫沈降した。洗浄免疫複合体を全５回の免
疫化に関して４週間間隔で腹腔内接種した（文献46）。
マウスをついで殺し、脾臓細胞をP3×63Ag8.653胸腺細
胞に融合した。ハイブリドーマをHAT選択において生長
させ125I標識化PEER細胞および文献（75）に記載の他の
細胞に対してスクリーニングおよび特徴づけした。 結果 第10図、レーン４に示すとおり、ハイブリドーマ34D1
2上澄液（Supernate）における抗体は、PEER細胞のヨウ
素標識化溶解産物から還元条件下55dタンパク質および2
0Kdタンパク質を免疫沈降した。この55Kdタンパク質
は、Ｔ細胞抗原レセプターのγ鎖およびPEER細胞上のT3
タンパク質の20Kdタンパク質に相当する。 別個の実験において、Ｔ細胞抗原レセプターδ鎖に対
するモノクローナル抗体、すなわち4A1は、産生されか
つ特徴づれられた。第11図、レーン５に示すとおり、4A
1は、IDP2細胞からのＴ細胞抗原レセプターδ鎖（40K
d）を再免疫沈降した（文献75）。4A1はまた、IDP2、Mo
lt−13およびPBL系２等のいくつかの他のＴ細胞抗原レ
セプターγ、δ陽性細胞系からＴ細胞抗原レセプター
γ、δ複合体を免疫沈降することが示されている。
ビア数字にて参照する。 該参考文献に関する全引用文を本明細書の最後、請求
の範囲の直前に記載する。 該刊行物の全体の開示をここに本発明が関連する技術
分野をより十分に記載するために本出願に関連技術とし
て取り入れる。 抗原のＴ細胞認識および主要組織適合性複合体（MH
C）コード化抗原によるプロセスの制限を理解すること
は、免疫学における重要な目標となっている。主要段階
は、Ｔ細胞抗原レセプター（TCR）αおよびβと命名さ
れるサブユニットからなるＴ細胞上のクローン特異性ジ
スルフィド結合ヘテロダイマーの免疫化学的同定ととも
に進められている。TCRαおよびβサブユニットは、相
対分子質量（Mr）約50,000および40,000ダルトンを有す
る、各々文献（1,2,3）。Ｔ細胞個体発生時に再配列し
かつTCRβ、文献（4,5）、およびTCRα、文献（6,7,8）
サブユニットをコード化する遺伝子は、サブトラクティ
ブハイブリダイゼーションまたはオリゴヌクレオチドで
の精査（probing）のいずれかにより単離された。 ヒトTCRα，βの独特の特徴は、共転形（comodulatio
n）、文献（２）、免疫共沈（coimmunoprecipitatio
n）、文献（9,10）により観察され、またTCRα，β分子
のT3糖タンパクとのコエクスプレッション（coexpressi
on）を必要とし、文献（11）、該２つの構造が関連した
ことが提案された。続いて、２つのタンパク質複合体の
直接物理的会合がTCRα，β分子をT3糖タンパクに化学
的に架橋し、架橋複合体の成分をTCRβサブユニットお
よびT3糖タンパク（Mr 28,000）として同定することに
よって示された、文献（12）。T3複製は、同様にマウス
TCRα，βと会合される、文献（13,14）。 TCRγと命名されるＴ細胞において再配列する第３遺
伝子は、マウス、文献（15,16,17）およびヒト、文献
（18,19）において同定されている。しかしながら、そ
の遺伝子構造に関してヒトおよびマウスTCRγ遺伝子の
間の主要な相違がある。すなわち、例えば、ヒトTCRγ
遺伝子のcDNAは、TCRγ遺伝子産生物におけるＮ結合グ
リコシル化に関する５つの可能部位を示し、マウスTCR
γ遺伝子における該部位の実質的不存在と対照的であ
る。従って、ヒトTCRγ遺伝子産生物は、遺伝子配列か
ら予想不能な高分子量を有する。 TCRγ遺伝子再配列は、サプレッサー細胞毒でリンパ
球において並びにヘルパー表現型でリンパ球において生
じ、また多数のTCRγ鎖を産生し得る、文献（18,19,20,
21,22,23）。しかしながら、TCRγ遺伝子の機能は、未
知である。さらに、TCRγによりコード化されたタンパ
ク質および他の構造とのその可能な会合（TCRα，βお
よびT3糖タンパクで生じる際の）のいずれも明らかにさ
れていない。ヒトにおいて、多数の糖タンパク質のため
正確にTCRγポリペプチド構造の性質および寸法を予想
するのは、不可能である。加えて、発行された文献は、
ヒト疾病を診断し、監視しまたは段階づけ（staging）
することに関してTCRγの有効性を教示または示唆して
いない。 TCRα，β分子のみが少なくともいくつかのＴ細胞上
における抗原認識とMHC制限との両方を決定することは
いよいよ実現しそうである、文献（24,25）。しかしな
がら、TCRα，βＴが細胞個体発生の際、Ｔ細胞選択の
プロセスを示すかあるいは成熟Ｔ細胞により全ての抗原
特異性認識を示すということは、明らかでない。例え
ば、サプレッサーＴリンパ球は、なぞが残る。すなわ
ち、いくつかの場合において、該サプレッサーＴリンパ
球は、TCRβ遺伝子を再配列することを削除（delete）
または失敗する、文献（26,27）。従って、第2T細胞レ
セプターが存在するかかどうかを決定し、その構造を定
義し（特にTCRγ遺伝子産生物の可能な用途に関して）
およびひいてはこれがどんな機能を提供するかを理解す
ることは、非常に重要である。 発明の開示 本発明は、少なくともδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドの部分からなる純化ポリペプチドを提供する。加え
て、少なくとも１つのδＴ細胞レセプターポリペプチド
と複合体を特異的に形成し得る物質を提供する。 また、Ｔ細胞の各々がδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するＴ細胞を検出する方法を提供する。この方法
は、Ｔ細胞を含有するサンプルをδＴ細胞レセプターポ
リペプチドと複合体を形成することができる物質と接触
させ、該物質とδＴ細胞レセプターポリペプチドとの細
胞性複合体を形成することからなる。該細胞性複合体を
検出することにより、各Ｔ細胞がδＴ細胞レセプターポ
リペプチドを有するＴ細胞が検出される。 本発明は、さらに被験者における免疫系異常を診断す
る方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプル
におけるＴ細胞の数を決定し、サンプルを少なくとも１
つのδＴ細胞レセプターポリペプチドと複合体を形成し
得る物質と接触させ、該物質とＴ細胞レセプターポリペ
プチドとの細胞性複合体を形成することからなる。δＴ
細胞レセプターポリペプチドを有するサンプルにおける
Ｔ細胞のパーセンテージは、決定され、免疫系異常を示
さない正常被験者からのサンプルにおけるδＴ細胞レセ
プターポリペプチドを有するＴ細胞のパーセンテージと
比較される。このようにして決定されたＴ細胞のパーセ
ンテージの相異は、免疫系異常の表示である。 本発明は、被験者における免疫系異常を診断する別の
方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプルに
おけるδＴ細胞レセプターポリペプチド支持（bearin
g）Ｔ細胞の数を決定し、δＴ細胞レセプターポリペプ
チド支持Ｔ細胞におけるδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドの量を決定することからなる。このようにして決定さ
れたδＴ細胞レセプターポリペプチドの量は、免疫系異
常を示さない正常被験者からのサンプルにおける同数の
δＴ細胞レセプターポリペプチド支持Ｔ細胞におけるδ
Ｔ細胞レセプターポリペプチドの量と比較される。この
ようにして決定された量の相異は、免疫系異常の表示で
ある。 被験者における免疫系異常を診断するさらに別の方法
を提供する。この方法は、被験者からのサンプルにおい
てδＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の数
および表面マーカーT4,T8およびα，βＴ細胞レセプタ
ーのひとつを有するＴ細胞の基からなるＴ細胞の数を決
定することからなる。このようにして決定されたＴ細胞
の数は、免疫異常を示さない被験者からのサンプルにお
けるδＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の
数および被験者からのサンプルにおいて決定されたＴ細
胞の基と同一の表面マーカーを有する基におけるＴ細胞
の数と比較される。このようにして決定された基におけ
るＴ細胞の数と比較するδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するこのようにして決定されたＴ細胞の数の相異
は、免疫系異常の表示である。 本発明はまた、少なくともγＴ細胞レセプターポリペ
プチドの部分からなる純化ポリペプチドを提供する。加
えて、少なくとも１つのγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドと複合体を特異的に形成し得る物質を提供する。さら
にまた、Ｔ細胞の各々がγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するＴ細胞を検出する方法を提供する。この方法
は、Ｔ細胞を含有するサンプルをγＴ細胞レセプターポ
リペプチドと複合体を形成することができる物質と接触
させ、該物質とγＴ細胞レセプターポリペプチドとの細
胞性複合体を形成することからなる。該細胞性複合体を
検出することにより、各Ｔ細胞がγＴ細胞レセプターポ
リペプチドを有するＴ細胞が検出される。 本発明は、さらに被験者における免疫系異常を診断す
る方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプル
におけるＴ細胞の数を決定し、サンプルを少なくとも１
つのγＴ細胞レセプターポリペプチドと複合体を形成し
得る物質と接触させ、該物質とＴ細胞レセプターポリペ
プチドとの細胞性複合体を形成することからなる。γＴ
細胞レセプターポリペプチドを有するサンプルにおける
Ｔ細胞のパーセンテージは、決定され、免疫系異常を示
さない正常被験者からのサンプルにおけるγＴ細胞レセ
プターポリペプチドを有するＴ細胞のパーセンテージと
比較される。このようにして決定されたＴ細胞のパーセ
ンテージの相異は、免疫系異常の表示である。 本発明は、被験者における免疫系異常を診断するさら
に別の方法を提供する。この方法は、被験者からのサン
プルにおけるγＴ細胞レセプターポリペプチド支持（be
aring）Ｔ細胞の数およびγＴ細胞レセプターポリペプ
チド支持Ｔ細胞におけるγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドの量を決定することからなる。このようにして決定さ
れたγＴ細胞レセプターポリペプチドの量は、免疫系異
常を示さない正常被験者からのサンプルにおける同数の
γＴ細胞ポリペプチド支持Ｔ細胞ポリペプチド支持Ｔ細
胞におけるγＴ細胞レセプターポリペプチドの量と比較
される。このようにして決定された量の相異は、免疫系
異常の表示である。 本発明は、被験者における免疫系異常を診断するさら
に別の方法を提供する。この方法は、被験者からのサン
プルにおいてγＴ細胞レセプターポリペプチドを有する
Ｔ細胞の数および表面マーカーT4,T8およびα，βＴ細
胞レセプターのひとつを有するＴ細胞の基からなるＴ細
胞の数を決定することからなる。このようにして決定さ
れたＴ細胞の数は、免疫異常を示さない被験者からのサ
ンプルにおけるγＴ細胞レセプターポリペプチドを有す
るＴ細胞の数おび被験者からのサンプルにおいて決定さ
れたＴ細胞の基と同一の表面マーカーを有する基におけ
るＴ細胞の数と比較される。このようにして決定された
基におけるＴ細胞の数と比較するγＴ細胞レセプターポ
リペプチドを有するこのようにして決定されたＴ細胞の
数の相異は、免疫系異常の表示である。 本発明はさらにまた、少なくともδＴ細胞レセプター
ポリペプチドの部分および少なくともγＴ細胞レセプタ
ーポリペプチドの部分からなる純化複合体を提供する。
また、少なくとも１つのγ，δＴ細胞レセプター複合体
と複合体を特異的に形成し得る物質を提供する。さら
に、Ｔ細胞の各々がγ，δＴ細胞レセプター複合体を有
するＴ細胞を検出する方法を提供する。この方法は、Ｔ
細胞を含有するサンプルをγ，δＴ細胞レセプター複合
体と複合体を形成することができる物質と接触させ、該
物質とγ，δＴ細胞レセプター複合体との細胞性複合体
を形成することからなる。該細胞性複合体を検出するこ
とにより、各Ｔ細胞がγ，δＴ細胞レセプター複合体を
有するＴ細胞が検出される。 本発明は、さらに被験者における免疫系異常を診断す
る方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプル
におけるＴ細胞の数を決定し、サンプルを少なくとも１
つのγ，δＴ細胞レセプター複合体と複合体を形成し得
る物質とを接触させ、該物質とγ，δＴ細胞レセプター
複合体との細胞性複合体を形成することからなる。γ，
δＴ細胞レセプター複合体を有するサンプルにおけるＴ
細胞のパーセンテージは、決定され、免疫系異常を示さ
ない正常被験者からのサンプルにおけるγ，δＴ細胞レ
セプター複合体を有するＴ細胞のパーセンテージと比較
される。このようにして決定されたＴ細胞のパーセンテ
ージの相違は、免疫系異常の表示である。 本発明は、被験者における免疫系異常を診断するさら
に別の方法を提供する。この方法は、被験者からのサン
プルにおけるγ，δＴ細胞レセプター複合体支持（bear
ing）Ｔ細胞の数およびγ，δＴ細胞レセプター複合体
支持Ｔ細胞におけるγ，δＴ細胞レセプター複合体の量
を決定することからなる。このようにして決定された
γ，δ細胞レセプター複合体の量は、免疫系異常を示さ
ない正常被験者からのサンプルにおける同数のγ，δＴ
細胞複合体支持Ｔ細胞レセプター複合体支持Ｔ細胞にお
けるγ，δＴ細胞レセプター複合体の量と比較される。
このようにして決定された量の相異は、免疫系異常の表
示である。 本発明により被験者における免疫系異常を診断するさ
らに別の方法が提供される。この方法は、被験者からの
サンプルにおいてγ，δＴ細胞レセプター複合体を有す
るＴ細胞の数および表面マーカーT4,T8およびα，βＴ
細胞レセプター複合体のひとつを有するＴ細胞の基から
なるＴ細胞の数を決定することからなる。このようにし
て決定されたＴ細胞の数は、免疫異常を示さない被験者
からのサンプルにおけるγ，δＴ細胞レセプターの数お
よび被験者からのサンプルにおいて決定されたＴ細胞の
基と同一の表面マーカーを有する群におけるＴ細胞の数
と比較される。基におけるＴ細胞の数と比較するγ，δ
Ｔ細胞レセプター複合体を有するこのようにして決定さ
れたＴ細胞の数は、免疫系異常の表示である。 図面の簡単な説明 第１図:TCRα，βを認定する基質モノクローナル抗体の
反応性。 A.レーン1:対照抗体、正常マウス血清。 レーン2:抗基質TCRα，βモノクローナル抗体（βF
1）。 B.レーン1:対照抗体、正常マウス血清。 レーン2:抗T3モノクローナル抗体（UCHT−１）。 レーン3:抗基質TCRα，βモノクローナル抗体（WT3
1）。 C.正常成人末梢血リンパ球の流動血球計算分析の３次
元表示。緑色および赤色蛍光を非特異対照FITC−および
ビオチン接合モノクローナル抗体に比較して測定した。
いずれかのモノクローナル抗体と反応性のない細胞は、
非Ｔ細胞であった（左下隅）;2重陽性、すなわちOKT
３およびβF1の両方と反応した細胞は、格子の中央にお
けるリンパ球と多数の個体を構成する；βF1と反応しOK
T 3+と反応しなかった細胞は、Ｘ軸にそって観察され
た少ないが識別可能なリンパ球の基（４％のT3+細胞）
からなる。 第２図：細胞表面T3およびIDP1およびIDP2細胞系による
T3会合（架橋）分子のSDS−PAGE分析。 A.IDPI細胞系２（WT31+）および細胞系３（WT31-）。 レーン1,2,7および8:正常マウス血清。 レーン3,4,9および10:抗T3モノクロナール抗体（UC
HT−１）。 レーン5,6,11および12:抗基質TCRα，βモノクロナ
ール抗体（βF1）。 B.IDP2細胞系７（88％WT31-T3+） レーン1,4,7および10:正常マウス血清。 レーン2,5,8および11:抗基質TCRモノクローナル抗
体（βF1）。 レーン3,6,9および12:抗T3モノクローナル抗体（UC
HT−１）。 DSPと架橋した125I標識化試料XL。 C.IDP2細胞系５（WT31+T3+）および細胞系７（88％WT
31-T3+） 第３図:TCRα,TCRβおよびTCRγcDNAプローブを用いてI
DP2細胞系から単離されたRNAのノーザンブロット分析。 A.レーン1:IDP2細胞系６（WT31-） レーン2:T白血病細胞系 HBP−MLT。 B.レーン1:IDP2細胞系５（WT31+T3+）。 レーン2:IDP2細胞系７（88％WT31-T3+）。 レーン3:細胞系 HPB−MLT。 第４図:IDP2細胞系７からの抗Ｖγおよび抗Ｃγペプチ
ド血清免疫沈降。 A.レーン1:正常マウス血清。 レーン2:抗Ｖγペプチドマウス血清。 レーン3:正常ラビット血清。 レーン4:抗Ｃγペプチドラビット血清。 B.レーン1:正常マウス血清。 レーン2:抗T3モノクローナル抗体（UCHT−１）。 レーン3:正常ラビット血清。 レーン4,5:抗Ｃγペプチドラビット血清。 第５図：ヒト腫瘍および末梢血リンパ球系からのTCR
γ，δおよびT3の免疫沈降。 125I標識化細胞溶解産物からの免疫沈降は、還元（re
ducing）（Ｒ）または非還元（ＮまたはNR）条件下SDS
−PAGE（10％アクリルアミド）によって分析された。サ
イズマーカー、Mr,1000。 A.IDP2およびPEER細胞上のTCRγ，δおよびT3サブユニ
ット。免疫沈降は、１μｇ対照mAb P3（P3X63.Ag8骨髄
腫により分泌されたmAb,レーン1,3,5および６）;1μgUC
HTI（抗T3）（文献40）（レーン2,4,7および８）;10μ
正常ラビット血清（NRS,レーン９）および10μ抗Ｃ
ペプチド血清（抗TCRγ）（レーン10）を用いて実行さ
れた。矢印は、ＲおよびNR条件下、移動度を変化するTC
Rδサブユニットの位置を示す。 末梢血Ｔ細胞クローン、PBL C1およびWT31-PBL系上
のTCRγ，δおよびT3サブユニット。免疫沈降は、対照m
Ab P3（レーン1,4,9および12）、１μｇ βF1（抗TCR
β）（レーン2,5,10および13）、NRS（レーン７および1
5）および抗ペプチド血清（レーン８および16）を用い
て実行された。白抜き矢印は、ジスルフィド結合F1およ
び未反応性T3会合種、黒塗り矢印は、非ジスルフィド結
合、悲還元条件下増加SDS−PAGE移動度を表示するT3会
合物質（ＡにおけるTCRδ等）を示す。 第６図:PBL C1から単離されたRNAのノーザンブロット
分析。 Ｔ白血病細胞系HPB−MLT（各プローブに関してレーン
１）およびPBL C1（各プローブに関してレーン２）か
らの総RNA組織標本は、TCRα,TCRβおよびTCRγプロー
ブを用いノーザンブロットが分析された。 第７図:TCRγポリペプチドおよび前駆体の二次元ゲル分
析。 パネルＡ〜Ｄ PBL C1細胞からの還元（分離）および
非還元（二量性）T3−会合ポリペプチドの比較をCHAPS
に溶解し、抗T3mAbで免疫沈降した。二次元ゲル電気泳
動を還元条件下（A,C）あるいは非還元条件下（B,D）を
行った。T3γ，δおよびε部位を標識化し、ＲおよびＮ
の両方の条件下、同位置に電気泳動させた。ジスルフィ
ド結合の開裂後、T3会合ポリペプチド（40Kおよび36K）
は、Ｒ条件下、T3γの近くの電気泳動部位に移動したが
Ｎ条件下（二量体の両組成物が存在する際（68K））、
より酸性部位にシフトした。サイズマーカー、Mr. パネルＥ〜Ｈ グリコシル化および未グリコシル化IDP2
およびPBL C1 TCRペプチド前駆体の分析。IDP2および
PBL C1細胞は、35S−メチオニンでパルス標識化され、
変性条件下、溶解され、抗Ｃγペプチド血清で免疫沈降
された。免疫沈降は、ついでエンド−Ｈで処置、または
模擬処理され、２次元ゲル電気泳動により分析された。
グリコシル化TCRγペプチドを白抜き矢印で、未グリコ
シル化TCRγを黒塗り矢印で示す。見かけ相対分子質量
をパネルＡおよびＢ（図示せず）に用いた標準の移動か
ら計算した。各パネルにおけひし形で示される小量の汚
染アクチンは、内部マーカーとして作用した。E,IDP2
TCRγ、模擬培養、F,IDP2 TCRγ，エンド処置;G,PBL
C1 TCRγ模擬培養、H,PBL C1 TCRγエンド処理。 第８図:TCRγポリペプチドを発現するＴ細胞におけるγ
およびβ遺伝子の再配列。 IDP2細胞系、PBL C1,PbL C2,WT31-PBL系、胎児胸
腺、新生児胸腺,PBLおよびＢ細胞系（胚子系（germlin
e）に関してJY）から単離されたゲノムDNAをTCRγ（A,
B）およびTCRβ（Ｃ）遺伝子再配列に関してサザンブロ
ット分析を行った。ゲノムDNAは、アガロースゲル上に
分画されたBamH I（A,C）またはEcoR I（Ｂ）で消化さ
れ、32P−標識化Ｊγ1,3（A,B）またはＣβ２プローブ
（Ｃ）でのハイブリダイゼーションのためニトロセルロ
ースフィルターに写された。矢印およびローマ数字はTC
Rγ再配列を示す。サイズマーカーKb. 第９図:IDP2およびPBL C1細胞による細胞溶解。 パネルA,C IDP2またはPBL C1エフェクター細胞を（表
示されたエフェクター：ターゲット（E:T）比で）51Cγ
−標識化ターゲット細胞K562（白血球系）、U937（単核
細胞系）、MOLT−4,CEM（Ｔ白血病系）、ダウディ（Dau
di）（バーキットリンパ腫系）または同種異系または自
系PBL（ヒトPBLの３日PHAブレスト（blasts））で培養
した。各ターゲットに対する51Cγの特異放出％を示
す。抗T3 mAb UCHIを30分間０℃でエフェクター細胞
（＋抗T3）に予備結合した後に同様の検定を行った。 パネルＢ 種々のmABによるMOLT−４ターゲット細胞のI
DP2細胞溶解の禁止。IDP2および51Cγ標識化MOLT−４細
胞を種々の希釈度の抗MHCクラス1mAb W6/32（抗HLA−
A,B,C単系性決定因子）、（文献58）、抗HLA−A,B,C
（単系性決定因子）、（文献59）、4E（抗−HLA−Ｂお
よびＣ部位）、（文献60）、131（抗HLA−Ａ部位）、
（文献61）または抗MHC（クラスII mAB LB3.1（抗DR特
異性）、（文献62）、抗Leu 10（抗DQ特異性）、（文
献63）、または抗T3 mAB UCHTIの存在下、40:1のE:T
比でお互いに培養した。高稀釈度は、腹水とししてmAb
用に用いられ（W6/32,4E,131,LB3.1およびUCHTI）、ま
たは低稀釈度は、市販mAb用（抗Leu 10）または培養上
澄液用（抗HLA−A,B,C）に用いられた。 第10図：ピーア（peer）細胞から誘導されたTCRγ鎖の
免疫沈降。 レーン１〜18は、同一ハイブリドーマ融合実験からの
種々のハイブリドーマ培養上澄液（spurnatates）であ
る。レーン４は、抗γ鎖モノクローナル抗体34D12であ
り、レーン９は対照P3×63Ag8.653培養上澄液であり、
またレーン10は、対照正常マウス血清である。 第11図:IDP2細胞からのTCRδ鎖の免疫沈降。 レーン１は、対照P3×63Ag.8.653は培養上澄液、レー
ン２および５は、モノクローナル抗体4A1培養上澄液、
レーン３は、Leu4,またレーン４は、対照正常ラビット
血清である。 IDP2細胞は、ラクトペルオキシターゼを用いて125I標
識化し、２％トリトンX100（Triton X100）に可溶化し
た。レーン４および５において、この溶解産物を１％ト
リトンX100 ４容量で稀釈した１％SDS中、３分間煮沸
し、４℃で１晩変性した。これによりTCRγおよびδ鎖
の分離をした。このような鎖分離の後、モノクローナル
ネ抗体4A1は、上述のごとく、TCRδ鎖（レーン５）を免
疫沈降した。 発明の詳細な説明 しかして、本発明は、少なくともδＴ細胞レセプター
の部分からなる純化ポリペプチドを提供するものであ
る。このポリペプチドは、少なくとも内部鎖、共有結
合、ジスルフィド架橋を有し得る。加えて、ポリペプチ
ドは、分子量約40,000ダルトンのδＴ細胞レセプターポ
リペプチドからなり得る。さらに、δＴ細胞レセプター
ポリペプチドは、ヒトδＴ細胞レセプターポリペプチド
であり得る。 少なくとも１つのδＴ細胞レセプターポリペプチドと
複合体を特異的に形成し得る物質もまた、本発明によっ
て提供される。この発明の一実施例態様において、該物
質は、１つのδＴ細胞レセプターポリペプチドと複合体
を特異的に形成できる。この発明の他の実施態様におい
て、該物質は、１以上のδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドと複合体を特異的に形成できる。この発明の他の実施
態様において、該物質は、１以上のδＴ細胞レセプター
ポリペプチドと複合体を特異的に形成できる。該物質
は、抗体であり得る。該抗体は、ポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体であり得る。 また、Ｔ細胞の各々がδＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するＴ細胞を検出する方法を提供する。この方法
は、Ｔ細胞を含有するサンプルをδＴ細胞レセプターポ
リペプチドと複合体を形成することができる物質と接触
させ、該物質とδＴ細胞レセプターポリペプチドとの細
胞性複合体を形成することからなる。該細胞性複合体を
検出することにより、各Ｔ細胞がδＴ細胞レセプターポ
リペプチドを有するＴ細胞が検出される。 従って、この発明の一実施態様において、δＴ細胞レ
セプターポリペプチドは、Ｔ細胞上の表面上に存在す
る。この発明の別の実施態様において、δＴ細胞レセプ
ターポリペプチドは、δＴ細胞の細胞質内に存在する。 該方法は、特異δＴ細胞レセプターポリペプチド複合
体を形成することによって行なわれる。この発明の一実
施態様において、特異δＴ細胞レセプターポリペプチド
は、サプレッサーＴ細胞内のみに存在する。 本発明は、さらに被験者における免疫系異常を診断す
る方法を提供する。本明細書において、免疫系異常と
は、正常または標準免疫応答と比較して上昇または減少
免疫応答であることを特徴とする抗原に対する免疫学的
応答性の状態を意味するものである。従って、免疫系異
常としては、これに限定されるものではないが、免疫不
全状態、例えば後天性免疫不全症候群および先天性免疫
不全症等、高免疫状態および高免疫症、例えばアレルギ
ーおよび枯草熱等が挙げられる。本発明の方法は、被験
者からのサンプルにおけるＴ細胞の数を決定し、サンプ
ルを少なくとも１つのδＴ細胞レセプターポリペプチド
と複合体を形成し得る物質と接触させ、該物質とδＴ細
胞レセプターポリペプチドとの細胞性複合体を形成する
ことからなる。δＴ細胞レセプターポリペプチドを有す
るサンプルにおけるＴ細胞のパーセンテージは、決定さ
れ、免疫系異常を示さない正常被験者からのサンプルに
おけるδＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞
のパーセンテージと比較される。このようにして決定さ
れたＴ細胞のパーセンテージの相異は、免疫系異常の表
示である。 この発明の一実施態様において、免疫系異常は、癌で
ある。癌は、白血病またはリンパ腫であり得る。この発
明の他の実施態様において、免疫系異常は、後天性免疫
不全症候群である。この発明の別の実施態様において、
免疫系異常は、先天性免疫不全症である。この発明のさ
らに別の実施態様において、免疫系異常は、自己免疫疾
患である。 免疫系異常が診断される被験者は、動物であり得る。
この発明の一実施態様において、被験者は、ヒトであ
る。さらにまた被験者からのサンプルは、血液または組
織からなることができる。 本発明は、被験者における免疫系異常を診断する別の
方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプルに
おけるδＴ細胞レセプターポリペプチド支持Ｔ細胞の数
およびδＴ細胞レセプターポリペプチド支持Ｔ細胞にお
けるδＴ細胞レセプターポリペプチドの量を決定するこ
とからなる。このようにして決定されたδＴ細胞レセプ
ターポリペプチドの量は、免疫系異常を示さない正常被
験者からのサンプルにおける同数のδＴ細胞レセプター
ポリペプチド支持Ｔ細胞におけるδＴ細胞レセプターポ
リペプチドの量と比較される。このようにして決定され
た量の相異は、免疫系異常の表示である。この発明の一
実施態様において、シグナルδＴ細胞レセプターポリペ
プチドの量が決定される。 被験者における免疫系異常を診断するさらに別の方法
を提供する。この方法は、被験者からのサンプルにおい
てδＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の数
および表面マーカーT4,T8およびα，βＴ細胞レセプタ
ーのひとつを有するＴ細胞の基からなるＴ細胞の数を決
定することからなる。このようにして決定されたＴ細胞
の数は、免疫異常を示さない被験者からのサンプルにお
けるδＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の
数および被験者からのサンプルにおいて決定されたＴ細
胞の基と同一の表面マーカーを有する基におけるＴ細胞
の数と比較される。このようにして決定された基におけ
るＴ細胞と比較するδＴ細胞レセプターポリペプチドを
有するこのようにして決定されたＴ細胞の数の相異は、
免疫系異常の表示である。 本発明はまた、分子量約40,000ダルトンのδＴ細胞レ
セプターをコード化する核酸分子を提供する。この発明
の一実施態様において、該分子は、DNA分子である。さ
らにまた、δＴ細胞レセプターポリペプチドをコード化
する核酸分子と相補性である核酸分子が提供される。 少なくともγＴ細胞レセプターの部分からなる純化ポ
リペプチドもまた、本発明によって提供される。該ポリ
ペプチドは、分子量約55,000ダルトンのγＴ細胞レセプ
ターからなり得る。この発明は、一実施態様において、
該ポリペプチドは、分子量約31,000ダルトン〜約40,000
ダルトンを有するペプチド配列を有する。加えて、該ポ
リペプチドヒトγＴ細胞ポリペプチドであり得る。 本発明はさらに、お互い会合された２つの本発明のγ
Ｔ細胞レセプターポリペプチドからなる純化複合体を提
供する。この発明の一実施態様において、該２つのγＴ
細胞レセプターポリペプチドは、少なくとも１つの内部
鎖、共有結合、ジスルフィド結合によりお互い会合され
る。この発明の他の実施態様において、該２つのγＴ細
胞レセプターは、お互い非共有結合的に会合される。こ
の発明の別の実施態様において、該２つのγＴ細胞レセ
プターは、同一の一定ドメインを有する。この発明のさ
らに別の実施態様において、該２つのγＴ細胞レセプタ
ーポリペプチドは、異なる一定ドメインを有する。 本発明はまた、少なくとも１つのγＴ細胞レセプター
ポリペプチドと複合体を特異的に形成し得る物質を提供
する。この発明の一実施例態様において、該物質は、１
つのγＴ細胞レセプターポリペプチドと複合体を特異的
に形成できる。この発明の他の実施態様において、該物
質は、１以上のγＴ細胞レセプターポリペプチドと複合
体を特異的に形成できる。該物質は、抗体であり得る。
この発明の一実施態様において該抗体は、ポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。 また、Ｔ細胞の各々がγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するＴ細胞を検出する方法を提供する。この方法
は、Ｔ細胞を含有するサンプルをγＴ細胞レセプターポ
リペプチドと複合体を形成することができる物質と接触
させ、該物質とγＴ細胞レセプターポリペプチドとの細
胞性複合体を形成することからなる。該細胞性複合体を
検出することにより、各Ｔ細胞がγＴ細胞レセプターポ
リペプチドを有するＴ細胞が検出される。この発明の一
実施態様においてγＴ細胞レセプターポリペプチドは、
Ｔ細胞表面上に存在する。この発明の他の実施態様にお
いて、γＴ細胞ポリペプチドは、γＴ細胞の細胞質内に
存在する。この発明の別の実施態様において、該物質
は、特異γＴ細胞ポリペプチドと複合体を形成し得る。
この該特異γＴ細胞レセプターポリペプチドは、サプレ
ッサーＴ細胞内のみに存在し得る。さらにまた、該γＴ
細胞レセプターポリペプチドは、別のγＴ細胞レセプタ
ーポリペプチドと会合され得る。この発明の一実施態様
において、該γＴ細胞レセプターポリペプチドは、別の
γＴ細胞レセプターポリペプチドと会合される。この発
明の他の態様において、該γＴ細胞レセプターポリペプ
チドは、非主要の組織適合制限細胞毒Ｔリンパ球のみに
おいて別のγＴ細胞レセプターポリペプチドと会合され
る。さらにまた、該非主要の組織適合制限細胞毒Ｔリン
パ球は、Ｔキラー細胞または天然キラー様細胞であり得
る。 本発明は、さらに被験者における免疫系異常を診断す
る方法を提供する。この方法は、被験者からのサンプル
におけるＴ細胞の数を決定し、サンプルを少なくとも１
つのγＴ細胞レセプターポリペプチドと複合体を形成し
得る物質と接触させ、該物質とγＴ細胞レセプターポリ
ペプチドとの細胞性複合体を形成することからなる。γ
Ｔ細胞レセプターポリペプチドを有するサンプルにおけ
るＴ細胞のパーセンテージは、決定され、免疫系異常を
示さない正常被験者からのサンプルにおけるγＴ細胞レ
セプターポリペプチドを有するＴ細胞のパーセンテージ
と比較される。このようにして決定されたＴ細胞のパー
センテージの相異は、免疫系異常の表示である。この発
明の一実施態様において、免疫系異常は、癌である。癌
は、白血病またはリンパ腫であり得る。この発明の他の
実施態様において免疫系異常は、後天性免疫不全症候群
である。この発明の別の実施態様において、免疫系異常
は、先天性免疫不全症である。この発明のさらに別の実
施態様において、免疫系異常は、自己免疫疾患である。 免疫系異常が診断される被験者は、動物であり得る。
また免疫系異常が診断される被験者は、ヒトであり得
る。さらにまた、γ,T細胞レセプターポリペプチドを有
するＴ細胞のパーセンテージが決定されるサンプルは、
血液または組織からなることができる。 被験者における免疫系異常を診断するさらに別の方法
は、本発明によって提供される。この方法は、被験者か
らのサンプルにおけるγＴ細胞レセプターポリペプチド
支持Ｔ細胞の数およびγＴ細胞レセプターポリペプチド
支持Ｔ細胞におけるγＴ細胞レセプターポリペプチドの
量を決定することからなる。このようにして決定された
γＴ細胞レセプターポリペプチドの量は、免疫系異常を
示さない正常被験者からのサンプルにおける同数のγＴ
細胞ポリペプチド支持Ｔ細胞におけるγＴ細胞レセプタ
ーポリペプチドの量と比較される。このようにして決定
された量の相異は、免疫系異常の表示である。この発明
の一実施態様において、シグナルγＴ細胞レセプターポ
リペプチドの量が決定される。 被験者における免疫系異常を診断するさらに別の方法
を提供する。この方法は、被験者らかのサンプルにおい
てγＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の数
および表面マーカーT4,T8およびα，βＴ細胞レセプタ
ーのひとつを有するＴ細胞の基からなるＴ細胞の数を決
定することからなる。このようにして決定されたＴ細胞
の数は、免疫異常を示さない被験者からのサンプルにお
けるγＴ細胞レセプターポリペプチドを有するＴ細胞の
数および被験者からのサンプルにおいて決定されたＴ細
胞の基と同一の表面マーカーを有する基におけるＴ細胞
の数と比較される。このようにして決定された基におけ
るＴ細胞の数と比較するγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するこのようにして決定されたＴ細胞の数の相異
は、免疫系異常の表示である。 さらに、少なくともδＴ細胞レセプターポリペプチド
の部分および少なくともγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドの部分からなる純化複合体が、本発明によって提供さ
れる。この複合体は、分子量約40,000ダルトンのδＴ細
胞レセプターポリペプチドおよび分子量約50,000ダルト
ンのγＴ細胞レセプターポリペプチドからなることがで
きる。また、δＴ細胞レセプターポリペプチドは、ヒト
γＴ細胞ポリペプチドであり得、γＴ細胞レセプターポ
リペプチドは、ヒトγＴ細胞ポリペプチドであり得る。
さらにまた、δＴ細胞レセプターポリペプチドおよびγ
Ｔ細胞レセプターポリペプチドは、少なくとも１つの内
部鎖、共有結合、ジスルフィド結合によりお互い会合し
得、あるいはお互い非共有結合的に会合できる。 また、少なくとも１つのγ，δＴ細胞レセプター複合
体と複合体を特異的に形成し得る物質が本発明によって
提供される。この物質は、１つのγ，δＴ細胞レセプタ
ー複合体と複合体を形成できる。さらに、この物質は、
１以上のγ，δＴ細胞レセプター複合体と複合体を形成
できる。 この発明の一実施態様において、該物質は、抗体であ
る。この発明の他の実施態様において、該物質は、ポリ
クローナル抗体である。この発明の別の実施態様におい
て、該物質は、モノクローナル抗体である。 本発明はさらに、Ｔ細胞の各々がγ，δＴ細胞レセプ
ター複合体を有するＴ細胞を検出する方法を提供する。
この方法は、Ｔ細胞を含有するサンプルをγ，δＴ細胞
レセプター複合体と複合体を形成することができる物質
と接触させ、該物質とγ，δＴ細胞レセプター複合体と
の細胞性複合体を形成することからなる。該細胞性複合
体を検出することにより、各Ｔ細胞がγ，δＴ細胞複合
体を有するＴ細胞が検出される。この発明の一実施態様
においてγ，δＴ細胞レセプター複合体は、Ｔ細胞の表
面上に存在する。この発明の別の実施態様において、
γ，δＴ細胞レセプター複合体は、Ｔ細胞の細胞質内に
存在する。この発明のさらに別の実施態様において、該
物質は、特異γ，δＴ細胞レセプター複合体と複合体を
形成することができる。該特異γ，δ細胞複合体は、サ
プレッサーＴ細胞のみに存在し得る。 さらに、被験者における免疫系異常を診断する方法
が、本発明によって提供される。この方法は、被験者か
らのサンプルにおけるＴ細胞の数を決定し、サンプルを
少なくとも１つのγ，δＴ細胞レセプター複合体と複合
体を形成し得る物質と接触させ、該物質とγ，δＴ細胞
レセプター複合体との細胞性複合体を形成することから
なる。γ，δＴ細胞レセプター複合体を有するサンプル
におけるＴ細胞のパーセンテージは、決定され、免疫系
異常を示さない正常被験者からのサンプルにおけるγ，
δＴ細胞レセプター複合体を有するＴ細胞のパーセンテ
ージと比較される。このようにして決定されたＴ細胞の
パーセテージの相異は、免疫系異常の表示である。この
発明の一実施態様において、免疫系異常は、癌である。
癌は、白血病またはリンパ腫であり得る。この発明の他
の実施態様において、免疫系異常は、後天性免疫不全症
候群である。この発明の別の実施態様において、免疫系
異常は、先天性免疫不全症である。この発明のさらに別
の実施態様において、免疫系異常は、自己免疫疾患であ
る。 免疫系異常が診断される被験者は、動物であり得る。
さらに、免疫系異常が診断される被験者は、ヒトであ
る。さらにまた、γ，δＴ細胞レセプター複合体を有す
るＴ細胞のパーセンテージが決定されるサンプルは、血
液または組織からなることができる。 本発明により被験者における免疫系異常を診断するさ
らに別の方法が提供される。この方法は、被験者からの
サンプルにおけるγ，δＴ細胞レセプター複合体支持Ｔ
細胞の数およびγ，δＴ細胞レセプター複合体支持Ｔ細
胞におけるγ，δＴ細胞レセプターの量を決定すること
からなる。このようにして決定されたδＴ細胞レセプタ
ー複合体の量は、免疫系異常を示さない正常被験者から
のサンプルにおける同数のγ，δＴ細胞レセプター複合
体支持Ｔ細胞におけるγ，δＴ細胞レセプター複合体の
量と比較される。このようにして決定された量の相異
は、免疫系異常の表示である。この発明の一実施態様に
おいて、シグナルγ，δＴ細胞レセプター複合体の量が
決定される。 被験者における免疫系異常を診断するさらに別の方法
を提供する。この方法は、被験者からのサンプルにおい
てγ，δＴ細胞レセプター複合体を有するＴ細胞の数お
よび表面マーカーT4,T8およびα，βＴ細胞レセプター
のひとつを有するＴ細胞の基からなるＴ細胞の数を決定
することからなる。このようにして決定されたＴ細胞の
数は、免疫異常を示さない被験者からのサンプルにおけ
るγ，δＴ細胞レセプター複合体を有するＴ細胞の数お
よび被験者からのサンプルにおいて決定されたＴ細胞の
基と同一の表面マーカーを有する基におけるＴ細胞の数
と比較される。このようにして決定された基におけるＴ
細胞の数と比較するγ，δＴ細胞レセプター複合体を有
するこのようにして決定されたＴ細胞の数は、免疫系異
常の表示である。 本発明によって提供される種々の異常を診断する方法
およびＴ細胞を検出する方法は、以下に詳述する新規ポ
リペプチド類および該ポリペプチド類と複合体を形成す
る物質に基づく。該方法は、これに限定されるものでは
ないが本発明に関して当業者に公知の活性化細胞餞別お
よびオートラジオグラフィ等、Ｔ細胞を検出し、定量す
る方法を利用する。 実施例 実施例１ 物質および方法 リンパ球培養株および細胞個体群分析 生育可能なリンパ球をフィコール−ハイパーク高密度
遠心分離により単離し、特異モノクローナル抗体、例え
ばWT31（文献28,29）、またはOKT 3,OKT ４またはOKT
８［オルソー・ダイアグノスティック・システムズ・
インコーポレーテッド、ラーリトン・ニュージャーシー
州（Ortho Diagnostic Systems,Inc.,Raritan,NJ）］、
を30分間４℃で染色した。洗浄後、細胞ペレットをさら
にフルオレセインイソチオシアネート（FITC）接合ヤギ
抗マウスIgC（ab）′２フラグメントで染色した。フル
オレセイン活性化細胞選別（FACS）分析を先に記載のご
とく（文献37）オルソーサイトフルオログラフ（cytofl
uorograph）またはコールター・エピシス（Coulter Epi
cs）で行った。特異的に染色された陽性細胞は、各細胞
系（非特異対照モノクローナル抗体で染色）に関する陰
性対照プロフィールと比較して決定された。基線での陰
性対照プロフィールの妨害より大きいフルオレセイン強
度チャンネル数を有する細胞を陽性とし、陽性％を合計
総細胞数と比較して計算した。 全IL−２依存細胞を先に記載のごとく（文献34）、PR
MI 1640、10％ヒト血清および２〜５ユニットのインタ
ーロイキン−２活性含有条件培地からなる培地中生体外
生殖した。 同種抗原（allo）活性化培養株を１週間間隔で照射同
種異系末梢血リンパ球で刺激した。マイトジェン、すな
わちフィトヘムアグルチニン（PHA）活性化系を培養開
始時に1:1000稀釈PHA［ディフコ、デトロイト、ミシガ
ン（Difco,Detroit,MI）］で刺激した。 モノクローナル抗体を用いた細胞培養株の反応性および
特徴づけ 125I標識化リンパ球溶解産物からの免疫沈降物をドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）で分析した。放射性ヨウ素化白血病細胞
系HPB−MLTおよびジャーカット（Jurket）、HTLV−１形
質転換細胞系ANITAおよび休止末梢血リンパ球を１％ト
リトン−Ｘ−100（TX−100）に可溶化し、対照抗体、正
常マウス血清（MMS）またはTCRα，βに対する基質抗
体、すなわちF1（文献54）で免疫沈降した。βF1モノク
ローナル抗体を標準方法で調製した（文献46,47,52）。
文献（28）に記載のごとく純化TCRα，βで免疫化した
マウスからの脾臓を融合実験用に用いた。陽性クロー
ン、βF1,が上述のごとくＴ細胞系および末梢血リンパ
球での免疫沈降により得られた。 125I標識化リンパ球を0.1％TX−100に可溶化し、NM
S、抗T3抗体UCHT−１（文献40）およびTCRに対する基質
抗体、すなわちFWT31で免疫沈降した。WT31での免疫沈
降の効率をここに用いられるTX−100低濃度で改善し、
またモノクローナル抗体187.1（文献53）を第２抗体と
して用いた。 正常末梢血リンパ球の２色FACS分析を抗TCRα，βモ
ノクローナル抗体および抗T3モノクローナル抗体を用い
て行った。末梢血リンパ球は、最初にFITC接合抗モノク
ローナル抗体（OKT ３）で染色し、ついでビオチニル
抗TCRα，βモノクローナル抗体（BF1）で染色し、ひき
つづき藻紅素接合アビジン［PE−アビジン、ベクトン・
ディッケンソン、マウント・ビュー，カリフォルニア州
（Becton Dickenson,Mt.View,CA）］で染色した。 生育可能なリンパ球をSDS−PAGEおよびFACS分析のた
めにフィコール−ハイパーク高密度遠心分離により単離
した。SDS−PEGE分析に関して、リンパ球は、ラクトペ
ルオキシターゼ技術により放射性ヨウ素化され、１％TX
−100に可溶化し、そして１マイクログラムの特異抗
体、すなわちモノクローナル抗体βF1またはモノクロー
ナル抗体UCHT−１、または１マイクロ力価のNMSを用い
て免疫沈降した。免疫沈降物をついで還元条件下10.5％
SDS−PAGEにより分析した。125I標識化分子は、先に記
載のごとく（文献28）オートラジオグラフィーにより可
視化した。 ２色サイトフルオログラフィー分析は、まず第１にFI
TC−OKT ３モノクローナル抗体で45分間４℃にて染色
することによって行なわれた。洗浄後、リンパ球を１％
パラホルムアルデヒドに15分間23℃にて固定し、ついで
70％エタノールリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中５分間
−20℃にて培養した。さらに洗浄後、細胞をビオチニル
−βF1モノクローナル抗体で染色し、ついでPE−アジビ
ンで染色した。分析は、オルソーサイトフルオログラフ
（オルソー・ダイアゴスティック・システムズ、インコ
ーポレーション.,ウエウト ウッド、マサチューセッツ
州）で行なわれた。 IDP1およびIDP2細胞系上のT3分子と会合された細胞表面
分子の分析 IDP1細胞系２（WT31+）および細胞系（WT31-）を上述
のごとく125I−標識化した。放射性ヨウ素化された無傷
のリンパ球をついでジチオビスサクシニミジルプロピオ
ネート50マイクログラム/ml含有PBS（pH8）中の培養に
より架橋を行うかまたは模擬培養をした。細胞をついで
１％TX−100中に可溶化し、先に記載のごとく（文献1
2）免疫沈降した。抗T3免疫沈降におけるT3会合分子（M
r 40,000〜55,000）は、未架橋サンプルにおいて低レ
ベルでまたは架橋サンプルにおいて高レベルで検出され
た。 IDP2細胞系７（88％WT31-T3+）を125I−標識化しかつ
DSPで処理したかあるいは模擬培養した。免疫沈降をモ
ノクローナル抗体βF1でのTCRα，β分子の予備洗浄な
しまたはありのいずれかでNMS,抗T3モノクローナル抗体
および抗TCRα，βモノクローナル抗体βF1を用いて行
った。少フラクションの放射性標識化TCRα，βは、予
備洗浄されないサンプル中に検出されたが、βF1で予備
洗浄されたサンプル中には検出されなかった。 IDP2細胞系５（WT31+T3+）および細胞系７（88％WT31
-T3+）を125I標識し、１％TX−100に可溶化し、そしてN
MSまたは抗T3モノクローナル抗体UCHT−１を用いて免疫
沈降した。T3ヘビーサブユニット（Mr27,000）は、これ
ら２つの細胞系に同様に表われ、一方T3ライトサブユニ
ット（Mr19,000〜25,000）は、表われなかった。 オートラジオグラフィーによる10.5％SDS−PAGE分析
後、125I−標識化、１％TX−100中への可溶化、免疫沈
降および可視化を先に記載のごとく（文献28）行った。
化学的架橋を先に記載のごとく（文献28）DPS（50マイ
クログラム/ml）PBS溶液（pH8）を用いて無傷の放射性
標識化リンパ球上に23℃で30分間行った。免疫沈降後、
全サンプルをタンパク質サブユニット間のジスルフィド
結合よおびDSP化学的架橋の両者を解裂する５％２−メ
ルカプトエタノールを用いてて還元条件下SDS−PAGEに
より検査した。 TCRα,TCRβおよびTCRγcDNAプローブを用いてIDP2細胞
系から単離されたRNAのノーザンブロット検定 IDP2細胞系６（WI31-）からおよびＴ白血病細胞系HBP
−MLTから単離された総RNA（15マイクログラム）を2.2M
ホルムアルデヒド含有1.5％アガロースゲル上に分画
し、ニトロセルロースに形質転換し、そしてTCRα,TCR
β，およびTCRγプローブとハイブリダイゼーションし
た。 IDP2細胞系５（WT31+T3+）,IDP2細胞系７（88％WT31-
T3+）およびHPB−MLTから単離された総RNA（３マイクロ
グラム）を上述のごとく分析した。 RNA調製、電気泳動、ニトロセルロースへの形質およ
び32P標識化ニック翻訳されたプローブ（１〜３×108cp
m/マイクログラム）とのハイブリダイゼーションは、先
に記載のとおりであった（文献41）。α鎖プローブは、
ヒトcDNAクローンpG45（文献８）またはL17α（文献4
2）のいずれかであった。γ鎖プローブは、ヒトDNAクロ
ーンＴγ−１から誘導されたAcc Iに対するEcoR Iであ
った。放射線活性バンドは、強化スクリーンを用いてオ
ートラジオグラフィーで可視化された。全プローブは、
ほぼ同一の特異的活性に標識化され同一曝露時間を与え
る。 抗γ抗血清を用いたIDP2細胞系表面分子の免疫沈降 TX−100可溶化125I標識化IDP2細胞系７（88％WT31-T3
+）を変性し（下記参照）、ついでNMSまたは正常ラビッ
ト血清でおよび抗Ｖγペプチド血清または抗Ｃγペプチ
ド血清で免疫沈降した。特異的バンドは、抗Ｖγペプチ
ド血清および抗Ｃγ免疫沈降物の両者においてMr55,000
にて観察された。Mr90,000における補足的バンドは、抗
Ｃγ免疫沈降において再限的には観察されなかった（下
記参照）。 125I標識化IDP2細胞系７からのDSP架橋個有溶解産物
（１％TX100）をNMSでまたは抗T3モノクローナル抗体UC
HT−１で免疫沈降した。別に、該溶解産物を変性し（下
記参照）、ついで正常ラビット血清または抗Ｃγペプチ
ド血清のいずれかで免疫沈降した。 補足的アリコートの溶解産物を２段階免疫沈降した。
ポリペプチドを抗T3モノクローナル抗体UCHT−１で免疫
沈降し、ついでDSP架橋を切断するために変性および還
元条件下免疫吸収剤から溶離した。ついで、この溶離物
からの免疫沈降を抗Ｃγペプチド血清を用いて行った。 125I標識化、１％TX−100中への可溶化および免疫沈
降を上述のごとく行った。個有溶解産物（１％TX−10
0）をSDS（最終濃度１％）およびジチオスレイトール
（dithiothreitol）（最終濃度2mM）を添加しつづいて6
8℃で５分間該混合物を加熱することにより変性した。
冷却句後、ヨードアセタミドを添加し（最終濃度20mM、
サンプルを４容量の1.5％TX−100トリス緩衝生理食塩水
（pH8）で溶離した。該実験における初期免疫沈降物を
変性し、つづいて部分的に再生（renatured）した（文
献28）。サンプルを10マイクロリットルの抗Ｃγまたは
抗Ｖγペプチド血清、１マイクログラムのUCHT−１また
は１マイクロ力価のNMSまたは正常ラビット血清で免疫
沈降し、ついで還元条件下（５％２−メルカプトエタノ
ール）、10.5％SDS−PAGEで分析した。 推定ＶγまたはＣγアミノ酸配列に相当するペプチド
（残基数は、下記の実験結果の節に記載）は、エリクソ
ン（Erickson）およびメァリーフィールド（Merrifiel
d）の方法（文献44）を用いてベックマン990ペプチドシ
ンサセイザー（Beckman 990 peptide synthesizer）で
合成された。ペプチド純度は、高圧液体クロマトグラフ
ィーで評価され、ペプチド配列は、アミノ酸分析で確認
された。ペプチドは、キーホール・リンペット・ヘモシ
アニン（Keyhole limpet hemocyanin）（KLH）と1KLP分
子につき50プペチドの比率でカップルした（文献45）。
マウスおよびラビットは、各々ＶγペプチドまたはＣγ
ペプチドで免疫化された。動物は、３週間間隔で接種さ
れ、血清をペプチド−KLHおよびペプチド−ウシ血清ア
ルブミン接合に対する反応性をバインドするためスクリ
ーニングし、ペプチド−特異抗体の存在を確認した。 γ鎖に対するモノクローナル抗体は、文献（47,50）
に記載された標準方法により発生された。BALB/cマウス
は、エリクソンおよびメァリーフィールドの方法（文献
44）を用いて上述の有効領域γ鎖ペプチドへのKLHカッ
プルペプチドで免疫化した。２週間間隔での４回の免疫
処理後、脾臓細胞をD3−X63−Ag8U1骨髄腫細胞と融合し
た。陽性ハイブリードマクローンをスクリーニングし、
文献（48）に記載の酵素免疫検定法（EIA）により同定
した。 純化タンパク質からのδポリペプチドのDNA配列の単離 TCRδ遺伝子のDNA配列は、単離され得、また文献（4
9,50）に記載のごとくTCRβ遺伝子を単離するのに利用
される方法により決定され得る。簡単に言うと、TCRδ
遺伝子のアミノ酸配列は、以下に記載されるTCRδ遺伝
子の単離に従って決定され得る。アミノ酸配列を決定し
た後、短い合成DNA配列は、市販DNAシンセサイザー［ア
プライド・バイオシステムズ、インコーポレーテッド、
フォースター・シティー，カリフォルニイ州（Applied
Biosystems,Inc.,Foster City,CA）］を用いて調製され
る。該合成DNA配列は、TCRポリペプチド含有細胞系のcD
NAライブラリーからのDNAの完全配列の単離用プローブ
として用いられる。タンパク質の腫瘍構造は、ついで決
定される（文献51）。 δポリペプチドに対するおよびγ、δ複合体に対するモ
ノクロナール抗体の調製 δポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、標準
方法（文献47,50）により発生され得る。TCRδポリペプ
チドから誘導されるペプチドは、上述の方法により決定
された核酸配列から調製され得る。免疫処置に有効なこ
のようなペプチドを選択する方法は、詳細に記載されて
いる（文献55,56,57）。 γ，δ複合体に対して誘導されるモノクローナル抗体
は、刊行物記載方法（文献47、50）に従って調製され得
る。γ，δ複合体は、上述のＴ細胞系から単離され得、
また先の刊行物の記載の方法（文献28）に記載のごとく
BALB/cマウスを免疫化するのに用いられ得る。別に、BA
LB/cマウスは、細胞系、例えばIDP1細胞系またはIDP2細
胞系で免疫化され得る。 ハイブリドーマ細胞系の融合、発生および保守管理方
法は、広く刊行物に記載され当業者に公知である。特異
TCRγ，δ細胞系に対して誘導されるが他のＴ細胞系と
架橋反応（cross react）しないモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞は、選択され回収される。 ヒト腫瘍および末梢血リンパ球からのTCRγ，δおよびT
3の免疫沈降 生育可能なリンパ球をフィコールーハイパーク密度傾
斜遠心分離により単離し、２×107細胞を文献（28）に
記載のごとくラクトペルオキシターゼ技術によって放射
性ヨウ素標識化した。標識化細胞は、2mMフェニルメチ
ルスルフォニルフルオロイド（PMSF）および8mMヨード
アセタミド（IAA）を含有するTCR−T3会合を保護する
（文献64）0.3％３−［（３−コラミドプロピル）ジメ
チルアンモニノ］−１−プロパン−スルフォネート（CH
APS）とともに5mlのTBS（10mlトリスpH8、140mM Nac
l）に溶解された。文献（12）に記載の固定スタフィロ
コッカスアウレウス（Staphylococcus aureus）コーワ
ンＩ（Cowan I）（SACI）を用いて免疫沈降を行い、免
疫複合体を0.1％トリトンＸ−100（TX−100）含有TBS中
５度洗浄した。還元サンプルを2mMジチオスレイトール
（DTT）中煮沸し、全サンプルをSDS−PAGEによる検定の
前、10mA IAA中23℃にて10分間培養した。抗Ｃγ血清
を用いた免疫沈降は、IAAを除去するために透析された
１％TX−100溶解産物で行なわれ、ついで３分間煮沸し
ながら3mM DTT含有ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）10
分の１の容量の添加により変性された。４容量の30mM
IAA含有TBS中の1.5％TX−100による部分再生の後、抗Ｃ
γ血清またはNRSを添加し、免疫沈降物をSDS−PAGEによ
る分析の前、0.5％ TX−100、0.5％デオキシコレート
および0.05％SDS含有TBS中で洗浄した。ラット抗マウス
α鎖特異mAb187.1（15Mg）を第２抗体として加えて、Ig
GImAbβF1、UCHTおよびP3の結合タンパク質Ａを産生し
た（文献53）。 PBL C1から単離されたRNAのノーザンブロット検定 １レーンにつき約1.5MgRNAを載せ、プローブを同様な
特異活性にまで、標識化し、同一オートラジオグラフィ
暴露を与えた。RNAサイズは、TCRBおよびTCRγ転写体に
関する先に記載された長さ（文献36、４）に基づいて決
定された。 TCRγポリペプチドおよび前駆体の２次元ゲル分析 ラクトペルオキシターゼでの放射性ヨード化の後、リ
ンパ球をリン酸緩衝食塩水（PBS）1mg/mlウシ血清アル
ブミン、1mg/mlグルコース中の100Uのニューラミニター
ゼ［ジブコ（Gibco）で90分間23℃にて処置し、PBS中洗
浄し、ついで0.3％CHAPSに可溶化した。免疫沈降物を第
１図のごとく調製し、NEPHGE（電荷分離）をpH3.5〜10
アンフォリン（LKB,スウェーデン）、を用いるあるいは
pH3.5〜10,4〜6,9〜11アンフォリン（2:15.5:1.5）を用
いたIEFを用いて、つづいて文献（12）に記載のごとく
サイズ分離のため10.5％ SDS−PAGEゲルを用いて行っ
た。NEPHGEは、酸性末端にヨウ素化IFFサンプルを適用
して行われ（A,B）、一方IEFC C,D）は、40Vにて20時
間他の（塩基性）末端にサンプルを適用して行った。ブ
ラケットは、T3会合種を含む。 細胞（２×107）は、10％胎児ウシ血清で補足された4
mlメチオニン遊離RPMI1640中37℃にて１時間予備培養さ
れた。35S−メチオニンを250μCi/mlまで加え、培養を3
7℃で１時間続けた。細胞を回収、洗浄し、１％SDS、10
mMトリスHCl（pH8.0）、0.1mM PMSFおよび10mM IAAの
煮沸溶液0.4に溶解した。溶解産生物を2.5％ ノニデッ
ドP40（Nonidet−P40）、１％ゼラチン、10mlトリス−H
Cl（pH8）2mlおよび1mg/ml DNアーゼ、0.5mg/ml RNア
ーゼ、0.5Mトリス−HCl（pH7）、50mM MgCl20.2mlで希
釈し、０℃にて２〜４時間培養した。ペレット不溶性片
まで12,000×ｇで15分間遠心分離後、１％ゼラチンで予
め沈降されたタンパク質Ａセファロースを用い、ついで
洗浄し抗γ血清での免疫沈降を文献（65）に記載のごと
く行った。免疫吸収剤からの溶離およびエンド−Ｈ［ミ
レス、サンヘンティフィック、ナパービレ、イリノイ州
（Miles Scientific,Naperville,IL）］での処置は、文
献（65）に記載されている。サンプルは、第１次元にNE
PHGEおよび第２次元に10％SDS−PAGEを利用する２次元
ゲル電気泳動、ひきつづきフルオログラフィーにより抗
血清で分析した（文献66）。 TCRγポリペプチドを発現するＴ細胞におけるγおよび
βおよび遺伝子の再配列 ゲノムDNAは、記載のごとく（BamH IまたはEcoR I）
単離し、0.7％アガロース（BamH I消化）または0.9％ア
ガロース（EcoR I消化）上にサイズ分画し、ついで文献
（67）に記載のごとくくニトロセルロースに形質転換し
た。フィターをニック翻訳された32P−標識化0.8Kb Hi
nd III−EcoR I Ｊγ1,3プローブ（文献20）または1.1
Kb EcoR I−Hind III Cβ２プローブ（文献68）にハイ
ブリダイゼーションした。強化スクリーンでのオートラ
ジオグラフィーの前、フィルターを２％SSCおよび0.1％
SDS中で洗浄し、つづいて55℃で0.2％SSCおよび0.1％SD
S中で洗浄した。 IDP2およびPBL C1細胞による細胞分解 細胞溶解検定を文献（34）に記載のごとく51Cr−標識
化、回収および％特異放出の計算により丸底96ウェル組
織培養プレートにて行った。IDP2およびPBLC1細胞をUCH
T1（1:300稀釈度）（＋抗T3）で０℃にて30分間予め培
養し、３回洗浄するか、あるいは模擬培養し、標識化タ
ーゲット細胞とお互い取り代えた。抗HLAクラスＩおよ
びクラスII mAb抗T3mAbを51CR標識化MOLT4細胞含有ウェ
ルに０℃にて30分間配置し、ついでIDP2細胞を40:1のE:
T比で加えた。全サンプルを３回検定し、各実験を少な
くとも３回行った。各々の代表的実験の１つを第９図に
示す。 実験結果 多数のヒトTCRα，β６を認識するマウス基質抗血清
は、先に報告されている（文献28）。つづいてヒトβ鎖
における割り当てられた決定因子と反応性であるマウス
モノクローナル抗体、消化基質１（βF1）が得られた
（文献46）。βF1モノクローナル抗体は、多数のT3陽性
（T3+）ヒト末梢血リンパ球（PBL）と反応し、またα，
βＴ細胞レセプターを有し、かつT3糖タンパクを発現す
る試験された全ヒトＴ細胞系からのTCRα，βヘテロダ
イマーを免疫沈降できる。このモノクローナル抗体を用
いたＴ細胞系のパネルからの免疫沈降は、この反応性並
びに異なるレセプターからのTCRαおよびTCRβサブユニ
ットの異質性を示す（第１図）。基質抗血清（文献28）
と同様に、このモノクローナル抗体は、生体Ｔ細胞の表
面を染色しないが、70％エタノールでのリンパ球血漿膜
の部分解離（solution）後、膜および細胞形質Ｔ細胞レ
セプターの両者と特異的に反応するであろう。フルオレ
セイン抗T3モノクローナル抗体およびビオチニル−β−
F1モノクローナル抗体つづいてアジビンでのヒトPBLSの
２重染色は、βF1モノクローナル抗体が95〜97％の末梢
血T3+リンパ球を認識することを明らかにする。しかし
ながら、これはβF1陰性（βF1-）さらにはT3+である小
個体群のＴ細胞を明らかに限定する（第1C図）。 T3抗体を認識することが初期に考えられたW31と命令
されたされた第２基質モノクローナル抗体（文献29）
は、最近、TCRα，βの共通のエピトープと反応するこ
とが示されている（文献30）。抗T3モノクローナル抗体
（OKT・３）およびWT31での二重染色は、各該モノクロ
ーナル抗体が他の結合をクロスブロックすることを明ら
かにしたが、１色螢光は,WT31が抗T3モノクローナル抗
体がするよりも末梢血において１〜３％少ない細胞を代
表的に認識することを示した。WT31モノクローナル抗体
は、Ｔ細胞の表面に効率的に結合し（FACS分析等参
照）、また放射性標識化洗浄溶解産物からは非効率的で
あるがTCRα，βを免疫沈降できる（文献30）（第1B
図、レーン３）。従って、βF1モノクローナル抗体およ
びWT31モノクローナル抗体は、少フラクションのヒト末
梢血T3+細胞を除いて全てを認識し、またT3+であるがTC
Rα，β分子に対するこれらの基質モノクローナル抗体
の両方と未反応性である亜個体群を決定するらしい。モ
ノクローナル抗体βF1と未反応性であるT3+リンパ球も
またモノクローナル抗体WT31と未反応性であるという証
拠を以下に示す。WT31は、主にFACS分析に用いられてい
て、またβF1は主に免疫沈降研究に用いられていた。正
常成人PBLからのWT31-T3+個体群の生長に対する成果
は、WT31+T3+リンパ球がマイトジェン刺激に伴うWT31-T
3+細胞が通常生長しすぎるので困難であることが判明し
た。しかしながら、免疫不全症患者のPBLからのWT31-T3
+個体群の生長は、良好であった。免疫不全症患者１（I
DP1）は、裸リンパ球症候群（bare lympocyte syndrom
e）に病み、リンパ系細胞におけるるクラスII MHC抗原
を欠いており（文献31,32）、一方免疫不全症患者２（I
DP）は、外胚芽形成異常症候群に病み、マイトジェンに
対する少ない生体内Ｔ細胞繁殖性応答を示した。 同種抗原でのIDP1からのPBLの活性化およびインター
ロイキン−２（IL−２）活性含有条件地における繁殖
後、得られた細胞系は、約50％WT31+T3+および50％WT31
-T3+であることが観察された（下記第１表参照、細胞系
１）。ひきつづきこの細胞の選別によりWT31+T3+細胞お
よびWT31-T3+細胞の均質個体群を得た（下記第１表参
照、各々細胞系２および３）。 細胞系はまたIDP2からも得られた。IDP2からの新鮮PB
Lは、63％のPBLがT3+であり、１〜２％少ない細胞（61
％）が代表的な正常PBLであるWT31+であったことを明ら
かにした（第１表，細胞系４）。フィトヘムアグルチニ
ン（PHA）または同種抗原でのこれらIDP2PBLの活性化お
よび条件培地での生体外繁殖はいくつかの細胞系となっ
た。該細胞系としては、均質WT31+T3+細胞系（第１表、
細胞系５）、均質WT31-T3+細胞系（第１表，細胞系６）
および第３の場合、88％WT31-T3+（12％不純WT31+T3+細
胞（第１表細胞系）であった。WT31-T3+固体群は、T8+
およびT4-T8-細胞の両方を含んだ（第１表、細胞系3,6
および７）。さらにに表現型分析は、この個体群がT11+
であったがLeu7、Leu11およびOKM1等の天然キラー細胞
マーカーおよび未熟胸腺細胞マーカーT6に対しては陰性
であったことを現わした。 βF1モノクローナル抗体は、125I標識化WT31+T3+IDP1
リンパ球の表面上のヘテロダーマー構造を免疫化学的に
決定したが（第2A図、レーン５）、この同一個体からの
WT31-T3+個体群上の同様なタンパク質を確認できなかっ
た（第2B図、レーン11）。IDP2細胞系の同様な分析は、
WT31+T3+細胞での12％染色と一致する88％WT31-T3+細胞
系７上のTCRα，βのトレースを表わした（第2B図、レ
ーン２）。従って、FACS分析におけるWT31-T3+モノクロ
ーナル抗体との細胞表面反応性の欠乏によって、同定さ
れたWT31-T3+細胞はまた、免疫沈降においてTCRα，β
の欠乏によって決定されたとおりβF1-であった。全WT3
1+T3+およびWT31-T3+細胞系は、FACS分での免疫沈降に
より同様な量のT3を発現した（第2A図レーン３および9;
第2C図、レーン２および４）。しかしながら、WT31-βF
1-T3+リンパ球に見い出されたT3分子は、SDS−PAGEによ
りWT31+βF1+T3+細胞に見い出されたT3分子とは同一で
なかった。１次元（第2C図）および２次元ゲル分析は、
T3の相異が異なるSDS−PAGE移動度を再限的に示したラ
イトT3サブユニットに制限されたことを示した（第2C
図、矢印）。 WT31-βF1-T3+個体群がTCRα，β分子を欠いたか、ま
たは別に、これらのモノクローナル抗体と反応しそこな
ったTCRα，βを発現したかどうかを決定するために、T
CRαおよびβタンパク質をコード化するmRNAの存在が研
究された。TCRα，βおよびTCRγをコード化する32P標
識化cDNAクローンは、WT31-βF1-T3+およびWT31+βF1+T
3+IDP2細胞系からのおよびTCRα,TCRβおよびTCRγに対
するnRNAを含有することが知られたHPB−MLTからの全細
胞RNAを含有するノーザンブロットを詳しく調べるのに
用いられた。TCRαまたはTCRβ、mRAN転写体は、WT31-
βF1-T3+IDP2細胞系６からのRNAにおいては検出できな
かったが（第3A図α−プローブ、レーン1;またはβ−プ
ローブ，レーン１）、両者の発現は、HPB−MLTからのRN
Aにおいて明らかに検出可能であった（第３図、α−プ
ローブ、レーン2;およびβ−プローブ、レーン２）。明
らかに、TCRγmRNAは、HPB−MLTにおけるレベルに匹敵
するレベルでWT31-T3+細胞に存在した（第３図，γ−プ
ローブ，レーン１および２）。従って、WT31-βF1-T3+
リンパ球は、TCRαおよびβmRNAを欠いた。ほとんどWT3
1-T3+である細胞系に対する次の実験は、これらの結果
を確認した。例えば、IDP2細胞系７（88％WT31-T3+）に
対して行なわれ、IDP2細胞系５（WT31+T3+）並びにHPB
−MLT細胞と比較されたノーザンブロット分析は、ほん
のトレースの85％WT31-T3+細胞（12％WT31-T3+細胞での
汚染と一致する）におけるTCRαまたはTCRβmRNAを現わ
した（第3B図、各プローブに対するレーン２）。さらに
検出できた多数のβ転写体は、1.0であり1.3Kbでなくま
たおそらく機能的でなかった（文献35）。これに対し
て、IDP2細胞系５（WT31+T3+）は、HBP−MLTに匹敵する
RNA種の両方のレベルを発現した（第3B図、各プローブ
に対するレーン）。しかしながら、第3A図に示すWT31-T
3+細胞系と同様に、WT31-T3+およびWT31+T3+細胞系の両
者は、HLB−MLTに匹敵するTCRγRNAレベルを示した。従
って、WT31-T3+細胞は、αおよびβＴ細胞レセプターmR
NA（ノーザンブロット検定）およびαおよびβＴ細胞レ
セプタータンパク質（免疫沈降およびFACS分析）を欠い
た。Ｔαタンパク質発現に一致するが、WT31-T3+におけ
るＴγmRNAの存在は、正常サイズのＴγmRNAを発現する
多くのヒト細胞系が不完全Ｖ−Ｊ結合のため構造外であ
る十分な長さの転写体を発現し得るので（文献36）、強
力な証拠とならなかった。 TCRα，β分子に類似するタンパク質がWT31-βF1-T3+
細胞上に存在するかどうかを決定するために、化学的架
橋技術が利用された。この方法は、T3糖タンパク質との
TCRα，β分子の物理的会合を直接示すのに用いられて
いる（文献12）。２官能性、分割性指示薬、ジチオビス
サクシミジルプロピオネート（DSP）が、生育可能Ｔリ
ンパ球の125I標識化表面タンパク質を架橋するのに利用
された。架橋後、リンパ球は、非イオン性洗浄剤に可溶
化され、抗T3モノクローナル抗体で免疫沈降された。期
待されたとおり、WT31+βF1+T3+リンパ球は、TCRαおよ
びβ鎖がT3と架橋されたことを表わした。例えば、TCR
α，β分子およびT3は、架橋IDP1細胞系２（WT31+T3+）
からの抗T3またはβF1モノクローナル抗体中に見い出さ
れた。（第2A図、レーン４および６）。しかしながら、
βF1モノクローナル抗体との反応性の欠如およびTCRα
またはTCRβmRNAの欠如にもかかわらず、IDP1細胞系３
（WT31-T3+）およびIDP2細胞系７（88％WT31-T3+）は、
T3と特異的に架橋した２つのタンパク質（Mr55,000およ
び40,000）を両方とも発現した（第2A図，レーン10;第2
B図，レーン６）。これらT3会合分子の移動度は、WT31+
T3+細胞系からのTCRαおよびβ鎖からのものと明らかに
異なった（第2A図、レーン４および10;または第2B図レ
ーン５および６と比較対照）。 IDP2細胞系７（88％WT31-T3+）が（第2B図、レーン
２）に示された弱いβF1免疫沈降物を示す12％のWT31+T
3+を含有したので、これらの細胞からの溶解産物は、β
F1モノクローナル抗体を用いてTCRα，βタンパク質を
予め除いた。予め除いた後、残基βF1反応性物質は、検
出されなかった（第2B図、レーン８および11）。架橋細
胞からの溶解産物を予め除かれたβF1-は、抗T3モノク
ローナル抗体で免疫沈降され、Mr55,000および40,00サ
ブユニットがさらに検出された（第2B図、レーン12）。 これらの細胞溶解産物が検出可能レベルのTCRαおよ
びTCRβmRNAを示すので、該細胞表面においてT3と特異
的に架橋されたことが見い出された分子は、既知TCRα
またはTCRβ遺伝子によってコード化されたタンパク質
を与えることができない。 再配列ヒトTCRγ遺伝式を表わすcDNAクローンは、予
想分子量40,000ダルトンでポリペプチドをコード化する
であろう（文献36）。しかしながら、Ｎ結合グルコシル
化部位を表わさないマウスTCRγ遺伝子（文献15）とは
異なって、ヒトTCRγ遺伝子は、Ｎ結合グリコシル化に
対する５つの部位を表わす。すなわち、そのうち４つ
は、一定領域に位置する（文献36）。TCRγタンパク質
は、今まで単離されていないので、これらの可能部位の
いくつが利用され得るかは、わからない。しかしなが
ら、十分にグリコシル化されたヒトTCRγタンパク質
は、Mr約55,000を有し得る。WT31-βF1-T3+IDP1およびI
DP2細胞系上同定された非α−非βT3会合サブユニット
の重鎖は、55,000ダルトンのSDSPAGEにおける相体移動
度を示す（第2A図および第2B図）。 このT3会合重鎖が血清学的にTCRαタンパク質と架橋
またはTCRγタンパク質と同一であるかどうかを決定す
るために、抗血清にヒトcDNAクローンから推定されたTC
Rγアミノ酸配列（文献36）の配列： RTKSVTRQTGSSAEITC （有効領域からの残基５〜12の17アミノ酸範囲を示
す；抗Ｖγペプチド血清）を有する合成ペプチドおよび
配列： DKQLDADVSPKPTIFLDSIA （一定領域からの残基117〜136の20アミノ酸範囲を示
す；抗Ｃγペプチド血清）を有する合成ペプチドを与え
る。抗Ｃγペプチド血清および抗Ｖγペプチド血清の両
者は、125I−標識化されたWT31-βF1-T3+細胞の変性溶
解産物からMr55,000の分子を免疫沈降した（第4A図、レ
ーン２および４）。該分子は、非機能的TCRγmRNAのみ
を発現する125I標識化HPB−MLT細胞の溶解産物から免疫
沈降されなかった（文献36）。 抗ＣγおよびおよびＶγペプチド血清によって免疫沈
降された55,000ダルトン分子が実際にT3に架橋された重
鎖サブユニットであることを示すために、補足的実験を
行った（第4B図）。WT31-βF1-T3+細胞からのDSP架橋溶
解産物のサンプルを最初に抗T3モノクローナルで免疫沈
降し、再びT3と会合されたMr55,000および40,000サブユ
ニットの存在を示した（第4B図、レーン２）。平行し
て、架橋溶解産生物の別のアリコートを抗T3モノクロー
ナル抗体で免疫沈降し、ついで免疫沈降T3架橋ポリペプ
チドをDSP架橋を切断するために変成および還元条件下
免疫吸収剤からら溶離した。この溶離物をついで抗Ｃγ
ペプチド血清と再び沈降した。T3と架橋したMr55,000サ
ブユニットを抗γペプチド血清により再び沈降し（第4B
図、レーン５）、これらの２つのアプローチにより特定
されたMr55,000サブユニットが同一であることを示し
た。 抗T3mAbを用いた（T3からのTCRサブユニットが解離し
ない条件で、第５図参照）表面ヨウ素化IDP2リンパ球の
溶解産物からの免疫沈降は、T3サブユニット（第5A図）
に加えて２つの種（55Kおよび40K）をもたらした。この
結果は、化学的架橋を用いた先に報告されたものと一致
した。55K種は、抗Ｃγおよび抗Ｖγペプチド血清と特
異的に反応することが見い出された。40Kポリペプチド
は、該抗γペプチド血清と反応性がなく、従って非TCR
α，βまたはγサブユニット、すなわちδを表わすよう
である。これらのサブユニットがTCRαおよびβサブユ
ニットのように共有結合されているかどうかを決定する
ためにT3免疫共沈ポリペプチドを還元および非還元下、
調べた。非還元条件下ヘテロダイマージスルフィド結合
形態にて存在するTCRα，βサブユニットと明らかに対
照して、IDP2細胞系上のTCRγおよびδサブユニット
は、共有結合されいなかった（第5A図）。非還元条件下
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）におけ
る相対移動の少しの増加が拡散、重グリコシル化（下記
参照）TCRγに関して観察されたのに対して、移動度の
劇的な増加がδサブユニットに関して観察され、これは
１以上の内部鎖ジスルフィドループの存在を提唱する
（レーン２および４の矢印における種参照）。 ウェイスら（Weiss,et al）は、PEER細胞系がTCRγmR
NAの発現を欠くがT3−会合50〜60Kポリペプチドを発現
できるので、TCRγポリペプチドを発現できることを提
案した（文献69）。さらなる実験において、この細胞系
は、TCRβ鎖、βF1上の基質決定因子を認識するmAbとの
反応性に欠け（第5A図）、また強くヨウ素化された38K
ポリペプチドを発現することが見い出された。55K〜60K
ポリペブチドは、抗Ｃγペプチド血清と特異的に免疫沈
降され、従ってTCRγタンパク質の別の例を示すようだ
（第5A図）。PEER上のTCRγおよびδポリペプチドは、I
DP2細胞系上のものと同様なサイズであり、同様にジス
ルフィド結合されていない。IDP2細胞上のδサブユニッ
トと同様に、PEER上の複製分子は、還元および非還元条
件下比較された際（レーン７および８の矢印における種
比較対照）、SDS−PEGE移動度において著しいシフトを
受けた。従って、IDP2およびPEER細胞系は、同様のタイ
プのTCRγおよびδサブユニットが共有結合されていな
いTCRγ，δT3複合体を発現するらしい。 本発明者らは、この第２抗体もまた正常末梢血におけ
るＴ細胞個体群の成分として発現するかどうかを決定し
ようとした。mAbβF1およびOKT ３でのヒト末梢血リン
パ球（PBL）の染色を比較する２色サイトフルオログラ
フ分析は、TCRα、β陰性であるらしい２〜５％のT3+PB
Lを示す分離個体群を示した。このリンパ球個体群を検
査するために、正常成人PBLをmABWT31での染色後、サイ
トフルオログラフ細胞選別した。未染色PBLを単離し、
放射性化自系飼育細胞およびフィトヘムアグルチニン
（PHA−Ｐ）の添加を２週間受けるIL−２含有条件培地
中生体外培養した。細胞系誘導WT31-PBL-系を0.5細胞ウ
ェルでプレートすることでの希釈を制限することによっ
てクローンし、クローン細胞をポリクローナル細胞系と
して培養した。いくつかのこのような末梢血誘導Ｔ細胞
クローンが得られ、PBLクローン１（PBL C1）を詳細に
研究した。サイトフルオログラフ分析により、このクロ
ーンは、T3+T11-であったが、T4-T8-およびWT31-でなか
った。PBL C1からのTCRα，βおよびγmRNAの発現は、
ノーザンブロット分析により決定された（第６図）。WT
31+βF1+T細胞腫瘍HPB−MLTと比較すると、ほんの低レ
ベルのTCRαおよびβmRNAが検出された。これに対し
て、豊富なTCRγmRNAが示され（第６図、γプロー
ブ）；興味深いことに、TCRγmRNAは、HPB−MLTにおよ
びTCRγ発現IDP2細胞系に見い出された1.6キロベース
（Kb）メッセージよりわずかに少なかった（第６図）。
これらの観察と一致して、WT31反応性は、サイトフルオ
ログラフ分析において検出されず（データ示さず）、ま
たほんの限られたレベルのTCRαおよびβポリペプチド
がmAbβF1を用いた免疫沈降により見い出された（第5B
図、レーン2,5）。これに対して、PBLC1において検出さ
れるトレースレベルのTCRαおよびβタンパク質は、こ
のクローンの培養に用いられる放射化自系飼育細胞での
１〜２％染色によって説明される。２つの豊富な鎖（40
Kおよび36K）は、SDS−PAGE分析において還元条件下T3
と会合されることが観察された（第5B図、レーン３）、
抗Ｃγ血清は、還元および変性PBLC1溶解産物からこれ
らのポリペプチドの両方を免疫沈降した（第5B図、レー
ン８）。 これら40Kおよび36KTCRγポリペプチドがジスルフィ
ド結合ダイマーの一部かどうかを決定するために、抗T3
との免疫共沈が非還元条件下行われた。Mr（70K）の単
一バンドが観察され、これは、IDP2およびPEER細胞と異
なり、PBLC1がジスルフィド結合ダイマー性複合体の部
分であるT3会合TCRγ遺伝子産生物を発現することを示
す。 TCRγパートナー（δ）は、IDP2およびPEER細胞上の
このレセプター複合体は非ジスルフィド結合形態得に存
在したので、本発明物らは、PBLC1上のレセプターのジ
スルフィド結合形態がホモまたはヘテロダイマーからな
るかどうかを検査した。免疫沈降物は、２次元ゲル電気
泳動（非平衡pHゲル電気泳動（NEPHGE）につづいてSDS
−PAGE;第7A図、第7B図）により検定された。還元条件
下、両方のTCRγ種（40Kおよび36K）は、同一帯電量を
有することが見い出され、またシアリル化糖タンパクに
関して代表的な不均質性を示した。これらの特徴は、同
一アミノ酸骨組みを有するTCRγペプチドの特異的にグ
ルコシル化された形態に関して先に記載されたもの同様
である。従って、これらの種は、同一TCRγペプチドの
特異的にグリコシル化された形態を示すであろう。この
結果は、PBLC1において単一前駆体のみを現わす代謝性
パレス標識の結果（下記）によって支持される。 これらのTCRγ種の１つおよび両方からなるジスルフ
ィド結合ダイマーは、NEPHGEまたは平衡等電点電気泳動
（IEF）により分析された際、２つの成分のいずれか一
つのみと同様な電気泳動位置を有するべきである。しか
しTCRγからなるヘテロダイマーおよび個々のポリペプ
チドは、異なる帯電量および電気泳動位置を有するかも
しれない。ジスルフィド結合ダイマーの位置は、それ
故、非還元条件下NEPHGEを行い、つづいて非還元条件下
SDS−PAGEを行うことによって検査された（第7B図）。
著しく、ジスルフィド結合ダイマーの位置は、還元条件
下検査されたTCRγポリペプチドのものより実質的によ
り酸性であった（第7A図における40Kおよび36K種を第7B
図における70K種と比較参照のこと）。この結果は、TCR
γ種が別個のNEPHGE移動度のポリペプチドに共有結合さ
れたことを提案する。従って、TCRγパートナーが（125
Iで不十分に標識化されたかあるはここに用いられる電
気泳動系において分解されなかったかのいずれかのた
め）直接可視化され得なかったけれど、PBLC1上のTCRγ
ポリペプチドは、ジスルフィドヘテロダイマーの一部と
して発現されたらしい。平衡IEF（NEPHGEよりむしろ）
を用いた実験は、この観察を確認した（第3D図）。 ジスルフィド結合と非結合形態とのさらなる識別は、
成熟TCRγ糖タンパクのサイズであった（IDP2およびPEE
R上の50〜60K対PBLC1上の36K）。このラジカルサイズ相
異のいくつが特異グリコシレーションによるのかおよび
いくつが異なるペプチド骨組みによるのか評価するため
に、TCRγペプチドは、35S−メチオニンでパルス標識化
された細胞において分析された。還元条件下および変性
条件下における可溶化の後、溶解産物は、抗Ｃγ血清で
免疫沈降され、そし２次元ゲル電気泳動により検査され
た（第7E〜Ｈ図）。免疫沈降物は、パルス標識化物質よ
り未熟高マンノースグリカン類を除くためエンドグリコ
シダーゼＨ（endo−Ｈ）で処置されるかまたは模擬処置
された。同一NEPHGE移動度のTCRγポリペプチド（48Kお
よび43K）は、IDP2細胞系により合成された。エンド−
Ｈでの処置は、40K形態まで両形態を減じ、これは、46K
および43K形態が、異なる数の炭水化物を運び、また単
一TCRγポリペプチド骨組み（40K）が、IDP2によって合
成されることを提案する（第7E、7E図）。これに対し
て、より塩基性の38Kグリコシル化形態は、エンド−Ｈ
消化が非ギリコシル化31K骨組みを示した後、PBLC1によ
って合成される（第7G,H図）。従って、本明細書に特徴
ずけられた非ジスルフィド結合（IDP2）およびジスルフ
ィド結合PBLC1）形態上のTCRγポリペプチドは、ラジカ
ル的に相異する骨組みサイズを示す（各々、40Kおよび3
1K）。パルス標識することにより観察されるTCRγペプ
チドが細胞表面ヨウ素化により見い出されるものと相異
する分子量のものであるという事実は、これらの運ぶ相
異する炭水化物すなわち高マンノース対複合体から生じ
る。 本発明者らは、ついでジスルフィド結合および非共有
結合の両者が正常成人末梢血に生ずるかどうかを決定し
ようとした。それ故、PBLC1がクローンされたポリクロ
ーナル末梢血細胞系（WT31-PBL系）を非常に詳細に研究
した。WT31-PBL系は、均質にT3+T11+であり５％汚染WT3
1+細胞とともに95％WT31-T4-T8-を含有した。ヨウ素化
可溶化細胞からの免疫沈降により検査した際、弱いが検
出可能なmAbβＦとの反応性が期待された５％TCRα、β
陽性リンパ球と一致して観察された（第5B図、レーン10
還元および13非還元）。これに対して、抗T3mAbは、還
元条件下多量のT3および35〜45Kの会合ポリペプチドの
両者を免疫沈降した（第5B図、レーン11）。これらの分
画のなにがジスルフィド結合したのかを決定するため
に、T3免疫沈降物が非還元条件下検査された（第5B図、
レーン14）。T3会合ポリペプチドの半分未満がジスルフ
ィド結合された。この物質は、レーン14の白抜き矢印の
上に位置されたジスルフィド結合α，βペプチド（サイ
ズは、βF1沈降物により同定された、レーン13）および
より小さいサイズのジスルフィド結合TCRγ（白抜き矢
印，レーン14）を含有した。著しく、多数のT3会合種
は、ジスルフィド結合されず、還元および非還元の両方
の条件下、同一移動度で移動された。特に、これら非結
合種の分画は、IDP2およびPEER細胞上のTCRδと同様にS
DS−PAGE移動度の著しい増加を示した（第5B図、レーン
14、黒塗り矢印参照）。抗Ｃγ血清との反応性は、WT31
-PBL系上に発現されたT3と会合された標識化物質のほと
んどがTCRγ遺伝子産生物であることを確認した（レー
ン16）。 従って、TCRγ遺伝子のタンパク質産生物は、ジスル
フイド結合および未結合分子形態の両方で成人末梢血に
おけるT3+リンパ球上に生じた。また、TCRγの非ジスル
フィド結合形態は、55〜60Kグリコシル化（IDP2およびP
EER）または35〜45グルコシル化（胸腺Ｔ細胞クローンC
11（文献70）およびWT31-PBL系）種にさらに分割され得
る。 TCRγおよびβ遺伝子再配列は、その細胞表面上にTCR
γポリペプチドを発現することが知られているＴ細胞に
おいて検査された。サザンブロッド分析は、0.8Kb Eco
R I−Hind IIIヒトＪγ1,3プローブ［クェアーターモス
ら（Quertermous et al.）（文献71）による学名］を用
いて行なわれた。このプローブは、ゲノムDNAのBamH I
消火物における23Kbおよび12Kbの胚子系（germline）バ
ンドを検出する。23Kbバンドは、Cr1を包含し、12Kbバ
ンドは、Cr2をコード化する。このプローブを用いてIDP
1,PBLC1およびPBLC2（WT31-PBL系から誘導されたもの
も）、TCRγ遺伝子の再配列を示した（PBLC1およびPBLC
2の両者、同一再配列を示した；第8A図）。 サザンブロット分析におけるＪγ1,3プローおよびEco
R I消化ゲノムDNAを用いてPBLにおける７つの再配列が
検出されている（文献20）。これら７つの再配列のうち
６（I,II,III,IV,VIIおよびＶ）をPBL胎児胸腺および新
生児胸腺ゲノムDNAに示した（第8B図；矢印および再配
列番号参照）。４つの再配列（I,II,IV,およびVII）
は、TCRγポリペプチドを発現する末梢血リンパ球によ
って用いられないかまたはこれを示す細胞はWT31−PBL
系に用いられる培養条件下に失われた。それにもかかわ
らず、WT31-PBL系DNAは、少なくともこれらの再配列の
うち３つ（III,IVおよびVI）を現わし（第8B図、レーン
３）、またこれら同一再配列は、IDP2、PBLC1およびPBL
C2によって用いられ（EcoR I消化物に関してデータを示
さず）、またこれらの再配列の全てを胎児胸腺に示し
た。 TCRβもまた、IDP2、PBLC1およびPBLC2細胞において
再配列した。1.1KbEcoR I−Hind III Cβ２プローブ
は、ゲノムDNAのBam I消化物におけるＣβ一定領域の両
方を包含する20Kbの胚系バンドを検出する（文献68）。
IDP2に関する１つの優位なTCRβ再配列およびPBLC1およ
びPBLC2に関する２つの同一な再配列が観察された（第8
C図）。これは、TCRβ再配列がこれらの細胞系に関する
免疫沈降ならびにノーザンブロット分析に基づいて非保
護的であることが推定される。PBLC1およびPBLC2の両者
が同一のTCRαおよびβ再配列を有するので、これらは
クローン性でありまたWT31-PBL系内の同一細胞から誘導
されるらしい。 TCRγ発現細胞が成人抹消血に見い出されたので、機
能的研究を行いこれがエフェクター能を有するかどうか
を決定した。IDP2およびPBLC1がその51Cr放出検定にお
いてターゲット細胞を溶解する能力に関して検査された
際、これらが自発性エフェクター細胞毒能力を有するこ
とを証明した（第９図）。IDP2細胞は、多数の天然キラ
ー（NK）ターゲットまたは同種系PBLのPHA芽細胞を溶解
しないが、これらは、51Cr標識化MOLT−４細胞を選択的
に溶解することができた（第9A図上部）。６つの同様な
検定のうち２つにおいて、K562ターゲットの弱い溶解
（10〜15％51Cr放出）もまた観察された。MOLT−４細胞
の溶解は、本発明者らがこれらmAbがMHCクラスＩおよび
クラスII同種特異性CTLにより殺生を閉塞することを先
に見い出したが［文献（34）］、単系性クラスＩ（W6/3
2抗HLA−A,B,C,4Eおよび131）またはクラスII（LB3.1お
よび抗Lev10）決定因子に対して導かれる種々のmAbによ
って禁止されなかった（第9B図）。これらのデータは、
MOLT−４細胞の溶解がMHCクラスＩおよびIIが独自であ
ることを提唱する。抗T3mAbのみがMOLT−４細胞の特異
性溶解を部分的にブロックした（第9B図）。一方抗T3mA
bのIDP2への予備結合によって誘発した際、胸腺誘導C I
I7に関して先に報告されているとおりIgGに関するFcレ
セプターを発現する51Cr標識化ターゲット細胞（例え
ば、U937）は、効率的に溶解された（第9A図、＋抗T
3）。このような殺生は、凝集ヒトIgGによって完全に禁
止でき、このことはこのT3−媒介溶解がIgGFcレセプタ
ーを経て増強された接合形態により生じたことを確認し
た（データ示さず）。いくつかのターゲット（U937）に
関する抗T3mAbによる溶解の逆接的増量および特異的に
認識されたターゲット（MOLT−４）に関する溶解のブロ
ックは、誘発の競合効果およびT3を介する接合形態の増
加から生じるがTCRを介する立体的ブロック抗原認識に
よるものではない。 PBLC1は、IDP2よりより効率的キラー細胞であること
を立証した。PBLC1は、エフェクター；ターゲット比
（E:T）20:1で検査された際、K562（MHCクラスＩおよび
II陰性）に対して自動性細胞溶解性活性を示した（第9C
図上部）。さらに、PBLはまた、MOLT細胞およびより少
ない範囲でCEM細胞を溶解した。ダウティ（Daudi）、U9
37または同種系または同種異系PBLのいずれの溶解も検
出されなかった。抗T3mAbでの誘発は、PBLC1を誘導し、
U937細胞系を溶解した。さらに、K562の溶解がわずかに
増大されたがMOLT−４の溶解は部分的に禁止された（第
9C図）。合わせると、K562およびMOLT−４等の腫瘍ター
ゲット上のIDP2およびPBLC1の自発性細胞溶解活性およ
びこれらのTCRγリンパ球が非MHCクラスＩおよびクラス
IIであることを示すMHCmAbによる該活性をブロックする
ことの失敗は、細胞毒Ｔリンパ球を制限した。 検討 TCRα、β分子に対する基質抗体、βF1およびWT31
は、２例の免疫不全症患者の未梢血リンパ球からWT31-
βFI-3+リンパ球個体群を固定し、単離するのに用いら
れた。基質モノクローナル抗体での免疫沈降およびTCR
αおよびTCRβ特異性CDNAプローブを用いるノーザンブ
ロット検定の両方の診断基準によって、この表現型のポ
リクローナルヒトＴ細胞系は、TCRα、βmRNA転写体お
よびポリペブチドのいずれも発現しないことが示され
た。とはいっても、解裂性DSP指示薬を用いた化学的架
橋の研究は、これらの細胞上のT3糖タンパク質と会合さ
れたタンパク質複合体の存在を表わした。T3と架橋した
２つのサブユニットの重い方（Mr55,000）は、２つの異
なる抗血清、すなわち一方は、有効領域の部分に相当す
る17アミノ酸合成ペプチドに対して発生し、他方は再配
列TCRγ遺伝子の推定アミノ酸配列の一定領域の一部分
に相当する20アミノ酸合成ペプチドに対して発生する抗
血清によっても免疫沈降された（文献19,36）。従っ
て、Mr55,000タンパク質は、TCRγ遺伝子を再配列する
ことによってコード化されたTCRγタンパク質であった
（文献15）。Mr40,000ポリペプチドは、1/4T3会合タン
パク質消化TCRσである（第2A図および第2B図）。TCRγ
およびδポリペプチドは、前述のＴ細胞レセプター複合
体（TCRα、β）に類似したこれらの細胞（Ｔγ、δ−T
3）上のT3会合ヘテロダイマー性構造を形成する。 本明細書で検査されたTCRγリンパ球は、非MHC制限細
胞溶解合活性を示し、またＴ細胞レセプターが明確に特
徴づけられていない他のT3+NK様細胞と同様であり得る
（文献39、72、73、74）。NK様リンパ球として、これら
は、悪性腫に対する宿主免疫監視において関与し得る。
観察された溶解の特異性は、TCRγの可能性が全てでは
ないがいくつかの抗体特異性認識を媒介したことを提唱
する。抗T3mAbがいくつかのターゲット細胞の非特異性
溶解を誘発できたので、または別に他のターゲットの特
異性溶解をブロックできたので、これらの細胞上のT3分
子は、機能的であるようだ。 実施例２ 物質および方法 培養方法 前述のPEER細胞系をRPMI 1640、10％胎児ウシ血清、
ペニシリン−ストレプトマイシン（Penicillin−strept
omyin）、およびＬ−グルタミンからなる培地中生体外
培養した。培養株は、週に２度飼育され５％CO2で湿さ
れたインキュベータ中37℃で保持された。 TCRγ鎖に対して特異なモノクローナル抗体に関するハ
イプリドーマ産生 BALB/cマウスを0.2mlリン酸緩衝食塩水（PBS）に懸濁
された２×107PEER細胞で腹腔内（I.P）免疫化された。
マウスを全20接種に対して２×107PEER細胞での10日ご
とのI.P.接種により補助注射した。融合前３日、マウス
を３日連続静脈（I.V.）接種のため２×107PEER細胞で
のI.V.接種により補助接種した。マウスを殺し、脾臓を
最終I.V.接種時除いた。免疫脾臓細胞を標準方法により
マウス骨髄腫細胞P3×63Ag8.653でポリエチレングリコ
ール1500の存在下5:1比で融合した。融合後、細胞をヒ
ポキサンチン（１×10-4）、アミノプテリン（８×10-8
M）およびチミジン（1.6×10-5M）含有培養培地中に懸
濁し、飼育細胞として２×105BALB/c胸腺細胞を含有す
るマイクロタイタープレートに１ウェルにつき２×10-5
細胞でプレートした。培養株を、７日において同一培地
で飼育した。開始14日、培養株をアミノプテリンを欠く
同一培地で飼育した。 TCRγ鎖に特異なモノクローナル抗体に関するハイブリ
ドーマスクリーニング PEER細胞上のＴ細胞抗原レセプターのγおよびσ鎖の
両者がCD3抗原と複合されるので、Ｔ細胞抗原レセプタ
ーに対する抗体は、OKT ３等の抗CD3モノクローナル抗
体とこれら表面タンパク質と共転形し得るべきである
（文献２）。このような共転形は、次のとおり所望のハ
イブリドーマの主要スクリーニングとして利用された。
ハイブリドーマ培養上澄液の各々を生育させ、その抗CD
3モノクローナル抗体と表面CD3タンパク質複合体を共転
形する能力に関してスクリーニングした。100マイクロ
力価の培養上澄液を１ウェルにつき５×105PEER細胞含
有96ウェルマイクロ力価プレートの各ウェルに加えた。
37℃での一晩の培養後、フルオレセインイソチオシアネ
ート接合OKT ３を各ウェルに加え、さらに０℃で30分
間培養した。サンプルをついで流動細胞計測法で分析し
た。蛍光強度の著しい減少を誘いた上澄液を選択し、さ
らに以下に記載する免疫沈降法により特徴づけした。抗
ヒトＴ細胞抗体レセプタータンパク質を分泌した選択ウ
ェルにおける細胞をついで制限希釈度法によりクローン
した。 免疫沈降 PEER細胞は、125Iで放射性標識化され、上述の１％ノ
ニデットＰ−40含有トリス緩衝食塩水（TBS）中に可溶
化した。免疫沈降は、還元条件下各選択上澄液での125I
標識化PEER細胞溶解産物を培養することにより実施され
た。免疫沈降後、サンプルは、10％ドデシル硫酸ナトリ
ウウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAG
E）により分析された。ゲルを乾燥し、オートラジオグ
ラフ化し、そしてタンパク質の分子量を分子量標準との
比較により決定した（文献75）。 TCRδ鎖に特異なモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマの産生およびスクリーニング モノクローナル抗体は、BALB/cマウスをピーPEERから
の免疫沈降TCRγ、σCD3で免疫化することにより作成さ
れた。簡単に言うと、文献（46）に記載された方法と同
様に１グラムのピーア細胞を0.3％CHAPSに可溶化しつい
で５マイクロタイターのUCHT1腹水と固定スタフィロコ
ッカスアウレアスコウンＩ（Staphylococcus aureas Co
wn I）株で免疫沈降した。洗浄免疫複合体を全５回の免
疫化に関して４週間間隔で腹腔内接種した（文献46）。
マウスをついで殺し、脾臓細胞をP3×63Ag8.653胸腺細
胞に融合した。ハイブリドーマをHAT選択において生長
させ125I標識化PEER細胞および文献（75）に記載の他の
細胞に対してスクリーニングおよび特徴づけした。 結果 第10図、レーン４に示すとおり、ハイブリドーマ34D1
2上澄液（Supernate）における抗体は、PEER細胞のヨウ
素標識化溶解産物から還元条件下55dタンパク質および2
0Kdタンパク質を免疫沈降した。この55Kdタンパク質
は、Ｔ細胞抗原レセプターのγ鎖およびPEER細胞上のT3
タンパク質の20Kdタンパク質に相当する。 別個の実験において、Ｔ細胞抗原レセプターδ鎖に対
するモノクローナル抗体、すなわち4A1は、産生されか
つ特徴づれられた。第11図、レーン５に示すとおり、4A
1は、IDP2細胞からのＴ細胞抗原レセプターδ鎖（40K
d）を再免疫沈降した（文献75）。4A1はまた、IDP2、Mo
lt−13およびPBL系２等のいくつかの他のＴ細胞抗原レ
セプターγ、δ陽性細胞系からＴ細胞抗原レセプター
γ、δ複合体を免疫沈降することが示されている。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
33/566
33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(73)特許権者 999999999
プレジデント アンド フェローズ オ
ブ ハーバード カレッジ
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
02138，ケンブリッジ，クィニー スト
リート 17
(72)発明者 ブレンナー，マイケル，ビー
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
01721 アッシュランド，＃73，オーク
ストリート，99
(72)発明者 ストロミンガー，ジャック，エル
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
02173，レキシントン，マサチューセッ
ツ アベニュー 2030
(72)発明者 サイドマン，ジョナサン
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
02186，ミルトン，キャントン アベニ
ュー 1350
(72)発明者 イプ，ステファン，エイチ
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
01710、フラミンハム ジョディー ロ
ード 45
(72)発明者 クランゲル，マイケル，エス
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
02160，ニュートンビレ，アルストン
ストリート ８
(56)参考文献 Ｃｅｌｌ，45（1986）Ｐ．237−246
Ｎａｔｕｒｅ，322（1986）Ｐ．145−
149
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．γＴ細胞レセプターポリペプチドの少なくとも一部
からなる精製ポリペプチドであって、該γＴ細胞レセプ
ターポリペプチドが以下の性質： （ａ）Ｔ細胞の表面に存在するとき、T3抗原との複合体
として結合している； （ｂ）αまたはβＴ細胞レセプターポリペプチドに対す
る抗体とは反応しない； （ｃ）モノクローナル抗体βF1とは反応しない；そして （ｄ）γＴ細胞レセプターポリペプチドに対する抗体と
は反応する； を有することを特徴とするポリペプチド。 ２．分子量約55,000ダルトンのγＴ細胞レセプターポリ
ペプチドからなる請求の範囲第１項に記載のレセプタ
ー。 ３．約31,000ダルトン〜約40,000ダルトンの範囲の分子
量を有するペプチド配列を有する請求の範囲第２項に記
載のレセプター。 ４．γＴ細胞レセプターポリペプチドがヒトγＴ細胞レ
セプターポリペプチドである請求の範囲第１項に記載の
ポリペプチド。 ５．γＴ細胞レセプターポリペプチドの少なくとも一部
からなる精製ポリペプチドであって、該γＴ細胞レセプ
ターポリペプチドが以下の性質： （ａ）Ｔ細胞の表面に存在するとき、T3抗原との複合体
として結合している； （ｂ）αまたはβＴ細胞レセプターポリペプチドに対す
る抗体とは反応しない； （ｃ）モノクローナル抗体βF1とは反応しない；そして （ｄ）γＴ細胞レセプターポリペプチドに対する抗体と
は反応する； を有するポリペプチド２つが互いに結合してなる精製複
合体。 ６．被験者から得たサンプル中の、γＴ細胞レセプター
ポリペプチドを保持するＴ細胞の数を測定し、γＴ細胞
レセプターポリペプチドを保持するＴ細胞におけるγＴ
細胞レセプターポリペプチドの量を測定し、そしてこの
ようにして測定されたγＴ細胞レセプターポリペプチド
の量を、免疫系の異常を示さない正常被験者から得たサ
ンプル中の同数のγＴ細胞レセプターポリペプチドを保
持するＴ細胞におけるγＴ細胞レセプターポリペプチド
の量と比較することからなり、その際このようにして測
定された量の差異が免疫系異常の指標となる、免疫系異
常の検査方法であって、該γＴ細胞レセプターポリペプ
チドが以下の性質： （ａ）Ｔ細胞の表面に存在するとき、T3抗原との複合体
として結合した状態で存在し得る形態である； （ｂ）αまたはβＴ細胞レセプターポリペプチドに対す
る抗体とは反応しない； （ｃ）モノクローナル抗体βF1とは反応しない；そして （ｄ）γＴ細胞レセプターポリペプチドに対する抗体と
は反応する； を有することを特徴とする方法。 ７．被験者から得たサンプルにおいてγＴ細胞レセプタ
ーポリペプチドを有するＴ細胞の数および表面マーカー
T3,T4,T8およびα，βＴ細胞レセプターの１つを有する
Ｔ細胞のグループからなるＴ細胞の数を測定し、このよ
うにして測定されたＴ細胞の数を、免疫系の異常を示さ
ない被験者から得たサンプルにおけるγＴ細胞レセプタ
ーポリペプチドを有するＴ細胞の数および被験者から得
たサンプルにおいて測定されたＴ細胞のグループと同一
の表面マーカーを有するグループのＴ細胞の数と比較す
ることからなり、その際このようにして測定されたグル
ープのＴ細胞数に対するγＴ細胞レセプターポリペプチ
ドを有するこのようにして測定されたＴ細胞数が免疫系
異常の指標となる、免疫系異常の検査方法であって、該
γＴ細胞レセプターポリペプチドが以下の性質： （ａ）Ｔ細胞の表面に存在するとき、T3抗原との複合体
として結合した状態で存在し得る形態である； （ｂ）αまたはβＴ細胞レセプターポリペプチドに対す
る抗体とは反応しない； （ｃ）モノクローナル抗体βF1とは反応しない；そして （ｄ）γＴ細胞レセプターポリペプチドに対する抗体と
は反応する； を有することを特徴とする方法。
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