DE69021456T2

DE69021456T2 - Monoklonale Antikörper gegen aktivierte endotheliale Zellen.

Info

Publication number: DE69021456T2
Application number: DE69021456T
Authority: DE
Inventors: T Vencat Gopal; Walter Newman; Diane O Wilson
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-05-23
Filing date: 1990-05-21
Publication date: 1996-02-15
Anticipated expiration: 2010-05-22
Also published as: DE69021456D1; EP0408859B1; EP0585963A1; EP0583799A1; EP0408859A3; EP0408859A2; JPH03201995A

Description

Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper und ihre Verwendungen bei Entzündungsprozessen. Insbesondere betrifft die Erfindung neue monoklonale Antikörper, die gegen aktivierte Endothelialzellen in vitro und in vivo gerichtet sind. Die Erfindung betrifft auch neue Endothelialzell- Oberflächenantigene, die als Folge der IL-1-Behandlung induziert werden. Die komplette cDNA-Sequenz für eines dieser Antigene wird offenbart. Die neuen monoklonalen Antikörper, wie auch die neuen Antigene, sind nützlich als Medikamente zur Behandlung von akuten und/oder chronischen Entzündungsreaktionen, die mit Endothelialzellen einhergehen, und die Erfindung betrifft ferner solche Medikamente, wie auch Verfahren zur Behandlung solcher Entzündungsreaktionen. Zusätzlich betrifft die Erfindung Verfahren zum Nachweis von Entzündungsreaktionen, die mit Endothelialzellen einhergehen, wie die frühe Plantatabstoßung, subklinische Infektion und Vaskulitis.
Endothelialzellen (EC) sind die Hauptteilnehmer bei chronischer und akuter Entzündung. Sie regulieren die Passage von Zellen und Flüssigkeiten zwischen dem Blutstrom und dem extravaskulären Raum. Zusätzlich reagieren sie auf Entzündungsstimuli durch Sekretion von Faktoren, die eine Vielzahl von Wirkungen auf die Hematopoiese (Quesenberry und Gimbrone, Blood, 56: 1060-1067, 1980), Chemotaxis (Streiter et al., Science, 243: 1467-1469, 1989) und Gerinnung (Bevilacqua et al., J. Exp. med., 160: 618-623, 1984) haben. Interleukin-1 (IL-1) wird von einer großen Vielzahl von Zelltypen als beinahe universelle Antwort auf Zellverletzung ausgeschüttet (Neta und Oppenheim, Ann. Int. Med., 109: 1-31, 1988). Viele Zelltypen sekretieren diesen Faktor unter entsprechender Stimulierung, und viele Zelltypen reagieren hierauf und in einer Vielzahl von Arten. Man findet IL-1 an der Entzündungsstelle, und wenn er als ein gereinigtes Protein injiziert wird, führt er zu Erythem und Einströmung von Granulocyten aus dem Blutkreislauf, und er führt zweitens zur Gewebezerstörung (Beck et al., J. Immunol., 136: 3025- 3031, 1896; Pettipher et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 8749-8753, 1986).
Verschiedene Laboratorien haben gezeigt, daß Endothelialzellen eine rasche Reaktion gegen IL-1 haben, die mit ihrer begleitenden Natur bei der Entzündungsreaktion übereinstimmt. Zwei der am besten beschriebenen Reaktionen sind eine Erhöhung der Prokoagolanzaktivität (Bevilacqua et al., 1984, supra) und einen begleitenden Anstieg der Haftungsfähigkeit für Leucocyten (Bevilacqua et al., J. Clin. Invest., 75: 2003-2011, 1985).
Was die Auskleidung der Blutgefäße betrifft, so sind Endothelialzellen einheitlich angeordnet, um den Strom in den Entzündungszellen und ihre reaktiven Nebenprodukte zu regulieren. Zusätzlich können Endothelialzellen selbst in den Blutstrom neu synthetisierte Proteine sekretieren, die ein früher Indikator des Entzündungsprozesses sein können. Trotz dieser Schlüsselrolle wurden sehr wenige therapeutische Untersuchungen oder diagnostische Indikatoren entwickelt, die direkt die Rolle dieses Zelltyps ansprechen. Man beginnt nun die Biologie dieser Endothelialzellen in größerem Detail aufgrund jüngster Erfolge bei der Kultur dieser Zellen im Labor zu verstehen.
Wie oben erwähnt, ist ein Schlüsselmediator der Entzündungsreaktion IL-1. IL-1 ist eine 17-Kd-Polypeptid, das durch Makrophagen und viele andere Zelltypen sekretiert wird, der zur Auslösung einer großen Vielzahl von Reaktionen, die von der Induktion von Fieber bis zur Proliferation von Entzündungszellen und der Rekrutierung reifer Leucocyten aus Vorstufen im Knochenmark reichen, in der Lage ist (Überblick bei Dinarello, FASEB J., 2: 106-115, 1988).
Endothelialzellen reagieren sowohl auf IL-1 und sekretieren TL-1 in einem sehr frühen Stadium des Entzündungsprozesses. Während ein Nebenprodukt der bakteriellen Infektion mit gram- negativen Organismen die Produktion von Endotoxin und die konsequente Sekondärproduktion von IL-1 ist, ist der Punkt, ob eine mechanische Verletzung die IL-1-Freisetzung auslösen kann, eine kritische, aber bislang noch nicht beantwortete Frage für solche, die die sportinduzierte Entzündung untersuchen.
Man glaubt, auf Grundlage der Arbeiten verschiedener Laboratorien in den letzten 10 Jahren, daß die Bindung von Leucocyten an die Gefäßwand, ein Prozeß, der durch in-vitro- Behandlung von Endothelialzellen mit IL-1 nachgeahmt werden kann, der erste Schritt bei der Diapedese von Leucocyten im den Geweberaum ist. Jedoch bleiben mehrere Aspekte dieses Prozesses unklar, insbesondere insofern sie die Verwendbarkeit der gegenwärtigen entzündungshemmenden Mittel zur Intervention betreffen.
IL-1 induziert eine rasche Veränderung der Membraneigenschaften von kultivierten humanen Endothelialzellen. Dies geht aus der Fähigkeit von behandelten Zellen zur Bindung von Leucocyten, ihrer Anreicherung an Prokoagulanzaktivität und der Expression neuer Zelloberflächenantigene einschließlich einiger, für die bislang keine funktionellen Eigenschaften zugeordnet werden konnten, hervor. In den untersuchten Fällen ist die Entwicklung der neuen beschriebenen Eigenschaften empfindlich gegen die Wirkung von Actinomycin D und Cycloheximid, was auf ein Erfordernis für die Synthese von neuen Botenstoffen und neuen Proteinen hinweist.
Die Bindung von Leucocyten und Tumorzellen hematopoietischen Ursprungs an Basal- und aktivierten Endothelialzellen, wie auch an die "hohen" Endothelialzellen der Kapillaren wurde in verschiedenen Laboratorien untersucht. Es wurden Belege vorgelegt, daß Granulocyten, Monocyten, T- und B-Zellen alle an Endothelialzellen nach Stimulierung mit physiologischen Konzentrationen von IL-1 binden können (Bevilacqua et al., J. Clin. Invest., 76: 2003-2011, 1985; Cavender et al., J. Immunol., 136: 203-207, 1986; Polman et al., J. Immunol., 136: 4548-4553, 1986). T-Zellenbindung kann auch durch Vorbehandlung der Endothelialzellen mit IFN-gamma induziert werden (Yu et al., Clin. exp. Immunol., 62: 554-560, 1985; Masuyama und Kano, J. Clin. Invest., 77: 1596-1605, 1986) wie auch TL-1 (Cavender et al., J. Immunol., 136: 203-207, 1986; Bender et al., J. Clin. Invest., 79: 1679-1688, 1987) lps (Yu et al., J. Immunol., 136: 569-573, 1986) und TNF (Cavender et al., J. Immunol., 139: 1855-1860, 1987). Die pro-adhäsiven Wirkungen dieser Cytokine für das ruhende Endothelium wird in hohem Maße als ein Modell von frühen Vorkommnissen bei der extravasatorischen Komponente der Entzündung angesehen. Im Fall hoher endothelialer Venulen (HEV) sind die beteiligten Endothelialzellen vermutlich bereits in einiger Weise aktiviert, was ihre Rolle bei der Rezirkulierung von T- und B-Zellen ermöglicht (Übersicht bei: Yednock et al., Adv. in Immunol., 44: 313-378, 1989). Die Bindüng von Monocyten (Pawlowski et al., J. Exp. Med., 168: 1865-1882, 1988; Wallis et al., J. Immunol., 135: 2323-2330, 1985) und Granulocyten (Lo et al., J. Exp. Med., 169: 1779-1793, 1989) an kultivierten Endothelialzellen, die sonst nicht stimuliert sind, wurde als ein Modell für die Unbedeutendheit dieser Zelltypen innerhalb des Blutkreislaufes angesehen.
Eine fundamentale Annahme der Forschung bei der Lymphocytenrezirkulierung und in frühen Stadien der Entzündung ist das Vorliegen selektiver Mechanismen zur Bindung und Extravasation von Leucocyten-Subsets. Das Vorliegen solcher Mechanismen leitet sich aus der differentiellen Rezirkulierung von Lymphocyten durch mukosale gegenüber periphalen Lymphoidorganen ab (Übersicht bei: Yednock et al., Adv. in Immunol., 44: 313-378, 1989), dem kinetischen Unterschied in der Extravasation von Neutrophilen, Monocyten und Lymphocyten bei der Entzündung (Issekutz et al., Am. J. Pathol., 103: 47, 1981) und der selektiven Bindung und Akkumulation von Monocyten bei der Atherogenese (Tayler und Lewis, Am. J. Pathol., 125: 152, 1986). T-Zellen sind späte aber dauerhafte Elemente von Entzündungsverletzungen, insbesondere solche, die in chronischer Form andauern. Die Rolle von T-Zellen bei der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen (Wofsy und Seaman, J. Exp. Med., 161: 378-391, 1985; Ranges et al., J. Exp. Med., 162: 1105-1110, 1985; Tauroget al., Cell. Immunol., 75: 271- 282, 1983; Maron et al., J. Immunol., 131: 2316-2322, 1983; Rossini et al., Ann. Rev. Immunol., 3: 289-320, 1985) hat zu einigem Interesse über ihre Emigration an Stellen von möglichem Gewebeschaden unter spezieller Beachtung ihrer Wechselwirkung mit aktivierten oder pro-adhäsiven Endothelialelementen geführt.
Direkter und indirekter Nachweis deutet stark darauf hin, daß die Anhaftung von Leucocyten an Basal- oder aktivierte Endothelialzellen ein komplexer Prozeß ist. Während vier scheinbar unterschiedliche Strukturen auf aktivierten Endothelialzellen beschrieben wurden (Hagemeier et al., Int. J. Cancer, 38: 481-488, 1986; Goerdt et al., Expl. Cell. Biol., 55: 117-126, 1987; Duijvestijin et al., Am. J. Pathol., 130: 147-155, 1988; Leeuwenberg et al., Eur. J. Immunol., 19: 715-720, 1989) wurden mindestens zwei zusätzliche gut charakterisierte Moleküle direkt den Adhäsionsvorkommnissen zugeordnet. Das ELAM-1-Protein scheint primär die Anhaftung von Granulocyten an Cytokin-aktiviertes Endothel zu vermitteln (Pober et al., J. Immunol., 136: 1680- 1687, 1986; Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 9238-9242, 1987; Bevilacqua et al., Science, 243: 1160-1165, 1989); und das ICAM-1-Protein ist teilweise für die Anhaftung einiger mononuklearer Zellen verantwortlich (Dustin und Springer, J. Cell Biol., 107: 321-331, 1988) und Granulocyten (Smith et al., J. Clin. Invest., 83: 2008-2017, 1989; Smith et al., J. Clin. Invest., 82: 1746-1756, 1988) an aktivierte Endothelialzellen. Ein wesentlicher Punkt der Übereinstimmung in diesem und anderen (Haskard et al., J. Immunol., 137: 2901-2906, 1986) Untersuchungen, ist die Existenz von (einem) von ICAM-1 und ELAM-1 unabhängigen Weg(en) für die Anhaftung von Lymphocyten an aktivierte Endothelialzellen.
Trotzdem besteht weiterhin Aufklärungsbedarf über die Rolle dieser und anderer Moleküle bei der Bindung mononuklearer Zellen.
Es ist demnach eine Aufgabe der Erfindung, neue monoklonale Antikörper zu entwickeln, die spezifisch für Antigene auf aktivierten humanen Endothelialzellen, sowohl in vitro als auch in vivo sind.
Eine zweite erfindungsgemäße Aufgabe ist die Entwicklung neuer monoklonaler Antikörper, die die Bindung weißer Blutzellen blockieren, wodurch sie die monoklonalen Antikörper nutzbar für Medikamente und bei Verfahren zur Behandlung von Entzündungsreaktionen, die mit aktivierten Endothelialzellen einhergehen, machen.
Eine dritte erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung neuer Antigene und/oder neuer Epitope von Antigenen, die auf aktivierten Endothelialzellen exponiert sind, die als Medikamente und in Verfahren zur Behandlung von Entzündungsreaktionen, die mit aktivierten Endothelialzellen einhergehen, nützlich sind.
Eine vierte erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines Nachweisverfahrens, das zum Nachweis von Entzündungsreaktionen, die mit aktiven Endothelialzellen einhergehen, in der Lage ist.
Diese und andere Aufgaben wurden gelöst durch Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers oder Bindungsstelle enthaltenden Fragments davon, der spezifisch an IL-1 aktivierte Endothelialzellen bindet, worin der monoklonale Antikörper ausgewählt ist aus
(A) einem monoklonalen Antikörper mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:
(1) bindet nicht wesentlich an normale ruhende Endothelialzellen;
(2) bindet nicht wesentlich an normale ruhende oder IL- 1-aktivierte epidermale Keratinocyten oder ruhende oder IL-1-aktivierte Fibroblasten;
(3) bindet nicht wesentlich an eine Mischung von ruhenden oder IL-1-aktivierten Granulocyten oder mononuklearen Zellen, umfassend T-Zellen, B-Zellen und Monocyten;
(4) verhindert nicht oder verhindert teilweise die Bindung von T-Zellen an IL-1-aktivierte Endothelialzellen in vitro;
(5) inhibiert nicht die Bindung von Granulocyten an IL- 1-aktivierter Endothelialzellen in vitro; und
(6) bindet spezifisch an 1E7/2G7- Sialoglycoproteinantigen, das auf der Oberfläche IL-1-aktivierte Endothelialzellen gefunden wird, und durch die cDNA-Sequenz, wie in den Fig. 34A bis 34D gezeigt, definiert ist;
(B) einem monoklonalen Antikörper mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:
(1) bindet nicht signifikant an normale ruhende Endothelialzellen;
(2) bindet nicht signifikant an normale ruhende IL-1aktivierte epidermale Keratinocyten oder ruhende oder IL-1-aktivierte Fibroblasten;
(3) bindet nicht signifikant an eine Mischung von ruhenden oder IL-1-aktivierten Granulocyten oder mononuklearen Zellen, umfassend T-Zellen, B-Zellen und Monocyten; und
(4) bindet spezifisch an das CMP-170-Antigen, das im Cytoplasina ruhender und IL-1-aktivierter Endothelialzellen und auf der Oberfläche von IL-1- aktivierten Endothelialzellen vorkommt; und
(C) einem monoklonalen Antikörper mit den folgenden charakterisierenden Eigenschaften
(1) bindet nicht signifikant an normale ruhende Endothelialzellen;
(2) bindet nicht signifikant an normale ruhende IL-1- aktivierte epidermale Keratinocyten oder ruhende oder IL-1-aktivierte Fibroblasten;
(3) bindet nicht signifikant an eine Mischung von ruhenden oder IL-1-aktivierten Granulocyten oder mononuklearen Zellen, umfassend T-Zellen, B-Zellen und Monocyten;
(4) inhibiert teilweise die Bindung von T-Zellen an aktivierte Endothelialzellen in vivo;
(5) inhibiert vollständig oder teilweise die Bindung von Granulocyten an IL-1-aktivierte Endothelialzellen in vitro;
(6) bindet spezifisch an die N-terminalen 10 % des ELAM-1-Sialoglycoproteinantigens, das auf der Oberfläche von IL-1-aktivierten Endothelialzellen vorliegt; und
(7) bindet nicht an das 1E7/2G7- Sialogylcoproteinantigen, das auf der Oberfläche von IL-1-aktivierten Endothelialzellen vorliegt.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Hybridom-Zellinien zur Verfügung, die die oben beschriebenen monoklonalen Antikörper produzieren.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die monoklonalen Antikörper der monoklonale Antikörper 1E7, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 1E7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10136, der monoklonale Antikörper 2G7, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 2G7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10137, der monoklonale Antikörper 3A2, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 3A2 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10138, der monoklonale Antikörper 7A9, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 7A9 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10135 und der monoklonale Antikörper 3B7, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 3B7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10391 der Bindungsstellen-haltige Fragmente dieser monoklonalen Antikörper.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Medikament zur Behandlung von entzündlichen Reaktionen, die mit aktivierten Endothelialzellen einhergehen, zur Verfügung, wobei das Medikament umfaßt
(I) eine pharmazeutisch wirksame Menge eines monoklonalen Antikörpers oder eines Bindungsstellen-haltigen Fragments davon, oder pharmazeutisch annehmbare Salze der monoklonalen Antikörper oder des Fragments, worin der monoklonale Antikörper mindestens eine der oben beschriebenen monokonalen Antikörper (A), der teilweise die Bindung von T-Zellen an aktivierte Endothelialzellen in vitro inhibiert, oder der monoklonale Antikörper (C) ist, und
(II) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünner oder Exzipienten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die monoklonalen Antikörper der monoklonale Antikörper 2G7, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 2G7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10137, der monoklonale Antikörper 7A9, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 7A9 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10135, der monoklonale Antikörper 3B7, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 3B7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10391 oder Bindungsstellen-haltige Fragmente dieser monoklonalen Antikörper.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Entzündungsreaktionen, die mit aktivierten Endothelialzellen einhergehen, zur Verfügung, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge der monoklonalen Antikörper oder Bindungsstellen-haltige Fragmente davon oder pharmazeutisch annehmbarer Salze des monoklonalen Antikörpers oder des Fragments, wie für das Medikament beschrieben, an eine Person, die der Behandlung bedarf, umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die monoklonalen Antikörper der monoklonale Antikörper 2G7, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 2G7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10137, der monoklonale Antikörper 7A9, produziert von der Hybridom-Zellinie 7A9 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10135, und der monoklonale Antikörper 3B7, produziert von der Hybridom-Zellinie 3B7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10391, oder Bindungsstellen-haltige Fragmente dieser monoklonalen Antikörper.
Die Erfindung betrifft ferner ein im wesentlichen reines Antigen oder antigenes Fragment davon, das auf IL-1- aktivierten Endotehlialzellen gefunden wird, wobei das Antigen oder antigene Fragment davon ausgewählt ist aus:
(A) einem 1E7/2G7-Antigen mit den folgenden charakterisierenden Eigenschaften:
(1) ist ein Sialoglycoprotein;
(2) Molekularmasse, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen;
(a) Hauptbande bei ca. 114 kDa;
(b) Nebenbande bei ca. 95 kDa;
(3) Molekularmasse, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen;
(a) Hauptbande bei ca. 100 kDa;
(b) Nebenbande bei ca. 93 kDa;
(4) Molekularmasse, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen, vermindert um ca. 1 bis 3 kDa nach Entfernung der O-verknüpften Zucker;
(5) isoelektrischer Punkt ca. 4,8 bis 4,9, wie bestimmt durch 2-D-Gelanalyse;
(6) nicht-exprimiert auf konstitutiven oder Thrombinstimulierten peripheren mononuklearen Blutzellen, Granulocyten, Plättchen; Fibroblasten oder Keratinocyten;
(7) Expression auf IL-1-aktivierten Endothelialzellen, die durch E. coli-Lipopolysaccharid (lps) und Tumornecrosefaktor alpha (TNF), aber nicht durch gamma-Interferon (IFNγ) stimuliert sind;
(8) zeigt chronische Kinetik, wie bestimmt in vitro durch die Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers 1E7 und/oder 2G7 zur Bindung an humane Endothelialzellen, die für zunehmend längere Zeiträume mit IL-1 vorbehandelt wurden, wobei der monoklonale Antikörper 1e7 von der Hybridom- Zellinie 1E7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10136 produziert wird, und der monoklonale Antikörper 2G7 von der Hybridom-Zellinie 2G7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10137 produziert wird;
(9) zeigt chronische und akute Kinetiken, wie durch invivo-Expression des Antigens in Blutgefäßen oder Geweben, die entweder an chronischer oder akuter Entzündung leiden, bestimmt;
(10) bindet nicht an Antikörper, die spezifisch an ELAM- 1 oder ICAM-1 binden;
(11) bindet den monoklonalen Antikörper 1E7 und/oder den monoklonalen Antikörper 2G7; und
(12) durch COS-Zellen exprimiert wird, die mit einer in Fig. 34A bis 34D gezeigten cDNA-Sequenz transfektiert sind;
(B) einem EMP-170-Antigen mit den folgenden charakterisierenden Eigenschaften:
(1) Molekularmasse, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter reduzierenden und nicht- reduzierenden Bedingungen: ca. 170 kDa;
(2) nicht-exprimiert auf ruhenden oder IL-1- stimulierten peripheren mononuklearen Blutzellen, Granulocyten, Fibroblasten oder Keratinocyten;
(3) vorhanden im Cytoplasma ruhender Endothelialzellen, Fibroblasten und Leucocyten;
(4) Expression auf der Zelloberfläche aktivierter Endothelialzellen inhibiert durch Cycloheximid und Actinomycin D;
(5) lokalisiert keine Weibel-Palade-Körperchen in Endothelialzellen;
(6) assoziiert an der Zelloberfläche mit ELAM-1 in IL- 1-stimulierten Endothelialzellen;
(7) zeigt akute Kinetiken, wie bestimmt in vitro durch die Fähigkeit von monoklonalem Antikörper 3A2 zur Bindung an humane Endothelialzellen, die für zunehmend längere Zeiträume mit IL-1 vorbehandelt wurden, wobei der monoklonale Antikörper 3A2 durch Hybridom-Zellinie 3A2 mit der ATCC- Hinterlegungsnummer HB 10138 produziert wird;
(8) bindet an den monoklonalen Antikörper 3A2; und
(C) einem Antigen, das aus einer antigenen Fragment von ELAM-1-Antigen mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften besteht:
(1) umfaßt die ca. N-terminalen 31 % des ELAM-1- Antigens;
(2) bindet an monoklonalen Antikörper 7A9, produziert von der Hybridom-Zellinie 7A9 mit der ATCC- Hinterlegungsnummer HB 10135;
(3) bindet an monoklonalen Antikörper 3B7, produziert von der Hybridom-Zellinie 3B7 mit der ATCC- Hinterlegungsnummer HB 10391;
(4) nicht-exprimiert auf konsitutiven oder Thrombinstimulierten peripheren mononuklearen Blutzellen, Granulocyten, Blutplättchen, Fibroblasten oder Keratinocyten; und
(5) Expression auf IL-1-aktivierten Endothelialzellen stimuliert durch E. coli-Lipopolysaccharid (lps) und Tumornecrosefaktor-alpha (TNF), aber nicht durch gamma-Interferon (IFNγ).
Die Erfindung stellt auch ein Medikament zur Behandlung von Entzündungsreaktionen, die mit aktivierten Endothelialzellen einhergehen, zur Verfügung, wobei das Medikainent umfaßt:
(I) eine pharmazeutisch wirksame Menge eines im wesentlichen reinen Antigens oder antigenen Fragments davon, oder pharmazeutisch annehmbarer Salze des Antigens oder Fragments, worin das Antigen mindestens ein Antigen ist, ausgewählt aus mindestens einem des oben beschriebenen 1E7/2G7-Antigens, dem CMP-170-Antigen und dem ELAM-1- Antigenfragment; und
(II) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünner oder Exzipienten.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung von Entzündungsreaktionen, die mit aktivierten Endothelialzellen einhergehen, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge des im wesentlichen reinen Antigens oder antigenen Fragments davon oder pharmazeutisch annehmbarer Salze des Antigens oder des Fragments, wie oben für das Medikament beschrieben, an eine Person, die der Behandlung bedarf, umfaßt.
Die Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zum Nachweis von Entzündungsreaktionen, die mit IL-1-aktivierten Endothelialzellen einhergehen, zu Verfügung, wobei das Verfahren umfaßt
(I) in Kontaktbringen einer biologischen Flüssigkeit mit einem der oben beschriebenen monoklonalen Antikörper oder Bindungsstellen-haltigen Fragmenten davon, und
(II) Testen auf spezifische Bindung der monoklonalen Antikörper oder Bindungsstellen-haltiger Fragmente davon an ein Antigen in der biologischen Flüssigkeit.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die monoklonalen Antikörper der monoklonale Antikörper 1E7, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 1E7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10136, der monoklonale Antikörper 2G7, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 2G7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10137 und der monoklonale Antikörper 2A2, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 3A2 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10138, der monoklonale Antikörper 7A9, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 7A9 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10135 und der monoklonale Antikörper 3B7, hergestellt von der Hybridom-Zellinie 3B7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10391.
Schließlich stellt die Erfindung eine cDNA-Sequenz oder ein Fragment davon und einen die cDNA-Sequenz oder ein Fragment davon, das für das Antigen 1E7/2G7 kodiert, tragenden Vektor zur Verfügung.
Die cDNA-Sequenz umfaßt die cDNA-Sequenz wie im wesentlichen in den Fig. 34A bis 34D gezeigt.
Der Vektor umfaßt einen Vektor, der die cDNA-Sequenz, wie im wesentlichen in den Fig. 34A bis 34D gezeigt, umfaßt.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Mechanismus, nachdem die neuen monoklonalen Antikörper (Mab) der Erfindung, die die Bindung von weißen Blutzellen an IL-1-aktivierten Endothelialzellen blockieren, und durch den die neuen erfindungsgemäßen Antigene (Peptid) die Blockade der Entzündung bewerkstelligen.
Fig. 2 zeigt eine cytometrische Analyse von nicht- induzierten (...) und IL-1-induzierten (-) humanen Endothelialzellen aus der Nabelschnur (HUVEC). Auf der horizontalen Achse bedeuten jeweils 25 Kanäle eine ungefähre Verdopplung der Fluoreszenzaktivität a.u. = willkürliche Einheiten. Die Zellanzahl in willkürlichen Einheiten ist auf der vertikalen Achse angegeben. In Fig. 2A bedeutet 1 die Intensität der Fluoreszenz auf Endothelialzellen, die mit dem indirekten Fluroeszenz-Ziege-Antimaus-Reagens allein gefärbt wurden. 2 bedeutet die Intensität des W6/32- Anti-HLA-Reagenses, was den Standard für den Vergleich mit den folgenden Figuren bildet. In Fig. 2B bedeutet die durchgezogene Linie die Färbung mit 1E7-Antikörper. Die Figuren 2C, 2D, 2E und 2F bedeuten die Färbung mit den Antikörpern 2G7, 7A9, 3B7 und RRL (Anti-ICAM-1). Die gepunktete Linie in den Figuren 2B bis 2F bedeutet Färbung mit dem angegebenen monoklonalen Antikörper von nicht- induziertem HUVEC.
Fig. 3 ist ein Histogramm, das die Reaktivität der monoklonalen Antikörper 1E7, 2G7 und 3B7 mit 1E7/2G7- cDNA-transfektierten COS-Zellen zeigt. Die Ergebnisse sind als CPM x 10&supmin;³ ¹²³J-Streptavidin und anschließender biotinyliertem Ziege-Antimaus- Antikörper angegeben.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die die Inhibierung der Bindung von humanen mononuklearen Zellen an IL-1- aktivierten Endothelialzellen, die mit verschiedenen Dosen an F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Antikörpers 2G7 oder mit 10 ug/ml des monoklonalen Antikörpers 1E7 gemäß der vorliegenden Erfindung vorbehandelt wurden.
Fig. 5 ist ein Histogramm, das die Wirkung der monoklonalen Antikörper auf die Granulocytenadhäsion an HUVEC zeigt. Die Ergebnisse sind als Zellen gebunden pro Weil ± s.e.m. (n = 3) ausgedrückt.
Fig. 6 ist ein Histogramm, das die Wirkung der inonoklonalen Antikörper auf die T-Zelladhäsion an HUVEC zeigt. Die Ergebnisse sind als Zellen gebunden pro Weil ± s.e.m. = 3) ausgedrückt.
Fig. 7 ist eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(SDS- PAGE)-Muster (10 % Acrylamid) der Antigene, definiert durch die monoklonalen Antikörper 1E7 und 2G7 gemäß der Erfindung unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Die Molekulargewichtsstandards sind ebenfalls gezeigt.
Fig. 8 ist ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Muster (8 % Acrylamid) der durch die monoklonalen Antikörper 3A2 und 7A9 der Erfindung unter reduzierten Bedingungen (Fig. 8B und nicht-reduzierten Bedingungen (Fig. 8A) definierten Antigene. Die Molekulargewichtsstandards sind ebenfalls gezeigt.
Fig. 9 ist eine graphische Darstellung, die die Bindung der monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung an normale ruhende und IL-1-aktivierte Endothelialzellen (EC) zeigt.
Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, die die Bindung der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper an normale weiße humane Blutzellen, entweder Granulocyten oder mononukleare Zellen (T-Zellen, B-Zellen und Monocyten) in Abwesenheit von IL-1 zeigt.
Fig. 11 ist eine graphische Darstellung, die die Bindung der monoklonalen erfindungsgemäßen Antikörper an Endothelialzellen, die IL-1 für verschiedene Zeiträume von 2 Stunden bis 96 Stunden ausgesetzt wurden, zeigt.
Fig. 12 ist ein 2-D-Gelmuster von TRITON X-114-Detergenz- Pellets (Membranproteine) von ³&sup5;S-Cystein-markierten ruhenden (Fig. 12a) und IL-1 (Fig. 12B) aktivierten Endothelialzellen. Die drei Pfeile oben links bei den nicht-induzierten Zellen (-IL-1) 1-D-Gel (Fig. 12A) zeigen auf Regionen, wo induzierte Proteine im induzierten Gel (Fig. 12B) auf der rechten Seite (+IL-1) erscheinen. Die scheinbaren Molekulargewichte und isoelektrische Punkte sind angegeben, wobei diese auf Referenz mit bekannten Proteinen in einer Datenbank beruhen.
Fig. 13 ist ein 2-D-Gelmuster von 1E7- und 2G7- Immunpräzipitaten, allein und in Mischung mit den gesamten Membranproteinen aus nicht-induzierten (-IL-1) und induzierten (+IL-1) HUVEC. In jedem der acht Quadrate wird ein Teil eines 2-D-Gels gezeigt, das dem unteren linken Quadrat des gesamten in Fig. 12 analysierten Gels entspricht. Fig. 13A und 13B sind Immunpräzipitate allein mit entweder dem 1E7 (oben) oder 2G7 (unten) Antikörper. Keine zusätzlichen Spots konnten in anderen Teilen dieses Gels gesehen werden. Fig. 13c und 13d zeigen die Gesamtmembranproteine aus nicht-inudzierten (-IL-1, oben) oder induzierten (IL-1, unten) HUVEC ohne zugesetzte Immunpräzipitate. Fig. 13E und 13f zeigen die Wirkung des Zusatz es von 1E7 (oben) oder 2G7 (unten) Immunpräzipitaten zu den Membranproteinen von nicht-induzierten HUVEC. Fig. 13G und 13H zeigen die Wirkung der Zugabe der 1E7 (oben) oder 2G7 (unten) Immunpräzipitate zu den Membranproteinen aus IL-1- induzierten HUVEC. Plus (+) bedeutet das saure und Minus (-) das basisches Ende eines jeden Gels.
Fig. 14 ist ein 2-D-Gelmuster von Immunpräzipitaten allein und in Kombination. Die für die Immunpräzipitation verwendeten Antikörper waren wie folgt Fig. 14a (RR1 (Anti-ICAM-1); Fig. 148, 2G7; Fig. 14C, 7A9; Fig. 14D, RR1 + 2G7; Fig. 14e, RRL + 7A9; Fig. 14F, 2G7 + 7A9. Nur das obere linke Quadrat eines jeden der sechs 2-D-Gele ist gezeigt. Keine zusätzlichen Spots waren in den anderen Regionen vorhanden.
Fig. 15 ist ein Diagramm des pCDN-ELAM-1-Expressionsplasmids. ELAM-1-cDNA wurde in Plasmid (pCDN-1; T.V. Gopal, nicht publizierte Arbeiten) enthaltend den frühen SV40-Promotor (durch diagonale Balken gezeigten Bereich) und 5V40-"t"-Splice und Poly-A- Additionssequenzen (gepunkteter Bereich) abgeleitet von pSV2 NEO (Southern und Berg, J. Mol. Applied Genetics, 1: 327-341, 1982) kloniert. Der Rest des Plasmids enthielt p8R322 (-) Sequenzen. Wichtige Restriktionsstellen sind in der Figur angegeben. MCS bedeutet multiple Klonierungsstelle.
Fig. 16 ist ein Histogramm eines monoklonalen Antikörperbindungsstests von ELAM-1-transfektierten und blind transfektierten COS-Zellen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert (t s.e.m. n = 3) des gesamten cpm/Well ausgedrückt.
Fig. 17 ist ein 10%iges SDS-Polyacrylamid-reduzierendes Gelmuster von zusammenfließenden HUVEC, behandelt mit TL-1 ohne oder mit Tunicamycin B2 und immunpräzipitiert mit entweder dem 2G7- oder dem 7A9- monoklonalen Antikörper.
Fig. 18 ist ein 2-D-Gelmuster von HUVEC, das mit IL-1 aktiviert wurde und mit ³&sup5;S-Cystein metabolisch markiert wurde. Man ließ die Zellen unbehandelt oder für 30 Minuten mit Neuraminidase vor der Lyse behandelt. TRITON X-100-Lysate wurden mit entweder dem 2G7 (Fig. 18A) oder 7A9 (Fig. 18B) Antikörper immunpräzipitiert. Ein Teil eines jeden der vier 2-D- Gele ist in der Figur gezeigt.
Fig. 19 ist ein 10%iges SDS-Polyacrylamid-reduzierendes Gelmuster von TRITON X-100-Lysaten von IL-1- aktivierten S-Cystein-markierten HUVEC, entweder mit 7A9- oder 2G7-Antikörper immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden entweder mit dem Puffer allein, Neuraminidase (N'ase) oder Neuraminidase und anschließender Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O- Gly'case) behandelt.
Fig. 20 ist ein 10%iges SDS-Polyacrylamid-reduzierendes Gelmuster von HUVEC, inkubiert mit IL-1 für die angegebenen Zeiträume. Immunpräzipitate der TRITON X- 100-Lysate wurden entweder mit 2G7- oder dem 7A9- Antikörper gebildet.
Fig. 21 zeigt Histogramme von Verdrängungstests durchgeführt an monoklonalen Antikörpern 1E7, 2G7, 3B7 oder 7A9 konjugiertem Fluorescein. Fig. 21A: 1E7; Fig. 21B: 2G7; Fig. 21C: 3B7; Fig. 21D: 7A9. Auf der vertikalen Achse ist der Prozentsatz positiver Zellen angegeben. Die Daten stammen aus der Flußcytometrie.
Fig. 22 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse bei Exposition von IL-1 an HUVEC für die angegebenen Zeiträume zeigt. Antikörper 2G7 ( ) oder 7A9 ( ) wurde in einem Sandwich-Bindetest bei einer Sättigungskonzentration verwendet. Die Ergebnisse sind als Mittel-cpm ± s.e.m (n = 3) ausgedrückt.
Fig. 23 zeigt die cytometrische Analyse von ruhenden (...) oder IL-1-stimulierten (-) Endothelialzellen, die mit indirektem Reagens allein (Fig. 23A), dem W6/32-Anti- HLA-Antigen (Fig. 23B), dem Anti-ICAM-1-Antikörper RR/1 (Fig. 23C) und dem 3A2-Antikörper (Fig. 23D) gefärbt wurden.
Fig. 24 zeigt ein SDS-Polyacrlyainid-reduzierendes Gel (8 % Acrylamid) Muster aus metabolisch markierten Endothelialzellen, die unbehandelt (-) oder IL-1- behandelt (+), lysiert mit 1 % TRITON X-100 und mit dem angegebenen Antikörper immunpräzipitiert waren. In der Fig. bedeuten MAB 7 und MAb 3 den monoklonalen Antikörper 7A9 und 3B7.
Fig. 25 zeigt Histogramme von Endothelialzellen, die mit IL-1 und Actinomycin D oder Cycloheximid behandelt wurden und dann in einem Plattenbindungstest auf die Expression von 2G7, 7A9 (Anti-ELAM-1) oder 3A2- Antigenen getestet wurden. Fig. 25A: IL- 1 ± Cycloheximid; Fig. 25B: IL-1 ± Actinomycin D (Akt D).
Fig. 26 zeigt eine lichtmikroskopische Begutachtung des 3A2- Antigens. Fig. 26A: Endothelialzellen, nur in Wachstumsmedium kultiviert und mit Antikörper 7A9 gefärbt; Fig. 26B: Endothelialzellen, aktiviert mit IL-1 und gefärbt mit Antikörper 7A9; Fig. 26C: Endothelialzellen, nur in Wachstumsmedium kultiviert und gefärbt mit Antikörper 3A2; Fig. 26D: mit IL-1 aktivierte Endothelialzellen und mit Antikörper 3A2 gefärbt. Die größeren Flecken in Fig. 26B, 26C und 26D stammen aufgrund einer roten Farbe aus der Färbung, was auf das Vorliegen des entsprechenden Antigens hinweist. Die kleinen dunklen Flecken in Fig. 26A sind blau gefärbte Kerne, die jedoch nicht von irgendeiner roten Cytoplasmafärbung umgeben sind.
Fig. 27 zeigt SDS-Polyacrylamid-Gelmuster für unbehandelte (-) oder IL-1-behandelte (+) Endothelialzellen, die mit dem 3A2-Antikörper (MAB 3) oder allein mit dem Kontroll-Ziege-Antimaus-IgM-Reagens (MAB-) immunpräzipitiert wurden. Ein Teil dieser Immunpräzipitate wurde auf 8 % SDS-Polyacrylamidgelen unter nicht-reduzierenden (Fig. 27A) oder reduzierenden (Fig. 27B) Bedingungen aufgetrennt.
Fig. 27C, erste und zweite Bahn: Immunpräzipitate mit monoklonalen Antikörpern 7A9 oder 2G7 (MAB 7 und MAB 2) aus IL-1-aktivierten Zellen (als Kontrollen); Fig. 27C, dritte und vierte Bahn: Immunpräzipitate von 3A2-Immunpräzipitaten mit 7A9- oder 2G7- Antikörper. Daher copräzipitierte die zweite Bande mit dem monoklonalen Antikörper 3A2 (170 kda) in Fig. 27A und Fig. 27B mit dem 7A9- und nicht mit dem 2G7- Antigen.
Fig. 28 ist ein SDS-Polyacrylamid-reduzierendes Gel (10 % Acrylamid) Muster für die 7A9- oder 3A2- Immunpräzipitate von COS-Zellen, die einer Blindtransfektion (-) oder mit der ELAM-1-cDNA in dem CDN-Plasmid (+) transfektiert wurden. Der monoklonale Antikörper 7A9 präzipitiert das ELAM-1-Protein, der monoklonale Antikörper 3A2 präzipitiert das COS- Zellen-endogene 170-kda-Antigen und copräzipitiert ELAM-1.
Fig. 29 zeigt ein SDS-Polyacrylamid-reduziertendes Gel (10 % Acrylamid) Muster für Immunpräzipitate von mit ³&sup5;S- Cystein entweder 45 oder 120 Minuten und gepulste und entweder nach 45 Minuten (Fig. 29A, ersten zwei Bahnen) oder für zusätzliche 1 oder 2 Stunden für die Lyse gechaste (Fig. 29A übrige Bahnen) Endothelialzellen. Für Fig. 29B wurden die Endothelialzellen im IL-1 4 Stunden exponiert und dann mit ¹²&sup5;Jod oberflächenmarkiert. Die Gele zeigen die Kinetiken der 3A2: ELAM-1-Assoziation. In der Figur bedeuten MAB 3 und MAb 7 die monoklonalen Antikörper 3A2 und 7A9.
Fig. 30 ist eine graphische Darstellung, die die Kinetiken der Zelloberflächenexpression von CMP-170 und 7A9 (ELAM-1) Antigene zeigt. Die offenen Kreise bedeuten das 7A9-Antigen, und die offenen Dreiecke bedeuten das 3A2-Antigen.
Fig. 31 zeigt Diagramme verschiedener verkürzter Formen des Antigens ELAM-1.
Fig. 32 zeigt Immunpräzipitationsmuster des intakten ELAM-1- Antigens und verschiedener verkürzter Formen des ELAM-1-Antigens mit den monoklonalen Antikörpers 3A2, 3B7 und 7A9. Antigene Fragmente wurden aus den Überständen allein von mit dem angegebenen ELAM-1- Konstrukt transfektierten COS-Zellen erhalten und 48 Stunden später mit ³&sup5;S-Cystein 14 Stunden markiert. Die Strukturen der verkürzten Formen sind in Fig. 31 wiedergegeben.
Fig. 33 ist ein Diagramm des VCAM-1-Antigens und des 1E7/2G7- Antigens.
Fig. 34A bis 34D zeigen eine cDNA-Sequenz für die Basen 24 bis 2243 (kodierende Region) des Moleküls, das für das 1E7/2G7-Antigen kodiert. Die entsprechende Aminosäuresequenz ist auch gezeigt unter Verwendung des Ein-Buchstabensymbolstandards für Aminosäuren.
Die gesamte Beschreibung der ebenfalls anhängigen US- Anmeldung Nr. 07/355 701, angemeldet am 23. Mai 1989, wird hiermit durch Bezugnahme in die Offenbarung mit aufgenommen.
Die Erfindung stellt neue Hybridoma zur Verfügung, die neue monoklonale Maus-Antikörper produzieren mit den oben beschriebenen charakteristischen Eigenschaften und in den Beispielen hierin. Die Erfindung stellt auch neue Antigene zur Verfügung, an die die monoklonalen Antikörper spezifisch binden.
Der Begriff "bindet nicht wesentlich", wie für die erfindungsgemäßen neuen monoklonalen Antikörper verwendet, bedeutet, daß die Bindung nicht statistisch signifikant im Vergleich zu Kontrollen ist, worin keine Bindung auftritt.
Der Begriff "inhibiert nicht die Bindung" wie für die neuen erfindungsgemäßen Antikörper verwendet, bedeutet, daß die Inhibierung nicht statistisch signifikant im Vergleich zu Kontrollen ist, wo keine Inhibierung auftritt.
Der Begriff "inhibiert teilweise die Bindung", wie für die neuen erfindungsgemäßen Antikörper verwendet, bedeutet, daß die Inhibierung statistisch signifikant ist im Vergleich zu Kontrollen, wo keine Inhibierung auftritt, jedoch ist die lnhibierung weniger als die komplette Inhibierung.
Der Begriff "inhibiert vollständig die Bindung", wie für die neuen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper verwendet, bedeutet, daß die Inhibierung innerhalb des experimentellen Fehlers komplett ist. Im allgemeinen ist der experimentelle Fehler im Hinblick auf die Inhibierung der Bindung von Zellen, wie T-Zellen, Granulocycten und/oder Monocyten ca. ± 10%.
Der Begriff "Entzündungsreaktionen, die mit aktivierten Endothelialzellen einhergehen", wie für die neuen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und die erfindungsgemäßen Antigene verwendet, bedeutet Entzündungsreaktionen, die durch die Beteiligung von Endothelialzellen charakterisiert sind, und die Blutzellen, worin sie vorkommen, bei der stabilen Bindung und/oder Extravasation von Leucocyten aus dem Blutstrom im Gewebe.
Entzündung kann nur in Bindung bestehen, falls dies zu einer Leucocyten-vermittelten Schädigung der lokalen Gefäße führt. Die Schädigung kann auch aus der tatsächlichen Passage durch das Blutgefäß herrühren, was zu einer Schädigung umgebender Gefäße aufgrund der Wechselwirkung mit irgendeinem verschiedenen Leucocyten-Subtyp herrührt.
Der Begriff "Sialoglycoprotein", wie hier verwendet, bedeutet ein Protein, das durch seine Fähigkeit zum Einbau von ³&sup5;S- Cystein definiert ist, dessen Mobilität auf Polyacrylamidgelen als Ergebnis der Inhibierung der Glycosylierung durch Tunicamycin und der Entfernung von Sialinsäure durch Vorbehandlung des Immunpräzipitats oder der aktivierten Endothelialzellen erhöht ist.
Der Begriff "im wesentlichen rein", wie für die Antigene, definiert durch die monoklonalen Antikörper, verwendet, bedeutet, daß die Antigene nicht in ihrem natürlichen Zustand vorliegen. D. h. sie sind nicht mit den Zellen verbunden, die die Antigene darstellen, oder mit einer anderen Körperflüssigkeit, in der die Antigene gefunden werden.
Der Begriff "chronische Kinetik" im Hinblick auf in-vitro- Tests, wie für die durch die neuen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper definierte Antigene angewendet, bedeutet, daß die Antigene weiterhin auf humanen Endothelialzellen in Gegenwart von IL-1 für einen Zeitraum von ca. 72 bis 96 Stunden exprimiert werden, und daß die Expression zu Spiegeln höher oder ca. gleich dem ursprünglich erreichten Spiegel nach Zugabe von IL-1 stattfindet. Zwei Beispiele eines solchen Verhaltens sind in Fig. 11 für die durch die monoklonalen Antikörper 1E7 und 2G7 definierten Antigene und in Fig. 22 für die durch die monoklonalen Antikörper 7A9 definierten Antigen gezeigt.
Der Begriff "akute Kinetik" im Hinblick auf die in-vitro- Tests wie für die durch die neuen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper definierte Antigen angewendet, bedeutet, daß die Antigene abnehmen und vollständig verschwinden könnten von der Oberfläche humaner Endothelialzellen in Gegenwart von IL-1 innerhalb eines Zeitraums von ca. 24 Stunden ab Beginn der Zugabe von IL-1. Ein Beispiel eines solchen Verhaltens ist in Fig. 11 für das durch den monoklonalen Antikörper 3A2 definierte Antigen gezeigt.
Der Begriff "chronische Kinetik" im Hinblick auf die in-vivo- Tests wie für die durch die neuen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper definierten Antigene verwendet, bedeutet, daß das Antigen in Blutgefäßen des Gewebes, die an einer chronischen Entzündung leiden, exprimiert werden. Dies ist eine übliche Bestimmung, wie sie durch einen geübten Pathologen, der die Krankengeschichte des Patienten kennt, erstellt werden kann, und auf der Anzahl und der Natur der eindringenden Leucocyten und anderen Standardkriterien beruht.
Der Begriff "akute Kinetik" im Hinblick auf die in-vivo- Tests, wie für die durch die neuen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper definierten Antigene verwendet, bedeutet, daß das Antigen in Blutgefäßen des Gewebes, was an einer akuten Entzündung leidet, exprimiert wird. Dies ist eine übliche Bestimmung, die durch einen geübten Pathologen, der die Krankengeschichte des Patienten kennt, erstellt wird, und auf der Zahl und der Natur der eindringenden Leucocyten und anderer Standardkriterien beruht.

HYBRIDOMA UND MONOKLONALE ANTIKÖRPER

Die erfindungsgemäßen Hybridoma können reproduzierbar durch Routinemaßnahmen nach etablierten Methoden, wie in Einzelheiten in Beispiel 1 beschrieben, produziert werden.
Im allgemeinen ist das Immunogen für die Herstellung immunisierter Zellen IL-1-aktivierte humane Endothelialzellen.
Humane Endothelialzellen können aus Nabelschnüren nach bekannten Verfahren erhalten werden (Jaffe et al., J. Clin. Invest., 52: 2745-2757, 1973). D. h. die Zellen werden von dem Blutgefäßwänden durch Behandlung mit Collagenase abgestreift und in Gelatine-beschichteten Gewebekulturflaschen im M 199-Medium, enthaltend 20 % niedriges Endotoxin fetales Kalbsserum, 90 ug/ml Konservierungsstoff-freie Schweineheparin, 20 ug/ml Endothelialzell-Wachstumgssupplement (ECGS), Glutamin und Antibiotika, kultiviert. ECGS ist eine rohe Wachstumsfaktorpräparation, erhalten aus dem Rinderhypothalamus, wobei der Schlüsselbestandteil Fibroblasten-Wachstumsfaktor ist. ECGS ist handelsüblich erhältlich.
Die Endothelialzellen werden durch Zügabe von IL-1-beta zu 1 ng/ml für 4 Stunden aktiviert. IL-1-beta ist ohne weiteres für den Fachmann erhältlich, sowohl handelsüblich als auch sonst.
Der bestimmte Wirt, der für die schließliche Produktion von Hybridoma immunisiert wird, sollte eine Maus sein. Balb/c- Mäuse sind bevorzugt. Das Immunisierungsplan und die Menge an für die Immunisierung der Maus verwendeten aktivierten Endothelialzellen kann leicht durch den Fachmann festgestellt werden. Z. B. ist ein geeigneter Immunisierungsplan für Balb/c-Mäuse die viermalige Injektion von 3 x 10&supmin;&sup6; IL-1- aktivierten humanen Endothelialzellen, jeweils im Abstand von 10 Tage, wobei die letzte Injektion 3 bis 4 Tage vor der Fusion stattfindet.
Die sensiblisierten Zellen, z. B. immunisierte Milzzellen, werden entfernt, und Splenocyten werden mit der SP2/0- Myelomazellinie oder einer anderen Myelomazellinie nach etablierten Verfahren fusioniert (Köhler G. und Milstein C., Nature, 256: 495-497, 1975 und Young W.W. et al., J. Exp. Med., 150: 1008-1019, 1979). Fusionen werden vorzugsweise mit Polyethylenglycol durchgeführt.
Die bestimmten Myelomzellen, die erfindungsgemäß für die Fusion mit den sensibilisierten Milzzellen des immunisierten Wirts verwendet werden, sind hierfür nicht kritisch, und können jede bekannte Myelomzelle sein, die zur Herstellung von Hybridoma vom Mausursprung geeignet sind. Beispiele solcher Myelomzellen umfassen HAT-sensitive Mäuse- Myelomzellen, wie NS/1-, SPI- und SP2/0-Zellen.
Die fusionierten Zellen werden unter Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, kultiviert.
Nach einem geeigneten Kulturzeitraum werden produzierende monoklonale Anitkörper, die mit IL-1-aktivierten Endothelialzellen, aber nicht mit normalen ruhenden Endothelialzellen reagieren, kloniert und durch limitierende Verdünnung subkloniert.
Im allgemeinen erfolgt das Screenen auf konfluenten Monoschichten ruhender oder IL-1-aktivierter Endothelialzellen. Kulturüberstände werden zu den Monoschichten der Zellen zugegeben und für einen geeigneten Zeitraum, z. B. 60 Minuten bei 4ºC, inkubiert, um zu ermöglichen, daß die monoklonalen Antikörper in den Kulturüberständen mit den Monoschichten der Zellen reagieren. An das Antigen-beschichtete Well-gebundener Antikörper wird im allgemeine durch Sekondärantikörper, z. B. biotinylierter Antimaus-IgM- und IgG-Ziegen- oder Kaninchenantikörper, nachgewiesen, worauf eine geeignete radioaktive Sonde, z. B. ¹²&sup5;Jod-Streptavidin, folgt.
Monoklonale Antikörper, die durch die so isolierten erfindungsgemäßen Hybridoma produziert werden, können in großer Menge durch das Kultivieren großer Chargen an Hybridom-Zellkulturen und Reinigen der Antikörper aus dem Überstand oder durch Injizieren von Mäusen mit der Hybridomlinie unter Stimulierung der Produktion von Ascitesflüssigkeit produziert werden. Beide Verfahren sind im Stand der Technik bekannt.
Nach dem oben beschriebenen Verfahren wurden fünf Hybridoma, die die bevorzugten monoklonalen Antikörper produzieren, hergestellt. Die bevorzugten monoklonalen Antikörper wurden als 1E7, 2G7, 3A2, 7A9 und 3B7 bezeichnet. Die diese monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridoma, bezeichnet als Hybridom 1E7, 2G7, 3A2, 7A9 und 3B7, wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland hinterlegt, und haben die ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10136, HB 10137, HB 10138, HB 10135 und HB 10391.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper 1E7 und 2G7 werden durch die Hybridom-Zellinien 1E7 und 2G7 hergestellt, und umfassen zwei bevorzugte monoklonale Antikörper, die innerhalb der erfindungsgemäßen Gruppe (A) der monoklonalen Antikörper fallen. Die monoklonalen Antikörper der Gruppe (A) haben die folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:
(1) binden nicht wesentlich an normale ruhende Endothelialzellen;
(2) binden nicht wesentlich an normale ruhende oder IL-1- aktivierte epidermale Keratinocyten oder ruhende IL-1- aktivierte Fibroblasten;
(3) binden nicht wesentlich an eine Mischung ruhender oder IL-1-aktivierter Granulocyten oder mononuklearer Zellen, umfassend T-Zellen, B-Zellen und Monocyten;
(4) inhibieren nicht oder inhibieren nur teilweise die Bindung von T-Zellen an aktivierte Endothelialzellen in vitro;
(5) inhibieren nicht die Bindung von Granulocyten an IL-1- aktivierte Endothelialzellen in vitro; und
(6) binden spezifisch an das 1E7/2G7- Sialoglycoproteinantigen auf der Oberfläche IL-1- aktivierter Endothelialzellen, das definiert ist durch die cDNA-Sequenz wie in den Fig. 34A bis 34D gezeigt.
Von den obigen kennzeichnenden Eigenschaften inhibiert eine Untergruppe der monoklonalen Antikörper, die die monoklonalen Antikörper 1E7 umfaßt, nicht die Bindung von T-Zellen an IL- 1-aktivierte Endothelialzellen in vitro, und eine Untergruppe von monoklonalen Antikörpern, die den monoklonalen Antikörper 2G7 umfaßt, inhibiert teilweise die Bindung von T-Zellen an IL-1-aktivierte Endothelialzellen in vitro.
Ein weiteres kennzeichnendes Merkmal einer Untergruppe der Gruppe (A) monoklonaler Antikörper ist das, daß sie teilweise die Bindung von THP-1-Myelomonocytazellen an IL-1-aktivierten Endothelialzellen in vitro inhibiert. Diese Eigenschaft zeigt sich bei einer Untergruppe der Gruppe (A) inonoklonaler Antikörper, die den bevorzugten monoklonalen Antikörper 2G7 umfaßt.
Weitere kennzeichnende Eigenschaften des bevorzugten monoklonalen Antikörpers 1E7 sind, daß der monoklonale Antikörper eine Mäuse-monoklonaler Antikörper ist, und einen Isotyp von IgG2a hat.
Weitere kennzeichnende Eigenschaften des bevorzugten monoklonalen Antikörpers 2G7 sind, daß der monoklonale Antikörper ein Mäuse-monoklonaler Antikörper ist, und einen Isotyp von IgG1 hat. Auch inhibiert der monoklonale Antikörper 2G7 teilweise die Bindung von THP-1- Myelomonocytazellen an IL-1-aktivierten Endothelialzellen in vitro.
Der erfindungsgemäße monoklonalen Antikörper 3A2 wird durch die Hybridom-Zellinie 3A2 produziert und umfaßt einen bevorzugten monoklonalen Antikörper, der in die Gruppe (B) monoklonaler Antikörper der Erfindung fällt. Die Gruppe (B) monoklonaler Antikörper hat die folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:
(1) bindet nicht wesentlich an normale ruhende Endothelialzellen;
(2) bindet nicht wesentlich an normale ruhende oder IL-1- aktivierte epidermale Keratinocyten oder ruhende oder IL-1-aktivierte Fibroblasten;
(3) bindet nicht wesentlich an eine Mischung ruhender oder IL-1-aktivierter Granulocyten oder mononuklearer Zellen, umfassend T-Zellen, B-Zellen und Monocyten; und
(4) bindet spezifisch an CMP-170-Antigen, das im Cytoplasma ruhender und aktivierter IL-1 Endothelialzellen und auf der Oberfläche IL-1-aktivierter Endothelialzellen vorkommt.
Weitere kennzeichnenden Eigenschaften der Gruppe (B) monoklonaler Antikörper sind, daß sie spezifisch an CMP-170, das auf ruhende Fibroblasten und Leucocyten gefunden wird, binden.
Weitere kennzeichnende Eigenschaften des bevorzugten monoklonalen Antikörpers 3A2 sind, daß der monoklonale Antikörper ein Maus-monoklonaler Antikörper ist, und einen Isotyp von IgM hat.
Monoklonale Antikörper 7A9 und 3B7, gemäß der Erfindung, werden durch die Hybridom-Zellinien 7A9 und 3B7 produziert, und umfassen zwei bevorzugte monoklonale Antikörper, die in die Gruppe (C) monoklonaler Antikörper der Erfindung fallen. Die Gruppe (C) monoklonaler Antikörper hat die folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:
(1) binden nicht wesentlich an normale ruhende Endothelialzellen;
(2) binden nicht wesentlich an normale ruhende oder IL-1- aktivierte epidermale Keratinocyten oder ruhende oder IL-1-aktivierte Fibroblasten;
(3) binden nicht wesentlich an eine Mischung ruhender oder IL-1-aktivierter Granulocyten oder mononuklearer Zellen, umfassend T-Zellen, B-Zellen und Monocyten;
(4) inhibieren teilweise die Bindung von T-Zellen an aktivierte Endothelialzellen in vitro;
(5) inhibieren vollständig oder teilweise die Bindung von Granulocyten an IL-1-aktivierte Endothelialzellen in vitro; und
(6) binden spezifisch an die N-terminalen 20 % von ELAM-1- Sialoglycoproteinantigen, das auf der Oberfläche IL-1- aktivierter Endothelialzellen vorkommt; und
(7) binden nicht an 1E7/2G7-Sialoglycoproteinantigen, das auf der Oberfläche IL-1-aktivierter Endothelialzellen vorkommt.
Im Hinblick auf die oben angegebenen kennzeichnenden Eigenschaften inhibiert eine Untergruppe der monoklonalen Antikörper, die den monoklonalen Antikörper 7A9 umfaßt, vollständig die Bindung von Granulocyten an IL-1-aktivierte Endothelialzellen in vitro, und eine Untergruppe der monoklonalen Antikörper, die den monoklonalen Antikörper 3B7 umfaßt, inhibiert teilweise die Bindung von Granulocyten an IL-1-aktivierte Endothelialzellen in vitro.
Weitere kennzeichnende Eigenschaften des bevorzugten monoklonalen Antikörpers 7A9 sind, daß ein monoklonaler Mäuse-Antikörper ist und einen Isotyp von IgG1 hat.
Weitere kennzeichnende Eigenschaften des bevorzugten monoklonaler Antikörpers 3B7 sind, daß er monoklonaler Mäuse- Antikörper ist und einen Isotyp von IgG2a hat.
Bindungsstellen-haltige Fragmente von irgendeinem der oben beschriebenen monoklonalen Antikörper können durch im Stand der Technik zahlreich bekannte Verfahren erhalten werden, wie z. B. Pepsinverdau, verwendet zur Herstellung von (Fab)&sub2;- Fragmenten. Sie Parham, J. Immunol., 131: 2893-2092, 1983.
Ein spezifischer Test zur Bestimmung der Bindung an normale ruhende Endothelialzellen ist in Beispiel 2B beschrieben.
Im allgemeinen kann jedoch ein Test nach mehreren im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, z. B. nach solchen beschrieben in Handbook of Experimental Immunology 4th Edition, 1986, D.M. Weir, Autor, Bd. 1-4, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England.
Spezifische Tests zur Bestimmung der Bindung an normale ruhende oder IL-1-aktivierte epidermale Keratinocyten oder ruhende oder IL-1-aktivierte Fibroblasten sind in Beispiel 3(B) dargelegt.
Jedoch kann der Test im allgemeinen nach im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie z. B. solchen beschrieben in Handbook of Experimental Immunology 4th Edition, 1986, D.M. Weir, Autor, Bd. 1-4, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England.
Ein Test zur Bestimmung, ob die obig beschriebenen monoklonalen Antikörper an eine Mischung ruhender oder IL-1- aktivierter Granulocyten oder mononuklearer Zellen, umfassend T-Zellen, B-Zellen und Monocyten, binden, ist in Beispiel 3(B) beschrieben.
Jedoch können im allgemeinen verschiedene bekannte Methoden für diese Bestimmung eingesetzt werden, wie z. B. solche beschrieben in Handbook of Experimental Immunology 4th Edition, 1986, D.M. Weir, Autor, Bd. 1-4, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England.
Ein spezifischer Test zur Bestimmung, ob die oben beschriebenen monoklonalen Antikörper die Bindung von T- Zellen an IL-1-aktivierte Endothelialzellen in vitro inhibierten, ist in Beispiel 2(E) dargelegt.
Es ist jeder von mehreren bekannten Verfahren geeignet, wie z. B. beschrieben bei Masuyama und Kano, J. Clin. Invest., 77: 1596-1605, 1986.
Ein spezifisches Verfahren zur Bestimmung, ob der obige monoklonale Antikörper die Bindung von Granulocyten an IL-1- aktivierte Endothelialzellen in vitro inhibiert, ist in Beispiel 2(D) beschrieben.
Es ist jedoch jedes von mehreren bekannten Verfahren geeignet, wie z. B. solche beschrieben in z. B. Prober et al., J. Immunol., 136: 1860-1687, 1986.
Ob die obig beschriebenen monoklonalen Antikörper spezifisch an das 1E7/2G7-Sialoglycoproteinantigen, CMP-170-Antigen und ELAM-1-Sialoglycoproteinantigen binden, kann durch Durchführung von Flußcytometrie wie in Beispiel 2(B) beschrieben, bestimmt werden.
Ein spezifisches Verfahren zur Bestimmung, ob die obig beschriebenen monoklonalen Antikörper an die N-terminalen 20 % des ELAM-1-Sialoglycoproteinantigens binden, ist in Beispiel 5 beschrieben.

NEUE ANTIGENE UND ANTIGENE FRAGMENTE

Die Erfindung stellt auch neue im wesentlichen reine Antigene und antigene Fragmente von Antigenen, die auf IL-1- aktivierten Endothelialzellen gefunden werden, zur Verfügung. Die Antigene und antigenen Fragmente sind bezeichnet 1E7/2G7-, CMP-170- und neue Antigene, die antigene Fragmente des bekannten Antigens ELAM-1 sind.
Das 1E7/2G7-Antigen hat die folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:
(1) es ist ein Sialoglycoprotein;
(2) Molekularmasse, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen;
(a) Hauptbande bei ca. 114 kDa;
(b) Nebenbande bei ca. 95 kDa;
(3) Molekularmasse, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen;
(a) Hauptbande bei ca. 100 kDa;
(b) Nebenbande bei ca. 93 kDa;
(4) Molekularmasse, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen, reduziert um ca. 1 bis 2 kDa nach Entfernung der O- verknüpften Zucker;
(5) isoelektrischer Punkt ca. 4,8 bis 4,9, bestimmt durch 2- D-Gelanalyse;
(6) nicht-exprimiert auf konstitutiven oder Thrombinstimulierten peripheralen mononuklearen Blutzellen, Granulocyten, Blutplättchen; Fibroblasten oder Keratinocyten;
(7) Expression auf IL-1-aktivierten Endothelialzellen, stimuliert durch E. coli-Lipopolysaccharid (lps) und Tumornicrosefaktor-alpha (TNF), jedoch nicht durch gamma-Interferon (IFNγ);
(8) zeigt eine chronische Kinetik, wie in vitro durch die Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers 1E7 und/oder 2G7 zur Bindung an humane Endothelialzellen, die für zunehmend längere Zeiträume mit IL-1 vorbehandelt wurden, bestimmt, wobei der monoklonale Antikörper 1E7, durch die Hybridom-Zellinie 1E7 mit der ATCC- Hinterlegungsnummer HB 10136 produziert wird, und der monoklonale Antikörper 2G7, der Hybridom-Zellinie 2G7 produziert wird, die ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10137 hat;
(9) zeigt eine chronische und akute Kinetik, wie in vivo durch Expression des Antigens in Blutgefäßen von Gewebe, das entweder an chronischer oder akuter Entzündung leidet, bestimmt;
(10) bindet nicht an Antikörper, die spezifisch an ELAM-1 oder ICAM-1 binden;
(11) bindet an den monoklonalen Antikörper 1E7 und/oder den monoklonalen Antikörper 2G7; und
(12) exprimiert durch COS-Zellen, die mit der in Fig. 34A bis 34D gezeigten cDNA-Sequenz transfektiert wurden;
Geeignete Fragmente des 1E7/2G7-Antigens umfassen das antigene Fragment, umfassend ein Epitop, das an den monoklonalen Antikörper 1E7 und nicht an den monoklonalen Antikörper 2G7 bindet, wie auch ein antigenes Fragment, das ein Epitop enthält, das an den monoklonalen Antikörper 2G7, und nicht an den monoklonalen Antikörper 1E7 bindet.
Zusätzliche kennzeichnende Eigenschaften des 1E7/2G7-Antigens sind, daß seine Molekularmasse, bestimmt durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen, nach Tunicamycinbehandlung zur Verhinderung der Kohlenhydratanheftung, ca. 80 kDa ist.
Das CMP-170-Antigen hat die folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:
(1) Molekularmasse, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter reduzierenden und nicht- reduzierenden Bedingungen: ca. 170 kDa;
(2) wird nicht auf der Oberfläche ruhender oder IL-1- stimulierten peripherer mononuklearer Blutzellen, Granulocyten, Fibroblasten oder Keratinocyten exprimiert;
(3) kommt im Cytoplasma ruhender Endothelialzellen, Fibroblasten und Leucocyten vor;
(4) Expression auf der Zelloberfläche aktivierter Endothelialzellen inhibiert durch Cycloheximid und Actinomycin D;
(5) lokalisiert keine Weibel-Palade-Körperchen in Endothelialzellen;
(6) assoziiert an der Zelloberfläche mit ELAM-1 in IL-1- stimulierten Endothelialzellen;
(7) zeigt eine akute Kinetiken, bestimmt in vitro durch die Fähigkeit des inonoklonalen Antikörper 3A2 zur Bindung an humane Endothelialzellen, die für zunehmend längere Zeiträume mit IL-1 vorbehandelt wurden, bestimmt, wobei der monoklonale Antikörper 3A2 durch Hybridom-Zellinie 3A2 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10138 produziert wird; und
(8) bindet an den monoklonalen Antikörper 3A2.
Das Antigen, das aus dem antigenen Fragment des ELAM-1- Antigens besteht, hat die folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:
(1) umfaßt ca. die N-terminalen 31 % des ELAM-1-Antigens;
(2) bindet an monoklonalen Antikörper 7A9, produziert von der Hybridom-Zellinie 7A9 mit der ATCC- Hinterlegungsnummer HB 10135;
(3) bindet an monoklonalen Antikörper 3B7, produziert durch die Hybridom-Zellinie 3B7 mit der ATCC- Hinterlegungsnummer HB 10391; und
(4) wird nicht auf konstituiven oder Thrombin-stimulierten peripheren mononuklearen Blutzellen, Granulocyten, Blutplättchen, Fibroblasten oder Keratinocyten exprimiert; und
(5) Expression auf IL-1-aktivierten Endothelialzellen stimuliert durch E. coli-Lipopolysaccharid (lps) und Tumornecrosefaktor-alpha (TNF), aber nicht durch gamma- Interferon (IFNγ).
Das Verfahren zur Bestimmung der Molekularmasse durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen ist im Stand der Technik bekannt und ist z. B. in Two Dimensional Electrophoresis and Immunological Techniques, Bonnie S. Dunbar, Plenum Press, New York, 1987 beschrieben.
Bei der Beschreibung der Molekularmasse sind die Begriffe "Hauptbande" und "Nebenbande" relativ, bezogen auf die Intensitäten der Banden in einem gegebenen Experiment. Jedoch kann der Fachmann leicht bestimmen, ob eine Bande die Hauptbande oder eine Nebenbande ist, z. B. durch Vergleich mit den Zeichnungen in der vorliegenden Anmeldung.
Der isolelektrische Punkt des Antigens wird auch durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren bestimmt, wie z. B. durch 2-D-Gelanalyse, wie beschreiben bei Garrels, Methods Enzymol., 100: 411-423, 1983 und in Two Dimensional Electrophoresis and Immunological Techniques, Bonnie S. Dunbar, Plenum Press, New York, 1987.
O-verknüpfte Zucker können nach bekannten Verfahren, wie z. B. in Beispiel 4(F) beschrieben, entfernt werden.
Andere Verfahren, die zur Entfernung O-verknüpfter Zucker eingesetzt werden können, sind im Handbook of Exprimental Immunology 4th Edition, 1986, D.M. Weir, Autor, Bd. 1-4, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England beschrieben.
Ein spezifisches Beispiel für einen Test zur Bestimmung, ob die erfindungsgemäßen Antigene auf ruhenden oder Thrombinoder IL-1-stimulierten peripheren mononuklearen Blutzellen, Granulocyten, Blutplättchen, Fibroblasten oder Keratinocyten exprimiert werden oder nicht, sind in den Beispielen 4(J) und (M) dargelegt.
Andere Verfahren, die zur Bestimmung eingesetzt werden können, ob die Antigene auf ruhenden oder Thrombin- oder IL- 1-stimulierten Zellen exprimiert werden, sind im Handbook of Exprimental Immunology 4th Edition, 1986, D.M. Weir, Autor, Bd. 1-4, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England beschrieben.
Ein spezifisches Verfahren zur Bestimmung, ob die Expression der erfindungsgemäßen Antigene auf IL-1-aktivierten Endothelialzellen durch lps, TNF und/oder IFNγ) stimuliert wird, ist in Beispiel 4(K) beschrieben.
Ein Verfahren zur Bestimmung, ob die erfindungsgemäßen Antigene eine chronische Kinetik und/oder akute Kinetik in vitro zeigen, ist in Beispiel 3(C) und 4(I) beschrieben.
Ob die erfindungsgemäßen Antigene eine chronische und/oder akute Kinetik in vivo zeigen, kann durch Beobachtung der Expression des Antigens in den Blutgefäßen vom Gewebe, das an einer chronischen oder akuten Entzündung leidet, bestimmt werden. Dies ist eine übliche Bestimmung, die durch einen geübten Pathologen, der die Krankengeschichte des Patienten kennt, durchgeführt werden kann und beruht auf der Zahl und der Natur der eindringenden Leucocyten und anderer Standardkriterien.
Ob die Antigene an bestimmte monoklonale Antikörper binden, kann durch Durchführung der Flußcytometrie, wie in Beispiel 2(B) beschrieben, festgestellt werden.
Ein spezifisches Verfahren zur Bestimmung, ob ein Antigen im Cytoplasma ruhender Endothelialzellen vorkommt, ist in Beispiel 4(P) beschrieben.
Zellen können z. B. mit Aceton oder Ethanol durchlässig gemacht werden, um zu ermöglichen, daß ein Antikörper mit im Inneren der Zellen vorhandenen Antigen reagiert. Die Zellen werden dann durch übliche Verfahren nach Umsetzen mit einer indirekten Sonde, die mit dem Antikörper reagiert, sichtbar gemacht. Siehe z. B. Fig. 26, wo alkalische Phosphatase, die an Ziege-Antimaus-Antikörper gekoppelt wurde, als indirekte Sonde verwendet wurde.
Ein spezifisches Verfahren zur Bestimmung, ob die Expression von Antigenen auf der Oberfläche aktivierter Endothelialzellen durch Cycloheximid und Actinomycin D inhibiert wird, ist in Beispiel 4(O) beschrieben.
Andere Verfahren, die anstelle der oben beschriebenen verwendet werden können, umfassen den Einsatz der Flußcytometrie, wie in Beispiel 2(B) beschrieben durchgeführt.
Übliche Verfahren können zur Bestimmung eingesetzt werden, ob Antigen Weibel-Palade-Körperchen lokalisiert werden. Die Verfahren umfassen die Bestimmung, ob das Antigen (bei Beobachtung unter dem Lichtmikroskop) mit den von-Willebrand- Faktor (vWF) - dem Hauptbestandteil von Weibel-Palade- Körpern - lokalisiert.
Geeignete Zellen, wie z. B. ruhende humane Endothelialzellen, werden kultiviert, und unter Verwendung von PBS-EDTA und Cytospun auf Glasmikroskop-Objektträger aufgebracht. Die Zellen werden mit Aceton fixiert und getrocknet, um sie durchlässig zu machen. Dann werden die Zellen nach einem Doppelfärbeplan, wie z. B. im Beispiel 4(P) beschrieben, mit dem fraglichen Antikörper und dem Anti-vWF-Antikörper (handelsüblich erhältlich) gefärbt. Die gefärbten Zellen werden dann auf Doppelfärbung von vWF geprüft.
Zusätzlich kann auch mit nur dein fraglichen Antikörper gefärbten Zellen der Fachmann leicht bestimmen, ob der Antikörper in Weibel-Palade-Körpern vorliegt.
Zwei spezifische Verfahren zur Bestimmung, ob ein Antigen an der Zelloberfläche mit ELAM-1 in IL-1-stimulierten Endothelialzellen assoziiert, sind in Beispiel 4(Q) beschrieben.
Andere Verfahren, die anstelle der oben beschriebenen eingesetzt werden können, umfassen die Verwendung von Vernetzungsmitteln auf der Zelloberfläche und die Coimmunpräzipitation, wie beschrieben bei Handbook of Experimental Immunology 4th Edition, 1986, D.M. Weir, Autor, Bd. 1-4, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England beschrieben.
Die neuen Antigene und antigenen Fragmente können nach üblichen Verfahren hergestellt und gereinigt werden, von denen einige in Einzelheiten in den Beispielen beschrieben sind.
Die Reinigung der ELAM-1-Fraginente kann nach dem Immunpräzipitationsprotokoll, wie in Beispiel 4(B) angegeben, erfolgen. Für eine Reinigung im größeren Maßstab kann der 1E7 oder 2G7 monoklonale Antikörper (z. B. 5 mg) an Affigel-10- Perlen (z. B. 5 ml) (handelsüblich erhältlich) nach der vom Hersteller angegebenen Standardvorschrift konjugiert werden, und man läßt Flüssigkeiten (Überstände von Zellen, die ELAM- 1-Fragmente produzieren) mit dem Antikörper beschichteten Perlen interagieren. Die Perlen werden mit PBS-TWEEN gespült, um nicht-spezifisch gebundenes Material zu entfernen, und die Antigenfragmente werden nach mehreren Standardtechniken, wie z. B. für ICAM-1-Fragmente in Marlin et al., Nature, 344: 70- 72, 1990 beschrieben, eluiert.
Zur Verwendung in löslicher Form sollten die Antigene oder antigenen Fragmente synthetisch produziert werden. Die Antigene können nach bekannten Verfahren kloniert und sequenziert werden (siehe z. B. Bevilacqua et al., Science, 243: 1160-1164, 1989). Die Bestimmung des aktiven Zentrums oder Zentren erfolgt auch durch Standardverfahren (siehe z. B. Peterson und Seed, Cell, 54: 65-72, 1988) wie bei der Synthese von Peptidfragmenten.
Die neuen Antigene und antigene Fragmente können zum Test auf die Blockade der Bindung weißer Blutzellen an aktivierte Endothelialzellen verwendet werden, um festzulegen, ob die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper eine solche Bindung verhindern. Der Fachmann kann leicht geeignete Testbedingungen festlegen.
Z. B. werden mononukleare Zellen, deren Bindung getestet werden soll, mit Antigen oder antigenem Fragment in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Konzentration und Temperatur für eine Zeit, die ausreichend ist, alle antigenen Bindungsstellen zu sättigen, vorinkubiert. Nach der Vorinkubation werden die mononuklearen Zellen bei ständiger Anwesenheit des Peptids zu aktivierten Endothelialzellen gegeben. Die nicht-anhaftenden Mononuklearzellen werden durch Abspülen mit Puffer abgewaschen, und die Zahl der an die aktivierten Endothelialzellen gebundenen Zellen wird bestimmt. Zur Kontrolle kann ein Paralleltest, unter Verwendung nicht-aktivierter Endothelialzellen durchgeführt werden.
Der Nachweis kann quantitativ durch Einbau eines radioaktiven Tracers, z. B. &sup5;¹Cr, nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren, in das Cytoplasma der Zellen, deren Bindung untersucht werden soll, Waschen zur Entfernung von extrazellulärer Radioaktivität und Aufbringen dieser markierten Zellen über die Endothelialzell-Monoschicht erfolgen.
Ein erfindungsgemäßer Test zum Nachweis der Blockade der Bindung weißer Blutzellen an aktivierte Endothelialzellen ist in Einzelheiten in Beispiel 4(U) beschrieben.
Die neuen erfindungsgemäßen Antigene sind in löslicher Form geeignet zur Blockade der Wechselwirkung weißer Blutzellen mit aktivierten Endothelialzellen, wie in Einzelheiten in dem Abschnitt mit dem Titel "Medikamente und Verfahren zur Behandlung von Entzündungsprozessen", beschrieben.

MEDIKAMENTE UND VERFAHREN ZUR BEHANDLUNG VON ENTZÜNDUNGSPROZESSEN

Die Erfindung stellt auch Medikamente und Verfahren zur Behandlung von Entzündungsprozessen zur Verfügung, die mit aktivierten Endothelialzellen einhergehen.
In einer Ausführungsform umfaßt das Medikament:
(I) eine pharmazeutisch wirksame Menge eines monoklonalen Antikörpers oder eines Bindungsstellen-haltigen Fragments davon, oder pharmazeutisch annehmbare Salze der monoklonalen Antikörper oder des Fragments, worin der monoklonale Antikörper mindestens einer der monoklonalen Antikörper aus der Gruppe (A) ist, der teilweise die Bindung von T-Zellen an aktivierte Endothelialzellen in vitro oder der monoklonale Antikörper aus der Gruppe (C), beide zuvor beschrieben und
(II) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünner oder Exzipienten.
In einer zweiten Ausführungsform umfaßt das Medikament:
(I) eine pharmazeutisch wirksame Menge eines im wesentlichen reinen Antigens oder antigenen Fragments davon, oder pharmazeutisch annehmbarer Salze des Antigens oder Fragments, worin das Antigen mindestens ein Antigen ist, ausgewählt aus mindestens dem zuvor oben beschriebenen 1E7/2G7-Antigen, dem CMP-170-Antigen und dem antigen Fragment von ELAM-1.
In gleicher Weise umfaßt gemäß einer Ausführungsform das Verfahren die Verabreichung an einen Patienten, der der Behandlung bedarf, einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines monoklonalen Antikörpers, oder eines Bindungsstellen-haltigen Fragments davon, oder pharmazeutisch annehmbarer Salze des monoklonalen Antikörpers oder des Fragments, worin der monoklonale Antikörper mindestens einer der oben beschriebenen monoklonalen Antikörper aus Gruppe (A) ist, der teilweise die Bindung von T-Zellen an aktivierte Endothelialzellen in vitro inhibiert, oder einer der obig beschriebenen monoklonalen Antikörper aus Gruppe (C).
In einer zweiten Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Verabreichung an einen Patienten, der der Behandlung bedarf, einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines im wesentlichen reinen Antigens oder antigenen Fragments davon, oder pharmazeutisch annehmbarer Salze des Antigens oder des Fragments, worin das Antigen mindestens ein Antigen ausgewählt aus dem oben beschriebenen 1E7/2G7-Antigen, dem CMP-170-Antigen und dem antigenen Fragment von ELAM-1 ist.
Die als Medikamente und in den Verhandlungsverfahren geeigneten monoklonalen Antikörper sind dieselben wie oben beschrieben, die zur Verhinderung der Bindung weißer Blutzellen an IL-1-aktivierte Endothelialzellen in vitro in der Lage sind, und in bevorzugten Ausführungsformen sind es die monoklonalen Antikörper 2G7, 7A9 und 3B7 wie oben beschrieben.
Chimere Antikörper, die die komplementären bestimmenden Regionen (CDR) der Antikörper der Erfindung und die Nicht- CDR-Regionen von geeigneten humanen Immunglobulinen enthalten, können auch verwendet werden (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033, 1989).
Die als Medikament und in den Behandlungsverfahren geeignete Antigene sind alle die oben beschriebenen neuen Antigene. Jedoch erwartet man, daß die oben beschriebenen Antikörper, an die die monoklonalen Antikörper 2G7, 7A9 und 3B7 spezifisch binden, besonders nützlich sind.
Geeignete pharmazeutisch annehmbare Salze können leicht durch den Fachmann bestimmt werden.
Geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünner oder Exzipienten können leicht durch den Fachmann bestimmt werden. Beispiele umfassen isotonische Kochsalzlösung (0,15 M NaCl) und Ringer's Glucoseinfusionslösung.
Die Medikamente können nach für den Fachmann leicht bestimmten Methoden, z. B. intravenös verabreicht werden.
Geeignete Dosierung zur Verabreichung können je nach der Art der Entzündungserkrankung variieren, können jedoch leicht durch den Fachmann festgestellt werden.
Im allgemeinen ist eine geeignete Dosis für eine intravenöse Injektion am Menschen ca. 20 bis 50 mg des monoklonalen Antikörpers oder des Bindungsstellen-haltigen Fragments davon oder des Antigens oder antigenen Fragments davon.
Fig. 1 ist eine vereinfachte schematische Darstellung wie man glaubt, daß die Medikamente und die erfindungsgemäßen Behandlungsverfahren wirken.
Die Medikamente und Behandlungsverfahren sind für jede Entzündungsreaktion, die mit aktivierten Endothelialzellen einhergeht, anwendbar und können sowohl für akute wie auch chronische Entzündungen verwendet werden.
Natürlich können Kombinationen verschiedener Medikamente immer verwendet werden, so lange das neue Antigen nicht in einem Medikament mit einem entsprechenden monoklonalen Antikörper kombiniert ist.
Der Fachmann kann leicht die Entzündungsreaktionen feststellen, für die die Medikamente und die Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Beispiele umfassen Tumorzell-vermittelte vaskuläre Schädigung, rheumatoide Arthritis, Post-Reprefusion, myokardiale Verletzung (Schädigung durch Granulocyten) und "adult respiratory distress syndrome" (Makrophagen und Granulocyten). Beispiele sind auch offenbart bei Simpson P.J. et al., J. Clin. Invest., 81: 624-629, 1988; Vedder N.B. et al., J. Clin. Invest., 81: 939-944, 1988; Simon und Ward "Adult Respiratory Distress Syndrome" in Inflamation: Basic Principles and Clinical Correlations (Gallin J.I., Goldstein I.M. und Snyderman R.; eds) Raven Press, New York, 1988, S. 815; Kadison und Barton "Vasculitis: Mechanisms of Vessel Damage ld. S. 703; und Harris "Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis: A Disorder Associated with Dysfunctional Immunoregulation ld. S.751.

VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON ENTZÜNDUNGSREAKTIONEN

Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von Entzündungsreaktionen, die mit aktivierten Endothelialzellen einhergehen, zur Verfügung, wobei das Verfahren umfaßt
(I) in Kontakt bringen einer biologischen Flüssigkeit mit mindestens einem der oben beschriebenen monoklonalen Antikörper aus Gruppe (A), (B) oder (C) oder Bindungsstellen-haltiger Fragmente davon, und
(II) Testen auf spezifische Bindung des monoklonalen Antikörpers oder Bindungsstellen-haltigen Fragments davon an das Antigen in der biologischen Flüssigkeit.
Das Verfahren zur Herstellung und Reinigung der monoklonalen Antikörper wurde bereits oben beschrieben.
Der Begriff "biologische Flüssigkeit" bedeutet Serum, Urin, Synovialflüssigkeit und andere Körperflüssigkeit, von der man annimmt, daß die in einer Entzündung produzierten Antikörper enthält.
Der Nachweis kann entweder in vitro oder in vivo erfolgen. Der in-vitro-Nachweis aus ausgeführt werden nach irgendeinem bekannten in vitro immunologischen Test, wie beschrieben bei Young W.W. et al., J. Exp. Med., 150: 1008-1019 (1979) und Kannagi R. et al., Cancer Res., 43: 4997-5005 (1983). Ferner kann der in-vivo-Nachweis unter Verwendung irgendeines bekannten in vivo immunologischen Test, wie z. B. beschrieben bei Burchell J. et al., Int. J. Cancer, 34: 763-768 (1984); Epenetos A.A. et al., Lancet, 2: 999-1004 (1982); Chantal J.- F. et al., J. Nuclear Med., 26: 531-537 (1985).
Ein speziell bevorzugtes Verfahren zum Nachweis des Antigens in biologischen Flüssigkeiten ist die Sandwich-ELISA-Technik. Dieses Verfahren besteht in seiner bevorzugten Form aus der Anheftung von monoklonalen Antikörpern gegen ein Epitop des fraglichen Proteins an eine Plastik-NUNC-ELISA-Schale. Hierauffolgt die Zugabe von Rinderserumalbumin in einer 1%igen Lösung, um nicht-spezifische Bindung von Proteinen in biologischen Flüssigkeiten zu blockieren. Nach Spülen der Wells unter Entfernung ungebundener Proteine, werden die biologischen Flüssigkeiten (Blut, Urin, usw.) für den Zeitraum von 1 Stunde zu der Schale gegeben. Nach Waschen zur Entfernung ungebundener biologischer Flüssigkeit wird der zweite monoklonale Antikörper gegen ein anderes Epitop des fraglichen Proteins zugegeben. Der zweite monoklonale Antikörper wird mit einem geeigneten Nachweismolekül, wie alkalischer Phosphatase, konjugiert. Nach einer Inkubation werden die Wells gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen, und ein geeignetes Enzymsubstrat (falls das Nachweismolekül ein Enzym ist), wie z. B. Aminoethylcarbazol, wird zugegeben, und das Reaktionsprodukt auf einem ELISA- Plattenableser quantifiziert. Ein Beispiel zur Durchführung eines Sandwich-ELISAS, beschrieben bei Lokeshwar und Lin. J. Immunol. Methods, 123: 123-129 (1989).
Das Verfahren kann z. B. verwendet werden, um eine frühe Transplantatabstoßung oder subklinische Infektionen oder Vaskulitis nachzuweisen.

cDNA-SEQUENZ UND DIE cDNA DES 1E7/2G7-ANTIGENS TRAGENDER VEKTOR

Die Erfindung stellt auch eine cDNA-Sequenz, oder ein Fragment davon, und einen Vektor, der die cDNA-Sequenz oder ein Fragment davon trägt, das für das Antigen 1E7/2G7 kodiert, zu Verfügung.
Die cDNA-Sequenz umfaßt die Sequenz wie im wesentlichen in den Fig. 34A bis 34D bezeigt, mit der Maßgabe, daß die Basen 952 bis 1227 im wesentlichen wie in Fig. 34B gezeigt vorliegen.
Im "wesentlichen wie gezeigt" soll bedeuten, daß die in den Fig. 34A bis 34D gezeigte cDNA-Sequenz-Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen an Basen haben kann:
(1) so lange wie die cDNA-Sequenz immer noch als Sonde zur Isolierung von mRNA verwendet werden kann, welche die Synthese des Antigens 1E7/2G7 oder eines antigenen Fragments davon steuert, oder
(2) so lange wie die Lingand-bindenden Eigenschaften des Liganden, für den die cDNA-Sequenz kodiert, erhalten bleiben.
Fragmente der cDNA-Sequenz, im wesentlichen wie gezeigt oder direkt wie in den Fig. 34A bis 34D gezeigt, sind Fragmente der cDNA-Sequenz, die für Fragmente des 1E7/2G7-Antigens kodieren, bei denen die Liganden-bindenden Eigenschaften erhalten sind.
Ob eine cDNA-Sequenz oder ein Fragment davon noch als Sonde zur Isolierung von mRNA, welche die Synthese von Antigen 1E7/2G7 oder eines antigenen Fragments davon steuert, kann leicht durch den Fachmann nach üblichen Verfahren und ohne unzumutbare experimentelle Untersuchungen bestimmt werden.
Ob eine cDNA-Sequenz oder ein Fragment davon für ein Protein kodiert, bei dem die Ligand-bindenden Eigenschaften erhalten sind, kann auch leicht durch den Fachmann nach üblichen Verfahren und ohne unzumutbare experimentelle Tätigkeit wie folgt bestimmt werden.
Zunächst sollte der Fachmann feststellen, daß die solubilisierte Form von 1E7/2G7 gemacht werden kann und daß diese Form an die Zellen bindet. Die lösliche Form wird hergestellt durch Deletion der cytoplasmatischen und Transmembran-Regionen. Praktisch wird ein Stop-Codon in die kodierende Sequenz eingeführt, was verhindert, daß diese Regionen translatiert werden. COS-Zellen werden mit dieser nach üblichen Verfahren, z. B. Ca&spplus;&spplus;-Schock nachgewiesenen Form von cDNA transfektiert, und man läßt sie in Gegenwart von ³&sup5;S-Isotopen von Cystein und Methionin, dies in die wachsenden COS-Zellen und daher in das translatierte Antigen eingebaut werden, wachsen. Nach ca. 48 Stunden wird der Überstand dieser Zellen geerntet, und die Bindung des Antigens an die Zelloberfläche wird wie folgt durch Vergleich von blindtransfektierten Zellen gemessen.
Ein geeigneter Zelltyp, wie die Zellinien RAMOS und JURKAT, erhältlich von der ATCC, oder normale humane periphere mononukleare Blutzellen (eine Million) werden mit 1 ml des Kulturüberstands des blindtransfektierten oder transfektierten Zellen für ca. 1 Stunde auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen durch Zentrifugation mit Dulbecco's PBS, enthaltend 1 % BSA vom RIA-Grad, gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden lysiert, indem man sie in 100 ml 1%iges SDS-Detergens bei Raumtemperatur für 5 Minuten gibt. Das gesamte lysierte Zellpellet wird dann zu einer geeigneten Szintillationsflüssigkeit gegeben, und die gebundene Radioaktivität wird in einem Szintillationszähler gemessen. Die spezifisch gebundenen cpm werden bestimmt durch Subtraktion der cpm, die von Zellen erhalten werden, die in Gegenwart von Überstand inkubiert wurden, der seinerseits von blindtransfektierten Zellen erhalten wurde.
Die minimale Größe des Bindungsfragments wird dann bestimmt durch Konstruktion einer Reihe von deletierten cDNA- Molekülen, indem man Stop-Codon näher und näher an den N- Terminus einbringt, welche das Protein exprimiert, und Testen seiner Bindung im obigen Test.
Die cDNA-Sequenz kann wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt werden, unter Verwendung von handelsüblich erhältlichen Säugerexpressionsvektoren, wie pEUK-C1, pEUK-C2 und pMAM-neo anstelle des Plasmids pCDN-1.
Der Vektor, der die cDNA-Sequenz trägt, kann ein beliebiger der im Stand der Technik bekannten zahlreichen Vektoren sein.
Falls das Ziel nicht nur die Vermehrung der cDNA-Sequenz ist, kann der Vektor ein beliebiger der zahlreich bekannten Vektoren sein, wie p8R322, pSP72 und pUC, die alle handelsüblich erhältlich sind.
Falls das Ziel die Expression der cDNA-Sequenz ist, kann der Vektor einer der zahlreich bekannten Säugerexpressionsvektoren sein, die Expressionskontrollsequenzen enthalten, wie pEUK-C1, pEUK-C2 und pMAM-neo, die alle handelsüblich erhältlich sind.
Die cDNA-Sequenzen können in Vektoren nach üblichen Verfahren eingefügt werden, und die Vektoren können nach üblichen Verfahren vermehrt und exprimiert werden.

BEISPIELE

Die Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf spezifische Beispiele beschrieben, die nicht limitierend sein sollen.
Sofern nicht anders angegeben, sind alle Prozentangaben, Verhältnisangaben, Teile, usw. auf das Volumen bezogen.
Die in den Beispielen verwendeten Reagenzien wurden erhalten und/oder behandelt wie folgt: TRITON X-114 stammte von Kodak. Es wurde dreimal mit 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, 0,15 M NaCl unter Entfernung von Verunreinigungen extrahiert. TRITON X- 100, Schweinedarmheparin und Collagenasetyp 1 wurden von Sigma erworben. TWEEN 20 wurde von Aldrich erworben. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) stammte von Calbiochem. Gelatine wurde von Bio Rad erworben. Biotinylierte Ziege- Antimaus-leichtes Kettenreagens und FITC-Ziege-Antimaus- Reagens stammten von Jackson Laboratories. Affinitätsgereinigtes Ziegen-Antimaus-IgG wurde von Kirkegaard und Perry Laboratories erworben, und ¹²&sup5;J-Streptavidin und ³&sup5;S- Cystein stammten von Amersham. Rekombinantes humanes IL-1- beta war eine Gabe von Dr. Y. Hirai des Tokushima Research Institute. Das Material wurde aus E. coli gereinigt und ergab eine einzelne Bande bei 17 kDa bei SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (15 % Acrylamid) unter reduzierenden Bedingungen; IL-1, geeignet zur Verwendung in diesen und den folgenden Beispielen kann auch handelsüblich erhalten werden. Tumornecrosefaktor-alpha (TNF) stammte von Genzyme. Humanes α-Thrombin mit einer spezifischen Aktivität von 3008 Einheiten/mg Protein wurde von John W. Fenton zur Verfügung gestellt. E. coli-Lipopolysaccharid (lps) stammte von Difco. Tunicamycin als sein B2-Homolog stammte von Boehringer-Mannheim. T4, T8, B1 und Mo2 monoklonale Antikörper wurden von Coulter Corporation erworben. Der W6/32-Antikörper stammte von Accurate Chemical and Scientific Co., der RR/1-Antikörper wurde von Dr. Thimothy Springer, der 10E5-Antikörper von Dr. Barry Coller zur Verfügung gestellt, und das MOPC-21-Myelomprotein wurde aus Kulturüberständen der P3X63Ag8-Zellinie, erhältlich vom ATCC, gereinigt.

BEISPIEL 1

HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN, DIE SPEZIFISCH GEGEN AKTIVIERTE HUMANE ENDOTHELIALZELLEN SIND

(A) ZELLKULTUR:

Verworfene Nabelschnüre, erhalten mit Erlaubnis des Klinikaufsichtsrates, wurden nach dem Verfahren von Jaffe verarbeitet (J. Clin. Invest., 52: 2745-2756, 1973) mit kleineren Modifikationen unter Erhalt von menschlichen Endothelialzellen aus der Bauchnabelvene (HUVEC). Die Zellen wurden von den Blutgefäßwänden durch Behandlung mit Collagenase abgestreift und in Gelatine-beschichteten Gewebekulturflaschen in dem unten beschriebenen Medium kultiviert. Aufgrund des Vorliegends von Weibel-Palade- Körperchen unter Aufnahme von acetylierten Low Density Lipoprotein durch lebende Zellen wurden die Zellen zu größer als 95 % als endothelial eingestuft. Die Zellen wurden im M199-Medium, enthaltend 20 % fetales Kalbsserum mit niedrigem Endotoxin (FCS, Hyclon), 90 ug/ml Konservierungsstoff-freies Schweineheparin, 20 ug/ml endotheliales Zellwachstumssupplement (ECGS) (von Collaborative Research), Glutamin und Antibiotika (im folgenden "Wachstumsmedium") kultiviert. ECGS wurde aus Rinderhypothalamus durch Salzlösungsextraktion in einem gekühlten Mixer und anschließendem Rühren für 2 Stunden bei 4ºC und Zentrifugation bei 14000 g unter Entfernung unlöslichen Materials hergestellt. Nach Entfernen von Fett und Filtration durch 0,45 Mikronfilter wurden Aliquots getrocknet. Es wurden humane Granulocyten aus dem peripheren peparinisierten Blut, aus dem die mononuklearen Zellen durch Zentrifugation über FICOLL-HYPAQUE entfernt worden waren, erhalten. Das Granulocyt/rote Zellpellet wurde über 3 % Dextran unter Entfernung der Mehrheit der roten Zellen sedimentiert. Die zurückbleibenden roten Zellen wurden, falls nötig, mit hypotonischer Kochsalzlösung lysiert. Die Reinheit von Granulocyten war größer als 95 %, bestimmt durch Weight- Giemsa-Färbung. Humane T-Zellen wurden aus der inononuklearen Schicht nach der FICOLL-HYPAQUE-Abtrennung hergestellt. Diese Zellen wurden an B-Zellen und Monocyten durch Passagen über Nylon-Woll-Säulen abgereichert. Die erhaltenen Zellen enthielten weniger als 5 % Mol oder B1 positive Zellen, und die Summe der T4 plus T8-tragenden Zellen war 85 bis 90 %, bestimmt durch Flußcytometrie mit handelsüblich erhältlichen monoklonalen Reagenzien. Normale humane epidermale Keratinocyten wurden von Clonetics Corp. erhalten; Fibroblasten wurden erhalten durch Explantate aus humanem Vorhautgewebe und humane Blutplättchen wurden erhalten durch Säurecitrat-Dextrose-antikoaguliertes Blut normaler Spender. Blutplättchen wurden mehrere Male gewaschen und in Ca&spplus;&spplus;- freiem PBS, enthaltend 1 % BSA, resuspendiert.

(B) HYBRIDOM-PRODUKTION:

8 Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen wurde intraperitoneal 3 x 106 IL-1 (4 Stunden) aktivierte HUVEC viermal im Abstand von 10 Tagen injiziert, wobei die letzte Injektion 3 bis 4 Tage vor der Fusion stattfand. Die Milz wurde aseptisch entfernt, mit einem Spritzenhomogenisator vermahlen, gewaschen und mit dem SP2/O-Fusionspartner vermischt (Fazekas de St. Groth S. und Scheidegger D., J. Immunol. Methods, 35: 1-21, 1980) in einem Verhältnis von 5:1. Die Zellen wurden mit Polyethylenglycol wie zuvor beschrieben fusioniert (Kohler G. und Milstein C., Nature, 256: 495-497, 1975) und auf 6 bis 8 96-Well-Mikrotiterplatten plattiert, die residente peritoneale Exudatzellen aus Balb/c-Mäusen als Nährstoffschicht enthielten. Das Screenen erfolgte auf zusammenfließenden Monoschichten der ruhenden oder IL-1- aktivierten HUVEC (Aktivierung durch Zugabe von IL-1 in 1 ng/ml über 4 Stunden) ebenfalls auf 96-Wellplatten. Nachdem man bei 4ºC die Kulturüberstände 60 Minuten mit den Monoschichten von HUVEC reagieren hatte lassen, wurden die Zellen gewaschen und mit biotinylierten Ziege-Antimausleichter Kettenantikörper für 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Nach 3 mehreren Spülungen wurden die Zellen 15 Minuten bei 4ºC mit 0,5 uCi ¹²&sup5;J-Streptavidin pro Well inkubiert. Nach der abschließenden Spülung wurden die Zellen mit 1 % TRITON X-100-Detergenslösung lysiert, und Aliquots in einem gamma-Zähler gezählt. Hybridoma wurden aufgrund ihrer Fähigkeit zur Sekretion von Antikörper, die exklusiv mit IL-1 behandelten aber nicht mit unbehandelten HUVEC reagierten, selektiert.
Nach diesem Verfahren wurden fünf Hybridom-Zellinien erhalten, die die erwünschten monoklonalen Antikörper produzierten. Diese Hybridom-Zellinien und die monoklonalen Antikörper, die sie produzierten, wurden bezeichnet als 1E7, 2G7, 3A2, 7A9 und 3B7. Die Hybridoma wurden bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland hinterlegt und haben die Hinterlegungsnummern HB 10136, HB 10137, HB 10138, HB 10135 und HB 10391.
Zusätzlich wurde die obige Vorschrift 13mal auf einer Gesamtzahl von 71 Mikrotiterplatten mit Hybridoma-Kandidaten durchgeführt. Bei der ersten Fusion wurde die 1E7-Hybridom- Zellinie erhalten. In der 8. wurden die 2G7- und 3A2- Hybridom-Zellinien erhalten. Die 7A9-Hybridom-Zellinie wurde in der 10. und die 3B7-Hybridom-Zellinie in der 13. Fusion erhalten. Daher lieferten zwei der 13 Experimente einen monoklonalen Antikörper (1E7 und 2G7) der erwünschten Eigenschaften für die monoklonalen Antikörper der Gruppe (A), beschrieben in der detaillierten Beschreibung der Erfindung; eines von 13 Experimenten lieferte einen monoklonalen Antikörper (3A2) mit den erwünschten Eigenschaften für die monoklonalen Antikörper der Gruppe (B), beschrieben in der detaillierten Beschreibung der Erfindung; und zwei der 13 Experimente lieferte einen monoklonalen Antikörper (7A9 und 3B7) mit den erwünschten Eigenschaften für die monoklonalen Antikörper der Gruppe (C), wie in der detaillierten Beschreibung der Erfindung dargelegt. Dies ist für den Fachmann keine unzumutbare experimentelle Tätigkeit, und es fehlen keine kritischen Schritte bei diesem experimentellen Verfahren. Daher ist das oben beschriebene und in der detaillierten Beschreibung der Erfindung dargelegte Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper der Gruppe (A), (B) und (C) ein reproduzierbares Verfahren.
Sofern nicht anders angegeben, wurden alle in den anschließenden Beispielen verwendeten monoklonalen Antikörper durch HPLC auf DEAE-Ionenaustauschersäulen oder durch Affinitätschromatographie auf Protein-A-Sepharose nach üblichen Verfahren gereinigt.

BEISPIEL 2

CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN ANTIKÖRPER 1E7, 2G7, 3A2 und 3B7

(A) ISOTYP-BESTIMMUNG:

Der Isotyp wurde bestimmt unter Verwendung von "Screentype", einem Kit, das alle notwendigen Reagenzien enthält, von Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN. Die Isotyp-Bestimmung erfolgte nach den Angaben des Herstellers.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt und sind wie folgt: 1E7 -- IgG2a; 2G7 -- IgG1; 3A2 --IgM; 7A9 --IgG1 und 3B7 --IgG2A.

(B-1) BINDUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN 1E7, 2G7, 7A9 UND 3B7 AN RUHENDE UND IL-1-AKTIVIERTE ENDOTHELIALZELLEN:

Die Antikörper 1E7, 2G7, 7A9 und 3B7 wurden in Plattenbindungstests von IL-1-behandelten gegenüber unbehandelten HUVEC, wie in Beispiel 1 beschrieben, entwickelt. Ihre Reaktivität mit der Kontrolle oder IL-1- behandelten Endothelialzellen wurde durch Flußcytometrie wie unten beschrieben analysiert und mit einem Anti-HLA- monoklonalen Antikörper, W6/32, und einem Antikörper gegen ICAM-1, RR/1, analysiert. Alle Antikörper wurden in gesättigte Konzentrationen, bestimmt in Vorexperimenten verwendet.
4 Stunden mit IL-1-aktivierte Endothelialzellen wurden in Mikrotiterplatten mit Konzentrationen an Antikörper im Bereich von 0,1 bis 10 ug/ml behandelt, gewaschen und dann mit FITC-Ziege-Antimaus-indirektem Reagens inkubiert. Die Zellen wurden durch Flußcytometrie analysiert, und die minimale Dosis, mit der eine maximale Fluoreszenz erhalten wurde, wurde als die Sättigungsdosis bewertet.
Die Flußcytometrie wurde wie folgt durchgeführt: Endothelialzellen wurden von Kulturgefäßen mit PBS, enthaltend 2 mM EDTA, für 5 Minuten bei 37ºC entfernt. Eine Einzelzellsuspension wurde hergestellt durch sanftes Pipettieren der abgenommenen Zellen mit PBS/EDTA-haltigen eingekühlten 1%igem BSA vom Radioimmuntest-(RIA)-Grad und 0,02 % Natriumazid. Eine halbe Million Zellen wurden in einem Rundboden-96-Wellplatten in einem Volumen von 100 ul, enthaltend eine sättigende Dosis von monoklonalem Antikörper in BPS-1 % BSA und 0,02 % Natriumazid (mit Waschpuffer) inkubiert. Nach 30-minütiger Inkubation bei 4ºC wurden die Zellen dreimal gewaschen und in 100 ul Waschpuffer, enthaltend FITC-Ziege-Antimaus-Reagens (Jackson Immuno Research Laboratories) zu 1,5 ug/ml inkubiert. Zur Kontrolle wurden die Zellen mit einem zweiten Stufenreagens allein inkubiert. Nach weiteren 30 Minuten Inkubation bei 4ºC wurden die Zellen dreimal gewaschen und für die Analyse resuspendiert. In der Praxis wird das FITC-Ziege-Antimaus- Reagens verwendet, um den Fluoreszenzhintergrund einzustellen. Der Cutoff-Point wird so eingestellt, daß er 95 % der mit FITC-Avidin allein behandelten Zellen erfaßt. Der Anteil an Zellen, die größere Fluoreszenzintensität nach spezifischer Ligandbindung zeigen, bestimmt den Prozentsatz positiver Zellen. Die Flußcytometrie erfolgte auf einem Coulter-Modell 541, ausgerüstet mit einem Argonlaser und einer Quarzflußzelle.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt, die zeigen, daß abgestreifte Zellen, gefärbt mit FITC-Ziege-Antimaus-(FGαM)- Reagens (Fig. 2A #1) oder W6/32-Anti-HLA plus GαM (Fig. 2A #2) oder FGαM anschließend mit den monoklonalen Antikörpern 1E7 (Fig. 2B) , 2G7 (Fig. 2C), 7A9 (Fig. 2D), 3B7 (Fig. 2E) oder RR1 (ICAM-1) (Fig. 2F). Alle Reagenzien wurden in sättigenden Dosierungen eingesetzt. Jedes Histogramm zeigt eine Analyse von 25000 Zellen. Auf der horizontalen Achse bedeuten jeweils 25 Kanäle eine ungefähre Verdoppelung der Fluoreszenzintensität in a.u. = willkürlichen Einheiten. Die Zellanzahl in willkürlichen Einheiten ist auf der vertikalen Achse angegeben. Uninduziert (...) und IL-1-induziert (-) HUVEC.
Fig. 2 zeigt, daß das ICAM-1-Protein auf nicht-stimulierten HUVEC vorliegt, und ca. 8-fach nach IL-1-Stimulierung erhöht ist, wie zuvor beschrieben (Dustin und Springer, J. Cell Biol., 107: 321-331, 1988), wogegen das HLA-Protein sich nach IL-1-Stimulierung nicht vermehrt. Jedoch können alle vier der neuen getesteten Antikörper auf nicht-stimulierten Zellen nicht nachgewiesen werden und zeigen eine heterogene Verteilung des Antigens, von schwach bis stark positiv, innerhalb der stimulierten HUVEC-Population. Alle diese Antigene sind an ihrer maximalen Fluoreszenzintensität vergleichbar in ihrem Auftreten mit HLA-Proteinen (Fig. 2A #2) dessen mittlere Fluoreszenzintensität ca. bei Kanal 150 liegt. Die Heterogenität der Expression dieser Aktivierungsantigen von HUVEC verhinderte eine aussagekräftige Scatchard-Analyse der Anzahl von Stellen pro Zelle. Diese Heterogenität wurde auch bestätigt, wenn die Zellen auf Monoschichten auf Abdeckplatten geprüft wurden, und wurde nicht durch die Zeit oder die Dosis der IL-1- Exposionen beeinflußt (Daten nicht gezeigt).

(B-2) BINDUNG DER MONOKLONALEN ANTIKÖRPER 1E7, 2G7 UND 3B7 AN 1E7/2G7 cDNA-TRANSFEKTIERTE COS-ZELLEN:

Die Bindung erfolge an 1E7/2G7-cDNA oder blindtransfektierten COS-Zellen, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben. COS- Zellen (2 x 10&sup4;/Well) wurden auf 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden 24 Stunden vor dem Test und 48 Stunden nach Transfektion ausplattiert. Die Zellen wurden mit Medium allein (Kontrolle) oder getrennt mit jeweils den monoklonalen Antikörpern zu 5 ug/ml 60 Minuten bei 4ºC inkubiert. Nach 3 Spülungen wurden die Zellen mit biotinyliertem Zeige- Antimaus-Antikörper 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Nach weiteren 3 Spülungen wurden die Zellen 15 Minuten bei 4ºC mit 0,3 ul ¹²&sup5;J-Streptavidin pro Well inkubiert. Nach abschließenden Spülungen wurden die Zellen mit 1 % TRITON X- 100 lysiert, und Aliquots wurden in einem gamma-Zähler gezählt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Fig. 3 zeigt, daß die monoklonalen Antikörper 1E7 und 2G7, jedoch 3B7 (Anti-ELAM-1) an die 1E7/2G-cDNA-transfektierten COS-Zellen binden.

(C) BLOCKIEREN DER AKTIVITÄT VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN:

Endothelialzellen wurden aus verworfenen Nabelschnüren erhalten und wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert. Die Zellen vermehrten sich rasch und wurden verteilt (Passage) bis zu sechsmal in andere Kolben bevor ihre differenzierenden Eigenschaften abnahmen, vermutlich als Ergebnis der in-vitro- Wachstumsbedingungen. Nach der zweiten Passage standen ausreichend Zellen zur Verfügung, um den Blockadetest durchzuführen. Rekombinantes humanes IL-1-beta wurde in einer Konzentration von 1 ng/ml zu den Zellen in der Kultur für 4 bis 6 Stunden zugegeben, während die Zellen wie üblich hin einer angefeuchteten Inkubationskammer, enthaltend 6 % CO&sub2;, 94 % Luft, gehalten wurden. Kontrollen bestanden in der Kultur-Endothelialzellen in Abwesenheit von IL-1. Nach der Inkubationsperiode wurden die Zellen mit Medium gespült, um unverbrauchtes IL-1 zu entfernen, und die entsprechenden monoklonalen Antikörper wurden in Konzentrationen im Bereich von 0,0016 bis 10 ug/ml 1 Stunde bei 37ºC gegeben. Das F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Antikörpers 2G7, erhalten nach üblichen Verfahren; wurde für diesen Test ebenfalls verwendet. Die Zellen, deren Bindungen untersucht wurden, wurden 30 bis 60 Minuten lang überschichtet, um Anheftung zu erlauben. Die verwendeten Zellen waren humane Monocyten, Granulocyten oder eine Mischung von mononuklearen Zellen, die T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen enthielten. Diese Zellen wurden isoliert und nach bekannten Verfahren gereinigt. Die nicht-anhaftende Zellen wurden durch Spülen mit Wachstumsmedium abgewaschen, und der Unterschied in der Anzahl an Endothelialzellen (EC), die unbehandelt oder mit IL-1 behandelt waren, wurde beobachtet.
Dieser Test wurde auf quantitativer Weise durch Einbau eines radioaktiven Markers, z. B. &sup5;¹Cr, nach bekannten Verfahren, in das Cytoplasma der Zellen durchgeführt, deren Bindung untersucht wurde, unter Reinigung und Entfernung der extrazellulären Counts und Aufbringen dieser markierten Zellen auf eine EC-Monoschicht. Die für diesen Zweck verwendete &sup5;¹Cr-Markierung zeigte eine minimale Leckbildung während der 30 bis 60 Minuten des Bindungstests. Nach Spülung zur Entfernung nicht-anhaftender Zellen wurden die Monoschichten mit Detergens solubilisiert. Die aus jedem Weil gezählte Radioaktivität war ein Maß für die Anzahl der gebundenen Zellen.
Die Ergebnisse zeigen eine Inhibierung der mononuklearen Zellbindung durch verschiedene Dosen an F(ab')&sub2;-Fragmenten des monoklonalen Antikörpers 2G7 und 10 ug/ml des monoklonalen Antikörpers 1E7 sind in Fig. 4 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß der monoklonale Antikörper 2G7, aber nicht der monoklonale 1E7, bei Verwendung zur Vorbehandlung von IL-1-aktivierten Endothelialzellen, eine dosisabhängige teilweise Inhibierung der Bindung humaner mononuklearer Zellen an Endothelialzellen bewirkt. Das F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Antikörpers 7A9 zeigte ebenfalls eine dosisabhängige Inhibierung von Zellen wie in Tabelle 1 gezeigt.
Die Ergebnisse für alle untersuchten vier monoklonalen Antikörper sind in Tabelle I zusammengefaßt. VERGLEICH VON ERFINDUNGSGEMÄSSEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN MIT PUBLIZIERTEN ANTIKÖRPERN Name Ursprung oder Referenz Isotyp Spezies Blockierungsaktivität Immunogen* Referenz Prober er al. Bevilacqua Erfindung McEver Hsu-Lin Goerdt Maus Ratte keine teilweise Greanulocyten keine Teilweise T-Zellen und vielleicht B-Zellen oder Granulocyten nicht durchgeführt Granulocyten gesamt, Monocyten teilweise Blutplättchen * Abkürzungen sind wie folgt: IL-1-EC (Interleukin-1-activierte Endothelialzellen); TNF-EC (Tumornecrosefaktor-activierte Endothelialzellen); lps 24 h (24 Stunden Endotoxin (Lipopolysaccharid, LPS) aktivierte Endothelialzellen.
Tabelle I vergleicht die Eigenschaften der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper mit denen der am nahekommendsten publizierten Antikörper. H4/18 ist der erste Antikörper, der gegen IL-1-stimulierte Endothelialzellen erzeugt wurde (Prober et al., J. Immunol., 136: 1680-1687, 1986). H1B/7 ist ein monoklonaler Antikörper gegen IL-1-stimulierte Endothelialzellen und er blockiert teilweise die Granulocytenanhaftung an IL-1-stimulierte Endothelialzellen (Belvilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 9238-9241, 1987). S12 ist ein monoklonaler Antikörper, der an aktivierte Blutplättchen bindet, und den man ehesten mit dem monoklonalen Antikörper 3A2 der Erfindung vergleichen kann. (Mcever und Martin, J. Biol. Chem., 259: 9799-9804, 1984). Unerwarteterweise hat jedoch der monoklonale Antikörper 3A2 einen IgM-Isotyp, wogegen S12 IgG1 ist. Der IgM-Isotyp ist etwas ungewöhnlich für monoklonale Antikörper. KC4 ist ein Antiplättchen monoklonaler Antikörper (Su-Lin et al., J. Biol. Chem., 259: 9121-9126, 1984). Von den publizierten monoklonalen Antikörpern hat KC4 die engste Spezifität zum monoklonalen Antikörper 3A2 der Erfindung. Jedoch hat der monoklonale Antikörper KC4 einen IgG1-Isotyp, wogegen der monoklonale Antikörper 3A2 einen unerwarteten IgM-Isotyp hat. 4D10 ist ein monoklonaler Ratten-Antikörper mit Spezifität für IL-1-stimulierte Endothelialzellen (Goerdt et al., Expl. Cell Biol., 55: 117-126, 1987). Der Monoklonale Antikörper 4D10 hat keine offensichtliche Verwandtschaft mit den erfindungsgemäßen Antikörpern. Jedoch ist das Antigen, an das der monoklonale Antikörper 4D10 bindet, am nächsten im Molekulargewicht zum Antigen, an das der monoklonale Antikörper 7A9 bindet.
Die Vergleichsdaten in Tabelle I zeigen, daß die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper unerwartete Eigenschaften gegenüber den am nächst kommenden monoklonalen Antikörpern haben.

(D) INHIBIERUNG DER GRANULOCYTENBINDUNG:

Die relative Bedeutung der vier Epitope auf den bei den Proteinen, 1E7/2G7 und 3B7/7A9 (ELAM-1), bei der nicht- stimulierten Granulocyten an IL-1-aktivierte HUVEC wurde wie folgt geprüft.
HUVEC bei 4 oder weniger Passagen wurden auf Gelatine vorbeschichtete 24-Wellplatten ausplattiert und 48 Stunden oder bis zum Zusammenfluß kultiviert. Die Zellkulturen wurden mit 1 ng/ml IL-1 in RPMI-1640, enthaltend 10 % FCS, exponiert, oder die Zellen wurden in RPMI-1640 plus 10 % FCS (Waschmedium) allein kultiviert. Nach 4 Stunden Exposition mit IL-1 bei 37ºC wurden die Kulturen einmal mit Waschmedium gespült. Die Monoschichten wurden an diesem Punkt mit F(ab')&sub2;-Fragmenten der in Waschmedium verdünnten Antikörper 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. (Vorläufige Ergebnisse hatten die Notwendigkeit der Verwendung von F(ab')&sub2;-Fragmenten zur Vermeidung von Verbrückung von HUVEC und Granulocyten über FCS-Rezeptoren auf dem Letzteren gezeigt). Die Kontrollwells enthielten Waschmedium allein oder 10 ug/ml des gereinigten Myelomproteins MOPC-21. Alle experimentellen Punkte wurden in Dreifachbestimmungen durchgeführt. Die Monoschichten wurden übereinandergelegt, in Gegenwart des Antikörpers, mit ca. 10&sup6; &sup5;¹-Cr-markierten Granulocyten in eiriem Volumen von 0,5 ml. Nach 45 Minuten bei 37ºC wurden die Monoschichten sanft zweimal mit Waschmediuin bei Raumtemperatur gespült. Die zurückbleibenden anhaftenden Granulocyten wurden mit 300 ul 1 % TRITON X-100 in PBS lysiert. Die Hälfte dieses Volumens (150 ul) wurde in einem gamma-Zähler gezählt. Der Prozentsatz der Inhibierung der Bindung von Granulocyten durch monoklonale Antikörper wurde die folgt berechnet: [(experimentelle - Hintergrund-cpm) ÷ (IL-1-induzierte cpm - Hintergrund-cpm)] x 100. Der IL minus Hintergrundwert repräsentiert den induzierbaren Grad der Bindung. Die Menge an &sup5;¹Cr, die von 10&sup6; gewaschene Granulocyten aufgenommen wurde, wurde verwendet, um die Daten von cpm/Well in Anzahl von gebundener Zellen/Weil uinzurechnen. Die Monoschichten wurden immer vor der Lyse geprüft, um sicherzustellen, daß keine Anhaftung von HUVEC vorgekommen war.
F(ab')&sub2;-Fragmente wurden nach dem Verfahren von Parham (Parham, J. Immunol., 131: 2895-2902, 1983) hergestellt. Pepsin wurde zum gereinigten monoklonalen Antikörper in 0,1 M Citratpuffer, pH 4,1, in einem Gewicht/Gewicht-Verhältnis von 1:50 gegeben. Der Verdau wurde über Nacht bei 37ºC durchgeführt. Entfernung von Pepsin erfolgte durch Ionenaustauschchromatographie. Der Verdau wurde in reduzierenden und nicht-reduzierenden SDS-Polyacrylamidgelen (10 % Acrylamid) geprüft, und die Bindungsaktivität an IL-1- aktivierten HUVEC wurde durch Flußcytometrie (durchgeführt wie oben beschrieben) als gleich zu derjenigen, die mit nicht-verdautem Antikörper erhalten wurde, festgestellt.
Verfahren und Reagenzien zur Durchführung der reduzierenden und nicht-reduzierenden SDS-Polyacylamid-Gelelektrophorese sind beschrieben im Two Dimensional Electrophoresis and Immunological Techniques, Bonnie S. Dunbar, Plenum Press, New York, 1987.
Die Ergebnisse für ein repräsentatives Experiment sind in Fig. 5 gezeigt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Zellen gebunden pro Weil ± s.e.m (n = 3).
Die Ergebnisse legen nahe, daß die Anti-ELAM-1-Antikörper stärkere Inhibitionskraft haben als die Antikörper 1E7 und 2G7. Unter Zusammenfassung der Ergebnisse aus 6 Experimenten gaben 1E7 und 2G7 0 % und 3 % Inhibierung der Granulocytenbindung bei der höchsten getesteten Dosis (10 ug/m1), während 3B7-Antikörper ein Mittel von 81 % Inhibierung und der 7A9-Antikörper ein Mittel von 95 %1 d. h. vollständige Inhibierung, beide bei 10 ug/ml, ergaben. Obwohl die 3B7- und 7A9-Antikörper nicht überlappende Epitope auf ELAN-1 definieren, seinen ihre Effekte nicht additiv zu sein (Daten nicht gezeigt). Sowohl für 7A9 und 3B7 wurde eine signifikante Inhibierung der Granulocytenbindung bei einer so niedrigen Dosis wie 0,4 ug/ml beobachtet. Da Granulocyten weder das 1E7/2G7 oder das 3B7/7A9 (ELAM-1) Antigen (Tabelle IV) exprimieren, schließt der Fachmann, daß die beobachteten Effekte auf der Wirkung der Antikörper auf der Ebene der Endothelialzellen beruhen.

(E) INHIBIERUNG DER T-ZELLBINDUNG:

Die Fähigkeit der monoklonalen Antikörper 1E7, 2G7, 7A9 und 3B7 zur Inhibierung der Bindung von T-Zellen an IL-1- aktivierte Endothelialzellen wurde nach dem Verfahren bestimmt, daß die für die Inhibierung der Granulocytenbindung beschrieben wurde, mit Ausnahme, daß an Nylon nicht- anhaftende T-Zellen anstelle der Granulocyten eingesetzt wurden und daß 0,9 x 10&sup6; T-Zellen zu jedem Weil gegeben wurden.
Die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn diese vier Antikörper auf ihre Blockierungsfähigkeit bei der Anhaftung von nicht-stimulierten Nylon-Wolle an nicht-anhaftende T- Zellen an IL-1-aktivierte Endothelialzellen erhalten wurden, ist in einem beispielhaften Experimente in Fig. 6 gezeigt. Bei der Kombination der Experimente, gezeigt auf der rechten Seite der Fig. 6, war die Endkonzentration eines jeden Antikörpers 10 ug/ml. Die Phenotypanalyse zeigte 54 % CD4+, 32 % CDB+, 2 % Mo2+ (CD14) und 4 % B1+ (CD20). Die Ergebnisse sind als gebundene Zellen/Weil ± s.e.m. (n 3).
Fig. 6 zeigt, daß wie bei Granulocyten der 1E7-Antikörper keine Inhibierung der Bindung bei der höchsten getesteten Dosis (10 ug/ml) zeigt. Das MOPC-21-Myelomprotein (IgG1) zeigte ebenfalls keine Inhibierung der T-Zellen in getrennten Experimenten (nicht gezeigt). Jedoch wurde teilweise Inhibierung, bei jedem der anderen drei Antikörpern in einer dosisabhängigen Weise beobachtet. In sechs Experimenten war der mittlere Prozentsatz der Inhibierung, der mit dem 2G7- Antikörper beobachtet wurde, 34 %, wogegen Werte von 21 % und 37 % für den 3B7- und 7A9-Antikörper erhalten wurde. Insoweit diese Antikörper unterschiedliche Epitope auf verschiedenen Strukturen definieren, und drei der vier inhibierend wirken, wurden Mischungsexperimente durchgeführt, und ein beispielhaftes Experiment ist auf der rechten Seite in Fig. 6 gezeigt. Es gaben daher die beiden Anti-ELAM-1-Antikörper, 3B7 und 7A9, jeweils bei 10 ug/ml eine 31%ige Inhibierung, ein Wert der nicht additiv zu den mit entweder 3B7 (19 %) oder 7A9 (40 %) einzeln erhaltenen Werten war. Wenn jedoch entweder der Anti-ELAM-1-Antikörper mit den 2G7-Antikörper (jeweils 10 ug/ml) kombiniert wurde, wurden additive Werte erhalten. Daher ergab die Kombination 2G7 plus 7A9 eine 68%ige Inhibierung (gegenüber 29 % mit 2G7 und 40 % mit 7A9 einzeln) und 2G7 plus 3B7 ergab eine 60%ige Inhibierung (gegenüber 29 % mit 2G7 und 19 % mit 3B7). Diese Ergebnisse wurden in zwei zusätzlichen Experimenten bestätigt. Die p- Werte für den Vergleich der Inhibierüng, die bei den einzelnen Antikörpern in Fig. 6 relativ zu IL-1 beobachtet wurden, zeigen, daß die 2G7- 3B7- und 7A9-Antikörper einzeln statistisch signifikante Inhibierung ergeben (p-Werte 0,0009, 0,01 und 0,002). Die Kombination von 2G7 mit sowohl 3B7 als auch 7A9 ist deutlich besser als jeder Antikörper allein (p- Werte alle Kombinationen weniger als 0,001). Die Kombination von 3B7 plus 7A9 ist nicht deutlich besser als jeder Antikörper für sich allein. Da weder das 1E7/2G7- noch das 3B7/7A9-Antigen auf peripheren Blutlymphocyten vorliegt, von denen 70 % T-Zellen sind, können die in Fig. 15 gezeigten Effekte der Rolle des Antigens auf den Endothelialzellen zugeschrieben werden.

BEISPIEL 3

CHARAKTERISIERUNG DER SPEZIFITÄT VON ERFINDUNGSGEMÄSSEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN MIT PUBLIZIERTEN ANTIKÖRPERN

(A) ANTIGENGRÖSSE:

Zusammenfließende Kulturen von humanen Nabelschnurvenen- Endothelialzellen (HUVEC) mit niedriger Passage ( weniger als p6)in 100-mm-Gewebekulturschalen wurden über Nacht in eine Medium mit weniger Methionin gegeben. Am nächsten Tag wurde IL-1 zu 1 ng/ml zugegeben, und ³&sup5;S-Methionin (Amersham) wurde in einem Verhältnis von 250 uCi/10&sup7; Zellen zugefügt. IL-1 wurde zu den Kontrollen nicht zugegeben. Nach 6-stündiger Kultur bei 37ºC wurden die Monoschichten dreimal mit Einkalten Dulbecco's-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (D- PBS) gespült und mit 250 ul einer 1%igen Lösung von TRITON X- 100 Lysepuffer lysiert.
Nunc-ELISA-96-Well-Mikrotiterplatten wurden mit 25 ug von Affinitäts-gereinigtem Ziege-Antiemaus-Antikörper in 100 ul 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,5, 1 Stünde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Wells wurden dann zehnmal mit PBS-0,05 % TWEEN 20 gespült, worauf die Zugabe von 100 ul 1 % BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur folgte. Zu jedem Well wurde in Gegenwart von BSA 5 ug gereinigter monoklonaler Antikörper für 1 zusätzliche Stunde bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 10 Waschvorgängen mit PBS-TWEEN wurden 1 bis 3 x 10&sup6; cpm Lysat zu jedem Well bei 4ºC für 2 Stunden unter leichtem Schütteln zugegeben. Die Wells wurden mit PBS-TWEEN gewaschen, getrocknet und mit reduzierenden Probenpuffer extrahiert und auf SDS-Polyacrylamid-(SDS-PAGE)-Gelen aufgebracht, entweder reduzierende oder nicht-reduzierende. Die Gele waren 8 % Acrylamid für die 3A2- und 7A9-Proben und 10 % Acrylamid für die 1E7- und 2G7-Proben.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 7 und 8 gezeigt und in Tabelle III zusammengefaßt. Die Ergebnisse waren wie folgt (die Werte in Klammern sind der Mittelwert der aus drei Experimenten erhaltenen Ergebnisse):
(1) Lysate von monoklonalen Antikörper 1E7 und monoklonalen Antikörper 2G7 zeigten eine Hauptbande bei 125 (114) kda und eine Nebenbande bei 97 (95) kDa unter reduzierenden Bedingungen, und eine Hauptbande bei 99 (100) kDa und eine Nebenbande 87 (93) kDa unter nicht-reduzierenden Bedingungen (Ergebnisse unter Reduzierenden Bedingungen sind nicht in den Fig. gezeigt);
(2) Lysate von monoklonalem Antikörper 3A2 zeigte eine Bande bei 177 (170) kda unter reduzierenden und nicht- reduzierenden Bedingungen, und;
(3) Lysate von monoklonalem Antikörper 7A9 zeigte eine Bande bei 100 kda unter reduzierenden Bedingungen und eine Bande bei 90 kDa unter nicht-reduzierenden Bedingungen.
Wie im folgenden Beispiel 4 gezeigt, sind die Antigene, an die die monoklonalen Antikörper 1E7 und 2G7 spezifisch binden, dieselben Antigene wie die Antigene, an die die monoklonalen Antikörper 7A9 und 3B7 spezifisch finden.

(B) ANTIGENVERTEILUNG:

Ein allgemeiner Bindungstest wurde wie folgt durchgeführt: 20000 HUVEC wurden in jedes Well einer 96-Well- Mikrotiterplatte auf einer Gelatine-beschichteten Oberfläche ausplattiert. Man ließ die Zellen über Nacht im Wachstumsmedium stehen (siehe Beispiel 1), um eine volle Anhaftung zu ermöglichen. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 1 ng/ml IL-1 für 4 Stunden exponiert, gewaschen und getrennt mit jeweils den monoklonalen Antikörpern bei 5 mg/ml inkubiert. Die Kontrollen bestanden aus HUVEC, das nicht IL-1 exponiert war, oder mit IL-1 exponiert wurde, jedoch nicht einem Antikörper ausgesetzt wurde. Nach einstündiger Inkubation bei 4ºC wurden die Zellen gewaschen und mit biotinyliertem Ziegen-Antimaus-Reagens zu einer Verdünnung von 1/1000 inkubiert. Nach 30 Minuten bei 4ºC wurden die Zellen gespült und einer 1:10-Verdünnung von ¹²&sup5;J- Streptavidin exponiert. Nach 15 Minuten bei 4ºC wurden die Zellen gespült und mit TRITON X-100-Detergens (1 %) lysiert, und Aliquots wurden in einen gamma-Zähler gezählt.
Für einen Test auf nicht-anhaftende Zellen, wie T-Zellen, B- Zellen und Granulocyten, wurden die Platten zur Pelletierung der Zellen vor dem Entfernen des Mediums zentrifugiert. Die Zellen wurden in einem geeigneten Medium für die nächste Inkubation resuspendiert.
Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt. Fig. 9 zeigt, daß alle vier monoklonalen Antikörper 1E7, 3A2, 7A9 und 2G7 an IL-1- aktivierte humane Endothelialzellen (HEC) binden, aber nicht signifikant an normale ruhende HEC binden. Dies bedeutet, daß die Antigene, an die die monoklonalen Antikörper 1E7, 3A2, 7A9 und 2G7 binden, auf IL-1-aktivierten HEC gemäß den wie in Beispiel 2 berichtet, gefunden werden.
Das Vorliegen des Antigens, das einem jeden der vier monoklonalen Antikörper entspricht, wurde als allgemeiner Bindungstest bestimmt, mit Ausnahme, daß bei der Zugabe zu den Endothelialzellen andere Zelltypen verwendet wurden, und daß die Inkubationszeit (wie oben) mit IL-1 4 Stunden war. Die anderen Zelltypen waren humane Fibroblasten (MRHF), Keratinocyten (NHEK) und Endothelialzellen (HUVEC).
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II gezeigt. TABELLE II ANTIGENVERTEILUNG VON MAbs:1E7, 2G7, 3A2 UND 7A9 UNTER VERWENDUNG VON HUVEC, NHEK UND MRHF Zellen + IL-1 keine MAb
Die in Tabelle II angegebenen Daten, daß alle vier monoklonalen Antikörper, 1E7, 3A2, 7A9 und 2G7 an IL-1- aktiviert HEC aber nicht an signifikant an normale ruhende oder IL-1-aktivierte humane epidermale Keratinocyten oder ruhende oder IL-1-aktivierte humane Fibroblasten binden.
Diese Daten belegen, daß die Antigene, an die die monoklonalen Antikörper 1E7, 3A2, 7A9 und 2G7 binden, auf IL- 1-aktivierten HEC gebunden werden.
Dieselbe Vorschrift wie für den allgemeine Bindungstest wurde verwendet, mit Ausnahme, daß anstelle der Verwendung von Endothelialzellen, Granulocyten und mononukleare Zellen (T-, B- und Monocytzellen) verwendet wurden. Granulocyten und mononukleare Zellen wurden aus humanem heparinisiertem Blut durch Ficol-Hypaque-Abtrennung nach bekannten Verfahren isoliert.
Die Ergebnisse sind in Fig. 10 gezeigt. Fig. 10 zeigt, daß die vier monoklonalen Antikörper 1E7, 3A2, 7A9 und 2G7 nicht signifikant an eine Mischung normaler ruhender oder IL-1- aktivierter humaner Granulocyten oder mononuklearer Zellen binden.
Diese Daten zusammen mit denen aus Fig. 9 und Tabelle II weisen darauf hin, daß die monoklonalen Antikörper 1E7, 3A2, 7A9 und 2G7 spezifisch für IL-1-aktivierte HEC sind.

(C) ANTIGENKINETIK IN VITRO:

HUVEC wurde in verschiedenen Petri-Schalen (35 mm Durchmesser) nach Gelatine-beschichten des Plastiks ausplattiert. Wachstumsmedium (beschrieben in Beispiel 1) wurde zugegeben, und die Zellen wurden für die Dauer des Experiments in Wachstumsmedium, zu dem 1 ng/ml IL-1 gegeben wurde, kultiviert. Die Zeiten, zu denen die Zellen anfänglich plattiert wurden, waren gestaffelt, so daß alle Zellen am selben Tag aber nach verschiedenen Zeiträumen der Zugabe von IL-1 geerntet wurden, so daß einige Zellen dem IL-1 für die letzten 12 Stunden allein, die vollen 96 Stunden oder für dazwischenliegende Zeiten ausgesetzt waren. Die HUVEC wurden von den Petri-Schalen unter Verwendung von PBS/EDTA abgekratzt, zweimal in PBS-BSA gewaschen und zu 75000 Zellen pro Weil in Rundboden-Mikrotiterplatten plaziert. Zu diesen Wells wurden einzeln jeweils die vier monoklonalen Antikörper 1E7, 2G7, 3A2 und 7A9 zu 5 ug/ml für 30 Minuten für 4ºC zugegeben. Nach dreimaligem Waschen der Zellen wurden diese FITC-Ziege-Antimaus-Reagens in einer 1/40-Verdünnung für 30 Minuten bei 4ºC ausgesetzt. Nach zusätzlichem dreimaligem Waschen wurden die Zellen auf ihren Fluoreszenzgrad in einem Coulter-Modell 541 EPICS-Flußcytometer nach üblichen Routineverfahren, wie vom Hersteller angegeben, geprüft. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 gezeigt und sind als Prozentsatz positive (Zellen) gegen die Dauer der Exposition gegenüber IL-1 ausgedrückt.
Die Daten in Fig. 11 zeigen, daß die Antigene, definiert durch die monoklonalen Antikörper 1E7 und 2G7, sich in Gegenwart von IL-1 erhöhen und weiterhin in Gegenwart von IL- 1 exponiert werden. Im Gegensatz hierzu verschwindet das durch den monoklonalen Antikörper 3A2 definierte Antigen mit der Zeit. Kein Null-Zeitpunkt ist in dieser Figur gezeigt, der erste Zeitpunkt ist 4 Stunden, bei dem sich die 4 Antigene maximal zeigten.
Ein Verhalten, wie ein solches das durch die monoklonalen Antikörper 1E7 und 2G7 definierten Antigene gezeigt wird, wurde als "chronische Kinetik" bezeichnet, um anzudeuten, daß diese Antigene mit einer chronischen Entzündung einhergehen könnten. Vorübergehende Expression wurde als "akute Kinetik" bezeichnet, um anzudeuten, daß diese Antigene mit einer akuten Entzündung einhergehen könnten.
Die Daten aus Beispiel 3 bilden zusätzliche kennzeichnende Eigenschaften für die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und die erfindungsgemäßen neuen Antigene. Die Daten sind in Tabelle III zusammengefaßt und mit ähnlichen Daten für die am nächsten bekannten publizierten monoklonalen Antikörpern verglichen. TABELLE III VERGLEICH DER SPEZIFITÄT DER ERFINDUNGSGEXKSSEN MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN MIT PUBLIZIERTEN ANTIKÖRPERN Name Ag-Größe (kDa)¹ reduzierende Nicht-reduzierend Verteilung² Kinetik Bemerkung ¹ Unterstreichung bedeutet Hauptbande ² Abkürzungen sind wie folgt IL-1-EC (Interleukin-1-aktivierte Endothelialzellen; EC (ruhende Endothelialzellen) ³ Aus Devilacqua, Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 9238-9242, 1987 &sup4; Aus Bevilacqua, Proc. Natl. Acad. Sci,, li: 9238-9242, 1987 &sup5; Aus Prober et al., J. Immunol., 136: 1680-1687, 1986 und aus Bevilacqua, Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 9238-9242, 1987 &sup6; Aus Goerdt et al., Expl. Cell Biol., 55: 117-126, 1987 &sup7; Aus Goerdt et al., Expl. Cell Biol., 55: 117-126, 1987 &sup8; Aus Goerdt et al., Expl. Cell Biol., 55: 117-126, 1987 &sup9; Aus McEver und Martin, J. Biol. Chem., 259: 9799-9804, 1984 ¹&sup0; Aus McEver und Martin, J. Biol. Chem., 259: 9799-9804, 1984 ¹¹ Aus McEver und Martin, J. Biol. Chem., 259: 9799-9804, 1984 ¹² Rice et al., Science, 246: 1303-1305, 1989 unbekannt Blutplättchen, EC¹¹ chronisch akut Erfindung publiziert
Die Daten aus Tabelle III zeigen, daß die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper unerwartet verschieden sind von den nächsten bekannten publizierten monoklonalen Antikörpern.

BEISPIEL 4

DETAILLIERTE ANALYSE DER ANTIGENE 1E7/2G7, 1A7/3B7 UND CMP- 170

(A) 2-D-GELANALYSE DER MEMBRANPROTEINE AUS RUHENDEN UND IL- 1-STIMULIERTEN HUVEC:

Für eine Schätzung der Anzahl der neuen Membranproteine, die durch Endothelialzellen nach kurzzeitiger Exposition mit IL-1 synthetisiert werden, wurden Detergenspellets aus TRITON X- 114 lysiert mit Zellen durch 2-D-Gelanalyse wie folgt untersucht.
Konfluente Kulturen von HUVEC mit niedrigen Passagen (weniger als p6) in 100-mm-Gewebekulturschalen wurden über Nacht im Wachstumsmedium&sub1; enthaltend D-MEM (Gibco) ohne Cystein plus 20%ig dialysiertem fetalem Kalbsserum und anderen Komponenten von endothelialem Zellwachstumsmedium eingebracht. Am nächsten Tag wurde IL-1 zu 1 ng/ml zugegeben, und ³&sup5;S-Cystein (Amersham) wurde in einem Verhältnis von 250 uCi/10&sup7; Zellen zugegeben. nach 6-stündiger Kultur bei 37ºC wurden die Monoschichten mit eiskaltem Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) gespült und mit 250 ul einer 1%igen Lösung TRITON X-114 Lysepuffer, enthaltend 10 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl und 2 mM PMSF lysiert. Die Abtrennung der hydrophoben von den Proteinen der wäßrigen Phase erfolgte im wesentlichen wie bei Bordier, J. Biol. Chem., 256: 1604-1607, 1981 beschrieben. Nach 5 Minuten wurden die Zellysate aus der Schale in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gekratzt, bei 12000 g 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, und der Überstand über 300 ul 6%iger Saccharose, 10 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl und 0,06 % TRITON X-114 überschichtet. Der Gradient wurde bei 37ºC genau 1 Minute eingestellt, um Phasentrennung zu erreichen, und bei 850 g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand der wäßrigen Phase wurde Entfernt und mit frischem 10%igem TRITON X-114 vereinigt, um die Konzentration auf 1 % Detergens bei 4ºC einzustellen. Dieser wiederum extrahierte Überstand wurde über dem ursprünglichen Saccharosegradient/TRITON X-114- Detergenspellet geschichtet, auf 37ºC für 1 Minute gebracht und wie zuvor noch einmal zentrifugiert. Diese Operation umfaßte letztendlich die ursprüngliche Auftrennung des Detergens und der wäßrigen Phasen, worauf sich drei nochmalige Extraktionen der wäßrigen Phase durch nochmalige Detergenszugabe anschlossen. Die vereinigten Detergenspellets für jede Probe wurden durch Zugabe von 9 Teilen Puffer (10 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl) zu einem Teil Pellet verdünnt. Dieses Material wurde noch einmal durch Überschichtung über ein Saccharosekissen, Inkubation für 1 Minute bei 37ºC und Rezentrifugation, wie oben beschrieben, reextrahiert. Die letzte wäßrige Phase und das Saccharosekissen wurden verworfen, und das Detergenspellet bei -70ºC bis zur 2-D- Gelanalyse eingefroren.
Es wurde gezeigt, daß diese Verfahren zur Partitionierung der Membranproteine wegen ihrer hydrophoben Transmembranregionen eher in hydrophobe (Detergens) als in die wäßrige Phase favorisiert (Bordiert, J. Biol. Chem., 256: 1604-1607, 1981). Dieses trifft auch für Mitochondriale, Plasma und andere Membranproteine zu. Vorbestimmungen der Selektivität, bei der Membranproteine in den wäßrigen gegenüber den Detergens- Phasenextrakten gefunden wurden, wurde durch Fraktionierung der Zellen festgestellt, dessen Oberfläche durch Inkubation durch 10&sup7; Zellen in Protein-freiem PBS, enthaltend N- Hydroxysuccinimidobiotin bei 100 ug/ml für 30 Minuten auf Eis (4ºC) biotinyliert wurden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 % BSA in PBS abgebrochen, und durch Spülen der Zellen durch Zentrifugation und Resuspension zur Entfernung von nicht-umgesetztem Reagens. Die Zellen wurden mit TRITON X-100 lysiert und auf einem 10 % reduzierenden SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Dieses Gel wurde dann einem Western-Blott mit äquivalenten Mengen an Protein aus den beiden Phasen in die Nitrozellulose unterworfen. Hierauffolgte der Nachweis mit Streptavidin-beta-galactoxidase, die, wenn auch nicht quantitativ, anzeigte, daß die große Mehrheit des Biotins mit der Detergensphase assoziiert war (Daten nicht gezeigt).
Die 2-D-Gelanalyse erfolgte durch Protein Databases Inc. (PDI), wie zuvor beschrieben (Garrels, J. Biol. Chem., 254: 7961-7977, 1979; Garrels, Methods Enzymol., 100: 411-423, 1983). Es wurde eine Probe von 20 ul oder weniger, enthaltend 400000 dpm ³&sup5;S-Cystein, in das Zellprotein (5 bis 20 mg) eingebaut und diese auf ein pH 3,5 bis 10 Gradientengel mit erster Dimension unter Verwendung von LKB-Ampholyten aufgegeben. Die zweite Dimension erfolgte auf SDS-PAGE-Gelen zu 10 % Acrylamid unter reduzierenden Bedingungen. Es wurden Filme auf die getrockneten Gele zusammen mit einem Satz an densitometrischen Standards für verschiedene Zeiträume aufgelegt. Die Molekulargewichte und isolelektrische Punkte wurden durch Referenz mit Proteinen mit bekannten Werten festgestellt. Eine Computer-unterstützte Analyse der Gele erfolgte wie beschrieben (Garrels, J. Biol. Chem., 264: 5269- 5282, 1989).
Die Ergebnisse sind in den Fig. 12A und 12B gezeigt, worin die Membranproteine aus ³&sup5;S-Cystein-markierten Endothelialzellen in Fig. 11A gezeigt sind, und die IL-1- aktivierten Endothelialzellen in Fig. 11B gezeigt sind. Für jedes Gel wurden 400000 cpm aufgegeben. In dieser Figur wurde der Film auf die getrockneten Gele 22 Tage aufgelegt. Die scheinbaren Molekulargewichte und die isoelektrischen Punkte sind angegeben, bezogen auf Referenz mit bekannten Proteinen in einer Datenbank.
Fig. 12A zeigt das Muster von Proteinen, die ³&sup5;S-Cystein im ruhenden und zusammenfließenden Zellen in einem 6-stündigen Zeitraum einbauen. Auf der rechten Seite sind die Proteine, die durch Zellen synthetisiert wurden, welche IL-1 und ³&sup5;S- Cystein 6 Stunden ausgesetzt wurden, gezeigt. Die drei Pfeile auf der oberen linken Seite der Fig. 12A bedeuten Klusters von Flecken, die bei nicht-induzierten fehlen und bei induzierten vorkommen. Diese Muster in Serie produzierbar in einer Reihe von 6 solcher Analysen und im wesentlichen äquivalent zu den Ergebnissen, erhalten unter Verwendung von ³&sup5;S-Methionin als metabolische Markierung. In diesem beispielhaften Experiment identifizierte die Computeranalyse eine Gesamtzahl von 652 Spots auf den beiden Filmen, 300 davon waren über 30 der Fälle pro Minute (dpm). Von dieses Spots in den IL-1-induzierten 2-D-Gelen mit über 30 dpm, hatten 19 dpm-Werte die 2-fach oder höher über den Werten in den nicht-induzierte 2-D-Gel waren. Die drei Kluster von Spots, die die meisten der 19 Spots enthielten, waren die einzigen haupt-induzierten Proteine in allen sechs Experimenten.

(B) CHARAKTERISIERUNG DES 1E7/2G7-ANTIGENS:

TRITON X-114-Lysate (hergestellt wie oben beschrieben) von IL-1-aktivierten oder nicht-aktivierten HUVEC wurden fraktioniert unter Erhalt von Detergenspellets. Ein Teil des IL-1-aktivierten Membranpellets wurde zur Immunpräzipitation der 1E7- und 2G7-Antigene verwendet.
Die Immunpräzipitation wurde wie folgt durchgeführt. Nunc- ELISA-96-Wellplatten wurden mit 25 ug Affinitätspuffergereinigtem Ziege-Antimaus-Antikörper in 100 ul 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,5, 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Wells wurden zehnmal mit PBS-0,05% TWEEN 20 gespült, worauf die Zugabe von 200 ul 1 % BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur folgte. 5 ug gereinigter monoklonaler Antikörper wurde zu jedem Well in Gegenwart von BSA für eine zusätzliche Stunde bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 5 Waschvorgängen mit PBS-TWEEN wurden 1 bis 3 x 10&sup6; cpm Lysat zu jedem Well bei 4ºC für 2 Stunden unter sanftem Schütteln zugegeben. Die Wells wurden mit PBS-TWEEN gewaschen und die überschüssige Flüssigkeit wurde entfernt. Das immunpräzipitierte Material wurde mit 2 % SDS, 2 % 2- Mercaptoethanol extrahiert und ein Teil jeder dieser Präzipitate wurde mit TRITON X-114-Lysat-Membranreaktionen für die 2-D-Gelanalysen vermischt.
Fig. 13 zeigt die 2-D-Gelanalyse von 1E7- und 2G7- Immunpräzipitaten allein und in Mischung der gesamten Membranproteine aus nicht-induzierten (-IL-1) und induzierten (+IL-1) HUVEC. In jedem der acht Quadrate ist ein Teil eines 2-D-Gels gezeigt, welches dem oberen linken Quadranten des gesamten in Fig. 12 analysierten Gels entspricht. Fig. 13A und 13H sind Immunpräzipitate allein mit entweder dem 1E7 (oben) oder dem 2G7 (unten) Antikörper. Keine zusätzlichen Spots wurden in anderen Teilen des Gels gesehen. Fig. 13C und 13D zeigen die gesamten Membranproteine aus nicht-induzierten (-IL-1, oben) oder induzierten (IL-1, unten) BVVEC ohne zugesetztes Immunpräzipitat. Fig. 13E und 13F zeigen den Effekt der Zugabe von 1E7 (oben) oder 2G7 (unten) Immunpräzipitat zu Membranproteinen von nicht-induzierten HVVEC. Fig. 13G und 13H zeigen den Effekt der Zugabe von 1E7 (oben) oder 2G7 (unten) Immunpräzipitaten zu Membranproteinen aus IL-1-induzierten HUVEC. Plus (+) bedeutet das saure und minus (-) das Basische Ende eines jeden Gels.
Aus Fig. 13 können mehrere Schlüsse gezogen werden. Erstens sind die Muster der durch die 1E7- und 2G7-Antigene immunpräzipitierten Spots nicht unterscheidbar (Fig. 13A, oben und unten). Zweitens zeigen Mischexperimente sowohl mit dem 1E7- als auch dem 2G7-Immunpräzipitat, daß sie eine identische Position hinsichtlich der Größe und Ladung relativ zu den anderen Spots in den gesamten Membranlysaten einnehmen. Das kann sehr einfach gesehen werden, dort wo die 1E7- oder 2G7-Immunpräzipitate zu den nicht-induzierten (-IL- 1) Lysat (Fig. 13E und 13F) zugegeben werden. Drittens sind die 1E7- und 2G7-Antigene identisch, und definieren das im induzierten Membranlysat vorliegende Protein, mit dem diese drei Immunpräzipitate überlappen, wenn sie zum IL-1- induzierten Lysat (Fig. 13B und 13H) zugegeben werden. Diese Spots entsprechen dem mittleren Pfeil in Fig. 11, die ständig die am meisten hervortretende Anordnung von Spots in 2-D- Gelen aus Cystein (oder Methionin) markierten Zellen ist. Aus diesen Mischexperimenten, wie auch dem in Fig. 12 gezeigten 2-D-Gel, ist der Schluß, bezogen auf die Molekularmasse und den isoelektrischen Punkt von bekannten, auf 10%igen SDS- Polyacrylamid-reduzierenden Gelen aufgetrennten Proteinen, daß das Molekulargewicht des 1E7/2G7-Antigens bei ca. 110 kDa mit einem isoelektrischen Punkt im Bereich von 4,8 bis 4,9 liegt.

(C) VERGLEICH DES 3B7/7A9-ANTTGENS MIT DEM 1E7/2G7-ANTIGEN:

Vorläufige Analyse in 2-D-Gelen von Immunpräzipitaten der 3B7- und 7A9-Antigene zeigte, daß sie identische und in Mischexperimenten, überlappende Profile hatten. Die Immunpräzipitation, die 2-D-Gelelektrophorese und Mischexperimente wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Jedes Präzipitat bestand aus ca. 10 Spots, deren Molekularmassenbereich ca. 110 bis 120 kDa war, und deren isoelektrischer Punkt im Bereich von ca. 4,3 bis 5,0 lag. Es konnte daher vermutlich geschlossen werden, daß die 3B7- und 7A9-Antikörper jeweils das gleiche Polypeptid definieren. Um die Verwandtschaft des 1E7/2G7-Proteins mit den 3B7/7A9- und ICAM-1-Proteinen zu überprüfen, und jedes dieser in einen Kontext mit den in Fig. 11 gezeigten IL-1-induzierbaren Membranproteinen zu stellen, wurde eine 2-D-Gelanalyse, durch geführt wie oben beschrieben, von Mischungen der verschiedenen Immunpräzipitate durchgeführt. Entsprechende cpm (ca. 10&sup4;) der Immunpräzipitate von IL-1-aktivierten und ³&sup5;S-Cystein-markierten HUVEC wurden analysiert. Die für die Immunpräzipitationen verwendeten Antikörper waren: RRL (Anti- ICAM-1), 2G7, 7A9, RR1 + 2G7, RR1 + 7A9 und 2G7 + 7A9.
Die Ergebnisse sind in Fig. 14 gezeigt Fig. 14A, RR1 (Anti- ICAM-1); Fig. 14B, 2G7; Fig. 14C, 7A9; Fig. 14D, RR1 + 2G7; Fig. 14E, RR1 + 7A9 und Fig. 14F, 2G7 + 7A9. Nur das obere linke Quadrat eines jeden der sechs 2-D-Gele ist gezeigt. Keine zusätzlichen Spots lagen in anderen Bereichen vor.
Die individuellen Immunpräzipitate für ICAM-1, 2G7 und 7A9 sind in den Fig. 14A, 14B und 14C gezeigt. Fig. 14D zeigt den Unterschied sowohl der 2G7- und ICAM-1-Proteine und ihre Relation zueinander. Fig. 14E zeigt einen Vergleich von 7A9 und ICAM-1-, während Fig. 14F den Vergleich 2G7 mit 7A9 zeigt. Nur im letzten Fall ist eine teilweise Überlappung von Spots mit dem 7A9 vorhanden, das ein leicht saureres Profil mit höherem Molekulargewicht zeigt. Die Ergebnisse erlauben Identifikation der drei Reihen in Fig. 12. Der am meisten links stehende Pfeil identifiziert das saure Ende des 3B7/7A9-Proteins, der mittlere Pfeil zeigt auf die Region des 1E7/2G7-Proteins und der rechte Pfeil zeigt auf die ICAM-1- Region. Die entsprechenden induzierten Proteine sind in Fig. 12 gezeigt (+IL-1). Die Unterschiede in den 1E7/2G7- und 3B7/7A9-Proteinen und ihre Verwandtschaft zu der zuvor identifizierten ELAM-I-Struktur (Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 9238-9242, 1987; Bevilacqua et al., Science, 243: 1160-1165, 1989) wurde in den folgenden Experimenten getestet.
Die kodierende Sequenz der ELAM-1-cDNA, kloniert durch Polymerase-Kettenreaktion, wurde in den pCDN-1- Expressionsvektor (Fig. 15) eingefügt und zur Transfektion von COS-Zellen verwendet.
ELAM-1-cDNA-Klonierung durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde wie folgt durchgeführt. die folgenden PCR-Primer wurden zur Vermehrung der ELAM-1-kodierenden Region verwendet:
Primer 1 5'-GGGGGGCTCG AGTGAAGTCA TGATTGCTTC ACAGTTTCTCTC-3'
Primer 2 5'-GGGGGGACGC GTAACTTAAA GGATGTAAGA AGGCTTTTGGTA-3'
Die zwei Primer wurden so ausgewählt, daß sie die kodierende Region von ELAM-1-mRNA umfassen, und jeweils die Start- und Stop-Codons einschließen. Ebenfalls wurden Restriktionsenzymschnittstellen Xho-I und Mlu-I in diese Primer zur erleichterten Klonierung des PCR-amplifizierten Produkts in den Expressionsvektor eingebaut, PCR- amplifizierte ELAM-1-cDNA wurde auf zwei verschiedenen Wegen hergestellt. In Verfahren 1 wurde polyA RNA aus IL-I- aktivierten HUVEC verwendet zur Herstellung von cDNA unter Verwendung eines jeden Invitrogen Copy Kits. Die gesamte RNA aus HUVEC wurde isoliert durch saure Phenolextraktion (Chromczynski und Saccri, Anal. Biochem., 152: 156-159, 1987). Polya RNA wurde durch oligo-dT- Zellulosechromatographie isoliert (Aviv und Leder, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 69: 1408-1412, 1972). Dann wurde die cDNA zur Amplifizierung der ELAM-1-kodierenden Sequenz durch PCR verwendet (Saiki et al., Science, 239: 487-491, 1988) unter Verwendung der oben beschriebenen beiden Primer und des von Cetus Corp. erhältlichen Amplifizierungskits. Die PCR- Amplifizierung erfolgte für 30 Zyklen unter Verwendung der folgenden Bedingungen: Denaturierung: 94ºC, 1 Minute; Verschmelzen: 50ºC, 2 Minuten; Elongation: 72ºC, 3 Minuten. Während des letzten Zyklus war die Elongationszeit 7 Minuten. In Verfahren 2 wurden 2500 nm polyA RNA aus IL-1-aktivierten HUVEC revers in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 ml mit PCR-Primer 1 und MuLV-reverser Transkriptase, erhalten von BRL, unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen, transkripiert. Diese cDNA wurde dann zur Amplifizierung der ELAM-1-kodierenden Sequenzen nach den Bedingungen des Verfahrens 1 verwendet. Das PCR-amplifizierte Produkt aus beiden Verfahren wurde durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Das erwartete 1,85-Kb-Produkt der ELAM-1- kodierenden Sequenz wurde in beiden Fällen erhalten.
Die 1,85-Kb-Bande wurde elektroeluiert und mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase I (BRL) behandelt und in das Plasmid pSP72A ligatisiert, mit Nru-I linearisiert und mit alkalischer Phosphatase aus dem Kalbsdarm behandelt (Boehringer-Mannheim).
Das Plasmid pSP72A ist eine modifizierte Version des von Promega Biotech erhaltenen pSP72. Insbesondere wurde pSP72 (Promega Biotech; Katalognummer P2191) durch Ersatz der multiplen Klonierungsstelle (MCS) mit einer neuen multiplen Klonierungsstelle, enthaltend die folgenden Stellen: NdeI, NotI. XhoI, HindIII, NruI, ClaI, MluI, BamHI, XbaI, EcoRI, SmaI, SacII, SnaBI, SalI, EagI und BGlII modifiziert. Die Synthese des für die modifizierte MCS kodierenden Oligonukleotids erfolgte in einem Gen-Assembler unter Verwendung einer Standardvorschrift. Das Oligonukleotid wurde in NdeI/BgIII verdauten pSP72 unter Gewinnung des Vektors pSP72A eingefügt.
Klone, die das Insert der ELAM-1-kodierenden Sequenz enthielten, wurden durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung einer synthetischen Oligomersonde innerhalb der kodierenden Region der ELAM-1-cDNA erhalten. Es wurden sechs Klone isoliert und unter Verwendung acht unterschiedlicher synthetischer Oligomersonden, die über die kodierende Sequenz der ELMA-1-cDNA in gleichmäßigen Abständen verteilt waren, sequenziert. Alle Klone enthielten zufällig verteilte Sequenzvariationen, die verschieden waren von der publizierten Sequenz von ELAM-1-cDNA (Bevilacqua et al., Science, 243: 1160-1165, 1989), was auf einen Fehler während der PCR-Amplifizierung hindeuten könnte. Jedoch waren zwei Variationen an den Nukleotidpositionen 1518 und 1916 der publizierten Sequenz in allen Klonen der PCR-amplifizierten ELAM-1-kodierenden Sequenz vorhanden. Daher ist vermutlich die korrekte Sequenz die neue Sequenz. Von diesen Klonen enthielt SPELAM-4 die gleiche Sequenz wie die publizierte Sequenz mit Ausnahme der Unterschiede an den Nukleotidpositionen 1518 und 1916. Das ELAM-1-kodierende Sequenzinsert wurde aus diesem Klon nach Verdau mit Not-I und Sma-I freigesetzt und in den Expressionsvektor pCDN-1 kloniert.
Das erhaltene ELAM-1-Expressionsplasmid ist in Fig. 15 gezeigt. Fig. 15 zeigt das Plasmid (pCDN-1; T.V. Gopal, nicht publizierte Arbeit), enthaltend den SV40-frühen Promotor (Bereich mit diagonalen Streifen) und 5V40"t"-Splice und polyA-Additionssequenzen (gepunkteter Bereich) der aus pSV2 NEO stammt (Southern und Berg, J. Mol. Applied Genetics, 1: 327-341, 1982). Der Rest des Plasmids enthielt pBR322 (-) Sequenzen. Wichtige Restriktionsschnittstellen sind in der Figur angegeben. MCS bedeutet multiple Klonierungsstellen. Andere handelsüblich erhältliche Säugerexpressionsvektoren, wie pEUK-C1, pEUK-C2 und pMAM-neo (Clontech Laboratories, CA) können anstelle von pCDN-1 zur Untersuchung der vorübergehenden Expression von ELAM-1 in COS-Zellen verwendet werden.
Blind- oder ELAM-1-transfektierte COS-Zellen wurden verwendet, um die Reaktivität der 4 monoklonalen Antikörper zu testen. Voruntersuchungen, nicht gezeigt, zeigten, daß ca. 2 bis 5 % der ELAM-1-transfektierten Zellen an HL-60- Tumorzielzellen banden, wogegen die blind-transfektierten Zellen nur gelegentliche HL-60-Bindung zeigten. Blindtransfektierte und ELAM-1-transfektierte Zellen wurden auf einem Plattebindungstest, analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen, gescreent.
COS-Zellen (2 x 10&sup4;/Well) wurden auf Mikrotiterwells 24 Stunden vor dem Test und 48 Stunden nach Transfektion plattiert. Die Zellen wurden der Nahe nach mit Medium allein (Kontrolle) oder 1 ug/ml von jedem der vier gereinigten monoklonalen Antikörpern, und anschließendem biotinyliertem Ziege-Antimaus-Antikörper und ¹²&sup5;J-Streptavidin inkubiert.
Die Transfektion erfolgte wie folgt. 20 ug pCDN ELAM-1- Plasmid-DNA wurde in ca. 1 x 10&sup6; COS-Zellen nach dem DNA- CaPO&sub4;-Copräzipitationsverfahren von Wigler et al., Cell, 16: 777-785, 1979 transfektiert. 4 Stunden nach Zugabe des DNA- CaPO&sub4;-Präzipitats wurden die Zellen mit 15 % Glycerin für zwei Minuten bei Raumtemperatur nach dem Verfahren von Parker und Stark, J. Virol., 31: 360-396, 1979 behandelt. Die gleiche Menge an Vektor-Plasmid-DNA ohne ein Insert wurde Verwendet als Kontrolle für die Transfektion in 1 x 10&sup6; Zellen unter Erhalt von blind-transfektierten Zellen. Die Zellen wurden ca. 48 Stunden nach Glycerinschock geerntet und für die Antikörper-Bindungsstudien verwendet.
ELAM-1-transfektierte aber nicht blind-transfektierte Zellen zeigten wirksame Bindung an HL-60-Zellen (Daten nicht gezeigt).
Die Daten aus drei Experimenten mit identischen Ergebnissen sind in Fig. 16 gezeigt. In dieser Figur sind die Ergebnisse ausgedrückt als Mittelwert (± s.e.m., n = 3) der gesamten cpm/Well. Diese Figur zeigt, daß weder der 1E7- noch der 2G7- Antikörper mit dem ELAM-1-Genprodukt reagiert, wogegen sowohl 3B7 und 7A9 reagieren. Dieses Reaktivitätsmuster wurde durch Immunpräzipitationsanalyse der gleichen Zellen nach metabolischer Markierung bestätigt. Nur die 3B7- und 7A9- Antigene präzipitierten ein Protein der Molekularmasse von ca. 100 kDa aus ELAM-1-transfektierten aber nicht aus blindtransfektierten Zellen (Daten nicht gezeigt). Aus Gründen der Einfachheit wurden daher nur die 2G7- und 7A9-Antikörper in den abschließenden Vergleichen der beiden Proteine verwendet.

(D) VERGLEICH DER ICAM-1, 2G7- UND 7A9-PROTEINE NACH TUNICAMYCINBEHANDLUNG:

Ein weiterer Vergleich der ICAM-1-, 2G7- und 7A9-Proteine hinsichtlich ihres Ausmaßes an N-verknüpten Kohlenhydrat wurde durchgeführt. Zusammenschließende HUVEC wurden 6 Stunden in Gegenwart von 1 ng/ml IL-1 und in Abwesenheit oder Anwesenheit von 1 ug/ml Tunicamycin B2 behandelt. Tunicamycin wurde während der Zugabe von IL-1 zusammen mit ³&sup5;S-Cystein zugegeben. TRITON X-100-Lysate wurden, wie oben beschrieben, immunpräzipitiert, mit Ausnahme, daß die Wells mit reduzierendem Probenpuffer in 60ºC Wasser, bei für 5 Minuten, extrahiert wurden. Die Immunpräzipitate wurden auf 10 % SDS- Polyacrylamid-reduzierenden Gelen analysiert. TRITON X-100- Lysate wurden, wie oben beschrieben, für die TRITON X-114- Lysate hergestellt, mit Ausnahme, daß das Phasenabtrennverfahren weggelassen wurde.
Die Ergebnisse sind in Fig. 17 gezeigt. Fig. 17 zeigt, daß das ICAM-1-Glycoprotein vorliegt, nach Tunicamycinbehandlung, als eine Mischung von nativen und Kernproteinstrukturen, die letztere bei 50 kDa. Das 2G7-Immunpräzipitat mit den Hauptund Nebenbanden bei 114 kda und 95 kDa liegt nach Tunicamycinbehandlung als Mischung des nativen 114 kda und Kernproteins bei 80 kDa vor. Die reduzierte Expression der 114-kda-Bande legt nahe, daß Tunicamycin die gleiche Verminderung bei der Proteinsynthese bewirkt haben könnte. Das 7A9-(ELAM-1)-Antigen, in Übereinstimmung mit dem komplexen Muster, wie in den 2-D-Gelen beobachtet, ist eine breite Bande in der Region von 110 kDa, die nach Tunicamycinbehandlung beinahe vollständig auf ein Protein mit einer Molekularmasse von ca. 67 kDa eingeschränkt ist.

(E) SIALINSÄUREGEHALT VON 2G7- UND 7A9-(ELAM-1)-ANTIGENEN:

Das Spotmuster, gezeigt in den 2-D-Gelanalysen der Immunpräzipitate von 2G7- und 7A9-(ELAM-1)-Antigene (Fig. 12 und 13) weisen auf eine Ladungsheterogenität hin, die aufgrund eines variablen Grades an Sialinsäuregehalt herrühren könnte. HUVEC wurden daher mit IL-1 6 Stunden in Gegenwart von ³&sup5;S-Cystein aktiviert und entweder mit PBS(EDTA (Kontrolle) oder durch Neuraminidasebehandlung abgelöst. Die Lebensfähigkeit solcher Zellen war immer größer als 95 %. TRITON X-100-Extrakte (erhalten wie oben beschrieben) dieser Zellen wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren entweder mit dem 2G7- oder 7A9-Antikörper immunpräzipitiert. 2-D- Gelanalysen (durchgeführt wie oben beschrieben) dieser Immunpräzipitate wurden durchgeführt.
Die Neuraminidasebehandlung der HUVEC erfolgte wie folgt. Die Zellen wurden einmal mit D-PBS gespült und 0,05 Einheiten Neuraminidase in PBS wurden zu ca. 3 x 10&sup6; Zellen für 20 Minuten bei 37ºC zugegeben. Die abgelösten und voll lebensfähigen Zellen wurden zentrifugiert und durch Zugabe von 1 % TRITON X-114, wie oben beschrieben, lysiert.
Fig. 18 zeigt einen Teil von jedem der vier 2-D-Gele. Für beide Antigene trat eine deutliche Abnahme in der Anzahl der nachweisbaren Spots plus dem Auftreten von neuem(n) Spot(s) mit vermindertem Molekulargewicht um ca. 5 kDa und erhöhter Ladung um einen ca. 0,5 isoelektrischen Punkt auf. Dies ist ein Beleg, daß bei de Proteine Sialinsäure in verschiedenen Substitutionsgraden enthalten.

(F) O-VERKNÜPFTER KOHLENHYDRATGEHALT VON 2G7- und 7A9-(ELAM- 1)-ANTIGEN:

³&sup5;S-Cystein-Immunpräzipitate (hergestellt wie oben beschrieben in Mikrotiterwells) von beiden Antigenen wurden zunächst mit Verdaupuffer allein oder mit Puffer, enthaltene 1 Einheit/ml Neuraminidase behandelt (Boehringer Mannheim) für 1 Stunde bei 37ºC. Der Verdaupuffer bestand aus 0,155 M Natriumphosphat, pH 6,0, enthaltend 1 mM Kaliziumacetat. Zusätzlich enthielt der Verdaupuffer einen Cocktail aus Proteaseinhibitoren, wie bei Ronnett et al. (Ronnett et al., J. Biol. Chem., 259: 4566-4575, 1984) beschrieben, bestehend aus Leupeptin, Benzamidin, Aprotinin, Antipain, Pepstatin und Chymostatin. Nach Neuraminidasebehandlung wurden die Wells unbehandelt stehengelassen oder mit Endo-alpha-N- acetylgalactosaminidase (O-Glycanase) zu 25 mEinheiten/ml im gleichen Puffer wie für die Neuraminidasebehandlung verwendet, behandelt. O-Glycanasebehandlung wurde bei 37ºC über Nacht fortgesetzt. Am nächsten Tag wurden die Wells zweimal mit PBS-TWEEN gespült, wie oben beschrieben mit Probenpuffer extrahiert, und die Extrakte wurden auf 10 % SDS-Polyacrylamid-reduzierenden Gelen analysiert.
Die Ergebnisse sind in Fig. 19 gezeigt. Wie in Fig. 19 gezeigt, gab es eine Massenverminderung von ca. 5 kDa sowohl für die 2G7- als auch das 7A9-(ELAM-1)-Antigen nach Neuraminidasebehandlung, welches übereinstimmte mit den Ergebnissen, erhalten durch Behandlung intakter Zellen (Fig. 18). Die Behandlung zur Entfernung von O-verknüpften Zuckern verursachte nur eine geringe Massenverrlngerung, ca. 1 bis 2 kDa sowohl für die 2G7- als auch 7A9-Antigene in beiden Experimenten.

(G) KINETIK DER ANTIGENSYNTHESE:

Um weiterhin die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den 2G7- und 7A9-Glycoproteinen aufzuzeigen, wurden die Glycoproteine wie oben beschrieben zu verschiedenen Zeiten nach Zugabe von IL-1 zu den HUVEC-Kulturen immunpräzipitiert. ³&sup5;S-Cystein wurde gleichzeitig mit der IL-1-Zugabe zugegeben. Es wurden TRITON X-100-Lysate hergestellt, und Immunpräzipitate entweder mit dem 2G7- oder 7A9-Antikörper gebildet. Die Immunpräzipitate wurden auf 10 % SDS- Polyacrylamid-reduzierenden Gelen analysiert.
Die Ergebnisse, gezeigt in Fig. 20, weisen darauf hin, daß bei 1 Stunde nur das 7A9-(ELAM-1)-Antigen nachgewiesen werden, wenn auch nur schwach. Es wurde vermutlich bereits dem gleichen Ausmaß an Glycosylierung unterworfen, da seine Masse zu dieser Zeit ca. 79 kDa ist, und nicht 67 kDa, wie nach Tunicamycinbehandlung beobachtet. Nach 2 Stunden zeigt das 2G7-Immunpräzipitat zwei Banden von gleicher Intensität bei ca. 95 kDa und 114 kDa, während zu diesem Zeitpunkt das 7A9-(ELAM-1)-Antigen in seiner "reifen" Form als eine breite Bande bei ca. 95 kDa vorliegt. Nach 6 Stunden zeigt das 2G7- Antigen die Hauptbande bei 114 kda.

(H) VERDRÄNGUNGS-BINDUNGSTESTS:

Um die räumliche Beziehungen der vier Epitope, definiert durch die verschiedenen monoklonalen Antikörpern auf diesen Proteinen zu überprüfen, wurde ein Verdrängungs-Bindungstest durchgeführt, worin jeder der gereinigten monoklonalen Antikörper mit FITC gekoppelt und ein einem Flußcytometer auf seine Fähigkeit zur Verdrängung in homologen und heterologen Kombinationen getestet wurde.
FITC-Konjugate der monoklonalen Antikörper 1E7, 2G7, 7A9 und 3B7 wurden auf IL-1-aktivierten Endothelialzellen titriert, um eine leichte untersättigende Dosierung zu bestimmen. Dieses Dosis an FITC-Antikörper wurde mit einem 50-fachen Überschuß von jedem der nicht-konjugierten monoklonalen Antikörpern vorgemischt. Dann wurde diese Mischung zu einer Einzelzellsuspension in IL-1-aktivierten HUVEC bei 4ºC 30 Minuten in PBS, enthaltend 1 % BSA und 0,2 % Natriumazid zugegeben. Die Zellen wurden dreimal im gleichen Puffer gewaschen und für die flußcytometrische Analyse resuspendiert.
Es erfolgte FITC-Konjugation von monoklonalen Antikörpern bei 4 mg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer bei pH 9,5 wie beschrieben (Hardy, in Handbook of Experimental Immunology, Bd. 1, 4. Auflage, 1986 - (Weir D.M., ed.) Bläckwell Scientific Publications, Oxford, England, 3101-3112).
Die Ergebnisse sind in Fig. 21 gezeigt. Der für jedes der vier gezeigten Experimente verwendete bestimmte FITC- Antikörper war wie folgt: Fig. 21S: 1E7; Fig. 21B: 2G7; Fig. 21C: 3B7; Fig. 21D: 7A9. Auf der vertikalen Achse ist der Prozentsatz positiver Zellen angegeben.
Die Resultate zeigen, daß bei einem 50-fachen Überschuß 1E7, 2G7 und 3B7 nur um die Bindung der homologen FITC- monoklonalen Antikörper konkurrieren. Der 7A9-Antikörper ist dahingehend unterschiedlich, daß er reproduzierbar die Bindung des 2G7-Antikörpers, einen Maximalwert von 62 % bei einem 1:50-Molverhältnis 2G7:7A9 stört.

(I) KINETIK DER ANTIGENEXPRESSION AUF DER ZELLOBERFLÄCHE:

HUVEC wurden für verschiedene Zeiträume in 1 ng/ml IL-1 kultiviert und auf die 2G7- und 7A9-Antigene unter Verwendung des 96-Well-Plattenbindungstests im wesentlichen auf dieselbe Weise wie für den Hybridom-Screentest analysiert. Alle Zellen wurden gleichzeitig analysiert.
Die Ergebnisse sind in Fig. 22 gezeigt, worin geschlossene Kreise den Antikörper 2G7 und geschlossene Dreiecke den Antikörper 7A9 bedeuten. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als mittlere cpm ± s.e.m. (n = 3).
Die in Fig. 22 aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß nach 2 Stunden das 7A9-(ELAM-1)-Protein maximal exprimiert wurde, wogegen das 2G7-Antigen nur zur Hälfte seines Maximalwertes exprimiert wird. Nach 4 Stunden hat das 2G7-Antigen seinen Maximalspiegel erreicht. Das Ergebnis stimmt überein mit der etwas früheren Expression des 7A9-(ELAM-1)-Protein bei biosynthetischen Markierungsexperimenten (Fig. 20). Interessanterweise werden bei ständiger Anwesenheit von IL-1 beide Proteine auf der Zelloberfläche in hohen Spiegeln bis zu 7 Tage exprimiert. Falls IL-1 abgesetzt wird, kehren sie innerhalb von 24 Stunden zum Normalspiegel zurück (Daten nicht gezeigt).

(J) ZELLULÄRE VERTEILUNG DER 2G7- UND 7A9-ANTIGENE:

Eine Vielzahl von Zellen in der Primärkultur wurden getestet, mit oder ohne IL-1-Vorbehandlung, auf die Expression der 2G7- oder 7A9-Glycoproteine. Diese Experimente erfolgten in 96- Wellplatten im wesentlichen auf dieselbe Weise wie für den Hybridom-Screentest. Insbesondere wurden die angegebenen Zelltypen in die 96-Wellplatten gegeben. Die folgenden Zellen wurden in der angegeben Konzentration 24 Stunden vor dem Test angeimpft: Fibroblasten, Keratinocyten und HUVEC, 2 x 10&sup4;/Well; am Tag des Tests wurden die peripheren monoklonalen Blutzellen zu 5 x 10 &sup4;/Well, Granulocyten zu 10&sup5;/Well und Blutplättchen zu 10&sup5;/Well angeimpft. Die Blutplättchen wurden mit 1 Einheit humanem alpha-Thrombin 1 Stunde vor dem Test auf Antigenexpression stimuliert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt. TABELLE IV ZELLULÄRE VERTEILUNG DER 2G7- UND 7A9-(ELAM-1)-PROTEINE Zelltyp Antikörper cpm gebunden, kein IL-1 HUVEC Granulocyten Periphere monounkleare Blutzellen Keratinocyten Fibroblasten Blutplättchen * Thrombinstimulierung, 1 Einheit/ml
Die Ergebnisse in Tabelle IV zeigen, daß diese Antigene nicht in einem nachweisbaren Maß auf Fibroblasten, Granulocyten, nicht-fraktionierten peripheren mononuklearen Blutzellen, Keratinocyten oder Blutplättchen (mit oder ohne Thrombinstimulierung) exprimiert werden. Die Blutplättchen schienen ein hohes Maß an nicht-spezifischer Bindung von ¹²&sup5;J-Streptavidin zu haben.

(K) EFFEKTE VON TNF, LPS UND IFNy AUF DIE 1E7/2G7- UND 7A9 / 3B7-ANTIGENEXPRESSION:

Der Effekt der lps-Stimulierung für 4 Stunden, TNF- Stimulierung für 6 Stunden und Langzeit-IFNγ-Stimulierung auf die Expression de 1E7/2G7-Antigens und des 7A9/3B7-Antigens wurde untersucht. Insbesondere wurden HUVEC verschiedenen Induktionsmitteln wie folgt ausgesetzt gamma-IFN, 100 u/ml, 2,5 Tage; lps 1 ug/ml für 6 Stunden, TNF 1 u/ml für 4 Stunden; und IL-1 1 ng/ml für 4 Stunden. Nach Waschschritten unter Entfernung dieser Agenzien wurden die angegebenen Antikörper bei sättigenden Dosen für die Antigenexpression in einem Plattenbindungstest getestet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt und als Mittelwert ± s.e.m (n = 3) ausgedrückt. TABELLE V EFFEKTE VERSCHIEDENER ANTIGENE AUF DIE 1E7/2G7- UND 7A9/3B7- ANTIGENEXPRESSION Antikörper IFN-Gamma * nb = nicht bestimmt.
Wie zuvor für ELAM-1 gezeigt, führen lps- und TNF- Stimulierung zur Expression des 1E7/2G7-Proteins. INFY war jedoch nach 2,5-tägigen Inkubation nicht wirksam bei der Tnduktion von 1E7/2G7, obwohl HLA-DR wie erwartet exprimiert wurde.

(L) OBERFLÄCHENEXRESSEN DES 3A2-ANTIGENS:

Es wurde eine flußcytometrische Analyse der Endothelialzellen durchgeführt, die 4 Stunden mit 1 ng/ml IL-1 vorbehandelt waren und mit 50 ug/ml 3A2-Antikörper gefärbt waren. Die Zellenanzahl wurde in willkürlichen Einheiten aufgrund der relativen Fluoreszenzintensitäten bestimmt. Zum Vergleich wurde ebenfalls die HLA- und ICAM-1-Antigene unter Verwendung des W6/32-Anti-HLA-Antigens und des Anti-ICAM-1-Antikörpers RR/1 bestimmt. Flußcytometrie erfolgte wie oben beschrieben. Das Färben erfolgte nach üblichen Verfahren unter Verwendung von FITC-markierten Antikörpern.
Die Ergebnisse sind in Fig. 23 gezeigt. Fig. 23 zeigt ruhende (...) oder IL-1-stimulierte (-) Endothelialzellen, die mit dem indirekten Reagens allein (Fig. 23A), dem W6/32-Anti-HLA- Antigen (Fig. 23A), dem Anti-ICAM-1-Antikörper RR/1 (Fig. 23C) und dem 3A2-Antikörper (Fig. 32D) gefärbt wurden.
Das durch den 3A2-Antikörper definierte Antigen ist auf der Oberfläche ruhender Endothelialzellen nicht nachweisbar, ist jedoch nach Exposition mit IL-1 innerhalb 2 Stunden nachweisbar. Die Ergebnisse zeigen, daß anders als bei dem HLA- oder ICAM-1-Protein, der 3A2-Antikörper eine heterogene Verteilung von Antigen im Bereich von Kanal 50 bis Kanal 150 nachweist, einem ca. 8-fachen Bereich an Fluoreszenzintensität. Die am intensivsten positiven Zellen entsprechen in ihrer Fluoreszenzintensität dem HLA-Antigen, obwohl weniger als ICAM-1. Wie zuvor berichtet (Dustin und Springer, J. Cell Biol., 107: 321-331, 1988) zeigt ICAM-1 eine ca. 8-facher Erhöhung auf Endothelialzellen nach 4- stündiger IL-1-Exposition.

(M) GEWEBEEXPRESSION DES 3A2-ANTIGENS:

Granulocyten, periphere mononukleare Blutzellen (PBL), Keratinocyten und Fibroblasten wurden auf Membranexpression des 3A2-Antigens vor oder nach Exposition für 4 Stunden mit 1 ng/ml IL-1 getestet. Die verwendeten Verfahren waren diejenigen wie für die 1E7/2G7- und 7A9/3B7-Antigene beschrieben, mit Ausnahme, daß die Zellen mit IL-1 anstelle von Thrombin stimuliert wurden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt. TABELLE VI ZELLOBERFLÄCHENVERTETLUNG DES CMP-170-PROTEINS ZELLTYP cpm gebunden, kein IL-1 HUVEC granulocyt PBL Keratinocyten Fibroblasten
Tabelle VI zeigt, daß nur Endothelialzellen eine Induzierbarkeit für die Expression des 3A2-Antigens zeigten.

(N) 3A2-ANTIGENCHARAKTERISIERUNG:

Endothelialzellen mit früher Passage wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 ng/ml IL-1 und 250 uCi ³&sup5;S-Cystein 4 Stunden kultiviert, und ³&sup5;S-Cystein-markierte Zellen wurden mit 1 % TRITON X-100 lysiert und, wie oben beschrieben, mit den Antikörpern 3A2, 7A9 (Anti-ELAM-1) oder 2G7, gerichtet gegen die endotheliale T-Zelladhäsionsstruktur, immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden auf 8 % SDS- Polyacrylamidgelen unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 24 gezeigt, worin (-) unbehandelt und (+) IL-1-behandelte Zellen bedeutet. Die Ergebnisse zeigen, daß nicht mit IL-1 behandelte Zellen kein ELAM-1- Antigen zeigen, daß jedoch IL-1-behandelte Zellen ein 110 bis 120-kda-Molekül präzipitieren, das mit dem 7A9-Antikörper, wie erwartet, reagiert, und ein 114-kda-Protein, das mit dem 2G7-Antikörper wie oben gezeigt reagiert. Der 3A2-Antikörper präzipitiert 170-kda-Protein in Anwesenheit und Abwesenheit von IL-1. Zusätzlich präzipitiert der 3A2-Antikörper eine schwache Bande in der Region der 2G7- und 7A9-Proteine nur aus den IL-1-behandelten Zellen. Dieses Ergebnis läßt vermuten, daß der 3A2-Antigenkomplex auf zwei Proteinen oder Untereinheiten aufgebaut sein könnte, von denen einer konstitutiv und der andere induzierbar ist. Während die Expression des 3A2-Antigens durch IL-1 an der Zelloberfläche induzierbar ist (Fig. 23), könnte die Expression des Antigens (der Antigene) im Cytoplasma konstitutiv sein.

(O) EXPRESSION DER 3A2-, 2G7- und 7A9-(ELAM-1-)-ANTIGENE AUF DER PLASMAMEMBRAN ERFORDERT RNA- UND PROTEINSYNTHESE:

Endothelialzellen in Monoschichtkultur in 96-Well flachen Bodenplatten wurden 30 Minuten mit 1 ug/ml vorbehandelt oder für 15 Minuten mit 1 ug/ml Actinomycin D vor der Zugabe von IL-1. Die Mittel wurden in den Kulturen während des Zeitraums der IL-1-Aktivierung belassen. Nach 4 Stunden wurden die Kulturen gespült und mit dem relevanten monoklonalen Antikörper in einem Plattenbindungstest, wie oben beschrieben, inkubiert. Lebensfähige Zellen in Monoschichtkulturen wurden auf die Oberflächenexpression dieser drei Proteine geprüft.
Die Ergebnisse sind in Fig. 25 gezeigt; Fig. 25A: IL- 1 ± Cycloheximid; Fig. 258: IL-1 ± Actinomycin D (Akt D).
Fig. 25 zeigt, daß alle getesteten Antigene eine Abhängigkeit der Expression von RNA und Proteinsynthese zeigten.

(P) LICHTMIKROSKOPISCHE BEWERTUNG DES 3A2-ANTIGENS:

Ruhende und IL-1-stimulierte Endothelialzellen wurden auf cytoplasmatische Expression des 3A2-Antigens geprüft. HUVEC wurde 4 Stunden in Abwesenheit oder Anwesenheit von 1 ng/ml IL-1 kultiviert. Die kultivierten HUVEC wurden durch kurze Exposition mit PBS-EDTA abgelöst und auf Glasmikroskop- Objektträger cytozentrifugiert. Die Zellen wurden mit Aceton für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und an der Luft getrocknet um die Zellen durchlässig zu machen, und mit 3A2- und 7A9-Antikörper gefärbt.
Für die Färbung wurden 100 ul Antikörper, enthaltend 0,1 ug Antikörper, auf die fixierten Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur gegeben. Die Zellen wurden mit PBS-1 % BSA gespült und mit 5 ug/ml Ziege-Antimaus-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, für 30 Minuten inkubiert. Das Spülen mit PBS-1 % BSA wurde der Objektträger mit dem Chronogen AEC unter Entwicklung einer Farbe inkubiert und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Objektträger wurden nach Aufbringung einer Abdeckung mit dem Auge beobachtet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 26 gezeigt. Fig. 26A: kein IL-1, gefärbt mit Antikörper 7A9; Fig. 26B: plus IL-1, gefärbt mit Antikörper 7A9; Fig. 26C: kein IL-1, gefärbt mit Antikörper 3A2; Fig. 26D: plus IL-1, gefärbt mit Antikörper 3A2. Die größeren Flecken in den Fig. 26B, 26C und 26D rühren von der roten Farbe her aus der Färbung, die das Vorliegen des entsprechenden Antigens andeutet. Die kleinen dunklen Flecken auf Fig. 26A sind blau gefärbte Kerne, die jedoch nicht von irgendeiner roten cytoplasmatischen Färbung umgeben sind.
Wie in Fig. 26 gezeigt, wurde die Färbung mit 3A2 sowohl bei unbehandelten als auch IL-1-behandelten Zellen beobachtet, wogegen Färbung mit dem 7A9 (Anti-ELAM-1) nur bei IL-1- behandelten HUVEC beobachtet wurde. Man beachte den Unterschied in der Intensität und der Verteilung des 3A2- Antigens in IL-1-behandelten im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Die Färbung bei IL-1-behandelten Zellen ist mehr punktförmig und kann in einigen Fällen in Verbindung mit einem Membran angesehen werden. In zusätzlichen Experimenten wurde Antikörper gegen den von-Willebrand-Faktor in einem Doppelfärbeprotokoll (unter Verwendung eines Zymed- Doppelfärbungskits für zwei Maus-primäre Antikörper nach den Herstellerangaben) mit dem 3A2-Antikörper und auf nicht-IL-1- behandelten Endothelialzellen eingesetzt. Die Antigene lokalisieren nicht die Weibel-Pallade-Körperchen. Daher, wie durch die Immunpräzipitationsexperimente in Fig. 24 nahelegt, muß das 3A2-Antigen vorher in den Zellen als ein 170-kDa- Polypeptid existieren. Aus diesem Grund wurde dieses Protein als cytoplasmatisches Membranproteine 170 (CMP-170) bezeichnet.

(Q) NATUR DER CMP-170-COPRÄZIPITIERTEN STRUKTUR:

Der Zweck dieses Beispiels ist die Identifizierung des 100 bis 120-kda-Materials, das mit CMP-170 in I1-1-behandelten Endothelialzellen assoziiert. Vorläufige Untersuchungen mit einer Reihe von Detergenzien, wie TRITON X-100, CHAPSO, OCTYLCLUCOSID, TRITON X-114, CHAPS und Deoxycholat zeigten, daß die Solubilisierung des 3A2-Antigens aus IL-1-behandelten Zellen Routine war, jedoch war nur manchmal von Copräzipitation einer kleineren Molekulargewichtsbande begleitet war. Man fand, daß die Copräzipitation optimal und reproduzierbar in Gegenwart des Detergens TRITON X-114 war. Demnach wurden unbehandelte oder IL-1-behandelte Endothelialzellen mit 1 % TRITON X-114-Detergens lysiert und, wie oben beschrieben, mit dem 3A2-Antikörper oder mit dem Kontroll-Ziege-Antimaus-IgM-Reagens allein immunpräzipitiert. Ein Teil dieser Immunpräzipitate wurde auf 8 % SDS- Polyacrylamidgelen unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Zusätzliche Wells, die 3A2-Immunpräzipitat enthielten, wurden mit TRITON X.100 unter Dissoziation des 3A2-Antigenkomplexes extrahiert und in Wells mit entweder 7A9- oder 2G7-Antikörper für eine zweite Immunpräzipitation überführt. Die Proben wurden auf 8 % SDS- Polyacrylamidgelen unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 27 gezeigt, worin (-) bedeutet unbehandelt und (+) bedeutet behandelte Endothelialzellen. Fig. 27A: Gel, aufgetrennt unter nicht-reduzierenden Bedingungen; Fig. 27: Gel, aufgetrennt unter reduzierenden Bedingungen; Fig. 27C, erste und zweite Bahnen: Immunpräzipitate mit 7A9- oder 2G7-Antikörper aus IL-1- aktivierten Zellen (als Kontrollen); und Fig. 27C, dritte und vierte Bahnen: zweite Immunpräzipitation mit 7A9- oder 2G7- Antikörper.
Die Ergebnisse in den Fig. 27A und 27B zeigen, erstens, daß das 3A2-Antigen-Molekulargewicht 170 kda unter nichtreduzierenden und reduzierenden Bedingungen ist. Die Schärfung des 3A2-Antigens unter reduzierenden Bedingungen läßt vermuten, daß etwas Multimerisierung des Antigens auftreten könnte. Die Anwesenheit von Jodacetamid bei der Lyse und in Probenpuffern macht es unwahrscheinlich, daß dieser Effekt ein Artifakt ist. Zweitens, zeigen die Ergebnisse in den Fig. 2A und 2B, daß die copräzipitiert Struktur, bei einer Molekularmasse von 100 bis 120 kda, nicht covalent mit dem CMP-170 verbunden ist, da sie sowohl unter nicht-reduzierenden wie auch unter reduzierenden Bedingungen auftritt.
Sowohl die Cytokininduzierbarkeit als auch die Ähnlichkeit im Molekulargewicht des 7A9-(ELAM-1)- und 2G7-Antigens (im Bereich von 110 bis 120 kDa) machten sie zu Kandidaten für die copräzipitierte Struktur. Die Identität der zusätzlichen Bande wurde bestimmt durch Extraktion des copräzipitierten Materials mit TRITON X-100, das ihre Assoziation nicht fördert, und Immunpräzipitation mit entweder dem 2G7- oder 7A9-Antikörper. Die Ergebnisse in Fig. 27C zeigen, daß das 7A9-(ELAM-1)-Protein, jedoch nicht das 2G7-Protein copräzipitiert wird. Immunpräzipitate der 7A9- und 2G7- Antigene sind in den ersten beiden Bahnen von Reihe C zum Vergleich gezeigt.
Ein weiterer Ansatz wurde unternommen zur Bestätigung des CMP-170:ELAM-1-Assoziation. Dies war möglich, da Vorexperimente gezeigt hatten, daß CMP-170 auch im Cytoplasma unbehandelter COS-Zellen vorkommt. Dies erlaubte das Testen als ob ELAM-1-transfektierte COS-Zellen, metabolisch markiert und mit TRITON X-114-Detergens lysiert, eine Assoziierung zwischen CMP-170 und ELAM-1 zeigen würden.
Spezifisch wurden COS-Zellen (eine Mäuse-Nieren-Zelline die endogenes CMP-170 hat) einer Blindtransfektion unterworfen, oder wurden durch übliche Verfahren mit der ELAM-1-cDNA in CDN-Plasmid transfektiert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden 3x 106 Zellen metabolisch mit 250 uCi ³&sup5;S-Cystein markiert, mit 1 % TRITON X-114, wie oben beschrieben, lysiert und wie oben beschrieben mit Antikörpern 7A9 oder 3A2 immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden auflo % SDS- Polyacrylamid reduzierenden Gelen aufgetrennt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 28 dargestellt, wo (-) eine Blindtransfektion und (+) eine Transfektion mit der ELAM-1- cDNA bedeutet.
Die Ergebnisse in Fig. 28 zeigen, wie erwartet, daß das ELAM- 1-Protein aus ELAM-1-transfektierten, aber nicht aus blindtransfektierten COS-Zellen in Übereinstimmung mit den vorhergehenden Experimenten präzipitiert wird (Bevilacqua et al., Science, 243: 1160-1165, 1989). In Bahn 5 immunpräzipitierte der 3A2-Antikörper eine 170-kDa-Struktur, die in Bahn 3 nicht zu beobachten ist (Kontrollbahn). Interessanterweise gibt es eine herausragende zusätzliche Bande von ca. 100 kDa, die in der Kontrollbande nicht gesehen wird. In der letzten Bande auf der rechten Seite (Bahn 6) copräzipitierte der 3A2-Antikörper, zusätzlich zur 170-kDa- Struktur deutlich das ELAM-1-Antigen. Ob das endogene 3A2- assoziierte COS-Protein, beobachtet bei 100 kda in Bahn 5, durch ELAM-1 in transfektierten Zellen ersetzt wurde, konnte aufgrund der Ähnlichkeit ihrer Molekulargewichte nicht bestimmt werden. Wie man aus Bahn 1 sehen kann, präzipitierte der 7A9-Antikörper nicht ein Protein aus blind-tranfektierten COS-Zellen. Auch zeigten die Immunpräzipitationsdaten aus COS-Zellen (Bahn 2 in Fig. 28) und Endothelialzellen (Bahn 1 aus Fig. 27C) mit 7A9 keine Bande, die bei 170 kDa copräzipitierte. Daher ist die Copräzipitation von ELAM-1 mit CMP-170 unidirektional.

(R) KINETIK DER 3A2:ELAM-1-ASSOZIATION:

3 x 10&sup6; Endothelialzellen wurden mit 250 uCi ³&sup5;S-Cystein entweder 45 oder 120 Minuten gepulst und unmittelbar darauf lysiert oder für zusätzliche 1 bis 2 Stunden vor der Lyse mit TRITON X-114, wie oben beschrieben, gechased. Die Lysate wurden, wie oben beschrieben, mit den 3A2- oder 7A9- Antikörpern immunpräzipitiert und die Immunpräzipitate wurden auf 70 % SDS-Polyacrylamid-reduzierenden Gelen aufgetrennt. Ferner wurden Endothelialzellen, die für 4 Stunden mit IL-1 exponiert worden waren, mit PBS-EDTA abgelöst und mit ¹²&sup5;J durch das unten beschriebene Lactoperoxidaseverfahren markiert. Die Zellen wurden mit dem TRITON X-114-Detergens lysiert und Immunpräzipitate mit dem 3A2- oder 7A9-Antikörper hergestellt. Die Immunpräzipitate wurden auf 10 % SDS- Polyacrylamid-reduzierenden Gelen aufgetrennt.
Für die Zelloberflächenjodierung wurden fünf Millionen Endothelialzellen durch Behandlung mit PBS-EDTA abgelöst, zweimal gewaschen und in 200 ul PBS bei 4ºC resuspendiert. In dieses Röhrchen wurden 0,5 mCi ¹²&sup5;J, 50 ul Lactoperoxidase (0,2 mg/ml) und aufeinanderfolgende 20-ul-Zugaben von 30 % H&sub2;O&sub2; in 1-minütigen Abständen zu Verdünnungen von 1/27000, 1/9000, 1/3000 und 1/1000, wie bei Hardy beschrieben (R.R. Hardy, in Handbook of Experimental Immunology, Bd. 1, S. 208, D.M. Weir, Autor, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England). Die Zellen wurden dreimal gewaschen und mit 1 % TRITON X-114-Detergens, enthaltend 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4, 2 mM PMSF und 1 mM Jodacetamid lysiert.
Die Ergebnisse sind in Fig. 29 gezeigt. Fig. 29A zeigt die Ergebnisse für ³&sup5;S-Cystein-pulsmarkierte Zellen, lysiert nach 45 Minuten (die ersten beiden Bahnen), oder geschased für weitere 1 bis 2 Stunden, Bahnen 2 und 3 und Bahnen 4 und 5. Fig. 29B zeigt die Ergebnisse der Zelloberflächenjodierung.
Die Ergebnisse in Fig. 29A zeigen, daß 45 Minuten nach Zugabe von IL-1 ein naszierendes 7A9-(ELAM-1)-Protein auftritt, das immunpräzipitiert werden kann. In ähnlicher Weise wird das Protein mit der gleichen Molekularmasse von 79 kDa mit CMP- 170 copräzipitiert. Wenn die Zellen 2 Stunden gepulst werden und für entweder 1 oder 2 zusätzliche Stunden gechased werden, copräzipitiert der 3A2-Antikörper weiterhin das Material mit der gleichen Molekularmasse, das von 7A9-(ELAM- 1)-Antikörper präzipitiert wurde. Daher ist die CMP-170/ELAM- 1-Assoziation vom frühesten Punkt der ELAM-1-Synthese, bis es seine reife Größe erreicht, nachweisbar. Die Ergebnisse in Fig. 298 zeigen, daß der 3A2-Antikörper auch das 7A9-(ELAM- 1)-Protein von der Zelloberfläche copräzipitiert, obwohl, wie man sehen kann, das 3A2-Antigen selbst nicht sehr gut zu markieren scheint.

(S) KINETIK DER ZELLOBERFLÄCHENEXPRESSION VON CMP-170 UND 7A9- (ELAM-1)-ANTIGENE:

Bis zum Zusammenfluß in Flachboden-Mikrotiterplatten gewachsene Endothelialzellen wurden in 1 ng/ml IL-1 für Zeiträume von 0 bis 48 Stunden exponiert und dann in einem Plattenbindungstest, analog zu dein wie für die Hybridoma- Produktion beschrieben, für die Expression der 7A9- und 3A2- Antigene getestet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 30 gezeigt. In Fig. 30 bedeuten die offenen Kreise das 7A9-Antigen und die offenen Dreiecke das 3A2-Antigen. Wie man aus den Ergebnissen aus Fig. 30 sehen kann, tritt die Expression von beiden Proteinen gleichzeitig auf, und erreicht ihren Höhepunkt bei ca. 2 bis 4 Stunden. Das 7A9-(ELAM-1)-Antigen bleibt jedoch in hohen Spiegeln erhalten, solange IL-1 vorliegt, während das 3A2- Antigen auf einen Grundspiegel nach 48 Stunden abnimmt. Zusätzliche Experimente (nicht dargelegt) zeigen, daß CMP- 170, ähnlich wie ELAM-1, durch Exposition der Endothelialzellen mit TNF und Lipopolysaccharid, aber nicht mit gamma-Interferon induziert wird.

(T) BESTIMMUNG DES EPITOPS VON ELAM-1 AN DAS DIE MONOKLONALEN ANTIKÖRPER 7A9 und 3B7 BINDEN UND PRÄPARATION LÖSLICHER FORMEN VON ELAM-1:

Fig. 31 zeigt verschiedene verkürzte Formen von ELAM-1, die hergestellt wurden, um das Epitop, an das die monoklonalen Antikörper 7A9 und 3B7 binden, zu bestimmen. Die verkürzten ELAM-1-Versionen wurden durch PCR, wie im Abschnitt (C) dieses Beispiels unter Verwendung von PCR-Primer, die ein Stop-Codon enthielten, z. B. entweder TAA oder TAG, am 3'- Ende der deletierten Versionen der ELAM-1-cDNA beschrieben. Die Konstruktion solcher Primer ist im Stand der Technik üblich. Die COOH-Enden wurden derart ausgewählt, daß die verkürzten Versionen des ELAM-1-Moleküls Lectin enthielten (L-ELAM-1), Lectin plus EGF (LE-ELAM-1), Lectin plus EGF plus Teile der Komplement-Regulationsdomänen (LEC-ELAM-1) und Lectin + EGF + die gesamte Komplement-Regulationsdomänen ohne den Transmembran und den cytoplasmatischen Schwanz des ELAM- 1-Moleküls (ELAM-1 Tm&supmin;). L-ELAM-1, LE-ELAM-1, LEC-ELAM-1 und die reife Forin von ELAM-1 wurden in einen Expressionsvektor kloniert, der einen RSV-Promotor enthielt, der das exogen eingeführte Gen (verkürzte Versionen von ELAM-1) und einen anderen dominanten selektierbaren Marker, SV2 DHFR, kontrollierte. Ein solcher Vektor kann nach üblichen Verfahren unter Verwendung von Plasmiden, erhältlich von der ATCC (prsvneo (ATCC Nr. 37198) und pSV2 DHRF (ATCC Nr. 67110)) konstruiert werden. Die Transmembran-deletiere Version von ELAM-1, ELAM-1 Tm wurde in den pCDN-1-Vektor kloniert. Die Plasmide wurden in COS-Zellen durch das DNA- CaPO&sub4;-Copräzipitationsverfahren, beschrieben in Abschnitt (C) dieses Beispiels, eingeführt. 48 Stunden nach DNA- Transfektion wurden Teile der transfektierten Zelle für die Immunpräzipitation verwendet (wie in Abschnitt (C) dieses Beispiels beschrieben) mit ELAM-1-spezifischen Antikörpern, 7A9 und 3B7, wie auch dem Antikörper 3A2. Sowohl die Überstände der transfektierten Zellen als auch die Zeliysate wurden für die Immunpräzipitation nach metabolischer Markierung der Zellen mit ³&sup5;S-Cystein verwendet.
Die Ergebnisse der Immunpräzipitationsuntersuchungen aus den Überständen dieser Zellen sind in Fig. 32 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß ein Fragment (LE-ELAM-1), was 30,7 % des N-Terminus des durch Lectin und EGF-änhliche Domänen definierten Moleküls ausmacht, sowohl mit den 7A9- als auch 3B7-Antikörpern reagiert.

(U) TEST AUF DEN NACHWEIS DER BLOCKIERUNG DER BINDUNG WEISSER BLUTZELLEN AN AKTIVIERTE ENDOTHELIALZELLEN:

Endothelialzellen werden aus verworfenen Nabelschnüren gewonnen und wie in Beispiel 1 kultiviert. Die Zellen vermehren sich rasch und werden verteilt (über Passagen) bis zu sechsmal in andere Kolben, bevor ihre differenzierten Eigenschaften abnehmen. Nach der zweiten Passage sind ausreichend Zellen zur Durchführung von Blockierungstests vorhanden. Rekombinantes IL-1-beta wird bei einer Konzentration von 1 ng/ml zu den Zellen in der Kultur für 4 bis 6 Stunden zugegeben, während die Zellen wie üblich in einer feuchten Inkubationskammer, enthaltend 6 % CO&sub2;, 94 % Luft, gehalten werden. Die Kontrollen bestehen aus der Kultur der Endothelialzellen in Abwesenheit von IL-1. Nach dem Inkubationszeitraum werden die Zellen mit Medium unter Entfernung unverbrauchten IL-1 gespült.
Die mononuklearen Zellen, z. B. Monocyten, Granulocyten oder eine Mischung von mononuklearen Zellen enthalten T-Zellen, B- Zellen und NK-Zellen, werden aus Menschen erhalten und nach bekannten Verfahren isoliert und gereinigt.
Die mononuklearen Zellen werden in Gegenwart von Antigen 1E7/2G7 für die antigenen Fragmente von ELAM-1 für 30 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. Das Antigen wird in einer Menge zugegeben, die ausreichend ist, die Ligandbindungsstellen auf den mononuklearen Zellen zu sättigen.
Die mononuklearen Zellen werde dann in ständiger Gegenwart des Antigens zu den Endothelialzellen für 30 bis 60 Minuten zugegeben, um eine Anhaftung zu ermöglichen. Die nicht- angehafteten Zellen werden durch Spülen mit Wachstumsmedium abgewaschen, und der Unterschied in der Anzahl von gebundenen Zellen zu unbehandelten oder mit IL-1-behandelten Endothelialzellen (EC) wird beobachtet.
Dieser Test wird in einer quantitativen Weise durch Einbau eines radioaktiven Markers, z. B. &sup5;¹Cr, nach im Stand der Technik bekannten Verfahren, in das Cytoplasma der Zellen, deren Bindung untersucht werden soll, gewaschen, unter Entfernung extrazellulärer Counts und Ausbreiten dieser markierten Zellen über der EC-Monoschicht durchgeführt. Die &sup5;¹Cr-Markierung, die für diesen Zweck verwendet wird, sollte eine minimale Leckrate während der 30 bis 60 Minuten des Bindungstests haben. Nach Spülen unter Entfernung der nicht- anhaftenden Zellen, werden die Monoschichten mit Detergens solubilisiert. Die Radioaktivität, die durch Zählung aus jedem Weil ermittelt wird, ist ein Maß für die Anzahl der gebundenen Zellen.

BEISPIEL 5

cDNA-SEQUENZ DES 1E7/2G7-ANTIGENS

Kürzlich wurde ein Adhäsionsmolekül, bezeichnet als VCAM-1, beschrieben (Osborn et al., Cell, 59: 1203-1211, 1989). Vor einem Versuch zur Klonierung des 1E7/2G7-Antigens durch cDNA- Expressionsklonierung, wurde VCAM-1-cDNA kloniert, um zu bestimmen, ob das 1E7/2G7-Antigen mit VCAM-1 verwandt ist oder nicht. VCAM-1-cDNA wurde unter Verwendung von polyA&spplus;-RNA aus IL-1-aktivierten HUVEC durch PCR, wie in Beispiel 4(C) beschrieben, kloniert. Die folgenden PCR-Primer wurden ausgewahlt, um nur die publizierten kodierenden Sequenzen von VCAM-1-cDNA entsprechend einer Größe von ca. 2,0 kb zu amplifizieren:
Primer 1 5'GGGGGGCGGC CGCGCAACTT AAAATGCCTG GGAAGATG3'
Primer 2 5'GGGGGCTCGA GCATTAGCTA CACTTTTGAT TTCTGTGA3'
Anstatt des Erhalts einer kodierenden Sequenz von ca. 2,0 kb wurde eine 2,3-kb-Bande als Hauptprodukt der PCR- Amlplifikation erhalten. die 2,3-kb-Bande wurde in den Expressionsvektor pCDN-1, wie in Beispiel 4(C) beschrieben, kloniert, und es wurden mehrere Klone isoliert. 5 Klone wurden auf 1E7/2G7-Antikörperbindung in einem Transienten- Expressionstest unter Verwendung von COS-Zellen, wie in Beispiel 4(B-2) beschrieben, getestet. Alle 5 Klone zeigten eine starke Bindung an die monoklonalen Antikörper 1E7 und 2G7.
Restriktionsanalyse, durchgeführt unter Verwendung üblicher Methoden, mit diesen Klonen zeigte ein Muster, das verschieden von den erwarteten Banden war, falls die PCR- amplifizierten Klone die gleiche Sequenz wie die der publizierten VCAM-1-Sequenz enthielt. Diese Untersuchungen legen auch ein Insert von beinahe 282 bp ungefähr in der Mitte des publizierten Gens nahe. Ein Klon wurde nach dem Verfahren von Sanger sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977) und dieser zeigte ein Insert von 94 Aminosäuren an der Aminosäureposition 308 im VCAM-1-Molekül (Fig. 33). Daher ist das 1E7/2G7-Antigen verschieden vom publizierten VCAM-1-Molekül. Die cDNA- Sequenz, zusammen mit der entsprechenden Aminosäuresequenz des Moleküls, die für das 1E7/2G7-Antigen kodiert, ist in den Fig. 34A bis 34D gezeigt.
Während die Erfindung in Einzelheiten und unter Bezugnahme auf spezifische Beispiele beschrieben wurde, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Veränderungen und Modifikationen gemachten werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.

HINTERLEGUNGSERKLÄRUNG

Hybridoina 1E7, 2G7, 3A2 und 7A9 wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, unter den Bedingungen des budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentverbreitung am 9. Mai 1989 hinterlegt und haben die ATCC- Hinterlegungsnummern HB 10136, HB 10137, HB 10138 und HB 10135. Hybrodoma 3B7 wurde hinterlegt bei der American Type Culture Collection am 21. März 1990, und hat die ATCC- Hinterlegungsnummer HB-10391. Alle Zugangsbeschränkungen werden unwiderruflich nach Erteilung eines US-Patentes auf die vorliegende Anmeldung fallengelassen.

Claims

1. Monokionaler Antikörper 1E7 oder ein eine Bindungsstelle enthaltendes Fragment davon, worin der monoklonale Antikörper von der Hybridom-Zellinie 1E7 mit der ATCC- Hinterlegungsnummer HB 10136 produziert wird.

2. Monoklonaler Antikörper 2G7 oder ein eine Bindungsstelle enthaltendes Fragment davon, worin der monoklonale Antikörper von der Hybridom-Zellinie 2G7 mit der ATCC- Hinterlegungsnummer HB 10137 produziert wird.

3. Hybridom-Zellinie 1E7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10136.

4. Hybridom-Zellinie 2G7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10137.

5. Medikament zur Behandlung von Entzündungsreaktionen einhergehend mit aktivierten Endothelzellen, wobei das Medikament umfaßt:

(I) eine pharmazeutisch wirksame Menge eines monoklonalen Antikörpers oder eines eine Bindungsstelle enthaltenden Fragmentes davon, worin der monoklonale Antikörper der monoklonale Antikörper 2G7, produziert von Hybridom-Zellinie 2G7 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10137, ist; und

(I) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünner oder Exzipienten.

6. Die Verwendung einer pharinazeutisch wirksamen Menge eines monoklonalen Antikörpers oder eines eine Bindungsstelle enthaltenden Fragmentes davon, worin der monoklonale Antikörper der monoklonale Antikörper 2G7, hergestellt von Hybridom-Zellinie 2G7 mit der ATCC- Hinterlegungsnummer HB 10137, ist, zur Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung von Entzündungsreaktionen, einhergehend mit aktivierten Endothelzellen, geeignet ist.