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Diese
Erfindung betrifft Antikörper
mit CHO-Glykosylierung zur Verwendung bei humaner medizinischer
Therapie und Formulierungen, die solche Antikörper enthalten.
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Antikörper oder
Immunglobuline sind proteinhaltige bifunktionelle Moleküle. Ein
unter verschiedenen Antikörpern
stark variabler Bereich ist für
die Bindung an ein Antigen (Fab-Bereich) verantwortlich, zum Beispiel
die zahlreichen unterschiedlichen infektiösen Agenzien, mit denen der
Körper
in Berührung
kommt, während
der zweite konstante Bereich (oder Fc-Bereich) für die Bindung an die Fc-Rezeptoren
von Zellen und außerdem
die Komplementaktivierung verantwortlich ist. In dieser Hinsicht
stellen Antikörper
eine wesentliche Komponente der Immunantwort von Säugern bei
der Zerstörung
fremder Mikroorganismen und Viren dar.
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Ein
Antikörper-Molekül setzt
sich aus zwei leichten und zwei schweren Ketten zusammen, die durch Disulfidbindungen
zwischen den Ketten zusammengehalten werden. Jede leichte Kette
ist durch Disulfidbindungen an eine schwere Kette gebunden, und
die zwei schweren Ketten sind untereinander durch Disulfidbindungen
verbunden. Jede schwere Kette hat an einem Ende eine variable Domäne, die
von einer Zahl konstanter Domänen
gefolgt ist, und jede leichte Kette hat eine variable Domäne an einem
Ende und eine konstante Domäne
an dem anderen Ende. Die variable Domäne der leichten Kette ist parallel
mit der variablen Domäne der
schweren Kette ausgerichtet. Die konstante Domäne der leichten Kette ist parallel
mit der ersten konstanten Domäne
der schweren Kette ausgerichtet. Die restlichen konstanten Domänen der
schweren Ketten sind aufeinander ausgerichtet. Die konstanten Domänen in den
leichten und schweren Ketten sind nicht direkt an der Bindung des
Antikörper
an das Antigen beteiligt.
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Die
variablen Domänen
jedes Paars von leichten und schweren Ketten bilden die Antigen-Bindungsstelle.
Sie besitzen die gleiche allgemeine Struktur, wobei jede Domäne ein Gerüst aus vier
Bereichen, deren Sequenzen verhältnismäßig gut
erhalten sind, umfaßt,
die durch drei komplementaritätsbestimmende
Bereiche (CDRs) verbunden sind. Die vier Gerüstbereiche nehmen größtenteils
eine Faltblattstruktur an, und die CDRs bilden Schleifen, die die
Faltblattstruktur verbinden und sie in einigen Fällen einen Teil einschließen. Die CDRs
sind in enger Begrenzung durch die Gerüstbereiche zusammengehalten
und tragen mit den CDRs der anderen Domäne zu der Bildung der Antigenbindungsstelle
bei.
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Die
Immunisierung eines Tiers mit einem Antigen führt zu der Herstellung verschiedener
Antikörper mit
verschiedenen Spezifizitäten
und Affinitäten.
Ein von dem immunisierten Tier erhaltenes Antiserum ist daher heterogen
und enthält
einen durch viele verschiedene Lymphozytenklone hergestellten Antikörperpool.
Die so erhaltenen Antikörper
werden als polyklonale Antikörper
bezeichnet, und dieser polyklonale Charakter ist bei der Verwendung
von Antikörper
in diagnostischen Assays und therapeutischen Anwendungen von großem Nachteil.
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1975
gelang eine bahnbrechender Fortschritt, als Kohler und Milstein
(Nature, 1975, 256, 495–497) über die
erfolgreiche Fusion von Milzzellen von Mäusen, die mit einem Antigen
immunisiert wurden, mit Zellen einer Murin-Myelomlinie berichten.
Die resultierenden Hybridzellen, Hybridome genannt, besitzen die
Eigenschaften der Antikörperherstellung
von den Milzzellen und des fortlaufenden Wachstums von den Myelomzellen.
Jedes Hybridom synthetisiert und sondert einen einzelnen Antikörper gegen
eine bestimmte Determinante des Ursprungsantigens ab. Zur Sicherstellung,
daß alle
Zellen in einer Kultur identisch sind, d.h., daß sie die genetische Information
enthalten, die für
die Synthese einer einzelnen Antikörperart erforderlich ist, werden
die von der Zellfusion resultierenden Hybridome kloniert und subkloniert.
Auf diese Weise stellen die klonierten Hybridome homogene oder monoklonale
Antikörper
her.
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Die
Vorteile der Hybridom-Technologie sind bemerkenswert. Da viele Hybride,
die von jeder Milz entstehen, auf ihr Potential, Antikörper gegen
das Antigen von Interesse herzustellen, gescreent werden und nur wenige
ausgewählt
werden, ist es möglich,
mit unreinen Antigenen zu immunisieren und dennoch spezifische Antikörper zu
erhalten. Die Unsterblichkeit der Zellinie stellt sicher, daß ein unbeschränkter Vorrat
eines homogenen, gut charakterisierten Antikörpers für die Verwendung bei einer
Vielzahl von Anwendungen, insbesondere der Diagnose und Immuntheraphie
von pathologischen Erkrankungen erhältlich ist.
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Unglücklicherweise
kann der Nutzen solcher monoklonaler Antikörper in einem klinischen Gesamtbild ernstlich
durch die Entwicklung humaner Anti-Maus-Antikörper – eine Anti-Globulin-Antwort – die mit
der Therapie interferieren oder allergische oder Immunklomplex-vermittelte Überempfindlichkeit
verursachen kann, behindert sein.
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Wenn
zum Beispiel Murin- (oder Ratin-) monoklonale Antikörper in
der Therapie beim Menschen verwendet wird, ist die Induktion einer
menschlichen Anti-Maus-Antikörper-Antwort
auf die murine Herkunft der konstanten Domänen und der vier Gerüstbereiche
zurückzuführen. Dieses
Problem wurde daher bei der Antikörperentwicklung zweier basischer
Typen berücksichtigt.
Bei dem ersten Typ, der als chimärer
Antikörper
bezeichnet wird, sind die murinen konstanten Domänen nur durch äquivalente
Domänen
humaner Herkunft ausgetauscht worden (Morrison et al., P.N.A.S.,
1984, 81, 6851–6855;
Boulianne et al., Nature, 1985, 314, 268–270 und Neuberger et al.,
Nature, 1985, 314, 268–270).
Bei dem zweiten Typ sind die murinen konstanten Domänen und
die murinen Gerüstbereiche
allesamt durch äquivalente
Domänen
und Bereiche humaner Herkunft ausgetauscht worden. Dieser zweite
Antikörper-Typ
wird als humanisierter oder CDR-transplantierter Antikörper bezeichnet
(Jones et al, Nature, 1986, 321, 522–525 und Riechmann et al.,
Nature, 1988, 332, 323–327).
Ein menschlicher Antikörper
umgeht selbstverständlich
die Notwendigkeit der "Humanisierung", jedoch sind Zellen,
die humanen Antikörper
sekretieren, sehr instabil, und es wurde im allgemeinen festgestellt, daß sie für die kommerzielle
Großherstellung
nicht geeignet sind.
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Zur
Herstellung ausreichender Antikörpermengen
für die
uneingeschränkte
klinische Verwendung ist es wünschenswert,
ein wirksames rekombinantes Expressionssystem zu verwenden. Da Myelomzellen
einen natürlichen
Wirt darstellen, der auf die Antikörperherstellung und -Absonderung
spezialisiert ist, sind von diesen abstammende Zellinien zur Expression
rekombinanter Antikörper
verwendet worden. Häufig
ist eine komplexe Vektorkonstruktion, die auf den Regulatorelementen
der Immunglobulin-Gene beruht, erforderlich, und es wurde über End-Expressionsraten
berichtet, die sehr variabel sind (Winter et al., Nature, 1988,
332, 323–327;
Weidle et al., Gene, 1987, 60, 205–216; Nakatani et al., Bio/Technology,
1989, 7, 805–810
und Gillies et al, Bio/Technology, 1989, 7, 799–804).
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Ein
alternatives Säuger-Expressionssystem
ist eines, das durch die Verwendung von Dihydrofulatreduktase (dhfr)
fehlenden CHO-Zellen (chinese hamster ovary) angeboten wird. Die
Verwendung dieser Zellen ermöglicht
die Herstellung großer
Mengen verschiedener therapeutischer Proteine für die Forschung und die klinische
Verwendung (Kaufman et al., Mol. Cell Biol., 1985, 5, 1750–1759 und
Zettlmeissl et al, Bio/Technology, 1987, 5, 720– 725). Es gibt jedoch nur wenige
Anwendungsbereiche dieser Zellen für die Expression von Antikörpern.
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WO89/01783
und Colcher et al. Cancer Research 49, 1738 (1989) beschreiben die
Herstellung einer rekombinanten B72.3-Form, eines Antikrebs-Antikörpers, in
CHO-Zellen. In beiden Literaturangaben wird die erfolgreiche Herstellung
beschrieben und es wird in Tiermodellen gezeigt, daß sich der
resultierende Antikörper
in den Tumoren befindet. Bis jetzt ist jedoch nicht bekannt, ob
in CHO-Zellen hergestellte Antikörper
die Bindung und Funktionalität
beibehalten und falls ja, ob dies für die therapeutische Verwendbarkeit
adequat sein wird.
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Antikörper sind
Glykoproteine, die zwischen 3 und 12% Kohlenhydrate enthalten. Die
Kohlenhydrateinheiten werden nach dem Zusammenführen der leichten und schweren
Ketten auf die Akzeptorstellen der Antikörper-Ketten übertragen.
Die Hauptkohlenhydrateinheiten werden an Aminosäurereste des konstanten Antikörperbereichs
gebunden. Es ist außerdem
bekannt, daß Kohlenhydrate
an die Antigen-Bindungsstellen einiger Antikörper binden und die Antikörper-bindenden
Merkmale durch die Beschränkung
des Antikörperzugangs
an die Antikörper-Bindungsstelle
beeinflussen können.
Kohlenhydrateinheiten spielen eine Vielzahl von Rollen. Sie können die
gesamte Löslichkeit
und die Abbaurate des Antikörpers
beeinflussen. Es ist außerdem bekannt,
daß Kohlenhydrate
für die
zelluläre
Sekretion einiger Antikörperketten
notwendig sind. Es ist gezeigt worden, daß die Glykosylierung des konstanten
Bereiches eine wichtige Rolle bei der Effektorwirkung eines Antikörpers spielt;
ohne diese Glykosylierung in seiner korrekten Konfiguration kann
der Antikörper
zwar an das Antigen binden, aber er kann zum Beispiel nicht an Makrophage,
Helfer- und Suppressor-Zellen
oder Komplement binden, um seine Rolle der Blockierung oder Lyse
der Zelle an die er gebunden ist, durchzuführen.
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Es
ist jetzt festgestellt worden, daß durch CHO-Zellen glykosylierter
Antikörper
die Fähigkeit
der Antigenbindung und Effektorfunktionalität beibehält. Dies wurde in in vitro
Komplement-Lyse-Assays und in vivo bei einem Patienten gezeigt.
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Die
Erfindung stellt daher einen Antikörper mit CHO-Glykosylierung
bereit. Solche Antikörper
können natürlich sein,
wie humane Antikörper,
veränderte
Antikörper,
zum Beispiel Hybridantikörper
oder bispezifische Antikörper,
chimäre
oder CDR-transplantierte Antikörper.
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Die
CHO-Glykosylierung kann bei der Antigen-Bindungsstelle oder anderen
Teilen der variablen Domäne
auftreten. Sie kann alternativ oder zusätzlich bei dem konstanten Bereich
auftreten. Der glykosylierte Antikörper wird durch Expression
der Antikörper-Gene
in einer geeigneten gentechnisch veränderten CHO-Zelle hergestellt,
gefolgt von der Gewinnung und, wenn notwendig, der Reinigung des
Antikörpers
aus dem Zellkulturmedium.
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CHO-glykosylierte
Antikörper
sind in der medizischen Therapie bei der Behandlung zahlreicher
Erkrankungen beim Menschen nützlich,
im allgemeinen als immunsuppressive Substanzen, insbesondere zum Beispiel
bei T-Zell-vermittelten
Erkrankungen, einschließlich
schwerer Gefäßentzündung, rheumatoider
Arthritis, systemischer Lupis, außerdem bei Autoimmunerkrankungen,
wie Multiple Sklerose, Transplantat-Wirt-Reaktion, Psoriasis, Insulin-abhängige Diabetes,
Sjogrens-Krankheit, Schilddrüsen-Erkrankung, Erb-Goldflam-Syndrom,
Transplantatabstoßung
und Asthma. Diese Antikörper
sind außerdem
bei der Behandlung von Krebs, wie Non-Hodgkin-Lymphom, multiples
Myelom, und infektiösen
Krankheiten, wie HIV und Herpes, verwendet.
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Die
Erfindung stellt folglich die Verwendung von CHO-glykosylierten
Antikörpern
bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung jeder der
zuvor genannten Erkrankungen bereit. Außerdem wird ein Verfahren zur
Behandlung von Menschen, die an einer dieser Krankheiten leiden,
bereitgestellt, das die Verabreichung an den besagten Patienten
eine therapeutisch wirksamen Menge des CHO-glykosylierten Antikörpers umfaßt.
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Die
Dosierung solcher Antikörper
hängt von
dem zu behandelnden Zustand und dem Empfänger der Behandlung ab, befindet
sich aber in dem Bereich von 1 bis ungefähr 100 mg bei einem Erwachsenen,
bevorzugt 1 bis 10 mg, wobei sie täglich für einen Zeitraum zwischen 1
und 30 Tagen verabreicht werden. Eine zweiteilige Dosierungstherapie
kann bevorzugt sein, wobei 1–5
mg für
5–10 Tage,
gefolgt von 6–15
mg für
weitere 5–10
Tage verabreicht werden.
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Die
Erfindung umfaßt
außerdem
Formulierungen, die den CHO-glykosylierten Antikörper enthalten. Solche Formulierungen
umfassen zusätzlich
zu dem Antikörper
bevorzugt ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel oder einen Träger, womöglich in
Mischung mit anderen Substanzen, wie anderen Antikörpern oder
einem Antibiotikum. Geeignete Träger
schließen
physiologische Kochsalzlösung,
phosphatgepufferte Kochsalzlösung,
phosphatgepufferte Kochsalz-Glucoselösung und gepufferte Kochsalzlösung ein,
sind aber nicht darauf beschränkt.
Alternativ kann der Antikörper
lyophilisiert (gefriergetrocknet) sein und vor der Verwendung durch
die Zugabe einer oben beschriebenen wässrigen gepufferten Lösung rekonstituiert
werden. Die Verabreichungswege sind routinemäßig parenterale, einschließlich intravenöse, intramuskuläre, subkutane
und intraperitoneale Injektion oder Zufuhr.
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Es
wurde ein Verfahren entwickelt, das die ausgeglichene Expression
der leichten und schweren Ketten eines Antikörpers von CHO-Zellen ermöglicht.
Die ausgeglichene Expression ist wünschenswert, da die leichten
und schweren Ketten miteinander in dem Antikörpermolekül in äquimolaren Anteilen verbunden
sind. Dieses Verfahren ermöglicht
es, daß der
Antikörper
in funktioneller Form erhalten und in hohen Ausbeuten abgesondert
wird. Folglich ermöglicht
das Verfahren den Erhalt von ausreichenden funktionellen Antikörpermengen
zur Verwendung bei der Immuntherapie pathologischer Erkrankungen.
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Eine
CHO-Zellinie, wie sie hier beschrieben ist, kann alle Antikörperarten
herstellen, die im allgemeinen äquimolare
Anteile leichter und schwerer Ketten umfassen. Die Erfindung schließt daher
humane Antikörper
ein, worin die Aminosäuresequenzen
der schweren und leichten Ketten mit solchen Antikörpersequenzen, die
in vivo oder in vitro durch Hybridome von humanen Lymphozyten hergestellt
werden, homolog sind. Außerdem
sind erfindungsgemäß veränderte Antikörper umfaßt, wie
Hybridantikörper,
bei denen die schweren und leichten Ketten mit einem natürlichen
Antikörper
homolog sind, aber die auf eine Weise verbunden sind, die in der
Natur nicht auftreten würde.
Zum Beispiel hat ein bispezifischer Antikörper Antigenbindungsstellen,
die für mehr
als ein Antigen spezifisch sind. Der konstante Bereich des Antikörpers kann
sich auf den einen oder anderen Bindungsbereich beziehen oder kann
von einem anderen Antikörper
stammen. Veränderte
Antikörper, wie
chimäre
Antikörper,
haben variable Bereiche von einem Antikörper und konstante Bereiche
von einem anderen. Folglich können
chimäre
Antikörper
Art/Art-chimäre
oder Klasse/Klasse-chimäre
Antikörper
sein. Solche chimären
Antikörper
können
eine oder mehrere weitere Modifikationen enthalten, um die Fähigkeit
der Antigenbindung zu verbessern oder die Effektorwirkung zu verändern. Eine
andere veränderte
Antikörperform
ist ein humanisierter oder CDR-transplantierter Antikörper, einschließlich eines
zusammengesetzten Antikörpers, worin
Teile der hypervariablen Bereiche zusätzlich zu den CDRs auf das
humane Gerüst übertragen
werden. Zusätzliche
Aminosäuren
in dem Gerüst
oder den konstanten Bereichen solcher Antikörper können verändert werden. Folglich ist
erfindungsgemäß jeder
veränderte
Antikörper
umfaßt,
dessen Aminosäuresequenz
keine in der Natur vorkommende ist.
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Eine
CHO-Zellinie, wie sie hier beschrieben ist, kann zur Herstellung
veränderter
Antikörper,
am meisten bevorzugt chimärer
Antikörper
oder CDR-transplantierter
Antikörper,
verwendet werden. Bestimmte Beispiele umfassen Antikörper gegen
T-Zellmarker, wie CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19,
CD25, CD45 und CDw52 und insbesondere CDR-transplantierte Antikörper gegen
das CDw52-Antigen, wie Campath-1H (Campath ist eine Marke der Wellcome
Foundation Ltd.), der in
EP 328
402 beschrieben ist. Weitere Beispiele schließen CDR-transplantierte
Antikörper
gegen verschiedene Markerantigene von Krebszellen, wie CD33 und
CD38, ein.
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Nach
der Cotransfektion in die Empfänger-CHO-Zellen
können
die resultierenden Kolonien unter Verwendung beider Marker ausgewählt werden.
Kolonien, die den doppelten Phenotyp entfalten, können im
allgemeinen sowohl die leichten als auch die schweren Ketten coexprimieren.
Die ausgewählten
Marker können oder
können
nicht dominanter Art sein. Beispiele von Selektionsmarkern zur Verwendung
bei der Cotransfektion umfassen Adenosindeaminase (Kaufman et al.,
P.N.A.S., 1989, 83, 3136–40),
Aparaginsynthetase (Cartier et al., Mol. Cell Biol., 1987, 7, 1623–28), E.
coli trpB-Gen und Salmonella hisD-Gen (Hartman et al., P.N.A.S.,
1988, 85, 8407–51),
M2 Mausribonucleotidreduktase (Thelander et al., EMBO J., 1989,
8, 2475–79), humanes
Multimedikament-Resitanz-Gen (Kane et al., Gene, 1989, 84, 439–446), Glutaminsynthetase
(Bebbington et al, DNA Cloning, Vol. III, 1987, Hrsg. D. M. Glover,
163–188,
IRL Press), Xanthinguaninphosphoribosyl-Transferase (gpt) (Mulligan et al.,
Science, 1980, 209, 1422–27),
Hygromycin B (Santerre et al., Gene, 1984, 30, 147–156), Neomycin-Gen
(Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 1982, 1, 327–341) und
Dihydrofolatreduktase (Subramani et al., Mol. Cell Biol., 1981,
1, 854–864).
Ein besonders bevorzugter Selektionsmarker ist dhfr, der gewöhnlich mit
einer parenteralen CHO-Zellinie des dhfr–-Phenotyps
verwendet wird (Urlaub et al, P.N.A.S., 1980, 77, 4216–4220).
Erfolgreich cotransfizierte CHO-Zellen besitzen den dhfr+-Phenotyp und können leicht durch Kultivierung
der Kolonien auf einem Thymidin- und Hypoxanthin-freiem Medium,
das wahlweise Methotrexat (MTX) enthält, selektiert werden. Ein
bevorzugter Selektionsmarker zur Verwendung mit den anderen Vektoren
ist ein dominanter Resistenzmarke r, wie Neomycin (neo). Die mit
diesem Marker erfolgreich transfizierten CHO-Zellen können durch
Kultivierung der Kolonien auf Medien, die Antibiotikum und G-418, auch
als "Geneticin" bekannt, enthalten
selektiert werden.
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Ein
zweites Selektions- und Amplifikationssystem (das GS-System) wird
durch den Glutaminsynthetase-Selektionsmarker, der in WO87/04462
beschrieben ist, bereitgestellt. Die CHO-Zellen, die erfolgreich
mit dem das GS-Enzym
codierenden Gen und dem gewünschten
Antikörpergen
transfiziert sind, können
durch Kultivieren der Kolonien auf Glutamin-freiem Medien selektiert
werden, wie in der veröffentlichten
PCT-Anmeldung Nr. WO87/04462 beschrieben.
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Mindestens
ein Selektionsmarker liefert außerdem
bevorzugt die Basis, auf der die die leichten und schweren Ketten
codierenden Gene amplifiziert werden können. Bei der Cotransfektion
einer CHO-Zellinie werden die Vektor-DNA häufig in das Chromosom der Zelle
an dem gleichen Locus integriert. Folglich führt die Verwendung von nur
einem Selektionsmarker als Basis für die Amplifikation normalerweise
zu einer parallelen Erhöhung
der Zahl der Kopien beider Gene. Ein besonderer Selektionsmarker,
der hierfür
verwendet werden kann, ist dhfr, der die gewünschte zu erhaltende Amplifikation
durch die Verwendung zunehmender MTX-Konzentrationen ermöglicht.
Ein zweiter bevorzugter Selektionsmarker ist GS, der die Amplfikation
durch die Zugabe von Methioninsulfoximin (MSX) ermöglicht.
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Die
Selektionsmarker sind zur Sicherstellung der Expression selbstverständlich unter
der Kontrolle von DNA-Regulationselementen. Wenn dhfr als Selektionsmarker
verwendet wird, stammen die Regulationselemente bevorzugt von einer
viralen Quelle, wie DNA-Tumorviren. Besonders bevorzugt ist die
Verwendung eines SV40- oder späten
Hauptadenovirus-Promotors. Es ist in dieser Hinsicht von besonderem
Vorteil, das Enhancerelement von dem Promotor zu entfernen, um ihn
wirksam zu "verkrüppeln". Diese Modifikation
ermöglicht
erhöhte
Genamplifikationraten bei jeder Methotrexatkonzentration, um zu
selektieren, die ansonsten bei der Verwendung eines starken Promotors
auftreten. Wenn neo als Selektionsmarker verwendet wird, ist zum
Beispiel ein geeigneter Promotor der Metallothionein-Promotor aus
der Maus.
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Die
Gene für
die leichten und schweren Ketten können sich aus Genom-DNA oder bevorzugt
aus cDNA zusammensetzen und werden unter Verwendung der im Stand
der Technik bekannten Verfahren kloniert (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2. Auflage, Maniatis et al., Cold Spring Harbor). Die Gene
sind außerdem
unter der Kontrolle von DNA-Regulationselementen, um deren Expression
sicherzustellen. Die Verwendung der gleichen Regulationselemente
für beide
Ketten ist bevorzugt, so daß ihre
Expression im wesentlichen ausgeglichen ist. Die Regulationselemente
können
viraler Herkunft sein, und Beispiele umfassen solche, die in Verbindung
mit der dhfr-Expression als Selektionsmarker oben erwähnt wurden.
Ein anderes Beispiel ist die Verwendung des β-Actin-Promotors und dem zugehörigen β-Actin-Polyadenylierungssignal.
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Einer
oder beide Vektoren können
außerdem
einen SV-40 Replikations-Startpunkt
enthalten, um die Untersuchung der Vektorkonstrukte durch das schnelle
transiente Assay zu erlauben.
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Die
Konstruktion der Expressionsvektoren kann gemäß der im Stand der Technik
bekannten Verfahren durchgeführt
werden (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Maniatis
et al., Cold Spring Harbor).
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Die
Cotransfektion der CHO-Zellinie mit den Expressionsvektoren kann
leicht unter Verwendung von äquimolaren
Mengen beider Vektoren und Standardtransfektionsverfahren, wie der
Calciumphosphatausfällung
oder mit Lipofectin, durchgeführt
werden. Die Selektion der gewünschten
cotransfizierten Zellinie kann gemäß der Standardverfahren, die
für die
bestimmten Selektionsmarker bekannt sind, durchgeführt werden.
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Die
Kultur der Zellinie kann in Serum-enthaltendem oder bevorzugt Serum-
und Protein-freiem Medium durchgeführt werden. In einem bevorzugten
Beispiel, in dem die Zellinie ein dhfr+-Transformant
ist; fehlt dem Medium bevorzugt Hypoxanthin und/oder Thymidin und
wahlweise enthält
es MTX. Wenn ein Selektionsmarker Glutaminsynthetase ist, fehlt
dem Medium bevorzugt Glutamin und es enthält wahlweise MSX. Die Expression
beider Ketten zu im wesentlichen äquimolaren Anteilen ermöglicht optimale
Ausbeuten des zu erhaltenden funktionellen Antikörpers. Die beiden Ketten setzen
sich in der Zelle zusammen und werden anschließend in das Kulturmedium als
funktioneller Antikörper
abgesondert. Die resultierenden Antikörper können gereinigt und gemäß Standardverfahren
formuliert werden.
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Die
beiliegenden Abbildungen zeigen:
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1(a) Das Konstrukt pLD9, enthaltend die
Expressionskassetten für
den "verkrüppelten" dhfr-Selektions/Amplifikationsmarker
und die cDNA für
die leichte Kette von Campath-1H. Der kleine Kasten mit dem unterbrochenen
Pfeil ist der geschwächte
SV40-Promotor; der größere Kasten
mit einem Pfeil ist der β-Actin-Promotor;
Poly-A betrifft Polyadenylierungs- und Terminationssignale der jeweiligen
Quellen; der kleine Kasten mit ori enthält den SV40-Replikationsstart.
- (b) Das Konstrukt pNH316, enthaltend die Expressionskassetten
für den
Neomycin-Selektionsmarker und die cDNA für die schwere Kette von Campath-1H. Der Kasten mit
dem Pfeil und MT betrifft den Metallothionein-Promotor aus der Maus.
Die angezeigten Restriktionsschnittstellen sind:
- – H,
HindIII; Bg, BglII; B, BamHI; R1, EcoR1.
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2 Vergleichende Bestimmungen der Rate
der Campath-1H-Synthese in konfluenten A39-Zellen über vier
aufeinanderfolgende Tage. Nach der [35S]-Methionin-Pulsperiode
wurden gleiche Aliquote von Zellen (C) und Kulturmedium (M) immunausgefällt und
durch SDS-PAGE getrennt. Die Position der leichten und schweren
Ketten von Campath-1H ist angezeigt (H und L Pfeile). Bei der Zellprobe
vom dritten Tag ging etwas Material verloren.
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3 Ein Puls-Chase-Experiment zur Bestimmung
der Sekretionsrate und der Verteilung von radioaktiv markiertem
Campath-1H in A39-Zellen. Konfluente Zellen wurden 6 Stunden mit
[35S]-Methionin pulsiert. Dann wurde frisches
Medium, enthaltend einen nicht-markierten Methioninüberschuß, zugegeben.
Gleiche Aliquote von Zellen und Kulturmedium wurden zu den angegebenen
Zeitpunkten entnommen (in Stunden nach dem Ende der Pulsperiode)
und, wie in der Legende zu 2 beschrieben,
behandelt. Die Proben der mittleren Zeitpunkte von 48 und 72 Stunden
wurden auf einem unterschiedlichen Gel laufen gelassen, als die
der Zeitpunkte von 6 und 24 Stunden, und die Bahnen wurden nur im
Verhältnis
zu der Position der schweren (H) Kette aneinandergelegt.
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4 zeigt das Wachstum von C1H 3D11* 44
in WCM5 (proteinfreiem Medium) in einem 1 Liter Fermentor, gemessen
als Zellzahl/ml über
90 Tage.
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5 zeigt die Antikörper-Herstellung von C1H 3D*
44 in WCM5 (proteinfreiem Medium) in einem 1 Liter Fermentor, gemessen
in Mikrogramm Antikörper/ml über 80 Tage.
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Die
folgenden Beispiele dienen ausschließlich zur Darstellung der Erfindung.
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Beispiel 1: Klonierung
der cDNA für
die schwere und leichte Kette von Campath-1H
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Die
komplementaritätsbestimmenden
Bereiche der monoklonalen Ratten Campath-1G wurden ursprünglich direkt
in die humanen Schwer- und Leichtketten-Genomgerüste transplantiert (Winter
et al., Nature, 1988, 332, 323–327.
Diese Konstrukte wurden zur Expression in der Myelom-Zellinie YO
konstruiert und führen
zu Campath-1H Ausbeuten von bis zu 5 μg/ml nach 10 bis 14 Tagen in
Kultur (Hale et al., Tissue Antigens, 1990, 35, 118–127 und
Winter et al., Nature, 1988, 332, 323–327). Die Myelom-Zellinie
TF57 (Hale et al., ibid.) wurde verwendet, um cDNA-Fraktionen nach
Größen von
jeweils 0,9–1,2
kb und 1,4–1,7
kb der Leicht- und Schwerketten-cDNA herzustellen. Diese wurden
zur Herstellung von EcoR1 gekoppelten cDNA-Bibliotheken in λgt10 verwendet.
Alle Verfahren sind von Huynh et al. (DNA Cloning: Bd. I: A practical
Approach, 1984, Glover D. (Herausgeber), IRL Press, Oxford) beschrieben.
Die Bibliotheken wurden unter Verwendung von [32P]-nicktranslatierten
Sonden, die für
variable Bereiche spezifisch sind, gescreent, um cDNA-Klone mit
vollständiger
Länge zu
isolieren. Bei der cDNA für
die leichte Kette wurde der nicht-translatierte 5'-Leader unter Verwendung
von Bal-31 Exonuclease bis zur Position -32 entfernt und ein HindIII-Linker
zugegeben. Am 3'-Ende
wurde von einer einzelnen SacI-Stelle 47bp stromaufwärts des
Stop-Codons Gebrauch gemacht. Ein SacI-HindIII Oligonucleotidpaar
wurde verwendet, um diese Sequenz herzustellen und die HindIII-Stelle
sofort nach dem Stop-Codon einzuführen. Bei dem 5'-Ende der Schwerketten-cDNA
wurde unter Verwendung eines HindIII-NcoI-Oligonucleotidpaares die einzige NcoI-Stelle,
die das ATG-Startcodon überlappt,
verwendet, um einen 29 by nicht-translatierten Leader wiederherzustellen,
der identisch mit dem der leichten Kette ist. Am 3'-Ende wurde die einzige
NaeI-Stelle unter Verwendung von Linkern 12 by stromabwärts des
Stop-Codons in eine HindIII-Stelle umgewandelt.
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Beispiel 2: Herstellung
von Vektoren
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Der
humane β-Actin-Promotor
wurde aus pHβAPr-3-neo
(das pHβAPr-1-neo
entspricht (Gunning et al., P.N.A.S., 1987, 84, 483–35), außer daß das SV40
Polyadenylierungs/Terminationssignal mit den jeweiligen humanen β-Actin-Signalen ausgetauscht
wurde) als ein 2860 by PvuII-HindIII-Fragment ausgeschnitten, bei dem
die PvuII-Stelle anschließend
unter Verwendung von Linkern in eine BglII-Stelle umgewandelt wurde.
Zur Isolierung der humanen β-Actin-Polyadenylierungs/Terminationssignale
von pHβAPr-3-neo
wurde eine SphI-Stelle 1,4 kb stromabwärts der einzigen HindIII-Stelle
unter Verwendung von Linkern in eine BamHI-Stelle umgewandelt. Der
basale dhfr-Vektor,
p104 genannt, wurde wie folgt hergestellt. Die SphI-Stelle an der
Position –128
in dem SV40-Promotor in pSV2dhfr (Subramani et al., Mol. Cell Biol.,
1981, 1, 854–864)
wurde in eine SalI-Stelle umgewandelt, um alle Enhancerelemente
von dem Promotor zu entfernen. Die geschwächte dhfr-Expressionseinheit wurde als ein SalI-BamHI-Fragment
in die homologen Stellen in pSVOd subkloniert (Mellon et al., Cell,
1981, 27, 279–288).
-
Zur
Herstellung von pLD9 wurde der Vektor p104 mit BamHI verdaut, phosphatisiert
und mit drei anderen Fragmenten, bestehend aus dem BglII-HindIII β-Actin-Promotor,
der HindIII Campath-1H Leichtketten-cDNA und den HindIII-BamHI-β-Actin-PolyA/Terminationssignalen,
ligiert. Zur Herstellung von pNH316 wurde das pdBPV-Konstrukt MMTneo
(Law et al., Mol. Cell Biol., 1983, 3, 2110–2115) mit BamHI verdaut, phosphatisiert
und das Fragment, enthaltend das Neomycin-Gen, wurde isoliert, gefolgt
von der Trennung auf einem Agarosegel. Dieses wurde an die beiden β-Actin-Fragmente
und die Campath-1H Schwerketten-cDNA ligiert. Die Konstrukte pLD9
und pNH316 sind in 1 dargestellt.
-
Beispiel 3: Expression
von Campath-1H in CHO-Zellen
-
Die
dhfr–-CHO-Zellinie
DUK-B11 (Urlaub et al, P.N.A.S., 1980, 77, 4216–4220) wurde in mit 10%igem fetalem
Rinderserum und sowohl 4 μg/ml
Hypoxanthin als auch Tymidin ergänztem
Iscoves MEM wachsen gelassen. 10 μg
pLD9 und pNH316 wurden unter Verwendung des Calciumphosphat-Verfahrens
auf diesen Zellen ausgefällt
(Gorman et al., DNA Cloning, 1985, Bd. II, 143–190, Academic Press, N. Y.)
und auf den doppelten Phenotyp von dhfr+/Neoresistenz
selektiert unter Verwendung des obigen Mediums, außer daß 10% dialysiertes
Serum und kein Hypoxanthin/Thymidin verwendet wurden und G418 (Gibco)
bei 500 μg/ml
zugefügt wurde.
In einigen Experimenten wurde MTX direkt in der ersten Selektionsrunde
auf dhfr+-Transformanten miteinbezogen.
Mehrere hunderte resistente Kolonien wurden zusammengeführt und
auf die Herstellung von Campath-1H Antikörper in dem Kulturmedium untersucht.
Die durchschnittlichen Ausbeuten nicht amplifizierter Transformanten
der ersten Runde betrug 0,5 μg/ml.
-
Jede
zusammengeführte
Zellpopulation wurde anschließend
in der Gegenwart von 10–7 M MTX kultiviert,
und nach 2 Wochen wurden die resistenten Kolonien wieder zusammengeführt und
auf Campath-1H Herstellung titriert. Die Ausbeute erhöhte sich
beträchtlich
auf bis zu 80-fach (Tabelle 1). Diese Zellen wurden kloniert (dilution
cloned), auf Campath-1H
Ausbeute gescreent, und die zwei höchsten Herstellerlinien, die
A37 und 3D9 genannt wurden, wurden isoliert (Tabelle 1). Beide wurden
in Gegenwart von 10–6 M MTX weiter amplifiziert
und anschließend
kloniert (dilution cloned) und wie oben gescreent. Die Steigerung
der Expression bei diesem zweiten und letzten Amplifikationsschritt
war nicht so dramatisch, wie zuvor beobachtet; trotzdem konnten
die Zellinien A39 und 3D11 bis zu 200 μg/ml Campath-1H herstellen,
wenn sie bei Konfluenz wieder gefüttert und vier weitere Tage
stehen gelassen wurden.
-
Tabelle
1: Expressionsraten von Campath-1H unter Verwendung der schrittweisen
Amplifikation
-
Legende zur Tabelle
-
Die
Zellen wurden in einem T-175 Gewebekulturkolben bis zur Konfluenz
kultiviert und anschließend mit
50 ml frischem Gewebekulturmedium gefüttert und weitere 4 Tage stehen
gelassen. Der Campath-1H Antikörper,
der sich während
dieses Zeitraumes in dem Medium anhäufte, wurde durch ELISA gemessen.
Die gesamten Zellzählungen
an dem Tag des Assays betrugen 2,5 × 107.
Die Ausbeute der 3D11-Zellinie reflektiert eine Produktivität 100 μg/106 Zellen/Tag.
-
Die
Cotransfektionsvektoren pLD9 und pNH316 wurden weiter verwendet,
um eine alternative Amplifikationsstrategie zu der oben beschriebenen
zu untersuchen. Die dhfr–-CHO-Zellen wurden wie
gewöhnlich cotransfiziert
und zwei Tage später
direkt in einer Reihe von Kolben, enthaltend G418 (zur Neomycinselektion) und
zunehmende MTX-Konzentrationen im Bereich von 3 × 10–9 M
bis 10–7 M,
aufgeteilt. Nach zwei Wochen dieser Selektion wurde die Zahl der
resistenten Kolonien gezählt
und von jedem Kolben zusammengeführt. Nach
der Stabilisierung der Zellpopulationen wurden sie auf Campath-1H
Antikörper-Titer
untersucht, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Mit Erhöhen der
MTX-Gehaltes ergab sich eine bedeutende Verringerung der Zahl der überlebenden
dhfr+-Kolonien, aber sie exprimierten verhältnismäßig mehr
Campath-1H. Folglich ist es bei hohen MTX-Konzentrationen in einer
direkten ein-Schrittselektion möglich,
Zellpopulationen zu isolieren, die eine bis zu 60-fache Erhöhung der
Antikörper-Ausbeute
im Vergleich zu Zellpopulationen, die auf Basal-dhfr-Werte selektiert
wurden, herzustellen.
-
Tabelle
2: Expressionsraten von Campath-1H unter Verwendung der direkten
Selektion
-
Legende zur Tabelle
-
Die
Kolonien in jeder MTX-Selektionsstufe wurden zusammengeführt und,
wie in der Legende zur Tabelle 1 beschrieben, untersucht.
-
Dieses
Selektionsverfahren wurde nach einer weiteren Cotransfektion von
Zellen wiederholt, und in diesem Fall wurde die gesamte Population
in einem Medium, enthaltend G418 und 3 × 10–8 M
MTX, selektiert. Dies führte
zu einem großen
Pool resistenter Kolonien, die daraufhin zusammengeführt und
noch zweimal unter Verwendung von MTX-Konzentrationen von 6 × 10–7 M
und dann 3 × 10–6 M
amplifiziert wurden. In dieser Stufe wurden die Zellen kloniert
(dilution cloned) und auf Campath-1H Gehalte gescreent. Die zwei
isolierten Hersteller-Zellinien, die am meisten herstellten, konnten
Antikörpergehalte
bis zu 100~150 μg/ml
herstellen und wurden als Linien 4F11 und 5E10 bezeichnet.
-
Die
Wachstumsraten dieser Zellinien und der oben beschriebenen A39/3D11-Linie
waren erheblich langsamer als die der parenteralen nicht-transformierten dhfr–-CHO-Zellen.
Ein gewöhnliches
Merkmal dieser Zellen ist, daß sie – sobald
sie gentechnisch verändert
wurden – hohe
Mengen eines Produktgens exprimieren. Die Ausbeuten der 5E10 und
4F11 Zellinien erwiesen sich über
den Zeitraum als ziemlich variabel und die letztere schien vor dem
Eintritt der Krise und des Todes nur ein beschränktes Passagenleben von ungefähr 3 Wochen
zu haben. Die Instabilität
war in all den anderen Zellinien nicht offensichtlich, obwohl im
allgemeinen die von dem zweiten Amplifikationsverfahren isolierten
Linien, einschließlich
5E10, gewöhnlich
in Kultur unbeständiger
waren. Von all den Linien ergab 3D11 zufriedenstellenden Wachstum
und Stabilität
mit hohen Campath-1H Ausbeuten. Zur Sicherstellung der Weitervererbung
dieser Merkmale wurde die 3D11 Zellinie nochmals unter Erhalt der
3D11* Linie kloniert (dilution cloned), und diese stellte Campath-1H
auch in Ausbeuten von bis zu 200 μg/ml
her.
-
Beispiel 4: Wachstum und
Herstellung von C1H 3D11* 44 in WCM4
-
- a) C1H 3D11* Zellen, die als Monoschicht in
Iscoves Medium, enthaltend 10% FBS Flow, nicht-essentielle Aminosäuren, 10–6 M
Methotrexat und Antibiotika, wachsen gelassen wurden, waren ungefähr 90% konfluent.
Diese Zellen wurden mit Trypsin/Versen von der Plastik entfernt,
in Iscoves Medium ohne Ergänzungsmittel
gewaschen, zentrifugiert und bei 5 × 104/ml
in WCM4 Medium (Tabelle 3) + 0,25% Pepton + 0,1% Polyethylenglycol
(PEG) 10000 + 0,5% fetalem Rinderserum (FDS) ohne Methotrexat (MTX)
suspendiert.
-
Tabelle 3: Formulierung
des Mediums WCM4
-
Iscoves
DMEM-Modifizierung ohne BSA, Transferrin und Lecithin. Erhältlich von
GIBCO Ltd., Unit 4, Cowley Mill Td. Est., Uxbridge UB8 27G. Ähnlich wie
das veröffentlichte
Medium (Iscoves and Melcher, 1978, J. Exp. Med. 1, 47, 923) ohne
Rinderserumalbumin, reinem humanen Transferrin oder Sojabohnenlecithin.
| + 5
ml/Liter | 200
mM L Glutamin |
| + 50
mg/Liter | L
Prolin |
| + 50
mg/Liter | L
Threonin |
| + 50
mg/Liter | L
Methionin |
| + 50
mg/Liter | L
Cystein |
| + 50
mg/Liter | L
Tyrosin |
| + 25
mg/Liter | Ascorbinsäure |
| + 0,062
mg/Liter | Vitamin
B6 |
| + 1,36
mg/Liter | Vitamin
B12 |
| + 0,2
mg/Liter | Liponsäure |
| + 0,088
mg/Liter | Methyllinoleat |
| + 1 μM | Methotrexat |
| + 1
mg/Liter | FeSO4 |
| + 1
mg/Liter | ZnSO4 |
| + 0,0025
mg/Liter | CuSO4 |
| + 5
mg/Liter | rekombinantes
Insulin (Nucellin) |
| + 50000
Iu/Liter | Polymyxin |
| + 20000
Iu/Liter | Neomycin |
| + 0,16
mg/Liter | Putrescin-2
HCL |
-
Zu
drei 25 cm2-Kolben wurden 10 ml Zellsuspension,
Hypoxanthin (H), Thymidin (T) oder HT gegeben. Diese Kolben wurden
bei 36,5°C
in einem 5% CO2-Inkubator inkubiert.
-
Nach
6 Tagen wurden die Kolben zusammengeführt und zu einem gleichen Volumen
aus WCM4 + MTX ohne Pepton oder PEG gegeben und in einen 75 cm 2-Kolben überführt.
-
Die
Zellen wurden verwendet, um in einer 500 ml-Techner-Rollerflasche
eine Kultur anzusetzen, die bei 36,5°C inkubiert wurde und sich bei
40 Upm drehte. Die Zellen wurden frei von Serum für einen
Zeitraum von über
5 Monaten weiter wachsen gelassen, und, obwohl festgestellt wurde,
daß die
Zellen einen Anpassungszeitraum benötigten, verbesserte sich die
Wachstumsrate und Lebensfähigkeit
stetig. Die Populationsverdoppelungszeit berechnete sich auf 73,1
Tage über
ungefähr
7 Wochen; sie verringerte sich auf 47,4 Stunden über die folgenden 20 Tage und
stabilisierte sich dann. Die Antikörpersekretion blieb hoch, bei
Gehalten von über
60 μg/ml.
Es wurde gemäß der Bandenintensität unter
Verwendung der Northern-Blotanalyse festgestellt, daß sich die
Zahl der Genkopien in diesen Zellen nicht verringerte.
-
In
Fermentatoren stellten die Zellen über 70 μg/ml Antikörper her und erreichten regelmäßig Gehalte von
100 μg/ml
oder mehr. Diese Zellen wurden C1H 3D11* 44 genannt.
- b) Die Zellen von obigem a), die serumfrei über zwei Monate wachsen gelassen
wurden, wurden in einen SGi l Liter-Fermentor mit einem gebogenen
Paddel aus Edelstahl, das sich bei 70 Upm drehte, übertragen. Die
Temperatur wurde auf 37°C,
d02 bei 10% und der pH auf 7 bis 7,2 eingestellt.
Eine Kultur wurde in dem Fermentor an dem Tag 0 mit 0,22 × 106 Zellen/ml
in WCM4 (Tabelle 3) mit 0,1% Polyethylenglycol (PEG) 10000 und 0,25%
Sojapepton angesetzt und mit O2-Gas oben
versorgt. Die Zellen wurden regelmäßig unter Verwendung von frischem
Medium und einer Trennrate gewöhnlich
zwischen 1 bis 2 und 1 bis 4 Passagen unterworfen.
-
Am
Tag 33 wurde die obere Sauerstoffzufuhr durch tiefes Anschwänzen ausgetauscht,
was eine stärkere
physikalische Störung
der Zellen verursacht.
-
Vom
Tag 50 wurde WCM5 (Tabelle 4) zusammen mit Pepton und PEG anstelle
von WCM5 verwendet.
-
Tabelle 4: Formulierung
von Medium WCM5
-
Iscoves
DMEM-Modifizierung ohne BSA, Transferrin oder Lecithin (siehe Tabelle
3).
| + 5
ml/Liter | 200
mM L Glutamin |
| + 50
mg/Liter | L
Prolin |
| + 50
mg/Liter | L
Threonin |
| + 50
mg/Liter | L
Methionin |
| + 50
mg/Liter | L
Cystein |
| + 50
mg/Liter | L
Tyrosin |
| + 25
mg/Liter | Ascorbinsäure |
| + 0,062
mg/Liter | Vitamin
B6 |
| + 1,36
mg/Liter | Vitamin
B12 |
| + 2
mg/Liter | Ferricitrat |
| + 1
mg/Liter | Zinksulfat |
| + 0,0025
mg/Liter | Kupfersulfat |
| + 50000
IE/Liter | Polymyxin |
| + 20000
IE/Liter | Neomycin |
| + 3 μl/Liter | Ethanolamin |
| + 0,16
mg/Liter | Putrescin |
| + 5
mg/Liter | rekombinantes
Insulin (Nucellin) |
-
Am
Tag 53 wurde PEG mit 0,1% pluronem F68 ausgetauscht. Das resultierende
Wachstum und die erhaltenen Antikörpergehalte sind in den beigefügten graphischen
Darstellungen gezeigt (4 und 5) und zeigen die Kapazität der Erfindung,
proteinfreie Antikörperherstellung über 100 μg/ml in Fermentatoren
zu erlauben.
-
Beispiel 5: Analyse der
Campath-1H Syntheserate und Sekretion aus CHO-Zellen
-
Während der
Kultivierung der Campath-1H herstellenden CHO-Zellen aus Beispiel
3 wurde deutlich, daß,
selbst wenn sie Konfluenz erreichten, die Antikörpergehalte sich mit der Zeit
fortlaufend in dem Kulturmedium ansammelten. Zur Bestimmung, ob
dies möglicherweise
eine Folge der intrazellulären
Anhäufung,
die an eine langsame Sekretion gebunden ist, war, wurden die Syntheseraten
von Campath-1H und die Sekretion unter Verwendung von A39-Zellen
gemessen. Diese Untersuchungen wurden über 3 bis 4 aufeinanderfolgende Tage
mit Zellen durchgeführt,
die sich entweder in der Wachstumsphase oder konfluenten stationären Phase befanden.
Unabhängig
vom Wachstumszustand der Zellen waren die Ergebnisse identisch,
und die Daten sind nur für
immunausgefälltes
radioaktiv markiertes Campath-1H, das von stationären Zellen
hergestellt wurde, dargestellt.
-
Die
Syntheserate des Antikörpers
wurde durch Pulsieren der Zellen für einen kurzen Zeitraum mit [S35]-Methionin an jedem von vier aufeinanderfolgenden
Tagen gemessen und anschließend
wurde die Menge und die Verteilung des immunausgefällten Materials
untersucht. Aus 2 wird deutlich, daß die Syntheserate bei
allen gemessenen Zeitpunkten gleichermaßen hoch ist. Außerdem war,
sogar am Ende dieser kurzen Pulsierung, in jedem Fall schon mehr
als die Hälfte
des neu synthetisierten Campath-1H in dem Medium anwesend, was auf
eine schnelle Sekretion hinweist. Dies wurde durch die in 3 gezeigten Daten bestätigt, wobei parallele Zelle ähnlich pulsiert
wurden und die Verteilung von radioaktiv markiertem Campath-1H über einen
Zeitraum von 3 Tagen verfolgt wurde. Innerhalb von 24 Stunden war
fast der gesamte zelluläre
radioaktiv markierte Antikörper
in das Medium übergegangen,
wo er für
die Zeitspanne des Experiments stabil blieb. Dies zeigt, daß sogar,
wenn die rekombinanten CHO-Zellen für längere Zeiträume stationär blieben, die Syntheseraten
von Campath-1H und die Sekretion nicht vermindert wurden.
-
Campath-1H
ELISA-Assay. Mikrotiterplatten wurden mit einem antihumanen IgG
beschichtet und mit der Assayprobe (in Kulturmedium) inkubiert.
Der Antikörpernachweis
wurde unter Verwendung eines antihumanen Gammaketten-spezifischen
Peroxidasekonjugats sichtbar gemacht.
-
Analyse
der Syntheseraten von Campath-1H und dessen Sekretion. Die Zellen
von Beispiel 3 wurden bis zur Konfluenz in 3 cm Gewebekultur-Wells
wachsen gelassen, anschließend
30 Minuten in Methionin-freiem Dulbeccos MEM, enthaltend 10% fetales
Kalbserum, inkubiert. Danach wurden die Zellen in Gegenwart von
120 μCi/ml
[35S]-Methionin (> 800 Ci/mMol, Amersham) für einen
geeigneten Zeitraum markiert, dann wurden sie entweder geerntet
und in 500 μl
NP-40 Lysepuffer lysiert oder weiter in normalem Wachstumsmedium inkubiert.
Anschließend
wurden 125 μl
Aliquote des Zell-Lysats
oder Kulturmediums unter Verwendung von anti-humanem IgG der Ziege
(spezifisch für
die schwere Kette, Sigma) und 10% Protein-A-Sepharose (Pharmacia)
immunausgefällt.
Die Proben wurden dann auf 10% SDS-PAGE Reduktionsgelen gemäß Laemmli
getrennt, und die Signale wurden mit Enhance (NEN-Dupont) amplifiziert.
Die getrockneten Gele wurden anschließend über Nacht autoradiographiert.
-
Biologische Assays für funktionellen
CHO-glykosylierten Campath-1H Komplement-Lyse-Assay für Campath-1H
-
Das
Komplement-Lyse-Assay ist ein Maß der Antikörperwirkung, ausgedrückt als
spezifische Aktivität, die
durch die Fähigkeit
eines CHO-glykosylierten Antikörpers
bekannter Konzentration an eine vorbestimmte Zahl von Zellen zu
binden und Zellyse zu bewirken, bestimmt wird.
-
Das
Assay wird mit Campath-1H von Beispiel 4 unter Verwendung von Karpas
422-Zellen (von einer B-Zell Non-Hodgkin Lymphom-Zellinie (Dyer
et al., 1990, Blood 75, 704–714),
die Campath-Antigen auf der Zelloberfläche exprimiert, durchgeführt. 1,2 × 107 Zellen wurden durch Inkubieren bei 37°C in einem
CO2-Inkubator in der Gegenwart von 600 μCi 51Cr (Natriumchromat)
zwei Stunden radioaktiv markiert.
-
5,3
ml der markierten Zellen in dem Medium (Gesamtvolumen 23,5 ml) wurden
zu 12,5 ml normalem humanem Serum gegeben und 150 μl der Mischung
wurden in die Wells einer Mikrotiterplatte pipettiert.
-
50 μl Proben
des Endeluats von drei Reinigungsgängen wurden mit den Zellen
gemischt und bei 4°C 30
Minuten und dann bei 37°C
90 Minuten inkubiert. Die Kultur wurde bei 2000 Upm 5 Minuten zentrifugiert, und
die Radioaktivität
in 100 μl
Zellüberstand
wurde in einem Gammazähler
gezählt.
Die Komplement-Lyse-Aktivität
in Kilo Einheiten/ml wurde mit einer Standardkurve einer Referenzpräparation
(100 Einheiten/ml) berechnet.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.
-
Die
Campath-1H Konzentration in den 50 μl Proben des Endeluats wurden
unter Verwendung von Proben in PBS pH 7,2, die in einem Spectrophotometer
bei 280 nm untersucht wurden, geschätzt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 3 als optische Dichte in mg/ml ausgedrückt.
-
Mit
diesen Daten wird die spezifische Aktivität
bestimmt.
-
-
Die
Ergebnisse zeigen, daß CHO-glykosyliertes
Campath-1H funktionell ist.
-
Behandlung eines Patienten
mit CHO-glykosyliertem Campath-1H
-
Ein
Patient mit schwerer T-Zell-vermittelter Gelenkentzündung (immobilisierende
Polyarthritis, Pleuritis, Abdominalschmerzen), bei dem lange Krankenhausaufenthalte über 5 Jahre
erforderlich waren, wurde mit CHO-abstammendem Campath-1H aus Beispiel
4 unter Anwendung des folgenden Therapieplans behandelt:
2
mg pro Tag über
6 Tage durch intravenöse
Injektion,
10 mg pro Tag über
weitere 6 Tage durch intravenöse
Injektion.
-
Während der
zweiten sechstägigen
Behandlung konnte eine bedeutende symptomatische Verbesserung festgestellt
werden. Am Ende des zweiten Zeitabschnittes war die Gelenkentzündung wesentlich
verbessert und ein Hautabszess verschwand durch Antibiotika. 30
Tage nach Beendigung der Behandlung wurde der Patient entlassen.
-
Ungefähr 9 Monate
nach der ersten Behandlung litt der Patient an einem Rückfall,
wobei mehrere Gelenke betroffen waren. Nach erster Untersuchung
auf die Sensitivität
mit einer niedrigen Dosis begann eine 10 Tage lange weitere Behandlung
mit 10 mg/Tag Campath-1H mit bedeutender Besserung.
-
Beispiel 6: Expression
humanisierter Anti-C4 Antikörper
von CHO-Zellen
-
Herstellung des Expressionsvektor
pBanI: Modifikation von p342-12
-
Die
komplementaritätsbestimmenden
Bereiche von Ratten IgG2b, das gegen humanes CD4 gezüchtet wurde
(The New England Journal of Medicine 1990, 323, 250–254), wurde
auf humane Schwer- und Leichtketten-Gerüste transplantiert (Winter
et al., Nature, 1988, 322, 323–327).
-
Die
die humanisierte CD4-Leichtkette codierende cDNA wurde in pLD9 [Page
and Snydenham, M. A. 1991 Biotechnology 9, 64–68] kloniert. Das resultierende
Plasmid wurde p2100 genannt. Die humanisierte CD4-Schwerkette wurde
sequenziert und in eine modifizierte Version des Plasmids p342-12 kloniert [Law, M-F.,
Byrne, J. C. und Hinley, P. M., 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 2110–2115].
Das Plasmid p342-12 wurde mit BamHI verdaut, um das 7,4 kbp Fragment,
das einen Teil von dem BPV-1 Genom enthält, zu entfernen. Das Gerüst, das
das β-Lactamase-Gen
und das Neomycin-Resistenz-Gen unter der Kontrolle von dem Metallothionein-Promotor
aus der Maus enthält,
wurde entfernt und wieder an die BamHI-Stelle ligiert. Dieses Plasmid wurde
mit HindIII verdaut, mit dem großen Fragment der DNA Polymerase
I inkubiert, um die HindIII-Stelle zu entfernen und anschließend wieder
ligiert. Die β-Actin-Expressionskassette,
die den β-Actin-Promotor
unmittelbar stromaufwärts
von der HindIII-Stelle und dem Polyadenylierungssignal enthält, wurde
in die BamHI-Stelle des modifizierten Plasmids p342-12 kloniert,
um pBanI herzustellen.
-
Das
Plasmid pBanI besteht daher aus dem Neomycin-Resistenz-Gen, dem β-Lactamase-Gen und
der β-Actin-Expressionskassette,
enthaltend die einzige HindIII-Stelle. Die cDNA für die humanisierte
schwere Kette wurde in diese Stelle kloniert, und das resultierende
Plasmid, enthaltend das richtig orientierte Insert, wurde pBanCD4H
genannt. Folglich enthalten p2110 und pBanCD4H einen unterschiedlichen
Selektionsmarker und die Cotransfektion in die Empfänger dhfr–-CHO-Zellen
erlaubt die direkte Selektion und Isolierung der dhfr+/neor-Kolonien. Die Zellen, die diesen Phenotyp
entfalten, sollten funktionellen Anti-CD4-Antikörper exprimieren und könnten amplifiziert
werden, um die Antikörpertiter
zu erhöhen.
-
Expression von Anti-CD4
Antikörper
in CHO-Zellen
-
a) Zellkulturverfahren.
-
Die
dhfr–-CHO-Linie
DUK-B11 [Urlaub, G. und Chasin, L. A., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77, 4216–4220]
wurde in Iscoves mit 10% fetalem Rinderserum und jeweils 4 μg Hypoxanthin
und Thymidin (alle von Flow) ergänztem
Iscoves MEM Medium fortgepflanzt. Nach der Transfektion wurden die
Transformanten in dem oben beschriebenen Medium, außer daß es kein
Hypoxanthin/Thymidin enthält
und dialysiertes fetales Rinderserum verwendet wurde, selektiert.
Zusätzlich
wurde G418 auf 500 μg/ml
zugegeben. Zur Induktion der spontanen Amplifikation der Sequenzen,
die das dhfr-Gen enthalten und flankieren, wurde MTX auf eine Konzentration
von 0,1 μM
zugegeben.
-
b) Transfektion und Amplifikation.
-
Die
dhfr–-CHO-Linie
DUK-B11 wurde mit 5 μg
p2100 und 5 μg
pBAnCD4H unter Verwendung des Transfectamreagens unter den vom Hersteller
empfohlenen Bedingungen cotransfiziert. Die Transformanten wurden
wie oben beschrieben auf den dhfr+/neor-Phenotyp selektiert. Mehrere Hundert Transformanten
wurden beobachtet und zusammengeführt. Die ersten Titer zeigten
an, daß ungefähr 0,1 μg/ml/Tag
der ersten Runden von Basaltransformanten sekretiert wurden. Diese
zusammengeführte
Population wurde anschließend
in der Gegenwart von 0,1 μM
MTX ungefähr
14 Tage kultiviert. Resistente Kolonien wurden wieder gesammelt
und untersucht. Die Expression hatte sich ungefähr hundertfach erhöht, wobei
die gesammelten amplifizierten Kolonien ungefähr 10 bis 12 μg/ml/Tag
herstellten. Zum Erhalt von stabilen, klonalen Zellinien, die hohe
Antikörpertiter
ergeben, wurden die resistenten Pools durch begrenzte Verdünnung in
96-Well-Platten kloniert. Fünfzig
einzelne Kolonien wurden identifiziert und untersucht, und die vier
Linien, die die höchsten Titer
ergaben, wurden fortgepflanzt. Dieses Verfahren zur Identifizierung
stark exprimierender Klone innerhalb der resistenten Population
erzeugte eine Linie, die D419 genannt wurde, und die ungefähr 20 μg/ml/Tag
des Anti-CD4-Antikörpers
exprimierte.
-
Charakterisierung der
dhfr+/neor-Zellinien
-
i) Bestimmung der Kopienzahl
und stationären
Transkriptionsgehalte durch Slot-Blot-Analyse der DNA und RNA.
-
RNA
und DNA der ganzen Zelle wurden durch die verschiedenen Stufen der
Amplifikation hergestellt, wie von Maniatis et al. [1982 Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Sprin Harbour Laboratory, Cold Spring
Harbour, New York) beschrieben. Nach der Fixierung auf Nitrozellulosefiltern
wurden die Nucleinsäuren mit
[32P]-αATP
markierten DNA-Sequenzen der Schwerkette sondiert, wobei das dhfr-Gen
und das β-Actin-Gen
als ein Kontroll-"Haushalts"-Gen dienen, um Artifacte
wegen Beladungsfehlern auszuschließen.
-
Zuerst
wurde der nicht-klonierte 0,1 μM
MTX amplifizerte Pool mit den beschriebenen Sonden mit der ersten
Runde nicht-amplifizierter Transformanten und nicht-transformierter
parenteraler B11-Zellen verglichen. Folglich wurde kein DNA-Signal
in der parenteralen Linie nachgewiesen, wenn sie mit der schweren
Kette sondiert wurde, aber ein schwaches dhfr-Signal wurde nachgewiesen.
Das geschieht wegen dem einzelnen nicht-funktionellen dhfr-Allel
in der B11-Zellinie. Als Folge wurde kein RNA-Signal mit beiden
Proben nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurde ein starkes Signal
mit beiden Proben auf RNA und DNA in den primären Transformanten nachgewiesen,
die den Start der Expression reflektieren. Eine sehr bedeutende
Erhöhung
in der Copyzahl und den stationären
RNA-Gehalten der schweren Kette und dhfr wurden in den nicht-klonierten amplifizierten
Proben beobachtet. Dies korreliert genau mit der beobachteten Expressionserhöhung. Die
stationären β-Actin-RNA-Gehalte
stimmten in allen drei untersuchten Linien überein.
-
Ein ähnlicher
Vergleich wurde zwischen den vier am stärksten exprimierenden klonierten
Zellinien gemacht. Ein starkes Signal wurde sowohl auf den RNA-
als auch auf den DNA-Blots nachgewiesen. Obwohl die DA19-Linie zweimal mehr
Antikörper
als eine D423 genannte Linie exprimierte, betraf dieser Unterschied
nicht die Copyzahl und auch nicht die steadystate RNA-Gehalte. Für diese
Beobachtung gibt es zwei mögliche
Erklärungen,
die erste ist, daß die
DNA in der DA19-Linie an einer Stelle in dem Genom integriert wurde,
an dem sie unter dem Einfluß eines
Enhancers ist. Dies würde
jedoch in erhöhten
RNA-Gehalten wiedergespiegelt werden. Die wahrscheinlichere Erklärung ist,
daß bei
der Replikation und Verdoppelung der Tandem-Arrays in der D423-Linie
einige der Kopien der dhfr/Antikörperkassette
einer Neuordnung unterlagen und nicht-funktionell und verstümmelt sind.
Dies ist ungewöhnlich,
da die Integrationsstelle heterologer Gene häufig an Bruchstellen in den
Chromosomen, wie Telomeren ist, die auch als "Hot Spots" für
solche Neuordnungen bekannt sind. Dies könnte durch Northern- und Southern-Analyse
geklärt
werden.
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ii) Proteinsynthese und
Sekretion von Anti-CD4 Antikörper
der D419-Linie.
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Die
klonale D419-Linie wurde mit 35S-Methionin
und -Cystein markiert, und der intrazelluläre und sekretierte Antikörper durch
Immunausfällung
mit geeigneten Antikörpern
extrahiert. Nach der Elektrophorese auf Reduktions- SDS-PAGE-Gelen wurden
die Gele getrocknet und das Signal durch Autoradiographie nachgewiesen.
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Diese
Ergebnisse klären,
daß sowohl
die schwere als auch die leichte Kette wirksam synthetisiert wird. Intrazellulär braucht
keine Stöchiometrie
zwischen den schweren und leichten Ketten zu bestehen, da die beiden
miteinander assoziieren, wenn sie die sekretorischen Organellen
passieren.
