DE69233192T2

DE69233192T2 - Humanisierter antikörper gegen cd18

Info

Publication number: DE69233192T2
Application number: DE69233192T
Authority: DE
Inventors: Herman Cambridge WALDMANN; Martin Beckenham SIMS; Scott Beckenham CROWE
Original assignee: Cambridge University Technical Services Ltd CUTS
Current assignee: Cambridge University Technical Services Ltd CUTS
Priority date: 1991-07-16
Filing date: 1992-07-15
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2012-07-16
Also published as: US5997867A; US20030185818A1; ATE249518T1; EP0594732A1; JPH06508996A; DK0594732T3; ES2202303T3; US5985279A; JP2003199594A; EP1304379A2; WO1993002191A1; DE69233192D1; EP0594732B1; US6689869B2; GB9115364D0; JP3626753B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen humanisierten Antikörper, der spezifisch an das humane CD 18 Antigen bindet, die Herstellung eines solchen Antikörpers und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper enthält.
Antikörper umfassen typischerweise zwei durch Disulfidbindungen verknüpfte schwere Ketten und zwei leichte Ketten. Jede leichte Kette ist durch Disulfidbindungen an eine entsprechende schwere Kette geknüpft. Jede schwere Kette hat an einem Ende eine variable Domäne, gefolgt von einer Reihe von konstanten Domänen. Jede leichte Kette hat eine variable Domäne an einem Ende und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende. Die variable Domäne der leichten Kette ist in einer Linie mit der variablen Domäne der schweren Kette. Die konstante Domäne der leichten Kette ist in einer Linie mit der ersten konstanten Domäne der schweren Kette. Die konstanten Domänen in den leichten und schweren Ketten sind an der Bindung des Antikörpers an Antigen nicht direkt beteiligt.
Die variablen Domänen eines jeden Paares leichter und schwerer Ketten bilden die Antigenbindungsstelle. Die Domänen an den leichten und schweren Ketten besitzen die gleiche allgemeine Struktur und jede Domäne umfasst ein Gerüst aus vier Regionen, deren Sequenzen relativ konserviert sind, die durch drei komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) verbunden sind. Die vier Gerüstregionen nehmen größtenteils eine Beta-Faltblatt Konformation an, und die CDRs bilden Schleifen, die die Beta-Faltblatt Struktur verbinden, und in manchen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDRs werden in unmittelbarer Nähe zu den Gerüstregionen gehalten und wirken mit den CDRs der anderen Domäne an der Bildung der Antigenbindungsstelle mit. CDRs und Gerüstregionen von Antikörpern können durch Referenz zu Kabat et al ("Sequences of proteins of immunological interest" US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987) bestimmt werden .
Die Herstellung eines veränderten Antikörpers, in dem die CDRs von einer anderen Spezies als das Gerüst der variablen Domänen des Antikörpers abstammen, ist in EP-A-0239400 offenbart. Die CDRs können von einem monoklonalen Antikörper der Ratte oder der Maus stammen. Das Gerüst der variablen Domänen und die konstanten Domänen des veränderten Antikörpers können von einem humanen Antikörper stammen. Solch ein humanisierter Antikörper ruft bei Verabreichung an einen Menschen eine unwesentliche Immunantwort verglichen mit der Immunantwort, die durch einen Menschen gegen einen Antikörper der Ratte oder der Maus aufgebaut wird, hervor. Humanisierter CAMPATH-1 Antikörper ist in EP-A-0328404 (Campath ist ein Warenzeichen der The Wellcome group of companies) offenbart.
Die Erfindung stellt in einem ihrer Aspekte einen humanisierten Antikörper oder Fragment davon bereit, umfassend eine variable Region der leichten Kette und eine variable Region der schweren Kette, worin die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) der variablen Region der leichten Kette und die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) der variablen Region der schweren Kette die folgenden Aminosäure-Sequenzen besitzen:

leichte Kette: CDR1 (SEQ ID NR: 4)

CDR2 (SEQ ID NR: 6)

CDR3 (SEQ ID NR: 8)

schwere Kette: CDR1 (SEQ ID NR: 12)

CDR2 (SEQ ID NR: 14)

CDR3 (SEQ ID NR: 16)

worin besagter humanisierter Antikörper oder Fragment an humanes CD 18 Antigen spezifisch bindet.
Die Endung stellt in einem anderen ihrer Aspekte ein DNA-Molekül bereit, das die Aminosäure-Sequenz eines humanisierten Antikörpers oder Fragments davon codiert, umfassend eine variable Region der leichten Kette und eine variable Region der schweren Kette, worin die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) der variablen Region der leichten Kette und die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRl, CDR2 und CDR3) der variablen Region der schweren Kette die folgenden Aminosäure-Sequenzen besitzen:

leichte Kette: CDR1 (SEQ ID NR: 4)

CDR2 (SEQ ID NR: 6)

CDR3 (SEQ ID NR: 8)

schwere Kette: CDR1 (SEQ ID NR: 12)

CDR2 (SEQ ID NR: 14)

CDR3 (SEQ ID NR: 16)

worin besagter humanisierter Antikörper oder Fragment an humanes CD18 Antigen spezifisch bindet.
Weitere Aspekte der Erfindung sind durch die folgenden Ansprüche definiert, und die folgende Beschreibung dient lediglich zur Veranschaulichung.
Der Antikörper besitzt vorzugsweise die Struktur eines natürlichen Antikörpers oder eines Fragmentes davon. Der Antikörper kann deshalb einen vollständigen Antikörper, ein (Fab')₂ Fragment, ein Fab Fragment, ein Dimer aus leichten Ketten oder ein Dimer aus schwereren Ketten umfassen. Der Antikörper kann ein IgG, wie beispielsweise IgG1, IgG2, IgG3 oder IgG4; oder IgM, IgA, IgE oder IgD sein. Die konstante Domäne der schweren Kette des Antikörpers kann dementsprechend gewählt werden. Die konstante Domäne der leichten Kette kann eine kappa oder lambda konstante Domäne sein.
Der Antikörper kann ein chimärer Antikörper der in WO 86/01533 beschriebenen Art sein. Ein chimärer Antikörper gemäß WO 86/01533 umfasst eine Antigenbindungsregion und eine nicht-Immunglobulinregion. Die Antigenbindungsregion ist eine variable Domäne der leichten Kette und/oder eine variable Domäne der schweren Kette des Antikörpers. Typischerweise umfasst der chimäre Antikörper sowohl variable Domänen der leichten als auch der schweren Kette. Die nicht-Immunglobulinregion ist an den C-Terminus der Antigenbindungsregion fusioniert. Die nicht-Immunglobulinregion ist typischerweise ein nicht-Immunglobulinprotein und kann eine Enzymregion, eine Region, die von einem Protein mit bekannter Bindungsspezifität, von einem Proteintoxin oder tatsächlich von einem beliebigen Protein, das von einem Gen exprimiert ist, stammt, sein. Die nicht-Immunglobulinregion kann eine Kohlenhydratregion sein. Die zwei Regionen des chimären Antikörpers können durch eine spaltbare Linkersequenz verbunden sein.
Die CDRs 1 bis 3 der leichten Kette und die CDRs 1 bis 3 der schweren Kette von SEQ ID NOS: 3 bis 8 und beziehungsweise SEQ ID NOS: 11 bis 16 sind die CDRs des YFC51.1.1 Antikörpers der Ratte, der ein CD18 Antikörper ist. Die Spezifität eines humanisierten Antikörpers für das humane CD18 Antigen kann durch Durchflusscytometrie, Monocytenadhäsion und/oder durch T-Zellproliferationstests wie folgt bestimmt werden:
Monocyten MNC)-Adhäsion
MNC's werden mit dem Phorboldiester PDBu (10^-9 M) bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein von Antikörper (20 μl) 5 Minuten behandelt. Diese Zellen werden dann zu bovinen aortalen Endothelzellen (BAEC) Einzelzellschichten transferiert und 30 Minuten in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft, 5% CO₂ bei 37°C inkubiert. Nonadhärente Zellen werden durch dreimaliges Waschen in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) entfernt. Die adhärenten Zellen werden dann in situ mit 5O μl, 0,5% Hexadecyltrimethylammoniumbromid lysiert. 0,4 mM Wasserstoffperoxid enthaltendes Dianisidindihydrochlorid (0,63 mM) wird zu jeder Vertiefung hinzugefügt (250 μl) und weitere 10 Minuten inkubiert. Enzymaktivität wird dann unter Verwendung des Vorhandenseins von Monocyten-spezifischer Myeloperoxidase, die als Absorptionszunahme aufgezeichnet wird, bewertet. Die optische Dichte der Proben kann bei 450 nm unter Verwendung eines Multi-Well Plattenlesegerätes (Anthos Series, Lab Teck Instruments) aufgezeichnet werden. Ein Vergleich kann zwischen behandelten und unbehandelten Proben erfolgen (Bath et al, 7. Immunol. Meth., 118, 59-65, (1989)).
Durchflusscytometrie
Oberflächenmarkierung von Monocyten der Ratte, des Kaninchens, des Meerschweinchens und des Menschen mit Antikörper wird gemäß dem Verfahren nach Gladwin et al., (Biochem. Biophys. Acta., 1052, 166-172 (1990}) durchgeführt. Kurz zusammengefasst werden 1 ml Aliquots der Zensuspension (5 × 10⁶) mit dem geeigneten Antikörper inkubiert, monodispergiert und auf schmelzendem Eis 30 Minuten inkubiert. Die Zellen werden zweimal in PBS gewaschen und weitere 30 Minuten mit einer 1:200 Verdünnung von Kaninchen anit-Ratte F(ab')₂ FITC Konjugat auf schmelzendem Eis inkubiert. Die Zellen werden schließlich dreimal in PBS gewaschen und in 0,1% Paraformaldehyd fixiert. Eine Analyse der Obenflächenmarkierang kann unter Verwendung eines Epics Elite Durchflusscytometers (Coulter Cytometry, Hialhea, FL) unter Verwendung von Standardcomputer; -elektronik und – Optik durchgeführt werden. Das Elite wird mit einem 15mW 488 nm Argon-Ionen-Laser (Cyonics Modell 2201, San Jose, CA) konfiguriert. Monocyten- und Lymphocytenpopulationen werden durch Vorwärtsstreuung und Seitwärtsstreuung getrennt. Für 2 × 10⁴ Monocyten werden Daten der grünen Fluoreszenz unter Verwendung von Bit-map Gating gesammelt und auf einer dreidekadischen logarithmischen Skala dargestellt. Die Daten der grünen Fluoreszenz für 2 × 10⁴ Neutrophile werden auf ähnliche Weise gesammelt. Für jede Probe wird die mittlere Fluoreszenzintensität bei Vorhandensein des primären mAB mit Zellen verglichen, die mit Kaninchen anti-Ratte F(ab')₂ FITC Fragmenten alleine inkubiert wurden, und der Prozentsatz an Zellmarkierung wird bestimmt. Die Proben können dreifach markiert werden, und wiederholte Experimente können an drei getrennten Gegebenheiten durchgeführt werden.
T-Zell Proliferationstest
Humane mononukleäre Zellen werden aus von Fibrin befreitem Blut unter Verwendung von Dichtegradiententrennung über Ficoll-Paque präpariert. Lymphocyten (2 × 10⁵ Zellen) werden in jeder Vertiefung einer flachbödigen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Nunclon, Roskild, Dänemark) in RPMI 1640, das mit 10% autologem Serum, 2 mM Glutamin und 100 iU Penicillin / 100 μg ml^-1 Streptomycin ergänzt wurde, kultiviert. In dreifachen Ansätzen werden die Kulturen mit dem Medium al-leine oder mit Antigen (Tetanustoxid, 3 μg ml^-1) oder Mitogen (PHA, 1 μg ml^-1), bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein verschiedener Konzentrationen von monoklonalen Antikörpern angesetzt. Die Zellen werden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 95% Luft, 5% CO₂ fünf Tage lang kultiviert. Die Vertiefungen werden dann mit 1 μCi [Methyl³H] Thymidin (2 Ci mmol^-1, Amersham) einem Puls ausgesetzt, 18 Stunden später geerntet, und die Radioaktivität durch Flüssigszintillation unter Verwendung eines B-Zählers (LBK, Betaplate, Schweden) gezählt. Die Ergebnisse sind als Mittel +/- SEM dargestellt.
Geeigneterweise sind die CDRs eines humanisierten Antikörpers die obigen CDRs 1 bis 3 der leichten Kette und die obigen CDRs 1 bis 3 der schweren Kette. Die Aminosäure-Sequenzen dieser CDRs können dennoch verändert werden. Die Aminosäure-Sequenz jeder CDR kann bis zu 40% durch Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen und/oder -Deletionen, zum Beispiel bis zu 30%, bis zu 20% oder bis zu 10% verändert werden.
Jede CDR kann deshalb eine oder zwei Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen und/oder -Deletionen einschließen. Es können bis zu drei Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen und/oder -Deletionen in CDR der leichten Kette vorhanden sein.
Bis zu vier Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen und/oder -Deletionen können in CDR1 der leichten Kette oder CDR3 der schweren Kette vorhanden sein. Bis zu sechs Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen und/oder -Deletionen können in CDR2 der schweren Kette vorhanden sein. Vorzugsweise ist die Aminosäure-Sequenz einer CDR im wesentlichen zu der einer CDR von YFC51.1.1 homolog.
Das Gerüst und die konstanten Domänen des Antikörpers sind humanes Gerüst und humane konstante Domänen, Vorzugsweise ist das Gerüst der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers zu dem entsprechenden Gerüst des humanen Proteins NEWM (Saul et al., J. Biol. Chem. 25, 585-597, (1987)) im wesentlichen homolog. Homologie hinsichtlich des Gerüstes ist im Bezug auf NEWM im Allgemeinen 80% oder mehr, zum Beispiel 90% oder mehr oder 95% oder mehr. Eine Anzahl an Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen und/oder Deletionen kann vorhanden sein. In Frage kommende Veränderungen des Gerüstes, die zur Wiederherstellung der Bindung vorgenommen werden können, schließen Veränderungen der Aminosäurereste 27, 30, 48, 66, 67, 71, 91, 93, 93 und 94 ein. Die Nummerierung der Aminosäure erfolgt gemäß Kabat et al..
Das Gerüst der variablen Region der leichten Kette des Antikörpers ist zum Gerüst der variablen Domäne des Proteins REI (Epp et al., Eur. J. Biochem. 45, 513-524, (1974)) im wesentlichen homolog. Homologie hinsichtlich des Gerüstes ist im Bezug auf REI im Allgemeinen 80% oder mehr, zum Beispiel 90% oder mehr oder 95% oder mehr. Eine Anzahl an Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen und/oder Deletionen kann vorhanden sein, zum Beispiel bei Aminosäurerest 71 gemäß der Nummerierung nach Kabat et al..
Der die Erfindung verkörpernde Antikörper kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das Halten eines Wirts, der mit einem ersten Expressionsvektor, der die leichte Kette des humanisierten Antiköpers codiert, und mit einem zweiten Expressionsvektor, der die schwere Kette des humanisierten Antikörpers codiert, transformiert ist, unter Bedingungen, so dass jede Kette exprimiert wird, und Isolieren des humanisierten Antikörpers, der durch Zusammenfügen der demgemäss exprimierten Ketten gebildet ist, umfasst.
Die ersten und zweiten Expressionsvektoren können der gleiche Vektor sein. Die Erfindung stellt außerdem bereit:

– eine DNA-Sequenz, die die leichte Kette oder die schwere Kette des humanisierten Antikörpers codiert;
– einen Expressionsvektor, der eine besagte DNA-Sequenz inkorporiert; und
– einen Wirt, der mit einem besagten Expressionsvektor transformiert ist.

Jede Kette des Antikörpers kann durch CDR Ersatz hergestellt werden. Die CDRs einer variablen Region einer leichten oder schweren Kette eines humanen Antikörpers werden ausreichend durch die Aminosäure-Sequenz einer CDR des Ratte anti-Mensch CD18 Antikörpers YFC51.1.1 ersetzt, so dass der resultierende Antikörper fähig ist, an das CD18 Antigen zu binden. Die CDR-codierenden Regionen der DNA, die eine hypervariable Region einer humanen Antikörperkette codiert, werden durch DNA ersetzt, die die erwünschten CDRs codiert. Bei Eignung wird diese veränderte DNA an DNA geknüpft, die eine konstante Domäne für die Antikörperkette codiert. Die DNA wird in einen Expressionsvektor kloniert. Der Expressionsvektor wird in eine kompatible Wirtszelle eingeführt, die unter Bedingungen kultiviert wird, so dass die Antikörperkette exprimiert wird. Komplementäre Antikörperketten, die auf diese Weise koexprimiert werden, können sich dann zur Bildung des humanisierten Antikörpers zusammenfügen.
Die vorliegende detaillierte Beschreibung nimmt insbesondere Bezug auf die Herstellung eines humanisierten Anikörpers mit CDRs, die direkt oder indirekt von dem Antikörper YFC51.1.1 der Ratte stammen. Dennoch können die hierin beschriebenen Techniken gleichermaßen zur Ableitung anderer humanisierter anti-CD18 Antikörper verwendet werden. Zum Beispiel kann ein humanisierter (eingeführte CDR) anti-CD 18 Antikörper bereitgestellt werden.
Es gibt vier allgemeine Schritte zur Humanisierung eines monoklonalen Antikörpers. Diese sind:

(1) Bestimmung der Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäure-Sequenz der variablen Domänen der leichten und schweren Kette des anfänglichen Antikörpers;
(2) Entwurf des humanisierten Antikörpers, d.h. Entscheidung welche Gerüstregion des Antikörpers während des Humanisierungsverfahrens zu verwenden ist;
(3) die gegenwärtigen Humanisierungsverfahren/-techniken; und
(4) die Transfektion und Expression des humanisierten Antikörpers.

Schritt 1: Bestimmung der Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenz der variablen Domäne der leichten und schweren Kette des Antikörpers
Zur Humanisierung eines Antikörpers muss nur die Aminosäure-Sequenz der variablen Domänen der schweren und leichten Kette des Antikörpers bekannt sein. Die Sequenz der konstanten Domänen ist irrelevant, da diese nicht an der Neugestaltungsstrategie teilhaben. Das einfachste Verfahren zur Bestimmung der Aminosäure- Sequenz einer variablen Domäne eines Antikörpers ist aus klonierter cDNA, die die variable Domäne der schweren und leichten Kette codiert.
Es gibt zwei allgemeine Verfahren zur Klonierung von cDNAs einer variablen Domäne der schweren und leichten Kette eines gegebenen Antikörpers: (1) über eine herkömmliche cDNA Bibliothek, oder (2) über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Diese beiden Verfahren sind weitreichend bekannt. Ist die Nucleotid-Sequenz der cDNAs vorgegeben, ist es eine Einfachheit diese Information in die vorhergesagte Aminosäure-Sequenz der variablen Domänen des Antikörpers zu translatieren. Im vorliegenden Fall sind die Nucleotid-Sequenz und vorhergesagte Aminosäure-Sequenz der leichten und schweren Ketten des Rodentia YFC51.1.1 Antikörpers in SEQ ID NOS: 1 und 2 und SEQ 1D NOS: 9 und 10 dargestellt.
Schritt 2: Entwurf des humanisierten Antikörpers
Es gibt mehrere Faktoren, die bei der Entscheidung, welche humane Antikörper-Sequenz während der Humanisierung zu verwenden ist, zu beachten sind. Die Humanisierung von leichten und schweren Ketten werden als unabhängig voneinander angesehen, aber die Argumentation ist im Grunde für beide ähnlich.
Dieser Selektionsvorgang liegt dem folgenden Grundprinzip zugrunde: Antigenspezifität und -affinität eines gegebenen Antikörpers werden hauptsächlich durch die Aminosäure-Sequenz der CDRs der variablen Region bestimmt. Reste des Gerüstes der variablen Domäne leisten einen kleinen oder keinen direkten Beitrag. Die primäre Funktion der Gerüstregionen ist es, die CDRs in ihrer richtigen räumlichen Orientierung zur Antigenerkennung zu halten. Somit hat die Substitution von Rodentia-CDRs im Gerüst einer humanen variablen Domäne höchstwahrscheinlich eine Beibehaltung ihrer korrekten räumlichen Orientierung zur Folge, falls das Gerüst der humanen variablen Domäne zu der variablen Domäne aus Rodentia, aus der sie stammen, stark homolog ist. Deshalb sollte eine humane variable Domäne vorzugsweise so gewählt sein, dass sie zu der/den variablen Domäne(n) aus Rodentia stark homolog ist. Eine geeignete Sequenz einer variablen Domäne eines humanen Antikörpers kann wie folgt gewählt werden:

1. Unter Verwendung eines Computerprogramms Durchsuchung aller verfügbarer Protein- (und DNA-) Datenbanken nach solchen Sequenzen von variablen Domänen eines humanen Antikörpers, die die größte Homologie zu den variablen Domänen des Rodentia-Antikörpers aufweisen. Die Datenausgabe eines geeigneten Programms ist eine Liste der Sequenzen, die die größte Homologie zum Rodentia-Antikörper aufweisen, der Prozentsatz an Homologie zu jeder Sequenz, und eine Nebeneinanderstellung einer jeden Sequenz zu der Rodentia-Sequenz. Dies erfolgt unabhängig für die Sequenzen der variablen Domäne von sowohl schwerer als auch leichter Kette. Die obigen Analysen sind einfacher zu bewerkstelligen, wenn nur humane Immunglobulin-Sequenzen eingeschlossen sind.
2. Auflistung der Sequenzen der variablen Domäne des humanen Antikörpers und Homologievergleich. Zunächst erfolgt der Vergleich aufgrund der Länge der CDRs, mit Ausnahme von CDR3 der schweren Kette, die sehr variable ist. Humane schwere Ketten und Kappa und Lambda leichte Ketten werden in Untergruppen unterteilt; Schwere Kette 3 Untergruppen, Kappa Kette 4 Untergruppen, Lambda Kette 6 Untergruppen. Die CDR Größen innerhalb jeder Untergruppe sind ähnlich, variieren aber zwischen Untergruppen. Es ist normaler weise möglich als erste Homologieannäherung eine CDR eines Rodentia-Antikörpers in eine der humanen Untergruppen einzuordnen. CDRs von ähnlicher Länge tragende Antikörper werden dann bezüglich Aminosäure-Sequenzhomologie, insbesondere innerhalb der CDRs, aber auch in den umgebenden Gerüstregionen verglichen. Die humane variable Domäne, die die größte Homologie aufweist, wird als das Gerüst zur Humanisierung ausgewählt.

Schritt 3: Die gegenwärtigen Humanisierungsverfahren/-techniken
Ein Antikörper kann durch Einführen der erwünschten CDRs auf ein humanes Gerüst gemäß EP-A-0239400 humanisiert werden. Eine DNA-Sequenz, die den erwünschten neugestalteten Antikörper codiert, kann deshalb ausgehend von der humanen DNA, deren CDRs neugestaltet werden sollen, hergestellt werden. Die Aminosäure-Sequenz der variablen Domäne aus Rodentia, die die erwünschten CDRs enthält, wird mit der Sequenz der variablen Domäne des ausgewählten humanen Antikörpers verglichen. Die Reste in der humanen variablen Domäne, die in den entsprechenden Rest in der Rodentia-Domäne verändert werden müssen, damit die humane variable Region die Rodentia-CDRs inkorporiert, werden markiert. Es gibt ebenfalls Reste, die substituiert, hinzugefügt oder aus der humanen Sequenz deletiert werden müssen.
Oligonucleotide werden synthetisiert, die zur Mutagenese des Gerüstes der humanen variablen Domäne, damit die erwünschten Reste enthalten sind, verwendet werden können. Solche Oligonucleotide können eine beliebige Größe aufweisen. Normalerweise wird die Länge nur durch die Fähigkeiten des spezifischen zur Verfü gung stehenden Synthetisierers eingeschränkt. Das Verfahren der Oligonucleotidgerichteten in vitro Mutagenese ist wohl bekannt.
Wahlweise kann eine Humanisierung unter Verwendung der Verfahrens der rekombinanten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus WO 92/07075 erzielt werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine CDR zwischen den Gerüstregionen eines humanen Antikörpers gespleißt werden.
Im Allgemeinen kann die Technik von WO 92/07075 unter Verwendung einer Matrize, die zwei humane Gerüstregionen, AB und CD, und zwischen ihnen, die durch eine Donor-CDR zu ersetzende CDR umfasst, durchgeführt werden. Die Primer A und B werden zur Amplifikation der Gerüstregion AB verwendet, und die Primer C und D werden zur Amplifikation der Gerüstregion CD verwendet. Dennoch enthalten jeweils die Primer B und C ebenfalls an ihren 5'-Enden eine zusätzliche Sequenz, die der gesamten oder zumindest einem Teil der Donor CDR-Sequenz entspricht. Die Primer B und C überlappen innerhalb einer Länge, welche ausreicht, um eine Anlagerung ihrer 5'-Enden aneinander unter Bedingungen zu erlauben, die eine Durchführung einer PCR zulassen.
Somit können die amplifizierten Regionen AB und CD einem Genspleißen durch Overlap-Extension zur Herstellung des humanisierten Produktes in einer einzigen Reaktion unterworfen werden.
Schritt 4: Die Transfektion und Expression des neugestalteten Antikörpers
Im Anschluss an die Mutagenesereaktionen zur Neugestaltung des Antikörpers können die mutierten DNAs an eine geeignete DNA, die eine konstante Region der leichten oder schweren Kette codiert, gekoppelt werden, in einen Expressionsvektor kloniert werden und in Wirtszellen, vorzugsweise Säugerzellen, transfiziert werden. Diese Schritte können auf übliche Weise durchgeführt werden. Ein neugestalteter Antikörper kann deshalb durch ein Verfahren präpariert werden, umfassend:

(a) Herstellung eines ersten replizierbaren Expressionsvektors, der einen geeigneten Promotor einschließt, der an eine DNA Sequenz, die mindestens eine variable Domäne einer Ig schweren oder leichten Kette codiert, zweckorientiert verknüpft ist, wobei die variable Domäne Gerüstregionen aus einem humanen Antikörper und die für den humanisierten Antikörper der Erfindung erforderlichen CDRs umfasst;
(b) Herstellung eines zweiten replizierbaren Expressionsvektors, der einen geeigneten Promotor einschließt, der an eine DNA Sequenz, die wenigstens die variable Domäne einer komplementären Ig leichten oder beziehungsweise schweren Kette codiert, zweckorientiert verknüpft ist;
(c) Transformation einer Zelllinie mit dem ersten oder beiden präparierten Vektoren; und
(d) Kultivieren besagter transformierter Zelllinie zur Herstellung von besagtem veränderten Antikörper.

Die DNA Sequenz in Schritt (a) codiert vorzugsweise sowohl die variable Domäne als auch die oder eine konstante Domäne der Kette des humanen Antikörpers. Der humanisierte Antikörper kann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten rekombinanten Expressionssystems hergestellt werden. Die Zelllinie, die zur Her-Stellung des veränderten Antikörpers transformiert wird, kann eine Ovarzelllinie des chinesischen Hamsters (CHO) oder eine immortalisierte Säuger-Zelllinie, die vorteilhafterweise lymphoiden Ursprungs ist, wie beispielsweise eine Myelom-, Hybridom-, Triom- oder Quadromzellinie sein. Die Zelllinie kann ebenfalls eine normale lymphoide Zelle, wie beispielsweise eine B-Zelle, die durch Transformation mit einem Virus, wie beispielsweise das Epstein-Barr Virus, immortalisiert wurde, umfassen. Am Bevorzugtesten ist die immortalisierte Zelllinie ein Myelomzelllinie oder eine davon abstammende.
Die zur Expression der Antikörper gemäß der Erfindung verwendeten CHO-Zellen können Dehydrofolat-Reduktase (dhfr) defzient sein, so dass Wachstum in Abhängigkeit von Thymidin und Hypoxanthin erfolgt (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77 4216-4220 (1980)). Die parentale dhfr CHO-Zelllinie wird mit DNA, die den Antikörper und dhfr codiert, transfiziert, so dass eine Selektion von CHO-Zelltransformaten mit dhfr positivem Phänotyp möglich ist. Selektion erfolgt durch Kultivierung der Kolonien auf Thymidin- und Hypoxanthin-freien Medien, wobei deren Nichtvorhandensein das Wachstum nichttransformierter Zellen und die Rettung transformierter Zellen durch den Folatweg und somit ein Umgehen des Se-lektionssystems verhindert. Diese Transformanten exprimieren gewöhnlicherweise niedrige Gehalte der DNA von Interesse aufgrund von Co-Integration von transfizierter DNA von Interesse und dhfr codierender DNA. Die Expressionsgehalte der DNA, die den Antikörper codiert, kann durch Amplifikation unter Verwendung von Methotrexat (MTX) gesteigert werden. Dieser Stoff ist ein direkter Inhibitor des Enzyms dhfr und ermöglicht eine Isolierung von resistenten Kolonien, die ihre dhfr-Gen Kopienanzahl ausreichend amplifizieren, um unter diesen Bedingungen zu überleben. Da die DNA Sequenzen, die dhfr und den Antikörper codieren, in den ursprünglichen Transformanten eng gekoppelt sind, erfolgt normalerweise gleichzeitige Amplifikation und deshalb eine gesteigerte Expression des erwünschten Antikörpers.
Ein weiteres bevorzugtes Expressionssystem zur Verwendung mit CHO- oder Myelomzellen ist das in WO 87/04462 beschriebene Glutamin-Synthetase (GS)-Amplifikationssystem. Dieses System bezieht die Transfektion einer Zelle mit DNA, die das Enzym GS codiert und mit DNA, die den erwünschten Antikörper codiert, ein. Zellen, die in Glutamin-freiem Medium wachsen, werden dann gewählt und es wird davon ausgegangen, dass sie GS-codierende DNA integriert enthalten. Diese gewählten Klone werden dann einer Hemmung des Enzyms GS unter Verwendung von Methioninsulphoximin (Msx) ausgesetzt. Die Zellen werden zum Überleben die GS-codierende DNA bei gleichzeitiger Amplifikation der DNA, die den Antikörper codiert, amplifizieren.
Obwohl die zur Herstellung des humanisierten Antikörpers verwendete Zelllinie vorzugsweise eine Säuger-Zelllinie ist, kann eine andere geeignete Zelllinie, wie beispielsweise eine bakterielle Zelllinie oder eine Hefezelllinie wahlweise verwendet werden. Insbesondere wird es für möglich gehalten, dass von E. coli stammende Bakterienstämme verwendet werden könnten. Der erhaltene Antikörper wird bezüglich Funktionalität untersucht. Bei Funktionalitätsverlust ist es notwendig zu Schritt (2) zurückzukehren und das Gerüst des Antikörpers zu verändern.
Nach Expression können die ganzen Antikörper, ihre Dimere, einzelne leichte oder schwere Ketten, oder andere Immunglobulinformen der vorliegenden Erfindung gemäß Standardverfahren des Fachgebietes, einschließlich Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und Ähnliche (siehe, im Allgemeinen, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)) gewonnen und gereinigt werden. Für pharmazeutische Verwendungen werden im Wesentlichen reine Immunglobuline von wenigstens etwa 90 bis 95% Homo genität bevorzugt, und am Bevorzugtesten ist die Homogenität 98 bis 99% oder mehr. Nach teilweiser oder bis zur erwünschten Homogenität erfolgten Reinigung kann ein humanisierter Antikörper dann therapeutisch oder zur Entwicklung und Durchführung von Testverfahren, immunfluoreszierenden Färbungen und Ähnlichem verwendet werden (Siehe, im Allgemeinen, Immunological Methods, Vols. I und II, Lefkovits and Pernis, eds., Academic Press, New York, N.Y. (1979 und 1981)).
Die humanisierten CD18 Antikörper können zum Beispiel zur Behandlung von Leukocyten vermittelten Zuständen verwendet werden. Die humanisierten CD18 Antikörper finden typischerweise Verwendung bei der Hemmung des Influx von Leukocyten in die Lungen und anderen Organen während Sepsis oder einem anderen infektiösen oder nichtinfektiösen Trauma. Der humanisierte CD18 Antikörper kann deshalb zur Hemmung des Eintretens von Leukocyten in die Lunge und anderen Organen in Patienten mit endotoxischem Schock oder Adult-Respiratory-Distress-Syndrom verwendet werden. Der Antikörper kann zur Behandlung von Asthma oder Leukocyten vermitteltem Reperfusionsschaden post thrombolytischer Therapie, zur Behandlung von Entzündung in der Lunge und anderen Organen in Patienten mit durch Sepsis oder einem anderen infektiösen oder nichtinfektiösen Trauma verursachter Entzündung, zur Eliminierung oder Verringerung von Entzündung in einem Patienten, dem ein anti-Infektiöses Mittel verabreicht wird oder zur Beihilfe bei Verabreichung eines therapeutischen Stoffes an einen Patienten während Chemotherapie (EP-A-0346078) verwendet werden.
Die humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in Kombination mit anderen Antikörpern, insbesondere humanen monoklonalen Antikörpern, die mit anderen Markern auf den für die Erkrankung verantwortlichen Zellen reaktiv sind, verwendet werden. Zum Beispiel können geeignete T-Zellmarker solche einschließen, die den sogenannten "Clusters of Differentiation" zugeordnet sind, die durch den First International Leukocyte Differentiation Workshop, Leukocyte T in , Bernard, et al., Eds., Springer-Verlag, N.Y. (1984) benannt wurden.
Die Antikörper können ebenfalls als getrennt verabreichte Zusammensetzungen, die in Verbindung mit Chemotherapeutika oder Immunsuppressiva gegeben werden, verwendet werden. Typischerweise werden die Agenzien Cyclosporin A oder ein Purinanalog (z.B. Methotrexat, 6-Mercaptopurin oder Ähnliches) enthalten, aber zahlreiche zusätzliche Agenzien (z.B. Cyclophosphamid, Prednison, etc.), die einem Fachmann bekannt sind, können ebenfalls verwendet werden.
Ein Antikörper der vorliegenden Erfindung kann ein Teil eines Immunotoxins bilden. Immunotoxine sind durch zwei Bestandteile gekennzeichnet und sind insbesondere zur Tötung ausgewählter Zellen in vitro und in vivo nützlich. Ein Bestandteil ist ein cytotoxisches Mittel, das gewöhnlicherweise für eine Zelle nach Anlagerung oder Absorption tödlich ist. Der zweite Bestandteil, der als das "liefernde Vehikel" bekannt ist, stellt ein Mittel zur Lieferung des toxischen Mittels an einen besonderen Zelltyp, wie beispielsweise Zellen, die ein Karzinom umfassen, bereit. Die zwei Be-Standteile sind im Allgemeinen durch eine Vielzahl an bekannten chemischen Verfahren chemisch miteinander verbunden. Ist zum Beispiel das cytotoxische Mittel ein Protein und der zweite Bestandteil ist ein intaktes Immunglobulin kann die Verknüpfung durch heterobifunktionale Grosslinker, z.B. SPDP, Carbodiimid, Glutaraldehyd oder Ähnliche erfolgen. Eine Herstellung von verschiedenen Immunotoxinen ist im Fachgebiet wohlbekannt, und liegen zum Beispiel in "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe et al, Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190 (1982) vor.
Eine Vielzahl von cytotoxischen Mitteln sind zur Verwendung in Immunotoxinen geeignet. Cytotoxische Mittel können Radionuclide, wie beispielsweise Iod-131, Yttrium-90, Rhenium-188 und Bismuth-212; eine Anzahl von Chemotherapeutika, wie beispielsweise Vindesin, Methothrexat, Adriamycin und Cisplatin; und cytotoxische Proteine, wie beispielweise ribosomal hemmende Proteine wie Pokeweed antivirales Protein, Pseudomonas Exotoxin A, Ricin, Diphtherietoxin, Ricin A Kette, etc., oder ein an der Zelloberfläche aktives Agens, wie beispielsweise die Phospholipase-Enzyme (z.B., Phospholipase C) einschließen. Siehe im Allgemeinen "Chimeric Toxins," Olsnes und Phil, Pharmac. Ther., 25, 335-381 (1982), und "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy," eds. Baldwin und Byers, pp. 159-179, 224-266, Academic Press (1985).
Der liefernde Bestandteil des Immunotoxins ist ein humanisierter Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung. Intakte Immunglobuline oder ihre bindenden Fragmente, wie beispielsweise Fab, werden vorzugsweise verwendet. Typischerweise besitzen die Antikörper in den Immunotoxinen den humanen IgA, IgM oder IgG Isotyp, aber andere konstante Regionen des Säugers können, wenn erwünscht, verwendet werden.
Die Erfindung stellt außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel und als Wirkstoff, einen humanisierten Antikörper oder Fragment gemäß der Erfindung. Die Zusammensetzung kann ein Immunotoxin und den humanisierten Antikörper umfassen, Immunotoxin und pharmazeutische Zusammensetzungen davon sind ins besondere zur parenteralen Verabreichung, d.h. subkutan, intramuskulär oder intravenös nützlich.
Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung werden im Allgemeinen eine Lösung des Antikörpers oder einen Cocktail davon, der in einem geeigneten Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger gelöst ist, umfassen. Eine Vielzahl wässriger Träger können verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Saline, 0,3% Glycin und Ähnliches. Diese Lösungen sind steril und im Allgemeinen frei von partikulärer Materie. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, wohlbekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Hilfsmittel enthalten, die zur Annäherung an physiologische Bedingungen, wie beispielsweise pH Regulierung und Puffermittel, Toxizität regulierende Mittel und Ähnliche, zum Beispiel Natriumacetat, Natrium-Chlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlactat, etc. erforderlich sind. Die Antikörperkonzentration in diesen Formulierungen kann weitreichend variieren, zum Beispiel von weniger als etwa 0,5%, gewöhnlich bei oder mindestens etwa 1%, bis zu 15 oder 20% nach Gewicht, und wird primär basierend auf Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten, etc. in Übereinstimmung mit der besonderen gewählten Verabreichungsweise gewählt.
Somit könnte eine typische pharmazeutische Zusammensetzung zur intramuskulären Injektion, die 1 ml steril gepuffertes Wasser und 50 mg Antikörper enthält, hergestellt werden. Eine typische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion könnte 250 ml sterile Ringer Lösung und 150 mg Antikörper enthalten. Gegenwärtige Verfahren zur Herstellung von parental verabreichbaren Zusammensetzungen sind einen Fachmann bekannt oder zugänglich und sind detaillierter beschrieben in, zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980}.
Die Antikörper dieser Erfindung können zur Lagerung lyophilisiert und in einem geeigneten Träger vor Verwendung rekonstituiert werden. Diese Technik erwies sich bei herkömmlichen Immunglobulinen als wirksam. Jede geeignete Lyophilisations- und Rekonstitutionstechnik kann angewandt werden. Für einen Fachmann versteht es sich, dass Lyophilisation und Rekonstitution zu variierenden Ausmaßen an Aktivitätsverlust des Antikörpers führen kann (z.B. mit herkömmlichen Immunglobulinen, IgM Antikörper neigen zu einem größeren Aktivitätsverlust als IgG Antikörper) und dass die Anwendungsgehalte zum Ausgleich eingestellt werden müssen.
Die Zusammensetzungen enthaltend die human-ähnlichen Antikörper oder ein Cocktail davon können für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. Bei therapeutischer Applikation werden die Zusammensetzungen an einen Patienten, der bereits unter einer Erkrankung leidet, in einer Menge, die zur Heilung oder wenigstens teilweise zum Stillstand oder Linderung der Erkrankung und ihrer Komplikationen ausreicht, verabreicht. Eine Menge, die ausreicht, um dies zu erzielen, wird als eine "therapeutisch wirksame Dosis" bezeichnet. Für diese Verwendung wirksame Mengen hängen von der Schwere der Infektion und dem allgemeinen Zustand des eigenen Immunsystems des Patienten ab, reichen aber im Allgemeinen von etwa 1 bis etwa 200 mg Antikörper pro Dosis, wobei Dosierungen von 5 bis 25 mg pro Patient im Allgemeinen häufiger verwendet werden. Es ist zu beachten, dass die Materialien der Erfindung im Allgemeinen in ernsten Erkrankungsstadien, die lebensbedrohlich sind, oder in potentiell lebensbedrohlichen Situationen angewandt werden können. In solchen Fällen ist es möglich und scheint vom behandelten Arzt hinsichtlich der Minimierung von äußeren Substanzen und der verringerten Wahrscheinlichkeit von Abstoßungen von "Fremdsubstanz", die durch die human-ähnlichen Antikörper dieser Erfindung erzielt wird, erwünscht zu sein, einen wesentlichen Überschuss dieser Antikörper zu verabreichen.
In prophylaktischen Applikationen werden Zusammensetzungen enthaltend die vorliegenden Antikörper oder einen Cocktail davon, an einen Patienten, der nicht bereits im Erkrankungsstadium ist, zur Steigerung des Widerstandes des Patienten verabreicht. Solch eine Menge wird als eine "prophylaktisch wirksame Dosis" bezeichnet. In dieser Verwendung werden die präzisen Mengen wiederum vom Gesundheitszustand des Patienten und allgemeinen Immunitätszustand abhängen, reichen aber im allgemeinen von 0,1 bis 25 mg pro Dosis, spezifisch von 0,5 bis 2,5 mg pro Patient. Eine bevorzugte prophylaktische Verwendung ist zur Prävention von Nierentransplantatsabstoßung.
Einzelne und mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können mit Dosisgehalten und -mustern, die von dem behandelnden Arzt gewählt werden, durchgeführt werden. Auf jeden Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine Menge der/des Antikörpers) dieser Erfindung bereitstellen, die zur wirksamen Behandlung des Patienten ausreicht.
Human-ähnliche Antikörper der vorliegenden Erfindung können außerdem eine weitreichende Vielzahl an Verwendungen in vitro haben. Beispielsweise können die exemplarischen Antikörper zur T-Zelltypisierung, zur Isolierung spezifischer CD 18 Antigen oder Fragmente des Rezeptors tragender Zellen, zur Impfstoffherstellung oder Ähnliches verwendet werden.
Für diagnostische Zwecke können die Antikörper entweder markiert oder unmarkiert sein. Unmarkierte Antikörper können in Kombination mit anderen markierten Antikörpern (sekundäre Antikörper), die mit dem humanisierten Antikörper reaktiv sind, wie beispielsweise für konstante Regionen des humanen Immunglobulins spezifische Antikörper, verwendet werden. Wahlweise können die Antikörper direkt markiert sein. Eine weitreichende Vielzahl von Markierungen kann angewandt werden, wie beispielsweise Radionuclide, Fluore, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymcofaktoren, Enzyminhibitoren, Liganden (insbesondere Haptene), etc. Zahlreiche Arten von Immunassays sind erhältlich und sind einem Fachmann bekannt.
Kits können ebenfalls zur Verwendung mit den vorliegenden Antikörpern zum Schutz gegen oder Detektion von einer zellulären Aktivität oder bezüglich des Vorhandenseins eines gewählten Antigens bereit gestellt werden. Somit kann ein humanisierter Antikörper der vorliegenden Endung gewöhnlich in einer lyophilisierten Form in einem Behälter, entweder alleine oder in Verbindung mit zusätzlichen Antikörpern, die für den erwünschten Zelltyp spezifisch sind, bereitgestellt werden. Die Antikörper, die an eine Markierung oder Toxin konjugiert oder unkonjugiert sein können, sind in den Kits mit Puffern, wie beispielsweise Tris, Phosphat, Carbonat, etc., Stabilisatoren, Bioziden, inerten Proteinen, z.B. Serumalbumin oder Ähnlichen eingeschlossen. Im Allgemeinen werden diese Materialien in weniger als etwa 5% wt. basierend auf der Menge an aktivem Antikörper vorliegen und gewöhnlich in einer Gesamtmenge von wenigstens etwa 0,001% wt. wiederum basierend auf der Antikörperkonzentration vorhanden sein. Häufig wird es erwünscht sein, zur Verdünnung der Wirkstoffe ein inertes Streckmittel oder Arzneimittelträger einzuschließen, wobei der Arzneimittelträger in von etwa 1 bis 99% wt. der Gesamtzusammensetzung vorhan den sein kann. Wird ein zweiter Antikörper, der fähig ist, an den chimären Antikörper zu binden, in einem Assay angewandt, wird dieser gewöhnlicherweise in einem getrennten Vial vorhanden sein. Der zweite Antikörper ist typischerweise mit einer Markierung konjugiert und auf eine analoge Weise zu den oben beschriebenen Antikörperformulierungen formuliert. Das Kit wird im Allgemeinen ebenfalls Gebrauchsanweisungen beinhalten.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung.
BEISPIEL
Klonierung und Sequenzierung der YFC51.1.1 Ratte anti-Mensch-CD18 schweren und leichten Ketten Gesamt RNA wurde aus 2,5 × 10⁷ YFC51.1.1 exprimierenden Zellen in Anlehnung an das Verfahren nach Chomczynski und Sacchi (Anal. Biochem., 162, 156-159, (1987)) unter Verwendung von 1 ml Extraktionslösung pro 1 × 10⁷ Zellen isoliert. Das resultierende RNA Pellet wurde in 50 μl Diethyipyrocarbonat (DEPC)-behandeltem destillierten Wasser gelöst, und die Konzentration wurde spektrophotometrisch bei 4 μg/ml bestimmt. Dynabeads Oligo (dT)₂₅ (Dynal) wurden zur Extraktion von mRNA aus 75 μl Gesamt-RNA unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers verwendet.
cDNA wurde aus der isolierten mRNA synthetisiert und in das Plasmid pSPLAGE-1 unter Verwendung des SUPERSCRIPT Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning Kits (BRL) in Anlehnung an das vom Hersteller empfohlene Verfahren kloniert. Escherichia coli MAX EFFIqCIENCY DHSa Competent Cells (BRL) wurden mit der resultierenden cDNA/pSPLAGE-1 Ligation transformiert. Annähernd 5000 Kolonien wurden auf Hybond-N Nylonfilter (Amersham) übertragen und in Anlehnung an das Verfahren nach Buluwela et al (Nucleic Acids Res., 17, 452, (1989)) lysiert, denaturiert und fixiert. Die Filter wurden mit Proteinase K (50 μg/ml) in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 55°C 30 min behandelt, und die überschüssigen Zellbruchstücke wurden dann mit einem Tuch entfernt.
(i) Schwere Kette
Ein wie in SEQ ID NR: 17 dargestelltes Oligonucleotid, das zu einem Teil der gamma-CH1 konstanten Region der Ratte (Basen 496-515) komplementär ist, wurde endmarkiert und zum Durchsuchen der Filter hinsichtlich YFC51.1.1 schwere Kette in Anlehnung an die Standardprotokolle verwendet. Annähernd 50 potentiell positive Kolonien wurden detektiert und 20 wurden zur weiteren Analyse ausgewählt. Plasmid DNA wurde unter Verwendung des Verfahrens nach Del Sal et al (Nucleic Acid Res., 16, 9878, (1988)) präpariert und 12 der 20 enthielten Inserts der erwarteten Größe für cDNA der Immunglobulin schweren Kette der Ratte. Ein Klon, p51H.6, wurde gewählt, und die variable Region wurde in beide Richtungen durch Plasmid-Priming in Anlehnung an das Dideoxy-Kettenabbruch-Verfahren (Sanger et al, (Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467, (1977)) gemäß dem Sequenase Kit (USB) Protokoll sequenziert. Die Sequenz der variablen Region ist in SEQ ID NR: 9 und 10 dargestellt.
(ii) Leichte Kette
sEin Klon der leichten Kette des Myeloms der Ratte Y3-Ag 1.2.3 (Crowe et a1, Nucleic Acid Res., 17, 7992, (1989)) wurde mit Digoxigenin-11-dUTP unter Verwendung des Nonradioactive DNA Labelling and Detection Kit (Boehringer Mannheim) markiert und zum Durchsuchen der Filter nach der YFC51.1.1 leichten Kette in Anlehnung an das Protokoll des Herstellers verwendet. Annähernd 40 potentiell positive Kolonien wurden detektiert, und 24 wurden zur weiteren Analyse ausgewählt. Plasmid DNA wurde wie oben beschrieben präpariert. Sowohl Y3-Ag 1.2.3 und YFC51.1.1 leichte Ketten wurden isoliert (wobei die Y3 Zelllinie Hybridomfusionspartner ist), waren aber durch den Besitz verschiedener Restriktionsmuster unterscheidbar. Ein Klon, p51L.4, der die YFC51.1.1 leichte Kette enthält, wurde gewählt und wie oben bei der schweren Kette beschrieben, sequenziert. Die Sequenzen der variablen Region ist in SEQ ID NOS: 1 und 2 dargestellt.
Entwurf des humanisierten Antikörpers
Unter Verwendung des oben in Schritt (2) beschriebenen Selektionsverfahrens wurden die Gerüste der humanen variablen Domäne der NEWM schweren Kette und REI leichten Kette (Kabat et al, 1987) für den Humanisierungsprozess ausgewählt.
Konstruktion der Gene der humanisierten leichten und schweren Kette Die humanisierten schweren und leichten Ketten wurden in Anlehnung an das Verfahren nach Lewis und Crowe (Gene, 101, 297-302, (1991)) konstruiert.
(i) Leichte Kette
Oligonucleotid-Primer der leichten Kette:
A_L: SEQ ID NR: 18:
B_L: SEQ ID NR: 19:
C_L: SEQ ID NR: 20:
D_L: SEQ ID NR: 21:
E_L: SEQ ID NR: 22:
F_L: SEQ ID NR: 23:
G_L: SEQ ID NR: 24:
H_L: SEQ ID NR: 25:
PCR Reaktionen (Saiki et al., Science 239, 487-491, (1988)) wurden in einem programmierbaren Heizblock (Hybaid) unter Verwendung von 20 Runden eines Temperaturzyklus (94°C l min, 50°C 2 min und 72°C 3 min) gefolgt von einem letzten Schritt von 10 min bei 72°C durchgeführt. 1 μg eines jedes Primers, eine spezifische Menge Matrize und 2,5 Einheiten Taq Polymerase (Perkin Elmer Cetus) wurden in einem Endvolumen von 100 μl mit dem Reaktionspuffer wie vom Hersteller empfohlen verwendet.
Die anfängliche Matrize für die PCR war CAMPATH-1H leichte Kette (humanisiertes CAMPATH-1 auf RE1 Gerüst; Page und Sydenham, Biotechnology, 9, 64-68, (1991)). Vier anfängliche PCR Reaktionen wurden mit 10 μg Matrize pro Reaktion unter Verwendung der Primerpaare A_L mit B_L, C_L mit D_L, E_L mit F_L und beziehungsweise G_L mit H_L durchgeführt. Die Produkte dieser PCR Reaktionen, die Fragmente AB_L, CD_L, EF_L und beziehungsweise GH_L wurden unter Verwendung von Prep-A-Gene (Bio-Rad} in Anlehnung an das vom Hersteller empfohlene Protokoll gereinigt. Die Fragmente AB_L mit CD_L und EF_L mit GH_L wurden unter Verwendung eines Viertels eines jeden gereinigten Produktes vereint, und rekombinanten PCR Reaktionen mit den Primern A_L plus DL, und beziehungsweise E_L plus H_L unterworfen. Die Produkte dieser Reaktionen, die Fragmente AD_L und EH_L wurden wie oben gereinigt, und je ein Viertel wurde unter Verwendung der Primer A_L und H_L in einer rekombinanten PCR-Reaktion vereint. Das letzte rekombinante PCR-Produkt der humanisierten leichten Kette, AH_L, wurde in die HindIII Stelle von pUC-18 (BRL) in Anlehnung an das Verfahren nach Crowe et al., Nucleic Acids Res., 19, 184, (1991) unter Verwendung der HindllI Stellen in den Primern A_L und H_L kloniert. Die Plasmidisolate wurden durch das Dideoxy-Kettenabbruchverfahren sequenziert und die Klone mit der korrekten Sequenz wurden ausgewählt.
(ii) Schwere Kette
Oligonucleotid-Primer der schweren Kette:
A_H: SEQ ID NR: 26:
B_H: SEQ ID NR: 27:
C_H: SEQ ID NR: 28:
D_H: SEQ ID NR: 29:
E_H: SEQ ID NR: 30:
F_H: SEQ ID NR: 31:
G_H: SEQ ID NR: 32:
H_H: SEQ ID NR: 33:
Die anfängliche Matrize für die PCR war CAMPATH-1H schwere Kette. Die Rodentia-CDR's wurden in die Matrize in Anlehnung an das rekombinante PCR Verfahren, wie oben beschrieben, jedoch unter Verwendung der Oligonucleotid-Primer A_H bis H_H eingeführt. Die letzte PCR, d.h. die Fragmente AD_H und EH_H mit den Primern A_H und H_H, lieferte keine große Ausbeute des Produktes, so dass ein Fragment AF_H erzeugt wurde (aus den Fragmenten AD_H und EF_H) und mit dem Fragment EH_H in einer PCR mit den Primern A_H und H_H verwendet wurde. Die Oligonucleotide A_H und H_H wurden mit HindIII und beziehungsweise EcoRI Stellen entworfen, um eine anfängliche Klonierung der humanisierten variablen Region zu ermöglichen, und eine SpeI Stelle wurde in die NEWM Gerüst 4 (FR4) -region von Oligonucleotid G_H zur Vereinfachung von nachfolgender Klonierung der variablen Region mit einer geeigneten konstanten Region nach Wahl eingeführt. Die SpeI Stelle wurde gewählt, um den Leucin-Rest an Position 109 (Nummerierung gemäß Kabat et al., 1987) der Matrize der humanisierten schweren Kette nicht zu verändern. Vier der sechs J-Minigene der schweren Kette besitzen ein Leucin an dieser Position (Kabat et al., 1987). Somit sollte die Verwendung der konstruierten SpeI Stelle allgemein anwendbar sein.
Das rekombinante PCR-Produkt der variablen Region der humanisierten schweren Kette wurde in mit HindIII/EcoRI geschnittenen pUC-18 (BRL) kloniert, und Plasmidisolate mit der korrekten Sequenz wurden ausgewählt. Die FR4 und γ1 konstanten Regionen von CAMPATH-1H schwere Kette wurden in pUC-18 (BRL) unter Verwendung der Oligonucleotid-Primer X_H (SEQ ID NR: 34) und Y_H (SEQ ID NR: 35) durch PCR kloniert. Primer X_H enthält SpeI und HindIII Stellen und Y_H eine EcoRI Stelle. Die HindIII und EcoRI Stellen wurden zur Klonierung des PCR Pro duktes in pUC-18 verwendet, und Plasmidisolate der korrekten Sequenz wurden gewählt. Die vollständige schwere Kette wurde nachfolgend aus den Klonen der humanisierten variablen Region und γ1 konstanten Region unter Verwendung der konstruierten Spe1 Stelle rekonstituiert.
Transiente Expression in COS-Zellen
Die humanisierten schweren und leichten Ketten codierende DNA wurde in die Vektoren pEE6.hCMV und beziehungsweise pEE12 kloniert, siehe Stephens & Cockett, Nucleic Acids Res., 17, 7110 (1989); Bebbington et al., Biotechnology, 10, 169 (1992), und Bebbington und Hentschel in Glover ed., DNA Cloning Volume III, Academic Press (1987). Der Vektor pEE12 ist ein auf pBR322 basierender Vektor, der den h-CMV-MEI Promotor und die Hamster Glutamin-Synthetase (GS) cDNA unter Kontrolle des Promotors der SV40 frühen Region enthält. Der Vektor pEE12 entspricht pEE6 (siehe EP-A-0338841), wobei die durch den SV40 Promotor gesteuerte GS cDNA Expressionskassette in die gleiche Richtung wie der h-CMV-MEI Promotor transkribiert. Mit den Vektoren pEE6, hCMV und pEE12 transfizierte Zellen haben aufgrund des Vorhandenseins der GS cDNA die Fähigkeit in Glutaminfreiem Medium zu wachsen. Da die Selektion nur auf dem pEE12 Plasmid ist, beruht eine wirksame Expression auf der Co-Integration von beiden Plasmiden.
Die rekombinanten Plasmide (jeweils 5 μg} wurden in 5 × 10⁵ COS-1 Zellen unter Verwendung des Transfectam Reagenz (Promega, Southampton, U.K.) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen transfiziert. COS-1 Ausgangszellen (Herkunft ECACC, Porton Down, U.K.) wurden in DMEM Medium (Flow, Irvine, U.K.), das mit 10% fötalem Kälberserum (APP, Dudley, U.K.) ergänzt wurde, gehalten.
Transfektionen der COS-Zellen erfolgten in DMEM Medium (Flow, Irvine, U.K.). Wachstumsmedien aus COS-1 Zellen vier Tage nach Transfektion wurden durch einen Sandwich-ELISA Test unter Verwendung von flexiblen Mikrotiterplatten (Falcon, Becton-Dickinson, Plymouth, U.K.), die mit polyklonalem anti-Mensch IgG (Sigma, Poole, U.K.) als Fangantikörper beschichtet waren, untersucht. Die Testprobe wurde zugegeben und Detektion erfolgte mit einem anti-Mensch IgG γ Kettenspezifischen Peroxidase-Konjugat (Seralab, Crawlet, Down, U.K.) und Orthophenylendimin-HCl (Sigma, Poole U.K.) als Substrat.
Unter Verwendung des eingesetzten COS-Zellüberstandes zur Oberflächenmarkierung von MF-14 Zellen (ein T-Zell Klon) mittels FACS-Analyse gemäß dem Verfahren nach Gladwin et al., Biochem. Biophys. Acta, 1052, 166-172 (1990) zeigte sich, dass der humanisierte Antikörper in COS-Zellen transient exprimiert wird. Kurz zusammengefasst wurden 100 μl Aliquots einer Zellsuspension (10⁵) mit dem geeigneten Antikörper (eingesetzter COS-Zellüberstand) inkubiert und auf schmelzendem Eis 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und weiter 30 Minuten mit dem geeigneten Sekundärantikörper inkubiert (siehe unten). Die Zellen wurden wiederum gewaschen und 1:50 Verdünnungen von anti-Ratte Ig-FITC oder anti-Mensch Ig-FITC Konjugate wurde auf schmelzendem Eis hinzugegeben. Schließlich wurden die Zellen dreimal in PBS gewaschen und in 0,1% Paraformaldehyd fixiert. Analyse der Oberflächenmarkierung erfolgte unter Verwendung eines Becton-Dickenson FACScan unter Verwendung von Standardcomputer, -elektronik und -Optik.
Es wurde gezeigt, dass der humanisierte Antikörper im COS-Zellüberstand sowohl an MF-14 Zellen bindet, als auch die Bindung des YFC51.1.1 monoklonalen Antikörpers der Ratte hemmt. Da durch Blockierung der Bindung des monoklonalen Antikörpers der Ratte gezeigt wurde, dass der humanisierte Antikörper eine Bindung an CD18 beibehielt, wurden stabile NSO Transfektanten erzeugt.
Stabile Expression in NSO Zellen
Ein einzelner Expressionsvektor zur Erzeugung stabiler Transfektanten von NSO Zellen wurde durch Klonieren der vollständigen Expressionskassette der schweren Kette aus pEE6 in die BamH1 Stelle des pEE12 – leichte Kette Plasmids erzeugt. Somit werden sowohl schwere als auch leichte Kette codierende Sequenzen in der gleichen Richtung aus dem gleichen Vektor transkribiert. 40 μg Plasmid zur Transfektion wurde durch Verdau mit Sal1 Restriktionsenzym, das eine Erkennungssequenz innerhalb der bakteriellen Plasmidsequenz hat, linearisiert. Die linearisierte DNA wurde unter Verwendung von Ethanol aus der Lösung präzipitiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in sterilem Wasser resuspendiert.
Exponentiell wachsende NSO-Zellen (eine Myelomzelllinie des Menschen; siehe Jarvis, Methods in Enzymology, 73B, 3 (1981); Herkunft ECACC, Porton Down, U.K.) wurden in nichtselektivem DMEM Medium (d.h. ohne Glutamin und Eisennitrat, aber mit Natriumpyruvat bei 110 mg/λ(GIBCOBRL, Paisley, U.K.)), das mit 1X nichtessentiellen Aminosäuren (Flow, Irvine, U.K.), 2 mM Glutamin (GIBCO) und 10% fötalem Kälbersserum (APP, Dudley, U.K.) ergänzt wurde, gehalten. NSO-Zellen wurden zentrifugiert, gewaschen und in kaltem PBS resuspendiert, so dass nach Zugabe der DNA die Zellen bei einer Konzentration von 10⁷ Zellen /ml vorliegen würden. Die linearisierte Plasmid-DNA, 40 μg, wurde zu 10⁷ Zellen in einer Elektroporationsküvette auf Eis zugegeben. Die Zellen und DNA wurden sanft vermischt, um Blasenbildung zu vermeiden, und die Mischung wurde 5 Minuten auf Eis aufbewahrt. Das Äußere der Küvette wurde trocken gewischt und zwei aufeinanderfolgende Pulse wurden bei 1500 V, 3 inF unter Verwendung eines Gene Pulser (Bio-Rad) gegeben. Die Küvette wurde für 5 Minuten zurück auf Eis überführt. Transfizierte Zellen wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 3 × 10⁵, 7,5 × 10⁴ und 1,5 × 10⁴ Zellen /ml in 50 μl nichtselektivem Medium transferiert und bei 37°C 24 Stunden inkubiert. Nachfolgend wurde 100 μl selektives DMEM Medium (d.h. ohne Glutamin und Eisennitrat, jedoch mit Natriumpyruvat bei 100 mg/l(GIBCOBRL, Paisley, U.K.)), das mit Glutamat (60 mg/ml), Asparagin (60 mg/ml; Sigma, Poo1e, U.K.), 1X nichtessentiellen Aminosäuren, 7 mg/l Adenosin, Cytidin, Guanosin und Uridin, 2,4 mg/l Thymidin (Sigma, Poole, U.K.) und 10% dialysiertem fötalen Kälberserum (APP, Duddley U.K.) ergänzt wurde, zu gewählten Klonen, die das transfizierte Plasmid integriert enthielten, zugegeben. Die Platten wurden in den Inkubator zurückgeführt und dort bis zum Erfolgen von wesentlichem Zelltod und Erscheinen von diskreten überlebenden Kolonien gelassen. Sobald Kolonien von Glutamin-abhängigen Transfektanten ersichtlich waren, wurden Vertiefungen mit einzelnen Kolonien gewählt und die eingesetzten Kulturüberstände wurden gesammelt und hinsichtlich der Sekretion von humanem IgG untersucht.
Vertiefungen mit einzelnen Kolonien, die hinsichtlich IgG Sekretion positiv waren, wurden in Kultur unter Verwendung von selektivem Medium vermehrt. Die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit 10⁴ Zellen/Vertiefung in 100 μl Medium verteilt und über Nacht inkubiert. 100 μl des selektiven Mediums, das eine Konzentration von L-Methioninsulphoximin (MSX) enthielt, wurde zugefügt. MSX ist ein toxisches Glutamin-Analog, das Selektion hinsichtlich Vektoramplifikation erlaubt. Jede Platte mit 96 Vertiefungen hatte eine unterschiedliche MSX Endkonzentration, die von 200 μM bis hin zu 12,5 μM reichte. Individuelle Kolonien wurden aus jeder unabhängigen Transfektante bei der höchsten MSX Konzentration, bei der MSX Resistenz stattfand, isoliert. Die Kolonien wurden vermehrt und die Antikörpersekretionsrate (in μg/10⁶ Zellen/Tag) wurde mit der nichtamplifizierten Rate verglichen. Klone wurden erhalten, die den humanisierten Antikörper mit 1 bis 3 μg/10⁶ Zellen/Tag exprimierten.
Der humanisierte Antikörper wurde aus eingesetztem Gewebekulturüberstand durch Affinitätschromatographie über eine Superose Protein-G Säule (Pharmacia) gereinigt und in T-Zellproliferationstests und C 1 q Bindungsstudien verwendet.
T-Zellproliferation
Periphere humane mononukleäre Zellen wurden aus humanem, von Fibrin befreitem Vollblut unter Verwendung von Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norwegen) in Anlehnung an das Protokoll des Herstellers isoliert. Dreifache Kulturansätze wurden in flachbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nunclon, Roskild, Dänemark) mit dem Mediumklon (RPMI 1640, ergänzt mit 10% autologem Serum, 2 mM Glutamin und 100 N/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin) oder mit Medium und Antigen (Tetanustoxoid, 5 g/ml) oder Medium und Mitogen (PHA, 5 μg/m1), bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von YFC 51.1.1 oder dem humanisierten Antikörper angesetzt. Die Zellen wurden bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft, 5% CO₂ 5 Tage lang kultiviert. Die Vertiefungen erhielten dann einen Pulse mit 1 μCi [Methyl ³H]Thymidin (2 Ci/mmol, Amersham), wurden 4 Stunden später geerntet und die Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillation unter Verwendung eines β-Zählers (LKB, Betaplate, Schweden) gezählt.
Sowohl der YFC51.1.1 monoklonale Antikörper der Ratte, als auch der humanisierte Antikörper hemmten stark die Antigen-spezifische T-Zellantwort, hatten aber eine geringe Wirkung auf die PHA induzierte Proliferation. Dennoch konnte bei hohen Antikörpergehalten (50 μg/ml) und niedrigen PHA-Gehalten (2,5 μg/ml) bis zu 80% Hemmung erzielt werden.
Komplement-Bindung
Humane mononukteäre Zellen (wie oben präpariert) wurden mit 5 μg/ml PHA stimuliert und bei 37°C 3 Tage inkubiert. Das PHA wurde durch Waschen der Zellen in PBS entfernt. Die Zellen wurden dann mit 10 μg/ml Testantikörper 20 Minuten auf Eis inkubiert, die Zellen wurden in eiskaltem PBS gewaschen und mit eiskaltem humanen Serum 20 Minuten inkubiert. Das humane Serum wurde durch Waschen in eiskaltem PBS entfernt. Die Zellen wurden dann 20 Minuten mit fluoreszierendem plolyklonalen Schaf anti-Mensch C 1 q inkubiert. Nichtgebundenes anti-C 1 q wurde durch Waschen der Zellen in PBS entfernt, und die Zellen wurden durch ein Becton-Dickenson FACScan analysiert. Es wurde befunden, dass YFC51.1.1 an humanes Clq schwach bindet, und keine Bindung wurde bei dem humanisierten Antikörper detektiert. Potentielle therapeutische Verwendungen für anti-CD 18 Antikörper beruhen eher auf transienter Hemmung von CD18-vermittelter Adhärenz von Leukocyten als auf Depletion von CD18 positiven Zellen. Demgemäss ist die Unfähigkeit des humanisierten Antikörpers humanes Komplement auf CD18 positiven Zellen zu fixieren ein Vorteil, da es vermuten lässt, dass der Antikörper in vivo nicht unter Verwen dung von Komplement depletiert wird, jedoch als ein blockierender Antikörper fun- gieren wird.
FACS-Analyse
Ein CD18 positiver T-Zellklon (MF14) wurde zur Bestimmung der Bindung von humanisiertem Antikörper im Vergleich mit Antikörper der Ratte verwendet. Zellen wurden mit Antikörper der Ratte oder humanisiertem Antikörper 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nichtgebundener Antikörper wurde durch Waschen entfernt und der Sekundärantikörper wurde zugegeben (d.h. Antikörper der Ratte wurde zu mit humanisiertem Antikörper präinkubierten Zellen zugegeben und umgekehrt) und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden zur Entfernung von nichtgebundenem Antikörper gewaschen und ein FITC-markierter anti-Mensch oder anti-Ratte Antikörper wurde zugefügt. Nichtgebundene Markierung wurde durch Waschen entfernt, und die Zellen wurden durch ein Becton-Dickenson FACSan analysiert. Präinkubation von MF14 Zellen mit 10 μg/m1 YFC51.1.1 Antikörper blockierte vollständig die Bindung von 0,1 μg/ml humanisiertem Antikörper. In dem reziproken Experiment blockierte eine Präinkubation mit 10 μg/ml humanisiertem Antikörper vollständig die Bindung von 0,1 g/ml YFC51.1.1. In beiden Fällen führte eine Verwendung von 1,0 und 0,1 μg/m1 des ersten Antikörpers zu einer Titration der Blockierung.
SEQUENZLISTE

Claims

Ein humanisierter Antikörper oder Fragment davon, umfassend eine variable Region der leichten Kette und eine variable Region der schweren Kette, worin die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRl, CDR2 und CDR3) der variablen Region der leichten Kette und die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) der variablen Region der schweren Kette die folgenden Aminosäure-Sequenzen besitzen: leichte Kette: CDR1 (SEQ ID NR: 4) CDR2 (SEQ ID NR: 6) CDR3 (SEQ ID NR: 8) schwere Kette: CDR1 (SEQ ID NR: 12) CDR2 (SEQ ID NR: 14) CDR3 (SEQ ID NR: 16)

worin besagter humanisierter Antikörper oder Fragment an humanes CD18 Antigen spezifisch bindet.
Ein Antikörper oder Fragment wie in Anspruch 1 beansprucht, in dem das Gerüst der variablen Domäne der leichten Kette das Gerüst der variablen Domäne der leichten Kette des Proteins REI ist.
Ein Antikörper oder Fragment wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, in dem das Gerüst der variablen Domäne der schweren Kette das Gerüst der variablen Domäne der schweren Kette des Proteins NEWM ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines wie in einem der Ansprüche 1, 2 und 3 beanspruchten humanisierten Antikörpers oder Fragments, wobei das Verfahren Bereitstellen eines Wirts umfasst, der entweder mit (i) einem ersten Expressionsvektor, der die leichte Kette des humanisierten Antikörpers oder Fragments codiert, und einem zweiten Expressionsvektor, der die schwere Kette des humanisierten Antikörpers oder Fragments codiert; oder (ii) einem einzigen Expressionsvektor, der sowohl die leichte Kette als auch die schwere Kette des humanisierten Antikörpers oder Fragments codiert, transformiert ist; und Halten besagten Wirts unter Bedingungen, so dass jede Kette exprimiert wird, und Isolieren des humanisierten Antikörpers oder Fragments, der/das durch Zusammenfügen der demgemäß exprimierten Ketten gebildet ist.
Ein DNA-Molekül, das die Aminosäure-Sequenz eines humanisierten Antikörpers oder Fragments davon codiert, umfassend eine variable Region der leichten Kette und eine variable Region der schweren Kette, worin die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) der variablen Region der leichten Kette und die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3) der variablen Region der schweren Kette die folgenden Aminosäure-Sequenzen besitzen: leichte Kette: CDR1 (SEQ ID NR: 4) CDR2 (SEQ ID NR: 6) CDR3 (SEQ ID NR: 8) schwere Kette: CDR1 (SEQ ID NR: 12) CDR2 (SEQ ID NR: 14) CDR3 (SEQ ID NR: 16)

worin besagter humanisierter Antikörper oder Fragment an humanes CD18 Antigen spezifisch bindet.
Ein DNA-Molekül wie in Anspruch 5 beansprucht, in dem das Gerüst der variablen Domäne der leichten Kette das Gerüst der variablen Domäne der leichten Kette des Proteins REI ist.
Ein DNA-Molekül wie in Anspruch 5 oder 6 beansprucht, in dem das Gerüst der variablen Domäne der schweren Kette das Gerüst der variablen Domäne der schweren Kette des Proteins NEWM ist.
Ein DNA-Molekül wie in einem der Ansprüche 5, 6 und 7 beansprucht in Form eines Expressionsvektors.
Ein Wirt, der mit einem wie in Anspruch 8 beanspruchten Expressionsvektor transformiert ist.
Ein DNA-Molekül, das die leichte Kette eines wie in einem der Ansprüche 1, 2 und 3 beanspruchten Antikörpers oder Fragments codiert.
Ein DIVA-Molekül wie in Anspruch 10 beansprucht, worin die Nucleotid-Sequenzen der CDRs der leichten Kette die folgenden sind: CDRl (SEQ ID NR: 3) CDR2 (SEQ ID NR: 5) CDR3 (SEQ ID NR: 7).
Ein DNA-Molekül, das die schwere Kette eines wie in einem der Ansprüche 1, 2 und 3 beanspruchten Antikörpers oder Fragments codiert.
Ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 12, worin die Nucleotid-Sequenzen der CDRs der schwere Ketten die folgenden sind: CDRl (SEQ ID NR: 11) CDR2 (SEQ ID NR: 13) CDR2 (SEQ ID NR: 15).
Eine Wirtszelle, umfassend ein rekombinantes Expressionssystem, das die leichte und schwere Kette eines wie in einem der Ansprüche 1, 2 und 3 beanspruchten Antikörpers oder Fragments codiert.
Ein Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Antikörpers oder Fragments davon, umfassend Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 14 und Wiedergewinnen besagten Antikörpers oder Fragments.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 15, zusätzlich umfassend Reinigen des Antikörpers oder Fragments.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel und als Wirkstoff einen wie in einem der Ansprüche 1, 2 und 3 beanspruchten humanisierten Antikörper oder Fragment.
Ein wie in einem der Ansprüche 1, 2 und 3 beanspruchter humanisierter Antikörper oder Fragment zur therapeutischen oder prophylaktischen Anwendung.
Ein wie in einem der Ansprüche 1, 2 und 3 beanspruchter humanisierter Antikörper oder Fragment zur Verwendung bei Behandlung eines Patienten, der an einer Leukocyten vermittelten Erkrankung oder Zustand leidet oder in Gefahr ist, eine derartige Erkrankung oder Zustand zu bekommen.
Verwendung eines wie in einem der Ansprüche 1, 2 und 3 beanspruchten humanisierten Antikörpers oder Fragments zur Herstellung eines Medikaments zur Anwendung bei Behandlung eines Patienten, der an einer Leukocyten vermittelten Erkrankung oder Zustand leidet oder in Gefahr ist, eine derartige Erkrankung oder Zustand zu bekommen.