DE4314556A1 - Modifizierte Antikörperenzymkonjugate und Fusionsproteine sowie ihre Anwendung zur tumorselektiven Therapie - Google Patents

Modifizierte Antikörperenzymkonjugate und Fusionsproteine sowie ihre Anwendung zur tumorselektiven Therapie

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DE4314556A1
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Description

Die Erfindung betrifft Fusionsproteine und Antikörperenzymkon­ jugate, an welche Zuckermoleküle kovalent gebunden werden (1) und/oder schon gebundene Zuckermoleküle durch An- oder Abbau von Kohlenhydratbestandteilen modifiziert werden (2). Die betroffenen Fusionsproteine und Antikörperenzymkonjugate besitzen eine an Tumoren bindende Komponente sowie eine Komponente mit enzymatischer Aktivität, durch die ein nicht­ toxisches "Prodrug" in ein toxisches "Drug" gespalten wird. Die genannten modifizierten Fusionsproteine und Antikörperen­ zymkonjugate (1) und (2) werden durch chemische oder enzyma­ tische Glykosilierung gewonnen, wobei die Umsetzung mit monomeren Zuckern wie Galaktose bevorzugt ist. Bei partiellem Abbau von Verbindungen (2) ist die Umsetzung mit Neuraminidase bevorzugt.
Bei der Bekämpfung von Tumoren wurden in den letzten 20 Jahren eine Reihe von Versuchen unternommen, basierend auf der Spezifität von Antikörpern selektive therapeutische Effekte zu erzielen. Bahnbrechende therapeutische Erfolge wurden bei soliden Tumoren allerdings noch nicht erzielt. Dieser fehlende Durchbruch ist, obwohl hochspezifische tumorselektive monoklo­ nale Antikörper verfügbar sind, hauptsächlich durch die geringe Menge an in soliden Tumoren lokalisierbaren monoklona­ len Antikörpermolekülen bedingt. Ursache für diese für thera­ peutische Zwecke kaum ausreichende Lokalisation sind u. a. im Tumor vorhandene Diffusionsbarrieren (Jain, K.R., Cancer Res. 47, 3039, 1987). Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden Konzepte entwickelt, bei denen auch mit geringeren Mengen selektiv am Tumor Iokalisierter Moleküle therapeutische Effekte erzielbar sind.
Das erfolgversprechendste Prinzip besteht darin, daß im 1. Behandlungsschritt ein nicht toxisches Antikörperenzymkonjugat oder Fusionsprotein, das aus einer tumorbindenden Komponente und einem Enzym besteht (wobei das Enzym ein nicht-toxisches "Prodrug" in ein toxisches "Drug" spalten kann), i.v. in Tumorpatienten appliziert wird. Im folgenden werden diese Fusionsproteine und die Antikörperkonjugate FUP bzw. AEK genannt. Nach Eliminierung der FUP bzw. AEK aus dem Plasma und den Normalgeweben bei fortwährender Bindung am Tumor wird in einem 2. Schritt eine ebenfalls untoxische hydrophile Prodrug, die sich extrazellulär verteilt, in hoher Konzentration i.v. appliziert. Durch das am Tumor selektiv extrazellulär lokali­ sierte FUP oder AEK wird die Prodrug zur toxischen lipophilen Drug gespalten.
Dieses Konzept, welches die Spezifität eines monoklonalen Antikörpers bzw. tumorbindenden Fusionspartners, das kataly­ tische Amplifikationspotential eines Enzyms und den zytotoxi­ schen Effekt von Zytostatika nutzen möchte, ist mit einer Vielzahl technischer Schwierigkeiten behaftet.
  • - Herkömmliche AEK sind, da sie chemische Konjugate aus in der Regel Mausantikörpern und xenogenen Enzymen darstel­ len, im Menschen hoch immunogen. Eine wiederholte Anwen­ dung des gleichen Antikörperenzymkonjugates an demselben Patienten wird hierdurch vereitelt (Bagshawe et al., 1991, Disease Markers, 9, 233-238).
  • - Die AEK werden nur relativ langsam aus dem Plasma ausge­ schieden, so daß eine selektive und effektive Prodrugakti­ vierung nur nach z. B. Injektion eines galaktosilierten anti Enzym-MAk, als Halbwertzeit-verkürzendes und Enzymaktivität-blockierendes Reagenz möglich ist (Sharma et al., Brit. J. Cancer 61, 659, 1990).
Das oben erwähnte Problem der Immunogenität xenogener Anti­ körperenzymkonjugate wurde in der vorliegenden Anmeldung durch die Verwendung eines rekombinanten Fusionsproteins, welches aus rein humanen Komponenten besteht, weitgehend gelöst. Einzelheiten sind in der Europäischen Patentanmeldung EP-A-0 501 215 beschrieben. Dort sind beispielhaft Fusionsproteine der allgemeinen Formel huTuMAk-L-β-Gluc beschrieben, wobei huTuMAk ein humanisierter oder humaner tumorspezifischer monoklonaler Antikörper oder ein noch an den Tumor bindender Teil davon ist, L einen Linker darstellt und β-Gluc humane β- Glucuronidase bedeutet.
Im Verlauf der pharmakologischen Prüfung eines o.g. Fusions­ proteins wurde unerwarteterweise gefunden, daß schon sehr kurze Zeiträume (1-3 Minuten) nach i.v. Injektion des Fusions­ proteins in humantumor-tragende Nacktmäuse signifikante Mengen des Fusionsproteins an Tumorzellen in Bereichen nahe der Blutgefäße (leicht zugängliche Stellen = "easily accessible sites" = EAS) gebunden sind. Allerdings befinden sich zu diesen frühen Zeitpunkten noch große Mengen des Fusions­ proteins im Plasma, so daß eine selektive und wirkungsvolle Aktivierung einer geeigneten Prodrug im Tumor zu diesem frühen Zeitpunkt nach Injektion nicht möglich ist.
Es ist nun überraschenderweise gelungen, durch z. B. Galak­ tosilierung bzw. durch Abspalten endständiger Zucker, d. h. vorzugsweise Neuraminidase-Behandlung des Fusionsproteins die Halbwertzeit im Plasma so zu verkürzen, daß das so modi­ fizierte Fusionsprotein unter Erhalt seiner Spezifität, Avidität und enzymatischen Aktivität weiterhin innerhalb kürzester Zeit an die EAS bindet und nach 1-3 Stunden soweit aus dem Plasma ausgeschieden ist, daß eine effiziente, tumor­ selektive Aktivierung einer geeigneten Prodrug ohne Injektion eines elimierenden 2. Antikörpers (Sharma et al., Brit. J. Cancer 61, 659-662, 1990) wirkungsvoll ermöglicht wird. Des weiteren ist es gelungen, durch Hinzumischen von z. B. Galakto­ se zu dem galaktosilierten Fusionsprotein eine noch effizien­ tere Tumorlokalisation zu erreichen. Diese Beobachtungen konnten erfolgreich auf galaktosilierte bzw. auf mit Neurami­ nidase behandelte weitere Fusionsproteine und Antikörperenzym­ konjugate unter Beibehaltung ihrer biologischen Eigenschaften im erfindungsgemäßen Sinne ausgedehnt werden.
Die Allgemeingültigkeit der Erfindung wurde an vier Beispielen unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung, nämlich einem xenogenen Antikörperenzymkonjugat, einem humanisierten Zwei­ ketten-Fusionsprotein, einem humanisierten Einketten-Fusions­ protein und einem xenogenen Einketten-Fusionsprotein belegt und erstreckt sich auch auf Antikörperfragmentenzymkonjugate sowie sFv-Enzymkonjugate und Ligandenzymkonjugate.
Ein repräsentatives Antikörperenzymkonjugat besteht aus einem intakten monoklonalen Antikörper von der Maus (z. B. MAk aus EP-A-0 388 914), welcher mittels eines heterobispezifischen Reagenzes chemisch mit der Glucuronidase aus E. coli entspre­ chend der Methode von Haisma et al. (Br. J. Cancer 66, 474-478, 1992) bzw. Wang et al. (Cancer Res. 52, 4484-4491, 1992) auf Proteinebene verknüpft wurde. Weitere Verknüpfungsmöglich­ keiten, die ebenfalls zu funktionsfähigen Antikörperenzymkon­ jugaten führen können, wurden von Means und Feeney (Bioconju­ gate Chem. 1, 2-12, 1990) zusammengefaßt.
Ein humanisiertes Zweiketten-Fusionsprotein ist detailliert in der EP-A-0 501 215 beschrieben. Es ist ein gentechnisch her­ gestelltes, aus 2 Polypeptidketten bestehendes Protein. Eine Kette wurde durch Verknüpfung der Nukleotidsequenzen, die für eine humanisierte VHCH1 Hinge S Region kodieren, mit der Nukleotidsequenz, die für eine humane β-Glucuronidase kodiert, hergestellt (S = Polypeptid Spacer). Die Nukleotidsequenz, die für die humanisierte VLCL Kette kodiert, erzeugt zusammen mit der oben erwähnten Nukleotidsequenz nach Transfektion und Expression in geeigneten Expressionssystemen, vorzugsweise BHK oder CHO Zellen, das humanisierte Zweiketten-Fusionsprotein.
Das humanisierte Einketten-Fusionsprotein wurde durch Ver­ knüpfung der Nukleotidsequenzen, die für die humanisierte VH S VL Hinge S Region (single chain Fv, sFv) kodieren, und der Nukleotidsequenz, welche für die humane β-Glucuronidase ko­ diert, nach Expression in geeigneten Expressionssystemen, vorzugsweise in BHK-Zellen oder CHO Zellen erzeugt. Die Konstruktion eines repräsentativen humanisierten Einketten-Fu­ sionsproteins wird in den Beispielen 1-4 beschrieben. Ein xenogenes Einketten-Fusionsprotein ist in Beispiel 5 beschrie­ ben.
Die nachstehend in den Beispielen beschriebenen Konstrukte können nach Umklonierung in geeignete Vektoren auch in anderen Expressionssystemen, wie z. B. E. coli, Saccharomyces cerevi­ siae und Hansenula polymorpha, Insektenzellen oder auch trans­ genen Tieren exprimiert werden.
Diese beispielhaft beschriebenen Proteine (Antikörperenzymkon­ jugat, humanisiertes Zweiketten-Fusionsprotein, humanisiertes Einketten-Fusionsprotein, xenogenes Einketten-Fusionsprotein) wurden nach der von Krantz et al. (Biochemistry 15, 3963-3968, 1976) beschriebenen Methode chemisch galaktosiliert bzw. alternativ mit trägergebundener Neuraminidase behandelt, nachdem sie über anti-Idiotyp und/oder anti-β-Glucuronidase Immunaffinitätschromatographie gereinigt wurden. Sie werden im folgenden modifizierte Proteine genannt.
Die modifizierten Proteine wurden in vitro und in vivo im Ver­ gleich zu den unmodifizierten Ausgangsproteinen getestet. Die benutzten Spezifitäts-, Affinitäts- und quantitativen Immun­ reaktivitäts- und Enzymaktivitätstests zeigten, daß die modifizierten Proteine in den oben erwähnten in vitro Tests sich nicht signifikant von den Ausgangsproteinen unterschie­ den. Im Gegensatz hierzu war die Plasmahalbwertszeit (t1/2β) in Maus und Ratte (in vivo) bei den modifizierten Proteinen dramatisch verkürzt. Diese dramatische Verkürzung der t1/2β führte bei i.v. Injektion der galaktosilierten Proteine in tumortragenden nackten Mäusen schon nach 1-3 Stunden zu nicht mehr nachweisbaren Konzentrationen an modifizierten Proteinen im Plasma. Im Falle der desialylierten Proteine war die t1/2β derart verkürzt, daß nach 48 Stunden nicht mehr nachweisbare Konzentrationen an desialyliertem Protein im Plasma nachweis­ bar waren. Zum gleichen Zeitpunkt lag die Konzentration funk­ tionell aktiver modifizierter Proteine im Tumor im Bereich von 200-400 ng/g Tumor (bei Injektion von ≈ 400 µg modifiziertem Protein pro Maus ergab sich folglich ein sehr hohes Spezifi­ tätsverhältnis < 100 : 1). Absolut gesehen können die Konzen­ trationen an modifizierten Proteinen um zwei- bis dreimal höher liegen als die, welche bei einem vergleichbaren Spezi­ fitätsverhältnis mit unmodifizierten Ausgangsproteinen in vivo nach wesentlich längeren Zeiträumen erreicht werden. Weiterhin wird das oben erwähnte hohe Spezifitätsverhältnis (µg modifi­ ziertes Protein/g Tumor : µg modifiziertes Protein/g Normal­ gewebe) im Falle der modifizierten Proteine schon nach wenigen Stunden erreicht (1-3 Stunden bzw. 48 Stunden), wohingegen ein vergleichbares Spezifitätsverhältnis (µg unmodifiziertes Ausgangsprotein/g Tumor : µg unmodifiziertes Ausgangsprotein/g Normalgewebe) im Falle der unmodifizierten Ausgangsproteine erst nach mehreren Tagen (≈ 7-8 Tage) erreicht wird oder sogar der Verwendung eines 2. Antikörpers zur beschleunigten Clearance aus Normalgewebe bedarf. Die schnelle Entfernung der modifizierten Proteine aus dem Plasma und dem extrazellulären Bereich des Organismus durch Internalisation über Zucker-bin­ dende Rezeptoren (hauptsächlich den Galaktoserezeptor in der Leber, Thornburg et al., J. Biol. Chem. 255, 6820, 1980) sollte auch zu einer reduzierten Immunogenität der modifizier­ ten Proteine vor allem aber des Antikörperenzymkonjugates und des xenogenen Einketten-Fusionsproteins im Menschen führen. Dies erleichtert also auch den Einsatz von xenogenen oder humanisierten Fusionsproteinen in der Anti-Tumor-Therapie bzw. macht einen solchen Einsatz überhaupt erst sinnvoll.
Beispiel 1-4 Gentechnische Herstellung eines humanisierten Einketten-Fusionsproteins aus einem humani­ sierten Tumorantikörperteil und humaner β-Glucuronidase Beispiel 1
Mit den Oligonukleotiden pAB-Back und Linker-Anti (Tab. 1) wird aus pABstop 431/26 hum VH das VH-Gen einschließlich der VH-Gen eigenen Signalsequenz herausamplifiziert (Güssow und Seemann, 1991, Meth. Enzymology, 203, 99-121). Mit den Oligo­ nukleotiden Linker-Sense und VL(Mut)-For (Tab. 2) wird aus pABstop 431/26 hum VL (Güssow und Seemann, 1991, Meth. Enzy­ mology, 203, 99-121) das VLGen herausamplifiziert (Fig. 1).
Tabelle 1
Tabelle 2
Beispiel 2
Die Oligonukleotide Linker-Anti und Linker-Sense sind partiell komplementär zueinander und codieren einen Polypeptid-Linker, der die VH- und VL-Domäne zu einem sFv-Fragment verknüpfen soll. Um die amplifizierten VH mit den VL-Fragmenten zu fusionieren, werden sie gereinigt und in einer 10 Zyklen Reaktion wie folgt eingesetzt:
H₂O|37.5 µl
dNTPs (2.5 mM) 5.0 µl
PCR-Puffer (10×) 5.0 µl
Taq-Polymerase (Perkin-Elmer Corp., Emmeryville, CA) (2.5 U/µl) 0.5 µl
0.5 µg/µl DNA des VL-Frag. 1.0 µl
0.5 µg/µl DNA des VH-Frag. 1.0 µl
PCR-Puffer (10×): 100 mM Tris, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 m MgCl₂, 0.1% (w/v) Gelatine.
Die Oberfläche des Reaktionsgemisches wird mit Paraffin ver­ siegelt und anschließend die 10 Zyklen Reaktion in einer PCR-Apparatur mit dem Programm 94°C, 1 min; 55°C, 1 min; 72° C, 2 min, durchgeführt. Danach werden 2,5 pM der flankierenden Primer pAB-Back und VL(Mut)-For zugegeben und weitere 20 Zyklen durchgeführt. Man erhält ein PCR-Fragment, das aus dem VH-Gen besteht, welches über einen Linker mit dem VL-Gen verbunden ist (Fig. 4). Vor dem VH-Gen befindet sich noch die VH-Gen eigene Signalsequenz. Durch das Oligonukleotid VL(Mut)- For wird gleichzeitig die letzte Nukleotidbase des VL-Gens, ein C, gegen ein G ausgetauscht. Dieses PCR-Fragment codiert für einen humanisierten Single-Chain-Fv (sFv).
Beispiel 3
Das sFv-Fragment aus Beispiel 2 wird mit HindIII und BamHI geschnitten und in den mit HindIII vollständig und mit BglII partiell gespaltenen Vektor pABstop 431/26VHhußGluc1H ligiert. Der Vektor pABstop 431/26VHhußGluc1H enthält ein VH-Exon, ein­ schließlich der VH-eigenen Signalsequenz, gefolgt von einem CH1-Exon, dem Hinge-Exon eines humanen IgG3 C-Gens und der vollständigen cDNA der humanen β-Glucuronidase. Es wird der Plasmidklon pMCG-E1 isoliert, der den humanisierten sFv 431/26, ein Hinge-Exon und die vollständige β-Glucuronidase enthält (Fig. 3a, b). Vektor pABstop 431/26VHhußGluc ist in K. Bosslet et al., Br. J. Cancer (1992), 65, 234-238 beschrieben, wo auch die restlichen einzelnen Bestandteile in den dort aufgeführten Zitaten entnehmbar sind.
Beispiel 4
Der Klon pMCG-E1 wird zusammen mit dem Plasmid pRMH 140 (Fig. 4), das ein Neomycin-Resistenzgen trägt und dem Plasmid pSV2 (Fig. 5), das ein Methotrexat-Resistenzgen trägt, in BHK Zellen transfiziert. Daraufhin wird von den BHK Zellen ein Fusionsprotein ausgeprägt, das sowohl die Antigenbindungsei­ genschaften des MAk BW 431/26hum als auch die enzymatische Aktivität der humanen β-Glucuronidase hat (siehe Beispiele 8 und 9).
Beispiel 5 Konstruktion eines xenogenen Einketten-Fusions­ proteins
Das xenogene Einketten-Fusionsprotein wurde durch Verknüpfung der Nukleotidsequenzen, die für die humanisierten VH S VL Hinge S Regionen kodieren (siehe Beispiel 1-4 bzw. infra), und der Nukleotidsequenz, welche für die β-Glucuronidase aus E. coli kodiert, nach Expression in geeigneten Expressions­ systemen, vorzugsweise in BHK-Zellen, erzeugt.
Die Konstruktion eines Einketten-Fusionsproteins aus einem humanisierten sFv (anti CEA) und der E. coli β-Glucuronidase wird im folgenden detailliert beschrieben.
Das sFv 431/26-Fragment (a) wird für eine PCR mit den Oligos pAB-Back (Tab. 1) und sFv-For (Tab. 3) als Template benutzt. Dadurch wird am 3′-Ende des neu generierten sFv 431/26-Frag­ mentes (b) eine BglII- und eine HindIII-Schnittstelle einge­ führt.
Das PCR-Fragment wird gereinigt, mit HindIII verdaut und in einen pUC18-Vektor ligiert, der mit HindIII geschnitten und mit alkalischer Phosphatase behandelt wurde. Es wird der Plasmidklon pKBO1 isoliert, der das sFv-Fragment mit der BglII-Schnittstelle enthält (Fig. 6).
Das für die E. coli-β-Glucuronidase codierende Gen wird über PCR mit den Oligos E. coli-β-Gluc-Back1 (Tab. 4) und E.coli-β- Gluc.-For (Tab. 5) aus dem Vektor pRAJ260 (Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8447, 1986) herausamplifiziert und gleichzeitig am 5′ Ende mit einer BglII-Schnittstelle, am 3′ Ende mit einer XbaI-Schnittstelle und zusätzlich am 5′-Ende mit einer für einen Linker codierenden Sequenz versehen. Das entstehende Fragment wird gereinigt, mit BglII/ XbaI verdaut und in den ebenfalls mit BglII/XbaI verdauten Vektor pKBO1 kloniert. Es wird der Plasmidklon pKBO2 isoliert, der den über eine Linkersequenz mit der E. coli-β-Glucuronidase verknüpften sFv 431/26 enthält (Fig. 7).
Das aus dem Vektor pKBO2 durch einen HindIII/XbaI-Verdau erhaltene sFv-E. coli-β-Gluc. -Fragment wird gereinigt und in den ebenfalls mit HindIII/XbaI geschnittenen Expressionsvektor pABstop (Zettlmeißl et al. Behring Institute Mitteilungen 82, 26-34, 1988) ligiert. Es wird der Plasmidklon pKBO3 isoliert, der den humanisierten sFV 431/26, einen Linker und die voll­ ständige E. coli-β-Glucuronidase enthält (Fig. 8).
Tabelle 3
Tabelle 4
Tabelle 5
Tabelle 6a
Pharmakokinetikvergleich zwischen unmodifizierten humanisierten Zweiketten - Fusionsproteinen in Humantumor - Xenograft (MzSto1) tragenden CD-1 Nacktmäusen
Tabelle 6b
Pharmakokinetikvergleich zwischen unmodifizierten humanisierten Zweiketten - Fusionsproteinen in Humantumor - Xenograft (MzSto1) tragenden CD-1 Nacktmäusen
Tabelle 7
Pharmakokinetikvergleich zwischen unmodifizierten humanisierten Zweiketten - Fusionsproteinen in Humantumor - Xenograft (Lovo) tragenden CD-1 Nacktmäusen
Beispiel 6 Galaktosilierung des Zweiketten-Fusionsproteins
Die Galaktosilierung des Fusionsproteins wurde gemäß einer Modifikation der Methode von Mattes (J. Natl. Cancer Inst., 79 (4), 855-863, 1987) durchgeführt:
Cyanomethyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (Sigma; 250 mg) wurde in getrocknetem Methanol (Merck; 6.25 ml) gelöst und 625 µl einer methanolischen Natriummethanolat­ lösung (5.4 mg/ml) zupipettiert. Nach 48 h Inkubation bei R.T. wurde ein Aliguot von 5 ml des aktivierten Galaktosederivates entnommen und im Stickstoffstrom das Methanol abgedampft. Zum verbleibenden Rückstand wurden 100 ml einer Fusionsproteinlö­ sung (1 mg/ml in 0.25 M Natriumboratpuffer, pH 8.5) gegeben und 24 h bei R.T. inkubiert. Anschließend folgte eine Dialyse über Nacht gegen PBS.
In analoger Weise erfolgte die Galaktosilierung der prä­ formierten BW 431/26-E. coli β-Glucuronidase Konjugate bzw. des monoklonalen Antikörpers BW 431/26.
Beispiel 7 Aufarbeitung von Organen/Tumoren zur Fusions­ proteinbestimmung
Folgende sequentielle Schritte wurden durchgeführt:
  • - mit Fusionsprotein bzw. Antikörperenzymkonjugat behandelte Nacktmäuse (CD1), die einen subkutanen Tumor haben, werden retroorbital entblutet und dann getötet
  • - das Blut wird sofort in ein Eppendorfgefäß gegeben, in dem sich schon 10 µl Liquemin 25000 (Fa. Hoffman-LaRoche AG) befindet
  • - dann wird 10 min bei 2500 U/min in einer Zentrifuge (Megafuge 1.0, Fa. Heraeus) zentrifugiert
  • - danach wird das Plasma gewonnen und bis zur Testung eingefroren
  • - die Organe bzw. der Tumor werden entnommen und gewogen
  • - dann werden sie mit 2 ml 1% BSA in PBS, pH 7.2, voll­ ständig homogenisiert
  • - die Tumorhomogenate werden mit 0.1 N HCl auf pH 4.2 eingestellt (die Probe darf nicht übertitriert werden, da die β-Glucuronidase bei pH < 3.8 inaktiviert wird!)
  • - alle Homogenate werden 30 min bei 16000 g zentrifugiert
  • - der klare Überstand wird abgenommen
  • - die Tumorüberstände werden mit 0.1 N NaOH neutralisiert
  • - die Überstände und das Plasma können nun im OEAT (mißt Fusionsproteinkonzentration) oder EAT (mißt β-Glucuronida­ sekonzentration) getestet werden.
Beispiel 8 OEAT (Organ-Enzymaktivitätstest)
Die Testung läuft folgendermaßen ab:
  • - pro Loch einer Mikrotitrationsplatte (Polystyrol U-Form, Typ B, Fa. Nunc, Best.Nr. 4-60445) werden 75 µl eines 1 : 300 in PBS, pH 7.2, verdünnten Ziege-anti-human-kappa- Antikörpers (Fa. Southern Biotechnology Associates, Best.Nr. 2060-01) gegeben
  • - die Mikrotitrationsplatten werden abgedeckt und über Nacht bei R.T. inkubiert
  • - anschließend werden die Mikrotitrationsplatten 3mal mit 250 µl 0.05 M Tris-Citrat-Puffer, pH 7.4, pro Loch ge­ waschen
  • - diese so beschichteten Mikrotitrationsplatten werden pro Loch mit je 250 µl Blocklösung (1% Casein in PBS, pH 7.2) für 30′ bei R.T. inkubiert (Blockierung unspezifischer Bindungsstellen) (nicht benötigte beschichtete Mikrotitrationsplatten werden 24 Stunden bei R.T. getrocknet und dann zusammen mit Trockenpatronen zur Langzeitlagerung in beschichtete Aluminiumbeutel eingeschweißt)
  • - während der Blockierung wird das Substrat angesetzt (für jeden Test frisches Substrat: 2.5 mM 4-Methylumbelliferyl β-D-glucuronid, Best.Nr.: M-9130, Fa. Sigma, in 200 mM Na-Acetat + 0.01% BSA, pH 4.5)
  • - danach werden in einer unbehandelten 96 Loch U-Boden Mikrotiterplatte (Polystyrol, Fa. Renner, Best. Nr. 12058) 10 Proben + 1 Positivkontrolle + 1 Negativkontrolle in 1% Casein in PBS, pH 7.2, 1 : 2 in 8 Stufen ausverdünnt (ausgehend von 150 µl Probe werden 75 µl Probe in 75 µl Casein-Vorlage pipettiert usw.)
  • - die Blocklösung wird von der mit anti-human-kappa-Antikör­ per beschichteten Mikrotitrationsplatte abgesaugt, 50 µl der verdünnten Proben werden pro Loch von der Verdünnungs­ platte auf die Testplatte übertragen und 30 min bei R.T. inkubiert
  • - die Testplatte wird 3mal mit ELISA Waschpuffer (Behring­ werke, Best.Nr. OSEW96) gewaschen
  • - pro Loch werden 50 µl Substrat aufgetragen, die Test­ platten abgedeckt und 2 h bei 37°C inkubiert
  • - danach wird zu jedem Loch 150 µl Stopplösung (0.2 M Glycin + 0.2% SDS, pH 11.7) hinzugegeben
  • - die fluorometrische Auswertung erfolgt im Fluoroscan II (ICN-Biomedicals, Kat.Nr. 78-611-00) bei einer Anregungs­ wellenlänge von 355 nm und einer Austrahlungswellenlänge von 460 nm
  • - anhand der Fluoreszenzwerte der im identischen Experiment mitgeführten Positivkontrolle (Verdünnungsreihe mit gereinigtem Fusionsprotein als Eichkurve) wird die unbekannte Konzentration von Fusionsprotein in der Probe bestimmt.
Beispiel 9 EAT (Enzymaktivitätstest)
Der Test wird folgendermaßen durchgeführt:
  • - In einer 96 Loch Mikrotestplatte (Polystyrol, Fa. Renner, Best.Nr. 12058) werden 10 Proben + 1 Positivkontrolle + 1 Negativkontrolle 1 : 2 in 8 Verdünnungsstufen in 1% Casein in PBS, pH 7.2, ausverdünnt, so daß in jedem Loch 50 µl Proben enthalten sind
  • - zu jedem Loch werden 50 µl Substrat (2.5 mM 4-Methylumbel­ liferyl β-D-glucuronid (Fa. Sigma, Best. Nr. M-9130, in 200 mM Na-Acetat + 0.01% BSA, pH 4.5) gegeben
  • - die Mikrotestplatte wird abgedeckt und 2 h bei 37°C inkubiert
  • - danach werden 150 µl Stopplösung (0.2 M Glycin + 0.2% SDS, pH 11.7) pro Loch hinzugegeben
  • - die fluorometrische Auswertung erfolgt im Fluoroscan II (ICN-Biomedicals, Kat.Nr. 78-611-00) bei einer Anregungs­ wellenlänge von 355 nm und einer Ausstrahlungswellenlänge von 460 nm
  • - anhand der mitgeführten Positivkontrolle (Verdünnungsreihe mit gereinigtem Fusionsprotein als Eichkurve) kann nun die Probenkonzentration berechnet werden
Beispiel 10 Desialylierung des Zweiketten-Fusions­ proteins
Die Desialylierung des Zweiketten-Fusionsproteins erfolgte analog zu Murray, G.J. (Methods in Enzymology 149, 25-42, 1987). 8 Units an Agarose gekoppelte Neuraminidase (Sigma, Typ X-A von Clostridium perfringens) wurde 3× mit 40 ml 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 5, gewaschen und als 1 : 1 Suspension aufgenommen. Zu dieser Suspension wurden 100 ml Zweiketten- Fusionsprotein (1 mg/ml in Natriumacetatpuffer, pH 5) gegeben und 4 h bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Die immobilisierte Neuraminidase wurde durch Abzentrifugieren entfernt und das Fusionsprotein über Nacht gegen PBS dialy­ siert.
Beispiel 11 Nachweis der schnellen Eliminierung von modifiziertem Fusionsprotein
100 mg humanisiertes Zweiketten-Fusionsprotein wurde, wie in EP-A-0 501 215, Seite 10-11 beschrieben, aus BHK-Transfektom­ überständen gereinigt. Das gereinigte Fusionsprotein wurde, wie in den vorausgehenden Beispielen beschrieben, galaktosi­ liert bzw. desialyliert.
Von dem so erhaltenen modifizierten Protein, hier dem galakto­ silierten humanisierten Zweiketten-Fusionsprotein, wurden 400 µg i.v. in nackte Mäuse injiziert, die 10 Tage zuvor mit je 10⁶ CEA-exprimierenden humanen Magenkarzinomzellen (Mz-Sto-1) s.c. bestückt wurden. Nach unterschiedlichen Zeitintervallen wurden die Experimentaltiere getötet und die Konzentration an funktionell aktivem modifiziertem Protein im Tumor, Plasma und den Normalgeweben mittels des OEAT bzw. des EAT (siehe Bei­ spiele 7, 8, 9) bestimmt.
Als Antigenkontrolle wurden mit je 1 × 10⁶ CEA-negativen humanen Tumoren (Oat-75) bestückte nackte Mäuse verwendet. Des weiteren wurden als Proteinkontrolle identische Mengen des humanisierten Zweiketten-Fusionsproteins (Ausgangsprotein) bzw. einer mit Festphasenneuraminidase behandelten humanisier­ ten Zweiketten-Fusionsproteinprobe (desialyliertes Protein) i.v. injiziert (siehe Beispiel 10). Die Mengen der in diesem repräsentativen Experiment in den Organen gefundenen funktionell aktiven Proteine sind in Tab. 6 und Tab. 7 ange­ geben.
Vergleichbare Ergebnisse wurden im identischen Tiermodell­ system am Beispiel eines CEA-positiven Kolonkarzinoms, am Beispiel eines CEA-positiven Rektumkarzinoms, am Beispiel eines CEA-positiven Adenokarzinoms der Lunge, am Beispiel eines CEA-positiven Pankreaskarzinoms, am Beispiel eines CEA-positiven Schilddrüsenkarzinoms, am Beispiel eines CEA- positiven Mammakarzinoms gefunden.
Unter Verwendung geeigneter untoxischer Prodrugs, z. B. den in EP-A-0 511 917 beschriebenen, die zu einem Zeitpunkt appli­ ziert werden, zu dem die modifizierten Proteine weitgehend aus dem Plasma eliminiert sind bzw. in den Normalgeweben inter­ nalisiert und degradiert sind, lassen sich gegenüber der Standardchemotherapie überlegene therapeutische Effekte erzielen. Diese Effekte können durch Zugabe großer Mengen von Galaktose zum jeweiligen modifizierten Protein, was zu einer Optimierung der Pharmakokinetik führt, noch verbessert werden.
Weitere Verbesserungen lassen sich durch Zugabe oder Vorinjek­ tion von Glukose, Phosphationen oder Metaiodobenzylguanidin zum bzw. vor dem jeweiligen modifizierten Protein nach der von Jähde et al. (Cancer Res. 52, 6209-6215, 1992) beschriebenen Methode erreichen. Diese Methode führt zu einer Absenkung des pH-Wertes im Tumor. Hieraus resultiert eine effizientere Katalyse der Prodrugs durch die in den erfindungsgemäßen modifizierten und nicht modifizierten Proteinen verwendeten Enzyme. Alternativ kann zur Absenkung des pH-Wertes im Tumor auch HCO₃⁻ eingesetzt werden (Gullino et al., J. Nat. Cancer Inst. 34, 857, 1965).
Legende zu Fig. 1
Mit den Oligonukleotiden pAB-Back und Linker-Anti (Tab. 1) wird aus pABstop 431/26 hum VH das VH-Gen einschließlich der VH-Gen eigenen Signalssequenz herausamplifiziert (Güssow und Seemann, 1991, Meth. Enzymology, 203, 99-121). Mit den Oligo­ nukleotiden Linker-Sense und VL(Mut)-For (Tab. 2) wird aus pABstop 431/26 hum VL das VL-Gen herausamplifiziert.
Legende zu Fig. 6
Das sFv 431/26-Fragment (a) wird für eine PCR mit den Oligos pAB-Back (Tab. 2) und sFv-For (Tab. 5) als Template benutzt. Dadurch wird am 3′-Ende des neu generierten sFv 431/26-Frag­ mentes (b) eine BgIII- und eine HindIII-Schnittstelle einge­ führt.
Das PCR-Fragment wird gereinigt, mit HindIII verdaut und in einen pUC18-Vektor ligiert, der mit HindIII geschnitten und mit Alkalischer-Phosphatase behandelt wurde. Es wird der Plasmidklon pKBO1 isoliert, der das sFv-Fragment mit der BgIII-Schnittstelle enthält.
Legende zu Fig. 7
Das für die E.coli-β-Glucuronidase codierende Gen wird über PCR mit den Oligos E.coli-β-Gluc-Back1 (Tab. 6) und E.coli-β- Gluc.-For (Tab. 7) aus dem Vektor pRAJ275 herausamplifiziert und gleichzeitig mit einer BgIII-Schnittstelle, einer Xbal- Schnittstelle und am 5′-Ende mit einer für einen Linker codierenden Sequenz versehen. Das entstehende Fragment wird gereinigt, mit GbIII/HindIII verdaut und in den ebenfalls mit BgIII-HindIII verdauten Vektor pKBO1 kloniert. Es wird der Plasmidklon pKBO2 isoliert, der den über eine Linkersequenz mit der E.coli-β-Glucuronidase verknüpften sFv 431/26 enthält.
Legende zu Fig. 8
Das aus dem Vektor pKBO2 durch einen HindIII-Xbal-Verdau erhaltene sFv-E.coli-β-Gluc.-Fragment wird gereinigt und in den ebenfalls mit HindIII/Xbal geschnittenen Expressionsvektor pABstop ligiert. Es wird der Plasmidklon pKBO3 isoliert, der den humanisierten sFv 431/26, einen Linker und die vollstän­ dige E.coli-β-Glucuronidase enthält.

Claims (12)

1. Fusionsprotein oder Antikörperenzymkonjugat mit der Eigen­ schaft "Prodrug" in "Drug" zu spalten sowie an Tumore zu binden, dessen Kohlenhydratgehalt chemisch oder enzyma­ tisch modifiziert ist.
2. Fusionsprotein oder Antikörperenzymkonjugat nach Anspruch 1, das chemisch oder enzymatisch glykosidiert ist.
3. Fusionsprotein oder Antikörperenzymkonjugat nach Anspruch 2, das galaktosiliert oder mannosiliert ist.
4. Fusionsprotein oder Antikörperenzymkonjugat nach Anspruch 1, dessen Kohlenhydrate chemisch oder enzymatisch teilwei­ se abgebaut sind.
5. Fusionsprotein oder Antikörperenzymkonjugat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Endo- oder Exoglyco­ sidasen oder Neuraminidasen behandelt wurde.
6. Fusionsprotein oder Antikörperenzymkonjugat nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Eigenschaft "Pro­ drug" in "Drug" zu spalten durch ein Enzym humanen oder nicht humanen Ursprungs oder einen katalytischen Antikör­ per vermittelt wird.
7. Fusionsprotein oder Antikörperenzymkonjugat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Penicillin- G-amidase, eine Penicillin-V-amidase, eine β-Lactamase, eine alkalische Phosphatase, eine Carboxypeptidase G2, eine Carboxypeptidase A, eine Cytosindeaminase, eine Nitroreduktase, eine Diaphorase, eine Arylsulfatase, eine Glycosidase, eine β-Glucosidase oder eine β-Glucuronidase ist.
8. Fusionsprotein oder Antikörperenzymkonjugat nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der tumorbindende Teil ein monoklonaler Antikörper oder Fragment davon ist, der ein Epitop auf tumorassoziierten Antigenen wie CEA, N-CAM, N-cadherin, PEM, GICA, TAG-72, TFβ, GM3, GD3, GM2, GD2, GT3, HMWMAA, pMel17, gp113 (Muc18), p53, p97, MAGE-1, gp105, erbB2, EGF-, Transferrin-R, P-glykoprotein oder einem Zytokeratin erkennt.
9. Fusionsprotein oder Antikörperenzymkonjugat nach Anspruch 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper der MAk BW 431/26 ist.
10. Fusionsproteine nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeich­ net, daß das Fusionsprotein das in EP-A-0 501 215 be­ schriebene Protein ist.
11. Arzneimittel, enthaltend ein Fusionsprotein oder Antikör­ perenzymkonjugat noch einen oder mehreren der Ansprüche 1-10.
12. Kombinationspräparat, enthaltend ein Arzneimittel nach Anspruch 10 sowie davon getrennte Agentien zur Absenkung des pH-Werts in einem zu behandelnden Tumor und/oder applizierbare Galactose.
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