JPH09506507A - Ｃａ５５．１抗原指向性結合構造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＥＣＡＣＣ寄託番号９３０８１９０１として寄託されたハイブリドーマ５５．１から得られるようなＣＡ５５．１と呼ばれる腫瘍関連抗原を認識する抗体、ここで相補性決定領域は以下の配列を持っている：ａ）重鎖：ＣＤＲ１：ＧＹＷＩＨ（配列ＩＤ番号：２７）；ＣＤＲ２：ＥＶＮＰＳＴＧＲＳＤＹＮＥＫＦＫＮ（配列ＩＤ番号：２８）；ＣＤＲ３：ＥＲＡＹＧＹＤＤＡＭＤＹ（配列ＩＤ番号：２９）；ｂ）軽鎖：ＣＤＲ１：ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡ（配列ＩＤ番号：３０）；ＣＤＲ２：ＷＡＳＴＲＴＳ（配列ＩＤ番号：３１）；ＣＤＲ３：ＫＱＳＹＴＬＲＴ（配列ＩＤ番号：３２）；またはそれらの保存的類似体。バクテリオファージＮＣＩＭＢ番号４０６３８の表面に表されるようなペプチドＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ（配列ＩＤ番号：２６）は腫瘍関連抗原ＣＡ５５．１の模倣物である。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ＣＡ５５．１抗原指向性結合構造 技術分野 本発明は癌の診断および治療に有用な新規腫瘍付随抗原（５５．１）に関する 。 背景技術 正常細胞の腫瘍細胞への形質転換は細胞表面の炭水化物の変化を伴っているこ とが確立されている。多くのそのような細胞表面炭水化物構造は抗原として働い ており、腫瘍改変構造はいわゆる腫瘍付随抗原の型を示している（Ａｌｔｅｒｅ ｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｕｍｏｕｒ Ｃｅｌｌｓ、Ｒｅａｄ ｉｎｇ、ＨａｋａｍｏｒｉおよびＭａｒｃｕｓ編、１９８８、Ａｒｔｈｕｒ Ｒ ．Ｌｉｓｓ出版）。そのような抗原は例えば、ハイブリドーマ技術を用いる単一 特異的抗体を発生させることにより開発されるであろう。モノクローナル抗体の 単離および生成のためのハイブリドーマ技術は現在十分に確立されており、Ｋｏ ｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１ ９７５）により最初に記載されたものである。 腫瘍付随抗原はヒト腫瘍疾患に関連して報告されており、例えばＣＥＡ（胎児 性癌抗原、Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１２１ ，４３９，１９６５）、ＣＡ１９．９を運んでいるＧＩＣＡ（胃腸癌抗原）、お よびＣＡ５０上のＣ２４２．２エピトープ（Ｌａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，４２，８７７−８８２，１９８８）が示されている（特に 胃腸癌腫において）。すべてのこれらの抗原は腫瘍細胞表面に存在し、血液血清 でもまた証明することができる。 癌の処置において腫瘍付随抗原を標的とするそのような抗体を使用する概念は １０年以上に渡って評価されてきた（Ｈｅｒｌｙｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０，７１７）。腫瘍の種々の化学的および 生物的物質を標的とするために抗体が使用でき、そのような複合体はインビトロ およびインビボの両方の診断における多くの方法の基礎形成に特に貢献した。癌 の治療における免疫複合体の使用もまた有望である（Ｌｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（ １９８５）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３，１７５； Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，１０９８ ）。この方法は診断的応用よりも技術的によりきびしく、そのような免疫治療法 で標的とされる腫瘍付随抗原は高度に腫瘍特異的であり、生存しているヒト組織 において有意なレベルで発現されていてはならない。特異的に腫瘍がある組織に 分布する性質とともに、腫瘍細胞それ自身における抗原の代謝的運命もまた重要 な性質である。モノクローナル抗体およびその誘導体の種々の複合体の有効性は 細胞の膜表面からの腫瘍付随抗原のインターナリゼーションの速度に依存してい ることが見いだされている。特にある種の複合体、すなわち免疫毒素は医薬とし て有効であるためには腫瘍細胞の表面からの抗原分子の迅速で連続的なインター ナリゼーションを必要としている。免疫毒素または薬剤複合体に関連する使用で は速い速度のインターナリゼーションまたはエンドサイトーシスが望まれるが、 抗体指向性酵素プロドラッグ治療または放射線治療のような他の使用においては それは必須の特性ではない。 癌の処置に有用であるには、腫瘍付随抗原は一般的に：１）腫瘍細胞の大多数 の表面上に有意なレベルで発現され（一般的に細胞当たり＞１０，０００分子） および２）生存正常組織では低レベルまたは検出されない程度で発現されていな ければならないと信じられている。 癌診断および治療において有用な別のおよび改良された腫瘍付随抗原が求めら れている。 発明の開示 本発明はＣＡ５５．１と称される（本明細書で定義されるような）腫瘍付随抗 原の発見に基づいている。本抗原は既知の腫瘍特異的抗原よりもある種の癌の免 疫治療または診断においてより優れた標的となるいくつかの性質を示している。 それは結腸直腸腫瘍の大多数で発現され、正常結腸組織では非常に弱く発現され るかまたは存在しない。さらに、細胞結合性ＣＡ５５．１に抗体が結合された後 、そのようして形成された複合体は腫瘍細胞内に速い速度でエンドサイトーシス されるかまたはインターナリゼーションを受ける。 本発明の一つの態様に従うと抗原ＣＡ５５．１を認識する相補性決定領域（Ｃ ＤＲｓ）を持つ抗原結合構造が提供され、ここで抗原は： ａ）約４８から５２ｋＤ、約５８ｋＤから７２ｋＤおよび約８８ｋＤから９２ｋ Ｄの範囲のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を持つ３つの主な化学種； ｂ）ＣＯＬＯ ２０５腫瘍細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ ２２２）の膜分画中の細 胞下の所在； ｃ）複雑なＮ−結合炭水化物構造を持っており； およびここで抗原結合構造は下記の性質の少なくとも一つをもっている： ｉ）抗原結合構造はＣＡ５５．１抗原へのモノクローナル抗体５５．１（ＥＣＡ ＣＣ番号９３８１９０１）の結合を競合的に阻害するかまたは； ｉｉ）バクテリオファージＮＣＩＭＢ番号４０６３８の表面に示されるようなペ プチドＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ（配列ＩＤ番号：２６）は１０ｐＭまたはそれ未満 の効率的な結合で抗原結合構造へ結合する（抗原結合構造で被覆された固相とイ ンキュベートした場合）または； ｉｉｉ）抗原結合構造と前もってインキュベートした場合、バクテリオファージ ＮＣＩＭＢ番号４０６３８の表面に示されるようなペプチドＡＣＥＨＲＧＳＧＷ Ｃ（配列ＩＤ番号：２６）は２００ｎＭまたはそれ未満の有効濃度でＣＯＬＯ ２０５細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ ２２２）で被覆された固相への抗原結合構造 の結合を競合的に阻害する。 精製されたＣＡ５５．１でのレクチン結合研究から、ＣＡ５５．１炭水化物は ガラクトースへα（２−６）またはα（２−３）で結合されたシアル酸残基を持 たない複合体型のＮ−結合オリゴサッカライドであることが示されている。ＣＡ ５５．１認識の試験（抗体５５．１の結合の競合的阻害）は下記の実施例７に示 されている。ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ（配列ＩＤ番号：２６）存在下での結合の測 定は実施例１４に示されている。膜分画中の細胞下所在とは、実施例７．１ａに 記載したような方法により全細胞から得られる膜分画に抗原が存在していること を意味している。 Ｍａｂ５５．１のその抗原への結合の新規アンタゴニストの探索においては、 ファージマイナーコート蛋白質ｐIIIのＮ−末端上にランダムペプチド配列を示 すＭ１３バクテリオファージのライブラリーを発生させ、ポリスチレン上に固定 したＭａｂ５５．１でスクリーニングを行った。そのようなスクリーニングの結 果、 ｐIIIのＮ−末端で配列ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ（一文字アミノ酸コード；配列Ｉ Ｄ番号：２６）を示すファージがＭａｂ５５．１のＣＯＬＯ ２０５細胞上のそ の抗原への結合を阻害することが観察された。 マンノースー結合蛋白質コンカナバリンＡ（ｃｏｎ Ａ）（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏ １８９，ｐｐ． ５３９８−５４０２，１９９２；またＯｌｄｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ８９，ｐｐ．５３９３−５３ ９７，１９９２）および抗炭水化物Ｍａｂ（Ｈｏｅｓｓ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ，ｖｏｌ １２８，ｐｐ．４３−４９，１９９３）のためのペプチドリガンドを 含む炭水化物結合蛋白質についてスクリーニングしたライブラリーを示すファー ジペプチドから選択されているペプチド模倣物の文献に例がすでに存在する。ｃ ｏｎ Ａを研究している二つのグループの独立した結果は選択されたペプチド配 列に強い共通性を示しており（反復モチーフＹＰＹを含む）；Ｍａｂについての スクリーニングでは反復モチーフＰＷＬＹが選択された。両方の炭水化物結合蛋 白質により選択された芳香族側鎖は糖の環に類似の立体化学的コンフィグレーシ ョンでお互いに重なっているという推測がなされている。対称的に、Ｍａｂ５５ ．１により選択された構造は上記のリガンドの疎水的および立体配座特性が欠如 しており、名義上環式ペプチドライブラリーから選択され、一つの集団内部で発 生された直線状ペプチドライブラリーに対してのＭａｂ５５．１スクリーニング ではなにも選択されなかった（他の群では直線状ペプチドライブラリーから結合 物が選択された）。蛋白質配列データベースでの配列ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣの検 索では既知のペプチドとの相同性は示されず、従ってＭａｂ５５．１により結合 された配列は新規である。 抗原結合構造は一般的には抗体（またはその断片またはｓｃＦｖのような修飾 抗体構築物）であり、ＣＡ５５．１を認識および結合するであろう蛋白質配列と して定義される。好適には、ＣＡ５５．１抗原に対する結合親和性は少なくとも １０ｅ−５Ｍであり、より好適にはＣＡ５５．１抗原に対する結合親和性は少な くとも１０ｅ−６Ｍであり、より好適にはＣＡ５５．１抗原に対する結合親和性 は少なくとも１０ｅ−７Ｍであり、より好適にはＣＡ５５．１抗原に対する結合 親和性は少なくとも１０ｅ−８Ｍであり、より好適にはＣＡ５５．１抗原に対す る結合親和性は少なくとも１０ｅ−９Ｍであり、より好適にはＣＡ５５．１抗原 に対する結合親和性は少なくとも１０ｅ−１０Ｍであり、および特にはＣＡ５５ ．１抗原に対する結合親和性は少なくとも１０ｅ−１１Ｍである。抗原結合構造 の蛋白質配列は通常免疫グロブリンまたは免疫グロブリンスーパーファミリーの 免疫グロブリン領域から誘導され、完全に天然の分子、その断片または抗原への 結合を可能にする免疫グロブリン折り畳みの構造特性のみを保持するように遺伝 子工学で作られた化学種であろう。抗原結合構造は抗体５５．１のＣＤＲｓに基 づいているのが好適である。ＣＤＲｓすなわち相補性決定領域（complementarit y determining regions）は抗原抗体相互作用の特異性を決定するのに決定的で あると仮定されている抗体可変領域の高頻度可変ループ内の配列である（Ｋａｂ ａｔ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｙ Ｈｅａｌ ｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ） ；しかしながら、ここで定義されるＣＤＲｓには結合に寄与する骨格残基が含ま れている。抗体５５．１に対し、ＣＤＲｓは他のマウス抗体の高頻度可変配列と の相同性により決定された。 重鎖ＣＤＲｓは： 1 pos 31-35 inc.= G Y W I H （配列ＩＤ番号：２７） 2 pos 50-66 inc.= E V N P S T G R S D Y N E K F K N （配列ＩＤ番号：２８） 3 pos 99-110 inc.= E R A Y G Y D D A M D Y （配列ＩＤ番号：２９） である。 軽鎖ＣＤＲｓは： 1 pos 24-40 inc.= K S S Q S L L N S R T R K N Y L A （配列ＩＤ番号：３０） 2 pos 56-62 inc.= W A S T R T S （配列ＩＤ番号：３１） 3 pos 95-102 inc.= K Q S Y T L R T （配列ＩＤ番号：３２） である。 本発明の一つの態様に従うと、抗原ＣＡ５５．１を認識する相補性決定領域（ ＣＤＲｓ）を持つ抗原結合構造が提供され、ここでＣＤＲｓは以下の配列を持っ ている： ａ）重鎖 CDR1 G Y W I H （配列ＩＤ番号：２７） CDR2 E V N P S T G R S D Y N E K F K N （配列ＩＤ番号：２８） CDR3 E R A Y G Y D D A M D Y （配列ＩＤ番号：２９）； ｂ）軽鎖 CDR1 K S S Q S L L N S R T R K N Y L A （配列ＩＤ番号：３０） CDR2 W A S T R T S （配列ＩＤ番号：３１） CDR3 K Q S Y T L R T （配列ＩＤ番号：３２）； またはそれらの保存的類似体。 本発明の一つの態様に従うと下記の（随意にヒト適応化された）構造を持つ抗 原結合構造が提供される： 重鎖配列（配列ＩＤ番号：３３） および； 軽鎖配列（配列ＩＤ番号：３４）： またはそれらの以下の構築物の一つ： Ｆ（ａｂ’）２；Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ ＆Ｖ−ｍｉｎまた は； それらの保存的類似物（conservative analogue）。 本発明の別の態様に従うと、抗体の可変領域の重鎖または軽鎖をコードするポ リヌクレオチド配列が提供され、それはストリンジェント条件下、抗体５５．１ （ＥＣＡＣＣ寄託番号９３０８１９０１）の重鎖または軽鎖のＣＤＲ３をコード しているポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成する。 好適には、ポリヌクレオチドは抗体５５．１の重鎖または軽鎖の二つの（特別 には三つの）ＣＤＲ３をコードしている。ハイブリッド形成試験は下記実施例１ ０に示されている。 本発明の一つの態様に従うと、前に定義したような抗原結合構造の重鎖または 軽鎖の可変領域を少なくともコードしているポリヌクレオチド配列が提供される 。 本発明の別の態様に従うと、前に定義されたようなポリヌクレオチド配列によ りコードされている配列を持つ抗原結合構造が提供される。 本発明の別の態様に従うと、抗体５５．１（ＥＣＡＣＣ寄託番号９３０８１９ ０１）またはその保存的類似物の少なくとも一つのＣＤＲ３を持つ抗原結合構造 が提供される。好適には、抗原結合構造は抗体５５．１またはその保存的類似物 の少なくとも三つのＣＤＲ３（より好適には４ＣＤＲｓ、より好適には５ＣＤＲ ｓ、特別には６ＣＤＲｓ）を持っている。 保存的類似物とは抗原結合構造の結合特性を保持しているが、配列は一つまた はそれ以上の保存的アミノ酸が置換されて異なっている蛋白質配列である。本明 細書の目的のためには保存的アミノ酸置換とは偶然に起こる確率（Ｄａｙｈｏｆ ｆｅｔ ａｌ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９７１，ページ９５−９６ および図９−１０により 記載されているコンピューター法により定義されるような）より現実に起こる確 率が１０倍よりも大きい置換である。 本発明の別の態様に従うと、前に記載されたような抗原結合構造を持つ抗体が 提供される。 本発明の別の態様に従うと、ヒト適応化されていると特徴付けられる前記の抗 体または抗体断片が提供される。 ヒト適応化された抗体、関連する断片または抗体結合構造とは抗原結合部位（ 相補性決定領域すなわちＣＤＲｓ）内および周辺は非ヒト由来アミノ酸配列を維 持しているがヒト由来免疫グロブリン配列の構造枠で大部分は形成されているポ リペプチドである。適当な方法論は例えばＷＯ ９１／０９９６７、ＥＰ ０３ ２８４０４およびＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ ｃｉ８６，１００２９，Ｍｏｕｎｔａｉｎ ａｎｄ Ａｄａｉｒ（１９８９）Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １０，１（１９９２）に詳細に記載されており、ヒト適応化の 別の方法では表面残基の抗体張りつけのような企図が行われている（ＥＰ ５１ ９５９６，Ｍｅｒｃｋ／ＮＩＨ，Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ）。抗体５５．１の キメラヒト適応化抗体断片の調製は本明細書の実施例３に記載されている。 本発明の別の態様に従うと、ポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞 または前に定義したような抗原結合構造の少なくとも重鎖または軽鎖の可変領域 をコードしたポリヌクレオチド配列を持つ宿主細胞から発育したトランスジェニ ック非ヒト動物またはトランスジェニック植物が提供される。 本発明の別の態様に従うと、ＥＣＡＣＣ寄託物番号９３０８１９０１として寄 託されたハイブリドーマ５５．１およびその変異細胞株が提供される。 ハイブリドーマ５５．１はブタペスト条約に従って１９９３年８月１９日に寄 託参照番号９３０８１９０１としてユーロピアン コレクション オブ アニマ ル セル カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）、ＰＨＬＳ センター フォー アプラ イド マイクロバイオロジー ＆ リサーチ、ポルトン ダウン、サリスベリー 、 ウィルトシェア、ＳＰ４ ＯＪＧ、連合王国、に寄託された。 本発明の別の態様に従うと、ＮＣＩＭＢ番号４０６３８として寄託されたＡＣ ＥＨＲＧＳＧＷＣファージおよびその変異株が提供される。 ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージはブタペスト条約に従って１９９４年５月１０ 日に寄託参照番号ＮＣＩＭＢ４０６３８としてザ ナショナル コレクションズ オブ インダストリアル アンド マリン バクテリア、２３ Ｓｔ メイチャ ー ドライブ、アバディーン ＡＢ２ １ＲＹ、スコットランド、連合王国、に 寄託された。 本発明の別の態様に従うと： ａ） 抗原結合構造の少なくとも重鎖または軽鎖の可変領域をコードしたポリヌ クレオチド配列で宿主細胞を形質転換し、随意に形質転換された細胞をトランス ジェニック非ヒト動物またはトランスジェニック植物へと発育させ； ｂ） 宿主細胞、トランスジェニック非ヒト動物またはトランスジェニック植物 を少なくとも可変領域の発現、および随意に分泌を行う条件に置き、および随意 に； ｃ） 可変領域を少なくとも部分的に精製することからなる前に定義したような 抗原結合構造の少なくとも重鎖または軽鎖の可変領域を作製する方法が提供され る。 本発明の別の態様に従うと： ａ） ＥＣＡＣＣ寄託物番号９３０８１９０１として寄託されたハイブリドーマ ５５．１をそれらからの抗体の発現が行われる条件下で培地で培養し、および； ｂ） 培養培地から抗体５５．１を得、および随意に； ｃ） 酵素的消化により抗体５５．１のＦ(ａｂ’)２断片を調製することからな るモノクローナル抗体５５．１の製造方法が提供される。 本発明の別の態様に従うと、エフェクター部分（好適には毒素、しかし酵素ま たは放射活性リガンドでも）および前記のような抗原結合構造または抗体を含む 複合体が提供される。 本発明の複合体は必ずしも一つのエフェクター分子および一つの抗体分子から 成り立っているのではないことが理解されるであろう。例えば、複合体は抗体分 子当たり一つ以上のエフェクター分子を含んでいてもよい。 エフェクター分子が毒素である場合、この毒素部分は一般的に細胞毒性を持つ 成分を含んでおり、そのためインターナリゼーション後に細胞を殺すことができ る。 毒素部分および抗原結合構造はお互いに直接的に結合されていてもよいし、ま た間接的に結合されていてもよい。毒素部分および抗原結合構造は一般的に複合 体の形が抗原結合構造のその標的細胞への結合を可能にするように結合される。 都合がよいのは、毒素部分および抗原結合構造は複合体が標的細胞の外側では結 合されているがしかしインターナリゼーション後に毒素部分が放出されるように 、毒素部分および抗原結合構造が複合体が細胞外では安定であり、および細胞内 では不安定なように結合される。従って、都合がよいのは複合体が細胞内切断可 能／細胞外安定部位を持っていることである。 毒素部分が直接的に標的細胞結合部分に結合された複合体の例には、毒素部分 のチオール基および抗原結合構造のチオール基間で形成されるジスルフィド架橋 により毒素部分および抗原結合構造が結合されているものが含まれる。免疫毒素 および他の複合体の製造および性質の詳細は欧州特許出願ＥＰ ５２８ ５２７ （公開番号）に与えられており、その内容はここに引例として含まれている。 本発明の別の態様に従うと、前記のような免疫毒素を含む医薬組成物が提供さ れる。 用量および投与計画は、用いられた特定の毒素部分、標的細胞の集団、および 患者の病歴に依存するであろうことを理解されたい。投与される複合体の用量は 典型的には患者の体重ｋｇ当たり０．１から１ｍｇの範囲であろう。 本発明の複合体は普通医薬組成物の形で投与されるであろう。従って、本発明 に従うと医薬として受容可能な希釈剤または担体を伴った複合体（前に定義した ような）を含む医薬組成物も提供される。そのような処方の例は実施例９に与え られている。 本発明の医薬組成物は種々の剤形に処方されるであろう。一般的には、本発明 の複合体は非経口で、好適には静脈内に投与されるであろう。特別の非経口医薬 組成物は注射による投与に適した単一剤形に処方されるものである。従って、特 に適した組成物には、医薬として受容可能な非経口担体または希釈剤を伴った免 疫毒素の溶液、乳剤または懸濁剤が含まれる。適した担体または希釈剤には水性 媒体（例えば水または塩溶液）および非水性媒体（例えば不揮発性油またはリポ ソーム）が含まれる。組成物は組成物中での複合体の安定性を促進する薬剤を含 んでいてもよい。例えば、組成物は緩衝液（例えばトウィーン）を含んでいても よい。複合体の濃度はいろいろであろうが、一般的には約１から１０ｍｇ／用量 の濃度で処方されるであろう。 抗体５５．１は膵臓および結腸直腸腫瘍細胞に選択的であり、この抗体を含む 複合体は強力な免疫毒素で結腸直腸腫瘍細胞に選択的であることが観察された。 本発明の別の態様に従うと、前に定義したような抗原結合構造をコードしてい る発現ベクターが提供される。 本発明の別の態様に従うと、前に定義したような抗原結合構造の少なくとも重 鎖または軽鎖の可変領域をコードしている発現ベクターが提供される。 哺乳類細胞（ＣＨＯ、ＣＯＳ、骨髄腫）は特定された結合活性を持つ蛋白質を 生産するため、抗体ＨおよびＬ鎖ｃＤＮＡおよびその断片の共発現のための宿主 として使用されてきた（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄ ｓ，ｖｏｌ２，ｐ１３６−１４５、およびＡｄａｉｒ，Ｊ．，１９９２，Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｖｏｌ １３０）。ｃＤＮＡはプラス ミドに導入でき、染色体ＤＮＡ内へ組み込むことを可能にする。プラスミドはト ランスフェクトされた宿主での維持のための選択可能マーカー、ｃＤＮＡからの 転写を高レベルにするための有効な真核生物プロモーター、クローニングおよび ポリアデニル化のための便利のよい制限酵素部位およびメッセージ安定化のため の転写停止信号を必要とする。そのようなベクターのいくつかは文献に記載され ており（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ １０，ｐ１６９−１７５、およびＷｒｉｇｈｔ，Ａ．， １９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ ２，ｐ１２５−１３５）、ｐＲｃ／ＣＭＶ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，図８参照）のようにそれらは市販品とし て入手可能であり、必要な基準を満たしている。 大腸菌においての抗体断片範囲の発現はよく知られている（Ｐｌｕｃｋｔｈｕ ｎ，Ａ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９２，ｖｏｌ １３０，ｐ１５１−１８８、およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ ｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，ｖｏｌ ５，ｐ２５６− ２６２に総説がある）。ＦｄおよびＬ鎖の細胞内発現について記載されているが （Ｃａｂｉｌｌｙ，Ｓ．，１９８９，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ ８５，ｐ５５３−５５ ７）、結合活性を生じるにはインビトロでの鎖の再折り畳みおよび再会合が必要 とされる（Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｊ ａｎｄ Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｒ．，１９９１，Ｂ ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ９，ｐ１５７−１６２）。活性な抗体断 片を得るより効率的な方法はペリプラズム分泌によるものである（Ｂｅｔｔｅｒ ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ ２４０，ｐ１０４１− １０４３）。抗体断片のＨおよびＬ鎖成分は単一プラスミドから共発現される。 各々の抗体鎖は大腸菌ペリプラズムへ方向付ける細菌リーダーペプチドとともに 提供され、ペリプラズムにおいてリーダーが切断され、遊離鎖が会合して可溶性 で活性な抗体断片が生じる。この方法は発現された抗体が全抗体に会合する前に ＥＲの内腔内へ渡される真核生物の天然の過程を模倣していると信じられている 。この方法ではしばしば培養上清に結合活性が存在する。 本発明の別の態様に従うと、前記のようなベクターで形質転換された宿主細胞 が提供され、それはその中における発現を両立できる。 本発明の別の態様に従うと、前に定義したようなポリヌクレオチド配列で形質 転換された宿主細胞が提供される。 本発明の別の態様に従うと： ａ） 少なくとも可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列で宿主細胞を 形質転換し； ｂ） 少なくとも可変領域の発現、および随意に分泌を行うような条件に宿主細 胞をおき、および随意に； ｃ） 可変領域を少なくとも部分精製することからなる前に定義したような抗原 結合構造の重鎖または軽鎖の少なくとも可変領域を作製する方法が提供される。 好適には、重鎖および軽鎖の両方が同一の宿主細胞で発現され、組み立てられて 抗原結合構造を形成する。 いくつかの発現系はベクターによる宿主細胞の形質転換を含んでいる；そのよ うな系は例えば大腸菌、酵母および哺乳類宿主においてよく知られている（Ｍｅ ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ ｓｓ １９９０参照）。例えば、問題とする遺伝子（好適にはベクターから切り 出され、好適には哺乳器官のプロモーターと共同して発現された蛋白質を動物の ミルク内へ分泌させるようにする）が哺乳類接合体の前核内へ導入され（通常、 前核の二つの核の一つ（通常雄核）の中へマイクロインジェクションにより）、 その後養母内へ移植されるような発現の他の系も企図される。養母により生み出 される動物の集団は染色体内へ組み込まれた導入遺伝子を運び、および発現する であろう。普通、組み込まれた遺伝子は通常の繁殖により子へ渡されるのでスト ックの即座の拡大が可能である。好適には、問題とする蛋白質は雌トランスジェ ニック動物のミルクから簡単に採取される。以下の文献を参照されたい：Ｓｉｍ ｏｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７ ９−１８３；Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ ９：８３０−８３４；ＵＳ ４，８７３，１９１および；ＵＳ ５，３ ２２，７７５。マウス胚の操作はＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．”Ｍａｎｉｐｕｌａ ｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ １９８６、に記載されている。 例えば以下の文献に記載されているようなトランスジェニック植物技術もまた 企図される：Ｓｗａｉｎ Ｗ．Ｆ．（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ ９：１０７− １０９；Ｍａ Ｊ．Ｋ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ ２４：１３１−１３８；Ｈｉａｔｔ Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２ ）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０７：７１−７５；Ｈｅｉｎ Ｍ．Ｂ．ｅｔ ａｌ ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ７：４５ ５−４６１；Ｄｕｅｒｉｎｇ Ｋ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒＢｉｏｌｏｇｙ １５：２８１−２９４。 望むなら、宿主遺伝子は以下に概説されているような、および例えば”Ｇｅｎ ｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ；Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲ Ｌ Ｐｒｅｓｓ １９９３、に記載されているような標準的方法を用いて不活性 化または修飾できる。標的遺伝子またはその一部は好適には遺伝子内に挿入され た選択マーカー（Ｎｅｏのような）を持つベクター内へクローン化され、その機 能が破壊される。ベクターは直線状にされ続いて胎児性幹（ＥＳ）細胞（例えば マウスの１２９／０１ａ系統から誘導されたもの）内へ形質転換され、以後相同 性組換えが幹細胞の集団で起こる。遺伝子破壊を含む幹細胞を増殖させ、胚盤胞 （例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから）内へ注入し、発育のために養母内へ移植 する。キメラの子孫は被覆色マーカーにより同定できる。ＥＳ由来および宿主胚 盤胞由来配偶子間の区別を可能にする遺伝子マーカーを持つマウスと交配させ、 生殖系統へのＥＳ細胞の寄与を確かめるためキメラを繁殖させる。ＥＳ細胞由来 配偶子の半分は遺伝子修飾を運んでいるであろう。遺伝子破壊を持つものを同定 するために子孫をスクリーニング（例えばサザンブロッティングにより）した（ 子孫の約５０％）。これらの選択された子孫はヘテロ接合性であろうし、従って 別のヘテロ接合体およびその後に選択されるホモ接合性の子孫（子孫の約２５％ ）と繁殖できる。ノックアウト遺伝子を持つ動物は、前核内へのＤＮＡのマイク ロインジェクション、スフェロプラスト融合（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａ ｌ ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８）またはＥＳ細胞の脂 質媒介トランスフェクション（Ｌａｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒ ｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５ ２２−２９）のような既知の技術により産生される トランスジェニック動物と交雑できて外因性ノックアウト遺伝子および外来性遺 伝子置換を持つトランスジェニック動物が得られる。 標的化された遺伝子破壊を含むＥＳ細胞は特異的変換を含む標的遺伝子配列（ 好適には形質転換に先立ってベクター内へクローン化され直線状にされる）での 形質転換によりさらに修飾できる。相同的組換えに続いて改造された遺伝子はゲ ノム内へ導入される。これらの胎児性幹細胞は次に前記のようにトランスジェニ ック動物の創造に使用される。 術語”宿主細胞”には例えば細菌、酵母、植物細胞および非ヒト哺乳類接合体 、卵母細胞、胚盤胞、胎児性幹細胞およびトランスジェニック技術に適したその 他 の細胞のような発現技術に適した原核または真核細胞が含まれる。文脈によって は術語”宿主細胞”にはまた形質転換された非ヒト哺乳類接合体から発育された トランスジェニック植物または哺乳動物、卵母細胞、胚盤胞、胎児性幹細胞およ びトランスジェニック技術に適したその他の細胞も含まれる場合もある。 本発明の別の態様に従うと、 ａ） ＥＣＡＣＣ寄託番号９３０８１９０１として寄託されたハイブリドーマ５ ５．１を培養し、および； ｂ） 培養培地から抗体５５．１を得、および随意に； ｃ） 酵素的消化により抗体５５．１のＦ(ａｂ’)２断片を調製することからな るモノクローナル抗体５５．１の製造方法が提供される。 本発明の別の態様に従うと、前記のような免疫複合体（immunoconjugate）の 医薬として有効量をヒトまたは動物への投与することからなる処置を必要とする ヒトまたは動物のそのような処置法が提供される。 本発明の別の態様に従うと、前記のような毒素および抗原結合構造を含む免疫 毒素複合体（immunotoxin conjugate）の医薬として有効量を投与することから なる、抗原５５．１を示す細胞への毒素の標的化を必要とする哺乳類においての そのような標的化の方法が提供される。ここに記載したように、複合体は胃腸腫 瘍細胞を殺すことができる。従って、複合体（または”免疫毒素”）は毒素部分 がその細胞毒性を発揮するように腫瘍細胞に毒素部分を送達できる。それ故、一 般的に複合体は腫瘍細胞に結合することができ（腫瘍細胞への標的細胞結合部分 を通して）、細胞内へ毒素部分を通過させることが可能である（すなわち、毒素 部分を”インターナライズ（internalise）”することが可能である）。特に、 有効な複合体は一般的に以下の特性を持っている： １． 抗原結合構造は腫瘍細胞表面抗原と結合できなければならない。 ２． 細胞表面抗原は腫瘍細胞上で高いコピー数で存在しなければならない、例 えば少なくとも細胞当たり１万。 ３． 抗原は正常細胞上で高いコピー数で発現されてはならない。 ４． 抗体：抗原複合体は毒素部分がその活性を細胞内で発揮するように有効に インターナライズされねばならない。 ５． 複合体は、腫瘍細胞へ毒素部分を送達するため十分長く血液中で無傷のま ま残存する十分な安定性を持ち、ならびに一度毒素部分が細胞内部に入ると毒素 部分を放出できるように十分切断可能であるように構築されなければならない。 一般に、そのための用量範囲は複合体の確立された毒性用量（例えば、最大耐 性用量）に比例して決定される。共通して、この方法はヒトにも使用される。典 型的には、用量範囲は５０−５０００μｇ／ｋｇであろう。 本発明の別の態様に従うと、診断的方法における前記のような抗体の使用が提 供される。 一つの診断的方法は免疫アッセイである。本発明に従った新規抗体に基づくイ ンビトロ試験のための免疫アッセイは、本発明の抗体を標識または非標識形で利 用し、抗体と試験されるべき試料中の特定の抗原種との複合体形成を決定する本 分野の通常の免疫学的技術に従って設計されるであろう。一つのケースにおいて は、抗体が放射性標識、化学発光標識、蛍光標識または酵素標識のような検出可 能な標識で標識されているであろう。もしくは、抗体は標識物質との複合体形成 またはバイオセンサー法（例えば表面プラスモン（plasmon）共鳴に基づいて） のような非標識技術により検出される。試料は、例えば血清のような体液または 組織試料（組織化学的アッセイ）の形であろう。 インビボでの診断のためには、本発明による抗体は、例えば放射性標識または 重金属原子のように外部から検出可能な標識とともに提供されて患者に投与され 、それにより体内における抗体の局在した蓄積が決定される。 癌のインビトロ診断のためには、測定可能な信号を発生させることができる西 洋ワサビペルオキシダーゼおよび細菌ルシフェラーゼのような酵素、または直接 的に検出および定量できる蛍光マーカーまたは放射性同位元素と抗原結合構造が 結合できる。標準免疫アッセイ系において、そのような複合体は体の組織中のＣ Ａ５５．１の存在または不在を測定できる手段を提供し、結果として腫瘍疾患の ための迅速で便利な試験が提供される。方法論の一般的記述は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｅ．Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ＣＲＣ ＰｒｅｓｓおよびＵ Ｓ３６９０ ８３３４、ＵＳ３７９１ ９３２、ＵＳ３９１７ ８３７、ＵＳ３ ８５０ ５７８、ＵＳ３８５３ ９８７、ＵＳ３８６７ ５１７、ＵＳ３９０ １ ６５４、ＵＳ３９３５ ０７４、ＵＳ３９８４ ５３３、ＵＳ３９９６ ３ ４５およびＵＳ４０９８ ８７６に含まれている。 癌のインビボ診断のためには、全身イメージングカメラにより検出できるイッ トリウム、テクネシウムまたはインジウムまたは重金属同位元素のような元素と 抗原結合構造は結合できる（Ｌａｒｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．（１９８７）Ｒａｄｉｏｌ ｏｇｙ，１６５，２９７−３０４参照）。 癌治療のためには、抗原結合構造はさらに修飾しなくても使用できるが、好適 な実施態様ではＣＡ５５．１抗原を運ぶ癌細胞またはこれらの癌細胞のすぐ近傍 の細胞を殺すことができる毒性薬剤と結合できる抗原結合構造が含まれている。 好適な実施態様において、抗原結合構造はリシン、ジフェテリア毒素、スタフィ ロコッカス腸毒素、シュードモナス外毒素、アブリンまたは他のリボソーム不活 性化蛋白質のような蛋白質毒素に結合されている。これらの蛋白質は抗原結合構 造に化学架橋剤を用いて化学的に、または抗原結合構造のすべてまたは一部およ び蛋白質毒素のすべてまたは一部の単一直線状アミノ酸を含む融合蛋白質の構築 により遺伝子的に結合されているであろう。ＣＡ５５．１は迅速にインターナラ イズされるので、蛋白質毒素は選択的に腫瘍細胞に入り込んで細胞の死をもたら す。 腫瘍細胞の選択的細胞死はまた、抗原結合構造を直接的にまたは化学的誘導化 により９０Ｙ、１３１Ｉおよび１１１Ｉｎのような高エネルギー放射性同位元素 を含む大環式キレート剤と結合させることによっても達成できる。抗原結合構造 は同位元素の腫瘍への局在化に働き、同位元素から放射される放射線はまわりの 細胞のＤＮＡを破壊し、腫瘍を殺す。 腫瘍細胞の選択的細胞死はまた、抗原結合構造をメトキシレート、クロラムブ シル、アドリアマイシン、ダウノルブシンおよびビンクリスチンのような細胞毒 性で細胞増殖抑制性薬剤と結合させることによっても達成できる。これらの薬剤 は臨床で多年に渡って使用されてきたが、それらが提供される治療は非特異的毒 性のためしばしば制限を受けている。これらの薬剤のＣＡ５５．１抗原結合構造 への結合はこれらの薬剤を腫瘍部位に局在化させることを可能にし、骨髄または 神経系のような他の組織においてのそのような薬剤の作用による受容できない副 作用なしで腫瘍へ送達できる薬剤の量を増加させる。 腫瘍細胞の選択的細胞死はまた、非毒性量のプロドラッグを強力な毒性薬剤化 合物への変換を触媒できる酵素と抗原結合構造を結合させることによっても達成 される。複合体の投与により腫瘍部位での酵素活性の局在化が高められる。続い てプロドラッグを投与すると毒性薬剤の局所的生成が起こり、腫瘍部位での選択 的細胞死が起こる。この方法はＷＯ８０／０７３７８、ＵＳ４，９７５，２７８ およびＷＯ８９／１０１４０に記載されている。 ＣＡ５５．１の使用の別の応用は、別の抗体（ＣＡ５５．１特異的抗体のイデ ィオタイプ）を単離するために使用できる抗原結合構造の単離である。これらの 抗体はＣＡ５５．１を運ぶ腫瘍への天然の免疫応答を誘発または押し上げる腫瘍 ワクチンとして使用できる。この方法の例はＮｅｐｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．（１９８４）８１，２８６４により与 えられている。 ＣＡ５５．１抗原結合構造を製造する技術は実施例１および実施例２記載され ており、第一に抗原ＣＡ５５．１を運ぶ腫瘍細胞に対する数千のモノクローナル 抗体が産生され、次にＣＡ５５．１と特異的に反応する特定の抗体でスクリーニ ングされる（実施例６）。この技術では一般的に、ＣＡ５５．１抗原またはＣＯ ＬＯ ２０５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２２２，Ｃａｎ．Ｒｅｓ．（１９７８）３８ ，１３４５５）のようなＣＡ５５．１発現細胞の細胞または膜試料で免疫された げっし類の脾臓細胞とＳｐ／２（ＥＣＡＣＣカタログ番号８５１１０５０３，Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８１）７３Ｂ，３）のようなげっし 類骨髄腫細胞株との融合を用いて実施される。この融合の生成物はマウスＩｇＧ １５５．１抗体のようなげっし類モノクローナル抗体を発現するであろうげっし 類ハイブリドーマ細胞株である。上記の使用において、特定の応用に対しては最 も都合のよい抗原結合構造は必ずしもハイブリドーマ融合技術により産生される そのままのげっし類モノクローナル抗体ではなく、ＣＡ５５．１に対する本来の 結合特異性を保持する一方さらに修飾された分子が最良である。 特に、抗原結合構造単独でまたは複合体としてヒトにげっし類抗体のインビボ 投与を繰り返すと患者にげっし類抗体に対する免疫応答がもたらされる；ＨＡＭ Ａ応答。繰り返し投与が必要であるならば、ＨＡＭＡ応答は医薬組成物の有効性 を制限する。抗原結合構造の免疫原性はポリエチレングリコールのような親水性 ポリマーによる抗原結合構造の化学的修飾により、または遺伝子工学の方法を用 いて抗原結合構造をよりヒトに似せることにより減少するであろう。例えば、Ｃ Ａ５５．１を結合するげっし類抗体の可変領域の遺伝子配列をヒト骨髄腫蛋白質 の可変領域に置換することにより、組換え体キメラ抗体が産生される。これらの 方法はＥＰ１９４２７６、ＥＰ０１２０６９４、ＥＰ０１２５０２３、ＥＰ０１ ７１４９６、ＥＰ０１７３４９４およびＷＯ８６／０１５３３に詳述されている 。もしくは、ＣＡ５５．１結合げっし類抗体の相補性決定領域またはＣＤＲｓの 遺伝子配列を単離または合成し、相同的ヒト抗体遺伝子の対応する配列領域で置 換して本来のげっし類抗体の特異性を持つヒト抗体を生成させる。この方法はＥ Ｐ０２３９４０、ＷＯ９０／０７８６１およびＷＯ９１／０９９６７に記載され ている。もしくは、げっし類抗体の可変領域の多数の表面残基を相同的ヒト抗体 で通常観察されるその残基に変化でき、残基の表面’化粧張り’を持ったげっし 類抗体が生成され、それはヒトの体により自分自身だと認識されるであろう。こ の方法はＰａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２ ８，４８９、により示されている。 多くの応用において、抗体結合構造の大きさを減少させて医薬組成物の組織浸 透性およびその他の薬力学的性質を改良すると抗体結合の有効性が高められてい る。このことは抗体分子のＦｃ領域を酵素的に除去するか（実施例４）または遺 伝子工学的方法により組換え体Ｆａｂ’またはＦ(ａｂ’)２断片を産生すること により（実施例３．３）達成できる。 遺伝子工学的方法は抗原結合構造の大きさをさらに減少させるために使用する ことができる。ＣＤＲｓを含むＦｖは遺伝子操作できて孤立して発現され、例え ばジスルフィド架橋を用いて化学的に架橋された。もしくは、一つのドメインの 天然のＣ−末端からのリンカーペプチド配列を持つＦｖドメインと他のドメイン のＮ−末端と融合させてＦｖ構造を作り上げる軽鎖および重鎖両方のドメインが 単一ポリペプチド鎖（ＳＣＦｖ）として作製される（実施例３．３およびＰＣＴ ／ＵＳ／８７／０２２０８およびＵＳ４７０４６９２参照）。もしくは、Ｗａｒ ｄ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４により記載されてい るように単−Ｆｖドメインは単一ドメイン抗体またはｄＡｂを形成して孤立して 発現されるであろう。抗原結合構造の別の型は国際特許出願ＷＯ９４／１２６２ ５（発明者Ｓｌａｔｅｒ ＆ Ｔｉｍｍｓ）に開示されているＶ−ｍｉｎ構築物 である。 本発明は以下の非制限的な実施例により例示され、そこで： 図１は血清含有培地での５５．１ハイブリドーマの培養における細胞密度および ＩｇＧ濃度を示しており； 図２は無蛋白培地での５５．１ハイブリドーマの培養における細胞密度およびＩ ｇＧ濃度を示しており； 図３はｐＩＣＩ１６４６のプラスミド地図を示しており； 図４はＣＡ５５．１のエンドサイトーシスを示しており； 図５は５５．１抗体−リシン複合体のインビボ抗腫瘍効果を示しており； 図６はＰＮＧアーゼ処理ＣＯＬＯ ２０５細胞のウェスタンブロットの像を示し ており； 図７Ａおよび７ＢはレクチンＤＳＡおよびＧＮＡによるウェスタンブロットの像 を示しており； 図８はプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶの地図を示しており； 図９はＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂発現を示すウェスタンブロットを示してお り； 図１０はＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂結合のＥＬＩＳＡデータを示しており； 図１１はｓｃＦｖ発現を示すウェスタンブロットを示しており； 図１２はｓｃＦｖ結合のＥＬＩＳＡデータを示しており； 図１３は５５．１抗体へのＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージの直接結合の特異性を 示しており； 図１４は競合アッセイにおけるＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージの結合の特異性を 示しており； 図１５および１６は抗体５５．１の軽鎖および重鎖ｃＤＮＡ配列を示している。 成熟抗体鎖に存在する分泌リーダーペプチド配列の存在に注目されたい。リーダ ー配列は３文字アミノ酸コードでおよび成熟配列は１文字コードで示されている 。 図１７は５５．１抗原の対する抗体発生のフローチャートを示している。 図１８は抗体検出に使用されたｃ−ｍｙｃ ｔａｇの二本鎖ＤＮＡ配列を示して いる。 表１は血清含有培地での５５．１ハイブリドーマの培養における細胞密度および ＩｇＧ濃度を示しており； 表２は無蛋白培地での５５．１ハイブリドーマの培養における細胞密度およびＩ ｇＧ濃度を示しており； 表３は結腸直腸腫瘍との５５．１抗体反応性を示しており、および； 表４は５５．１抗体による正常組織染色の比率を示している。 略語： ＳＤＳ−ＰＡＧＥはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル 電気泳動（ＰＡＧＥ）である。 実施例１ ５５．１抗体およびＣＡ５５．１と交差反応する抗体の製造 １９７６年のその発端からモノクローナル抗体の生成は癌細胞選択的抗原の研 究に応用されてきた。完全に精製された抗原に対する抗体の生成と異なり、この 方法ではより不純な抗原がマウスに免疫され、次に必要とされる特異性を持つ抗 体が同定されるように段階的スクリーニングが適用される。この方法により同定 された抗体は続いて当業者にはよく知られた方法により癌選択的抗原の同定に使 用されるであろう。 抗原が同定されたら、類似の特異性を持つさらなる抗体を前記抗原の濃縮試料 （実施例１１に記載した方法により調製されたような）で動物を免疫することに より発生させ、これらの動物の脾臓細胞を以下に記載するような適した骨髄腫細 胞株と融合させ、得られたハイブリドーマは実施例６および７に記載した方法に よりモノクローナル抗体５５．１と交差反応するモノクローナル抗体の産生でス クリーニングする。 １．１ ハイブリドーマ細胞株の確立および１２０／４６６．０３４．０１７． ０２３．００３の産生；確立された脾臓細胞の調製 ヒト結腸直腸癌腫細胞株［ＣＯＬＯ２０５、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ， ＵＳＡから寄託番号第ＣＣＬ ２２２として商業的に入手可能］を無血清培地で 培養した。細胞が約７ｘ１０ｅ５の密度に達したときに採取し、免疫化のためＩ ｓｃｏｖｅｓ基本培地（蛋白質を含んでいない）で３回洗浄した。 ８から１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、０．１ｍｌのリン酸緩衝化塩溶液に 懸濁したＣＯＬＯ ２０５細胞からの膜１００μｇおよび０．１ｍｌのフロイン ト完全アジュバントの初期用量で腹腔内へ免疫した。２週間後および４週間後に 再度リン酸緩衝化塩溶液に懸濁したＣＯＬＯ ２０５細胞からの膜１００μｇお よびフロイント不完全アジュバントで動物を追加免疫した。第二の追加免疫をし て６週間後、マウスに１００μｇのＣＯＬＯ ２０５膜をリン酸緩衝化塩溶液の みに懸濁して腹腔内へ最後の免疫化を行い、４日後に動物を殺して脾臓を除去し た。脾臓はダルベッコ改良イーグル培地を脾臓袋に注入することにより単一細胞 懸濁液まで解離させた。 １．２ ハイブリドーマの調製 上記の細胞懸濁液からの１．９５ｘ１０ｅ８の脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞株 ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅ ｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓから寄託番号第８５１１０５３号で入手可能）からの２ ．１３６ｘ１０ｅ７の骨髄腫細胞と混合した。チューブを遠心分離し、傾けてす べての液体を捨てた。続いてチューブに３７℃で撹拌しながら１ｍｌのＰＥＧ溶 液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＰＥＧ１５００）を徐々に加え（一定に撹拌しなが ら１分以上かけて）、その後さらに１分間撹拌した。以下のスキームに従ってダ ルベッコ改良イーグル培地を加えることにより融合を停止させた：最初の２分間 に２ｍｌ、続いての４分間に８ｍｌおよび２分以上かけてさらに１０ｍｌ。チュ ーブは次に遠心分離し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ３０ｍｌに再懸濁し た。５０μｌづつ６枚の９６ーウエル組織培養皿に分配した。２４時間後、ウェ ル当たり５０μｌの１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ、および２倍の強度のヒ ポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）補給物が加えられた。各々 のウェルには７日後に２０００μｌの１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ、およ び１倍の強度のヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）補給物が 加えられた。 １．３ 抗体ハイブリドーマのスクリーニング 上記１３日目の疲弊培地をＣＯＬＯ ２０５陽性／正常結腸陰性抗体について 試験した。簡単に記すと、Ｎｕｎｃ イムノプレート マキシソープの二組のウ ェルをＣＯＬＯ ２０５細胞（１０ｅ５細胞／ウェル；被覆容量１００μｌ）ま たは正常結腸由来の膜（１０μｇ／ｍｌ、ウェル当たり１００μｌ）で被覆した 。プレートを遠心分離し、１００μｌの０．２％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳ を加え室温で２０分インキュベートした。次にプレートをＰＢＳトゥイーンで洗 浄し、０．１％ブタゼラチン含有ＰＢＳで遮断した（ウェル当たり２００μｌ） 。上記１３日目の疲弊培地を両方の組のプレートの被覆ウェルへ加えた、５０μ ｌ ／ウェル。室温で２時間インキュベーション後、０．１％トウィーン２０−ＰＢ Ｓで希釈した（１／２０００）したペルオキシダーゼ複合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉ ｇｍａ、ラット血清蛋白質に吸着されたヤギ抗マウスＩｇＧ全分子、Ａ８９２４ ）をウェル当たり１００μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。１５μｌ の３０％過酸化水素を加えた１００ｍｌのクエン酸／リン酸緩衝液、ｐＨ４．５ に溶解した９０μｇＯＰＤの形の基質をウェル当たり１００μｌ加え、室温で１ ５分インキュベートした。５０μｌのクエン酸（０．５Ｍ）を加えて反応を停止 させ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。 特定の標的へ結合する能力でハイブリドーマの生成物をスクリーニングする場 合、第一にはハイブリドーマの必要とされる所望の特性を反映し、および第二に はこれらの特性を持っているかもしれないハイブリドーマ生成物を排除しない（ 反応しない）第二の標識された抗種抗体の使用が便利である。特に５５．１発見 の場合においては、さらなる研究によりＩｇＭモノクローナル抗体を排除するよ うに努めた。なぜならこれらの分子は初期ヒト応答を起こし、一般的に低親和性 であり特異性が低いからである。このことを達成するため、多くの市販で入手可 能な抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ複合体のマウスＩｇＧとの反応能力をスク リーニングし、この特性を示す試料は廃棄した。しかしながら、ＩｇＧモノクロ ーナル抗体のどんなサブクラスをも排除することを望んだわけではない。従って 、次の工程は残った市販の複合体のマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂお よびＩｇＧ３と反応する能力を決定することであった。マウスＩｇＭと反応せず 、マウスＩｇＧのすべてのサブクラスと等しく反応するものは市販で入手可能な 試料では見いだせなかった。このことを克服するため、特異的抗サブクラス複合 体を加えることにより最高の抗マウスＩｇＧ試薬の能力を高めた。最終的な調製 試料は四つのマウスＩｇＧのサブクラスを等しく認識した。 大体６００のハイブリドーマクローンが試験された。最初、これらの１６５が ＣＯＬＯ ２０５細胞と反応した。これらの内、４３が正常ヒト結腸膜とも反応 することが示されたので廃棄された。残りのハイブリドーマの一つから確立され たクローンは１２０／４６６と名付けられＩｇＧ１クラスのイソタイプに分類さ れた。１２０／４６６ハイブリドーマは次に多くのサブクローニング工程により 結局、１２０／４６６．０３４．０１７．０２３．０２３．００３と名付けられ た（５５．１として知られるようになる）クローンを生じる最終的で安定なモノ クローナル抗体が生み出された。 即ち、１２０／４６６ハイブリドーマは最初クローン化されて１２０／４６６ ．０３４と呼ばれたクローンが生じた。このクローンは順にクローン化されてク ローン１２０／４６６．０３４．０１７を形成し；このクローンは順にクローン 化されてクローン１２０／４６６．０３４．０１７．０２３を形成し；このクロ ーンは順にクローン化されてクローン１２０／４６６．０３４．０１７．０２３ ．０２３を形成し；このクローンは順にクローン化されてクローン１２０／４６ ６．０３４．０１７．０２３．０２３．００３を形成した。これらのクローニン グのすべてにおいて、ハイブリドーマ懸濁液はヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ ）を補給した培養培地で２．５細胞／ｍｌの密度に希釈した。２００μｌ（１細 胞）を９６ウェル培養皿の各々のウェルに加えた。５−７日後、単一細胞クロー ンが顕微鏡による視覚的検分により検出された。１７日目に培地を交換し、疲労 培地の一部で上記のようなＥＬＩＳＡによりＣＯＬＯ ２０５細胞とは結合する が正常膜とは結合しない抗体の量を分析した。ＣＯＬＯ ２０５ＥＬＩＳＡで陽 性の反応を示しながら正常細胞ＥＬＩＳＡでは陰性の反応を保持しているという ことに関して最良のクローンが選択され、さらなる開発までバイアルに入れて液 体窒素で凍結された。 １２０／４６６．０３４．０１７のクローニングの試験は６６％の細胞がＣＯ ＬＯ ２０５細胞と反応する抗体を生産した。１２０／４６６．０３４．０１７ ．０２３のクローニングの試験は１００％の細胞がＣＯＬＯ ２０５細胞と反応 する抗体を生産した。１２０／４６６．０３４．０１７．０２３．０２３のクロ ーニングの試験は１００％の細胞がＣＯＬＯ ２０５細胞と反応する抗体を生産 した。クローニングに続いて、ＣＯＬＯ ２０５細胞と反応し、正常ヒト結腸膜 とは反応しないハイブリドーマが、５５．１を同定するために以下のような評価 が行われた。 ハイブリドーマにより分泌された抗体（１０⁷の細胞を７５ｃｍ²のフラスコで 約７日間増殖させた疲労培地）は原発性結腸腫瘍を持つ４人の異なった患者から 得られた４つの結腸腫瘍からの組織切片の免疫組織学的検討により（実施例６に 記載したような）評価された。これらの腫瘍の少なくとも二つと強く結合する（ ＋＋実施例６参照）抗体が１０人の異なった患者からの結腸直腸腫瘍切片のより 大きな一団での反応性が免疫組織学により評価された。これらの腫瘍の少なくと も五つと強く（＋＋）結合する抗体がさらに評価された。 この段階で腫瘍の少なくとも５０％に強い反応性（＋＋）を与えるハイブリド ーマ上清の最も高い希釈率を決定するため、ハイブリドーマ上清が１０の結腸直 腸腫瘍の一団に対して滴定された。これは”作用濃度”と称され、正常組織の一 連の集団をスクリーニングするのに用いられた。正常組織のスクリーニングを最 小にするため、４工程正常組織スクリーニングカスケードが考案され、より決定 的な組織が最初にスクリーニングされた。カスケード中の各々の工程において反 応性基準に当てはまらない抗体を分泌するハイブリドーマは廃棄された。カスケ ードの工程、組織および選択基準は以下のようである： このスクリーニングカスケードは抗体５５．１の同定を導いた。実施例２ 寄託された細胞株ＥＣＡＣＣ Ｎｏ ９３０８１９０１からの５５． １抗体の調製 ２．１ 血清含有培地からの調製 液体窒素に貯蔵されている１ｍｌの低温保存アンプルを取り出し、３７度Ｃの 水浴中で急速に融解させた。内容物は無菌１５ｍｌ遠心管に無菌的に移された。 細胞は１０ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ改良 イーグル培地（ＤＭＥＭ）を穏やかに撹拌しながら滴加することにより再懸濁さ せた。懸濁液は５０ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を無菌的に除去してペレッ トは９５％空気５％二酸化炭素のガスを前もって満たした２５ｍｌの組織培養フ ラスコ中で１０ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに再懸濁した。フラスコは暗所 にて３７℃でインキュベートした。 ３日後、全フラスコの内容物をより大きな７５ｍｌフラスコに移し、１０％Ｆ ＣＳ含有ＤＭＥＭで希釈することにより（最終生存密度＝２．５ｘ１０ｅ５細胞 ／ｍｌ）継代培養を行った。さらに１６２ｍｌフラスコへの拡張が同様の方法で 実施されたが、ただしＦＣＳ濃度は５％へ減少させた。 精製のための培養上清液は４９０ｍｌおよび８５０ｍｌの回転瓶中、各々２５ ０ｍｌおよび５００ｍｌの回転培養により調製された。培養物は前もってガスを 満たした回転瓶へ２．６ｘ１０ｅ５生存細胞／ｍｌで播種され、３ｒｐｍで回転 され、３７℃でインキュベートされた。培養物は完全に発育させ、接種３０９時 間後に採取したが、その時点での細胞生存度は０％であり、ＩｇＧ濃度は最高に 達していた（表１および図１）。 ２．２ 無蛋白培地からの調製 ５％ＦＢＳでの回転培養が蛋白質なしでの増殖および生産に適応され、ＦＢＳ を補給したＧｉｂｃｏ無蛋白ハイブリドーマ培地II（ＰＦＨＭII）中で一連の操 作が行われた。各々の連続する工程で５０％ＦＢＳ濃度を減少させ、健康な増殖 を確立した後にさらに減少させる。培養物は３ｘ１０ｅ５生存細胞／ｍｌで播種 され、適応過程の間は１ｘ１０ｅ６生存細胞／ｍｌより多く増殖させないように した。一度蛋白質を含まない増殖から引き離したら、精製のための培養上清液は 前記のように２５０ｍｌおよび５００ｍｌの回転培養により調製された。培養物 は前もってガスを満たした回転瓶へ２．０ｘ１０ｅ５生存細胞／ｍｌで播種され 、３ｒｐｍで回転され、３７℃でインキュベートされた。培養物は完全に発育さ せ、接種２３６時間後に採取したが、その時点での細胞生存度は０％であり、免 疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃度は最高に達していた（表２および図２参照）。 ２．３ 培養収集物の処理 収集後、回転培養上清液は６０ｇで３０分間遠心分離して透明な液とした。透 明化上清液は精製まで暗所で４℃で無菌的に貯蔵された。 ２．４ ５５．１の精製 プロテインＡに吸着させ、それから溶出させることにより細胞培養上清から５ ５．１抗体が単離された。 ５リットルの５５．１抗体細胞上清（血清を含まない栄養培地で増殖させたも の、約８０ｍｇＡｂ／リットル）は撹拌しながら５６２．５ｇのグリシンおよび ８７６．６ｇの塩化ナトリウムを加えることにより１．５Ｍグリシン／３Ｍ塩化 ナトリウムとした。溶液のｐＨは５Ｍ水酸化ナトリウムを加えて８．９に調整し た。得られた溶液はプレフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ’Ｐｏｌｙｇａｒｄ’ カートリッジフィルター）続いて０．４５μフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｄｉｓｋ ＰＶＤＦカートリッジフィルター）をポンプで通過させる ことにより濾過した。 ５００ｍｌのベッド容量で公称５００ｍｇのＩｇＧ受容力を持つＮｙｇｅｎｅ プロテインＡカートリッジをペリスタポンプを用いて５００ｍｌ／分の流速で４ ベッド容量の０．４５μ前濾過１．５Ｍグリシン／３Ｍ塩化ナトリウムｐＨ８． ９緩衝液で洗浄した。 Ｎｙｇｅｎｅカートリッジで続いて使用されるすべての緩衝液は前もって４． ５μフィルターを通して濾過された。 濾過した５５．１培養上清（ｐＨ８．９）は同様に５００ｍｌ／分でカートリ ッジへポンプで注入し、すべてのメチルレッド培地指示薬がカートリッジから除 去されるまで５ベッド容量のグリシン／塩緩衝液でカラムを洗浄した。カートリ ッ ジは次に同一の流速で１ベッド容量のＰＢＳで洗浄し、続いて２５０ｍｌ／分の 流速を用い３ベッド容量の１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．８）で５５ ．１抗体を溶出させ５０ｍｌの分画を集め、Ａｂの存在をＵＶ２８０ｎｍでモニ ターした。すべての抗体含有分画を集め、１Ｍ水酸化ナトリウムで中和した。 グリシン／塩カラム溶出液および洗浄液を再びプロテインＡカートリッジを通 すと、続いてのクエン酸洗浄でさらに１５％の抗体が得られた。 集められたすべての抗体の緩衝液をＰＢＳ緩衝液に変換した。このバルク抗体 のＳＤＳ−ＰＡＧＥは＞９０％の純度を示した（抗体の収量３６０ｍｇ）。実施例３ 組換えＤＮＡ技術の使用による抗体結合構造の生産 ３．１ ５５．１重鎖および軽鎖ｃＤＮＡ配列の決定 以下の実施例は５５．１ハイブリドーマからのｃＤＮＡライブラリーの構築、 重鎖および軽鎖蛋白質をコードしている特定のｃＤＮＡの単離およびこれらのク ローンの完全ＤＮＡ配列の決について記載している。 ３．１（ａ）ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製 真核細胞からポリＡ＋ｍＲＮＡを単離するにはいくつかの方法がある（Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第二 版、１９８９年、８章ｐ３、以後Ｍａｎｉａｔｉｓとして示される）。そのよう な方法の一つはＰｈａｒｍａｃｉａからキットとして提供されており、比較的少 ない数の細胞（１０⁷またはそれ未満）の溶解、続いてのオリゴｄＴカラムへの ポリＡ＋ ｍＲＮＡの結合に依存している。望ましくない細胞成分は高温、高塩 濃度でｍＲＮＡを溶出する前に低塩濃度で洗浄することにより除去される。 ｍＲＮＡはＱｕｉｃｋｐｒｅｐ ｍＲＮＡキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）を用いて１０⁷の５５．１ハイブリドーマ 細胞から調製された。ｍＲＮＡの濃度はＵｖｉｋｏｎ９３０分光光度計（Ｋｏｎ ｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により３００から２２０ｎｍまで試料を走 査し、２６０ｍｎでの４０μｇ／ｍｌの吸光係数を用いて見積もられた。ｍＲＮ Ａは２．５μｇづつエタノール中で沈殿させて保存された。 ３．１（ｂ） ｃＤＮＡ合成およびクローニング ｃＤＮＡ合成に使用された方法は、ｍＲＮＡからの逆転写続いてのＲＮエース Ｈ処理によるＤＮＡポリメラーゼＩによる第二の鎖のプライマー形成および合成 に依存するＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｍａｎの方法に基づいている。ｃＤＮＡの その他の方法はＭａｎｉａｔｉｓ（８章）により総括されている。 ｍＲＮＡの試料５μｇは２．５μの胎盤ＲＮエース阻害剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）を含みＲＮエースを含まない水で１０μｌにあ わせた溶液に溶解したオリゴｄＴ（１２−１８ｍｅｒ混合物、Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｔｄ．、０．５μｇ）と、７０℃でインキュ ベートし、続いて氷で冷却することにより準備された。第一の鎖のｃＤＮＡ合成 は、４μｌの５ｘＨ−ＲＴ緩衝液（２５０ｍＭトリス、ｐＨ８．３、２００ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）、２μｌの０． １Ｍ Ｄｔｔ（ジチオスレイトール）、１μｌのｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄ ＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２０ｍＭ）、４μｌのスーパースクリプト逆 転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）を加え、４２℃で １時間インキュベートすることにより実施された。第二の鎖の反応には、１．５ μｌのｄＮＴＰ混合物（上記）、９２．５μｌのＲＮエースを含まない水、３０ μｌの５ｘ反応緩衝液（１２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＫＣｌ、 ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄および０．５ｍｇ／ｍｌβ−Ｎ ＡＤ）、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１０ｕ．Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）、４μｌのＤＮＡポリメラーゼＩ（４０ｕ．Ｌｉｆｅ Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）および１μｌのＲＮエースＨ（２．７ｕ． Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）を加え、１６℃でさらに撹拌 を２時間続けた。平滑端化ｃＤＮＡが合成されるのを確実にするため、２μｌの Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（１０ｕ．Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌ ｔｄ．）を添加した後、１６℃で５分間の最終的なインキュベーションを実施し た。酵素活性は７０℃での１０分間のインキュベーションにより停止させた。 クローニングのためのｃＤＮＡを調製するため、上記溶液を等容量のフェノー ルで抽出し、得られた水相は蛋白質を除去するために等容量のフェノール：クロ ロホルム（５０：５０、ｖ：ｖ）で抽出し、カラム内にＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．から購入され、使用説明書に従って使用さ れるセファロースＣ４−ＬＢを用いるスパンカラムクロマトグラフィーで精製す る。精製されたｃＤＮＡは次に５μｌのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプター（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）、１μｌのＡＴＰ溶 液（５ｍＭ）および３μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１０ｕ、Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）と混合し、１２℃で一夜インキュ ベートした。ｃＤＮＡ＋アダプターは次に１０μｌのＡＴＰ溶液（５ｍＭ）およ び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ｕ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）を加え、３７℃で３０分間インキュベーシ ョンすることによりリン酸化した。再び、溶液を等容量のフェノールおよびフェ ノール：クロロホルムで抽出し、スパンカラムクロマトグラフィーで精製して過 剰のアダプターを除去した。この段階でｃＤＮＡは適当なプラスミドまたはファ ージベクター内へのクローニングが可能である。 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔ ｅｍｓ）がｃＤＮＡライブラリーの構築に使用された。このファージミドベクタ ーは独特のＥｃｏＲＩクローニング部位、アンピシリン耐性遺伝子、および二本 鎖または一本鎖ＤＮＡの単離のためのＣｏｌＥＩおよびｆＩ複製開始点を持って いる。５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ−ＤＮＡを９０ｍＭトリス−ＨＣ １、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液中、３ ７℃で４５分間３０ｕ ＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ）で完全に消化した。５’−リン酸基を除くために２μｌのウシ腸アルカリ性ホ スファターゼ（２ｕ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え、３７ ℃でさらに３０分間インキュベーションを続けた。ホスファターゼ活性は７０℃ での１０分間のインキュベーションにより破壊した。 ５μｌのｃＮＭＡ＋アダプターは３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰおよび１．５ｕＴ４ Ｄ ＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む溶液中、１６ ℃にて２．５時間、２５ｎｇのＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ で連結した。この反応液の５μｌおよび２．５μｌが各々１００μｌおよび５０ μｌの受容能のある大腸菌ＤＨ５α細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）の形質転換に使用された（この細胞に対して提供されたプロトコー ルを用いて）。形質転換された細胞は１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＩＴおよび０．２％Ｘ−ｇａｌを加えたＬ−寒天上に起き３７℃で一夜イン キュベートした。ｃＤＮＡ挿入物を含むクローンが親プラスミドを含む細胞によ り発生される青色と比較して白色のコロニーを上記培地上に産生することに基づ いて選択された。５０のバッチの２００の白色コロニーをＬ−寒天にアンピシリ ンを加えたプレート上のニトロセルロースディスク（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａ ｎｄ Ｓｃｈｕｌｌ）上に二重に選びとった。フィルターを含まないプレートの 第三の組は選択されたコロニーのマスター保存物を形成させるために画線培養さ れた。３７℃で一夜インキュベーション後、ニトロセルロースフィルターを除去 しＧｕｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、第１章 、１０２ページ）に従って処理することによりその場所で細菌細胞を溶解した。 種々の試薬（１０％ＳＤＳ２分、３Ｍ ＮａＯＨ）１Ｍ ＮａＣｌ５分および１ Ｍトリス、ｐＨ６．８ ２ｘ２分）に浸した３ＭＭ濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ）上に このフィルターをかぶせた。溶菌細胞を含んでいるフィルターは、２０ｘＳＳＣ （３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）で湿らせた３ＭＭ濾紙に移し 、自動架橋にセットした（１２０，０００ジュール）Ｓｔｒａｒａｌｉｎｋｅｒ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｌｔｄ．）中でＵＶ光へ暴露することによりＤＮＡを フィルターに架橋した。プロービング（下記参照）に使用する前にフィルターを 風乾した。マスター保存物プレートは必要になるまで４℃で保存した。 ３．１（ｃ）ｃＤＮＡライブラリースクリーニング ｃＤＮＡライブラリースクリーニングのために有効なプローブを発生させるた め、５５．１重鎖および軽鎖の可変領域ＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ 、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ ２３０ ｐ１３５０−１３５４）により単離された。このことは両方の鎖のＮ−末端蛋白 質配列データが入手可能であったため可能であった（上記参照）。このデータは ５’ＰＣＲプライマー（配列ＩＤ番号：１−４）の設計に使用された。各々の配 列に対し二つのプライマーが合成され、一つは報告された配列（Ｓｅｑｕｅｎｃ ｅｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅ ｓｔ，第四版，１９８７，Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｒｅｉｄ− Ｍｉｌｌａｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ ．，Ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈ ｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓにより出版、以後Ｋａｂａｔとして参照される）か ら決定されたマウスＶ−領域に最も共通して存在する配列に基づいており(配列 ＩＤ番号：１および３)、および別のものはいくつかのコドン選択を包含するた めにいくつかの塩基位置での宿重を含んでいる（配列ＩＤ番号：２および４）。 ３’末端のためのＰＣＲプライマー（配列ＩＤ番号：５および６）は各々Ｋａｂ ａｔにより報告されたＩｇＧ１のＣＨ１の５’領域およびＣκの３’末端と相補 的である。重鎖イソタイプはアッセイにより（上記参照）決定されており、Ｎ− 末端ＶＬ蛋白質配列は軽鎖がカッパイソタイプであったことを示した。これらの ３’不変部領域はまた親譲りのスクリーニングプローブとして使用することがで きた。 ３．１（ｄ）オリゴ合成 使用されたすべてのオリゴヌクレオチド配列はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ ３８０Ｂまたは３９４ ＤＮＡ合成機上、５’ジメトキシトリチル塩 基−保護ヌクレオシド−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ−イソピロピルホスホロ アミデートおよび制御された多孔性ガラス支持体に結合された保護ヌクレオシド から０．２μモルの規模でＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．に よる使用説明書に従って製造された。 もしくは、オリゴヌクレオチドはＡｔｋｉｎｓｏｎおよび Ｓｍｉｔｈにより ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ ｍａｎｕａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｍ．Ｔ．Ｇａｉｔ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ，３５−８１）に記載された方法により手で製造 できる。 各々合成されたオリゴヌクレオチドは固体支持体から切断後保護基を除去し、二 重に蒸留した水（１ｍｌ）に溶解された。 ３．１（ｅ）プローブ発生 可変部領域ＤＮＡ断片はＰＣＲを用いてｃＤＮＡから発生させた。１μｌのｃ ＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ゼ ラチン、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ ＰおよびｄＴＴＰ各々、１μＭの各々の適当なオリゴ対および２．５ｕＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ ｓ）を含む１００μｌの反応液に加えた。各々の反応液に１００μｌの鉱物油を 層積し、９４℃で１．５分間、７２℃で２．０分間を２５サイクルおよび７２℃ で１０分間インキュベートした。対照反応ではＤＮＡは組み込まれていなかった 。 ＰＣＲ反応物は各々の試料５μｌを０．８％アガロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ゲルで走らせ、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミ ド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ．）で染色し、Ｕ ＶトランスイルミネーターでＤＮＡを可視化することにより分析された。存在す る５５．１ＤＮＡのすべてのＰＣＲで約４００ｂｐのバンドが存在し、可変部領 域の増幅が成功したことを示している。対照反応におけるＤＮＡバンドの不在は 使用された試薬には夾雑したＤＮＡが含まれていなかったことを示している。 各々のＰＣＲ生成物はＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １００マイクロコンセントレータ ー（Ａｍｉｃｏｎ Ｌｔｄ）を使用して精製された。各々の反応液をコンセント レーターに加え、二回蒸留水を加えて液量を２ｍｌに増量した。ユニットを２０ ００ｒｐｍで５分間遠心分離し、”流れ出た”ものは廃棄した。保持されたもの は再び２ｍｌに希釈し、ユニットを再び遠心分離した。この過程は３回繰り返さ れた。この方法により、増幅されたＤＮＡから過剰のオリゴおよび緩衝液成分が 除去された。 増幅されたＶＨおよびＶＬ断片は重鎖および軽鎖ｃＤＮＡクローンのための特 異的ハイブリダイゼーションプローブの発生に使用された。放射性標識プローブ は下記のようにＴ７ ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅキット（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）を用いて発生させた：５μｌ（約５０ｎｇ） の精製ＰＣＲ生成物を３２μｌの２回蒸留水に加え、１００℃で２分間インキュ ベートして二本鎖ＤＮＡを変性させた。この試料は氷上で冷却した後、１０μｌ の試薬混合物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびランダムオリゴプライマー （主として９−ｍｅｒ）を含む緩衝化水溶液）、２μｌのα３２Ｐ ｄＣＴＰ（ ２０μＣｉ ３０００Ｃｉ／ナノモル、ＮＥＮ）、および１μｌのＴ７ポリメラ ーゼ（４−８ｕ）を加えた。反応液は３７℃で２０分間インキュベートした後、 １０ｍｌの６ｘＳＳＣ（１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ クエン酸ナトリウム）、０ ．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および０．２５％Ｍａｒｖｅｌ^TM（脱 脂乾燥牛乳粉末）を加え、プローブ溶液として使用された。 ３．１（ｆ）ライブラリープロービング 選択されたクローン（上記）を含む処理フィルターは（二つのバッチ）９０ｍ ｌの６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび０．２５％Ｍａｒｖｅｌ^TM中、回転ガラ ス管を用いてＴｅｃｈｎｅ ＨＢ−１ハイブリダイゼーションオーブンで６５℃ にて３時間プリハイブリダイズされた。二つの組は各々次に１０ｍｌのプローブ 溶液（一つの組はＶＨプローブで、他の組はＶＬで）中、同一の装置を用いて６ ５℃で一夜プローブを結合させた。インキュベーション後、各々の組のフィルタ ーを同一装置を用いて１００ｍｌの６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１ ５分、１００ｍｌの３ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分、および１ ００ｍｌの１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分洗浄した。洗浄され たフィルターは風乾し、ファーストタングステン酸塩増感スクリーンとともにＨ ｙｐｅｒｆｉｌｍ^TM ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ） を用いて−７０℃でオートラジオグラフィーを行った。Ｋｏｄａｋ自動フィルム 処理機でフィルムを現像すると、二つの潜在的重鎖ｃＤＮＡクローンおよび一つ の潜在的軽鎖ｃＤＮＡクローンが適切なプローブのハイブリダイゼーションによ り明瞭に同定された。同定された抗体ｃＤＮＡクローンの頻度はハイブリドーマ ｃＤＮＡライブラリーに典型的なものであった（Ｌｅｖｙ，Ｓ． ｅｔ ａｌ， １９８７，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ ５４，ｐ１６７−１７３）。 ３．１（ｇ）ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析 ハイブリダイゼーションにより同定された潜在的重鎖および軽鎖ｃＤＮＡクロ ーンはマスタープレートから採取し大規模プラスミドＤＮＡ製造に使用された。 各々のクローンは５００ｍｌ三角フラスコ中、アンピシリンを加えた２００ｍｌ のＬ−ブロスへの接種に使用された。培養物は３７℃で一夜振とうさせてインキ ュベートした。増殖後、各々の培養からの細胞をＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心 機およびＧＳ３ローターを用い４℃で１０分間５０００ｘｇで遠心分離すること によりペレット化した。各々の培養からの細胞ペレットは２０ｍｌＴＥ緩衝液に 再懸濁し、オークリッジチューブ中Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心機およびＳＳ −３４ローターを用い４℃で１０分間２０００ｘｇで再び遠心分離した。各々の 洗浄された細胞懸濁液を３ｍｌの氷冷２５％ショ糖、５０ｍＭトリス、ｐＨ８． ０、に再懸濁し氷上に放置した。新鮮なリンザイム溶液（１．０ｍｌ、１０ｍｇ ／ｍｌ）を加え、内容物をチューブを回転させることにより混合し、５分間イン キュベーションを続けた。エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）溶液 （１．０ｍｌ、０．５ｍＭ、ｐＨ８．５）を加え、内容物を穏やかに混合した。 最後に、５．０ｍｌの氷冷トリトンＸ溶液（０．１％トリトンＸ−１００、６２ ．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）を加えて内容物を穏やかに 混合し氷上のインキュベーションをさらに１０分間続けた。細胞破片はＳｏｒｖ ａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心機およびＳＳ−３４ローターを用い４℃で３０分間３９， ０００ｘｇで遠心分離することによりペレット化した。プラスミドＤＮＡを含む 上清に１６ｇの塩化セシウムおよび１５０μｌのエチジウムブロミド溶液（１０ ｍｇ／ｍｌ）を加え、ＴＥ緩衝液を加えることにより液量を１８．５ｍｌとした 。この溶液は１８．５ｍｌのクリンプトップ ポリエチレン遠心管（Ｓｏｒｖａ ｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に移した。遠心管を封じＳｏｒｖａｌｌ ＴＶ ８６５Ｂ（チタン、垂直）ローターおよびＯＴＤ６５Ｂ遠心機を用い１８℃で１ ６時間、 １８０，０００ｘｇで遠心分離した。 遠心分離後、プラスミドＤＮＡは形成されたＣｓＣｌ／ＥｔＢＲ密度勾配中に はっきりしたオレンジ色のバンドとして認められた。管壁を刺し通すために皮下 注射用の注射器を用いて濃度勾配液からプラスミドＤＮＡを取りだした。濃度勾 配液から取りだした試料は３−４倍ＴＥ緩衝液で希釈し、等量のイソプロピルア ルコールを加えて氷上で１０分間インキュベーションしてＤＮＡを沈澱させた。 沈澱したＤＮＡはＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｃ遠心機およびＳＳ−３４ローターを 用い４℃にて１７，０００ｘｇで遠心分離することによりペレット化し、上清は 廃棄した。得られたペレットは７０％エタノール（ｖ／ｖ）で洗浄し、５分間再 び遠心分離した。ペレットは次に真空下で乾燥し、１．８ｍｌのＴＥ緩衝液およ び２００μｌの酢酸ナトリウム溶液に再懸濁して等量のフェノールで抽出し、相 の分離には１７，０００ｘｇ、２分間の遠心分離を用いた。水相を等量のフェノ ールで再び抽出した後、−２０℃で等量のエタノールを加え、氷上で１０分間イ ンキュベートしてＤＮＡを沈澱させた。精製されたＤＮＡは上記のようにペレッ ト化し、７０％エタノールで洗浄し、ペレットを真空下で乾燥させた。乾燥ペレ ットは５００μｌの２回蒸留水に再懸濁し、希釈した試料の３００から２２０ｎ ｍをＵＶ分光光度計で走査し、５０μｇ／ｍｌ／ＯＤ ２６０ｎｍの吸光係数を 用いてＤＮＡ濃度を推定した。 この精製プラスミドＤＮＡはＤＮＡ配列分析に使用された。Ｕｎｉｔｅｄ Ｓ ｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙにより供給され、提供さ れるプロトコールに従うＳｅｑｕｅｎａｓｅキットのような独占的配列決定キッ トを用いるＳａｎｇｅｒのダイデオキシ鎖停止法（Ｐｒｏｃ．Ｎｓｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，１９７７，ｐ５４６３）により二本鎖ＤＮＡをＤＮ Ａ配列分析に使用できる。 重鎖および軽鎖ｃＤＮＡクローンプラスミドＤＮＡの一部（２−４μｇ）がＤ ＮＡ配列分析に使用された。各々の試料は最初に０．２Ｍ ＮａＯＨ、０．２ｍ Ｍ ＥＤＴＡ（最終容量１００μｌ）と室温で１０分間インキュベーションする ことにより変性させた。変性ＤＮＡは１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５． ０）および２７５μｌのエタノールを加え、氷上で１０分間インキュベーション して沈澱させた。沈澱したＤＮＡは前にプラスミドＤＮＡで記載したように回収 された。変性ＤＮＡは、各々をＳｅｑｕｅｎａｓｅ反応緩衝液（４０ｍＭトリス 、ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＮａＣｌ）および１０％ジメ チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下、０．５ピコモルの適当なプライマーと６ ５℃で２分間、続いて徐々に３０℃以下に冷却するインキュベーションにより配 列決定のためのプライマーを連結した。これらのプライマーが連結された鋳型は 次に、１０％ＤＭＳＯが標識および停止混合物に添加されているプロトコールに 従って配列決定反応で使用された。 配列決定反応は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓａｎｇｅｒおよ びＣｏｕｌｓｏｎ，１９７８，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．８７，ｐ１０７）後のオー トラジオグラフィーにより分析された。 クローン化ｃＤＮＡの完全重鎖および軽鎖配列は以下に与えられている（Ｈ鎖 ｃＤＮＡは配列ＩＤ番号：２３、アミノ酸は配列ＩＤ番号：３６であり図１５に それら間の配置が与えられており、同様に配列ＩＤ番号：２４はＬ鎖ｃＤＮＡを 示しており、配列ＩＤ番号：３７はアミノ酸配列を示しており、および図１６は それらの間の配置を示している）。これらのコード配列の確実性は、精製された 抗体蛋白質から演繹されたＮ−末端蛋白質配列と比較することにより確認された 。ＤＮＡ配列からまた抗体がＩｇＧ１κイソタイプであることが確認された。 ３．２ミエローマ細胞中での全５５．１抗体の発現 以下の実施例はｐＲｃ／ＣＭＶ内へクローン化した配列（図８）を用いたミエ ローマ細胞からの５５．１抗体の発現を記載している。 ｐＲｃ／ＣＭＶ（図８）は高レベル転写のためヒトサイトメガロウイルス（Ｃ ＭＶ）の即時初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列、ゲネチシン硫 酸（Ｇ４１８）耐性安定細胞株の分泌のためネオマイシン耐性遺伝子、プロモー ター配列から下流の独特の制限酵素部位（ＨｉｎｄIII、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ 、ＸｂａＩおよびＡｐａＩ）およびクローニング部位の３’のウシ成長ホルモン からのポリアデニル化信号／転写停止配列を使用する。 ３．２（ａ）ｐＲｃ／ＣＭＶ内へのサブクローニング ５５．１ｃＤＮＡは切り出し可能で無傷な、ＮｏｔＩ断片上のｐブルースクリ プトベクターからのものである。各々の断片はその後、ＣＭＶプロモーターから の発現を可能にするために独立してｐＲｃ／ＣＭＶのＮｏｔＩ部位内へクローン 化できる。 種々のＤＮＡの一部、ｐＲｃ／ＣＭＶ（３μｇ）、ｐ５５．１Ｈ（５μｇ）お よびｐ５５．１Ｌ（１０μｇ）はＮｏｔＩ（５ｕ／μｇ）、１０ｍＭ トリス− 酢酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウムおよび ０．１％トリトンＸ−１００を含む溶液中、３７℃で最低１時間インキュベート して別々に消化される。さらにｐＲｃ／ＣＭＶ ＮｏｔＩ消化物はその後同一の 溶液中、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（２ｕ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）と８０℃で１５分間処理された。これは連結 反応によるベクターの再環化を防止するためである。完全消化物はアガロースゲ ル電気泳動により分析され、適当なＤＮＡ断片（ｐＲｃ／ＣＭＶベクターバンド 、５．５Ｋｂｐおよび５５．１ＨおよびＬ挿入物、１．５Ｋｂｐおよび８００ｂ ｐ）をゲルから切り出して上記のように精製した。 別に、各々の５５．１ｃＤＮＡを上記のようにｐＲｃ／ＣＭＶベクターと連結 する。連結されたＤＮＡは応答力のあるＤＨ５α細胞の形質転換に使用し、プラ スミドＤＮＡ調製試料および５５．１ＨおよびＬ鎖挿入物を持つｐＲｃ／ＣＭＶ クローンを同定するためのＮｏｔＩによる制限酵素分析のためにアンピシリン耐 性クローンを採取した。続いてＰＣＲが適切なＮｏｔＩ挿入物を発現するために 正しい配向の挿入物を持つクローンの同定に使用された。各々の推定クローンか らの一つのクローンが１ｍｌの２回蒸留水に再懸濁される。細胞は６０００ｒｐ ｍで１分間の遠心分離によりペレット化し、上清の８００μｌを捨て、細胞ペレ ットは残りの２００μｌに再懸濁する。次に細胞を１００℃で１分間インキュベ ートして破壊し、不溶性物質は１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してペレット とする。透明化した上清の１μｌを、Ｔ７プロモータープライマー（配列ＩＤ番 号：７）および内部Ｈ鎖のためのＨ鎖プライマー（配列ＩＤ番号：８）かまたは 内部Ｌ鎖のためのＨＬプライマー（配列ＩＤ番号：６）、２００μＭ ｄＮＴＰ 、 １０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ₂、０．０１％ゼラチンおよび０．５ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ ｔａｑ）の２０μｌＰＣＲ反応に使用し、２０μｌの軽鉱物油（Ｓｉｇｍａ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ．）を層積する。ＤＮＡを含まない対 照反応が試薬溶液の夾雑物を検出するために組まれた。すべての反応液は９４℃ で１．５分、５０℃で１．０分、７２℃で２分を２０サイクル、最後に７２℃で １０分プログラム可能熱制御機（Ｔｅｃｈｎｅ ＰＨＣ−１）中でインキュベー トする。ＰＣＲ生成物は全反応物を０．８％アガロースゲルで走らせることによ り分析される。発現のために正しい断片配向を持つクローンは対照反応と比べた ときにＰＣＲ生成物（Ｈ鎖では約９００ｂｐ、Ｌ鎖では約６００ｂｐ）の存在に より同定される。正しくない断片配向のクローンは、両方のオリゴヌクレオチド が同じＤＮＡ鎖で開始するためＰＣＲ生成物を生成しない。正しい配向を持つ一 つのＨ鎖クローンはｐＲｃ／５５．１Ｈと名付けられ、正しいＬ鎖クローンはｐ Ｒｃ／５５．１Ｌである。 前記のような大規模プラスミド製造がこれらのクローンを用いて実施され、骨 髄腫細胞のトランスフェクションに十分なＤＮＡが提供される。トランスフェク ションに先だって、各々のプラスミドＤＮＡ（ｐＲｃ／５５．１Ｈ、ｐＲｃ／５ ５．１ＨおよびｐＲｃ／ＣＭＶ）の試料（５０μｇ）は、２５ｕ ＢｇｌII、６ ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＮａＣｌ および１ｍＭ ＤＤＴを含む溶液中、３７℃で最低１時間ＢｇｌIIで完全に消化 する。ＢｇｌIIは抗体配列および重要な制御要素の外側の点でプラスミドＤＮＡ の直線状化を起こし、宿主ゲノム内への発現カセットの組み込みを容易にする。 ３．２（ｂ）骨髄腫細胞のトランスフェクション 真核細胞内へのＤＮＡの導入にはいくつかの方法が存在する（Ｂｅｂｂｉｎｇ ｔｏｎ，Ｃ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ ２，ｐ１３６−１４５）。 リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱に代わって最近はエレクトロポレーションが日 常的に使用される方法になってきた。しかしながら、前者の方法は染色体ＤＮＡ 内へのプラスミドＤＮＡの組み込みが高頻度であるという利点を持っており、各 々同一の耐性マーカーを運ぶ二つのプラスミドの同時トランスフェクションが必 要とされるこの場合には好適である。ＨおよびＬ鎖を運ぶプラスミドの同時トラ ンスフェクション後に生成されるＧ４１８耐性コロニーの集団は機能的抗体分子 を発現するであろうことが期待される。ＮＳ０骨髄腫細胞（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８１，７３Ｂ，ｐ３、ＥＣＡＣＣ カタログ番 号８５１１０５０３）は内因性分泌抗体蛋白質が存在しないので、この研究に適 した宿主細胞である。 使用された方法はＧｏｒｍａｎ（１９８６，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｖｏｌ ．２，ｐ１４３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の方法に 基づいている。非選択的培地中（ダルベッコ改良イーグル培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．、に１０％のウシ胎児血清を加えたもの）、対 数的に増殖しているＮＳ０細胞を、１０ｍｌの非選択的増殖培地を含む９ｃｍの ペトリ皿に皿あたり５ｘ１０⁵の密度で播種し、３７℃で２４時間インキュベー トする。６２ｍｌ ＣａＣｌ₂を含む０．５ｍｌの水溶液中、直線状化プラスミ ドＤＮＡ（ｐＲｃ５５．１ＨおよびｐＲｃ５５．１Ｌ）を同じ比率で混合した（ 各々２．５、５または１０μｇ）。各々の混合物は次に連続的に撹拌しながら０ ．５ｍｌの２ｘＨＢＳ溶液（２８０ｍＭ ＮａＣｌ、２．８ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ 、４６ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．１）へ滴加する。リン酸カルシウム−ＤＮＡ 沈澱物の形成を助けるため混合物に空気を吹き込む。 ＮＳ０細胞から増殖培地を除き、１０ｍｌの無血清培地で洗浄し、それも廃棄 された。リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈澱物を１ｍｌの無血清培地とともにペトリ 皿に加える。いくつかの異なった比率の二つの発現プラスミドが使用され、対照 としてｐＲｃ／ＣＭＶが二つの異なった量で（５および１０μｇ）使用された。 ＤＮＡを含まない対照もまた組み立てられる。細胞は沈澱物の存在下３７℃で、 時々プレートの一部の乾燥を防ぐために揺れ動かしながら４時間インキュベート する。次に細胞から沈澱物を除き、３ｍｌの１５％のグリセロールを含む１ｘＨ ＢＳに置き換えて３７℃で１．５分経った後に１０ｍｌの無血清培地で洗浄する 。細胞は次に１０ｍｌの非選択的培地中、３７℃で２４時間インキュベートする 。 ２４時間後に選択的培地（ＤＭＥＭに１０％ＦＣＳおよび１．５ｍｇ／ｍｌの Ｇ４１８−ゲネチシン硫酸塩、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ． ）をトランスフェクトした細胞に応用し、Ｇ４１８耐性コロニーが出現するまで この選択的条件に細胞を維持する。コロニーを採取し、ＥＬＩＳＡによる抗体発 現の分析のためＧ４１８選択下で継代培養する（下記参照）。 ３．３ 大腸菌での５５．１の断片の発現 以下の実施例は大腸菌中のプラスミドベクターからのキメラＦａｂ’およびＦ （ａｂ’）２断片（ヒト不可変領域とともに）および５５．１の一本鎖Ｆｖ（ｓ ｃＦＶ）の発現を記載している。 ３．３（ａ） ベクター系 大腸菌の周縁質内への抗体断片の分泌を可能にするプラスミド発現ベクターは いくつかのグループにより記載されている（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ，１ ９９１，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ ９，Ｐ２７３−２７８。Ｃａ ｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ １０，ｐ１６３−１６７。Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｖｏｌ ９０，ｐ４５７−４６１）。これらは 一般的に、選択された大腸菌宿主内での選択および複製を可能にするベクターバ ックグラウンド（ｐａＴ１５３、ｐＵＣ１９など）において、各々それ自身の分 泌リーダー配列（ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡなど）を持つＦｄ’およびＬ鎖の共発現を 指示する制御可能なプロモーター（ｌａｃ、ａｒａＢ、ｌｐｐなど）を含んでい る。Ｔｃ耐性遺伝子、Ｔ４転写停止配列およびｃｅｒ安定性機能（ｒｅｆ）を持 つｐＡＴ１５３に基づくベクター内へ、サルモネラ チフィムリウムからのＰＣ Ｒにより誘導されたａｒａＢ／Ｃプロモーター／レプレッサー要素を導入するこ とによりそのようなベクターを構築した。二つのｐｅｌＢリーダー配列およびヒ トＣＨ１およびＣＫ配列はｐＳＷ１ＦａｂＤ１．３（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ，１９９１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ １９６，ｐ１５１−１５ ５）から誘導された。さらに、ｐｅｌＢリーダー配列は特異的制限部位を導入す るために部位特異的突然変異誘発により修飾された。Ｈ鎖断片の上流のｐｅｌＢ 配列は 特異的ＮｃｏＩ部位を導入するために修飾された、すなわち ５’．．．ＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣ ３’ ここで下線を付けた塩基はＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を創り出すために本 来の配列のＧがＣに置換されていることを示している。 上記のＮｃｏＩ部位を含む単一のｐｅｌＢリーダー配列および他のベクター特 性を持つベクター（ｐＩＣＩ２６６）はブタペスト条約のもとＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄ （ＮＣＩＭＢ），２３ Ｓｔ．Ｍａｃｈａ ｒ Ｄｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２ １ＲＹ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，Ｕ． Ｋ．に寄託された。 同様に、Ｌ鎖から上流の第二のｐｅｌＢリーダー配列内へ特異的ＳｆｉＩが導 入された、すなわち ５’．．．ＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣＣＡＧＧＣＣ ３’ ここで下線を付けた塩基はＳｆｉＩ部位（ＧＧＣＣＣＡＡＣＣＧＧＣＣ）を導 入し、第二のＮｃｏＩ部位の創造を妨げるための塩基置換を示している。この文 字変換はアミノ酸置換を余儀なくさせるが（ＭｅｔからＧｌｎ）、Ｃ−末端部分 （Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｌａ）はｏｍｐＡリーダーのものと同一であるので分泌に は影響しないことが期待される。 これらの修飾はＶＨではＮｃｏＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片およびＶＬではＳｆｉＩ −ＸｈｏＩ断片上の適当なＣ領域の上流および枠内に抗体Ｖ領域の挿入を可能に する。このプラスミドはＮ−末端アミノ酸置換なしに異なった抗体のＶ領域が挿 入できるという以前に記載されているベクターよりも便利な点を持っている。 ＣＨ１配列もまた二量化を促進するため、Ｌ鎖相互作用、完全なヒンジ領域お よびＣＨ２内への伸長のためのｃｙｓ残基の再導入により本来のｐＳＷ１Ｆａｂ ベクターを修飾したものである。このことは本来の配列のＳａｌＩおよびＳｐｈ Ｉ部位の間に合成オリゴヌクレオチド配列を挿入し（配列ＩＤ番号：９および１ ０）、続いて最初の挿入物のＰｍｌＩおよびＨｐａＩ部位の間にさらに合成オリ ゴヌクレオチド配列を挿入する（配列ＩＤ番号：１１および１２）ことにより達 成される。 ＦｄおよびＬ鎖間の共有結合による相互作用を可能にするため、Ｃκ中のＣ− 末端ｃｙｓ残基もまた部位特異性突然変異誘発により復元される。 プラスミドｐＩＣＩ１６４６は図２に示されている。 ３．３（ｂ）５５．１Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２発現クローンの発生 ３．３（ｂ）ｉ ５５．１Ｖ領域断片の単離 合成オリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号：１３−１６）はＰＣＲを用いてｃＤ ＮＡクローンから５５．１ＶＨおよびＶＬ領域を単離するために設計された。そ の後のｐＩＣＩ１６４６へのクローニングを可能にするためにオリゴは適当なク ローニング部位（ＶＨに対してはＮｃｏＩおよびＢｓｔＥIIおよびＶＬに対して はＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ）を導入する。 ＰＣＲは２００μＭ ｄＮＴＰｓ，１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）， ５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．０１％ゼラチンおよび２．５ ｕＴａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ）を含む１００μｌの反応液に１５ｎ ｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の５５．１ＨまたはＬ鎖ｃＤＮＡク ローン）、１００ピコモルの各々のオリゴ（ＶＨに対しては配列ＩＤ番号：１３ および１４、およびＶＬに対しては配列ＩＤ番号：１５および１６）を加え１０ ０μｌの軽鉱物油を層積した。ＤＮＡを含まない対照反応が試薬溶液の夾雑物を 検出するために組まれた。すべての反応液は９４℃で１．５分、５０℃で１．０ 分、７２℃で２分を２０サイクル、最後に７２℃で１０分プログラム可能熱制御 機（Ｔｅｃｈｎｅ ＰＨＣ−１）中でインキュベートした。ＰＣＲ生成物は５μ ｌの試料を０．８％アガロースゲルで走らせることにより分析された。 ＶＨおよびＶＬ断片を含むＰＣＲ反応液の残りはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １００ 微量濃縮器を使用し、各々２ｍｌの２回蒸留水中１０００ｘｇで５分間で３回洗 浄して（上記のように）過剰のオリゴを除去し、精製した。単離されたＶ領域断 片を含む保持物をとり、７０％エタノールおよび０．３Ｍ酢酸ナトリウム中、氷 上に１０分間置いてＤＮＡを沈澱させた。各々のＤＮＡは次に１３０００ｒｐｍ で１０分間遠心分離してペレット化し、ペレットは７０％エタノールで洗浄して 真空下で乾燥させた。 ３．３（ｂ）ｉｉ ５５．１ＶＨ断片の制限消化 ＰＣＲで単離した５５．１ＶＨ生成物は次に、１０ｍＭトリス−酢酸、ｐＨ７ ．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウムおよび２５ＵのＢｓｔ ＥIIを含む２００μｌの溶液に懸濁し、６５℃で１時間インキュベートすること によりＢｓｔＥIIで消化された。この反応液は氷上で冷却し、ＮｃｏＩによる消 化は緩衝液成分を２倍にし、５０ｕのＮｃｏＩを加えて３７℃で１時間インキュ ベーションすることにより実施された。消化されたＤＮＡはエタノールで沈澱さ せ、２０μｌの無菌２回蒸留水に懸濁した。消化された断片は次に０．７５％Ｓ ｅａＰｌａｑｕｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ゲ ルで電気泳動し、ゲルから精製された各々の断片は提供されたプロトコールに従 ってフェノール抽出された。ＤＮＡは続いてエタノールで沈澱され１０μｌの無 菌の蒸留水に再懸濁した。各々の断片の試料１μｌを０．８％アガロースゲルで 電気泳動してＤＮＡ濃度を算定した。 ３．３（ｂ）ｉｉｉ ５５．１ＶＨ断片のｐＩＣＩ１６４６へのクローニング ｐＩＣＩ１６４６の試料５μｇを上記５５．１ＶＨ断片と同じようにＢｓｔＥ IIおよびＮｃｏＩで消化した。消化したＤＮＡは上記のように精製され、ＤＮＡ 濃度が算定された。 １００ｎｇのＢｓｔＥII−ＮｃｏＩベクター断片、５０ｎｇのＢｓｔＥII−Ｎ ｃｏ Ｉ５５．１ＶＨ断片および２．５ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼを３０ｍＭトリ ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍ Ｍ ＡＴＰの中に含む１０μｌの結合反応液が準備された。結合反応液は１６℃ で２時間インキュベートした後、その１μｌが応答能のある大腸菌ＤＨ５α細胞 （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）２０μｌの形質転換に使用 された（製造元から提供される使用説明書に従って）。形質転換された細胞は１ ０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬ寒天プレートにおかれ、３７℃で一夜 インキュベートされた。 六つのテトラサイクリン耐性コロニーが寒天プレートから採取され、各々１０ μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加えた１０ｍｌのＬブロス内へ接種された。こ れらの培養物は３７℃で、振とうしながら一夜インキュベートし、Ｍａｎｉａｔ ｉｓに明記されている（１章、ｐ３８）ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法 を用いてプラスミドＤＮＡの調製に使用された。潜在的５５．１ＶＨクローンは 、親プラスミドと比較した場合に特有のＤｒａIII制限部位を獲得していること に基づいて選択された。ＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ密度勾配遠心分離を用いる大規模プ ラスミド製造が四つのそのようなクローンから実施され、クローンはＳｅｑｕｅ ｎａｓｅキット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ ｒｐ．）で提供されるようなＳａｎｇｅｒの方法に従ってＤＮＡ配列分析により 証明された。正しい配列を持つ一つのクローンがｐＩＣＩ１６５５と名付けられ た。 ３．３（ｂ）ｉｖ ５５．１ＶＬ断片のｐＩＣＩ１６５５へのサブクローニング 単離された５５．１ＶＬ断片およびｐＩＣＩ１６５５プラスミドＤＮＡ（各々 約５μｇ）を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ ０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＤＴＴを含む２００μｌの反応液中２５ｕのＳ ｆｉ Ｉで１時間５０℃で消化した。その後、各々の消化物に２４ｕのＸｈｏＩを 加えて３７℃で１時間インキュベーションを続けた。消化物は次にＳｔｒａｔａ ｃｌｅａｎ樹脂で処理し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、２０μｌの無菌２回 蒸留水に再懸濁し、０．７５％ＳｅａＰｌａｑｕｅ ＧＴＧアガロースゲルで電 気泳動し、上記のように適当なベクターおよびＶＬ断片が単離された。試料１μ ｌを０．８％アガロースゲルで電気泳動し、単離されたＤＮＡ断片の濃度が算定 された。 上記５５．１ＶＨで使用された条件下、結合液は１００ｎｇの ｐＩＣＩ１６ ５５ ＳｆｉＩ−ＸｈｏＩ断片、５０ｎｇの５５．１ ＶＬ ＳｆｉＩ−Ｘｈｏ Ｉ断片を含むように組み立てられた。結合液は１６℃で３時間インキュベートし た後、その１μｌが応答能のある大腸菌ＤＨ５α細胞のテトラサイクリン耐性へ の形質転換に使用された。八つのテトラサイクリン耐性コロニーが小規模プラス ミドＤＮＡ製造に選択された。これらのＤＮＡは親と比較した場合に特異的Ｓｓ ｔ Ｉ部位を喪失していることでスクリーニングされた。潜在的５５．１Ｆ（ａｂ ’）２が大規模プラスミドＤＮＡ製造のために選ばれ、前に詳しく説明されたＤ ＮＡ配列データ分析により証明された。５５．１Ｖ領域ＤＮＡ配列を持つと予想 された一つのクローンがｐＩＣＩ１６５６と名付けられた。 ３．３（ｂ）ｖ 発現試験 抗体断片発現の分析にため、ｐＩＣＩ１６５６ＤＮＡが大腸菌株ＭＣ１０００ （ＡＴＣＣ番号３９５３１）およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８）［ Ｃａｓａｄａｂａｎ，Ｍ．Ｊ．Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，１９８０，Ｊ．Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ １３８，ｐ１７９−２０７］の形質転換に使用された。こ れらはアラビノースを代謝できないａｒａ−株であり、ａｒａＢプロモーターか らの発現の導入に使用された。これらの二つの株からの応答能のある細胞が調製 され、Ｍａｎｉａｔｉｓが引用した方法（１章、ｐ７４−８４）に従ってテトラ サイクリン耐性への形質転換された。各々の株の純粋なクローンが次に培養上清 のウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによる発現の分析に使用された。 ３．３（ｂ）ｖｉ 培養上清の調製 ＭＣ１０００（ｐＩＣＩ１６５６）およびＭＣ１０６１（ｐＩＣＩ１６５６） は１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加えた１０ｍｌの２ｘＹＴブロスに接種 され、振とうしながら３７℃で一夜インキュベートした。一夜培養物はテトラサ イクリンを加えた１００ｍｌの２ｘＹＴブロス内に継代培養した（１００中１） 。これらの培養物は３７℃で振とうしながら３時間インキュベートした。３時間 後にインキュベーターのヒーターのスイッチを切り、放置して徐々に（約１時間 ）室温（２５℃）まで温度を下げた。各々の培養の１０ｍｌの試料を取り、ＯＤ₅₄₀ が測定された（約０．７）。試料を遠心分離してペレットとし（２５００ｘ ｇで１０分）、細胞および上清は前誘導試料として４℃で保存した。 アラビノース溶液（２０％ ｗ／ｖ）を１％（ｗ／ｖ）の最終濃度で各々の培 養液に加え、室温で３時間インキュベーションを続けた。その後、第二の試料１ ０ｍｌを取り、ＯＤ₅₄₀が測定され（約０．８５）、試料は遠心分離して細胞ペ レットとした。上清は４℃で保存された。 ３．３（ｂ）ｖｉｉ ウェスタンブロット分析 各々の上清試料の一部（１５μｌ）を等容量の還元剤を含む（５０ｍＭ ＤＴ Ｔ）または含まない試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ 、１０％ショ糖および０．０５％ブロモフェノールブルー）と混合した。試料は １００℃で１５分間インキュベートした後、マルチフォア装置（ＬＫＢ Ｐｒｏ ｄｕｋｔｅｒ ＡＢ）中で使用説明書に従って８−１８％アクリルアミド勾配ゲ ル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから のエクセルゲルシステム）で電気泳動を行った。電気泳動後、Ｎｏｖａｂｌｏｔ 装置（ＬＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ ＡＢ）を用い使用説明書に従って分離され た蛋白質をＨｙｂｏｎｄ Ｃ−Ｓｕｐｅｒ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎ ａｔｉｏｎａｌ）へ移した。ブロティング後、膜を風乾した。 抗体断片の存在はＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ）を用い、抗ヒトＣκ抗体−ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製品Ａ７１６４）を使用して検出された。 ウェスタンブロット分析の結果は図９に示されている。抗体断片の発現は、対 照前誘導試料と比較して誘導後の試料では信号が存在することにより明瞭に検出 された。還元剤存在下では、約２５ｋＤの単一のバンドが遊離軽鎖と一致した。 還元剤非存在下では、約５０ｋＤおよび約１００ｋＤの追加のバンドが観察され 、それらは抗体鎖が共有結合で会合したＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片と一 致した。 ３．３（ｂ）ｖｉｉｉ ＥＬＩＳＡ分析 ＥＬＩＳＡアッセイの標準法は”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ”、Ｂｕｒｄｏｎ，Ｒ．Ｈ．およびｖａｎ Ｋｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｐ． Ｈ．編、１５巻、”Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙ ｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”，Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，１９８５，Ｅｌｓ ｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．、に記載されて いる。他の情報源は”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ ｎｕａｌ”Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ｐ．１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｎから出版、である。 ＣＯＬＯ ２０５細胞（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，１９７８，Ｃａｎｃ ｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ ３８，ｐ１３４５−１３５５，ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ ３２２）への結合を検出するためＥＬＩＳＡで上清試料が使用された。ＣＯＬＯ ２０５細胞は無血清培地（Ｚｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｍ１）で培養され９６ウェルマイクロタイタープレートヘグルタルアルデヒド（ ０．１％ ｖ／ｖ ＰＢＳ溶液）で固定された（ウェルあたり１０⁵細胞）。培 養上清をウェルに加え、４℃で約７０時間インキュベートして抗体断片を結合さ せた。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．５％（ｖ／ｖ）トウィーン２０を含むＰ ＢＳで洗浄後、抗ヒトＣκ抗体−ペルオキシダーゼ複合体（上記参照）が結合抗 体断片の検出に使用された。色の発色にはｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ．）が用いられ、それはＴｈｅｍ ｏＭａｘ プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）中、４９ ０ｎｍで測定された。ＥＬＩＳＡの結果は図１０に示されている。５５．１抗体 断片によるＣＯＬＯ ２０５への特異的結合は誘導されたＭＣ１０００およびＭ Ｃ１０６１（ｐＩＣＩ１６５４）培養上清をＣＯＬＯ ２０５と異なった特異性 を持つ他の抗体断片を発現する非誘導試料または対照と比較した。 ３．３（ｃ） ５５．１ｓｃＦＶの発生 ＰＣＲを用いる抗体からのｓｃＦＶ断片の迅速な発生が報告されている（Ｄａ ｖｉｓ，Ｇ．Ｔ．ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏ ｌ ９，ｐ１６５−１６９）。構築はＶ領域の折り畳みを活性なコンホメーショ ンにする融通のきくペプチドリンカーによる抗体のＶＨおよびＶＬ領域の連結に 依存している。リンカー断片を含む離れたＶＨおよびＶＬ領域はＰＣＲにより発 生され、リンカー領域の相補性が続いてのＰＣＲにおいてのｓｃＦＶをコードす る遺伝子の創造に使用される。 ３．３（ｃ）ｉ ５５．１ｓｃＦＶ発現クローンの構築 オリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号：１３および１６−２０）がＰＣＲプライ マーとして働くように設計された。オリゴ２０は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー 配列をコードしており、その３’末端に抗体ＶＬ領域の５’領域に相補性も持っ ている。オリゴ２１はリンカー配列の補体であり、抗体ＶＬ領域の３’領域に相 補性を持っている。別のオリゴ（配列ＩＤ番号：２１）は５５．１ＶＬの３’領 域と相補的であり、さらに読み枠内に翻訳停止コドンおよびＥｃｏＲＩクローニ ング部位を持つように設計された。 ５５．１のＶＨおよびＶ１領域は上記のようにＶＨに対してはオリゴ１３およ び１７、ＶＬに対してはオリゴ１６および１８を用いる５５．１Ｆ（ａｂ’）２ 発現クローンの構築においてのＰＣＲにより単離された。これらの断片（各々約 ０．２ピコモル）は２００μＭ ｄＮＴＰｓ，１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８ ．３），５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．０１％ゼラチンおよ び１．２５ｕ Ｔａｑ ポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ）を含む５０μｌのＰ ＣＲ反応液中でオリゴ１９および２０（各々０．１ピコモル）と混合し、５０μ ｌの軽鉱物油を層積した。Ｖ領域を含まない対照反応液もまた準備された。これ らの反応液は９４℃で１分、６３℃で４分のインキュベーションを７サイクル行 った。このインキュベーション後、１００ピコモルのオリゴ１３および２１およ び２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，０．０１％ゼラチンおよび１．２５ｕ Ｔ ａｑ ポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ）を含む溶液５０μｌを加え、９４℃で １．５分、５０℃で１．０分および７２℃で２．５分を２５サイクル最後に７２ ℃で１０分インキュベーションを行った。 アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ反応液の分析から、対照ＰＣＲ反応と比 較して推定のｓｃＦＶ断片（約７５０ｂｐ）が存在していることが確認された。 上記Ｆ（ａｂ’）２発現クローンの構築で説明した方法により本断片が精製され 、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化され、ｐＩＣＩ１６４６内へクローニングさ れた。ｓｃＦｖを発現できるクローンはその後７５０ｂｐＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ 断片の存在により同定され、ＤＮＡ配列分析により確認された。 ３．３（ｃ）ｉｉ ｔａｇ配列の挿入 ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡでのｓｃＦｖ断片の検出は通常の試薬で は不可能である。ｃ−末端にｔａｇペプチドを付加させると、そのような検出が 容易になるであろう。９Ｅ１０と称されるデカペプチド（Ｍｕｎｒｏ，Ｓ．およ びＰｅｌｈａｍ，Ｈ．，１９８６，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ ４６，ｐ２９１−３００ 、ＥＣＡＣＣ番号８５１０２２０２、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １７９２）がそのよ うな目的に使用できる。このｔａｇはプラスミドｐＳＷ１Ｄ１．３ＶＨ．ＶＫ． ｔａｇ（ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ ３ ４１，ｐ５４４−５４６）からのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片上で入手可能であり 、または相補的オリゴヌクレオチドの対として合成できる（図１８および配列Ｉ Ｄ番号：２５および３５参照）。 ｐＳＷ１Ｄ１．３ＶＨ．ＶＫ．ｔａｇからのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片は精製 され、上記のように常法によりＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｓｃＦｖ発 現クローン内へクローン化された。ｓｃＦｖのｃ−末端でのｔａｇの存在はＤＮ Ａ配列分析により確認された。正しく構築された一つのクローンがｐＩＣＩ１６ ５７と名付けられた。 ３．３（ｃ） 発現試験 ＭＣ１０００およびＭＣ１０６１株をｐＩＣＩ１６５７プラスミドＤＮＡで形 質転換した後、発現の分析は上記のように培養上清のウェスタンブロット（図１ １）およびＥＬＩＳＡアッセイ（図１２）で実施されるが、ただし、検出は抗体 ９Ｅ１０とのインキュベーション続いて酸化可能基質の添加に先立って抗マウス 抗体−ペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎ ｙ、製品Ａ９０４４）と２時間さらにインキュベートされた。実施例４ 酵素的に誘導されたＦ（ａｂ）２抗原結合構造の調製 ５５．１抗体はパパインを用いる蛋白分解によりうまく切断され、以下に示し たＦ（ａｂ）２断片が得られた。 １５ｍｇの５５．１を３ｍｇ／ｍｌの濃度で、３ｍＭ ＥＤＴＡ／１００ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ５．５緩衝液に対し、４℃で一夜透析した。２ｍｇ（＝２ ００μｌ）パパイン［１０ｍｇ／ｍｌ懸濁液Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ ｅｉｍ Ｇｍｂｈ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙカタログ番号１０８ ０１４、から得られた］を２００μｌの３ｍＭ ＥＤＴＡ／１００ｍＭ酢酸ナト リウム／１００ｍＭシステイン ｐＨ５．５、で希釈し、３７度Ｃで３０分間イ ンキュベートした。過剰のシステインを消化物のクロマトグラフィーにより還元 パパインから除去した（５ｍｌのセファデックスＧ２５［Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ］のカラムを用い、４度Ｃで３ｍＭ ＥＤＴＡ／ １００ｍＭ塩化ナトリウム、緩衝液ｐＨ５．５、で溶出）。ＵＶ吸収［Ａ２９０ ｎｍ］をモニターして溶出される還元パパインの分画を集めた。還元パパインの 濃度は吸光係数２．５を用いて計算された。 抗体に対する酵素比３０対１で還元パパイン５００μｇを前もって透析した５ ５．１抗体に加えた。容器は次に窒素でパージし、混合物は水浴中３７℃で２０ 時間インキュベートした。０．５ｍｌの１００ｍＭ Ｎ−エチルマレイミドを加 えて反応を停止させた。 粗消化物は４℃で一夜の透析により１．５Ｍグリシン／３Ｍ塩化ナトリウム緩 衝液、ｐＨ８．９に交換し、５ｍｌのカラムのプロテインＡファーストフローセ ファロース［Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ］（同一の溶 媒で前もって平衡化）にのせた。カラムは３カラム容量のグリシン／塩緩衝液、 ３カラム容量の１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０および最後に３カラム容 量の１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．０で洗浄し、溶出液を２８０ｎｍで のｕｖ吸収でモニターし、分画を集めた。Ｆ（ａｂ）２はプロテインＡに結合し ないのでグリシン／塩洗浄した分画に溶出されており、より小さな分画はリン酸 洗浄で溶出され、および消化されていない抗体はクエン酸洗浄溶出された（ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥで決定された）。Ｆ(ａｂ)２含有分画をまとめ、保存のために３ｍ Ｍ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化塩溶液（リン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナ トリウム ｐＨ７．２）で透析した。実施例５ 免疫複合体の製造 ５．１ 抗体５５．１免疫複合体 モノクローナル抗体５５．１（２００ｍｇ）のリン酸緩衝化塩溶液（リン酸ナ トリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム ｐＨ７．２）（４．４ｍｇ／ｍｌ）を４ ℃で膜濾過（Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ１０膜、Ａｍｉｃｏｎ Ｌｔｄ．，Ｓｔｏｎｅ ｈｏｕｓｅ，Ｇｌｏｕｃｓ．Ｕ．Ｋ．）して１２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。濃縮 液は０．５容量のホウ酸緩衝液（１００ｍＭホウ酸ナトリウム ｐＨ９．１）で 希釈した。蛋白質濃度は２８０ｎｍでの吸収をモニタリングにより決定され、混 合溶液のｐＨは８．８＋／−０．１であった。 Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（”リンカー ”）を乾燥、再蒸留ジメチルホルムアミドまたはアセトニトリルに１０ｍｇ／ｍ ｌの濃度で溶解させた。この液の一部（０．３５２ｍｌ；３．５２ｍｇのＮ−ス クシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレートを含んでいる）を濃縮 抗体溶液にすぐに加えた。得られる溶液を混合し、次に１５℃で１時間放置した 。溶液は次に、過剰の試薬を除去し、緩衝液が誘導体化された抗体を交換させる ため２．６ｘ５８ｃｍのＧ２５セファデックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓ ａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラムによるゲル浸透クロマトグラフィー（５０ｍＭリ ン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ８． ０を２ｍｌ／分の流速で用いる）で脱塩した。もしくは反応生成物は十字流濾過 により除去できる。脱塩され誘導体化された抗体はプールし、２８０ｎｍでのｕ ｖ吸収のモニタリングにより蛋白質濃度が決定された。リンカーによる誘導体化 の程度は、過剰のジチオスレイトールを加え、３４３ｎｍで遊離チオピリジル基 の放出をモニターすることにより決定された。誘導体化の程度は抗体モルあたり ４から６のリンカー基であることが観察された。 組換え体リシンＡはリシンＡの溶液をｐＨ８のリン酸緩衝液中、過剰のジチオ スレイトールで処理して還元し、十字流濾過により濃縮された。５０ｍＭリン酸 ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ８．０を ２ｍｌ／分の流速で用いる２．６ｘ５８ｃｍのＧ２５セファデックス（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラムによるゲル浸透クロマトグ ラフィーにより過剰の試薬を除去した。 組換え体リシンＡ（１９０ｍｇ）および誘導体化抗体（１９０ｍｇ）溶液を１ ：１（ｗ／ｗ）のリシンＡ／誘導体化抗体比で混合することにより組換え体リシ ンＡが誘導体化抗体に結合された。２０％ ｖ／ｖまでグリセロールを加え、容 器をアルゴンでパージした。得られた溶液は１５℃に４０から６５時間維持され た。 抗体上の過剰のリンカー基にキャップ形成させるため、システインを最終濃度 ０．２ｍＭまで加えた（抗体上のリンカー基に対して少なくとも１０倍モル過剰 に）。この溶液は２０℃に２から３時間維持された。システインによるキャップ 形成に続いて、生じた免疫毒素の試料は過剰のジチオスレイトールで処理し、反 応の完了を定量化するために３４３ｎｍでモニターした。 複合体を含む溶液は膜濾過（Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ１０膜、Ａｍｉｃｏｎ Ｌｔ ｄ．，Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ，Ｇｌｏｕｃｓ．Ｕ．Ｋ．）し、５０ｍＭリン酸ナ トリウム／２５ｍＭ塩化ナトリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液を３ｍｌ／分の流 速で用いる２．６ｘ５０ｃｍのゲル浸透クロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ ＨＲ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａ ｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に応用する。この工程の効率はカラム溶出液のｕｖ吸収の ２８０ｎｍでのオンライン測定によりモニターされ、免疫毒素および非結合抗体 が非結合リシンＡから分離された。免疫毒素および抗体の混合物を含むピークを プールし、２８０ｎｍでのｕｖ吸収のモニタリングにより蛋白質濃度が決定され た。 非結合抗体および免疫毒素の両方を含む溶液は１Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨ６ ．３に調整し、トリアジン色素マトリックスＭｉｍｅｔｉｃ Ａ６ＸＬ（ＡＣＬ ｐｌｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ．）の８ｘ２６ｃｍのカラムを用い、１． ５ ｍｌ／分の流速でクロマトグラフィーを行った。カラムを１００ｍｌの出発緩衝 液で洗浄して非結合抗体を溶出させ、免疫毒素は０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む 出発緩衝液で溶出された。免疫毒素溶液はリン酸緩衝化塩溶液に対して透析し、 ０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過し、４℃で保存した。 免疫毒素の純度はＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により決定され、全部で ４５ｍｇの免疫毒素は：５０から６０％のモノリシンＡ誘導体、１０から３０％ のジリシンＡ誘導体、５から１５％のトリリシンＡ誘導体および＜１０％の非誘 導体化抗体の組成であった。 もしくは、精製過程においてゲル濾過工程（残存ｒ−リシンＡの除去）および 色素親和性クロマトグラフィー工程（残存５５．１抗体の除去）の順番を入れ換 えてもよい。この変法においては、システインで未反応リンカー部分の遮断後す ぐに（上記参照）複合体混合物は伝導度５ｍＳ未満の蒸留水で希釈される。１Ｍ 酢酸でｐＨを６．０に調整し、膜濾過により溶液を透明化する。この溶液は色素 リガンドカラムに加える（２．５ｍｌ ゲル／ｍｇ 複合体形成混合物で使用さ れたｒ−リシンＡ）。カラムは次に０．６８％酢酸ナトリウムｐＨ６．０で非複 合５５．１抗体がカラムから流し出されるまで洗浄する。免疫毒素および残存ｒ −リシンＡは２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、塩化ナトリウムに関 して０．５Ｍでカラムから溶出されるであろう。この溶出液は螺旋形カートリッ ジ限外濾過システムを用いる十字流濾過により濃縮し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ ３００ＨＲのカラムに応用する（元々の結合反応に使用された抗体ｍｇごとに２ ．５ｍｌのゲルおよびカラムの全容量の＜５％の容量で）。カラムはリン酸緩衝 化塩溶液のような適した処方の緩衝液で平衡化されるであろう。 ５．２ 抗体５５．１Ｆ（ａｂ）２免疫複合体 精製されたＦ（ａｂ）２断片は最初、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン 酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．カタログ番号Ｐ３ ４１５）で誘導体化された。８ｘモル過剰のＳＰＤＰアセトニトリル溶液（１０ ｍｇ／ｍｌ）を４ｍｇ／ｍｌの濃度で９０ｍｇのＦ（ａｂ）２蛋白質の５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ８．９の溶液に加えた。よく 混合後、２４℃で６０分かき混ぜないで誘導化を進行させた。抗体断片モル当た り３から４の間の誘導体化レベルが得られた。 過剰のリンカーは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、 １ｍＭエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ８．０で平衡化した２００ｍｌのＰｈａｒ ｍａｃｉａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐ ｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いるゲル浸透クロマトグラフィーで除去された。 １００ｍｇの還元剤を含まない精製リシンＡ鎖が誘導体化Ｆ（ａｂ）２断片の ５０ｍＭリン酸緩衝液（２０％ ｖ／ｖ グリセロール）に加えられた。容器は 酸素を含まない窒素でパージして十分に撹拌した。結合反応は２４℃で４８時間 放置して進行させた。 Ｆ（ａｂ）２断片上に残っている活性化リンカー基は結合反応混合物を４ｍｇ ／ｍｌの蛋白濃度で０．２Ｍのシステインで処理することにより遮断された。 結合反応後得られた２５ｍｇの複合体はリン酸緩衝化塩溶液ｐＨ７．２で平衡 化した１５０ｍｌのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲカラムを用いるゲルク ロマトゲラフィーを用いる前の実施例に記載したように残存するｒ−リシンＡお よびシステインから分離された。残存Ｆ（ａｂ）２は色素親和性クロマトグラフ ィー（ＡＣＬ Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅ）により除去された。５０ｍｌのＭｉ ｍｅｔｉｃ Ｂｌｕｅカラムは５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化された 。複合体は５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ６．５で溶出された。この方法の総収率は２０％であった。実施例６ 抗体５５．１の選択性 免疫毒素の選択性は特に重要である；腫瘍付随抗原へ結合しないと有効性がな くなり、正常組織を標的化すると組織毒性を示す。選択性を評価するため、アセ トン固定、凍結低温切片の高感度３段階間接免疫組織学を用いて抗体５５．１と の反応性について多くのヒト正常および腫瘍組織がスクリーニングされた。 免疫組織学は切除手術または死後に得られたヒト組織について実施された。最 適の形態および抗原性を保存するため、組織は可能な限り新鮮なものが得られ、 小片に切り（約１ｃｍ²）、−８０℃で保存する前に液体窒素で急速に凍結させ た。組織の６μｍ切片をクライオスタットで切断し、Ｖｅｃｔｏｒ結合スライド （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）にマウントし、２分氷冷アセトンで固定した後、ホ イルで包み−８０℃で保存した。スライドは室温で放置して霜をとった後、使用 直前にホイルをとる。各々の切片はＰＡＰ Ｐｅｎで形をとり、各々の切片に５ μｇ／ｍｌのトリス緩衝化塩溶液（ＴＢＳ）で希釈した１００μｌの５５．１抗 体、１００μｌのＭＯＰＣイソタイプ対照（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ ｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．カタログ番号Ｍ９２６９）をＴ ＢＳ中５μｇ／ｍｌで、または１００μｌのＬＰ３４（Ｄａｋｏ）のような関連 する陽性対照を加えた。すべての続いてのインキュベーションは湿気を加えたチ ャンバー中、室温で３０分間実施され；すべての洗浄工程はＴＢＳ中２回行われ た。インキュベーション後、スライドは１００μｌの第二抗体試薬（西洋ワサビ ペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ Ｐａｔｔｓ）に結合された１／５０ウサギ抗マウ ス免疫グロブリンを含む）で洗浄され、１／５正常ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）が各 々の切片に加えられた。スライドは再びインキュベートし、ＴＢＳで洗浄した。 最終検出抗体、１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたブタ抗ウ サギ免疫グロブリン（１／５正常ヒト血清−ＴＢＳで１／５０希釈）を各々の切 片に加え、インキュベートして十分に洗浄した。ＤＡＢ基質は１ＤＡＢ錠剤（Ｓ ｉｇｍａ）と１７μｌの過酸化水素を１７ｍｌのＴＢＳに加え、Ｗｈａｔｍａｎ ４番濾紙を通して滴加した。３分間インキュベーション後、過剰のＤＡＢを除き 、スライドをＴＢＳで洗浄した。メーヤーのヘマトキシリンで逆染色後、切片を アルコールおよびキシレン中で脱水し、Ｅ−Ｚマウント（Ｓｈａｎｄｏｎ）にマ ウントした後、顕微鏡で試験した。 抗体結合領域は切片上茶色の染色により可視化されていた。得点システムが組 織への５５．１抗体の結合の程度を評価するために使用された、 ＋＋＋ ＝＞７５％の腫瘍に抗体結合 ＋＋ ＝５０−７５％の腫瘍に抗体結合 ＋ ＝２５−５０％の腫瘍に抗体結合 ＋／− ＝腫瘍細胞の小さな領域への非集中性結合 − ＝染色なし １８人の結腸直腸腫瘍の一団の研究からのデータは５５．１抗体は腫瘍の約８ ０％と強く結合することを示した（表３）。 染色のさらなる分析で、約５０％の腫瘍（＋＋および＋＋＋のスコアを持つも の）において、５０％以上の細胞が陽性に染色され、染色は基底面および成長点 細胞で明かであることが示された。従って特定の腫瘍内の上皮細胞の大部分は標 的化を受けるべきである。さらに、基底面発現は血液から抗体への有効な標的化 を好むべきである。 表４に示したように，５５．１との反応性について大きな範囲のヒト正常組織 がスクリーニングされた。そのような選択的抗体はまれであり；１０／６５，０ ００のみの抗体上清が発生またはスクリーンされたが、一方発明の５５．１はそ のような最少程度の正常組織反応性を示した。実施例７ ＣＡ５５．１への競合的結合のためのアッセイ ７．１（ａ） 可溶性ＣＯＬＯ ２０５膜試料の生成 使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。１０Ｅ ９ ＣＯＬＯ ２０５細胞のペレットを７ｍｌの氷冷溶解緩衝液（２．５％トウ ィーン４０、１０ｍＭトリス、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍ Ｍ ＮＥＭ、１００μＭペプスタチン、ｐＨ７．４）に懸濁して１０ｍｌの全量 とした。得られた溶液は１時間氷浴中で撹拌した。次に細胞をホモジナイズし、 ４℃にて１０分間１５００ｇで遠心分離した。上清を吸引し、４℃にて１時間１ ００，０００ｇで遠心分離した。ペレットに５ｍｌの可溶化緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭオクチルグルコシド、１０ｍＭ ＮＥＭ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１ｍＭロイペプチン、ｐＨ７．４）を加え、得 られた懸濁液は４℃で穏やかに３０分撹拌した。上清（可溶化ＣＯＬＯ ２０５ 膜試料）を吸引し４℃で保存した。 ７．１（ｂ） 競合ＥＬＩＳＡ 使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。抗原保 存溶液を作るため可溶化ＣＯＬＯ ２０５膜試料を１対１００に被覆緩衝液（２ ０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で希釈した。マイク ロタイタープレート上、測定当たりＭＡｂ当たり六つのウェルに５０μｌの抗原 保存溶液を加えた。室温で２時間または４℃で一夜穏やかにかき混ぜる。５０μ ｌの固定緩衝液（０．５％グルタルアルデヒドを含む被覆緩衝液）を各々のウェ ルに加え、３分放置し、ＴＢＳ（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ塩化ナトリウム， ｐＨ７．４）でプレートを洗浄する。２００μｌの遮断緩衝液（３％ＢＳＡを含 む被覆緩衝液）を各々のウェルに加え、室温で１時間穏やかにかき混ぜる。ビオ チンで標識されたＭＡｂの保存溶液（Ｃｈａｒｏ ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｊ． Ｂｉｏｌ．ＣＨｅｍ．２６６，ｐ１４１５−１４２１）およびＴＥＳＴ ＭＡｂ は抗体緩衝液（１％ＢＳＡを含む被覆緩衝液）で調製する。これらの保存溶液を 混合し下記の比で二つのＭＡｂ含む六つの抗体溶液を作製する； 抗体溶液１．２ｍｇ／ｍｌ５５．１および ２００ｍｇ／ｍｌＴＥＳＴ ＭＡｂ 抗体溶液２．２ｍｇ／ｍｌ５５．１および ２０ｍｇ／ｍｌＴＥＳＴ ＭＡｂ 抗体溶液３．２ｍｇ／ｍｌ５５．１および ２ｍｇ／ｍｌＴＥＳＴ ＭＡｂ 抗体溶液４．２ｍｇ／ｍｌ５５．１および ０．２ｍｇ／ｍｌＴＥＳＴ ＭＡｂ 抗体溶液５．２ｍｇ／ｍｌ５５．１および０．０２ｍｇ／ｍｌＴＥＳＴ ＭＡｂ 抗体溶液６．２ｍｇ／ｍ１５５．１ 遮断工程の終わりにプレートをＴＢＳで洗浄し、１００μｌの各々の抗体溶液 を各々の列の一つのウェルに入れる。プレートは室温で２時間穏やかにかき混ぜ る。プレートをＴＢＳで洗浄し、１００μｌの第二抗体溶液（抗体緩衝液に１ｍ ｇ／ｍｌの抗ビオチンペルオキシダーゼ結合ＭＡｂ）を各々のウェルに加え、１ 時間穏やかにかき混ぜる。基質溶液を作るため９９．５ｍｌのクエン酸リン酸緩 衝液（０．５ｇクエン酸、１．７ｇリン酸水素二ナトリウム１２水和物を１００ ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に）に０．５ｍｌの過酸化水素溶液（１ｇの尿素過酸化 水素、２５ｍｌのクエン酸リン酸緩衝液）および８０ｍｇのｏ−フェニレンジア ミン二塩酸塩を加えた。プレートをＴＢＳで洗浄し、各々のウェルに１００μｌ の基質溶液を加えた。発色する色を４９５ｎｍでモニターする。０．７ＡＵＦＳ の最大吸光度に達したら、各々のウェルに５０μｌの停止溶液を加え、プレート を５分穏やかにかき混ぜて最終吸光度を読みとる。発色した色がＴＥＳＴ ＭＡ ｂ濃度依存性で減少したことからＴＥＳＴ ＭＡｂによる５５．１の結合の阻害 が示された。実施例８ ＣＡ５５．１に対する免疫複合体のインビトロ活性 リシンＡと結合された場合、有効な免疫毒素をつくる抗体の必須な性質は、腫 瘍細胞上の細胞膜決定基と結合すべきことであり、および蛋白合成を阻害し、細 胞毒性を誘導するために細胞膜を通過してリボソームヘリシンＡを容易に送達さ せることである。 ５５．１抗原は、フローサイトメトリーを使用してＣＯＬＯ ２０５を含むい くつかの結腸直腸腫瘍細胞上に高レベルで存在していることが示されている。Ｃ ＯＬＯ ２０５細胞がインターナリゼーションおよび細胞毒性研究に日常的に使 用されてきた。抗体５５．１が組換え体リシンＡと複合された場合、ＣＯＬＯ ２０５細胞に対して１ｘ１０^-11ＭのＩＣ５０を持つ高度に強力な免疫毒素が作 製された。 ＣＯＬＯ ２０５に結合した５５．１のエンドサイトーシスは以下のように示 された。ＣＯＬＯ ２０５細胞の細胞懸濁液を培養培地中ｍｌ当たり２０００万 細胞まで濃縮した。ヨード化抗体を１μｇ／ｍｌで加え、４℃で１時間インキュ ベートした。細胞は２度４℃で遠心分離して洗浄し、新しい培地でｍｌあたり１ ００万まで希釈した。１．５ｍｌの細胞懸濁液を２４ウェル組織培養プレートに 加え、続いて３７℃でインキュベーションを行った。１ｍｌの試料をとり間隔を あけて処理した。細胞および培地上清を遠心分離により分離した。いくつかの細 胞ペレットは酸性化ペプシン（１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ２．５、１ｍｌ／ペレット ３７℃で４０分）を用いて表面結合抗体を除去するように処理された。細胞は次 に遠心分離して洗浄した。培地上清をＴＣＡで処理して蛋白に付随する放射活性 を決定した。細胞ペレット、ペプシン処理細胞ペレット、培地および培地のＴＣ Ａ沈澱物のすべての放射活性を測定した。従って、表面、インターナリライズし たおよび脱落した抗体（分解生成物を含む）が定量化される。 対照のインターナリゼーションを起こさない抗体と比較すると、５５．１はＣ ＯＬＯ ２０５細胞内へ効果的にインターナライズされており、約２５％の細胞 結合抗体が４時間のインビトロインキュベーションで細胞膜を通過しており、２ ０時間のインキュベーション時間では４０％以上である（図４）。 ５５．１：リシンＡのインビボ能力はヒト腫瘍増殖のモデルとして”ヌード” マウスの皮下異種移植により算定された。 最初の抗腫瘍試験は５ｘ１０ｅ６のＣＯＬＯ ２０５細胞を左の脇腹に皮下に 移植された１０匹のマウスの群で実施された。腫瘍は０．５−０．７ｃｍの直径 まで増殖させた、通常移植後５−７日。この時点で１ｍｇ／ｋｇの５５．１：リ シンＡ免疫毒素を１日一度静脈に３日間注射した。対照群は塩溶液のみを受け取 った。 この投与計画は腫瘍退化の明瞭な証拠を与える非常に実質的な抗腫瘍応答を生 み出し、および多少の動物においては完全に治癒した。そのような実験において 、２／１０のマウスの腫瘍が完全に治癒した。残りのマウスの４／１０では中程 度の増殖遅延（１０日）があり、４匹では腫瘍増殖の３０日以上の遅延があった （図５）。 従って、５５．１：リシンＡはインビボにおいて高度に強力で、選択的細胞毒 性薬剤であり、固形腫瘍異種移植片内のＣＯＬＯ ２０５細胞への標的化されお よびインターナリゼーションを受けている。そのようなモデルにおいて５５．１ ：リシンＡ は５−フルオロウラシルのような通常の抗癌剤よりも活性である。実施例９ 医薬組成物 以下の処方はヒトにおける治療目的に使用されるであろう本発明の免疫毒素を 含む代表的な医薬剤形を例示している。注射可能な溶液 リシンＡ／５５．１抗体免疫毒素 １．０ｍｇ 酢酸ナトリウム３水和物 ６．８ｍｇ 塩化ナトリウム ７．２ｍｇ トウィーン２０ ０．０５ｍｇ 溶液mlあたり を含む注射のための無菌水溶液。実施例１０ ５５．１ ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列に関連したＤＮＡ配列のハイブリ ッド形成 １０．１ ハイブリッド形成試験 ５５．１抗体重鎖遺伝子に関する配列を含む核酸を検出する方法。これらの核 酸はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにおいて上記のように膜に固定され た細菌コロニーからのＤＮＡまたは真核細胞からのＤＮＡ／ＲＮＡのような、ま たはゲル電気泳動により分離されノーザン（Ｍａｎｉａｔｉｓ、７章、ｐ３９） またはサザン（Ｍａｎｉａｔｉｓ、９章、ｐ３１）ハイブリッド形成のためのよ うに適した膜へ移されているような精製された核酸の断片のような種々の形で存 在するであろう。 １０．２ ハイブリッド形成プローブ ハイブリッド形成プローブは５５．１Ｈ鎖、より特別には可変領域から、特に はこの領域のＣＤＲ３のコード領域をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡの断片 から作製されるであろう。合成オリゴヌクレオチド（配列ＩＤ番号：２２）また はその相補的配列がＣＤＲ３コード領域のための特異的プローブとして使用でき る。 ハイブリッド形成プローブは合成オリゴヌクレオチドからＴ４ポリヌクレオチ ドキナーゼの作用により３２Ｐ ＡＴＰから放射活性５’リン酸基の付加により 作製することができる。２０ピコモルのオリゴヌクレオチドを、１００ｍＭトリ ス、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭスペルミジン、２０ｍＭ ＤＴＴ、７．５５Ｍ ＡＴＰ、０．５５Ｍ ｇ ３２ＰＡＴＰおよび２．５ｕＴ ４ポリヌクレオチド キナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅ ｄｅｎ）を含む２０μｌの反応液に加えた。反応液はハイブリッド形成に使用す る前に３７℃で３０分および次ぎに７０℃で１０分間インキュベートした。オリ ゴヌクレオチド（１１章）から、またはＤＮＡおよびＲＮＡ断片（１０章）から ハブリッド形成プローブを作製する方法はＭａｎｉａｔｉｓにより与えられてい る。多くの特許、キットがこれらの方法のために入手可能である。 １０．３ ハイブリッド形成条件 核酸を含むフィルターは６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、および０．２５％Ｍａ ｒｖｅｌ^TMを含む１００ｍｌの溶液中、６５℃で最低１時間適した容器中でプリ ハイブリダイズされる。モデルＨＢ−１（Ｔｅｃｈｎｅ Ｌｔｄ）のような特許 ハイブリッド形成装置は実験の再現可能条件を提供する。 前ハイブリッド形成溶液を次に６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、および０．２５ ％Ｍａｒｖｅｌおよび前記の作製されたオリゴヌクレオチドプローブを含む１０ ｍｌのプローブ溶液に置換する。フィルターをこの溶液中６５℃で５分インキュ ベートした後、温度を徐々に３０℃以下に下げる。プローブ溶液を捨て、フィル ターを１００ｍｌの６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で５分洗浄する。同一 の新鮮な溶液中、３０℃で洗浄し。次に温度を１０℃づつ６０℃まで上げ各々５ 分間洗浄する。 洗浄後、フィルターを乾燥し写真像を高めるため急速タングステン酸塩増感ス クリーンを用いて遮光フィルムカセット中，−７０℃でＨｙｐｅｒｆｉｌｍ Ｍ Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のようなＸ線フイルムを 露光させるのに使用する。フィルムは適当な期間（通常一夜）露光させた後、現 像してフィルター上の放射活性領域の写真像を明らかにする。像を生み出すべき ではない全く関連しない配列と比較して、関連する核酸配列は写真像の存在によ り同定される。理想的には関連する配列は最も高い洗浄温度（６００Ｃ）で陽性 として現れるであろう。しかしながら、関連する配列はより低い温度（５０、４ ０ または３０℃）でのみ陽性を示してもよい。 これらの結果は使用されたプローブの性質にも依存するであろう。より長い核 酸断片プローブはハイブルダイズするのに高い温度でのより長い時間を必要とし ないであろうが、より高い洗浄温度および／またはより低い温度で関連する配列 と結合したまま残るかもしれない。混合または縮重オリゴヌクレオチドプローブ ではより低い温度およびより高いＮａ⁺濃度のようなより低いストリンジェント 洗浄条件を必要とするであろう。ハイブリッド形成プロトコールに対する考察の 議論はＭａｎｉａｔｉｓ（１１章）に与えられている。実施例１１ ＣＡ５５．１腫瘍付随抗原の分析 １１．１ ＣＯＬＯ ２０５細胞からのＣＡ５５．１の可溶化 使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。１０Ｅ ９ ＣＯＬＯ ２０５細胞のペレットを７ｍｌの氷冷溶解緩衝液（２．５％トウ ィーン４０、１０ｍＭトリス、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍ Ｍ ＮＥＭ、１００μＭペプスタチン、ｐＨ７．４）に懸濁して１０ｍｌの全量 とした。得られた溶液は１時間氷浴中で撹拌した。次に細胞をホモジナイズし、 ４℃にて１０分間１５００ｇで遠心分離した。上清を吸引し、４℃にて１時間１ ００，０００ｇで遠心分離した。ペレットに５ｍｌの可溶化緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭオクチルグルコシド、１０ｍＭ ＮＥＭ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１ｍＭロイペプチン、ｐＨ７．４）を加え、得 られた懸濁液は４℃で穏やかに３０分撹拌した。上清（可溶化ＣＯＬＯ ２０５ 膜試料）を吸引し４℃で保存した。 １１．２ ＣＡ５５．１の親和性による精製 Ｐｈａｒｍａｃｉａの標準プロトコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＣＮＢｒ 活 性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの添付書類、カタログ番号１７−０４３０−０１、Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてＭＡｂをＣＮ Ｂｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに結合させる。マトリックスは結合緩衝液 （２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭオクチルグルコシド、ｐＨ ７．０）で平衡化した。ＣＡ５５．１を含む細胞溶解物をマトリックスに加え４ ℃で一夜よく混合した。マトリックスは次に６カラム容量の洗浄緩衝液（２５ｍ Ｍトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で洗浄した。５５．１は３カラ ム容量の溶出緩衝液（２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）５Ｍ チオシア ン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）でマトリックスを洗浄することにより溶出させた 。ＣＡ５５．１を含む分画は下記のように５５．１抗体を用いるウェスタンブロ ティングにより同定された。 １１．３ ＣＡ５５．１のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット ＭＡｂ５５．１反応性を試験すべき試料をプリキャストＰｈａｒｍａｃｉａ ＥｘｃｅｌＧｅｌ^TM（８−１８％グラジエントポリアクリルアミド）に加え、推 奨されている条件を用い（６００ボルト、５０ｍＡおよび３０Ｗ ９０分、１５ ℃、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＥｘｃｅｌＧｅｌ Ｐａｃｋの添付書類、カタログ番 号８０−１２５５−５３、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ）Ｐｈａｒｍａｃｉａにより示唆されているプロトコールで実施された。ゲルを ベーキングプラスチックシートから除き２．５ｍＡ／ｃｍ２で１０−１２分ＰＶ ＤＦ膜上にエレクトロブロットされた。エレクトロブロッティング後、ＰＶＤＦ 膜を遮断緩衝液、ＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭトリス、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４）に３％ＢＳＡを加えたもの、に移し、１時間穏やかにかき混ぜた。膜は 簡単に抗体緩衝液（１％ＢＳＡを含むＴＢＳ）で洗い、２ｍｇ／Ｌの濃度でＭＡ ｂ５５．１を含む抗体緩衝液に移した。ＰＶＤＦ膜は２時間穏やかにかき混ぜた 。 膜を簡単にＭｉｌｌｉ−Ｑ^TM水（高品度脱イオン水）で洗い、抗体緩衝液で３ ｘ５分洗浄した。ＰＶＤＦ膜は次に西洋ワサビペルオキシダーゼに連結されたＭ Ａｂ抗マウスを１ｍｇ／Ｌの濃度で含む抗体緩衝液に移した。ＰＶＤＦ膜は１時 間穏やかにかき混ぜた。ＰＶＤＦ膜を簡単にＭｉｌｌｉ−Ｑ^TM水で洗い、抗体緩 衝液で３ｘ５分洗浄し、最後にＴＢＳで５分洗浄した。最後の洗浄工程が終了し たとき、ＨＲＰ発色溶液（６０ｍｇ ４−クロロ−１−ナフトールの氷冷メタノ ール（２０ｍｌ）溶液；使用５分前に作って暗所保存）およびペルオキシド溶液 （１００ｍｌＴＢＳに６０μｌの氷冷３０％Ｈ₂Ｏ₂、使用直前に調製）を一緒に 加え、膜はすぐに得られた溶液に移した。発色したら膜を２ｘ５分Ｍｉｌｌｉ− Ｑ^TM水で洗浄して反応を停止させた。膜はティッシュペーパー上で風乾し、貯蔵 された。 この実験の結果は図６に示されている。ＣＡ５５．１は約４８から５２ｋＤ、 約５８ｋＤから７２ｋＤおよび約８８ｋＤから９２ｋＤの範囲で三つの優勢なバ ンド分子量のように振る舞った。 １１．４ ＰＮＧエース処理、シアリダーゼ処理およびレクチンブロット ＣＡ５５．１エピトープの炭水化物の性質は、酵素ＰＮＧエースＦおよびシア リダーゼのウェスタンブロット上のＣＡ５５．１への影響を示すことによりあら わされた。ＰＮＧエースＦは特異的にアスパラギン残基および隣接するＧｌｃＮ Ａｃ残基の間（Ｘ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ）のＮ−結合オリゴサ ッカライドを切断し、この結合に局所的特異性であると考えられている。シアリ ダーゼは非還元末端シアール酸を切断し、アルファ２−＞３，６または８結合の 範囲で特異的である。 １１．４（ａ） ＣＡ５５．１のＰＮＧエース処理 使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。４０μ ｌのＣＯＬＯ ２０５膜試料に４０μｌの変性緩衝液（４０ｍＭ リン酸水素ナ トリウム、０．５％ＳＤＳおよび５％２−メルカプトエタノール，ｐＨ７．５） を加え、得られた溶液は２分間煮沸した。冷後、２μｌのＮｏｎｉｄｅｔ ＮＰ −４０を加えた（２．５％ ｖ／ｖ）。この溶液に２０単位のＰＮＧエースＦ（ Ｎ グリコシダーゼ Ｆ，Ｅｘ．Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍカタ ログ番号９１３７８２）を加え、続いて１６０μｌの消化緩衝液（４０ｍＭリン 酸水素ナトリウム、ｐＨ７．５）および１６０μｌのＭｉｌｌｉ Ｑ水を加えた 。得られた溶液は３７℃で１８時間インキュベートした。 １１．４（ｂ） ＣＡ５５．１のシアリダーゼ処理 使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。シアリ ダーゼ（０．１ｕ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｘ− ５０１１）を１０μｌの５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５に再懸濁した。 得られた溶液は４０μｌのＣＯＬＯ ２０５膜試料に加え、３７℃で１８時間イ ンキュベートした。ＰＮＧエースおよびシアリダーゼ処理ＣＯＬＯ ２０５膜試 料および非処理膜試料は上記のようにウェスタンブロットを行った。 図６はウェスタンブロットの結果である。トラック１は非処理ＣＯＬＯ ２０ ５膜試料、トラック２はＰＮＧエース処理試料およびトラック３はシアリダーゼ 処理試料である。トラック１は三つの主ＭＡｂ陽性種、約４８から５２ｋＤ、約 ５８ｋＤから７２ｋＤおよび約８８ｋＤから９２ｋＤの分子量を示している。ト ラック２は検出可能な化学種を含んでいない。トラック３は約４８−５２ｋＤ、 約５８−７２ｋＤおよび約８８−９２ｋＤの分子量を持つ５５．１陽性種を示し ている。トラック３において５５．１陽性種は対照試料のトラック１よりもより 弱い染色であった；この減少は３７℃での１８時間の間に部分的な蛋白の沈澱に よるものであると信じられている。 これらの結果はＣＯＬＯ ２０５膜試料のＰＮＧエース処理はＭＡｂ５５．１ の反応性を取り除くがシアリダーゼ処理は全くＭＡｂ反応性を取り除かなかった 。それ故、ＭＡｂ５５．１はＮ−結合オリゴサッカライドを認識し、末端シアー ル酸残基は認識には必要ではない。 １１．４（ｃ） アフィニティー精製ＭＡｂ５５．１陽性糖蛋白質のレクチンブ ロティング ＣＡ５５．１抗原の炭水化物部分の部分構造は、特異的に種々の炭水化物モチ ーフを認識する蛋白質を使用することにより推論できる。これらの蛋白質または レクチンは酵素で標識でき、それは可視化されたＳＤＳ−ＰＡＧＥブロットから 位置がわかる。 使用されたすべての物質は入手できる最も高い品質であるべきである。可溶化 ＣＯＬＯ ２０５膜試料は、ＭＡＢ５５．１結合アフィニティーカラムからの結 合、洗浄および溶出によりＭａｂ５５．１陽性糖蛋白によりエンリッチされた。 このエンリッチされた分画は（推奨された糖蛋白対照とともに）ウェスタンブロ ットを行い、Ｂｏｅｈｒｉｎｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＤＩＧ標識レクチン を用い、推奨プロトコールに従ってプローブを結合させた（ＤＩＧ Ｇｌｙｃａ ｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ キット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ ｎｈｅｉｍカタログ番号１２１０２３８）。 図７は４つの対照およびＭＡｂ５５．１陽性糖蛋白質とダチュラ ストラモニ ウム アグルチニン（ＤＳＡ）およびガランサス ニバリス アグルチニン（Ｇ ＮＡ）との反応性を示している。図７ＡはＤＳＡが二つの高分子量ＭＡｂ５５． １陽性糖蛋白質と交差反応することを示している、５８−７２ｋＤおよび８８− ９２ｋＤ、トラック６および７。最も低い分子量のＭＡｂ５５．１陽性糖蛋白質 ４８−５２ｋＤとは交差反応性がないようである；この交差反応性の欠如は多分 不十分な負荷のせいであろう。 図７ＢはＧＮＡとＭＡｂ５５．１陽性糖蛋白質の間には検出可能な交差反応性 がないことを示している、トラック６および７。両方ともトラック７にはトラッ ク６の５倍量が負荷されており、正しい交差反応性が糖蛋白質対照では観察され た。 レクチンＤＳＡはガラクトース−ベータ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミ ンと交差反応する、このジサッカライドは複合体およびハイブリッドＮ−結合グ ルカンに存在している。ＤＳＡはまたＯ−結合グリカンにおいてもこのジサッカ ライドを認識する。レクチンＧＮＡは高マンノースおよびハイブリッドＮ−結合 グリカンに観察される末端に結合されたマンノース残基と交差反応する。このレ クチンはＯ−結合グリカンの末端マンノースとも交差反応するであろう。ＰＮＧ エース処理ＣＯＬＯ ２０５膜試料はＭＡｂ５５．１陽性ではないため、ＭＡｂ ５５．１はＮ−結合グリカンを認識する。ＤＳＡと陽性の結果は、このグリカン がガラクトース−ベータ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミン ジサッカライ ドを含んでいることを示している。ＧＮＡとの陰性の結果はＭＡｂ５５．１が末 端マンノース基を含んでいず、従って高マンノースまたはハイブリッド型ではあ りえないことを示している。これらの結果は一緒になって，ＭＡｂ５５．１はガ ラクトース−ベータ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミンジサッカライド単位 を含む複雑なＮ−結合グリカンを認識すること示している。実施例１２ ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ配列を示すファージ（ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ ファージ）の繁殖、滴定および貯蔵 ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージ（ＮＣＩＭＢ番号４０６３８；配列ＩＤ番号： ２６）は大腸菌Ｋ１２、株ＴＧ１（ファージとともにＮＣＩＭＢに寄託されてい る）中で以下のように繁殖させた。単一のコロニーからとったＴＧ１細胞はＦ線 毛を維持するために最小培地寒天プレート（下記のように調製）上で維持され、 ２ｘＹＴ（酵母−トリプトン）ブロス（Ｄｉｆｃｏ）中、振とうしながら３７℃ で定常期まで液体培養で増殖させた。定常期培養物の一部（２ｍｌ）をとり、１ ００ｍｌ ２ｘＹＴブロスを含む新しいフラスコに接種し、３７℃で振とうしな がら半対数期まで増殖させた。ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージ（１０Ｅ１１プラ ーク形成単位）を培養液に加え、ファージが大腸菌のＦ線毛に吸着され、ウイル スＤＮＡの挿入を可能にするため、フラスコは３７℃で１０分間放置した。次に ファージ複製を起こすため培養物は３７℃で振とうしながら５時間インキュベー トした。ＳｏｒｖａｌｌＧＳＡまたは類似したローターを用い、４℃にて１００ ００ｒｐｍで遠心分離して細胞をファージ含有上清から分離した。残存する細胞 を殺すため上清を６５℃に１５分加熱し、続いて２０％ｗ／ｖのポリエチレング リコール（ＰＥＧ）を含む２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を培養上清１００ｍｌに対し て２０ｍｌ加えた。混合物を激しく振り、ファージ粒子を沈澱させるため４℃で 少なくとも４時間インキュベートした。上記のように遠心分離によりファージを 集め、上清は廃棄して、ファージペレットは５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１５０ｍ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）に１００ｍｌの元々の上清当たり１ｍｌで 再懸濁した。必要なら、ファージを上記のようにＰＥＧで再沈澱させ、より高度 に精製された試料を得る。ファージはＴＢＳ中、０．０２％ ｗ／ｖのアジ化ナ トリウム存在下−２０℃または４℃で貯蔵された、その後の生存性に相違は認め られなかった。 最小培地プレートは４００ｍｌの水に溶解した１．８％ ｗ／ ｖ寒天（Ｄｉｆｃｏ）をオートクレーブにかけることにより調製された。約５０ 度まで冷却後、以下の成分が加えられた：５ｘＭ９塩（１００ｍｌ）；１Ｍ硫酸 マグネシウム（５００マイクロリットル）；０．１Ｍ塩化カルシウム（５００マ イクロリットル）；４ｍｇ／ｍｌチアミン（５００マイクロリットル）；２０％ ｗ／ｖ グルコース（５ｍｌ）。実施例１３ ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージの数の滴定 固相培養で増殖した大腸菌指示細胞に存在するプラーク形成単位の数から生存 ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージ（配列ＩＤ番号：２６）の数が見積もられた。大 腸菌株ＴＧ１細胞を上記のように半対数期まで増殖させ、その一部２００μｌを １ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ（ＴＢＳ−ＢＳＡ）で連続的に 希釈したファージ５０μｌで感染させた。ファージの吸着およびウイルスＤＮＡ の注入を可能にするため室温に１０分間放置し、０．７５％ｗ／ｖのＢａｃｔｏ −Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）を含む２ｘＹＴブロスで４ｍｌに希釈して４８℃に維 持した後、直ちに２０ｍｌの１．５％のＢａｃｔｏ−Ａｇａｒを含む２ｘＹＴブ ロスで前もって満たしておいた９０ｍｍの直径のペトリ皿内へ注いだ。プレート はファージプラークを発育させるため、３７℃で一夜インキュベートし、アッセ イされている貯蔵懸濁液中の生存ファージの数を見積もるためプラークが計数さ れた。実施例１４ ＥＬＩＳＡによるＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージ結合特異性の決定 １４．１ ＭＡｂ５５．１への直接結合の特異性 以下のようにポリスチレンに固定されたＭＡｂ５５．１（ＥＣＡＣＣ番号９３ ０８１９０１）、ＭＡｂ１９．９（ハイブリドーマＡＴＣＣ番号ＮＳ１１１６Ｎ Ｄ）およびＭＡｂＣ２４２（Ｋａｂｉ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）への懸濁液中でのファージの直接結合により特異性が決定された 。ポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ，ＵＫ）のウェルを、０．０２％のアジ化ナトリウムを含 む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．６（炭酸水素塩ーアジド）中、 ０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＭＡｂ溶液５０μｌを用いて４℃で一夜被覆した。プ レー トは３０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む炭酸水素塩ーアジド溶液４００マイクロリッ トルを使用して室温で２時間遮断させ、続いてウェル当たり３ｘ４００マイクロ リットルのＴＢＳ−ＢＳＡで洗浄した（各々の洗浄は５分間続ける）。 連続的に希釈したＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージを抗体被覆プレートに加え、 ＴＢＳ−ＢＳＡ溶液を１００マイクロリットル、４℃で一夜インキュベートした 後、プレートを０．０５％ ｗ／ｖ トウィーン２０を含むＴＢＳ−ＢＳＡ（Ｔ ＢＡ−ＢＳＡ−トウィーン）で洗浄した（３ｘ４００マイクロリットル）。１： ２５００に希釈したヒツジ抗−Ｍ１３西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ，Ｍｉｌｔｏｎ Ｋｅｙｎｅｓ，ＵＫ）を各々のウェル当たり１ ００μｌ加え、室温で２時間インキュベートした。プレートを再び３ｘ４００マ イクロリットルのＴＢＡ−ＢＳＡ−トウィーンで洗浄し、２００マイクロリット ルのＯＰＤ基質（２５ｍｌの０．１Ｍクエン酸ーリン酸緩衝液、ｐＨ５．０当た り１０ｍｇのオルト−フェニレンジアミン、１２．５マイクロリットルの３０％ 過酸化水素溶液を含んでいる）で発色させる。着色反応は５０マイクロリットル の０．５Ｍクエン酸の添加により停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読みとった。 結果（図１３）はＭＡｂ５５．１へのＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージの結合は 特異的であり、飽和した。ＭＡｂ５５．１へのＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージの 結合の５０％飽和は１００マイクロリットルの容量で２ｘ１０ｅ７のファージ投 入により起こった。 アボガドロ数から（１モル溶液はリットル当たり６ｘ１０ｅ２３分子または１ ００マイクロリットル当たり６ｘ１０ｅ１９分子を含んでいるであろう）結合親 和性が計算された。この数字を使うと、１００マイクロリットル当たり２ｘ１０ ｅ７ファージは０．３ｐＭ全ファージ粒子または１．５ｐＭファージが表したペ プチドの濃度に対応する（各々のＭ１３ファージ粒子上に約５ｐＩＩＩ分子が存 在する）。従って、ＥＣ５０、すなわちＭＡｂ５５．１の５０％飽和に必要とさ れるペプチドーファージの濃度は１ｐＭの領域である。 １４．２ ＣＯＬＯ ２０５競合アッセイにおけるＭＡｂ５５．１への結合の特 異性 溶液中、ポリスチレン上に固定されたＭＡｂエピトープに対し、ＭＡｂ５５． １と競合するＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージのアッセイによる特異性が決定され た。マイクロタイタープレートのウェルを、リン酸緩衝化塩溶液（５０ｍＭリン 酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）中の１０｀ ５ＣＯＬＯ ２０５細胞（ＡＴＣＣ番号 ＣＣＬ２２２）の１００マイクロリッ トルで３０分間被覆し、等量の１％ ｖ／ｖ グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液 を加えて固定化し、１０％ ｗ／ｖ ＢＳＡのＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で ２時間ブロックした、すべての操作は室温で行われた。プレートを３ｘ４分、ウ ェル当たり４００マイクロリットルのＰＢＳで洗浄し、必要になるまで（被覆後 １ヶ月後まで）４℃にて湿気を供給した箱内で保存した。 ＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージを連続的に希釈して、ＭＡｂ５５．１、１９． ９、およびＣ２４２と４℃で一夜インキュベートした、すべて２０マイクログラ ム／ｍｌ １０％ｗ／ｖＢＳＡおよび０．００５％ｗ／ｖトウィーン２０を含む ＰＢＳ２５０マイクロリットル（ファージ希釈緩衝液）、その後二重に、調製し たＣＯＬＯ ２０５プレートのウェル内へ１００マイクロリットルを加え、反応 体間の相互作用を可能にするように室温で３時間インキュベートした。プレート を３ｘ５分０．０５％ｗ／ｖトウィーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−トウィーン 緩衝液）で洗浄し、ウェルにファージ希釈緩衝液で１：１０００に希釈したウサ ギ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ ，ＵＫ）１００マイクロリットルを加えた。プレートは室温で２時間インキュベ ートし、３ｘ５分ＰＢＳ−トウィーン緩衝液で洗浄し、ＯＰＤ基質で色を発色さ せた。 結果（図１４）はＭＡｂ５５．１はＣＯＬＯ ２０５細胞に結合するが、まｂ １９．９およびＣ２４２の結合はＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファージで阻害可能であ った、ＩＣ５０は１００マイクロリットルの容量で１０ｅ１２のファージ投入量 。 結合親和性の計算は上記のようにアボガドロ数から誘導された。もし溶質１０ ０マイクロリットル当たり６ｘ１０ｅ１９分子が１モル溶液に対応するとすると 、１００マイクロリットル中の１０ｅ１２ファージは全粒子の１６．７ｎＭまた はファージにより表されたペプチドで８０ｎＭに相当する。従ってＣＯＬＯ ２ ０ ５細胞上の抗原へのＭＡｂ５５．１の結合の５０％阻害を達成するのに必要とさ れるファージの濃度、すなわちＩＣ５０は２０−１００ｎｍのオーダーであるこ とが推定できる。配列 読者が誤り、脱落またはその他の矛盾に出会った場合、優先権のある特許ＵＫ９ ３２４９１８．３（３．１２．９３出願）およびＵＫ９４１１０８９．７（３． ６．９４出願）に開示されている核酸およびアミノ酸配列を特に参照されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/06 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 7/06 7/08 9356−4Ｈ 7/08 14/705 9356−4Ｈ 14/705 16/30 9356−4Ｈ 16/30 Ｃ１２Ｎ 5/10 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00 7/00 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 15/09 ＺＮＡ 0276−2Ｊ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 38/00 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ 39/395 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ )，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ブート，クリストファー イギリス国チェシャー エスケイ10 ４テ ィージー，マックレスフィールド，オール ダーリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者 コプレイ，クライヴ・グラハム イギリス国チェシャー エスケイ10 ４テ ィージー，マックレスフィールド，オール ダーリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者 パターソン，ダグラス・スティーヴン イギリス国チェシャー エスケイ10 ４テ ィージー，マックレスフィールド，オール ダーリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者 ホール，スーザン・マーガレット イギリス国チェシャー エスケイ10 ４テ ィージー，マックレスフィールド，オール ダーリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者 ライト，アンドリュー・ファーミン イギリス国チェシャー エスケイ10 ４テ ィージー，マックレスフィールド，オール ダーリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ ファーマシューティカルズ（番地なし) (72)発明者 ブレイキー，デイヴィッド・チャールズ イギリス国チェシャー エスケイ10 ４テ ィージー，マックレスフィールド，オール ダーリー・パーク，ミアサイド，ゼネカ・ ファーマシューティカルズ（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 抗原ＣＡ５５．１を認識する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を持つ抗原結合 構造、ここで抗原は： ａ）約４８から５２ｋＤ、約５８ｋＤから７２ｋＤおよび約８８ｋＤから９２ｋ Ｄの範囲のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を持つ３つの主要な化学種； ｂ）ＣＯＬＯ ２０５腫瘍細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ ２２２）の膜分画中の細 胞下所在および； ｃ）複雑なＮ−結合炭水化物構造を持っており； およびここで抗原結合構造は下記の性質の少なくとも一つを持っている： ｉ）抗原結合構造はＣＡ５５．１抗原へのモノクローナル抗体５５．１（ＥＣＡ ＣＣ番号９３０８１９０１）の結合を競合的に阻害する、または； ｉｉ）バクテリオファージＮＣＩＭＢ番号４０６３８の表面に表されるようなペ プチドＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ（配列ＩＤ番号：２６）は、固相に被覆された抗原 結合構造とインキュベートした場合、１０ｐＭまたはそれ未満の効率的な結合で 抗原結合構造と結合する、または； ｉｉｉ）バクテリオファージＮＣＩＭＢ番号４０６３８の表面に表されるような ペプチドＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣ（配列ＩＤ番号：２６）は、抗原結合構造と前も ってインキュベートした場合、２００ｎＭまたはそれ未満の有効濃度で固相に被 覆されたＣｏｌｏ ２０５細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ ２２２）への抗原結合構 造の結合を競合的に阻害する。 ２． 抗原ＣＡ５５．１を認識する相補的決定領域（ＣＤＲｓ）を持つ抗原結合 構造、ここでＣＤＲｓは下記の配列を持っている： ａ） 重鎖 CDR1 G Y W I H （配列ＩＤ番号：２７） CDR2 E V N P S T G R S D Y N E K F K N （配列ＩＤ番号：２８） CDR3 E R A Y G Y D D A M D Y （配列ＩＤ番号：２９） ｂ） 軽鎖 CDR1 K S S Q S L L N S R T R K N Y L A （配列ＩＤ番号：３０） CDR2 W A S T R T S （配列ＩＤ番号：３１） CDR3 K Q S Y T L R T （配列ＩＤ番号：３２） またはそれらの保存的類似物。 ３．下記の（随意にヒト適応化された）構造を持つ抗原結合構造： 重鎖配列（配列ＩＤ番号：３３） および； 軽鎖配列（配列ＩＤ番号：３４）： またはそれらからの下記の構築物の一つ： Ｆ（ａｂ’）２；Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ ＆ Ｖ−ｍｉｎま たは； それらの保存的類似物。 ４． 請求の範囲１−３項のいずれか１項で定義されたような抗原結合構造の重 鎖または軽鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチド配列。 ５． 請求の範囲１−３項のいずれか１項で定義されたような抗原結合構造の重 鎖または軽鎖の少なくとも可変領域をコードする発現ベクター。 ６． ポリヌクレオチド配列で形質変換された宿主細胞またはその宿主細胞から 発育されたトランスジェニック非ヒト動物またはトランスジェニック植物であっ て、当該ポリヌクレオチド配列は請求の範囲１−３項のいずれか１項で定義され たような抗原結合構造の重鎖または軽鎖の少なくとも可変領域をコードしている 上記宿主細胞または上記動物または上記植物。 ７． ＥＣＡＣＣ寄託番号９３０８１９０１として寄託されたハイブリドーマ５ ５．１、その変異細胞株またはそれにより生産される抗体。 ８． ＮＣＩＭＢ番号４０６３８として寄託されたＡＣＥＨＲＧＳＧＷＣファー ジおよびその変異体。 ９． ａ） 抗原結合構造の重鎖または軽鎖の少なくとも可変領域をコードす るポリヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換し、および随意に形質転換された 宿主細胞をトランスジェニック非ヒト哺乳類またはトランスジェニック植物に発 育させ； ｂ） 宿主細胞、トランスジェニック非ヒト哺乳類またはトランスジェニック植 物を少なくとも可変領域の発現が行われる、および随意に分泌される条件下にお き、および随意に； ｃ） 少なくとも部分的に当該可変領域を精製することからなる、請求の範囲１ −３項のいずれか１項で定義されたような抗原結合構造の重鎖または軽鎖の少な くとも可変領域を製造する方法。 １０． 同一細胞で重鎖または軽鎖両方の可変領域が発現されおよび組み立てら れて抗原結合構造が形成される請求の範囲９項に記載の方法。 １１． ａ） 抗体の発現が行われる条件下、ＥＣＡＣＣ寄託番号９３０８１９ ０１として寄託されたハイブリドーマ５５．１を培地中で培養し、および； ｂ） 培養培地から抗体５５．１を得、および随意に； ｃ） 酵素的消化により抗体５５．１のＦ（ａｂ’）２断片を製造することから なるモノクローナル抗体５５．１の製造法。 １２． 毒素および請求の範囲１−３項のいずれか１項で定義されたような抗原 結合構造を含む免疫毒素複合体。 １３． 毒素および請求の範囲１−３項のいずれか１項で定義されたような抗原 結合構造を含む免疫毒素複合体からなる医薬組成物。 １４． 毒素および請求の範囲１−３項のいずれか１項で定義されたような抗原 結合構造を含む免疫毒素複合体の医薬として有効量を投与することを含む、抗原 ＣＡ５５．１を表す細胞への毒素の標的化を必要とする哺乳類におけるそのよう な標的化の方法。 １５． 診断法における請求の範囲１−３項のいずれか１項で定義されたような 抗原結合構造の使用。