TW201731532A - 用於製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之有效方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之新穎方法。該方法包括以下步驟：使細胞結合劑與具有能夠與細胞結合劑形成共價鍵之反應基團的細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在4至9之間的pH值下在具有高離子強度之緩衝溶液存在下反應，其中該細胞結合劑包含與具有胺反應基團之細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物形成共價鍵之離胺酸ε-NH2。本發明亦包括根據本文中描述之方法製備的細胞結合劑-細胞毒性劑結合物。

Description

高效製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之方法 【相關申請案】
本申請案根據35 U.S.C.§119(e)主張於2016年2月5日申請之美國臨時申請案第62/292,018號申請日期之權益，該申請案全部內容，包括所有圖式、式、說明書及申請專利範圍，均以引用的方式併入本文中。
已展示吲哚啉并苯并二氮呯二聚體化合物之抗體-藥物結合物(ADC)在活體內具有高效能及/或高治療指數(最大耐受劑量與最小有效劑量之比率)。吲哚啉并苯并二氮呯二聚體化合物一般為疏水性的，且在結合反應期間可能影響抗體之穩定性。在某些環境下，結合反應具有極低反應產率，此對於ADC大規模生產而言為不合需要的。
鑒於上述，研發適於大規模生產之高效製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之方法的需求尚未得到滿足。
本發明提供製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之新穎及高效方法。
在一個實施例中，本發明之方法包括以下步驟：使細胞結合劑與具有能夠與細胞結合劑形成共價鍵之反應基團(例如胺反應基團)的細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在4至9之間的pH值下在具有高離子強度之緩衝溶液存在下反應。
在另一實施例中，本發明之方法包括以下步驟：使細胞結合劑與具有能夠與細胞結合劑形成共價鍵之反應基團(例如胺反應基團)的細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在具有7.3至8.4之pH值的緩衝溶液存在下反應。
在又一實施例中，本發明之方法包括以下步驟：使細胞結合劑與具有能夠與細胞結合劑形成共價鍵之反應基團(例如胺反應基團)的細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在4至9之間的pH值下在高濃度緩衝溶液存在下反應。
已意外地發現，當吲哚啉并苯并二氮呯二聚體化合物與抗體之結合反應在具有高離子強度之緩衝溶液中在7.3與8.4之間的pH值下進行時，結合反應比結合反應在具有低離子強度之緩衝溶液下在更高pH值下進行時顯著更有效。本發明之方法提供具有高純度及/或穩定性之細胞結合劑-細胞毒性劑結合物。
本發明亦針對使用本文中描述之方法製備的細胞結合劑-細胞毒性劑結合物。
本發明提供製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之新穎方法。
在第一實施例中，本發明之方法包括以下步驟：使細胞結合劑與具有能夠與細胞結合劑形成共價鍵之反應基團(例如胺反應基團)的細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在4至9之間的pH值下在具有高離子強度之緩衝溶液存在下反應。
如本文所用，溶液之「離子強度」為溶液中的離子濃度。其為溶液中存在之所有離子之濃度的函數。可使用以下方程式計算離子強度(I)：
Ci為溶液中存在之離子i的莫耳濃度，zi為其電荷數，且對溶液中之所有離子進行求和。當溶液之陽離子及陰離子分別攜帶+1和-1電荷時，離子強度等於溶液濃度。
在一個實施例中，緩衝溶液之離子強度在20mM與500mM之間，較佳在20mM與200mM之間、25mM與150mM之間、50mM與150mM之間、50mM與100mM之間或100mM與200mM之間。在另一 實施例中，緩衝溶液之離子強度在60mM與90mM之間，或70mM與80mM之間。在又一實施例中，緩衝溶液之離子強度為75mM。在另一實施例中，緩衝溶液之離子強度為100mM至160mM之間，或120mM與140mM之間。在又一實施例中，緩衝溶液之離子強度為130mM。
在另一實施例中，緩衝溶液之pH值在7.1與8.7之間，較佳在7.3與8.7之間、7.1與8.5之間、7.3與8.4之間、7.6與8.4之間、7.7與8.3之間、7.8與8.2之間。在一個實施例中，緩衝溶液之pH值在7.9與8.1之間。在另一實施例中，緩衝溶液之pH值為8.0。在一個實施例中，緩衝溶液之pH值在8.5與8.9之間。在另一實施例中，緩衝溶液之pH值在8.6與8.8之間。在又一實施例中，緩衝溶液之pH值為8.7。
在第二實施例中，本發明之方法包括以下步驟：使細胞結合劑與具有能夠與細胞結合劑形成共價鍵之反應基團(例如胺反應基團)的細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在具有7.3至9.0之pH值的緩衝溶液中反應。
在一個實施例中，緩衝溶液之pH值在7.3與8.4之間、在7.6與8.4之間、7.7與8.3之間或7.8與8.2之間。在另一實施例中，緩衝溶液之pH值在7.9與8.1之間。在另一實施例中，緩衝溶液之pH值為8.0。在一個實施例中，緩衝溶液之pH值在8.5與8.9之間。在另一實施例中，緩衝溶液之pH值在8.6與8.8之間。在又一實施例中，緩衝溶液之pH值為8.7。
在第一特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液具有20mM與200mM之間的離子強度及7.1與8.5之間的pH值。
在第二特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液具有50mM與150mM之間的離子強度及7.6與8.4之間的pH值。
在第三特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液具有50mM與100mM之間的離子強度及7.7與8.3之間的pH值。
在第四特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液具有60mM與90mM之間的離子強度及7.8與8.2之間的pH值。
在第五特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液具有70mM與80mM之間的離子強度及7.9與8.1之間的pH值。
在第六特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液具有75mM之離子強度及8.0之pH值。
在第七特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液具有50mM與200mM之間的離子強度及7.8與8.9之間的pH值。
在第八特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液具有110mM與150mM之間的離子強度及8.5與8.9之間的pH值。
在第九特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液具有120mM與140mM之間的離子強度及8.6與8.8之間的pH值。
在第十特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液具有130mM之離子強度及8.7之pH值。
此項技術中已知之任何適合緩衝溶液可用於本發明之方法中。適合緩衝溶液包括例如(但不限於)檸檬酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、丁二酸鹽緩衝液及磷酸鹽緩衝液。
在第十一特定實施例中，對於第一或第二實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十特定實施例中描述之方法，緩衝溶液選自由以下組成之群：MES((2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸))緩衝液、雙-三甲烷(2-[雙(2-羥乙基)胺基]-2-(羥甲基)丙-1,3-二醇)緩衝液、ADA(N-(2-乙醯胺基)亞胺基二乙酸)緩衝液、ACES(N-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、PIPES(哌嗪-N,N'-雙(2-乙烷磺酸))、MOPSO(β-羥基-4-嗎啉丙烷磺酸)緩衝液、雙-三丙烷(1,3-雙(三(羥甲基)甲基胺基)丙烷)緩衝液、BES(N,N-雙 (2-羥乙基)-2-胺基乙烷磺酸)、TES(N-[三(羥甲基)甲基]-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、HEPES(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸)緩衝液、DIPSO(3-(N,N-雙[2-羥乙基]胺基)-2-羥基丙烷磺酸或N,N-雙(2-羥乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸)、MOBS(4-(N-嗎啉基)丁烷磺酸)緩衝液、TAPSO(3-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]-2-羥基丙烷-1-磺酸)緩衝液、trizma(Tris或2-胺基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇)緩衝液、HEPPSO(N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(2-羥基丙烷磺酸))緩衝液、POPSO(哌嗪-1,4-雙-(2-羥基-丙烷-磺酸)脫水物)緩衝液、EPPS(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸)緩衝液、tricine(N-(2-羥基-1,1-雙(羥甲基)乙基)甘胺酸)緩衝液、gly-gly、bicine(2-(雙(2-羥乙基)胺基)乙酸)緩衝液、HEPBS(N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(4-丁烷磺酸)緩衝液、TAPS(3-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]丙烷-1-磺酸)緩衝液、AMPD(2-胺基-2-甲基-1,3-丙二醇)緩衝液、TABS(N-三(羥甲基)甲基-4-胺基丁烷磺酸)緩衝液、AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羥乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸)緩衝液及其組合。在一個實施例中，緩衝液選自由以下組成之群：HEPPSO(N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(2-羥基丙烷磺酸))緩衝液、POPSO(哌嗪-1,4-雙-(2-羥基-丙烷-磺酸)脫水物)緩衝液、HEPES(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸)緩衝液、EPPS(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸)緩衝液、TES(N-[三(羥甲基)甲基]-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、MES(2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸)緩衝液及其組合。
在第十二特定實施例中，對於第一或第二實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十特定實施例中描述之方法，緩衝溶液為EPPS緩衝液。在一較佳實施例中，緩衝溶液為75mM EPPS緩衝液。
在第十三特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液為具有7.8與8.9之間的pH值的50mM至200mM EPPS緩衝液。
在第十四特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液為具有7.8與8.2之間的pH值的60mM至90mM EPPS緩衝液。
在第十五特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方 法，緩衝溶液為具有7.9與8.1之間的pH值的70mM至80mM EPPS緩衝液。
在第十六特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液為具有8.0之pH值的75mM EPPS緩衝液。
在第十七特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液為具有8.5與8.9之間的pH值的110mM至150mM EPPS緩衝液。
在第十八特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液為具有8.6與8.8之間的pH值的120mM至140mM EPPS緩衝液。
在第十九特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液為具有8.7之pH值的130mM EPPS緩衝液。
在第三實施例中，本發明之方法包括以下步驟：使細胞結合劑與具有能夠與細胞結合劑形成共價鍵之反應基團(例如胺反應基團)的細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在4至9之間的pH值下在高濃度緩衝液存在下反應。
在一個實施例中，緩衝液之濃度在20mM與750mM之間。在另一實施例中，緩衝液之濃度在20mM與500mM之間、20mM與200mM之間、25mM與150mM之間、50mM與150mM之間、50mM與100mM之間、100mM與200mM之間或100mM與150mM之間。
在一個實施例中，緩衝溶液之pH值在7.3與8.9之間、7.3與8.4之間、7.6與8.4之間、7.7與8.3之間或7.8與8.2之間。在另一實施例中，緩衝溶液之pH值在7.9與8.1之間。在另一實施例中，緩衝溶液之pH值為8.0。在一個實施例中，緩衝溶液之pH值在8.5與8.9之間。在另一實施例中，緩衝溶液之pH值在8.6與8.8之間。在又一實施例中，緩衝溶液之pH值為8.7。
在第二十特定實施例中，對於第三實施例中描述之方法，緩衝溶液具有20mM與200mM之間的離子強度及7.1與8.5之間的pH值。
在第二十一特定實施例中，對於第三實施例中描述之方法， 緩衝溶液具有50mM與150mM之間的強度及7.6與8.4之間的pH值。
在第二十二特定實施例中，對於第一或第二實施例中描述之方法，緩衝溶液具有50mM與100mM之間的濃度及7.7與8.3之間的pH值。
在第二十三特定實施例中，對於第三實施例中描述之方法，緩衝溶液具有60mM與90mM之間的濃度及7.8與8.2之間的pH值。
在第二十四特定實施例中，對於第三實施例中描述之方法，緩衝溶液具有70mM與80mM之間的濃度及7.9與8.1之間的pH值。
在第二十五特定實施例中，對於第三實施例中描述之方法，緩衝溶液具有75mM之離子強度及8.0之pH值。
在第二十六特定實施例中，對於第三實施例中描述之方法，緩衝溶液具有50mM與200mM之間的濃度及7.8與8.9之間的pH值。
在第二十七特定實施例中，對於第三實施例中描述之方法，緩衝溶液具有110mM與150mM之間的濃度及8.5與8.9之間的pH值。
在第二十八特定實施例中，對於第三實施例中描述之方法，緩衝溶液具有120mM與140mM之間的濃度及8.6與8.8之間的pH值。
在第二十九特定實施例中，對於第三實施例中描述之方法，緩衝溶液具有130mM之濃度及8.7之pH值。
在一個實施例中，用於本發明之方法中的緩衝溶液可進一步包含惰性鹽以維持緩衝液之離子強度。在一個實施例中，緩衝溶液進一步包含氯化鈉。
在一個實施例中，對於上述本發明之方法，細胞結合劑與細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物之間的反應在少量有機溶劑存在下進行。更特定而言，有機溶劑為二甲基乙醯胺(DMA)。有機溶劑(例如DMA)可呈按體積計緩衝溶液與有機溶劑之總體積的1%-20%、1%-15%、2%-15%、5%-15%、8%-12%或10%-20%的量存在。在一個實施例中，有機溶劑(例如DMA)呈按體積計緩衝溶液與有機溶劑之總體積的10%的量存在。在另一個實施例中，有機溶劑(例如DMA)呈按體積計緩衝溶液與有機溶劑之總體積的15%的量存在。
在一個實施例中，對於上述本發明之方法，使反應進行2分鐘至1週、1小時至48小時、1小時至36小時、1小時至24小時、1小時至12小時、1小時至8小時、5小時至15小時、6小時至14小時、4小時至8小時、5小時至7小時、1小時至5小時、1小時至4小時、1小時至2小時、30分鐘至2小時、5分鐘至30分鐘或2小時至5小時。在一個實施例中，使反應進行2小時至6小時或3小時至5小時。在一個實施例中，使反應進行1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時等。在另一實施例中，使反應進行4小時。
細胞結合劑與細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物之間的反應可在任何適合溫度下進行。在一個實施例中，反應可在10℃至50℃、10℃至40℃或10℃至30℃之溫度下進行。在另一實施例中，反應可在15℃至30℃、20℃至30℃、15℃至25℃、16℃至24℃、17℃至23℃、18℃至22℃或19℃至21℃之溫度下進行。在又一實施例中，反應可在15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃之溫度下進行。
由細胞結合劑與細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物之間的結合反應形成的結合物可具有在儲存後或在結合反應結束與純化步驟之間的時間期間形成高分子量物質之傾向。為減少高分子量物質形成，可在結合反應後添加淬滅溶液以穩定結合物。
在第三十特定實施例中，以上第一、第二或第三實施例中描述之方法(例如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八或第二十九特定實施例中描述之方法)進一步包括在細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物與細胞結合劑之反應後添加高離子濃度之淬滅溶液之步驟。
第三十特定實施例中亦提供，該方法進一步包括在細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物與細胞結合劑之反應後添加包含高濃度緩衝 液之淬滅溶液之步驟。
在一個實施例中，淬滅溶液具有200mM與3000mM之間、200mM與2000nM之間、200mM與1000mM之間、500mM與1000mM之間、550mM與1000mM之間或600mM與1000mM之間的離子強度。在另一實施例中，淬滅溶液具有700mM與1000mM之間的離子強度。在另一實施例中，淬滅溶液具有900mM之離子強度。
在另一實施例中，淬滅溶液包含濃度在200mM與3000mM之間、200mM與2000mM之間、200mM與1000mM之間、500mM與1000mM之間、550mM與1000mM之間或600mM與1000mM之間的緩衝液。在另一實施例中，淬滅溶液具有濃度在700mM與1000mM之間的緩衝液。在另一實施例中，淬滅溶液具有濃度為750mM之緩衝液。
在另一實施例中，在細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物與細胞結合劑反應之後將淬滅溶液與反應混合物混合，且在混合之後，緩衝液之最終濃度在150mM與750mM之間、150mM與600mM之間、200mM與500nM之間、200mM與400nM之間、250mM與350mM之間。
在一些實施例中，淬滅溶液中之緩衝液與用於細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物與細胞結合劑之結合反應中的緩衝液相同。
本文中描述之淬滅溶液可包含緩衝液、鹽或其組合。可使用任何適合緩衝液或鹽。示例性緩衝液包括(但不限於)MES((2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸))緩衝液、雙-三甲烷(2-[雙(2-羥乙基)胺基]-2-(羥甲基)丙-1,3-二醇)緩衝液、ADA(N-(2-乙醯胺基)亞胺基二乙酸)緩衝液、ACES(N-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、PIPES(哌嗪-N,N'-雙(2-乙烷磺酸))、MOPSO(β-羥基-4-嗎啉丙烷磺酸)緩衝液、雙-三丙烷(1,3-雙(三(羥甲基)甲基胺基)丙烷)緩衝液、BES(N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙烷磺酸)、TES(N-[三(羥甲基)甲基]-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、HEPES(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸)緩衝液、DIPSO(3-(N,N-雙[2-羥乙基]胺基)-2-羥基丙烷磺酸或N,N-雙(2-羥乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸)、MOBS(4-(N-嗎啉基)丁烷磺酸)緩衝液、TAPSO(3-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]-2-羥基丙烷-1-磺酸)緩衝液、trizma(Tris或2-胺基-2-(羥 甲基)-1,3-丙二醇)緩衝液、HEPPSO(N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(2-羥基丙烷磺酸))緩衝液、POPSO(哌嗪-1,4-雙-(2-羥基-丙烷-磺酸)脫水物)緩衝液、EPPS(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸)緩衝液、tricine(N-(2-羥基-1,1-雙(羥甲基)乙基)甘胺酸)緩衝液、gly-gly、bicine(2-(雙(2-羥乙基)胺基)乙酸)緩衝液、HEPBS(N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(4-丁烷磺酸))緩衝液、TAPS(3-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]丙烷-1-磺酸)緩衝液、AMPD(2-胺基-2-甲基-1,3-丙二醇)緩衝液、TABS(N-三(羥甲基)甲基-4-胺基丁烷磺酸)緩衝液、AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羥乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸)緩衝液及其組合。在一個實施例中，緩衝液選自由以下組成之群：HEPPSO(N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(2-羥基丙烷磺酸))緩衝液、POPSO(哌嗪-1,4-雙-(2-羥基-丙烷-磺酸)脫水物)緩衝液、HEPES(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸)緩衝液、EPPS(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸)緩衝液、TES(N-[三(羥甲基)甲基]-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、MES(2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸)緩衝液及其組合。示例性鹽包括(但不限於)NaCl、KCl及鹽酸組胺酸。在一個實施例中，淬滅溶液包含EPPS。在另一實施例中，淬滅溶液包含EPPS及鹽酸組胺酸。
在一個實施例中，淬滅溶液具有5與9之間、5與7之間或5與6之間的pH值。在另一實施例中，淬滅溶液具有5.5之pH值。
在一個實施例中，在與反應混合物混合前淬滅溶液包含750mM EPPS及150mM鹽酸組胺酸。
在一個實施例中，淬滅溶液包含EPPS及鹽酸組胺酸，且在淬滅溶液與反應混合物混合之後，所得混合物包含200mM至400mM EPPS及40至60mM鹽酸組胺酸。在一個實施例中，所得混合物包含250mM至350mM EPPS及40至60mM鹽酸組胺酸。在又一個實施例中，所得混合物包含300mM至350mM EPPS及45mM至55mM鹽酸組胺酸。
在一個實施例中，根據本發明方法製備之細胞結合劑-細胞毒性劑結合物進行純化步驟。在此方面，細胞結合劑-細胞毒性劑結合物可使用切向流過濾(TFF)(其為基於膜之切向流過濾法)、非吸附層析法、吸附層析法、吸附過濾、選擇沈澱或任何其他適合之純化方法以及其組合自混合物之其他組分(例如游離細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物及反應 副產物)純化。
在本發明之一個實施例中，細胞結合劑-細胞毒性劑結合物使用單個純化步驟(例如TFF)純化。較佳地，結合物使用單個純化步驟(例如TFF)純化且交換成適當調配物。在本發明之另一實施例中，細胞結合劑-細胞毒性劑結合物使用兩個連續純化步驟純化。舉例而言，結合物可首先藉由選擇沈澱、吸附過濾、吸附層析法或非吸附層析法純化，接著用TFF純化。一般技術者將瞭解細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之純化能夠分離包含化學偶合於細胞毒性劑之細胞結合劑的穩定結合物。
任何適合之TFF系統均可用於純化，包括Pellicon型系統(Millipore,Billerica,Mass.)、Sartocon Cassette系統(Sartorius AG,Edgewood,N.Y.)、TangenX盒(TangenX Technology Corporation,Shrewsbury,MA)及Centrasette型系統(Pall Corp.,East Hills,N.Y.)。
任何適合之吸附層析樹脂可用於純化，其中樹脂可保留細胞結合劑-細胞毒性劑結合物且允許雜質溶離或保留雜質，且允許細胞結合劑-細胞毒性劑結合物溶離。較佳吸附層析樹脂包括羥磷灰石層析、疏水性電荷感應層析(HCIC)、疏水相互作用層析(HIC)、離子交換層析法、混合模式離子交換層析法、固定金屬親和層析(IMAC)、染料配位體層析法、親和層析法、反相層析法及其組合。適合羥磷灰石樹脂之實例包括陶瓷羥磷灰石(CHT I型及II型，Bio-Rad Laboratories,Hercules,Calif.)、HA Ultrogel羥磷灰石(Pall Corp.,East Hills,N.Y.)及陶瓷氟磷灰石(CFT I型及II型，Bio-Rad Laboratories,Hercules,Calif.)。適合HCIC樹脂之一實例為MEP Hypercel樹脂(Pall Corp.,East Hills,N.Y.)。適合HIC樹脂之實例包括丁基-瓊脂糖、己基-瓊脂糖、苯基-瓊脂糖及辛基瓊脂糖樹脂(均來自GE Healthcare,Piscataway,N.J.)以及Macro-prep甲基及Macro-Prep第三丁基樹脂(Biorad Laboratories,Hercules,Calif.)。適合離子交換樹脂之實例包括SP-瓊脂糖、CM-瓊脂糖及Q-瓊脂糖樹脂(均來自GE Healthcare,Piscataway,N.J.)及Unosphere S樹脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,Calif.)。適合混合模式離子交換劑之實例包括Bakerbond ABx樹脂(JT Baker,Phillipsburg N.J.)。適合IMAC樹脂之實例包括螯合瓊脂糖樹脂(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)及 Profinity IMAC樹脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,Calif.)。適合染料配位體樹脂之實例包括藍色瓊脂糖樹脂(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)及Affi-gel Blue樹脂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,Calif.)。適合親和樹脂之實例包括蛋白A瓊脂糖樹脂(例如MabSelect,GE Healthcare,Piscataway,N.J.)，其中細胞結合劑為抗體；及凝集素親和樹脂，例如小扁豆凝集素瓊脂糖樹脂(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)，其中細胞結合劑載有適當凝集素結合位點。或者，可使用對細胞結合劑具有特異性之抗體。此類抗體可固定至例如Sepharose 4 Fast Flow樹脂(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)。適合反相樹脂之實例包括C4、C8及C18樹脂(Grace Vydac,Hesperia,Calif.)。
任何適合之非吸附層析樹脂可用於純化。適合非吸附層析樹脂之實例包括(但不限於)SEPHADEXTM G-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM樹脂(例如S-200及S-300)、SUPERDEXTM樹脂(例如SUPERDEXTM 75及SUPERDEXTM 200)、BIO-GEL®樹脂(例如P-6、P-10、P-30、P-60及P-100)及一般技術者已知之其他樹脂。
藉由本文中描述之方法製備的結合物可在適合調配緩衝液中調配。
本發明之方法製備的細胞結合劑-細胞毒性劑結合物具有基本上高純度及穩定性。在本發明之一態樣中，基本上高純度之細胞結合劑-細胞毒性劑結合物具有一或多個以下特徵：(a)少於25%、少於20%、少於15%(例如少於或等於15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)之抗體片段；(b)大於90%(例如大於或等於91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)，較佳大於95%之結合物質為單體；(c)結合物製劑中未結合連接子含量少於約10%(例如少於或等於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%)(相對於總連接子)；(d)少於10%結合物質交聯(例如少於或等於約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或0%)；(e)結合物製劑中游離細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物之含量少於2%(例如少於或等於約1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%或0%)(相對於總細胞毒性劑之mol/mol)；(f)少於約 10%，少於約5%(例如少於或等於約4%、3%、2%、1%或0%)之高分子量物質；及/或(g)儲存時(例如約1週、約2週、約3週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約1年、約2年、約3年、約4年或約5年後)游離細胞毒性劑含量無顯著增加。游離細胞毒性劑之含量「顯著增加」意指在一定儲存時間(例如約1週、約2週、約3週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約1年、約2年、約3年、約4年或約5年)後，游離細胞毒性劑之含量增加少於約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1.0%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%、約2.0%、約2.2%、約2.5%、約2.7%、約3.0%、約3.2%、約3.5%、約3.7%或約4.0%。
如本文所用，術語「未結合連接子」係指與雙官能交聯試劑共價連接之細胞結合劑，其中細胞結合劑未經由雙官能交聯試劑之連接子共價偶合於細胞毒性劑(亦即，「未結合連接子」可由CBA-L表示，其中CBA表示細胞結合劑且L表示雙官能交聯試劑。相反，細胞結合劑-細胞毒性劑結合物可由CBA-L-D表示，其中D表示細胞毒性劑)。
如本文所用，術語“高分子量物質”或“HMW”係指含有抗體或含有結合物之高分子量的物質。高分子量物質可為二聚體、三聚體、由抗體或結合物聚集形成之其他更高級低聚物或其組合。高分子量物質可藉由SEC-HPLC鑑別且確定其量。
在一個實施例中，細胞結合劑-細胞毒性劑結合物中細胞毒性劑與細胞結合劑之平均莫耳比(亦即DAR)為1至15、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、1.5至5、2至7或3至5。在另一實施例中，DAR為1.5至3.5、2至3、2.1至2.9、2.2至2.8、2.3至2.7或2.4至2.6。在另一實施例中，藉由本發明方法製備之結合物的DAR為2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.5、2.7、2.8、2.9或3.0。在一個實施例中，DAR為2.5。在另一個實施例中，DAR為2.7。
DAR值可藉由此項技術中已知之任何方法測定。在一個實施例中，DAR值可藉由UV/Vis光譜學，使用在分別針對抗體及細胞毒性 劑之波長下的吸光度值測定。或者，DAR值可藉由質譜分析及/或HPLC測定。
細胞結合劑
對於用於本發明之方法，細胞結合劑可為結合於細胞、典型及較佳動物細胞(例如人類細胞)之任何適合試劑。細胞結合劑較佳為肽或多肽。適合細胞結合劑包括例如抗體(例如單株抗體及其片段)、干擾素(例如α、β、γ)、淋巴因子(例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6)、激素(例如胰島素、TRH(促甲狀腺素釋放激素)、MSH(刺激黑色素細胞之激素)、類固醇激素(諸如雄激素及雌激素)、生長因子及群落刺激因子(諸如EGF、TGF-α、FGF、VEGF、G-CSF、M-CSF及GM-CSF(Burgess,Immunology Today 5：155-158(1984))、營養素轉運分子(例如轉鐵蛋白)、維生素(例如葉酸鹽)及特異性結合細胞表面上標靶分子之任何其他試劑或分子。
在細胞結合劑為抗體之情況下，其結合於呈多肽或glycotope之抗原且可為跨膜分子(例如受體)或配位體，諸如生長因子。示例性抗原包括諸如以下之分子：血管緊張肽原酶；生長激素，包括人類生長激素及牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降血素；促黃體生成激素；胰高血糖素；凝血因子，諸如因子vmc、因子IX、組織因子(TF)及馮威里氏因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子，諸如蛋白質C；心房鈉尿素；肺表面活性劑；血纖維蛋白溶解酶原活化劑，諸如尿激酶或人類尿或組織型血纖維蛋白溶解酶原活化劑(t-PA)；鈴蟾素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α及-β；腦啡肽酶；RANTES(活化時調節，正常T細胞表現且分泌)；人類巨噬細胞發炎蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白；穆氏管抑制物質(Muellerian-inhibiting substance)；鬆弛激素A鏈；鬆弛激素B鏈；原鬆弛激素；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白，諸如β-內醯胺酶；DNase；IgE；細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA)，諸如CTLA-4；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子受體；蛋白A或D；類風濕因子；神經營養因子，諸如骨衍生神經營養因子(BDNF)、神經營養蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT4、 NT-5或NT-6)或神經生長因子，諸如NGF-β；血小板衍生生長因子(PDGF)；纖維母細胞生長因子，諸如aFGF及bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I及胰島素樣生長因子-II(IGF-I及IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)；胰島素樣生長因子結合蛋白；EpCAM；GD3；FLT3；PSMA；PSCA；MUC1；MUC16；STEAP；CEA；TENB2；EphA受體；EphB受體；葉酸鹽受體；FOLR1；間皮素；crypto；αvβ6；整聯蛋白；VEGF、VEGFR；EGFR；纖維母細胞生長因子受體(FGFR)(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)；轉鐵蛋白；IRTA1；IRTA2；IRTA3；IRTA4；IRTA5；CD蛋白質，諸如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD123、CD134、CD137、CD138、CD152、鳥苷酸環化酶C(GCC)或美國專利申請公開案No.2008/0171040或美國專利申請公開案No.2008/0305044中揭示之結合於一或多種腫瘤相關抗原或細胞表面受體之抗體且以引用的方式全部併入；促紅細胞生成因子；骨誘發性因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF及G-CSF；介白素(IL)，例如IL-1至IL-10；過氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒性抗原，諸如HIV包膜蛋白之一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調節蛋白；整聯蛋白，諸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4及VCAM；腫瘤相關抗原，諸如HER2、HER3或HER4受體；內皮糖蛋白；c-Met；IGF1R；前列腺抗原，諸如PCA3、PSA、PSGR、NGEP、PSMA、PSCA、TMEFF2及STEAP1；LGR5；B7H4；及任一上列多肽之片段。在一個實施例中，抗原並非GCC。
另外，結合於骨髓細胞之GM-CSF可作為細胞結合劑用於來自急性髓性白血病之患病細胞。結合於活化T細胞之IL-2可用於預防移植排斥反應、移植物抗宿主疾病之療法及預防以及治療急性T細胞白血病。結合於黑色素細胞之MSH可用於治療黑素瘤，如抗體針對黑素瘤。葉酸可 用於靶向在卵巢及其他腫瘤上表現之葉酸鹽受體。表皮生長因子可用於靶向鱗狀癌，諸如肺及頭頸部。抑生長素可用於靶向神經母細胞瘤及其他腫瘤類型。
乳癌及睾丸癌可成功地分別用雌激素(或雌激素類似物)或雄激素(或雄激素類似物)作為細胞結合劑來靶向。
如本文所用，術語「抗體」係指任何免疫球蛋白、任何免疫球蛋白片段，諸如Fab、Fab'、F(ab')2、dsFv、sFv、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、前抗體(Parham,J.Immunol.,131：2895-2902(1983)；Spring等人J.Immunol.,113：470-478(1974)；Nisonoff等人Arch.Biochem.Biophys.,89：230-244(1960)；Kim等人，Mol.Cancer Ther.,7：2486-2497(2008),Carter,Nature Revs.,6：343-357(2006)；美國專利No.8,399,219)或免疫球蛋白嵌合體，其可結合於細胞表面上之抗原(例如含有互補決定區(CDR))。任何適合之抗體可用作細胞結合劑。一般技術者將瞭解，適當抗體之選擇將取決於待靶向之細胞群體。關於此，在特定細胞群體(典型及較佳患病細胞群體)中選擇性表達之細胞表面分子(亦即抗原)之類型及數目將決定用於本發明之適當抗體的選擇。已知包括腫瘤細胞類型之多種細胞類型的細胞表面表現型態，或若未知，則可使用常規分子生物學及組織化學技術測定。
抗體可為多株或單株，但最佳為單株抗體。如本文所用，「多株」抗體係指通常含於免疫接種動物之血清中的抗體分子之異質群體。「單株」抗體係指對特定抗原具有特異性之抗體分子之均質群體。單株抗體通常由單個B淋巴細胞(「B細胞」)純系產生。單株抗體可使用一般技術者已知之多種技術，包括標準融合瘤技術獲得(參見例如Kohler及Milstein,Eur.J.Immunol.,5：511-519(1976)；Harlow及Lane(編輯)，Antibodies：A Laboratory Manual,CSH Press(1988)；及C.A.Janeway等人(編輯)，Immunobiology，第5版，Garland Publishing,New York,N.Y.(2001))。簡單地說，產生單株抗體之融合瘤方法通常包括將抗原(亦即「免疫原」)注入任何適合動物，通常且較佳小鼠。隨後處死動物，且自其脾分離之B細胞與人類骨髓瘤細胞融合。產生雜交細胞(亦即「融合瘤」)，其不定地增殖且連續分泌高滴度之在活體 外具有所需特異性之抗體。此項技術中已知之任何適當方法可用於鑑別產生具有所需特異性之抗體的融合瘤細胞。此類方法包括例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、西方墨點分析及放射免疫分析。對融合瘤群體進行篩選以分離個別純系，每個純系針對抗原分泌單個抗體物質。因為每個融合瘤為來源於與單個B細胞融合之純系，所以所有其產生之抗體分子的結構均一致，包括其抗原結合位點及同型。單株抗體亦可使用其他適合技術產生，包括EBV-融合瘤技術(參見例如Haskard及Archer,J.Immunol.Methods,74(2)：361-67(1984)及Roder等人，Methods Enzymol.,121：140-67(1986))、噬菌體載體表現系統(參見例如Huse等人，Science,246：1275-81(1989))或包含諸如Fab及scFv(單鏈可變區)之抗體片段之噬菌體展示庫(參見例如美國專利No.5,885,793及5,969,108，以及國際專利申請公開案WO 92/01047及WO 99/06587)。
單株抗體可自任何適合動物分離或在任何適合動物中產生，但較佳在哺乳動物、更佳小鼠或人類且最佳人類中產生。用於在小鼠中產生抗體之方法為一般技術者熟知且在本文中予以描述。關於人類抗體，一般技術者將瞭解多株抗體可自經適當抗原疫苗接種或免疫接種之人類個體之血清分離。或者，人類抗體可藉由改變在諸如小鼠之非人類動物中產生人類抗體之已知技術產生(參見例如美國專利No.5,545,806、5,569,825及5,714,352以及美國專利申請公開案No.2002/0197266 A1)。
雖然為人類中治療應用之理想選擇，但人類抗體、尤其人類單株抗體通常比小鼠單株抗體更難以產生。然而，當投與人類時小鼠單株抗體誘發快速宿主抗體反應，此會降低抗體-細胞毒性劑結合物之治療或診斷潛能。為阻遏此等併發症，人類免疫系統較佳不將單株抗體識別為「外來」。
為此，噬菌體展示可用於產生抗體。關於此，編碼抗體之抗原結合可變(V)域之噬菌體文庫可使用標準分子生物學及重組DNA技術產生(參見例如Sambrook等人(編輯)，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2001))。選擇編碼具有所需特異性之可變區的噬菌體用於特異性結合於所需抗原，且重組包含 所選可變域之完整人類抗體。將編碼重組抗體之核酸序列引入適合細胞株，諸如用於產生融合瘤之骨髓瘤細胞，使得細胞分泌具有單株抗體之特徵的人類抗體(參見例如Janeway等人，上述；Huse等人，上述；及美國專利No.6,265,150)。或者，單株抗體可自針對特定人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因進行基因轉殖之小鼠產生。此類方法為此項技術中已知且描述於例如美國專利No.5,545,806及5,569,825，以及Janeway等人，上述。
最佳地，抗體為人類化抗體。如本文所用，「人類化」抗體為形成抗體之抗原結合環的小鼠單株抗體之互補決定區(CDR)移植至人類抗體分子之構架上的抗體。歸因於小鼠及人類抗體之構架之相似性，此項技術中公認此方法產生抗原性與人類抗體一致，但與CDR序列所來源之小鼠單株抗體結合相同抗原的單株抗體。用於產生人類化抗體之方法為此項技術中熟知且詳細描述於例如Janeway等人，上述；美國專利No.5,225,539、5,585,089及5,693,761；歐洲專利No.0239400 B1；以及英國專利No.2188638。人類化抗體亦可使用美國專利No.5,639,641及Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235：959-973(1994)中描述之抗體表面重修技術產生。雖然用於本發明組合物之結合物中之抗體最佳為人類化單株抗體，如上所述之人類單株抗體及小鼠單株抗體亦在本發明之範疇內。
具有至少一個抗原結合位點，因此識別且結合於標靶細胞表面上存在之至少一個抗原或受體的抗體片段亦在本發明範疇內。在此方面，完整抗體分子之蛋白裂解可產生保留識別且結合抗原之能力的多種抗體片段。舉例而言，用蛋白酶木瓜蛋白酶限制性消化抗體分子通常產生三個片段，其中兩個片段一致且稱為Fab片段，因為其保留親本抗體分子之抗原結合活性。用酶胃蛋白酶使抗體分子裂解正常產生兩個抗體片段，抗體片段之一保留抗體分子之抗原結合臂，因此稱為F(ab')2片段。用二硫蘇糖醇或巰基乙胺還原F(ab')2產生稱為Fab'片段之片段。由包含抗體重鏈之可變(V)域經由合成肽與抗體輕鏈之V域連接的截短Fab片段組成的單鏈可變區片段(sFv)抗體片段可使用常規重組DNA技術產生(參見例如Janeway等人，上述)。類似地，經二硫化物穩定化之可變區片段(dsFv)可藉由重組DNA技術製備(參見例如Reiter等人，Protein Engineering,7：697-704 (1994))。然而，本發明上下文中之抗體片段不侷限於抗體片段之此等示例性類型。可採用識別且結合於所需細胞表面受體或抗原之任何適合抗體片段。抗體片段進一步描述於例如Parham,J.Immunol.,131：2895-2902(1983)；Spring等人，J.Immunol.,113：470-478(1974)；及Nisonoff等人，Arch.Biochem.Biophys.,89：230-244(1960)。抗體-抗原結合可使用此項技術中已知之任何適合方法，諸如放射免疫分析(RIA)、ELISA、西方墨點法、免疫沈澱反應及競爭性抑制分析進行分析(參見例如Janeway等人，上述；及美國專利申請公開案No.2002/0197266 A1)。
另外，抗體可為嵌合抗體或其抗原結合片段。「嵌合」意謂抗體包含至少兩個獲自或來源於至少兩個不同物種之免疫球蛋白或其片段(例如兩個不同免疫球蛋白，諸如人類免疫球蛋白恆定區與鼠科免疫球蛋白可變區組合)。抗體亦可為域抗體(dAb)或其抗原結合片段，諸如駱駝科抗體(參見例如Desmyter等人，Nature Struct.Biol.,3：752,(1996))或鯊魚抗體，諸如新抗原受體(IgNAR)(參見例如Greenberg等人，Nature,374：168(1995)；及Stanfield等人，Science,305：1770-1773(2004))。
任何適合抗體可用於本發明之上下文中。舉例而言，單株抗體J5為對急性淋巴母細胞性白血病共同抗原(CALLA)具有特異性之鼠科IgG2a抗體(Ritz等人，Nature,283：583-585(1980))，且可用於靶向表現CALLA之細胞(例如急性淋巴母細胞性白血病細胞)。單株抗體MY9為特異性結合於CD33抗原之鼠科IgG1抗體(Griffin等人，Leukemia Res.,8：521(1984))，且可用於靶向表現CD33之細胞(例如急性髓性白血病(AML)細胞)。在某些實施例中，MY9抗體已移除掉N端或C端殘基。
類似地，單株抗體抗B4(亦稱為B4)為結合於B細胞上CD19抗原之鼠科IgG1抗體(Nadler等人，J.Immunol.,131：244-250(1983))，且可用於靶向表現CD19之B細胞或患病細胞(例如非霍奇金氏淋巴瘤細胞(non-Hodgkin's lymphoma cell)及慢性淋巴細胞性白血病細胞)。N901為結合於在神經內分泌來源(包括小細胞肺腫瘤)細胞上發現之CD56(神經細胞黏著分子)抗原的鼠科單株抗體，其可用於將藥物靶向至神經內分泌來源細胞之結合物。J5、MY9及B4抗體較佳在其用作結合物之一部分前進行表面 重修或人類化。抗體之表面重修或人類化描述於例如Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91：969-73(1994)。
另外，單株抗體C242結合於CanAg抗原(參見例如美國專利No.5,552,293)，且可用於將結合物靶向表現CanAg之腫瘤，諸如結腸直腸、胰臟、非小細胞肺及胃癌。HuC242為單株抗體C242之人類化形式(參見例如美國專利No.5,552,293)。HuC242所產自之融合瘤以ECACC鑑別編號90012601寄存。HuC242可使用CDR移植法(參見例如美國專利No.5,585,089、5,693,761及5,693,762)或表面重修技術(參見例如美國專利No.5,639,641)製備。HuC242可用於將結合物靶向表現CanAg抗原之腫瘤細胞，諸如結腸直腸癌、胰臟癌、非小細胞肺癌及胃癌細胞。
為靶向卵巢癌及前列腺癌細胞，抗MUC1抗體可用作結合物中之細胞結合劑。抗MUC1抗體包括例如抗HMFG-2(參見例如Taylor-Papadimitriou等人，Int.J.Cancer,28：17-21(1981))、hCTMO1(參見例如van H等人，Cancer Res.,56：5179-5185(1996))及DS6。前列腺癌細胞亦可藉由使用抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)作為細胞結合劑，諸如J591，用結合物靶向(參見例如Liu等人，Cancer Res.,57：3629-3634(1997))。此外，表現Her2抗原之癌細胞，諸如乳癌、前列腺癌及卵巢癌，可藉由使用抗Her2抗體，例如曲妥珠單抗(trastuzumab)作為細胞結合劑用結合物靶向。表現表皮生長因子受體(EGFR)及其變異體，諸如III型缺失突變體EGFRvIII之細胞可藉由使用抗EGFR抗體用結合物靶向。抗EGFR抗體描述於國際專利申請No.PCT/US11/058,385及PCT/US11/058,378中。抗EGFRvIII抗體描述於美國專利No.7,736,644及7,628,986以及美國申請公開案2010/0111979、2009/0240038、2009/0175887、2009/0156790及2009/0155282。結合於胰島素樣生長因子受體之抗IGF-IR抗體，諸如美國專利No.7,982,024中所述之彼等抗體，亦可用於結合物中。結合於CD27L、Cripto、CD138、CD38、EphA2、整聯蛋白、CD37、葉酸鹽、CD20、PSGR、NGEP、PSCA、TMEFF2、STEAP1、內皮糖蛋白及Her3之抗體亦可用於結合物。
在一個實施例中，抗體選自由以下各者組成之群：huN901、 huMy9-6、huB4、huC242、抗HER2抗體(例如曲妥珠單抗)、比伐珠單抗(bivatuzumab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、huDS6、國際專利申請公開案WO 2010/124797中描述之抗間皮素抗體(諸如MF-T)、美國專利申請公開案2010/0093980中描述之抗cripto抗體(諸如huB3F6)、美國專利申請公開案2007/0183971中描述之抗CD138抗體(諸如huB-B4)、國際專利申請No.PCT/US11/058,385及PCT/US11/058,378中描述之抗EGFR抗體(諸如EGFR-7)、美國專利No.7,736,644及7,628,986及美國專利申請公開案2010/0111979、2009/0240038、2009/0175887、2009/0156790及2009/0155282中描述之抗EGFRvIII抗體、國際專利申請公開案WO 2011/039721及WO 2011/039724中描述之人類化EphA2抗體(諸如2H11R35R74)；國際專利申請公開案WO 2008/047242中描述之抗CD38抗體(諸如hu38SB19)、國際專利申請公開案WO 2011/106528及美國專利申請公開案2012/0009181中描述之抗葉酸鹽抗體(例如huMov19)；美國專利No.5,958,872、6,596,743及7,982,024中描述之抗IGF1R抗體；美國專利申請公開案2011/0256153中描述之抗CD37抗體(例如huCD37-3)；美國申請公開案2006/0127407中描述之抗整聯蛋白αvβ6抗體(例如CNTO95)；及國際專利申請公開案WO 2012/019024中描述之抗Her3抗體。在一個實施例中，細胞結合劑為結合於FGFR2之抗體或其抗原結合片段(例如US 2014/030820中描述之彼等抗體，其整個教示內容以引用的方式併入本文中)。在另一實施例中，細胞結合劑為結合於FGFR2及FGFR4之抗體或其抗原結合片段(例如US 2014/301946中描述之彼等抗體，其整個教示內容以引用的方式併入本文中)。
尤其較佳之抗體為本文中描述之人類化單株抗體。實例包括(但不限於)huN901、huMy9-6、huB4、huC242、人類化單株抗Her2抗體(例如曲妥珠單抗)、比伐珠單抗、西羅珠單抗、CNTO95、huDS6及利妥昔單抗(參見例如美國專利No.5,639,641及5,665,357、美國臨時專利申請No.60/424,332(其與美國專利No.7,557,189相關)、國際(PCT)專利申請公開案WO 02/16401；Pedersen等人，上述；Roguska等人，上述；Liu等人，上述；Nadler等人，上述；Colomer等人，Cancer Invest.,19：49-56(2001)；Heider 等人，Eur.J.Cancer,31A：2385-2391(1995)；Welt等人，J.Clin.Oncol.,12：1193-1203(1994)；及Maloney等人，Blood,90：2188-2195(1997))。其他人類化單株抗體為此項技術中已知且可用於本發明。
在一個實施例中，細胞結合劑為美國專利No.7,342,110及7,557,189(以引用的方式併入本文中)中描述之huMy9-6，或其他相關抗體。
在另一實施例中，細胞結合劑為美國專利No 8,557,966及9,133,275中描述之抗葉酸鹽受體抗體。此等專利中之每一者的教示內容以引用的方式整體併入本文中。
在另一實施例中，細胞結合劑為特異性結合人類葉酸鹽受體1(FOLR 1)之人類化抗葉酸鹽抗體或其抗原結合片段，其中抗體包含：(a)包含GYFMN之重鏈CDR1(SEQ ID NO：1)；包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3之重鏈CDR2(SEQ ID NO：2)；及包含YDGSRAMDY之重鏈CDR3(SEQ ID NO：3)；以及(b)包含KASQSVSFAGTSLMH之輕鏈CDR1(SEQ ID NO：4)；包含RASNLEA之輕鏈CDR2(SEQ ID NO：5)；及包含QQSREYPYT之輕鏈CDR3(SEQ ID NO：6)；其中Xaa1選自K、Q、H及R；Xaa2選自Q、H、N及R；且Xaa3選自G、E、T、S、A及V。較佳重鏈CDR2序列包含RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQ ID NO：7)。
在另一實施例中，抗葉酸鹽抗體為特異性結合人類葉酸鹽受體1之人類化抗體或其抗原結合片段，其包含具有以下胺基酸序列之重鏈 (SEQ ID NO：8)。
在另一實施例中，抗葉酸鹽抗體為藉由於2010年4月7日寄存在ATCC且具有ATCC寄存編號PTA-10772及PTA-10773或10774之質體DNA編碼的人類化抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，抗葉酸鹽抗體為人類化抗體或其抗原結 合片段，其包含與 (SEQ ID NO：24) 至少約90%、95%、99%或100%一致之重鏈可變域及與 (SEQ ID NO：9)或 (SEQ ID NO：10)至少約90%、95 %、99%或100%一致之輕鏈可變域。
在一個實施例中，細胞結合劑為特異性結合於GCC之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含SED ID NO：11-16之CDR序列。在一個實施例中，抗GCC抗體具有分別與SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18至少95%一致之VH及VL序列。在另一實施例中，抗GCC抗體具有分別為SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18之VH及VL序列。在又一實施例中，抗GCC抗體包含SEQ ID NO：19之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：20之輕鏈胺基酸序列。在一個實施例中，抗GCC抗體包含替換IgG1重鏈中之ELLG的重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：19)，其對於Fc RIIIb與PVA結合為重要的；及SEQ ID NO：20之輕鏈胺基酸序列，
在一個實施例中，細胞結合劑不為抗GCC抗體或其抗原結合片段。
雖然細胞結合劑較佳為抗體，細胞結合劑亦可為非抗體分子。適合非抗體分子包括例如干擾素(例如α、β或γ干擾素)、淋巴因子(例如介白素2(IL-2)、IL-3、IL-4或IL-6)、激素(例如胰島素)、生長因子(例如EGF、TGF-α、FGF及VEGF)、群落刺激因子(例如G-CSF、M-CSF及GM-CSF(參見例如Burgess,Immunology Today,5：155-158(1984))、抑生長素及鐵轉蛋白(參見例如O'Keefe等人，J.Biol.Chem.,260：932-937(1985))。舉例而言，結合骨髓細胞之GM-CSF可用作細胞結合劑以靶向急性髓性白血病細胞。另外，結合活化T細胞之IL-2可用於預防移植排斥反應、移植物抗宿主疾病之療法及預防以及治療急性T細胞白血病。表皮生長因子(EGF)可用於靶向鱗狀癌，諸如肺癌及頭頸部癌。抑生長素可用於靶向神經母細胞瘤細胞及其他腫瘤細胞類型。
在某些實施例中，可用於本發明之方法中的細胞結合劑(例如抗體)包含可與具有胺反應基團之細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物形成共價鍵的游離胺-NH2基團(例如一或多個離胺酸殘基上之ε胺基)。
細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物
如本文所用，「細胞毒性劑」係指引起細胞死亡、誘發細胞死亡或降低細胞存活力之任何化合物。在一個實施例中，細胞毒性劑為苯并二氮呯二聚體化合物。在另一實施例中，細胞毒性劑為吲哚啉并苯并二氮呯二聚體化合物。較佳地，吲哚啉并苯并二氮呯二聚體化合物具有可與細胞結合劑上之胺基(例如離胺酸胺基)形成共價鍵之胺反應基團。
在某些實施例中，細胞毒性劑可與具有胺反應基團之連接子反應，形成附接有胺反應基團之細胞毒性劑-連接子化合物。所得細胞毒性劑-連接子化合物接著可與細胞結合劑反應，形成細胞結合劑-細胞毒性劑結合物。
如本文所用，術語「胺活性基團」係指與胺基反應形成共價鍵之官能基。在一個實施例中，胺反應基團為反應性酯基。反應性酯基之實例包括(但不限於)N-羥基丁二醯亞胺酯、N-羥基磺基丁二醯亞胺酯、硝基苯基(例如2或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基(例如4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯及五氟苯基酯。在一個實施例中，反應性酯基為N-羥基丁二醯亞胺酯或N-羥基磺基丁二醯亞胺酯。
在第31特定實施例中，對於本文中描述之本發明方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九或第三十特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：L由以下各式表示：-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)E (A1)；或-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-zsl (A3)；其中：R5為-H或(C1-C3)烷基；P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽；Ra及Rb每次出現時各獨立地為-H、(C1-C3)烷基或帶電取代基或可電離基團Q(Q較佳為-SO3M)；m為整數1至6；且zsl選自以下各式中之任一者： 其中：q為整數1至5；M為-H或陽離子；且-C(=O)E表示反應性酯基。
在第三十二特定實施例中，對於上述式(I)或(II)之化合物，Ra及Rb均為H；且R5為H或Me；且剩餘變數如第三十一特定實施例中所述。
在第三十三特定實施例中，對於上述式(I)或(II)之化合物，P為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且剩餘變數如第三十一或第三十二特定實施例中所述。在一個實施例中，肽可藉由蛋白酶裂解，較佳可藉由在腫瘤組織中表現之蛋白酶裂解。在另一實施例中，P選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、 Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：21)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：22)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：23)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met及Met-Ala。P較佳為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第三十四特定實施例中，對於本文中描述之本發明方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九或第三十特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
在第三十五特定實施例中，對於本文中描述之本發明方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九或第三十特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一個實施例中，對於本文中描述之化合物(例如第三十一、第三十二、第三十三、第三十四或第三十五特定實施例中描述之化合物)，由-C(=O)E表示之反應性酯基選自N-羥基丁二醯亞胺酯、N-羥基磺基丁二醯亞胺酯、硝基苯基(例如2或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如2,4-二硝基苯基)酯、磺基四氟苯基(例如4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯及五氟苯基酯。更特定而言，反應性酯基由下式表示： 其中U為H或-SO3M。更特定而言，反應性酯基由下式表示：
在第三十六特定實施例中、對於本文中描述之本發明方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九或第三十特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
在一個實施例中，對於第三十六實施例中描述之方法，結構式(Ie)之化合物藉由使(IIe)之化合物與磺化劑反應來製備。在一特定實施例中，磺化劑為NaHSO3或KHSO3。在另一特定實施例中，對於第三十六實施例中描述之方法，結構式(Ie)之化合物藉由使(IIe)之化合物與磺化劑反應，不純化，接著結構式(Ie)之化合物與細胞結合劑反應來製備。在一個實施例中，式(IIe)之化合物與磺化劑(例如NaHSO3或KHSO3)之間的磺化反應在水溶液中在1.9至5.0、2.9至4.0、2.9至3.7、3.1至3.5、3.2至3.4之pH 值下進行。在一特定實施例中，磺化反應在水溶液中在pH 3.3下進行。在一個實施例中，磺化反應在二甲基乙醯胺(DMA)及水中進行。
在第三十七特定實施例中，對於本文中描述之本發明方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九或第三十特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
在第三十八特定實施例中，對於本文中描述之本發明方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九或第三十特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Rx1及Rx2獨立地為(C1-C6)烷基；Re1為-H或(C1-C6)烷基；Re2為-(CH2-CH2-O)n-Rk；n為整數2至6；Rk為-H或-Me；Zsl選自以下各式中之任一者： 其中：q為整數1至5；M為-H或陽離子；且-C(=O)E表示反應性酯基。
在第三十九特定實施例中，對於由結構式(III)、(IV)、(V)及(VI)表示之化合物，Re1為H或Me；Rx1及Rx2獨立地為-(CH2)p-(CRfRg)-，其中Rf及Rg各獨立地為-H或(C1-C4)烷基；且p為0、1、2或3；且剩餘變數如以上在第三十八特定實施例中所述。較佳地，Rf與Rg相同或不同，且選自-H及-Me。
在第四十特定實施例中，對於本文中描述之本發明方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九 或第三十特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
在第四十一特定實施例中，對於本文中描述之本發明方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、 第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九或第三十特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
在第四十二特定實施例中，對於本文中描述之本發明方法 (例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九或第三十特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
在第四十三特定實施例中，對於本文中描述之本發明方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九或第三十特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
在某些實施例中，由上述結構式(I)、(III)或(V)表示之化合物分別藉由使上述結構式(II)、(IV)或(VI)之化合物與磺化試劑反應來製備。
如本文所用，「磺化試劑」為可實現以下轉變之試劑。
在一個實施例，磺化試劑為NaHSO3。
在某些實施例中，由結構式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)表示之化合物藉由分別使由結構式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)及(IIe)表示之化合物與磺化試劑反應來製備。
在某些實施例中，由結構式(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)表示之化合物藉由分別使由結構式(IVa)、(IVb)或(IVc)表示之化合物與磺化試劑反應來製備。
在某些實施例中，由結構式(Va)、(Vb)或(Vc)表示之化合物藉由分別使由結構式(VIa)、(VIb)或(VIc)表示之化合物與磺化試劑反應來製備。
在某些實施例中，對於上述本發明方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十或第四十一或第四十三特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由結構式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(VIa)、(VIb)或(VIc)表示，且方法進一步包括使細胞結合劑-細胞毒性劑結合物與磺化試劑反應。在一個實施例中，磺化試劑為NaHSO3或KHSO3。
在某些實施例中，對於上述本發明方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十或第四十一或第四十三特定實施例中描述之方法)，細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由結構式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(VIa)、(VIb)或(VIc)表示，且方法包括使細胞結合劑與由結構式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(VIa)、(VIb)或(VIc)表示之細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在磺化試劑存在下反應。在一個實施例中，磺化試劑為NaHSO3或KHSO3。
在某些實施例中，由結構式(IIIa)、(IIIb)、(Va)或(Vb)表示之化合物藉由使由以下結構式之一表示之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，與由以下結構式之一表示之連接子化合物反應來製備：
在某些實施例中，由結構式(IIIc)或(Vc)表示之化合物藉由使由以下結構式之一表示之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，與由以下結構式之一表示之連接子化合物反應來製備：
在一個實施例中，對於本文所述之化合物(例如式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(Va)、(Vb)、(Vc)、(VI)、(VIa)、(VIb)或(VIc)之化合物)，M為-H、Na+或K+。在一個實施例中，M為Na+或K+。在另一實施例中，M為Na+。在又一實施例中，M為K+。
其他適合細胞毒性劑包括例如類美登素(maytansinoid)及可結合之安絲菌素(ansamitocin)(參見例如2011年11月3日申請之國際專利申請No.PCT/US11/59131及美國專利No.9,090,629)、紫杉烷類(taxoid)、CC-1065及CC-1065類似物及多拉司他汀(dolastatin)及多拉司他汀類似物。在本發明之一特定實施例中，細胞毒性劑為類美登素，包括美登醇及美登醇類似物。類美登素為抑制微管形成且對哺乳動物細胞為高毒性的化合 物。適合美登醇類似物之實例包括具有經改質芳環之美登醇類似物及在其他位置具有改質之美登醇類似物。此類類美登素描述於例如美國專利No.4,256,746、4,294,757、4,307,016、4,313,946、4,315,929、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,424,219、4,371,533、4,450,254、5,475,092、5,585,499、5,846,545及6,333,410。
具有經改質芳環之類美登素類似物之實例包括：(1)C-19-去氯(美國專利No.4,256,746)(藉由安絲菌素P2之LAH還原製備)；(2)C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利No.4,361,650及4,307,016)(藉由使用鏈球菌屬(Streptomyce)或放線菌屬(Actinomyce)進行去甲基或使用LAH進行去氯來製備)；及(3)C-20-去甲氧基、C-20-醯氧基(--OCOR)、+/-去氯(美國專利No.4,294,757)(藉由使用醯基氯進行醯化來製備)。
具有除芳環以外之位置之改質的美登醇類似物之實例包括：(1)C-9-SH(美國專利No.4,424,219)(藉由美登醇與H2S或P2S5反應來製備)；(2)C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(美國專利No.4,331,598)；(3)C-14-羥甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利No.4,450,254)(自諾卡氏菌屬(Nocardia)製備)；(4)C-15-羥基/醯氧基(美國專利No.4,364,866)(藉由鏈球菌屬轉變美登醇來製備)；(5)C-15-甲氧基(美國專利No.4,313,946及4,315,929)(自滑桃樹(Trewia nudiflora)分離)；(6)C-18-N-去甲基(美國專利No.4,362,663及4,322,348)(藉由鏈球菌屬使美登醇去甲基)；及(7)4,5-去氧基(美國專利No.4,371,533)(藉由美登醇之三氯化鈦/LAH還原來製備)。
在本發明之一特定實施例中，可用於本發明之方法中的細胞毒性劑為含硫醇之類美登素DM1，亦稱N2’-去乙醯基-N2’-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素。DM1之結構展示於下文中：
在本發明之另一特定實施例中，可用於本發明之方法中的細胞毒性劑為含硫醇之類美登素DM1，亦稱N2’-去乙醯基-N2’-(4-甲基-4-巰基-1-側氧基丙基)-美登素。DM4之結構展示於下文中：
其他類美登素可用於本發明之上下文中，包括例如在載有硫原子之碳原子上載有單或二烷基取代的含硫醇及二硫基之類美登素。尤其較佳為在C-3位具有以下之類美登素：(a)C-14羥甲基、C-15羥基或C-20去甲基官能基，及(b)經載有受阻硫氫基之醯基醯化的胺基酸側鏈，其中載有硫醇官能基之醯基之碳原子具有一或二個取代基，該等取代基為具有1至10個碳原子之直鏈或支鏈烷基或烯基、具有3至10個碳原子之環狀烷基或烯基、苯基、經取代之苯基或雜環芳基或雜環烷基，且此外其中取代基之一可為H，且其中羰基官能基與硫原子之間醯基之直鏈長度為至少三個碳原子。
為更充分地理解本文中描述之本發明，闡述以下實例。應瞭解此等實例僅出於說明之目的，且不應理解為以任何方式限制本發明。
在本發明中亦包括藉由本文中描述之任何方法(例如在第一、第二或第三實施例或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三特定實施例中描述之方法)製備之細胞結合劑-細胞毒性劑結合物。
在一個實施例中，藉由本發明方法製備之結合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中CBA-NH2為細胞結合劑；M為-H或醫藥學上可接受之陽離子，諸如Na+或K+；且r為整數1至10。
實例
實例1
化合物1a：
向攪拌之(5-胺基-1,3-伸苯基)二甲醇(1.01g，6.59mmol)於 無水二甲基甲醯胺(16.48mL)及無水四氫呋喃(16.48ml)中之溶液中添加4-甲基-4-(甲基二硫基)戊酸(1.281g，6.59mmol)、N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(2.53g，13.19mmol)及4-二甲基胺基吡啶(0.081g，0.659mmol)。所得混合物在室溫下攪拌18小時。反應用飽和氯化銨溶液淬滅且用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。有機萃取物用水及鹽水洗滌，接著經無水硫酸鈉乾燥。溶液過濾且真空濃縮且所得殘基藉由矽膠層析法(乙酸乙酯/己烷)純化，得到呈白色固體狀之化合物1a(0.70g，32%產率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6：δ 9.90(s,1H),7.43(s,2H),6.93(s,1H),5.16(t,2H,J=5.7Hz),4.44(d,4H,J=5.7Hz),2.43(s,3H),2.41-2.38(m,2H),1.92-1.88(m,2H),1.29(s,6H)。MS(m/z)，實驗值330.0(M+1)+。
化合物1b：
向冷卻之(-10℃)化合物1a(219mg，0.665mmol)於無水二氯甲烷(6.65mL)中之溶液添加三乙胺(463μl，3.32mmol)，接著逐滴添加甲烷磺酸酐(298mg，1.662mmol)。混合物在-10℃下攪拌2小時，接著混合物用冰水淬滅且用冷乙酸乙酯(2×30mL)萃取。有機萃取物用冰水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到粗二甲磺酸鹽。
粗二甲磺酸鹽(227mg，0.467mmol)及IGN單體A(303mg，1.028mmol)溶於無水DMF(3.11mL)中。添加碳酸鉀(161mg，1.169mmol)且混合物在室溫下攪拌18小時。添加去離子化水且所得沈澱過濾且用水清洗。固體再溶於二氯甲烷中且用水洗滌。有機層經無水硫酸鎂乾燥，過濾，且濃縮。粗殘餘物藉由矽膠層析法(甲醇/二氯甲烷)純化，得到化合物1b(227mg，36%產率)。MS(m/z)，實驗值882.5(M+1)+。
化合物1c：
向化合物1b(227mg，0.167mmol)於無水1,2-二氯乙烷(3.346mL)中之懸浮液中添加三乙醯氧基硼氫化鈉(37.3mg，0.167mmol)。混合物在室溫下攪拌一小時，接著其用飽和氯化銨溶液淬滅。混合物用二氯甲烷萃取且用鹽水洗滌。有機層經無水硫酸鎂乾燥，過濾且濃縮。粗殘餘物藉由RP-HPLC(C18，水/乙腈)純化。含有所需產物之溶離份用二氯甲烷萃取，經無水硫酸鎂乾燥，過濾且濃縮，得到化合物1c(35mg，19%產率)。MS(m/z)，實驗值884.3(M+1)+。
化合物1d：
向化合物1c(18mg，0.017mmol)於乙腈(921μL)及甲醇(658μL)中之溶液中添加三(2-羰基乙基)膦鹽酸鹽(17.51mg，0.060mmol)(用含飽和碳酸氫鈉溶液(0.2mL)之磷酸鈉緩衝液(132μL，0.75M，pH 6.5)中和)。混合物在室溫下攪拌3.5小時，接著用二氯甲烷及去離子化水稀釋。將有機層分離，用鹽水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮，得到粗硫醇。MS(m/z)，實驗值838.3(M+1)+。
來自步驟5之粗硫醇(15.5mg，0.018mmol)溶於2-丙醇(1.23mL)中。添加去離子化水(617μL)及亞硫酸氫鈉(5.77mg，0.055mmol)且混合物在室溫下攪拌5小時。反應冷凍在丙酮/乾冰浴中，凍乾且藉由RP-HPLC(C18，去離子化水/乙腈)純化。含有所需產物之溶離份冷凍且凍乾，得到化合物(12S,12aS)-9-((3-(4-巰基-4-甲基戊醯胺基)-5-((((R)-8-甲氧基-6-側氧基 -11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯甲基)氧基)-8-甲氧基-6-側氧基-11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-12-磺酸(化合物1d)(6.6mg，39%產率)。MS(m/z)，實驗值918.2(M-1)-。
實例2
合成6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((R)-8-甲氧基-6-側氧基-12a,13-二氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-6-側氧基己酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯，化合物90
步驟1： (S)-2-(((苯甲基氧基)羰基)胺基)丙酸(5g，22.40mmol)及(S)-2-胺基丙酸第三丁酯鹽酸鹽(4.48g，24.64mmol)溶於無水DMF(44.8mL)中。添加EDC．HCl(4.72g，24.64mmol)、HOBt(3.43g，22.40mmol)及DIPEA(9.75mL，56.0mmol)。反應在氬氣下在室溫下攪拌隔夜。反應混合物用二氯甲烷稀釋且接著用飽和氯化銨、飽和碳酸氫鈉、水及鹽水洗滌。有機層經硫酸鈉乾燥且濃縮。粗油狀物經由矽膠層析法(己烷/乙酸乙酯)純化，得到化合物2a(6.7g，85%產率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.38-7.31(m,5H),6.53-6.42(m,1H),5.42-5.33(m,1H),5.14(s,2H),4.48-4.41(m,1H),4.32-4.20(m,1H),1.49(s,9H),1.42(d,3H,J=6.8Hz),1.38(d,3H,J=7.2Hz)。
步驟2：化合物2a(6.7g，19.12mmol)溶於甲醇(60.7mL)及水(3.03mL)中。溶液用氬氣淨化五分鐘。緩慢添加鈀/碳(濕，10%)(1.017g，0.956mmol)。反應在氫氣氛圍下攪拌隔夜。溶液經矽藻土過濾，用甲醇清洗且濃縮。其與甲醇及乙腈共沸且所得油狀物直接置於高真空下，得到 化合物2b(4.02g，97%產率)，其直接用於下一步。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.78-7.63(m,1H),4.49-4.42(m,1H),3.55-3.50(m,1H),1.73(s,2H),1.48(s,9H),1.39(d,3H,J=7.2Hz),1.36(d,3H,J=6.8Hz)。
步驟3：化合物2b(4.02g，18.59mmol)及己二酸單甲酯(3.03mL，20.45mmol)溶於無水DMF(62.0mL)中。添加EDC．HCl(3.92g,20.45mmol)、HOBt(2.85g，18.59mmol)及DIPEA(6.49mL，37.2mmol)。混合物在室溫下攪拌隔夜。反應用二氯甲烷/甲醇(150mL，5：1)稀釋且用飽和氯化銨、飽和碳酸氫鈉及鹽水洗滌。其經硫酸鈉乾燥，過濾且洗提。化合物與乙腈共沸(5次)，接著在35℃下真空抽吸，得到化合物2c(6.66g，100%產率)。粗物質未經純化即用於下一步。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 6.75(d,1H,J=6.8Hz),6.44(d,1H,J=6.8Hz),4.52-4.44(m,1H),4.43-4.36(m,1H),3.65(s,3H),2.35-2.29(m,2H),2.25-2.18(m,2H),1.71-1.60(m,4H),1.45(s,9H),1.36(t,6H,J=6.0Hz)。
步驟4：在室溫下將化合物2c(5.91g，16.5mmol)在TFA(28.6mL，372mmol)及去離子化水(1.5mL)中攪拌3小時。反應混合物用乙腈濃縮且置於高真空下，得到呈黏性固體狀之粗化合物2d(5.88g，100%產率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.21(d,1H,J=6.8Hz),6.81(d,1H,J=7.6Hz),4.69-4.60(m,1H),4.59-4.51(m,1H),3.69(s,3H),2.40-2.33(m,2H),2.31-2.24(m,2H),1.72-1.63(m,4H),1.51-1.45(m,3H),1.42-1.37(m,3H)。
步驟5：化合物2d(5.6g，18.52mmol)溶於無水二氯甲烷(118mL)及無水甲醇(58.8mL)中。添加(5-胺基-1,3-伸苯基)二甲醇(2.70g，17.64 mmol)及EEDQ(8.72g，35.3mmol)且反應在室溫下攪拌隔夜。溶劑洗提且添加乙酸乙酯。所得漿狀物過濾，用乙酸乙酯洗滌且在真空/N2下乾燥，得到化合物2e(2.79g，36%產率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 9.82(s,1H),8.05,(d,1H,J=9.2Hz),8.01(d,1H,J=7.2Hz),7.46(s,2H),6.95(3,1H),5.21-5.12(m,2H),4.47-4.42(m,4H),4.40-4.33(m,1H),4.33-4.24(m,1H),3.58(s,3H),2.33-2.26(m,2H),2.16-2.09(m,2H),1.54-1.46(m,4H),1.30(d,3H,J=7.2Hz),1.22(d,3H,J=4.4Hz)。
步驟6：化合物2e(0.52g，1.189mmol)及四溴化碳(1.183g，3.57mmol)溶於無水DMF(11.89mL)中。添加三苯基膦(0.935g，3.57mmol)且反應在氬氣下攪拌4小時。反應混合物用DCM/MeOH(10：1)稀釋且用水及鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，且濃縮。粗物質藉由矽膠層析法(DCM/MeOH)純化，得到化合物2f(262mg，39%產率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 10.01(s,1H),8.11(d,1H,J=6.8Hz),8.03(d,1H,J=6.8Hz),7.67(s,2H),7.21(s,1H),4.70-4.64(m,4H),4.40-4.32(m,1H),4.31-4.23(m,1H),3.58(s,3H),2.34-2.26(m,2H),2.18-2.10(m,2H),1.55-1.45(m,4H),1.31(d,3H,J=7.2Hz),1.21(d,3H,J=7.2Hz)。
步驟7：二溴化物化合物2f及IGN單體化合物A溶於DMF中。添加碳酸鉀且在室溫下攪拌隔夜。水添加至反應混合物以使產物沈澱。在室溫下攪拌漿狀物且接著過濾且在真空/N2下乾燥。粗物質藉由矽膠層析法(二氯甲烷/甲醇)純化，得到化合物2g(336mg，74%產率)。LCMS=5.91min(15分鐘方法)。MS(m/z)：990.6(M+1)+。
步驟8：二亞胺化合物2g溶於1,2-二氯乙烷中。NaBH(OAc)3(STAB)添加至反應混合物且在室溫下攪拌1小時。反應物用CH2Cl2稀釋且用飽和NH4Cl溶液淬滅。分離各層且用鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥且濃縮。粗物質經由RPHPLC(C18管柱，乙腈/水)純化，得到化合物2h(85.5mg，25%產率)。LCMS=6.64min(15分鐘方法)。MS(m/z)：992.6(M+1)+。
步驟9：化合物2h溶於1,2-二氯乙烷中。三甲基錫醇添加至反應混合物且在80℃下加熱隔夜。反應混合物接著冷卻至室溫且用水稀釋。水層用1M HCl酸化至約pH 4。混合物用CH2Cl2/MeOH萃取。合併之有機層用鹽水洗滌，經Na2SO4乾燥，且濃縮。粗物質通過二氧化矽塞，得到化合物2i(48.8mg，80%產率)。LCMS=5.89min(15分鐘方法)。MS(m/z)：978.6(M+1)+。
步驟10：在室溫下EDC．HCl添加至攪拌之酸化合物2i及N-羥基丁二醯亞胺於CH2Cl2中之溶液中。將反應混合物攪拌2小時。反應混合物用CH2Cl2稀釋且用水及鹽水洗滌。有機層經Na2SO4乾燥，過濾，且濃縮。粗物質經由RPHPLC(C18管柱，乙腈/水)純化，得到6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((R)-8-甲氧基-6-側氧基-12a,13-二氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-6-側氧基己酸2,5-二側氧 基吡咯啶-1-基酯，化合物2j(8.2mg，30%產率)。LCMS=6.64min(15分鐘方法)。MS(m/z)：1075.4(M+1)+。
實例3
結合：先前方案
在結合前AbX一種人類抗GCC抗體5F9(具有SEQ ID NO：19之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：20之輕鏈胺基酸序列)經緩衝液更換成15mM HEPES pH 8.5。接著使用化合物(IIe)之磺化形式，製備AbX-(Ie)結合物。化合物(Ie)初始經由化合物(IIe)與5倍莫耳過量之亞硫酸氫鈉及50mM丁二酸鹽(pH 5.0)在90/10有機：水溶液中在周圍溫度下培育3小時，接著在4℃下培育隔夜而磺化。接著使用2.0mg/mL AbX抗體，在15mM HEPES pH 8.5中進行結合反應，且基於抗體之指定莫耳過量，添加化合物(Ie)(代表性結合參見表1)。結合反應具有15mM HEPES pH 8.5及DMA最終90/10水性：有機組成，且在水浴中在25℃下培育4小時，接著純化至調配緩衝液(10mM組胺酸、50mM氯化鈉、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20、50μM亞硫酸氫鈉，pH 6.2)。
結合：最佳化方案
研究各種參數，包括等張強度、傳導性、pH值、反應濃度及化合物(Ie)之莫耳當量，以最佳化所需AbX-(Ie)結合物之產率。自此等研究顯露出利用75mM EPPS pH 8.0緩衝液之最佳化方案。類似於標準平台方案，AbX-(Ie)結合物使用化合物(Ie)，化合物(IIe)之磺化形式(如先前部分中所述製備)製備。使用2.0mg/mL AbX抗體，在75mM EPPS pH 8.0中進行最佳化結合反應，且基於抗體之指定莫耳過量，添加化合物(Ie)(代表性結合參見表2)。結合反應具有75mM EPPS pH 8.0及DMA最終90/10水性：有機組成，且在水浴中在25℃下培育4小時，接著純化至調配緩衝液(10mM組胺酸、50mM氯化鈉、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20、50μM亞硫酸氫鈉， pH 6.2)。
如表2中所示，與使用具有較低離子強度之pH 8.5緩衝液之先前方案相比，在涉及使用具有較高離子強度之pH 8.0緩衝液的方案下，結合產率自24%增加至64%，增加約2倍。
純化
使用經20mM組胺酸、50mM氯化鈉、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20及50μM亞硫酸氫鈉pH 6.2平衡之Sephadex G-25 NAP管柱，純化AbX-(Ie)結合反應混合物。使用0.22μm PVDF針筒式濾器過濾經純化之結合物，且在4℃下針對新鮮調配緩衝液透析隔夜，接著在周圍溫度下使用新鮮調配緩衝液透析4小時。在分析前結合物使用0.22μm PVDF針筒式濾器再次過濾。
分析法：
藉由UV/Vis，使用在280nm及330nm下之吸光度值，測定經純化之結合物樣品中抗體及細胞毒性劑(D)之濃度。因為抗體與細胞毒性劑在280nm下吸收，所以需要二項式方程來考慮總信號中歸屬於每個部分之部分。僅僅細胞毒性劑吲哚啉并苯并二氮呯(IGN)在330nm下吸收，因此在該波長下濃度可歸屬於該細胞毒性劑。結合部分之消光係數值列於表3中。
使用以下代數表達式，定量抗體及細胞毒性劑分量，以下代數表達式說明在每個波長下每種成分之貢獻：CD=A330/ε330nm IGN
CAb=(A280-(ε280nm IGN/ε330nm IGN)x A330)/ε280nm Ab
Ax為X nm波長下之吸光度值，而CAb為抗體(亦即AbX)之莫耳濃度且CD為細胞毒性劑之莫耳濃度。細胞毒性劑：Ab之比率(DAR)計算為以上莫耳 濃度之比率。AbX與細胞毒性劑之mg/mL(g/L)濃度使用表3中所列之分子量計算。
確定單體結合物之百分比
經純化之AbX-細胞毒性劑樣品中單體結合物之百分比經由HPLC分析，使用尺寸排阻層析法(SEC)測定。將大約10-100μg AbX-細胞毒性劑結合物注射至附接有SEC管柱(TSK GEL G3000SWxl 5μm，7.8mm×30cm，部件號08541；推薦保護管柱TSK GEL，4cm，部件號08543，TOSOH Biosciences,King of Prussia,PA)之HPLC儀器上，且在每分鐘0.5mL下在400mM過氯酸鈉、50mM磷酸鈉、5%異丙醇之等度移動相下進行。收集280nm及330nm波長下之吸光度信號，歷時30分鐘。
AbX抗體單體通常在約17min下溶離，而AbX-細胞毒性劑結合物單體經常呈雙重峰在約17及約19min下溶離。高分子量物質(HMW，例如二聚體、聚集物)及低分子量物質(LMW，例如片段)通常分別在約12及約24min下溶離。
由17min峰(或17/19雙重峰)之280nm峰面積計算單體抗體(或結合物)%，且與所有組合之蛋白質峰之面積相比。
單體峰上之DAR亦藉由將280nm及330nm信號之峰面積代入以上部分中所示之CD及CAb方程式中A280及A330空間且接著除以CD/CAb來確定。
確定未結合細胞毒性劑之百分比
經純化之結合物樣品中存在之未結合細胞毒性劑(「游離藥物」)的量經由UPLC分析，使用串聯SEC及C-18逆相管柱(「雙管柱」)確定。兩個Waters Acquity UPLC Protein BEH SEC管柱(1.7μm，4.6×30 mm，部件號186005793，Waters Corporation,Milford,MA)串聯連接，將完整結合物與游離藥物分離，接著通過Waters Cortecs UPLC C-18管柱(2.1×50mm，部件號186007093)，以分離且定量游離CDA物質。藉由用乙腈(ACN)稀釋至20%(v/v)ACN，注射至管柱系列(25μL)，且根據表4中所列之梯度運作，來製備結合物：
表7：流速=0.35ml/mm；運作時間=12.5分鐘；C-18管柱溫度=30℃；移動相=A：含0.1%(v/v)TFA之水，B：含0.1%(v/v)TFA之ACN
管柱在2.2min自串聯SEC轉成C-18且在14.0分鐘回至串聯SEC。收集265nm下信號。使用來源於化合物(Ie)之標準曲線，樣品中存在之游離藥物的量由2.2-14.0分鐘窗中發現之峰，使用下式計算：ng游離=(AUC265nm+11805)/4888
%游離CDA=ng游離/ng注射
實例4.
人類化抗體Ab1及鼠科抗體、鼠科My9-6與化合物(Ie)之結合物根據實施例3中描述之方案製備。結果展示於表5中。
如表5中所示，使用pH 8之高離子強度緩衝液的結合使得與使用低離子強度之pH 8.5緩衝液的結合相比，反應產率顯著增加。
<---------->
實例5
利用75mM EPPS pH 8.0緩衝液之實例3中描述之方案用於製備5F9-PVAdG-(Ie)結合物。5F9-PVAdG抗體含有替換IgG1重鏈(SEQ ID NO：9)中之ELLG的胺基酸取代，其對於Fc RIIIb與PVA結合為重要的；IgG2中相似位置之胺基酸高度保守(Vidarsson等人，IgG subclasses and allotypes：from structure to effector functions,Frontiers in Immunology,5(520)：1-17(2014))。
使用2.0mg/mL 5F9 PVAdG抗體，在75mM EPPS pH 8.0中，且在基於抗體之指定莫耳過量，添加化合物(IIe)之磺化形式下進行結合反應(代表性結合參見表6)。結合反應具有75mM EPPS pH 8.0及DMA最終90/10水性：有機組成，且在水浴中在25℃下培育4小時，接著純化至調配緩衝液(10mM組胺酸、50mM氯化鈉、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20、50μM亞硫酸氫鈉pH 6.2)。
使用經10mM組胺酸、50mM氯化鈉、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20、50μM亞硫酸氫鈉pH 6.2平衡之Sephadex G-25 HiPrep管柱，純化5F9-PVAdG-(Ie)結合反應混合物。在分析前結合物使用0.22μm PVDF針筒式濾器過濾經純化之結合物。
實例6
最佳化磺化
化合物(IIe)如下磺化以產生化合物(Ie)。向3.75mL 50mM丁二酸鈉pH 3.3溶液中添加6.11mL之量的DMA。在混合及水浴中平衡至10℃後，添加及混合1.39mL含21.5mM化合物(IIe)儲備溶液之DMA(30.0μmol化合物(IIe))。在此添加後，將3.75mL 20mM亞硫酸氫鈉水溶液(2.5當量，75μmol)引入反應中。混合後，使反應在10℃下進行15.5小時且未經純化即用於下一步中。反應混合物之液相層析(逆相)分析表明92.4%轉變成化合物(Ie)，未反應化合物(IIe)剩餘2.4%。
結合後淬滅
為確定其中結合後離子強度之增加引起高分子量(HMW)物質形成減少的條件，進行以下最佳化。在22℃下5F9抗體(2mg/mL)結合於3.8莫耳當量之化合物(Ie)，歷時80-90分鐘。結合反應之最終組成由130mM EPPS pH 8.7與15體積% DMA組成。結合反應一結束，如表7中所詳述，用指示量之淬滅溶液稀釋等分試樣。在22℃下保持時，監測HMW物質百分比之變化所指示時間。基於此發現，選擇使用300、500或700mM EPPS淬滅溶液進行2倍稀釋，使用750mM EPPS進行1.4-1.6倍稀釋，且使用750mM EPPS/150mM鹽酸組胺酸進行1.4-1.6倍稀釋。在以下結合實例中，使用750mM EPPS/150mM鹽酸組胺酸進行1.5倍稀釋。表7描繪淬滅溶液對粗5F9-(Ie)結合物之穩定性的作用。將粗5F9-(Ie)結合物與不同淬滅溶液一起培育規定時間量，且藉由尺寸排阻層析測定分子量物質百分比之變化。
% HMW來計算。
最佳化結合及純化
在1L裝備頂置式攪拌器之含有325mL 130mM EPPS pH 8.7的夾套式玻璃反應器中添加68.6mL DMA。在混合及溶液平衡至22℃後，將100mL含10.0mg/mL 5F9抗體之130mM EPPS pH 8.7引入反應器中且混合15分鐘。隨後，將12.8mL 2mM化合物(Ie)溶液(25.5μmol，3.7當量5F9抗體；使用先前描述之最佳化磺化方案製備)引入反應溶液中。在22℃下攪拌60分鐘後，將含有150mM鹽酸組胺酸及750mM EPPS之250mL水溶液轉移至反應容器中。在澈底混合之後，此物質經由Millipore Optiscale 47 Express SHC 0.5/0.2μM過濾器過濾。接著藉由用TangenX 0.02m2 HyStream 30kD Sius LSN TFF盒超濾至所計算之2.5mg/mL的散裝蛋白質濃度，濃縮粗反應混合物。在濃縮步驟後，溶液針對4.8L 50mM組胺酸、6.7w/v(重量/體積)%蔗糖、0.1v/v(體積/體積)%聚山梨酸酯-80、50μM亞硫酸氫鈉pH 5.5緩衝液滲濾。滲濾後，將聚山梨酸酯-80添加至保留物溶液，最終濃度為0.1v/v(體積/體積)%聚山梨酸酯-80且所得溶液用Millipore Optiscale 47 Express SHC 0.5/0.2μM過濾器過濾。在2-8℃下儲存2天後，溶液藉由添加必需體積之額外50mM組胺酸、6.7w/v%蔗糖、0.1v/v%聚山梨酸酯-80、50μM亞硫酸氫鈉pH 5.5緩衝液而稀釋至1.0mg/mL結合物。接著此溶液經由Millipore Optiscale 47 Durapore 0.22μM過濾器過濾，得到818mL 1.0mg/mL結合物。藉由UV/vis，測得最終結合物之DAR為2.6，且藉由SEC，為97.4%單體及2.5% HMW。產物最後產率為82%。
分析：
藉由UV/Vis，使用在280nm及330nm下之吸光度值，測定經純化之結合物樣品中抗體及細胞毒性劑(Ie)之濃度。因為抗體與細胞毒性劑在280nm下吸收，所以需要二項式方程來考慮總信號中歸屬於每個部分之部分。僅僅細胞毒性劑吲哚啉并苯并二氮呯(IGN)在330nm下吸收，因此在該波長下濃度可僅僅歸屬於細胞毒性劑。用於此實例之結合部分在280及330nm下之消光係數值分別為34150及16270M-1cm-1。
使用以下代數表達式，定量抗體及細胞毒性劑分量，以下代 數表達式說明在每個波長下每種成分之貢獻：CD=A330/ε330nm IGN
CAb=(A280-(ε280nm IGN/ε330nm IGN)X A330)/ε280nm Ab
Ax為X nm波長下之吸光度值，而CAb為抗體(亦即AbX)之莫耳濃度且CD為細胞毒性劑之莫耳濃度。細胞毒性劑：Ab(DAR)之比率計算為以上莫耳濃度之比率。使用144887g/mol之分子量計算AbX之mg/mL(g/L)濃度。
<110> 免疫原公司
<120> 用於製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之有效方法
<130> 128037-03120
<150> 62/292018
<151> 2016-02-05
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗體重鏈CDR1
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
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<213> 人工
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<223> 抗GCC抗體重鏈
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<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> X
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<223> β-Ala
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<220>
<223> FOLR1抗體重鏈可變域
<400> 24

Claims (119)

  1. 一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之方法，其包括以下步驟：使細胞結合劑與具有能夠與該細胞結合劑形成共價鍵之反應基團的細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在4至9之間的pH值下在具有高離子強度之緩衝溶液存在下反應，其中該細胞結合劑包含與具有胺反應基團之該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物形成共價鍵的離胺酸ε-NH2基團。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該pH值在7.3與8.7之間。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該pH值在7.3與8.4之間。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該pH值在7.6與8.4之間。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該pH值在7.7與8.3之間。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該pH值在7.8與8.2之間。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該pH值在7.9與8.1之間。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法.其中該pH值為8.0。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該pH值在8.5至8.9之間。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該pH值在8.6至8.8之間。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該pH值為8.7。
  12. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之方法，其中該緩衝溶液之離子強度為20mM至500mM。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該緩衝溶液之離子強度為50mM至100mM。
  14. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該緩衝溶液之離子強度為60mM至90mM。
  15. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該緩衝溶液之離子強度為70mM至80mM。
  16. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該緩衝溶液之離子強度為75mM。
  17. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該緩衝溶液之離子強度為100nM至200mM。
  18. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該緩衝溶液之離子強度為100nM 至160nM。
  19. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該緩衝溶液之離子強度為120nM至140nM。
  20. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該緩衝溶液之離子強度為130nM。
  21. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝溶液具有7.8至8.9之間的pH值及50mM與200mM之間的離子強度。
  22. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液具有7.8至8.2之間的pH值及70mM與80mM之間的離子強度。
  23. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液具有8.0之pH值及75mM之離子強度。
  24. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液具有8.5至8.9之間的pH值及120mM與140mM之間的離子強度。
  25. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝液具有8.7之pH值及130mM之離子強度。
  26. 如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之方法，其中該緩衝液選自由以下組成之群：MES((2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸))緩衝液、雙-三甲烷(2-[雙(2-羥乙基)胺基]-2-(羥甲基)丙-1,3-二醇)緩衝液、ADA(N-(2-乙醯胺基)亞胺基二乙酸)緩衝液、ACES(N-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、PIPES(哌嗪-N,N'-雙(2-乙烷磺酸))、MOPSO(β-羥基-4-嗎啉丙烷磺酸)緩衝液、雙-三丙烷(1,3-雙(三(羥甲基)甲基胺基)丙烷)緩衝液、BES(N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙烷磺酸)、TES(N-[三(羥甲基)甲基]-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、HEPES(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸)緩衝液、DIPSO(3-(N,N-雙[2-羥乙基]胺基)-2-羥基丙烷磺酸或N,N-雙(2-羥乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸)、MOBS(4-(N-嗎啉基)丁烷磺酸)緩衝液、TAPSO(3-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]-2-羥基丙烷-1-磺酸)緩衝液、trizma(Tris或2-胺基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇)緩衝液、HEPPSO(N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(2-羥基丙烷磺酸))緩衝液、POPSO(哌嗪-1,4-雙-(2-羥基-丙烷-磺酸)脫水物)緩衝液、EPPS(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸)緩衝液、tricine(N-(2-羥基-1,1-雙(羥甲基)乙基)甘胺酸)緩衝液、gly-gly、 bicine(2-(雙(2-羥乙基)胺基)乙酸)緩衝液、HEPBS(N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(4-丁烷磺酸))緩衝液、TAPS(3-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]丙烷-1-磺酸)緩衝液、AMPD(2-胺基-2-甲基-1,3-丙二醇)緩衝液、TABS(N-三(羥甲基)甲基-4-胺基丁烷磺酸)緩衝液、AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羥乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸)緩衝液及其組合。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該緩衝溶液為EPPS緩衝液。
  28. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝溶液為具有7.8與8.9之間的pH值之50mM至200mM EPPS緩衝液。
  29. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝溶液為具有7.8與8.2之間的pH值之70mM至80mM EPPS緩衝液。
  30. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝溶液為具有8.0之pH值的75mM EPPS緩衝液。
  31. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝溶液為具有8.5與8.9之間的pH值之120mM至140mM EPPS緩衝液。
  32. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該緩衝溶液為具有8.7之pH值的130mM EPPS緩衝液。
  33. 一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之方法，其包括以下步驟：使細胞結合劑與細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在具有7.3至9.0之pH值之緩衝溶液中反應，其中該細胞結合劑包含與具有胺反應基團之該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物形成共價鍵的離胺酸ε-NH2基團。
  34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該緩衝溶液之該pH值在7.3與8.4之間。
  35. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該pH值在7.6與8.4之間。
  36. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該pH值在7.7與8.3之間。
  37. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該pH值在7.8與8.2之間。
  38. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該pH值在7.9與8.1之間。
  39. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該pH值為8.0。
  40. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該pH值在8.5與8.9之間。
  41. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該pH值在8.6與8.8之間。
  42. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該pH值為8.7。
  43. 一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之方法，其包括以下步驟：使細胞結合劑與具有能夠與該細胞結合劑形成共價鍵之反應基團的細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在4至9之間的pH值下在高濃度緩衝溶液存在下反應，其中該細胞結合劑包含與具有胺反應基團之該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物形成共價鍵之離胺酸ε-NH2基團。
  44. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該緩衝溶液之濃度在20mM與750mM之間、20mM與500mM之間、20mM與200mM之間、25mM與150mM之間、50mM與150mM之間、50mM與100mM之間、100mM與200mM之間或100mM與150mM之間。
  45. 如申請專利範圍第43項或第44項之方法，其中該pH值在7.3與8.9之間、7.3與8.4之間、7.6與8.4之間、7.7與8.3之間、7.8與8.2之間、8.5與8.9之間或8.6與8.8之間。
  46. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該緩衝溶液具有20mM與200mM之間的濃度及7.1與8.5之間的pH值。
  47. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該緩衝溶液具有50mM與150mM之間的濃度及7.6與8.4之間的pH值。
  48. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該緩衝溶液具有50mM與100mM之間的濃度及7.7與8.3之間的pH值。
  49. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該緩衝溶液具有60mM與90mM之間的濃度及7.8與8.2之間的pH值。
  50. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該緩衝溶液具有70mM與80mM之間的濃度及7.9與8.1之間的pH值。
  51. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該緩衝溶液具有50mM與200mM之間的濃度及7.8與8.9之間的pH值。
  52. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該緩衝溶液具有110mM與150mM之間的濃度及8.5與8.9之間的pH值。
  53. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該緩衝溶液具有120mM與140mM之間的濃度及8.6與8.8之間的pH值。
  54. 如申請專利範圍第33項至第53項中任一項之方法，其中該緩衝溶液選自由以下組成之群：MES((2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸))緩衝液、雙-三甲烷(2-[雙(2-羥乙基)胺基]-2-(羥甲基)丙-1,3-二醇)緩衝液、ADA(N-(2-乙醯胺基)亞胺基二乙酸)緩衝液、ACES(N-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、PIPES(哌嗪-N,N'-雙(2-乙烷磺酸))、MOPSO(β-羥基-4-嗎啉丙烷磺酸)緩衝液、雙-三丙烷(1,3-雙(三(羥甲基)甲基胺基)丙烷)緩衝液、BES(N,N-雙(2-羥乙基)-2-胺基乙烷磺酸)、TES(N-[三(羥甲基)甲基]-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、HEPES(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸)緩衝液、DIPSO(3-(N,N-雙[2-羥乙基]胺基)-2-羥基丙烷磺酸或N,N-雙(2-羥乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸)、MOBS(4-(N-嗎啉基)丁烷磺酸)緩衝液、TAPSO(3-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]-2-羥基丙烷-1-磺酸)緩衝液、trizma(Tris或2-胺基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇)緩衝液、HEPPSO(N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(2-羥基丙烷磺酸))緩衝液、POPSO(哌嗪-1,4-雙-(2-羥基-丙烷-磺酸)脫水物)緩衝液、EPPS(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-丙烷磺酸)緩衝液、tricine(N-(2-羥基-1,1-雙(羥甲基)乙基)甘胺酸)緩衝液、gly-gly、bicine(2-(雙(2-羥乙基)胺基)乙酸)緩衝液、HEPBS(N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(4-丁烷磺酸))緩衝液、TAPS(3-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]丙烷-1-磺酸)緩衝液、AMPD(2-胺基-2-甲基-1,3-丙二醇)緩衝液、TABS(N-三(羥甲基)甲基-4-胺基丁烷磺酸)緩衝液、AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羥乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸)緩衝液及其組合。
  55. 如申請專利範圍第54項之方法，其中該緩衝溶液為EPPS緩衝液。
  56. 如申請專利範圍第54項之方法，其中該緩衝溶液為75mM EPPS緩衝液。
  57. 如申請專利範圍第54項之方法，其中該緩衝溶液為130mM EPPS緩衝液。
  58. 如申請專利範圍第1項至第57項中任一項之方法，其進一步包含在該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物與該細胞結合劑反應之後混合具有高離子強度之淬滅溶液之步驟。
  59. 如申請專利範圍第58項之方法，其中該淬滅溶液具有200mM與3000mM之間、200mM與2000mM之間、200mM與1000mM之間、500 mM與1000mM之間、550mM與1000mM之間或600mM與1000mM之間的離子強度。
  60. 如申請專利範圍第58項之方法，其中該淬滅溶液具有700mM與1000mM之間的離子強度。
  61. 如申請專利範圍第58項至第60項中任一項之方法，其中該淬滅溶液包含EPPS。
  62. 如申請專利範圍第58項至第60項中任一項之方法，其中該淬滅溶液包含EPPS及鹽酸組胺酸。
  63. 如申請專利範圍第1項至第57項中任一項之方法，其進一步包含在該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物與該細胞結合劑反應之後混合包含高濃度緩衝液之淬滅溶液之步驟。
  64. 如申請專利範圍第63項之方法，其中該淬滅溶液中該緩衝液之濃度在200mM與3000mM之間、200nM與2000mM之間、200mM與1000mM之間、500mM與1000mM之間、550mM與1000mM之間或600mM與1000mM之間。
  65. 如申請專利範圍第63項或第64項之方法，其中在該混合之後，該緩衝液之最終濃度在150mM與750mM之間、150mM與600mM之間、200mM與500mM之間、200mM與400nM之間或250mM與350mM之間。
  66. 如申請專利範圍第58項至第65項中任一項之方法，其中該淬滅溶液具有5至9之間的pH值。
  67. 如申請專利範圍第66項之方法，其中該淬滅溶液具有5至7之間的pH值。
  68. 如申請專利範圍第66項之方法，其中該淬滅溶液具有5至6之間的pH值。
  69. 如申請專利範圍第66項之方法，其中該淬滅溶液具有5.5之pH值。
  70. 如申請專利範圍第69項之方法，其中該淬滅溶液包含750mM EPPS及150mM鹽酸組胺酸。
  71. 如申請專利範圍第58項至第70項中任一項之方法，其中該淬滅緩衝液之添加減少高分子量物質之量。
  72. 如申請專利範圍第1項至第71項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：L由以下各式表示：-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)E (A1)；或-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-zsl (A3)；其中：R5為-H或(C1-C3)烷基；P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽；Ra及Rb每次出現時各獨立地為-H、(C1-C3)烷基或帶電取代基或可電離基團Q；m為整數1至6；且zsl選自以下各式中之任一者： 其中：q為整數1至5；M為-H或陽離子；且-C(=O)E表示反應性酯基。
  73. 如申請專利範圍第72項之方法，其中Ra及Rb均為H；且R5為H或Me。
  74. 如申請專利範圍第72項或第73項之方法，其中P為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  75. 如申請專利範圍第74項之方法，其中P為可藉由蛋白酶裂解之肽。
  76. 如申請專利範圍第75項之方法，其中P為可藉由腫瘤組織中表現之蛋白酶裂解之肽。
  77. 如申請專利範圍第72項至第74項中任一項之方法，其中P選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、 Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：21)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：22)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：23)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met及Met-Ala。
  78. 如申請專利範圍第77項之方法，其中P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
  79. 如申請專利範圍第72項至第78項中任一項之方法，其中Q為-SO3M。
  80. 如申請專利範圍第72項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由以下各式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  81. 如申請專利範圍第72項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  82. 如申請專利範圍第72項至第81項中任一項之方法，其中該反應性酯基選自N-羥基丁二醯亞胺酯、N-羥基磺基丁二醯亞胺酯、硝基苯基(例如2或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如2,4-二硝基苯基)酯、磺基四氟苯基(例如4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯及五氟苯基酯。
  83. 如申請專利範圍第82項之方法，其中該反應性酯基由下式表示： 其中U為H或-SO3M。
  84. 如申請專利範圍第82項之方法，其中該反應性酯基由下式表示：
  85. 如申請專利範圍第72項之方法，其中該細胞毒性劑由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  86. 如申請專利範圍第72項之方法，其中該細胞毒性劑由以下結構式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  87. 如申請專利範圍第72項至第79項及第82項至第84項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由藉由結構式(II)之化合物與磺化試劑反應所製備之結構式(I)表示。
  88. 如申請專利範圍第80項及第82項至第84項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物藉由使由以下結構式之一表示之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，與磺化試劑反應來製備。
  89. 如申請專利範圍第85項之方法，其中該細胞毒性劑藉由使由以下結構式之一表示之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，與磺化試劑反應來製備。
  90. 如申請專利範圍第72項至第79項及第82項至第84項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由結構式(II)表示，且其中該方法進一步包括使該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物與磺化試劑反應。
  91. 如申請專利範圍第72項至第79項及第82項至第84項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由結構式(II)表示，且其中該方法包括使該細胞結合劑與由結構式(II)表示之該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物在磺化試劑存在下反應。
  92. 如申請專利範圍第81項至第84項及第86項中任一項之方法，其中該方法進一步包括使該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物與磺化試劑反應。
  93. 如申請專利範圍第81項至第84項及第86項中任一項之方法，其中該方法包括使該細胞結合劑與該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物在磺化試劑存在下反應。
  94. 如申請專利範圍第1項至第71項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Rx1及Rx2獨立地為(C1-C6)烷基；Re1為-H或(C1-C6)烷基；Re2為-(CH2-CH2-O)n-Rk；n為整數2至6；Rk為-H或-Me；Zsl選自以下各式中之任一者： 其中：q為整數1至5；M為-H或陽離子；且-C(=O)E表示反應性酯基。
  95. 如申請專利範圍第94項之方法，其中Re1為H或Me；Rx1及Rx2獨立地為-(CH2)p-(CRfRg)-，其中Rf及Rg各獨立地為-H或(C1-C4)烷基；且p為0、1、2或3。
  96. 如申請專利範圍第95項之方法，其中Rf與Rg相同或不同，且選自-H及-Me。
  97. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  98. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  99. 如申請專利範圍第94項至第98項中任一項之方法，其中該反應性酯基選自N-羥基丁二醯亞胺酯、N-羥基磺基丁二醯亞胺酯、硝基苯基(例如2或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如2,4-二硝基苯基)酯、磺基四氟苯基(例如4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯及五氟苯基酯。
  100. 如申請專利範圍第99項之方法，其中該反應性酯基由下式表示： 其中U為H或-SO3M。
  101. 如申請專利範圍第100項之方法，其中該反應性酯基由下式表示：
  102. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  103. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由以下結構式之一表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  104. 如申請專利範圍第94項至第96項及第99項至第101項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由藉由結構式(IV)之化合物與磺化試劑反應所製備的結構式(III)表示。
  105. 如申請專利範圍第94項至第96項及第99項至第101項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由藉由結構式(VI)之化合物與磺化試劑反應所製備的結構式(V)表示。
  106. 如申請專利範圍第97項及第99項至第101項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物藉由使由以下結構式之一表示之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，與磺化試劑反應來製備。
  107. 如申請專利範圍第97項及第99項至第101項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑-連接子化合物藉由使由以下結構式之一表示之細胞毒性劑： 或其醫藥學上可接受之鹽，與由以下結構式之一表示之連接子化合物反應來製備：
  108. 如申請專利範圍第102項之方法，其中該細胞毒性劑-連接子化合物藉由使具有以下結構式之一之化合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，與磺化試劑反應來製備。
  109. 如申請專利範圍第102項之方法，其中該細胞毒性劑-連接子化合物藉由使由以下結構式表示之細胞毒性劑： 或其醫藥學上可接受之鹽，與以下結構式之連接子化合物反應來製備：
  110. 如申請專利範圍第94項至第96項及第99項至第101項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑或該細胞毒性劑-連接子化合物由結構式(IV)或(VI)表示，且其中該方法進一步包括使該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物與磺化試劑反應。
  111. 如申請專利範圍第94項至第96項及第99項至第101項中任一項之方法，其中該細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物由結構式(IV)或(VI)表示，且其中該方法包括使由結構式(IV)或(VI)表示之該化合物在磺化試劑存在下反應。
  112. 如申請專利範圍第98項至第101項及第103項中任一項之方法，其中該方法進一步包括使該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物與磺化試劑反應。
  113. 如申請專利範圍第98項至第101項及第103項中任一項之方法，其中該方法包括使該細胞結合劑與該細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接子化合物在磺化試劑存在下反應。
  114. 如申請專利範圍第87項至第93項及第104項至第113項中任一項之 方法，其中該磺化試劑為NaHSO3。
  115. 如申請專利範圍第72項至第113項中任一項之方法，其中M為-H、Na+或K+。
  116. 如申請專利範圍第115項之方法，其中M為Na+。
  117. 如申請專利範圍第1項至第116項中任一項之方法，其中該細胞結合劑為抗體。
  118. 如申請專利範圍第117項之方法，其中該抗體為單株抗體。
  119. 如申請專利範圍第118項之方法，其中該抗體為人類化單株抗體。
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RU (1) RU2018130108A (zh)
SG (1) SG11201806478PA (zh)
TW (1) TW201731532A (zh)
WO (1) WO2017136623A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112543770A (zh) * 2018-06-26 2021-03-23 伊缪诺金公司 靶向adam9的免疫缀合物及其使用方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201703599VA (en) * 2014-11-19 2017-06-29 Immunogen Inc Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
AU2017345454A1 (en) 2016-10-19 2019-05-30 Invenra Inc. Antibody constructs
MX2019007019A (es) 2016-12-22 2019-08-16 Univ Degli Studi Magna Graecia Catanzaro Anticuerpo monoclonal dirigido a un epitope de cd43 sialoglicosilado especifico asociado al cancer.
CN113227127A (zh) 2018-06-05 2021-08-06 伦敦大学国王学院 向胃肠系统递送酬载的btnl3/8导引构建体

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
ATE275198T1 (de) 1991-12-02 2004-09-15 Medical Res Council Herstellung von antikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken.
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
IL111748A0 (en) 1993-12-03 1995-01-24 Zeneca Ltd Proteins
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5958872A (en) 1996-04-01 1999-09-28 Apoptosis Technology, Inc. Active survival domains of IGF-IR and methods of use
WO1999006587A2 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
TW593241B (en) 1999-04-20 2004-06-21 Hoffmann La Roche Carbamic acid derivatives
CA2398136A1 (en) 2000-02-08 2001-08-16 The Penn State Research Foundation Immunotherapy using interleukin 13 receptor subunit alpha 2
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US6596503B1 (en) 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
DZ3494A1 (fr) 2001-01-05 2002-07-11 Pfizer Anticorps anti-recepteur du facteur de croissance i analogue a l'insuline
EA010570B1 (ru) 2002-11-07 2008-10-30 Иммьюноджен, Инк. Антитело к cd33 и способы его применения
AU2004259398A1 (en) 2003-06-27 2005-02-03 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
KR101200133B1 (ko) 2004-06-01 2012-11-13 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
US20060045877A1 (en) 2004-08-30 2006-03-02 Goldmakher Viktor S Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
EP1817341A2 (en) 2004-11-29 2007-08-15 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
EP1819359B1 (en) 2004-12-09 2015-03-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-integrin immunoconjugates, methods of their production and their use
AU2006220709B2 (en) 2005-03-04 2012-09-06 Biogen Ma Inc. Methods of humanizing immunoglobulin variable regions through rational modification of complementarity determining residues
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
RU2011138951A (ru) 2009-02-23 2013-03-27 Сайтомкс Терапьютикс, Инк. Пропротеины и способы их применения
AR076284A1 (es) 2009-04-29 2011-06-01 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
TW201116297A (en) 2009-10-02 2011-05-16 Sanofi Aventis Antibodies that specifically bind to the EphA2 receptor
UY32913A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Sanofi Aventis Nuevos maitansinoides y el uso de dichos maitansinoides para preparar conjugados con un anticuero
KR20220017432A (ko) 2010-02-24 2022-02-11 이뮤노젠 아이엔씨 엽산염 수용체 1 항체와 면역접합체 및 이들의 용도
LT2544719T (lt) 2010-03-12 2019-10-25 Debiopharm Int Sa Cd37 surišančios molekulės, ir jų imunokonjugatai
WO2012019024A2 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
AU2011323316B2 (en) 2010-11-03 2016-02-25 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising new ansamitocin derivatives
WO2012095347A1 (en) 2011-01-10 2012-07-19 Technische Universität München Triazacyclononane-based phosphinate ligand and its use for molecular imaging
MY183977A (en) * 2011-02-15 2021-03-17 Immunogen Inc Cytotoxic benzodiazepine derivatives
US8795673B2 (en) * 2011-03-29 2014-08-05 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
SG195172A1 (en) * 2011-06-21 2013-12-30 Immunogen Inc Novel maytansinoid derivatives with peptide linker and conjugates thereof
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112543770A (zh) * 2018-06-26 2021-03-23 伊缪诺金公司 靶向adam9的免疫缀合物及其使用方法

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Publication number Publication date
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