CN113227127A - 向胃肠系统递送酬载的btnl3/8导引构建体 - Google Patents
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Abstract
本文中描述了包含BTNL3/8导引部分、酬载和任选性接头的蛋白质构建体。展示了包含构建体的药物组合物及其使用方法。
Description
1.相关申请的交叉引用
本申请要求2018年6月5日提交的美国临时申请号62/680,932的权益，其在此通过引用方式完整地并入。
2.序列表
本申请含有已经经由EFS网提交并在此通过引用方式完整并入本文中的序列表。
2019年6月4日创建的所述ASCII副本命名为GDT-P2577PCT–sequencelisting.txt，并且大小为17,284字节。
3.背景技术
大部分药物依赖于全身暴露以在病理部位实现足够的浓度。但是，药物暴露给脱靶组织往往产生明显毒性。因此，迫切需要开发向特定组织递送药剂的方法。
T细胞的组织选择性归巢被认为是正常免疫应答一体化期间的关键要素。这类‘组织归巢性’或‘组织常驻性’T细胞的一个有意义且高度独特类别是γδT细胞。γδT细胞是高度区隔化的T细胞，其显示亚群局限至特定组织，例如，鼠Vγ5T细胞仅存在于表皮中，而鼠Vγ7T细胞为肠独有。几个鼠和人IEL区室的发育和存活取决于稳态下的上皮细胞经由尚未阐明的机制所表达的蛋白质，诸如嗜乳脂蛋白(BTN)基因和嗜乳脂蛋白样(Btnl/BTNL)基因。(Di Marco Barros等人,Cell.2016；167(1):203-218；Kabelitz等人,F1000 FacultyRev:782；June 5,2017)。
嗜乳脂蛋白和嗜乳脂蛋白样蛋白(BTN/BTNL)是一组免疫球蛋白超家族成员，它们影响免疫力，如T细胞选择，以及发育过程，如分化和细胞命运决定(Arnett和Viney,NatureReviews,2014(14)第559-569页)。已经显示BTNL蛋白(特别地，BTNL3和BTNL8)在人肠道的肠细胞中不成比例地高度表达，并且BTNL3/8可以特异性调节人Vγ4+γδT细胞(Di MarcoBarros等人,Cell.2016；167(1):203-218)。鉴于BTN蛋白和BTNL蛋白已被报道以正向或负向方式调节多个T-细胞应答，而不清楚这类信号如何传输至T细胞(Kabelitz等人,F1000Faculty Rev:782；2017年6月5日)。
需要向胃肠系统局限化递送药物以治疗疾病，如炎症性肠病。因此需要能够靶向BTNL3/8表达细胞的化合物，包括能够将治疗性酬载(payload)导引至BTNL3/8表达细胞、尤其是肠道上皮的BTNL3/8表达细胞的化合物。
4.发明概述
为了进一步探索这种引人注目的-尽管表征不足-组织/免疫区室‘成型’和进一步‘归巢’，我们尝试探索藉此实现γδT细胞组织导引和特异性的机制。首先，我们尝试从起始性人γ链和δ链序列中工程化一组重组异二聚体和同型二聚体γδT细胞受体蛋白(TCR)。为实现这个目的，我们探索了多种融合配偶体，以确保所得的重组异二聚化和同型二聚体γδ链得到表达(例如，在HEK293细胞中)、保持完好、纯化时优势地免于聚集(如通过尺寸排阻色谱所测量)。从这些实验中，我们鉴定到众多更优选的融合配偶体，包括与工程化的亮氨酸拉链组合(i)使用抗体Fc融合结构域配偶体和(ii)使用TCRα-β链恒定结构域配偶体(Xu等人,PNAS,2011Vol.108；第2414-2419页)。但是，鉴于这些成功的实验是非详尽性的，我们还欣慰本领域其他普通技术人员将有动机鉴定生成重组γδ同型二聚体、异二聚体和单体亚单位的替代性方案。
一旦创建人γδ序列衍生的T细胞受体重组蛋白的这个小组或文库，接下来我们使用它探索哪些重组γδ配对(若有)显示出任何组织特异性或选择性。因此，我们将这些蛋白质与过量表达BTNL3/8的细胞系温育。前所未有地，通过设对照的研究，我们随后鉴定到某些特异性识别BTNL3/8蛋白的重组T细胞受体(例如，重组γ4δ1TCR和重组γ4δ2TCR)，与此同时，我们鉴定到无这种识别作用的其他这类受体(例如，重组γ2δ1TCR和重组γ8δ1TCR)。这首次显示，含有γ4的γδTCR直接与细胞表面上表达的BTNL3/8相互作用。
另外，TCR深度测序显示，在有BTNL3/8响应性的级分中存在表达γ4TCR的γδT细胞的选择性富集。总体上，测序数据和重组TCR实验显示，含有γ4亚单位的TCR配对选择性地结合于BTNL3/8。
因此，在第一方面，提供一种蛋白质构建体。该蛋白质构建体包含BTNL3/8导引部分、酬载和将导引部分与酬载连接的任选性接头。
在某些实施方案中，BTNL3/8导引部分包含Vγ结构域，其中在Vγ结构域的序列位置编号87的氨基酸是天冬氨酸或组氨酸，并且在Vγ结构域的序列位置编号90的氨基酸是甘氨酸或谷氨酸，并且其中VγCDR4的剩余残基在每个位置处独立地选自人或鼠Vγ结构域的相应残基。
在某些实施方案中，Vγ结构域CDR4的剩余残基在每个残基位置处独立地选自人Vγ4、人Vγ2或小鼠Vγ7的相应残基。在一个实施方案中，在Vγ结构域的位置编号87-90处的氨基酸序列是SEQ ID NO:1。在一个实施方案中，在Vγ结构域的位置编号87-90处的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，Vγ结构域CDR4的剩余残基均选自人Vγ4、人Vγ2或小鼠Vγ7的相应残基。在一个实施方案中，Vγ结构域CDR4的剩余残基选自人Vγ4的相应残基。在一个实施方案中，Vγ结构域CDR4的剩余残基选自人Vγ2的相应残基。在一个实施方案中，Vγ结构域CDR4的剩余残基选自小鼠Vγ7的相应残基。在一个实施方案中，Vγ结构域是其中CDR4氨基酸经氨基酸序列位置编号87处用天冬氨酸或组氨酸置换并经氨基酸序列位置编号90处用甘氨酸或谷氨酸置换的人Vγ2结构域。在一个实施方案中，Vγ结构域是人Vγ4结构域。
在一个实施方案中，Vγ结构域CDR3是人或小鼠VγCDR3序列。在一个实施方案中，Vγ结构域CDR3包含人Vγ4CDR3序列。在一个实施方案中，Vγ结构域CDR3包含人Vγ2CDR3序列。在一个实施方案中，Vγ结构域CDR3包含小鼠Vγ7CDR3序列。在一个实施方案中，J区是VγJ区。在一个实施方案中，J区是小鼠VγJ区。在某些实施方案中，J区包含选自SEQ IDNOs:15-18的SEQ ID NO。
在某些实施方案中，蛋白质构建体的BTNL3/8导引部分还包含配对的Vδ结构域。在一个实施方案中，Vγ结构域和Vδ结构域由至少一个二硫键共价连接。在一个实施方案中，Vγ结构域和Vδ结构域借助特异性异二聚体相互作用配对。在一个实施方案中，异二聚体相互作用是亮氨酸拉链互补性。在一个实施方案中，导引部分包含SEQ ID NO:9。在一个实施方案中，导引部分是SEQ ID NO:10。在一个实施方案中，导引部分是SEQ ID NO:11。在一个实施方案中，导引部分包含Vγ结构域和Vδ结构域的单链符合可读框融合物。在一个实施方案中，Vγ结构域位于Vδ结构域的N末端。在一个实施方案中，Vγ结构域位于Vδ结构域的C末端。在一个实施方案中，Vγ结构域和Vδ结构域的单链符合可读框融合物包含内部接头序列。在一个实施方案中，Vδ结构域是人Vδ结构域。在一个实施方案中，人Vδ结构域是Vδ1、Vδ2或Vδ5。在一个实施方案中，人Vδ结构域是Vδ1。
在某些实施方案中，蛋白质构建体还包含第一T细胞受体恒定区，其中第一T细胞受体恒定区以符合可读框方式融合于Vγ结构域的C末端。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体恒定区。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体β恒定区。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体α恒定区。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体γ恒定区。在一个实施方案中，导引部分还包含第二T细胞受体恒定区，其中第二T细胞受体恒定区以符合可读框方式融合于配对的Vδ结构域的C末端。在一个实施方案中，第二T细胞受体恒定区是人T细胞受体α恒定区。在一个实施方案中，第二T细胞受体恒定区是人T细胞受体β恒定区。在一个实施方案中，第二T细胞受体恒定区是人T细胞受体δ恒定区。在一个实施方案中，Vδ结构域和第二T细胞受体恒定区的符合可读框融合物在Vδ结构域和第二T细胞受体恒定区之间的包含内部接头序列。
在某些实施方案中，酬载是以符合可读框方式与导引部分融合的蛋白质酬载。在一个实施方案中，酬载是多肽。在一个实施方案中，酬载是肽。在一个实施方案中，酬载是细胞因子。在一个实施方案中，酬载是抗体。在一个实施方案中，酬载是单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，抗体至少包含对细胞因子抗原特异的ABS。在一个实施方案中，抗体至少包含对CD3抗原特异的抗原结合位点(ABS)。在一个实施方案中，抗体至少包含对肿瘤坏死因子α(TNFα)抗原特异的ABS。在一个实施方案中，抗体包含能够与Fc受体相互作用的Fc结构域。在一个实施方案中，抗体包含不能够与Fc受体相互作用的Fc结构域。在一个实施方案中，酬载是小分子。在一个实施方案中，酬载是激素。在一个实施方案中，酬载是核酸。在一个实施方案中，酬载是抑制性RNA(RNAi)。
在某些实施方案中，任选性接头是以符合可读框方式与导引部分融合的肽。在一个实施方案中，任选性接头以符合可读框方式融合于导引部分的C末端。在一个实施方案中，任选性接头以符合可读框方式融合于融合导引部分的N末端。在一个实施方案中，任选性接头是与导引部分缀合的分子。
在某些方面，本文描述了药物组合物，其包含上文提到的任一种蛋白质构建体和可药用载体。在一个实施方案中，药物组合物适于肠胃外施用。在一个实施方案中，施用是静脉内施用。在一个实施方案中，施用是肌内施用。在一个实施方案中，施用是皮下施用。
在某些方面，本文描述了治疗其中胃肠道组织表达BTNL3/8的胃肠系统病状的方法，所述方法包括：向患有其中胃肠道组织表达BTNL3/8的疾病的患者施用治疗有效量的根据权利要求62-66中任一项所述的药物组合物。在该方法的一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是抗炎药。在一个实施方案中，抗炎药是氨基水杨酸盐。在一个实施方案中，抗炎药是非甾体类抗炎药。在一个实施方案中，抗炎药是抗炎细胞因子。在一个实施方案中，抗炎药是抗促炎药。在一个实施方案中，抗炎药是类固醇。在一个实施方案中，类固醇是糖皮质激素。在一个实施方案中，糖皮质激素是泼尼松。在一个实施方案中，糖皮质激素是氢化可的松。在一个实施方案中，酬载是免疫调节剂。
在某些方面，本文描述了治疗炎性肠病的方法，所述方法包括向炎性肠病患者施用治疗有效量的前述提到的任一药物组合物。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎。在一个实施方案中，炎性肠病是Crohn病。在一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是抗炎药。在一个实施方案中，抗炎药是氨基水杨酸盐。在一个实施方案中，抗炎药是非甾体抗炎药。在一个实施方案中，抗炎药是抗炎细胞因子，任选地白介素10(IL-10)、白介素22(IL-22)或转化生长因子β(TGFβ)。在一个实施方案中，抗炎药酬载是抗促炎药。在一个实施方案中，抗炎药酬载是类固醇。在一个实施方案中，类固醇是糖皮质激素。在一个实施方案中，糖皮质激素是泼尼松。在一个实施方案中，糖皮质激素是氢化可的松。在一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是抗生素。在一个实施方案中，抗生素酬载是利福昔明、环丙沙星、甲硝唑、莫西沙星或阿莫西林。在一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是钙调神经磷酸酶抑制剂。在一个实施方案中，钙调神经磷酸酶抑制剂是环孢菌素A或他克莫司。在一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是免疫调节剂。在一个实施方案中，免疫调节剂是免疫抑制因子。在一个实施方案中，免疫抑制因子是硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤或硫嘌呤(thiopurine)。在一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是蛋白质酬载。在一个实施方案中，蛋白质酬载是抗体、抗体片段或单链可变片段。在一个实施方案中，蛋白质酬载至少包含对TNFα抗原特异的ABS。在一个实施方案中，蛋白质酬载包含阿达木单抗(adalimumab)、英夫利西单抗(infliximab)或赛妥珠单抗(certolizumab)的互补性决定区(CDR)。在一个实施方案中，蛋白质酬载至少包含对白介素抗原特异的ABS。在一个实施方案中，白介素是IL-12、IL-23或其组合。在一个实施方案中，蛋白质酬载包含优特克单抗(ustekinumab)或brikinumab的CDR。在一个实施方案中，生物制品酬载至少包含对整联蛋白抗原特异的ABS。在一个实施方案中，整联蛋白是α4整联蛋白。在一个实施方案中，蛋白质酬载包含英夫利西单抗、那他珠单抗或维多珠单抗的CDR。在一个实施方案中，蛋白质构建体包含镇痛药酬载。在一个实施方案中，蛋白质构建体包含膳食补充剂酬载。
在某些方面，本文描述了治疗肠激惹综合征的方法，所述方法包括向肠激惹综合征患者施用治疗有效量的前述提到的任一药物组合物。在诸方面实施方案，本文描述了治疗憩室炎的方法，所述方法包括向憩室炎患者施用治疗有效量的前述提到的任一药物组合物。在某些实施方案中，酬载是抗生素。在某些实施方案中，抗生素酬载是利福昔明、环丙沙星、甲硝唑、莫西沙星或阿莫西林。。
在某些方面，本文描述了治疗乳糜泻(celiac disease)的方法，所述方法包括向乳糜泻患者施用治疗有效量的前述提到的任一药物组合物。在某些实施方案中，酬载是免疫抑制因子。在某些实施方案中，免疫抑制因子是硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤或硫嘌呤。
在某些方面，本文描述了治疗微生物感染的方法，所述方法包括向微生物感染患者施用治疗有效量的前述任一者提到的药物组合物。在某些实施方案中，酬载是抗微生物药。在某些实施方案中，抗微生物药是抗寄生虫药、抗生素、抗真菌药或抗病毒药。
在某些方面，本文描述了治疗代谢疾病或代谢缺乏症的方法，所述方法包括向代谢疾病或代谢缺乏症患者施用治疗有效量的前述任一者提到的药物组合物。在某些实施方案中，酬载是膳食补充剂。在某些实施方案中，膳食补充剂是酶或维生素。
在某些方面，本文描述了调节免疫系统的方法，所述方法包括向免疫相关病状患者施用治疗有效量的前述提到的任一药物组合物。在某些实施方案中，酬载是免疫抑制因子。在某些实施方案中，免疫抑制因子是硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤或硫嘌呤。在某些实施方案中，酬载是免疫刺激剂。在某些实施方案中，免疫刺激剂是细胞因子。
5.附图简述
图1显示人Vγ4(hVγ4)、人Vγ2(hVγ2)和小鼠Vγ7(mVγ7)可变(V)结构域的氨基酸序列比对。此处显示的氨基酸位置编号基于T细胞受体(TCR)的完整蛋白质序列，包含18氨基酸前导序列(未显示)。比对结果中位置46和117处的短横线表示在mVγ7序列中引入的空位以优化比对。CDR区以粗体型字体指示。CDR1位于比对结果中氨基酸位置45-50处。CDR2位于比对结果中氨基酸位置68-75处。CDR3的前5个氨基酸位于比对结果中氨基酸位置114-118处。CDR4位于比对结果中氨基酸位置85-100处。比对结果中位置87和90处的人Vγ4-CDR4内加下划线氨基酸，当替换为hVγ2中相应的氨基酸时，消除了功能(图7中显示)。
图2描述了用来鉴定、克隆和测试从相应上皮内白细胞(IEL)分离的γδT细胞受体实验方案。
图3A是慢病毒载体主链的简图，所述慢病毒载体主链用于在TCR缺陷性Jurkat细胞中表达从分离的IEL衍生的γδTCR可变结构域的TCR构建体。
图3B显示TCR缺陷性Jurkat(J76细胞)中转导后72小时的TCR构建体表达，所述构建体具有来自γδTCR可变结构域的克隆的CDR3对。
图4A显示Vγ4Vδ1转导的J76细胞的BTNL3/8所诱导的应答的代表性实例。还显示采用抗CD3刺激的阳性对照(相对于同种型对照)。
图4B显示三个独立的Vγ4Vδ1转导的J76系响应于表达BTNL3/8的细胞，而不是Vγ9Vδ2系。B3、C11和H7代表用图2中所示方法获得的三个不同的CDR3对。
图5显示已转导细胞(+ve细胞)中CD69表达％的倍数变化(FC)(相对于表达空载体(EV)的细胞归一化)和表达Vγ4TCR或Vγ2TCR的J76细胞中的TCR下调百分数。当响应的Vγ4H7 TCR的完整V结构域由Vγ2编码序列(Vγ2H7)替换(未替换CDR3γ和完整δ链)时，BTNL3/8表达细胞所致的TCR激活丧失。然而，当相应的Vγ4H7 TCR的CDR1(H7CDR1Vγ2)和/或CDR2(H7 CDR2Vγ2)由Vγ2编码序列替换时，BTNL3/8表达细胞所致的TCR激活保留。
图6A显示人Vγ2和人Vγ4的一部分的V结构域序列比对。CDR1、CDR2和CDR3在加阴影的框中显示。总计九个(9)氨基酸不同。四个不一致的氨基酸位于CDR2和CDR4之间的框架区3中，我们在本文中定义其为“CDR4”。
图6B显示使用Cn3D比对的Vγ4/Vδ1配对可变结构域和Vγ5/Vδ1配对可变结构域的公开结构。CDR4区形成与经典CDR不可区分的恰当环。值得注意地，相对于Vγ5，Vγ4的CDR4环显示明显的构象差异。
图7显示已转导细胞(+ve细胞)中CD69表达％的倍数变化(FC)(相对于表达空载体(EV)的细胞归一化)和表达Vγ4TCR(H7 WT)、具有H7 CDR3的Vγ2TCR(Vγ2H7)和在CDR4内部具有氨基酸置换的Vγ4TCR的J76细胞中的TCR下调百分数。氨基酸位置87和90处的YA置换消除了BTNL3/8表达细胞所致的TCR激活；而氨基酸位置94和98处的NL置换未消除BTNL3/8表达细胞所致的TCR激活。
图8是根据本发明的一个实施方案的可溶性异二聚体γδTCR的多肽链的设计示意图，其中两条链借助亮氨酸拉链互补性异二聚化。Vγ或Vδ结构域分别地以符合可读框方式融合于缺少跨膜结构域的TCRα或TCRβ恒定区，后接亮氨酸拉链序列和组氨酸标签/接头。表达含有Vγ的多肽和含有Vδ的多肽并允许其发生翻译后二聚化。
图9A显示用加His标签的可溶性Vγ4δ2TCR和APC抗His标签抗体染色后，经BTNL3和BTNL8构建体或空载体转导的HEK293T细胞的流式细胞术结果。
图9B显示用抗FLAG和抗HA抗体平行染色后，经BTNL3和BTNL8构建体或空载体转导的HEK293T细胞的流式细胞术结果。
图10显示用如图8中所述那样构建的可溶性TCR染色。Vγ4Vδ1可溶性TCR和Vγ4Vδ2可溶性TCR显示与表达BTNL3+BTNL8而非空载体(EV)对照的细胞系强烈结合。
图11A是描述表达BTNL3+BTNL8的细胞与加His标签的可溶性TCR和抗His标签抗体在4℃温育的示意图。
图11B是描述表达BTNL3+BTNL8的细胞与加His标签的可溶性TCR和抗His标签抗体在37℃温育的示意图。
图12是可溶性TCR在37℃被表达BTNL3+BTNL8的细胞内化的时程。
图13A显示用抗BTNL3抗体和可溶性TCR着染表达BTNL3和BTNL8构建体的细胞的比较。
图13B显示与可溶性TCR相比，与抗BTNL3抗体温育的细胞的荧光减少。
图14是描述用于评估通过可溶性TCR递送酬载的方法的示意图。
图15A显示评估在表达BTNL3和BTNL8构建体的细胞中可溶性TCR+α-His抗体复合物内化的实验的结果。图15B是显示在已与可溶性TCR+α-His抗体复合物在4℃和37℃温育的细胞中，胰蛋白酶处理后剩余荧光信号的曲线。
图16A是与可溶性TCR+α-His抗体复合物在4℃和37℃温育并用DMEM处理的293T.L3RIL8细胞的成像流式(Image Cytometry)结果。
图16B是与可溶性TCR+α-His抗体复合物在4℃温育并用DMEM或胰蛋白酶处理的293T.L3L8细胞的成像流式结果。
图16C是与可溶性TCR+α-His抗体复合物在37℃温育并用DMEM或胰蛋白酶处理的293T.L3L8细胞的成像流式结果。
附图仅出于说明目的描绘了本发明的多种实施方案。本领域技术人员将从以下讨论容易地认识到，可以使用本文所示结构和方法的备选性实施方案，而不脱离本文所述的本发明原理。
6.发明详述
6.1.定义
除非另外定义，本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文所用，否则以下术语具有下文归属于它们的意思。
如本文所用，“蛋白质构建体”指一条或多条至少包含2种功能性元件：BTNL3/8导引部分和酬载的多肽链。酬载可以是或可以不是蛋白质酬载。
如本文所用，“BTNL3/8”指嗜乳脂蛋白3(BTNL3)蛋白和嗜乳脂蛋白8(BTNL8)蛋白。“BTNL3/8”可以指BTNL3而非BTNL8；BTNL8而非BTNL3；或BTNL3和BTNL8异二聚体。
如本文所用，“BTNL 3/8导引部分”指特异性结合BTNL3/8的分子。在某些实施方案中，BTNL3/8导引部分是抗原结合蛋白。在某些实施方案中，BTNL3/8导引部分至少是Vγ结构域多肽的一部分。
如本文所用，“Vγ结构域”指T细胞受体(TCR)γ链的可变结构域。Vγ结构域包括J区和互补性决定区(CDR)CDR1、CDR2、CDR3和CDR4。Vγ结构域残基编号如图1中所示，其中残基19是在剪切信号序列后成熟Vγ结构域的N端氨基酸。对于图1中未显示的Vγ结构域，与图1中的序列最佳比对后，分派残基编号。Vγ结构域的“相应残基”是处在与据称与之对应的残基相同的编号位置的氨基酸。
如本文所用，“Vγ结构域CDR4”指Vγ结构域的连续16个氨基酸部分，所述部分位于CDR2区和CDR3区之间，与图1的氨基酸序列位置85-100相对应。人Vγ4结构域的CDR4的氨基酸序列具有SEQ ID NO:3的序列。人δγ2结构域的CDR4的氨基酸序列具有SEQ ID NO:5的序列。小鼠Vγ7结构域的CDR4的氨基酸序列具有SEQ ID NO:4的序列。
如本文所用，“酬载”指向目的靶细胞(例如，表达BTNL3/8的细胞和/或肠上皮细胞)递送的任何分子。酬载可以包括核苷酸、核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏转录的核苷酸)、核酸如DNA和RNA(例如，mRNA、RNAi、miRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、piRNA、exRNA、scaRNA和lncRNA)、氨基酸(例如，包含可检测部分或毒素破坏翻译的氨基酸)、多肽(例如，酶、生物制品)、脂质、碳水化合物、小分子(例如，小分子药物和毒素)及其组合。在某些实施方案中，酬载是治疗药。治疗药包括但不限于化疗药、成像剂(例如，放射性同位素)、免疫调节剂(例如，细胞因子、趋化因子或检查点抑制剂)和毒素(例如，细胞毒药物)。在某些实施方案中，酬载是抗体。
如本文所用，“接头”指可以用来接合蛋白质构建体的功能性元件(例如，导引部分和酬载)的任何分子。在某些实施方案中，接头可以用来引起分子与蛋白质构建体的功能性元件(例如，导引部分或酬载)发生位点特异性缀合。在某些实施方案中，接头可以用来在体外或体内鉴定或检测蛋白质构建体。
如本文所用，“肽接头”指是多肽的接头。在某些实施方案中，肽接头以符合可读框方式融合于蛋白质构建体的功能性元件(例如，导引部分和酬载)。在某些实施方案中，肽接头允许分子与蛋白质构建体的元件发生位点特异性缀合。肽接头可以具有实现与肽接头融合的功能性元件的所需构象的任何长度和任何氨基酸序列。
如本文所用，“内部接头”指在其N末端和C末端上与至少一个额外多肽共价结合的多肽序列。在某些实施方案中，内部接头是导引部分内部的多肽链(例如，在Vγ和Vδ结构域之间的内部接头)。内部接头可以具有实现与内部接头融合的额外多肽的所需构象的任何长度和任何氨基酸序列。
如本文所用，“抗体”包括包含至少一个抗体可变结构域的任何抗体蛋白质构建体，所述抗体可变结构域包含至少一个抗原结合位点(ABS)。抗体包括但不限于仅有可变结构域的分子、单链可变片段(scFv)、单链Fab片段(scFab)、双特异性抗体、杂合IgG、Fab融合蛋白、Fc-修饰的IgG、附接的IgG、双体抗体、scDiabody、DART、tandAb和微型抗体。
如本文所用，“单链符合可读框融合物”指单链符合可读框融合物T细胞受体可变结构域(scTv)，其中T细胞受体的至少两个多肽可变结构域的至少一部分作为其中可变结构域序列以符合可读框方式融合的单一融合多肽链产生。单链符合可读框融合物T细胞受体可变结构域(scTv)可以包含多于一个可变结构域和/或恒定区并且可以与任何来源的T细胞受体配对。就这一点而论，scTvs包括串联scTv，其中2个或更多个可变结构域以符合可读框方式融合。
如本文所用，“抗原结合位点”(ABS)指抗体分子的特异性识别或结合于给定抗原或表位的区域。ABS据称与其特异性抗原或表位以特定亲和力结合。如本文所描述，“亲和力”指一个分子和另一个分子之间非共价分子间力的相互作用强度。亲和力，即，相互作用强度，可以表述为解离平衡常数(KD)，其中较低的KD值指分子之间较强的相互作用。通过本领域熟知的方法测量抗体构建体的KD值，所述方法包括但不限于生物膜层干涉测量(例如，
)、表面等离子体共振(SPR)技术(例如，
)和细胞结合测定法。ABS和其同族抗原或表位之间的亲和力具有低于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M的KD值。
如本文所用，“小分子”指具有小于<900道尔顿的低分子量的分子并且不包括肽。小分子包括可以调节生物学过程，具有1nm尺度大小的有机分子。
如本文所用，“抗炎细胞因子”指具有抗炎活性的任何细胞因子。抗炎细胞因子包括但不限于：白介素(IL)IL-1ra、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13和转化生长因子β(TGFβ)。
如本文所用，“抗促炎药”指抑制促炎细胞因子活性或表达的任何分子或物质。抗促炎药包括促炎细胞因子的抑制物，所述促炎细胞因子包括但不限于白介素-1(IL-1)、IL-12、IL-18、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(INF-γ)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。抗促炎药包括具有抗炎活性的可溶性细胞因子受体，如可溶性肿瘤坏死因子受体p55、可溶性肿瘤坏死因子、p75、可溶性IL-1受体2型、IL-18结合蛋白。抗促炎药还包括缺少胞内信号传导作用的与促炎细胞因子受体竞争的细胞因子受体，如膜结合型IL-1受体2型。
如本文所用，“免疫调节剂”指改变免疫系统细胞的免疫应答和/或活性的任何分子。在某些实施方案中，免疫调节剂是免疫抑制因子或免疫刺激因子。“免疫抑制因子”涉及减少免疫系统细胞的免疫应答和/或活性的任何分子或物质，而“免疫抑制因子”指增加免疫系统细胞的免疫应答和/或活性的任何分子或物质。
如本文所用，“免疫相关病状”指与改变的免疫系统活动相关的任何病状或病症。免疫相关病状包括与免疫应答增加或减少相关的病状。免疫相关病状包括但不限于：自身免疫性疾病、炎性病症、过敏反应、免疫缺陷、造血系癌症和其他造血系异常。
如本文所用，“炎性病症”指与炎症增加或存在发炎组织相关的任何病状或病症。炎性病症包括但不限于：哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、自身炎性疾病、癌症、乳糜泻、慢性前列腺炎、结肠炎、憩室炎、肾小球肾炎、化脓性汗腺炎、超敏性、炎性肠病、间质性膀胱炎、扁平苔癣、肥大细胞活化综合征、肥大细胞增多症、耳炎、骨盆炎症性疾病、再灌注损伤、风湿热、类风湿性关节炎、鼻炎、类肉状瘤病、移植排斥和血管炎。
如本文所用，“胃肠系统病状”指与胃肠系统的任何组织相关的任何病状或病症。胃肠系统病状包括但不限于免疫相关的胃肠系统病状、胃肠系统炎性病症、胃肠系统组织的微生物感染和由饮食异常、代谢疾病或缺陷引起的病状。胃肠系统病状包括但不限于炎性肠病、乳糜泻、肠激惹综合征、憩室炎、Crohn病和癌症(例如，结肠癌、直肠癌、胃癌)。
如本文所用，术语“治疗”或“疗法”指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目的是防止或减缓(减轻)不想要的生理学变化或病症，如多发性硬化、关节炎或癌症进展。有益或合乎需要的临床结果包括，但不限于症状减轻、病情程度减弱、病情状态稳定(即，未加重)、病情进展延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和，以及消退(无论是局部或总体消退)，无论是可检测的或不可检测的。“治疗”也可以意指与如果没有接受治疗的预期存活期相比，延长存活期。需要治疗的那些患者包括已经患有该病状或病症的那些患者以及易于患有该病状或病症的那些患者或其中待预防病状或病症的那些患者。
通过“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要诊断、预后判断或治疗的任何受试者，尤其哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家养动物、家畜和动物园动物、竞赛动物或宠物动物如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛、等等。
术语“足够的量”意指足以产生所需效果的量，例如，足以调节细胞中蛋白质聚集的量。
术语“治疗有效量”是有效减轻疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以视为治疗。
如本文件通篇提及的术语‘重组人γδTCR蛋白’或这个术语的衍生物涉及通过标准基因工程方法学从人γδTCR序列或其功能性衍生物或同源物生成的任何重组蛋白。这类重组蛋白还可以包含额外的融合元件如二聚化结构域。非限制性实例包括支持TCR正确折叠的融合物、作为跨膜结构域运转的融合物(例如，支持在细胞表面上的TCR的正确呈递)、或延长半衰期或增加大小的融合物(例如，人血清白蛋白融合结构域)或如本文他处描述的酬载融合物。这些额外的融合元件可以用衍生自γδTCR序列或其衍生物和同源物的序列生成，或备选地，这类融合序列可以是非TCR来源的。
如本文件通篇所提到的术语‘重组γδTCR序列’或‘重组人TCR文库’或‘重组人TCR组’或来自其中的衍生性术语涉及多于一种重组人γδTCR蛋白质、或多于二种、或三种或四种或五种、或更多多于十种重组人γδTCR蛋白质的集合有关。这个集合将包含差异至少一个或更多个氨基酸的一组序列。这个重组TCR集合可以按可溶性形式呈现。备选地，出于展示目的，这个集合也可以连接或融合或系留至无机材料或有机材料(非限制性实例包括‘珠’或‘平板’或‘柱’或‘噬菌体’)。备选地，也可以将这个集合呈现或展示在膜或膜集合上，如在完好细胞或活细胞中存在的那些膜或无生命膜如胶束。在一个活细胞或多个活细胞上表达和呈现这个集合时，常见的是还产生一组同族表达载体。这个同族表达载体集合可以用来首先使该细胞或多个细胞工程化，以展示所述重组人γδTCR蛋白或所述蛋白质的文库或小组或集合，以创建表达这类TCR蛋白的细胞文库。
如本文件通篇所提到的术语‘同族结合配偶体’或‘候选同族结合配偶体’或来自其中的衍生性术语涉及鉴定为按序列特异性方式结合重组人γδTCR蛋白的蛋白质或来自其的衍生物有关。为了发现或筛选或验证这类同族结合配偶体，可以将它们在天然背景下(例如在一个或多个细胞的表面上)呈现或展示。也可以将它们作为来自这类细胞的提取物或分泌物、从中纯化的衍生物或以重组形式呈现或展示。
6.2.其他解释性惯例
除非另外说明，对本文中序列的全部提及均是氨基酸序列。
在本公开中，“包含”、“包含着”、“含有”、“具有”、“包括了”、“包含”及其语言变体具有美国专利法中向它们所赋予的含义，允许除明确列举的那些之外的额外要素存在。
将本文中提供的范围理解为对所述范围内全部值(包括列举的端点)的简写。例如，一个1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围，所述组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50。
除非特别陈述或从内容显而易见，如本文所用的术语“或”理解成包含性。除非特别陈述或从内容中显而易见，如本文所用的术语术语“一个(a)”、“一者(an)”和“该(the)”理解成是单数或复数。
除非特别陈述或另外从内容中显而易见，如本文所用的术语“约”理解为在本领域的一系列正态容差内，例如在均数的2个标准差内。约可以理解为在所标注值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％范围内。除非从内容中另外明确，否则本文提供的全部数值受术语约修饰。
6.3.包含BTNL3/8导引部分的蛋白质构建体
在第一方面，提供蛋白质构建体。蛋白质构建体包含BTNL3/8导引部分、酬载和将导引部分与酬载连接的任选性接头。
6.3.1.1 BTNL3/8导引部分
BTNL3/8导引部分与人BTNL3、人BTNL8和/或人BTNL3/8异二聚体特异性结合。在某些实施方案中，BTNL3/8导引部分是T细胞受体(TCR)Vγ结构域多肽的至少一部分，如下文进一步细节中所描述。在替代实施方案中，BTNL3/8导引部分是抗体的抗原结合位点。在某些实施方案中，当BTNL3/8导引部分与BTNL3/8结合时，BTNL3/8导引部分抑制或部分地抑制BTNL3/8功能。在某些实施方案中，当BTNL3/8导引部分与BTNL3/8结合时，BTNL3/8导引部分刺激或激活BTNL3/8功能。在某些实施方案中，当BTNL3/8导引部分与BTNL3/8异二聚体结合时，BTNL3/8导引部分抑制或部分地抑制BTNL3/8异二聚体功能。在某些实施方案中，当BTNL3/8导引部分与BTNL3/8结合二聚体时，BTNL3/8导引部分刺激或激活BTNL3/8二聚体功能。
6.3.1.TCRγ可变结构域
在某些实施方案中，BTNL3/8导引部分至少包含T细胞受体(TCR)Vγ结构域多肽的一部分。在常见的实施方案中，BTNL3/8导引部分包含Vγ结构域多肽。
在某些实施方案中，BTNL3/8导引部分包含衍生自Vγ4的CDR4区。在某些实施方案中，BTNL3/8导引部分包含Vγ结构域，其中在Vγ结构域的序列位置编号87的氨基酸是天冬氨酸或组氨酸，并且在Vγ结构域的序列位置编号90的氨基酸是甘氨酸或谷氨酸，并且其中VγCDR4的剩余残基在每个位置处都独立地选自人或鼠Vγ结构域的相应残基。
在某些实施方案中，Vγ结构域CDR4的剩余残基在每个位置处都独立地选自人Vγ4、人Vγ2或小鼠Vγ7的相应残基。在一些实施方案中，Vγ结构域CDR4的剩余残基均选自人Vγ4、人Vγ2或小鼠Vγ7的相应残基。在一个实施方案中，Vγ结构域CDR4的剩余残基均选自人Vγ4的相应残基。在一个实施方案中，Vγ结构域CDR4的剩余残基均选自人Vγ2的相应残基。在一个实施方案中，Vγ结构域CDR4的剩余残基均选自小鼠Vγ7的相应残基。在一个实施方案中，在Vγ结构域的位置编号87-90处的氨基酸序列是SEQ ID NO:1。在一个实施方案中，在Vγ结构域的位置编号87-90处的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
在某些实施方案中，Vγ结构域是图1中显示的Vγ结构域序列。在某些实施方案中，Vγ结构域是人Vγ结构域。在一个实施方案中，Vγ结构域是人Vγ4结构域。在一个实施方案中，Vγ结构域是其中CDR4氨基酸经氨基酸序列位置编号87处用天冬氨酸或组氨酸置换并经氨基酸序列位置编号90处用甘氨酸或谷氨酸置换的人Vγ2结构域。
在某些实施方案中，Vγ结构域是人Vγ3或人Vγ5。在具体的实施方案中，Vγ结构域是其中CDR4氨基酸经氨基酸序列位置编号87处用天冬氨酸或组氨酸置换并经氨基酸序列位置编号90处用甘氨酸或谷氨酸置换的人Vγ3或人Vγ5。在某些实施方案中，Vγ结构域是与人Vγ4具有至少70％序列同一性的人Vγ结构域。
在某些实施方案中，Vγ结构域是其是非人类哺乳动物Vγ结构域的Vγ结构域。在某些实施方案中，Vγ结构域是与人Vγ4具有至少70％同一性的非人类哺乳动物Vγ结构域序列。
在一些实施方案中，Vγ结构域CDR3是人或小鼠VγCDR3序列。在某些实施方案中，Vγ结构域CDR3包含人CDR3序列。在具体的实施方案中，Vγ结构域CDR3包含人Vγ4CDR3序列。在具体的实施方案中，Vγ结构域CDR3包含人Vγ2CDR3序列。在某些实施方案中，Vγ结构域CDR3包含非人类哺乳动物CDR3序列。在一个实施方案中，Vγ结构域CDR3包含小鼠Vγ7CDR3序列。
在一些实施方案中，J区是VγJ区。在某些实施方案中，J区是人VγJ区。在某些实施方案中，J区是小鼠VγJ区。在一个实施方案中，J区具有选自SEQ ID NOs:15-18的多肽序列。
6.3.1.1.1与Vδ配对
在某些实施方案中，蛋白质构建体的BTNL3/8导引部分进一步不包含配对的Vδ结构域。在某些实施方案中，蛋白质构建体的BTNL3/8导引部分包含与至少额外的Vγ结构域配对的Vγ结构域。在某些实施方案中，BTNL3/8导引部分是Vγ4同型二聚体。在某些实施方案中，蛋白质构建体的BTNL3/8导引部分还包含配对的Vδ结构域。在某些实施方案中，Vδ结构域是人Vδ结构域。在某些实施方案中，人Vδ结构域是Vδ1、Vδ2、Vδ3、Vδ5或Vδ8。在一个实施方案中，人Vδ结构域是Vδ1。在某些实施方案中，Vδ结构域是非人类哺乳动物Vδ结构域。
(a)异二聚体样式
在一些实施方案中，Vδ结构域通过第一多肽和第二多肽的异二聚化配对，所述多肽之一包含Vγ结构域，所述多肽之一包含Vδ结构域。
异二聚体相互作用可以包括在包含Vγ结构域和Vδ结构域的多肽之间的共价和/或非共价相互作用。在常见的实施方案中，Vγ结构域和Vδ结构域通过其中同型二聚体比异二聚体更少形成的正交特征来配对。
在一些实施方案中，分别包含Vγ结构域和Vδ结构域的多肽通过至少一个工程化的二硫键桥共价连接。工程化的二硫键桥是在两个或更多结构域中如此提供非内源半胱氨酸氨基酸的氨基酸序列，从而两个或更多个结构域缔合时形成非天然二硫键。在这些实施方案的某些中，在Vγ和Vδ结构域内工程化至少一个二硫键。在某些实施方案中，在可变区之外部的结构域内(诸如按符合可读框方式与可变区融合的恒定区内部)工程化至少一个二硫键。
在一些实施方案中，异二聚体相互作用是亮氨酸拉链互补性。
在某些实施方案中，配对的Vγ/Vδ异二聚体的一个或多个多肽还包含T细胞受体恒定区。在某些实施方案中，第一T细胞受体恒定区以符合可读框方式融合于配对的Vγ结构域的C末端。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人TCR恒定区。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人TCRβ恒定区。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人TCRα恒定区。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人TCRγ恒定区。在一个实施方案中，配对的Vγ/Vδ异二聚体的多肽还包含第二T细胞受体恒定区，其中第二T细胞受体恒定区以符合可读框方式融合于配对的Vδ结构域的C末端。在一个实施方案中，第二T细胞受体恒定区是人TCRα恒定区。在一个实施方案中，第二T细胞受体恒定区是人TCRβ恒定区。在一个实施方案中，第二T细胞受体恒定区是人TCRδ恒定区。
在一些实施方案中，Vγ结构域与第一恒定区的符合可读框融合物在Vγ结构域和第一TCR恒定区之间包含内部接头序列。在一些实施方案中，Vδ结构域和第二TCR恒定区的符合可读框融合物在Vδ结构域和第二T细胞受体恒定区之间包含内部接头序列。
在一个实施方案中，BTNL3/8导引部分包含SEQ ID NO:9。在一个实施方案中，BTNL3/8导引部分包含SEQ ID NO:10。在一个实施方案中，BTNL3/8导引部分包含SEQ IDNO:11。
在某些实施方案中，BTNL3/8导引部分包含多于一个Vγ结构域和/或Vδ结构域。在某些实施方案中，多于一个Vγ结构域和/或Vδ结构域多聚化。在某些实施方案中，全部或一部分多于一个Vγ结构域和/或Vδ结构域以符合可读框方式融合于T细胞受体恒定区。在某些实施方案中，多聚化的多于一个Vγ结构域和/或Vδ结构域包含一个或多个内部接头。
在又一个方面，提供重组γδTCR构建体。因此，根据又一个方面，提供包含SEQ IDNO:9的重组γδTCR蛋白质(任选地无C末端His标签)。在另一个方面，提供包含SEQ ID NO:10的重组γδTCR蛋白质。在另一个方面，提供包含SEQ ID NO:11的重组γδTCR蛋白质(任选地无C末端His标签)。在另一个方面，提供包含SEQ ID NO:12的重组γδTCR蛋白质。在另一个方面，提供包含SEQ ID NO:13的重组γδTCR蛋白质。
(b)单链符合可读框融合物
在某些实施方案中，BTNL3/8导引部分包含Vγ结构域和配对的Vδ结构域的单链符合可读框融合物。在一些实施方案中，Vγ结构域位于Vδ结构域的N末端。在一些实施方案中，Vγ结构域位于Vδ结构域的C末端。在多种实施方案中，Vγ结构域和Vδ结构域的单链符合可读框融合物包含内部接头序列。
在一些实施方案中，Vδ结构域是人Vδ结构域。在一个实施方案中，人Vδ结构域是Vδ1、Vδ2或Vδ5。在一个实施方案中，人Vδ结构域是Vδ1。在某些实施方案中，单链符合可读框融合物还至少包含T细胞受体恒定区。在某些实施方案中，单链符合可读框融合物还包含第一T细胞受体恒定区，其中第一T细胞受体恒定区以符合可读框方式融合于Vγ结构域的C末端。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体恒定区。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体β恒定区。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体α恒定区。在一个实施方案中，第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体γ恒定区。在一个实施方案中，单链符合可读框融合物还包含第二T细胞受体恒定区，其中第二T细胞受体恒定区以符合可读框方式融合于配对的Vδ结构域的C末端。在一个实施方案中，第二T细胞受体恒定区是人T细胞受体α恒定区。在一个实施方案中，第二T细胞受体恒定区是人T细胞受体β恒定区。在一个实施方案中，第二T细胞受体恒定区是人T细胞受体δ恒定区。在一个实施方案中，Vδ结构域和第二T细胞受体恒定区的符合可读框融合物在Vδ结构域和第二T细胞受体恒定区之间的包含内部接头序列。
在某些实施方案中，单链符合可读框融合物包含多于一个Vγ结构域和/或Vδ结构域。在某些实施方案中，多于一个Vγ结构域和/或Vδ结构域多聚化。在某些实施方案中，多聚化的多于一个Vγ结构域和/或Vδ结构域包含一个或多个内部接头。在某些实施方案中，全部或一部分多于一个Vγ结构域和/或Vδ结构域以符合可读框方式至少融合于T细胞受体恒定区。
6.3.2.基于抗体的导引部分
在某些实施方案中，BTNL3/8导引部分包含与人BTNL3、人BTNL8和/或人BTNL3/8异二聚体特异性结合的抗体。在某些实施方案中，抗体是全长抗体片段或包括但不限于以下的抗体样式：Fab片段、Fvs、scFvs、串联scFvs、双体抗体、scDiabody、DART、tandAb、微型抗体、驼类VHH和本领域技术人员已知的其他抗体片段或样式。示例性抗体和抗体片段样式在Brinkmann等人,MABS,2017,第9卷,第2期,182–212中详细描述，所述文献通过引用方式并入本文用于其教导的全部。
在一个实施方案中，抗体包含能够与Fc受体相互作用的Fc结构域。在一个实施方案中，抗体包含不能够与Fc受体相互作用的Fc结构域。在某些实施方案中，抗体在抗体结构域的氨基酸序列中具有一个或多个工程化的突变，所述突变减少与抗体结合天然相关的效应子功能。效应子功能包括但不限于因Fc受体与Fc部分抗体结合而产生的细胞功能，如抗体依赖的细胞毒作用(ADCC，也称作抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)、补体固定(例如C1q结合)、抗体依赖性细胞介导的吞噬(ADCP)和调理作用。减少效应子功能的工程化的突变更详细地描述于以下文献中：美国公开号2017/0137530、Armour等人(Eur.J.Immunol.29(8)(1999)2613-2624)、Shields等人(J.Biol.Chem.276(9)(2001)6591-6604)和Oganesyan等人(Acta Cristallographica D64(2008)700-704)，所述文献每篇通过引用的方式完整并入。在特定的实施方案中，抗体在抗体结构域的氨基酸序列中具有一个或多个工程化的突变，所述突变减少ROR结合性分子的Fc部分与FcR受体的结合。在一些实施方案中，FcR受体是FcRγ受体。在具体的实施方案中，FcR受体是FcγRIIa受体和/或FcγRIIIA受体。在特定实施方案中，一个或多个减少效应子功能的工程化的突变是在抗体的CH2结构域中的突变。
6.3.2.1酬载
蛋白质构建体包含酬载。
在多种实施方案中，酬载可以包括核苷酸、进一步包含可检测部分或毒素或破坏转录的核苷酸、核酸如DNA、编码诸如酶的多肽的mRNA分子、其他RNA分子(例如，RNAi、miRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA和lncRNA)、氨基酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏翻译的氨基酸)、多肽(例如，酶、生物产品)、脂质、碳水化合物、小分子(例如，小分子药物和毒素)及其组合。
在某些实施方案中，酬载是治疗药。治疗药包括但不限于化疗药、免疫调节剂(例如，细胞因子、趋化因子或检查点抑制剂)、激素和毒素(例如，细胞毒药物)。
在某些实施方案中，酬载是抗体。在一个实施方案中，抗体至少包含对CD3抗原特异的抗原结合位点(ABS)。在一个实施方案中，抗体至少包含对肿瘤坏死因子α(TNFα)抗原特异的ABS。在一个实施方案中，抗体包含能够与Fc受体相互作用的Fc结构域。在一个实施方案中，抗体包含不能够与Fc受体相互作用的Fc结构域。
在某些实施方案中，酬载是激素。在某些实施方案中，酬载是膳食补充剂。在某些实施方案中，酬载是抗微生物药。
在某些实施方案中，蛋白质构建体包含多个可以相同或不同的酬载。
在具体的实施方案中，酬载与BTNL3/8导引部分的C末端结合。在具体的实施方案中，酬载与BTNL3/8导引部分的N末端结合。
6.3.1.多肽
在多种实施方案中，酬载是多肽。在某些实施方案中，酬载是以符合可读框方式与BTNL3/8导引部分融合的多肽。在具体的实施方案中，酬载以符合可读框方式融合于BTNL3/8导引部分的C末端。在具体的实施方案中，酬载以符合可读框方式融合于BTNL3/8导引部分的N末端。
在某些实施方案中，多肽酬载是细胞因子。在某些实施方案中，酬载是抗炎细胞因子，如白介素10(IL-10)、白介素22(IL-22)或转化生长因子β(TGFβ)。
在某些实施方案中，酬载是抗促炎多肽。在具体的实施方案中，抗促炎多肽是一种或多种促炎细胞因子的抑制剂。在具体的实施方案中，抗促炎多肽是白介素-1(IL-1)、IL-6、IL-12、IL-18、肿瘤坏死因子Α(TNFα)、干扰素γ(INF-γ)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中一者或多者的抑制剂。在某些实施方案中，抗促炎多肽是具有抗炎活性的可溶性细胞因子受体，如可溶性肿瘤坏死因子受体p55、可溶性肿瘤坏死因子、p75、可溶性IL-1受体2型、IL-18结合蛋白。在某些实施方案中，抗促炎多肽包含与促炎细胞因子特异性结合的抗体抗原结合位点。
在一些实施方案中，酬载是肽。在某些实施方案中，酬载是以符合可读框方式与BTNL3/8导引部分融合的肽。
6.3.2.1.1抗体抗原结合位点
在某些实施方案中，酬载是至少一个抗体抗原结合位点(ABS)。在某些实施方案中，抗体抗原结合位点的样式为为Fab片段、Fv、scFv、串联scFv、双体抗体、scDiabody、DART、tandAb、迷你抗体、驼类VHH、纳米体或本领域技术人员已知的其他抗体片段或样式。示例性抗体和抗体片段样式在Brinkmann等人,MABS,2017,第9卷,第2期,182–212中详细描述，所述文献通过引用方式并入本文用于其教导的全部。
在多种实施方案中，至少一个抗体抗原结合位点对细胞因子特异。在一些实施方案中，抗原结合位点对促炎细胞因子特异。在具体的实施方案中，至少一个抗原结合位点对白介素-1(IL-1)、IL-6、IL-12、IL-18、肿瘤坏死因子Α(TNFα)、干扰素γ(INF-γ)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子特异。
在一个实施方案中，抗体至少包含对抗炎细胞因子如白介素10(IL-10)、白介素22(IL-22)或转化生长因子β(TGFβ)特异的抗原结合位点(ABS)。在一个实施方案中，抗体至少包含对抗促炎药特异的抗原结合位点(ABS)。
在一些实施方案中，抗体至少包含对细胞因子抗原特异的抗原结合位点(ABS)。在一个实施方案中，抗体至少包含对肿瘤坏死因子α(TNFα)抗原特异的ABS。
6.3.2.小分子酬载
在某些实施方案中，酬载是小分子。在某些实施方案中，小分子是治疗药(即，小分子药物)。在某些实施方案中，小分子治疗药是免疫调节剂。在某些实施方案中，小分子是细胞蛋白(例如，受体、其他信号分子、酶或转录因子)的抑制物或激活物。在某些实施方案中，小分子治疗药是毒素。
在一些实施方案中，酬载是通过化学缀合与BTNL3/8导引部分连接的药物。
可以适应于将药物与本文公开的蛋白质构建体缀合的抗体-药物缀合物(ADC)制备方法例如描述于以下文献中：美国专利号8,624,003(锅法(pot method))、美国专利号8,163,888(一步法(one-step))、美国专利号5,208,020(两步法(two-step method))、美国专利号8,337,856、美国专利号5,773,001、美国专利号7,829,531、美国专利号5,208,020、美国专利号7,745,394、WO 2017/136623、WO 2017/015502、WO 2017/015496、WO 2017/015495、WO 2004/010957、WO 2005/077090、WO 2005/082023、WO 2006/065533、WO 2007/030642、WO 2007/103288、WO 2013/173337、WO 2015/057699、WO 2015/095755、WO 2015/123679、WO 2015/157286、WO 2017/165851、WO 2009/073445、WO 2010/068759、WO 2010/138719、WO2012/171020、WO 2014/008375、WO 2014/093394、WO 2014/093640、WO 2014/160360、WO 2015/054659、WO 2015/195925、WO 2017/160754,Storz(MAbs.2015Nov-Dec；7(6):989–1009)、Lambert等人(Adv Ther,2017 34:1015)、Diamantis等人(BritishJournal of Cancer,2016,114,362–367),Carrico等人(Nat Chem Biol,2007.3:321-2)、We等人(Proc Natl Acad Sci USA,2009.106:3000-5)、Rabuka等人(Curr Opin ChemBiol.,2011 14:790-6)、Hudak等人(Angew Chem Int Ed Engl.,2012:4161-5)、Rabuka等人(Nat Protoc.,2012 7:1052-67)、Agarwal等人(Proc Natl Acad Sci USA.,2013,110:46-51)、Agarwal等人(Bioconjugate Chem.,2013,24:846–851)、Barfield等人(DrugDev.and D.,2014,14:34-41)、Drake等人(Bioconjugate Chem.,2014,25:1331-41)、Liang等人(J Am Chem Soc.,2014,136:10850-3)、Drake等人(Curr Opin Chem Biol.,2015,28:174-80)和York等人(BMC Biotechnology,2016,16(1):23)，所述文献每篇因而通过引用方式完整地并入用于其教导的全部。
6.3.3.核酸酬载
在某些实施方案中，酬载是核酸。核酸可以是DNA或RNA，诸如但不限于dsDNA、mRNA、miRNA、lncRNA和siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA和scaRNA。
6.3.3.1任选性接头
本文所述蛋白质构建体的任选地包含将导引部分与酬载连接的接头。
在一些实施方案中，任选性接头是以符合可读框方式与导引部分融合的肽。在一个实施方案中，任选性接头以符合可读框方式融合于导引部分的C末端。在一个实施方案中，任选性接头以符合可读框方式融合于融合导引部分的N末端。
在一些实施方案中，任选性接头是与导引部分缀合的分子。在多种实施方案中，蛋白质构建体具有修饰，所述修饰包含可以用于下游过程如与额外功能性元件(例如，酬载，和BTNL3/8导引部分)连接和下游纯化过程中的官能团或化学反应基。在某些实施方案中，接头包含可切割分子(例如，可以被位点特异性蛋白酶或允许接头剪切成两个或更多个片段的其他分子切割的肽)。在某些实施方案中，修饰是化学反应基，所述化学反应基包括但不限于活性硫醇(例如，基于马来酰亚胺的活性基团))、活性胺(例如，基于N-羟基琥珀酰亚胺的活性基团)、“点击化学”基团(例如，活性炔基)和携带甲酰基甘氨酸(FGly)的醛。在某些实施方案中，修饰是官能团，所述官能团包括但不限于亲和肽序列(例如，HA、HIS、FLAG、GST、MBP和Strep体系等)。在某些实施方案中，官能团或化学反应基具有可切割的肽序列。在具体的实施方案中，借助多种手段切割可切割肽，所述手段包括但不限于光裂解、化学切割、蛋白酶切割、还原条件和pH条件。在具体的实施方案中，蛋白酶切割由胞内蛋白酶实施。在具体的实施方案中，蛋白酶切割由胞外或膜相关蛋白酶实施。采用蛋白酶切割作用的ADC治疗药在Choi等人(Theranostics,2012；2(2):156–178.)中更详细地描述，所述文献的完整内容因而通过引用的方式并入用于其教导的全部。
在某些实施方案中，除使导引部分与酬载连接之外，接头可以用来引起分子与蛋白质构建体的功能性元件(例如，导引部分或酬载)发生位点特异性缀合。在某些实施方案中，接头可以额外地用来在体外或体内鉴定或检测蛋白质构建体。在某些实施方案中，蛋白质构建体包含多于一个任选性接头。
6.4.其他的导引部分
在某些方面，本文描述了重组同型二聚体和异二聚体人γδTCR的小组或文库和使用这个小组或文库以鉴定决定或辅助γδT细胞的组织特异性分布的特殊同族人结合结构域或配偶体的方法。这些结合配偶体经常称作人天然‘自我抗原’并且已经非常难以/不可能进一步确定或表征，直至本文所述发现为止。在本发明的一个方面，我们描述了重组的人γδTCR蛋白，所述重组蛋白展现出与其天然细胞环境下所展现出的相似的组织特异性或结合作用。在本发明的又一个方面，我们描述了一种方法，所述方法(i)生成至少一种重组γδTCR(ii)显示或呈现或混合这种具有潜在的同族结合配偶体或多个配偶体的重组蛋白或多种蛋白质，其优选地在细胞表面上表达并且(iii)因此鉴定或验证特异性γδTCR/结合配偶体相互作用。在本发明的一个方面，采用已鉴定的所得γδTCR或来自其中的序列衍生物作为导引部分，以递送治疗用酬载至表达同族结合配偶体的靶组织或细胞。在又一个实施方案中，则用备选性导引部分如抗体或来自其的衍生物靶向借助本文所述方法鉴定的表达已鉴定同族结合配偶体的细胞。
6.5.生产方法
可以通过使用目前用于T细胞受体或抗体生产的标准无细胞翻译、瞬时转染和稳定转染方法表达，容易地生产本文所述的蛋白质构建体。
6.6.纯化方法
本领域技术人员已知的适宜纯化方法可以用来纯化蛋白质构建体。可以使用亲和树脂(例如，结合蛋白质构建体上亲和标签的亲和树脂)，将表达的蛋白质容易地与非所需蛋白质和蛋白质复合物分离。可以使用本领域常规使用的离子交换色谱，实现进一步纯化。
评估纯化步骤效能和效率的方法是本领域技术人员熟知的并且包括但不限于SDS-PAGE分析、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和质谱法。也可以根据多种标准评估纯度。标准的实例包括但不限于：1)评估洗脱物中由完全组装的蛋白质构建体提供的总蛋白的百分数；2)评估纯化所需产物的方法的富集倍数或增长百分数；例如，将洗脱物中由完全组装的蛋白质构建体提供的总蛋白与起始样品比较；3)评估总蛋白百分数或非所需产物(例如，上文描述的不完整复合物)的下降百分数，包括确定特定非所需产物(例如，未缔合的单一多肽链、多肽链的任何组合的二聚体、或多肽链的任何组合的三聚体)的百分数或下降百分数。
6.7.药物组合物
在另一个方面，提供包含蛋白质构建体和可药用载体或稀释剂的药物组合物，所述蛋白质构建体包含如本文所述的BTNL3/8导引部分和酬载。在常见的实施方案中，药物组合物是无菌的。在某些方面，本文描述了药物组合物，其包含上文提到的任一种蛋白质构建体和可药用载体。
在一个实施方案中，药物组合物适于肠胃外施用。在一个实施方案中，施用是静脉内施用。在一个实施方案中，施用是肌内施用。在一个实施方案中，施用是皮下施用。
在多种实施方案中，药物组合物以0.1mg/ml–100mg/ml的浓度包含蛋白质构建体。在特定的实施方案中，药物组合物以0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、7.5mg/ml或10mg/ml的浓度包含蛋白质构建体。在一些实施方案中，药物组合物以多于10mg/ml的浓度包含蛋白质构建体。在某些实施方案中，蛋白质构建体以20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml或甚至50mg/ml或更高的浓度存在。在具体的实施方案中，蛋白质构建体以多于50mg/ml的浓度存在。
在多种实施方案中，药物组合物更详细地描述于以下文献：美国专利号8,961,964、美国专利号8,945,865、美国专利号8,420,081、美国专利号6,685,940、美国专利号6,171,586、美国专利号8,821,865、美国专利号9,216,219、美国申请10/813,483、WO 2014/066468、WO 2011/104381和WO 2016/180941，所述文献每篇以其整体并入本文。
6.8.组合物用途
在一个方面，还为提供了组合物的用途。在一个实施方案中，提供一种包含蛋白质构建体的组合物用于疗法中，所述蛋白质构建体包含如本文所述的BTNL3/8导引部分和酬载。组合物可以用于例如治疗炎性病症、炎性肠病、肠激惹综合征、憩室炎、乳糜泻、代谢疾病、癌症、免疫相关病状、自身免疫性、移植排异、创伤后免疫应答、移植物抗宿主病、局部缺血、卒中和传染性疾病。
在一个方面，还提供组合物制造药物的用途。在一个实施方案中，提供一种包含蛋白质构建体的组合物制造用于治疗例如炎性病症、炎性肠病、肠激惹综合征、憩室炎、乳糜泻、代谢疾病、癌症、免疫相关病状、自身免疫性、移植排异、创伤后免疫应答、移植物抗宿主病、局部缺血、卒中和传染性疾病的药物的用途，所述蛋白质构建体包含如本文所述的BTNL3/8导引部分和酬载。
6.9.治疗方法
在一个方面，提供治疗方法，所述方法包括向患者以有效治疗该患者的量施用包含如本文所述的BTNL3/8导引部分和酬载的蛋白质构建体。可以将本公开的蛋白质构建体本身或以药物组合物形式施用至受试者用于治疗例如炎性病症、炎性肠病、肠激惹综合征、憩室炎、乳糜泻、代谢疾病、癌症、免疫相关病状、自身免疫性、移植排异、创伤后免疫应答、移植物抗宿主病、局部缺血、卒中和传染性疾病。
6.9.1.1胃肠系统病状
在某些方面，本文描述了治疗胃肠系统病状的方法。胃肠系统病状包括但不限于免疫相关的胃肠系统病状、胃肠系统炎性病状、胃肠系统组织的微生物感染和由饮食异常、代谢疾病或缺陷引起的病状。胃肠系统病状包括但不限于炎性肠病、乳糜泻、肠激惹综合征、憩室炎、Crohn病和癌症(例如，结肠癌、直肠癌、胃癌)。在某些方面，本文描述了治疗胃肠系统病状的方法，其中胃肠道组织表达BTNL3/8，所述方法包括：向患有其中胃肠道组织表达BTNL3/8的疾病的患者施用治疗有效量的根据权利要求62-66中任一项所述的药物组合物。在该方法的一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是抗炎药。在一个实施方案中，抗炎药是氨基水杨酸盐。在一个实施方案中，抗炎药是非甾体类抗炎药。在一个实施方案中，抗炎药是抗炎细胞因子，任选地白介素10(IL-10)、白介素22(IL-22)或转化生长因子β(TGFβ)。在一个实施方案中，抗炎药是抗促炎药。在一个实施方案中，抗炎药是类固醇。在一个实施方案中，类固醇是糖皮质激素。在一个实施方案中，糖皮质激素是泼尼松。在一个实施方案中，糖皮质激素是氢化可的松。在一个实施方案中，酬载是免疫调节剂。
6.9.2.1炎症性肠病
在某些方面，本文描述了治疗炎性肠病的方法，所述方法包括向炎性肠病患者施用治疗有效量的任意前述提到的药物组合物。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎。在一个实施方案中，炎性肠病是Crohn病。在一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是抗炎药。在一个实施方案中，抗炎药是氨基水杨酸盐。在一个实施方案中，抗炎药是非甾体抗炎药。在一个实施方案中，抗炎药是抗炎细胞因子，任选地白介素10(IL-10)、白介素22(IL-22)或转化生长因子β(TGFβ)。在一个实施方案中，抗炎药酬载是抗促炎药。在一个实施方案中，抗炎药酬载是类固醇。在一个实施方案中，类固醇是糖皮质激素。在一个实施方案中，糖皮质激素是泼尼松。在一个实施方案中，糖皮质激素是氢化可的松。在一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是抗生素。在一个实施方案中，抗生素酬载是利福昔明、环丙沙星、甲硝唑、莫西沙星或阿莫西林。在一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是钙调神经磷酸酶抑制剂。在一个实施方案中，钙调神经磷酸酶抑制剂是环孢菌素A或他克莫司。在一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是免疫调节剂。在一个实施方案中，免疫调节剂是免疫抑制因子。在一个实施方案中，免疫抑制因子是硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤或硫嘌呤。在一个实施方案中，蛋白质构建体的酬载是蛋白质酬载。在一个实施方案中，蛋白质酬载是抗体、抗体片段或单链可变片段。在一个实施方案中，蛋白质酬载至少包含对TNFα抗原特异的ABS。在一个实施方案中，蛋白质酬载包含阿达木单抗(adalimumab)、英夫利西单抗(infliximab)或赛妥珠单抗(certolizumab)的互补性决定区(CDR)。在一个实施方案中，蛋白质酬载至少包含对白介素抗原特异的ABS。在一个实施方案中，白介素是IL-12、IL-23或其组合。在一个实施方案中，蛋白质酬载包含优特克单抗(ustekinumab)或brikinumab的CDR。在一个实施方案中，生物制品酬载至少包含对整联蛋白抗原特异的ABS。在一个实施方案中，整联蛋白是α4整联蛋白。在一个实施方案中，蛋白质酬载包含英夫利西单抗、那他珠单抗或维多珠单抗的CDR。在一个实施方案中，蛋白质构建体包含镇痛药酬载。在一个实施方案中，蛋白质构建体包含膳食补充剂酬载。
6.9.3.1感染：
在某些方面，本文描述了治疗微生物感染的方法，所述方法包括向微生物感染患者施用治疗有效量的任一前述提到的药物组合物。在某些实施方案中，酬载是抗微生物药。在某些实施方案中，抗微生物药是抗寄生虫药、抗生素、抗真菌药或抗病毒药。
6.9.4.1代谢病或缺陷
在某些方面，本文描述了治疗代谢疾病或代谢缺乏症的方法，所述方法包括向代谢疾病或代谢缺乏症患者施用治疗有效量的任一前述提到的药物组合物。在某些实施方案中，酬载是膳食补充剂。在某些实施方案中，膳食补充剂是酶或维生素。
6.9.5.1调节免疫系统
在某些方面，本文描述了调节免疫系统的方法，所述方法包括向免疫相关病状患者施用治疗有效量的任一前述提到的药物组合物。在某些实施方案中，酬载是免疫抑制因子。在某些实施方案中，免疫抑制因子是硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤或硫嘌呤。在某些实施方案中，酬载是免疫刺激剂。在某些实施方案中，免疫刺激剂是细胞因子。
6.10.实施例
通过说明方式而非限制方式提供以下实施例。
6.10.1.1方法
下文描述设计和分析包含BTNL3/8导引部分的蛋白质构建体的非限制示意性方法，所述导引部分包含TCR Vγ结构域。用于分离原代淋巴细胞、与BTNL3/8表达HEK293细胞共培养和深度测序的方法还描述于Di Marco Barros等人,Cell.2016,(167),第203-218页中。
人样品和原代淋巴细胞分离
从接受例行诊断性结肠镜检查的成人供体的升结肠获得内窥镜下活检样品。使用改进的Clark等人,2006,J.Invest.Dermatol.(126),第1059–1070页方法，获得原代肠淋巴细胞。在5mL洗涤培养基(RPMI 1640 10％FCS、β-巯基乙醇、青霉素[500U/ml]、链霉素[500mg/ml]、甲硝唑[5mg/ml，药学部,Guy’s Hospital]、庆大霉素[100mg/ml，Sigma-Aldrich]和两性霉素12.5mg/ml[Thermo Fisher Scientific])中洗涤活检样品20分钟。将一份内窥镜下活检样品置于每种基质的顶部，所述基材倒转，并且施加压力，以将活检样品压入基质中。将基质置于24孔板(每孔1种)中并用2mL RPMI 1640(补充10％FCS、β-巯基乙醇、青霉素[100U/ml]、链霉素[100mg/ml]、甲硝唑[1mg/ml]、庆大霉素[20mg/ml]、两性霉素[2.5mg/ml])、IL-2(100U/mL,Novartis Pharmaceutical UK)和IL-15(10ng/mL,Biolegend)覆盖。每两日抽吸出1ml培养基并更换为含有2x浓缩胞因子的完全培养基。收获细胞并且用PBS0.02mM HEPES洗涤残余的活检样品和空孔。使细胞悬液穿过70mm尼龙细胞滤网，以400g离心5分钟并重悬于不加额外细胞因子的完全培养基中及立即置于共培养下。在5-7天培养后使用淋巴细胞。通过Ficoll梯度从获得自献血机构的血液分离PBMC。
HEK293T共培养测定法
将5x105个经空载体(EV)、BTNL3、BTNL8或BTNL3+8转导的HEK293T细胞和2x105个新鲜收获的原代人淋巴细胞在含有完全培养基(无补充性细胞因子)的96孔板中培养并且在37℃于5％CO2温育16小时。
深度测序
对来自从分选的Vγ7+IEL中纯化的RNA的小鼠TRDV基因扩增和TCRδCDR3测序使用Amp2Seq平台(iRepertoire)进行。人TCRG Vγ基因：使用immunoSEQ平台(AdaptiveBiotechnologies)进行TCRγCDR3的扩增和测序。
可溶性γδTCR异二聚体的设计
根据Xu等人,PNAS,2011Vol.108；第2414-2419页生成以下实施例中使用的包含T细胞受体α和T细胞受体β恒定区的可溶性γδTCR异二聚体的设计。
6.10.2.1实施例1：从衍生自人肠组织的上皮内白细胞分离的γδTCR可变区赋予BTNL3/8所致的TCR活性
克隆衍生自人肠并响应于BTNL3/8的上皮内白细胞(IEL)的TCR可变区并且在TCR缺陷性细胞中表达(图2)。将IEL从人肠组织分离并且与共过量表达BTNL3/8的HEK293T细胞共培养。随后对显示出TCR激活(CD25高表达和Vγ下调)的响应性IEL进行单一细胞分选。将γ链和δ链的可变区扩增并克隆入慢病毒表达载体(图3A)。转导TCR缺陷性Jurkat细胞(J76细胞系)并且将其与表达BTNL3/8的HEK293T细胞共培养(图3B)。随后对J76细胞分选TCR激活(CD69表达和TCR下调)(图4A)。使用抗CD3抗体作为TCR激活的阳性对照。当与表达BTNL3/8细胞共培养时，表达携带Vγ4和Vδ1结构域的转导的TCR(H7 TCR)的J76细胞显示出CD69表达增加和γδTCR下调。三个用Vγ4Vδ1转导的代表图2中所示方法获得的三个不同CDR3对的独立J76系：B3、C11和H7，而不是Vγ9Vδ2系(Vγ9Vδ2)，响应于BTNL3/8表达细胞(图4B)。这些结果显示人IEL的Vγ4Vδ1结构域足以赋予TCR对BTNL3/8的反应性。
6.10.3.1实施例2：TCR对BTNL3/8的反应性需要Vγ4的CDR4
为鉴定对BTNL3/8反应性关键的Vγ4区，将H7性TCR系的整个Vγ4结构域更换为Vγ2区(图5)。在表达Vγ4TCR(H7WT)或置换Vγ2的TCR的转导的J76细胞中，当与表达BTNL3/8的HEK293T共培养时，确定CD69表达％的倍数变化(FC)和TCR下调百分数。当响应的Vγ4H7TCR的完整V区由Vγ2编码序列(Vγ2H7)替换(未替换CDR3γ和完整δ链)时，BTNL3/8表达细胞所致的TCR激活丧失。然而，当响应的Vγ4H7 TCR的CDR1(H7
CDR1Vγ2)和/或CDR2(H7 CDR2Vγ2)由Vγ2编码序列替换时，BTNL3/8表达细胞所致的TCR激活保留。这些结果表明TCR对BTNL3/8的响应需要CDR4。
为了进一步阐明Vγ4内部对响应于BTNL3/8必需的区域，将位于CDR4内部的两对氨基酸替换为Vγ2序列(图6和图7)。确定与表达BTNL3/8的HEK293T细胞共培养时，转导的细胞中CD69表达％的倍数变化(FC)和在表达Vγ4TCR(H7 WT)、具有H7 CDR3的Vγ2TCR(Vγ2H7)和在CDR4内部具有氨基酸置换的Vγ4TCR的J76细胞中的TCR下调百分数(图7)。氨基酸位置87和90处的YA替换消除了BTNL3/8表达细胞所致的TCR激活；而基酸位置置94和98处的NL替换未消除BTNL3/8表达细胞所致的TCR激活。这些结果证实，Vγ4TCR的CDR4区的位置87和90处的氨基酸是TCR对BTNL3/8的响应必不可少的。
6.10.4.1实施例3：可溶性TCR Vγ4/Vδ异二聚体与BTNL3/8表达细胞结合
将可溶性Vγ/VδTCR异二聚体表达并且通过亮氨酸拉链互补性稳定化(图8)。Vγ或Vδ结构域以符合可读框方式融合于缺少跨膜结构域的TCRα或TCRβ恒定区，后接亮氨酸拉链序列和组氨酸标签/接头。Vγ4/Vδ1异二聚体对应于SEQ ID NOs:10和9。Vγ4/Vδ2异二聚体对应于SEQ ID NOs:10和11。Vγ2/Vδ1异二聚体对应于SEQ ID NOs:12和9。Vγ8/Vδ1异二聚体对应于SEQ ID NOs:13和9。
可溶性TCRs用来染色经Flag-BTNL3+HA-BTNL8或空载体转导的HEK293T细胞(图10)。Vγ4/Vδ1可溶性TCR和Vγ4/Vδ2可溶性TCR显示与表达BTNL3+BTNL8的细胞系强烈结合，而非空载体(EV)对照。结果表明，表达Vγ4/Vδ1结构域或Vγ4/Vδ2结构域的可溶性TCR与BTNL3/8表达细胞结合，但不与缺少BTNL3/8的细胞结合。总之，结果显示，Vγ4CDR4是对BTNL3/8诱导的的TCR响应必不可少，并且还表明Vγ4CDR4与BTNL3/8相互作用。
为了进一步评价可溶性Vγ4+TCR构建体与表达BTNL3+8的细胞的结合，将HEK293T细胞用编码所示BTNL3和BTNL8构建体或空载体(EV)的pCSIGPW转导。随后将细胞用加His标签的可溶性Vγ4δ2TCR在4℃染色45分钟，洗涤两次，用APC抗His标签抗体(α-His)在4℃染色45分钟，再洗涤两次并且随后通过流式细胞术来分析(图9A)。将图9B中代表的细胞群体用抗FLAG抗体和抗HA抗体平行染色，以证实缺少可溶性TCR结合作用不是由于未能表达BTNL3+8构建体。结果展示了可溶性TCR构建体能够结合表达BTNL3+BTNL8的细胞，但不能结合先前描述的无法诱导Vγ4+T细胞响应的任一IgV-结构域突变体(例如，L3GQFSS、L3RI、L3YQKAI)。参见Melandr等人Nat.Immunol.2018，所述文献因而通过引用方式完整地并入。
6.10.5.1实施例4：与BTNL3/8-表达细胞结合的可溶性TCR内化
为了确定与表达BTNL3+BTNL8的细胞的表面结合的可溶性TCR是否内化，将被转导以表达野生型BTNL3和BTNL8的HEK293T细胞(293T.L3L8)用加His标签的可溶性Vγ4Vδ2TCR在37℃染色直至120分钟(图11B)。用加His标签的可溶性Vγ4Vδ2TCR在4℃染色120分钟的293T.L3L8细胞充当对照，因为低温阻碍内化(图11A)。随后将细胞用APCα-His标签抗体(α-His)在4℃染色45分钟。结果显示在37℃温育的细胞群体中APC信号随时间推移下降，表明细胞快速地内化可溶性TCR构建体(图12)。
为确定可溶性TCR的内化是否为特异性或是否为细胞表面BTNL分子快速循环的结果，重复该实验以比较可溶性TCR与抗BTNL3抗体(兔多克隆，Aviva Biosystems)(包括参比)。使用空载体转导的HEK293T细胞(293T.EV)作为α-BTNL3染色的阴性对照。使用BTNL3构建体L3RIL8转导的HEK293T细胞(293T.L3RIL8)作为可溶性TCR染色的阴性对照。结果显示，α-BTNL3染色在4℃和37℃相同，从而展示尽管α-BTNL3与表达BTNL3/8的细胞特异性结合，但抗体停留在细胞的表面上(图13A)。图13B中显示结果的定量。
6.10.6.1实施例5：可溶性TCR递送酬载至BTNL3/8表达细胞
为确定可以是否借助与BTNL3/8表达细胞结合的可溶性TCR胞内递送酬载，将293T.L3L8细胞或293T.L3RIL8细胞与用APCα-His标签抗体在可溶性TCR构建体的羧基末端上预标记的可溶性TCR温育。将3或10μg/mL复合物在4℃或37℃温育1小时。随后如图14中所述，将细胞洗涤并用胰蛋白酶或DMEM(对照)处理15分钟。结果显示，与4℃相比，将细胞与在37℃复合物温育并且通过内化该复合物保护细胞免遭胰蛋白酶作用时，可溶性TCR+α-His信号(APC荧光)的分数在胰蛋白酶处理后更大(图15A)。因此，结果表明，可以使用可溶性TCR内化作为胞内递送酬载至BTNL3/8表达细胞的手段。图15B中显示定量结果。
Image Cytometry用来可视化可溶性TCR介导的APCα-His抗体酬载胞内递送。将293T.L3RIL8细胞或293T.L3L8细胞在4℃或37℃与可溶性TCR+α-His抗体复合物温育1小时。用DMEM或胰蛋白酶处理(如先前所述那样)后，将细胞固定并打孔(图16A)或固定、打孔并用晚期内体标志物CD107a染色(图16B和16C)。阴性对照的Image Cytometry允许评估背景APC信号(图16A)。与TCR+α-His抗体复合物温育的细胞的Image Cytometry结果显示，在4℃与细胞温育时，复合物大多与细胞表面结合，因为复合物可以在DMEM处理后于细胞周围可视化，而在胰蛋白酶处理后，信号完全丧失(图16B)。然而，胰蛋白酶处理后，在临近于CD107a+区室的胞内区域里检出在37℃与细胞温育的复合物(图16C)
6.11.序列表
>人Vγ4氨基酸87-90[SEQ ID NO:1]
DTYG
>小鼠Vγ7氨基酸87-90[SEQ ID NO:2]
HVYE
>人Vγ4结构域CDR4氨基酸85-100[SEQ ID NO:3]
KYDTYGSTRKNLRMIL
>小鼠Vγ7结构域CDR4氨基酸85-100[SEQ ID NO:4]
KYHVYEGPDKRYKFVL
>人Vγ2结构域CDR4氨基酸85-100[SEQ ID NO:5]
KYYTYASTRNNLRLIL
>人Vγ4氨基酸19-118[SEQ ID NO:6]
SSNLEGRTKSVIRQTGSSAEITCDLAEGSTGYIHWYLHQEGKAPQRLLYYDSYTSSVVLESGISPGKYDTYGSTRKNLRMILRNLIENDSGVYYCATWDG
人Vγ2氨基酸19-118[SEQ ID NO:7]
SSNLEGRTKSVIRQTGSSAEITCDLAEGSNGYIHWYLHQEGKAPQRLQYYDSYNSKVVLESGVSPGKYYTYASTRNNLRLILRNLIENDSGVYYCATWDG
>小鼠Vγ7氨基酸19-118[SEQ ID NO:8]
SSNLEERIMSITKLEGSSAIMTCDTHR-TGTYIHWYRFQKGRAPEHLLYYNFVSSTTVVDSRFNSEKYHVYEGPDKRYKFVLRNVEESDSALYYCASWA-
>与TCRα恒定区、亮氨酸拉链和C端His标签按符合可读框方式融合的人Vδ1连同来自晶体结构30MZ的CDR3[SEQ ID NO:9]
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGESLTRADKLIFGKGTRVTVEPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCTTAPSAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQGSGHHHHHH
>与TCRβ恒定区、亮氨酸拉链融合的人Vγ4连同来自晶体结构4MNH的CDR3[SEQ IDNO:10]
SSNLEGRTKSVIRQTGSSAEITCDLAEGSTGYIHWYLHQEGKAPQRLLYYDSYTSSVVLESGISPGKYDTYGSTRKNLRMILRNLIENDSGVYYCATWDEKYYKKLFGSGTTLVVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCTTAPSAQLEKELQALEKENAQLE
>与TCRα恒定区、亮氨酸拉链和C端His标签按符合可读框方式融合的人Vδ2连同来自晶体结构30MZ的CDR3[SEQ ID NO:11]
AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTITFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCALGESLTRADKLIFGKGTRVTVEPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCTTAPSAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQGSGHHHHHH
>与TCRβ恒定区、亮氨酸拉链融合的人Vγ2连同来自晶体结构4MNH的CDR3[SEQ IDNO:12]
SSNLEGRTKSVIRQTGSSAEITCDLAEGSNGYIHWYLHQEGKAPQRLQYYDSYNSKVVLESGVSPGKYYTYASTRNNLRLILRNLIENDSGVYYCATWDEKYYKKLFGSGTTLVVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCTTAPSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQ
>与TCRβ恒定区、亮氨酸拉链融合的人Vγ8连同来自晶体结构4MNH的CDR3[SEQ IDNO:13]
SSNLEGRTKSVTRPTGSSAVITCDLPVENAVYTHWYLHQEGKAPQRLLYYDSYNSRVVLESGISREKYHTYASTGKSLKFILENLIERDSGVYYCATWDEKYYKKLFGSGTTLVVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCTTAPSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQ
>人Vγ4的前导序列[SEQ ID NO:14]
MAWALAVLLAFLSPASQK
>人VγJ区，TRFJP[SEQ ID NO:15]
GQELGKKIKVFGPGTKLIIT
>人VγJ区，TRFJP1[SEQ ID NO:16]
GQELGKKIKVFGPGTKLIIT
>人VγJ区，TRFJP2[SEQ ID NO:17]
SSDWIKTFAKGTRLIVTSP
>人VγJ区，TRFJP1/2[SEQ ID NO:18]
NYYKKLFGSGTTLVVT
7.通过引用方式并入
本申请中引用的所有出版物、专利和专利申请在此为了所有目的以相同的程度以其整体引入作为参考，就如同每一单个出版物、专利、专利申请或其他文件被单独地说明为了所有目的引入作为参考一样。
8.等同物
尽管已经说明并描述了本发明的多种具体实施方案，但是以上说明书并无限制性。应理解，可以做出多种变化而不背离本发明的精神和范围。当查看本说明书时，本领域技术人员将显而易见许多变型。
Claims (134)
1.一种蛋白质构建体，包含：
BTNL3/8导引部分；
酬载；和
将导引部分与酬载连接的任选性接头。
2.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，
其中BTNL3/8导引部分包含Vγ结构域，
其中在Vγ结构域的序列位置编号87的氨基酸是天冬氨酸或组氨酸，并且在Vγ结构域的序列位置编号90的氨基酸是甘氨酸或谷氨酸，并且
其中VγCDR4的剩余残基在每个位置处都独立地选自人或鼠Vγ结构域的相应残基。
3.根据权利要求2所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域CDR4的剩余残基在每个残基位置处都独立地选自人Vγ4、人Vγ2或小鼠Vγ7的相应残基。
4.根据权利要求2所述的蛋白质构建体，其中在Vγ结构域的位置编号87-90处的氨基酸序列是SEQ ID NO:1。
5.根据权利要求2所述的蛋白质构建体，其中在Vγ结构域的位置编号87-90处的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
6.根据权利要求3所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域CDR4的剩余残基均选自人Vγ4、人Vγ2或小鼠Vγ7的相应残基。
7.根据权利要求6所述的蛋白质构建体，其中VγCDR4的剩余残基选自人Vγ4的相应残基。
8.根据权利要求6所述的蛋白质构建体，其中VγCDR4的剩余残基选自人Vγ2的相应残基。
9.根据权利要求6所述的蛋白质构建体，其中VγCDR4的剩余残基选自小鼠Vγ7的相应残基。
10.根据权利要求2所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域是其中CDR4氨基酸经氨基酸序列位置编号87处用天冬氨酸或组氨酸置换并经氨基酸序列位置编号90处用甘氨酸或谷氨酸置换的人Vγ2结构域。
11.根据权利要求2所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域是人Vγ4结构域。
12.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域CDR3是人或小鼠VγCDR3序列。
13.根据权利要求12所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域CDR3包含人Vγ4CDR3序列。
14.根据权利要求12所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域CDR3包含人Vγ2CDR3序列。
15.根据权利要求12所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域CDR3包含小鼠Vγ7CDR3序列。
16.根据权利要求2-15中任一项所述的蛋白质构建体，其中J区是VγJ区。
17.根据权利要求16所述的蛋白质构建体，其中J区是人VγJ区。
18.根据权利要求16所述的蛋白质构建体，其中J区是小鼠VγJ区。
19.根据权利要求16所述的蛋白质构建体，其中J区包含选自SEQ ID NOs:15-18的SEQID NO。
20.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质构建体，其中BTNL3/8导引部分还包含配对的Vδ结构域。
21.根据权利要求20所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域和Vδ结构域由至少一个二硫键共价连接。
22.根据权利要求21所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域和Vδ结构域借助特异性异二聚体相互作用配对。
23.根据权利要求22所述的蛋白质构建体，其中异二聚体相互作用是亮氨酸拉链互补性。
24.根据权利要求23所述的蛋白质构建体，其中导引部分包含SEQ ID NO:9。
25.根据权利要求23所述的蛋白质构建体，其中导引部分是SEQ ID NO:10。
26.根据权利要求23所述的蛋白质构建体，其中导引部分是SEQ ID NO:11。
27.根据权利要求20所述的蛋白质构建体，其中导引部分包含Vγ结构域和Vδ结构域的单链符合可读框融合物。
28.根据权利要求27所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域位于Vδ结构域的N末端。
29.根据权利要求27所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域位于Vδ结构域的C末端。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的蛋白质构建体，其中Vγ结构域和Vδ结构域的单链符合可读框融合物包含内部接头序列。
31.根据权利要求20-24或27-30中任一项所述的蛋白质构建体，其中Vδ结构域是人Vδ结构域。
32.根据权利要求31所述的蛋白质构建体，其中人Vδ结构域是Vδ1、Vδ2或Vδ5。
33.根据权利要求32所述的蛋白质构建体，其中人Vδ结构域是Vδ1。
34.根据权利要求2-33中任一项所述的蛋白质构建体，还包含：
第一T细胞受体恒定区，
其中第一T细胞受体恒定区以符合可读框方式融合于Vγ结构域的C末端。
35.根据权利要求34所述的蛋白质构建体，其中第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体恒定区。
36.根据权利要求35所述的蛋白质构建体，其中第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体β恒定区。
37.根据权利要求35所述的蛋白质构建体，其中第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体α恒定区。
38.根据权利要求35所述的蛋白质构建体，其中第一T细胞受体恒定区是人T细胞受体γ恒定区。
39.根据权利要求20-38中任一项所述的蛋白质构建体，其中导引部分还包含第二T细胞受体恒定区
其中第二T细胞受体恒定区以符合可读框方式融合于配对的Vδ结构域的C末端。
40.根据权利要求39所述的蛋白质构建体，其中第二T细胞受体恒定区是人T细胞受体α恒定区。
41.根据权利要求39所述的蛋白质构建体，其中第二T细胞受体恒定区是人T细胞受体β恒定区。
42.根据权利要求39所述的蛋白质构建体，其中第二T细胞受体恒定区是人T细胞受体δ恒定区。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的蛋白质构建体，其中Vδ结构域和第二T细胞受体恒定区的符合可读框融合物在Vδ结构域和第二T细胞受体恒定区之间的包含内部接头序列。
44.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质构建体，其中酬载是以符合可读框方式与导引部分融合的蛋白质酬载。
45.根据权利要求44所述的蛋白质构建体，其中酬载是多肽。
46.根据权利要求45所述的蛋白质构建体，其中酬载是肽。
47.根据权利要求45所述的蛋白质构建体，其中酬载是细胞因子。
48.根据权利要求45所述的蛋白质构建体，其中酬载是抗体。
49.根据权利要求48所述的蛋白质构建体，其中酬载是单链可变片段(scFv)。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的蛋白质构建体，其中抗体至少包含对细胞因子抗原特异的抗原结合位点(ABS)。
51.根据权利要求47-49中任一项所述的蛋白质构建体，其中抗体至少包含对肿瘤坏死因子α(TNFα)抗原特异的ABS。
52.根据权利要求47–或49-51中任一项所述的蛋白质构建体，其中抗体包含能够与Fc受体相互作用的Fc结构域。
53.根据权利要求47或48-51中任一项所述的蛋白质构建体，其中其中抗体包含不能够与Fc受体相互作用的Fc结构域。
54.根据权利要求1-42中任一项所述的蛋白质构建体，其中酬载是小分子。
55.根据权利要求54所述的蛋白质构建体，其中酬载是激素。
56.根据权利要求54所述的蛋白质构建体，其中酬载是核酸。
57.根据权利要求56所述的蛋白质构建体，其中酬载是抑制性RNA(RNAi)。
58.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质构建体，其中任选性接头是以符合可读框方式与导引部分融合的肽。
59.根据权利要求58所述的蛋白质构建体，其中任选性接头以符合可读框方式融合于导引部分的C末端。
60.根据权利要求58所述的蛋白质构建体，其中任选性接头以符合可读框方式融合于导引部分的N末端。
61.根据权利要求1-57中任一项所述的蛋白质构建体，其中任选性接头是与导引部分缀合的分子。
62.药物组合物，包含根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质构建体和可药用载体。
63.根据权利要求62所述的药物组合物，其中药物组合物适于肠胃外施用。
64.根据权利要求63所述的药物组合物，其中施用是静脉内施用。
65.根据权利要求63所述的药物组合物，其中施用是肌内施用。
66.根据权利要求63所述的药物组合物，其中施用是皮下施用。
67.治疗其中胃肠道组织表达BTNL3/8的胃肠系统病状的方法，包括：
向患有其中胃肠道组织表达BTNL3/8的疾病的患者施用治疗有效量的根据权利要求62-66中任一项所述的药物组合物。
68.根据权利要求67所述的方法，其中蛋白质构建体的酬载是抗炎药。
69.根据权利要求68所述的方法，其中抗炎药是氨基水杨酸盐。
70.根据权利要求68所述的方法，其中抗炎药是非甾体类抗炎药。
71.根据权利要求68所述的方法，其中抗炎药是抗炎细胞因子，任选地白介素10(IL-10)、白介素22(IL-22)或转化生长因子β(TGFβ)。
72.根据权利要求68所述的方法，其中抗炎药是抗促炎药。
73.根据权利要求68所述的方法，其中抗炎药是类固醇。
74.根据权利要求73所述的方法，其中类固醇是糖皮质激素。
75.根据权利要求74所述的方法，其中糖皮质激素是泼尼松。
76.根据权利要求74所述的方法，其中糖皮质激素是氢化可的松。
77.根据权利要求67所述的方法，其中酬载是免疫调节剂。
78.治疗炎性肠病的方法，包括：
向患有炎性肠病的患者施用治疗有效量的根据权利要求62-66中任一项所述的药物组合物。
79.根据权利要求78所述的方法，其中炎性肠病是溃疡性结肠炎。
80.根据权利要求78所述的方法，其中炎性肠病是Crohn病。
81.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中蛋白质构建体的酬载是抗炎药。
82.根据权利要求81所述的方法，其中抗炎药是氨基水杨酸盐。
83.根据权利要求81所述的方法，其中抗炎药是非甾体抗炎药。
84.根据权利要求81所述的方法，其中抗炎药是抗炎细胞因子。
85.根据权利要求81所述的方法，其中抗炎药酬载是抗促炎药。
86.根据权利要求81所述的方法，其中抗炎药酬载是类固醇。
87.根据权利要求86所述的方法，其中类固醇是糖皮质激素。
88.根据权利要求87所述的方法，其中糖皮质激素是泼尼松。
89.根据权利要求87所述的方法，其中糖皮质激素是氢化可的松。
90.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中蛋白质构建体的酬载是抗生素。
91.根据权利要求90所述的方法，其中抗生素酬载是利福昔明、环丙沙星、甲硝唑、莫西沙星或阿莫西林。
92.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中蛋白质构建体的酬载是钙调神经磷酸酶抑制剂。
93.根据权利要求92所述的方法，其中钙调神经磷酸酶抑制剂是环孢菌素A或他克莫司。
94.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中蛋白质构建体的酬载是免疫调节剂。
95.根据权利要求94所述的方法，其中免疫调节剂是免疫抑制因子。
96.根据权利要求95所述的方法，其中免疫抑制因子是硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤或硫嘌呤。
97.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中蛋白质构建体的酬载是蛋白质酬载。
98.根据权利要求97所述的方法，其中蛋白质酬载是抗体、抗体片段或单链可变片段。
99.根据权利要求97或98所述的方法，其中蛋白质酬载至少包含对TNFα抗原特异的ABS。
100.根据权利要求99所述的方法，其中蛋白质酬载包含阿达木单抗、英夫利西单抗或赛妥珠单抗的互补性决定区(CDR)。
101.根据权利要求97或98所述的方法，其中蛋白质酬载至少包含对白介素抗原特异的ABS。
102.根据权利要求101所述的方法，其中白介素是IL-12、IL-23或其组合。
103.根据权利要求102所述的方法，其中蛋白质酬载包含优特克单抗或brikinumab的CDR。
104.根据权利要求97或98所述的方法，其中生物制品酬载至少包含对整联蛋白抗原特异的ABS。
105.根据权利要求104所述的方法，其中整联蛋白是α4整联蛋白。
106.根据权利要求105所述的方法，其中蛋白质酬载包含英夫利西单抗、那他珠单抗或维多珠单抗的CDR。
107.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中蛋白质构建体包含镇痛药酬载。
108.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中蛋白质构建体包含膳食补充剂酬载。
109.治疗肠激惹综合征的方法，包括：
向患有肠激惹综合征的患者施用治疗有效量的根据权利要求62-66中任一项所述的药物组合物。
110.治疗憩室炎的方法，包括：
向患有憩室炎患者施用治疗有效量的根据权利要求1-66中任一项所述的药物组合物。
111.根据权利要求109或110所述的方法，其中酬载是抗生素。
112.根据权利要求111所述的方法，其中抗生素酬载是利福昔明、环丙沙星、甲硝唑、莫西沙星或阿莫西林。
113.治疗乳糜泻(celiac disease)的方法，包括：
向患有乳糜泻的患者施用治疗有效量的根据权利要求62-66中任一项所述的药物组合物。
114.根据权利要求113所述的方法，其中酬载是免疫抑制因子。
115.根据权利要求114所述的方法，其中免疫抑制因子是硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤或硫嘌呤。
116.治疗微生物感染的方法，包括：
向患有微生物感染患者施用治疗有效量的根据权利要求62-66中任一项所述的药物组合物。
117.根据权利要求116所述的方法，其中酬载是抗微生物药。
118.根据权利要求117所述的方法，其中抗微生物药是抗寄生虫药、抗生素、抗真菌药或抗病毒药。
119.治疗代谢疾病或代谢缺乏症的方法，包括：
向患有代谢疾病或代谢缺乏症患者施用治疗有效量的根据权利要求62-66中任一项所述的药物组合物。
120.根据权利要求119所述的方法，其中酬载是膳食补充剂。
121.根据权利要求120所述的方法，其中膳食补充剂是酶或维生素。
122.调节免疫系统的方法，包括：
向患有免疫相关病状患者施用治疗有效量的根据权利要求62-66中任一项所述的药物组合物。
123.根据权利要求122所述的方法，其中酬载是免疫抑制因子。
124.根据权利要求123所述的方法，其中免疫抑制因子是硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤或硫嘌呤。
125.根据权利要求122所述的方法，其中酬载是免疫刺激剂。
126.根据权利要求125所述的方法，其中免疫刺激剂是细胞因子。
127.根据权利要求67-126中任一项所述的方法，其中至少一部分的BTNL3/8导引部分和/或酬载内化于细胞中。
128.根据权利要求67-126中任一项所述的方法，其中BTNL3/8导引部分和/或酬载不内化于细胞中。
129.重组γδTCR蛋白质，包含：
至少一个序列，所述序列与来自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:13组成的组的序列具有至少90％序列同一性。
130.根据权利要求129所述的重组γδTCR蛋白质，其中蛋白质包含两个或更多个序列，所述序列与来自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:13组成的组的序列具有至少90％序列同一性。
131.根据权利要求129-130中任一项所述的重组γδTCR蛋白质，其中蛋白质包含与SEQID NO:10具有至少90％序列同一性的序列。
132.根据权利要求129-131中任一项所述的重组γδTCR蛋白质，其中蛋白质包含与SEQID NO:10和SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的序列。
133.根据权利要求129-131中任一项所述的重组γδTCR蛋白质，其中蛋白质包含与SEQID NO:9和SEQ ID NO:10具有至少90％序列同一性的序列。
134.根据权利要求129-133中任一项所述的重组γδTCR蛋白质，其中蛋白质包含与无His标签的SEQ ID NO:9或无His标签的SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性的序列。
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