JP2019510741A - 細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための効率的なプロセス - Google Patents
細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための効率的なプロセス Download PDFInfo
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Abstract
本発明は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製する新規の方法を提供する。該方法は、イオン強度が高い緩衝溶液の存在下で4〜9の間のpHにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含み、その際、細胞結合剤は、アミン反応基を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物との共有結合を形成するリシンε−NH2基を含む。本明細書に記載されている方法に従って調製される細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートも本発明に含まれる。【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、図面、式、明細書及びクレームすべてを含むそのそれぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる2016年2月5日に出願された米国仮特許出願番号62/292,018の米国特許法第119条(e)のもとでの出願日の利益を主張する。
本出願は、図面、式、明細書及びクレームすべてを含むそのそれぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる2016年2月5日に出願された米国仮特許出願番号62/292,018の米国特許法第119条(e)のもとでの出願日の利益を主張する。
インドリノベンゾジアゼピン二量体化合物の抗体・薬剤コンジュゲート(ADC)は生体内で高い効能及び/または高い治療指標(最大耐性用量の最小有効用量に対する比)を有することが示されている。インドリノベンゾジアゼピン二量体化合物は一般に疎水性であり、コンジュゲート反応の間での抗体の安定性に影響を及ぼし得る。特定の状況下で、コンジュゲート反応は非常に少ない反応収率を有し、それはADCの大規模製造にとって望ましくない。
前述のことを考慮して、大規模製造に好適である細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための効率的なプロセスを開発する満たされないニーズがある。
本発明は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製するための新規で且つ効率的な方法を提供する。
一実施形態では、本発明の方法は、イオン強度が高い緩衝溶液の存在下で4〜9の間のpHにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基(たとえば、アミン反応基)を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
別の実施形態では、本発明の方法は、7.3〜8.4のpHを有する緩衝溶液にて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基(たとえば、アミン反応基)を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、高濃度の緩衝溶液の存在下で4〜9の間のpHにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基(たとえば、アミン反応基)を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
驚くべきことに、インドリノベンゾジアゼピン二量体化合物と抗体とのコンジュゲート反応は7.3〜8.4の間のpHでのイオン強度の高い緩衝溶液にて行われ、コンジュゲート反応がさらに高いpHで低いイオン強度を有する緩衝溶液で行われる場合に比べてコンジュゲート反応が有意にさらに効率的であることが見いだされている。本発明の方法は、高い純度及び/または安定性を伴う細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを提供する。
本発明はまた本明細書に記載されている方法を用いて調製される細胞結合剤細胞毒性剤コンジュゲートも対象とする。
本発明は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製する新規の方法を提供する。
第1の実施形態では、本発明の方法は、イオン強度が高い緩衝溶液の存在下で4〜9の間のpHにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基(たとえば、アミン反応基)を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
本明細書で使用されるとき、溶液の「イオン強度」は溶液におけるイオンの濃度である。それは溶液に存在するイオンすべての濃度の関数である。イオン強度(I)は以下の方程式:
を用いて算出することができ、Ciは溶液に存在するイオンiのモル濃度であり、ziはその電荷数であり、合計は溶液におけるイオンすべてについて計算される。溶液のカチオン及びアニオンがそれぞれ+1及び−1の電荷を運ぶ場合、イオン強度は溶液の濃度に等しい。
一実施形態では、緩衝溶液のイオン強度は20mM〜500mMの間、好ましくは20mM〜200mMの間、25mM〜150mMの間、50mM〜150mMの間、50mM〜100mMの間、または100mM〜200mMの間である。別の実施形態では、緩衝溶液のイオン強度は60mM〜90mMの間、または70mM〜80mMの間である。さらに別の実施形態では、緩衝溶液のイオン強度は75mMである。別の実施形態では、緩衝溶液のイオン強度は100mM〜160mMまたは120mM〜140mMの間である。さらに別の実施形態では、緩衝溶液のイオン強度は130mMである。
別の実施形態では、緩衝溶液のpHは7.1〜8.7の間、好ましくは7.3〜8.7の間、7.1〜8.5の間、7.3〜8.4の間、7.6〜8.4の間、7.7〜8.3の間、7.8〜8.2の間である。一実施形態では、緩衝溶液のpHは7.9〜8.1の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のpHは8.0である。一実施形態では、緩衝溶液のpHは8.5〜8.9の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のpHは8.6〜8.8の間である。さらに別の実施形態では、緩衝溶液のpHは8.7である。
第2の実施形態では、本発明の方法は、7.3〜9.0のpHを有する緩衝溶液にて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基(たとえば、アミン反応基)を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
一実施形態では、緩衝溶液のpHは7.3〜8.4の間、7.6〜8.4の間、7.7〜8.3の間、または7.8〜8.2の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のpHは7.9〜8.1の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のpHは8.0である。一実施形態では、緩衝溶液のpHは8.5〜8.9の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のpHは8.6〜8.8の間である。さらに別の実施形態では、緩衝溶液のpHは8.7である。
第1の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は20mM〜200mMの間のイオン強度及び7.1〜8.5の間のpHを有する。
第2の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は50mM〜150mMの間のイオン強度及び7.6〜8.4の間のpHを有する。
第3の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は50mM〜100mMの間のイオン強度及び7.7〜8.3の間のpHを有する。
第4の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は60mM〜90mMの間のイオン強度及び7.8〜8.2の間のpHを有する。
第5の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は70mM〜80mMの間のイオン強度及び7.9〜8.1の間のpHを有する。
第6の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は75mMのイオン強度及び8.0のpHを有する。
第7の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は50mM〜200mMの間のイオン強度及び7.8〜8.9の間のpHを有する。
第8の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は110mM〜150mMの間のイオン強度及び8.5〜8.9の間のpHを有する。
第9の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は120mM〜140mMの間のイオン強度及び8.6〜8.8の間のpHを有する。
第10の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は130mMのイオン強度及び8.7のpHを有する。
当該技術で既知の好適な緩衝溶液を本発明の方法で使用することができる。好適な緩衝溶液には、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液及びリン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
第11の具体的な実施形態では、第1もしくは第2の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9もしくは第10の具体的な実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は、MES((2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸))緩衝液、ビス−トリスメタン(2−[ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオール)緩衝液、ADA(N−(2−アセトアミド)イミノジ酢酸)緩衝液、ACES(N−−2−アミノエタンスルホン酸)緩衝液、PIPES(ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸))、MOPSO(β−ヒドロキシ−4−モルフォリンプロパンスルホン酸)緩衝液、ビス−トリスプロパン(1,3−ビス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)プロパン)緩衝液、BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸)、TES(N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−アミノエタンスルホン酸)緩衝液、HEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸)緩衝液、DIPSO、(3−(N,N−ビス[2−ヒドロキシエチル]アミノ)−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸またはN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)、MOBS(4−(N−モルフォリノ)ブタンスルホン酸)緩衝液、TAPSO(3−[[1,3−ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−2−イル]アミノ]−2−ヒドロキシプロパン−1−スルホン酸)緩衝液、トリズマ(トリスまたは2−アミノ−2−(ヒドロキシメチル)−1,3−プロパンジオール)緩衝液、HEPPSO(N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸))緩衝液、POPSO(ピペラジン−1,4−ビス−(2−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸)無水物)緩衝液、EPPS(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−プロパンスルホン酸)緩衝液、トリシン(N−(2−ヒドロキシ−1,1−ビス(ヒドロキシメチル)エチル)グリシン)緩衝液、gly−gly、ビシン(2−(ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ)酢酸)緩衝液、HEPBS(N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(4−ブタンスルホン酸))緩衝液、TAPS(3−[[1,3−ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−2−イル]アミノ]プロパン−1−スルホン酸)緩衝液、AMPD(2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール)緩衝液、TABS(N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−4−アミノブタンスルホン酸)緩衝液、AMPSO(N−(1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル)−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)緩衝液、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。一実施形態では、緩衝液は、HEPPSO(N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸))緩衝液、POPSO(ピペラジン−1,4−ビス−(2−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸)無水物)緩衝液、HEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸)緩衝液、EPPS(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−プロパンスルホン酸)緩衝液、TES(N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−アミノエタンスルホン酸)緩衝液、MES(2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸)緩衝液、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
第12の具体的な実施形態では、第1もしくは第2の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9もしくは第10の具体的な実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液はEPPS緩衝液である。好まれる実施形態では、緩衝溶液は75mMのEPPS緩衝液である。
第13の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は7.8〜8.9の間のpHを有する50mM〜200mMのEPPS緩衝液である。
第14の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は7.8〜8.2の間のpHを有する60mM〜90mMのEPPS緩衝液である。
第15の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は7.9〜8.1の間のpHを有する70mM〜80mMのEPPS緩衝液である。
第16の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は8.0のpHを有する75mMのEPPS緩衝液である。
第17の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は8.5〜8.9の間のpHを有する110mM〜150mMのEPPS緩衝液である。
第18の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は8.6〜8.8の間のpHを有する120mM〜140mMのEPPS緩衝液である。
第19の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は8.7のpHを有する130mMのEPPS緩衝液である。
第3の実施形態では、本発明の方法は、高濃度の緩衝液の存在下で4〜9の間のpHにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基(たとえば、アミン反応基)を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含む。
一実施形態では、緩衝液の濃度は20mM〜750mMの間である。別の実施形態では、緩衝液の濃度は20mM〜500mMの間、20mM〜200mMの間、25mM〜150mMの間、50mM〜150mMの間、50mM〜100mMの間、100mM〜200mMの間、または100mM〜150mMの間である。
一実施形態では、緩衝溶液のpHは、7.3〜8.9の間、7.3〜8.4の間、7.6〜8.4の間、7.7〜8.3の間、または7.8〜8.2の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のpHは7.9〜8.1の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のpHは8.0である。一実施形態では、緩衝溶液のpHは8.5〜8.9の間である。別の実施形態では、緩衝溶液のpHは8.6〜8.8の間である。さらに別の実施形態では、緩衝溶液のpHは8.7である。
第20の具体的な実施形態では、第3の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は20mM〜200mMの間の濃度及び7.1〜8.5の間のpHを有する。
第21の具体的な実施形態では、第3の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は50mM〜150mMの間の濃度及び7.6〜8.4の間のpHを有する。
第22の具体的な実施形態では、第1または第2の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は50mM〜100mMの間の濃度及び7.7〜8.3の間のpHを有する。
第23の具体的な実施形態では、第3の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は60mM〜90mMの間の濃度及び7.8〜8.2の間のpHを有する。
第24の具体的な実施形態では、第3の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は70mM〜80mMの間の濃度及び7.9〜8.1の間のpHを有する。
第25の具体的な実施形態では、第3の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は75mMの濃度及び8.0のpHを有する。
第26の具体的な実施形態では、第3の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は50mM〜200mMの間の濃度及び7.8〜8.9の間のpHを有する。
第27の具体的な実施形態では、第3の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は110mM〜150mMの間の濃度及び8.5〜8.9の間のpHを有する。
第28の具体的な実施形態では、第3の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は120mM〜140mMの間の濃度及び8.6〜8.8の間のpHを有する。
第29の具体的な実施形態では、第3の実施形態に記載されている方法については、緩衝溶液は130mMの濃度及び8.7のpHを有する。
一実施形態では、本発明の方法で使用される緩衝溶液はさらに不活性の塩を含んで緩衝液のイオン強度を維持してもよい。一実施形態では、緩衝溶液はさらに塩化ナトリウムを含む。
一実施形態では、上記に記載されている本発明の方法については、細胞結合剤と細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物との間の反応は少量の有機溶媒の存在下で実施される。さらに具体的には、有機溶媒はジメチルアセトアミド(DMA)である。有機溶媒(たとえば、DMA)は緩衝溶液と有機溶媒の総体積の1体積%〜20体積%、1〜15体積%、2〜15体積%、5〜15体積%、8〜12体積%または10〜20体積%の量で存在することができる。一実施形態では、有機溶媒(たとえば、DMA)は緩衝溶液と有機溶媒の総体積の10体積%の量で存在する。別の実施形態では、有機溶媒(たとえば、DMA)は緩衝溶液と有機溶媒の総体積の15体積%の量で存在する。
一実施形態では、上記に記載されている本発明の方法については、反応を、2分間〜1週間、1時間〜48時間、1時間〜36時間、1時間〜24時間、1時間〜12時間、1時間〜8時間、5時間〜15時間、6時間〜14時間、4時間〜8時間、5時間〜7時間、1時間〜5時間、1時間〜4時間、1時間〜2時間、30分間〜2時間、5分間〜30分間、または2時間〜5時間進行させる。一実施形態では、反応を2時間〜6時間または3時間〜5時間進行させる。一実施形態では、反応を1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間
、13時間、14時間、15時間、等進行させる。別の実施形態では、反応を4時間進行させる。
、13時間、14時間、15時間、等進行させる。別の実施形態では、反応を4時間進行させる。
細胞結合剤と細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物との間の反応は好適な温度で実施することができる。一実施形態では、反応は10℃〜50℃、10℃〜40℃または10℃〜30℃の温度で実施することができる。別の実施形態では、反応は、15℃〜30℃、20℃〜30℃、15℃〜25℃、16℃〜24℃、17℃〜23℃、18℃〜22℃または19℃〜21℃の温度で実施することができる。別の実施形態では、反応は15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃または25℃で実施することができる。
細胞結合剤と細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物との間のコンジュゲート反応から形成されるコンジュゲートは、保存の際、またはコンジュゲート反応の完了と精製工程の間の時間中に、高分子量種を形成する傾向を有してもよい。高分子量種の形成を軽減するには、コンジュゲート反応の後に反応停止溶液を加えてコンジュゲートを安定化してもよい。
第30の具体的な実施形態では、第1、第2または第3の上記実施形態に(たとえば、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29の具体的な実施形態に)記載されている方法はさらに、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物の細胞結合剤との反応の後、イオン強度の高い反応停止溶液を添加する工程を含む。
別途第30の具体的な実施形態で提供されるように、方法はさらに細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物の細胞結合剤との反応の後、高い濃度の緩衝液を含む反応停止溶液を添加する工程を含む。
一実施形態では、反応停止溶液は、200mM〜3000mMの間、200mM〜2000mMの間、200mM〜1000mMの間、500mM〜1000mM、550mM〜1000mMの間、または600mM〜1000mMの間のイオン強度を有する。別の実施形態では、反応停止溶液は700mM〜1000mMの間のイオン強度を有する。別の実施形態では、反応停止溶液は900mMのイオン強度を有する。
別の実施形態では、反応停止溶液は、200mM〜3000mMの間、200mM〜2000mMの間、200mM〜1000mMの間、500mM〜1000mM、550mM〜1000mMの間、または600mM〜1000mMの間の濃度の緩衝液を含む。別の実施形態では、反応停止溶液は700mM〜1000mMの間の濃度の緩衝液を有する。別の実施形態では、反応停止溶液は750mMの濃度の緩衝液を有する。
別の実施形態では、反応停止溶液は細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物の細胞結合剤との反応の後、反応混合物と混合されたが、混合に続いて、緩衝液の最終濃度は150mM〜750mMの間、150mM〜600mMの間、200mM〜500nMの間、200mM〜400nMの間、250mM〜350mMの間である。
一部の実施形態では、反応停止溶液における緩衝液は、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物の細胞結合剤とのコンジュゲート反応で使用される緩衝液と同一である。
本明細書に記載されている反応停止溶液は緩衝液、塩またはそれらの組み合わせを含むことができる。任意の好適な緩衝液または塩を使用することができる。例となる緩衝液には、MES((2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸))緩衝液、ビス−トリスメタン(2−[ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオール)緩衝液、ADA(N−(2−アセトアミド)イミノジ酢酸)緩衝液、ACES(N−−2−アミノエタンスルホン酸)緩衝液、PIPES(ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸))、MOPSO(β−ヒドロキシ−4−モルフォリンプロパンスルホン酸)緩衝液、ビス−トリスプロパン(1,3−ビス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)プロパン)緩衝液、BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸)TES(N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−アミノエタンスルホン酸)緩衝液、HEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸)緩衝液、DIPSO、(3−(N,N−ビス[2−ヒドロキシエチル]アミノ)−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸またはN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)、MOBS(4−(N−モルフォリノ)ブタンスルホン酸)緩衝液、TAPSO(3−[[1,3−ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−2−イル]アミノ]−2−ヒドロキシプロパン−1−スルホン酸)緩衝液、トリズマ(トリスまたは2−アミノ−2−(ヒドロキシメチル)−1,3−プロパンジオール)緩衝液、HEPPSO(N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸))緩衝液、POPSO(ピペラジン−1,4−ビス−(2−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸)無水物)緩衝液、EPPS(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−プロパンスルホン酸)緩衝液、トリシン(N−(2−ヒドロキシ−1,1−ビス(ヒドロキシメチル)エチル)グリシン)緩衝液、gly−gly、ビシン(2−(ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ)酢酸)緩衝液、HEPBS(N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(4−ブタンスルホン酸))緩衝液、TAPS(3−[[1,3−ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−2−イル]アミノ]プロパン−1−スルホン酸)緩衝液、AMPD(2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール)緩衝液、TABS(N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−4−アミノブタンスルホン酸)緩衝液、AMPSO(N−(1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル)−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)緩衝液、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、緩衝液は、HEPPSO(N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸))緩衝液、POPSO(ピペラジン−1,4−ビス−(2−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸)無水物)緩衝液、HEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸)緩衝液、EPPS(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−プロパンスルホン酸)緩衝液、TES(N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−アミノエタンスルホン酸)緩衝液、MES(2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸)緩衝液、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。例となる塩には、NaCl、KCl及びヒスチジン塩酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、反応停止溶液はEPPSを含む。別の実施形態では、反応停止溶液はEPPS及びヒスチジン塩酸塩を含む。
一実施形態では、反応停止溶液は5〜9の間、5〜7の間または5〜6の間のpHを有する。別の実施形態では、反応停止溶液は5.5のpHを有する。
一実施形態では、反応混合物と混合する前の反応停止溶液は750mMのEPPS及び150mMのヒスチジン塩酸塩を含む。
一実施形態では、反応停止溶液はEPPS及びヒスチジン塩酸塩を含み、反応停止溶液を反応混合物と混合することに続いて、得られる混合物は200mM〜400mMのEPPS及び40〜60mMのヒスチジン塩酸塩を含む。一実施形態では、得られる混合物は250mM〜350mMのEPPS及び40〜60mMのヒスチジン塩酸塩を含む。さらに別の実施形態では、得られる混合物は300mM〜350mMのEPPS及び45mM〜55mMのヒスチジン塩酸塩を含む。
一実施形態では、本発明の方法に従って調製される細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは精製工程に供される。この点で、細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは、膜に基づく接線流濾過プロセスである接線流濾過(TFF)、非吸着性クロマトグラフィ、吸着性クロマトグラフィ、吸着性濾過、選択性沈殿、または他の好適な精製プロセス、と同様にそれらの組み合わせを用いて混合物(たとえば、遊離の細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物及び反応副生成物)の他の成分から精製することができる。
本発明の一実施形態では、細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは単一の精製工程(たとえば、TFF)を用いて精製される。好ましくはコンジュゲートは単一の精製工程(たとえば、TFF)を用いて精製され、適当な製剤に交換される。本発明の別の実施形態では、2つの連続精製工程を用いて細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは精製される。たとえば、コンジュゲートは先ず、選択性沈殿、吸着性濾過、吸着性クロマトグラフィまたは非吸着性クロマトグラフィによって精製し、その後、TFFによって精製することができる。当業者は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートの精製が細胞毒性剤に化学的に結合した細胞結合剤を含む安定したコンジュゲートの単離を可能にすることを十分に理解する。
Pellicon型システム(Millipore、Billerica、Mass.)、Sartoconカセットシステム(Sartorius AG、Edgewood、N.Y.)、TangenXカセット(TangenX Technology Corporation、Shrewsbury、MA)及びCentrasette型システム(Pall Corp.、East Hills、N.Y.)を含む任意の好適なTFFシステムが精製に利用されてもよい。
任意の好適な吸着性クロマトグラフィ樹脂が精製に利用されてもよく、その際、樹脂は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを保持し、且つ不純物の溶出を可能にしてもよく、または不純物を保持し、且つ樹脂は細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートの溶出を可能にしてもよい。好まれる吸着性クロマトグラフィ樹脂には、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性電荷誘導クロマトグラフィ(HCIC)、疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)、イオン交換クロマトグラフィ、混合モードイオン交換クロマトグラフィ、不動化金属アフィニティクロマトグラフィ(IMAC)、色素リガンドクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適なヒドロキシアパタイト樹脂の例には、セラミックヒドロキシアパタイト(CHTタイプI及びタイプII、Bio−Rad Laboratories、Hercules、Calif.)、HA Ultrogelヒドロキシアパタイト(Pall Corp.、East Hills、N.Y.)及びセラミックフルオロアパタイト(CFTタイプI及びタイプII、Bio−Rad Laboratories、Hercules、Calif.)が挙げられる。好適なHCICの例はMEP Hypercel樹脂(Pall Corp.,East Hills,N.Y.)である。好適なHIC樹脂の例には、ブチル−セファロース、ヘキシル−セファロース、フェニル−セファロース、及びオクチルセファロース樹脂(すべてGE Healthcare、Piscataway、N.J.に由来する)、と同様にMacro−prepメチル及びMacro−Prep t−ブチル樹脂(Biorad Laboratories、Hercules、Calif.)が挙げられる。好適なイオン交換樹脂の例には、SP−セファロース、CM−セファロース、及びQ−セファロース樹脂(すべてGE Healthcare、Piscataway、N.J.に由来する)、ならびにウノスフェアS樹脂(Bio−Rad Laboratories、Hercules、Calif.)が挙げられる。好適な混合モードイオン交換体の例には、Bakerbond ABx樹脂(JT Baker、Phillipsburg、N.J.)が挙げられる。好適なIMAC樹脂の例には、キレートセファロース樹脂(GE Healthcare、Piscataway、N.J.)及びProfinity IMAC樹脂(Bio−Rad Laboratories、Hercules、Calif.)が挙げられる。好適な色素リガンド樹脂の例には、ブルーセファロース樹脂(GE Healthcare、Piscataway、N.J.)及びAffi−ゲルブルー樹脂(Bio−Rad Laboratories、Hercules、Calif.)が挙げられる。好適なアフィニティ樹脂の例には、細胞結合剤が抗体であるプロテインAセファロース樹脂(たとえば、MabSelect、GE Healthcare、Piscataway、N.J.)、及び細胞結合剤が適当なレクチン結合部位を持つレクチンアフィニティ樹脂、たとえば、Lentilレクチンセファロース樹脂(GE Healthcare、Piscataway、N.J.)が挙げられる。或いは、細胞結合剤に特異的な抗体が使用されてもよい。そのような抗体は、たとえば、セファロース4ファストフロー樹脂 (GE Healthcare、Piscataway、N.J.)に不動化することができる。好適な逆相樹脂の例にはC4、C8及びC18樹脂(Grace Vydac,Hesperia,Calif.)が挙げられる。
任意の好適な非吸着性クロマトグラフィ樹脂が精製に利用されてもよい。好適な非吸着性クロマトグラフィ樹脂の例には、SEPHADEX(商標)G−25、G−50、G−100、SEPHACRYL(商標)樹脂(たとえば、S−200及びS−300)、SUPERDEX(商標)樹脂(たとえば、SUPERDEX(商標)75及びSUPERDEX(商標)200)、BIO−GEL(登録商標)樹脂(たとえば、P−6、P−10、P−30、P−60、及びP−100)、及び当業者に既知のその他が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されている方法によって調製されるコンジュゲートは好適な製剤化緩衝液にて製剤化することができる。
本発明のプロセスによって調製される細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは実質的に高い純度及び安定性を有する。本発明の態様の1つでは、実質的に高い純度の細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートは、以下の特徴:(a)抗体断片化の25%未満、20%未満、15%未満(たとえば、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%未満またはそれに等しい)、(b)90%を超える(たとえば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%を超えるまたはそれに等しい)、好ましくは95%を超えるコンジュゲート種が単量体である、(c)コンジュゲート調製物における未コンジュゲートのリンカーのレベルが約10%未満である(たとえば、約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%または0%未満またはそれに等しい)(総リンカーに対して)、(d)コンジュゲート種の10%未満が架橋される(たとえば、約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%または0%未満またはそれに等しい)、(e)コンジュゲート調製物における遊離の細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物のレベルが約2%未満(たとえば、約1.5%、1.4%、1.3%、1.2%、1.1%、1.0%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、または0%未満またはそれに等しい)(細胞毒性剤の合計に対するモル/モル)である、(f)高分子量種の約10%未満、約5%未満(約4%、3%、2%、1%または0%未満またはそれに等しい)、及び/または(g)保存の際(たとえば、約1週間後、約2週間後、約3週間後、約1ヵ月後、約2ヵ月後、約3ヵ月後、約4ヵ月後、約5ヵ月後、約6ヵ月後、約1年後、約2年後、約3年後、約4年後、または約5年後)遊離の細胞毒性剤のレベルの実質的な上昇がない、の1以上を有する。遊離の細胞毒性剤のレベルの「実質的な上昇」は、特定の保存時間(たとえば、約1週間、約2週間、3週間、約1ヵ月間、約2ヵ月間、約3ヵ月間、約4ヵ月間、約5ヵ月間、約6ヵ月間、約1年、約2年、約3年、約4年、または約5年)の後、遊離の細胞毒性剤のレベルの上昇が約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1.0%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%、約2.0%、約2.2%、約2.5%、約2.7%、約3.0%、約3.2%、約3.5%、約3.7%、または約4.0%未満であることを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「未コンジュゲートのリンカー」は二官能性の架橋試薬に共有結合している細胞結合剤を指し、その際、細胞結合剤は二官能性の架橋試薬のリンカーを介して細胞毒性剤に共有結合しない(すなわち、「未コンジュゲートのリンカー」はCBA−Lによって表すことができ、CBAは細胞結合剤を表し、Lは二官能性の架橋試薬を表す。それに対して、細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートはCBA−L−Dによって表すことができ、Dは細胞毒性剤を表す)。
本明細書で使用されるとき、用語「高分子量種」または「HMW」は、分子量が高い抗体含有種またはコンジュゲート含有種を指す。高分子量種は抗体またはコンジュゲートまたはそれらの組み合わせの集合によって形成される二量体、三量体、他の高次オリゴマーであることができる。SEC−HPLCによって高分子量種を特定することができ、その量を決定することができる。
一実施形態では、細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートにおける細胞毒性剤の細胞結合剤に対する平均モル比(すなわち、DAR)は1〜15、1〜10、1〜9、1〜8、1〜7、1〜6、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、1.5〜5、2〜7、または3〜5である。別の実施形態では、DARは1.5〜3.5、2〜3、2.1〜2.9、2.2〜2.8、2.3〜2.7、または2.4〜2.6である。別の実施形態では、本発明の方法によって調製されるコンジュゲートについてのDARは2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.5、2.7、2.8、2.9または3.0である。一実施形態では、DARは2.5である。別の実施形態では、DARは2.7である。
DAR値は当該技術で既知の方法によって決定することができる。一実施形態では、DAR値は、それぞれ抗体及び細胞毒性剤についての波長での吸光度の値を用いたUV/Vis分光法によって決定することができる。或いは、DAR値は質量分光分析及び/またはHPLCによって決定することができる。
細胞結合剤
本発明の方法における使用については、細胞結合剤は細胞、通常、及び好ましくは動物細胞(たとえば、ヒト細胞)に結合する任意の好適な作用物質であることができる。細胞結合剤は好ましくはペプチドまたはポリペプチドである。好適な細胞結合剤には、たとえば、抗体(たとえば、モノクローナル抗体及びその断片)、インターフェロン(たとえば、アルファ、ベータ、ガンマ)、リンホカイン(たとえば、IL−2、IL−3、IL−4、IL−6)、ホルモン(たとえば、インスリン、TRH(サイロトロピン放出ホルモン)、MSH(メラニン細胞刺激ホルモン)、ステロイドホルモン、たとえば、アンドロゲン及びエストロゲン)、増殖因子及びコロニー刺激因子、たとえば、EGF、TGF−アルファ、FGF、VEGF、G−CSF、M−CSF及びGM−CSF(Burgess、Immunology Today、5:155−158(1984))、栄養輸送分子(たとえば、トランスフェリン)、ビタミン(たとえば、葉酸塩)及び細胞の表面における標的分子を特異的に結合する他の作用物質または分子が挙げられる。
本発明の方法における使用については、細胞結合剤は細胞、通常、及び好ましくは動物細胞(たとえば、ヒト細胞)に結合する任意の好適な作用物質であることができる。細胞結合剤は好ましくはペプチドまたはポリペプチドである。好適な細胞結合剤には、たとえば、抗体(たとえば、モノクローナル抗体及びその断片)、インターフェロン(たとえば、アルファ、ベータ、ガンマ)、リンホカイン(たとえば、IL−2、IL−3、IL−4、IL−6)、ホルモン(たとえば、インスリン、TRH(サイロトロピン放出ホルモン)、MSH(メラニン細胞刺激ホルモン)、ステロイドホルモン、たとえば、アンドロゲン及びエストロゲン)、増殖因子及びコロニー刺激因子、たとえば、EGF、TGF−アルファ、FGF、VEGF、G−CSF、M−CSF及びGM−CSF(Burgess、Immunology Today、5:155−158(1984))、栄養輸送分子(たとえば、トランスフェリン)、ビタミン(たとえば、葉酸塩)及び細胞の表面における標的分子を特異的に結合する他の作用物質または分子が挙げられる。
細胞結合剤が抗体である場合、それはポリペプチドまたはグリコトープであり、且つ膜貫通分子(たとえば、受容体)または増殖因子のようなリガンドであってもよい抗原に結合する。例となる抗原には、レニンのような分子;ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;アルファ−1−アンチトリプシン;インスリンA−鎖;インスリンB−鎖;プロインスリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体形成ホルモン;グルカゴン;vmc因子、第IX因子、組織因子(TF)、及びヴォン・ヴィレブランド因子のような凝固因子;プロテインCのような抗凝固因子;心房性ナトリウム利尿因子;肺表面活性剤;ウロキナーゼまたはヒトの尿型もしくは組織型のプラスミノーゲン活性化因子(t−PA)のようなプラスミノーゲン活性化因子;ボムベシン;トロンビン;造血成長因子;腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ;エンケファリナーゼ;RANTES(活性化制御で、正常T細胞で発現、分泌される);ヒトのマクロファージ炎症性タンパク質(MIP−1−アルファ);ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン;ミュラー管阻害物質;レラキシンA−鎖;レラキシンB−鎖;プロレラキシン;マウス性腺刺激ホルモン−関連ペプチド;ベータ−ラクタマーゼのような微生物タンパク質;DNA分解酵素;IgE;CTLA−4のような細胞傷害性T−リンパ球関連抗原(CTLA);インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子(VEGF);ホルモンまたは成長因子のための受容体;プロテインAまたはD;リウマチ因子;たとえば、骨由来神経栄養因子(BDNF)、神経栄養因子−3、−4、−5、または−6(NT−3、NT4、NT−5、またはNT−6)、またはNGF−ベータのような神経成長因子のような神経栄養因子;血小板由来増殖因子(PDGF);aFGF及びbFGFのような線維芽細胞増殖因子;表皮増殖因子(EGF);TGF−.ベータ.1、TGF−.ベータ.2、TGF−.ベータ.3、TGF−.ベータ.4、またはTGF−.ベータ.5を含むTGF−アルファ及びTGF−ベータのような形質転換増殖因子(TGF);インスリン様増殖因子−I及び−II(IGF−I及びIGF−II);des(1−3)−IGF−I(脳IGF−I);インスリン様増殖因子結合タンパク質;EpCAM;GD3;FLT3;PSMA;PSCA;MUC1;MUC16;STEAP;CEA;TENB2;EphA受容体;EphB受容体;葉酸受容体;FOLR1;メソテリン;クリプト;αvβ6;インテグリン;VEGF、VEGFR;EGFR;線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)(たとえば、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4);トランスフェリン受容体;IRTA1;IRTA2;IRTA3;IRTA4;IRTA5;たとえば、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD123、CD134、CD137、CD138、CD152のようなCDタンパク質、グアニリルサイクラーゼC(GCC)、または参照によってその全体が組み入れられる米国特許出願公開番号2008/0171040もしくは米国特許出願公開番号2008/0305044にて開示された1以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体に結合する抗体;エリスロポイエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマのようなインターフェロン;コロニー刺激因子(CSF)、たとえば、M−CSF、GM−CSF、及びG−CSF;インターロイキン(IL)、たとえば、IL−1〜IL−10;活性酸素分解酵素;T−細胞受容体;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;ウイルス抗原、たとえば、HIVエンベロープの部分;輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;調節性タンパク質;インテグリン、たとえば、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA−4及びVCAM;腫瘍関連抗原、たとえば、HER2、HER3、またはHER4受容体;エンドグリン;c−Met;IGF1R;前立腺抗原、たとえば、PCA3、PSA、PSGR、NGEP、PSMA、PSCA、TMEFF2、及びSTEAP1;LGR5;B7H4;ならびに上記でリストにしたポリペプチドのいずれかの断片が挙げられる。一実施形態では、抗原はGCCではない。
さらに、骨髄系細胞に結合するGM−CSFは、急性骨髄性白血病に由来する病んだ細胞に対する細胞結合剤として使用することができる。活性化T細胞に結合するIL−2は、移植の移植片拒絶の防止、移植片対宿主病の治療及び予防、及び急性T細胞白血病の治療に使用することができる。メラニン細胞に結合するMSHは、黒色腫を対象とする抗体のように黒色腫の治療に使用することができる。葉酸を使用して卵巣癌及び他の腫瘍で発現される葉酸受容体を標的とすることができる。表皮増殖因子を用いて、肺癌及び頭頚部癌のような扁平上皮癌を標的とすることができる。ソマトスタチンを使用して神経芽細胞腫及び他の腫瘍型を標的とすることができる。
乳腺及び精巣の癌は、細胞結合剤としてそれぞれエストロゲン(またはエストロゲン類似体)またはアンドロゲン(またはアンドロゲン類似体)によって上手く標的化することができる。
用語「抗体」は本明細書で使用されるとき、任意の免疫グロブリン、たとえば、Fab、Fab’、F(ab’)2、dsFv、sFv、ミニボディ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、プロボディのような任意の免疫グロブリン断片(Parham,J.Immunol.,131:2895−2902(1983);Spring,et al.J.Immunol.,113:470−478(1974);Nisonoff,et al.Arch.Biochem.Biophys.,89:230−244(1960),Kim,et al.,Mol.Cancer Ther.,7:2486−2497(2008),Carter,Nature Revs.,6:343−357(2006),米国特許第8,399,219号)、または細胞の表面上の抗原に結合することができる免疫グロブリンキメラ(たとえば、相補性決定領域(CDR)を含有する)を指す。任意の好適な抗体は細胞結合剤として使用することができる。当業者は適当な抗体の選択は標的とされる細胞集団に左右されることを十分に理解する。この点で、特定の細胞集団(通常及び好ましくは病んだ細胞集団)で選択的に発現される細胞表面分子(すなわち、抗原)の種類及び数は本発明の組成物での使用のための適当な抗体の選択を支配する。細胞表面の発現プロファイルは、腫瘍細胞型を含む多種多様な細胞型で知られており、またはもし未知であれば、日常の分子生物学及び組織化学の技法を用いて決定することができる。
抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであることができるが、最も好ましくはモノクローナル抗体である。本明細書で使用されるとき、「ポリクローナル」抗体は、免疫された動物の血清に通常含有される抗体分子の不均一の集団を指す。「モノクローナル」抗体は特定の抗原に対して特異的である抗体分子の均一な集団を指す。モノクローナル抗体は通常、Bリンパ球(「B細胞」)の単一クローンによって産生される。モノクローナル抗体は、標準のハイブリドーマ技術を含む当業者に既知の種々の技法を用いて得られてもよい(たとえば、Kohler及びMilstein,Eur.J.Immunol.,5:511−519(1976),Harlow及びLane(eds.),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988),ならびにC.A.Janeway,et al.(eds.),Immunobiology,5.sup.th Ed.,Garland Publishing,New York,N.Y.(2001)を参照のこと)。手短には、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ法には通常、好適な動物、通常及び好ましくはマウスに抗原(すなわち、「免疫原」)を注射することが関与する。続いて動物を屠殺し、その脾臓から単離したB細胞をヒト骨髄腫細胞と融合させる。試験管内で無制限に増殖し、所望の特異性を持つ高い力価の抗体を連続的に分泌するハイブリッド細胞(すなわち、「ハイブリドーマ」)が作出される。当該技術で既知の適当な方法を用いて所望の特異性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定することができる。そのような方法には、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ウエスタンブロット解析及び放射線免疫アッセイが挙げられる。ハイブリドーマの集団をスクリーニングしてそのそれぞれが抗原に対する単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離する。各ハイブリドーマは単一のB細胞との融合に由来するクローンなので、それが産生する抗体分子はすべて、その抗原結合部位及びアイソタイプを含めて構造は同一である。モノクローナル抗体はEBV・ハイブリドーマ技術(たとえば、Haskard及びArcher,J.Immunol.Methods,74(2):361−67(1984),ならびにRoder,et al.,Methods Enzymol.,121:140−67(1986)を参照のこと)、バクテリオファージベクター発現系(たとえば、Huse,et al., Science,246:1275−81(1989)を参照のこと)、またはFab及びscFv(単鎖可変領域)のような抗体断片を含むファージディスプレイライブラリ(たとえば、米国特許第5,885,793号及び同第5,969,108号ならびに国際特許出願公開番号WO92/01047及びWO99/06587を参照のこと)を含む他の好適な技法を用いて生成されてもよい。
モノクローナル抗体は、好適な動物から単離され、または好適な動物で産生されることができるが、好ましくは哺乳類にて、さらに好ましくはマウスまたはヒトにて、及び最も好ましくはヒトにて産生される。マウスにて抗体を産生させる方法は当業者に周知であり、本明細書に記載されている。ヒト抗体に関して、当業者は、適当な抗原でワクチン接種されたまたは免疫されたヒト対象の血清からポリクローナル抗体を単離することができることを十分に理解する。或いは、ヒト抗体はマウスのような非ヒト動物でヒト抗体を作出する既知の技法を適応させることによって生成することができる(たとえば、米国特許第5,545,806号、同第5,569,825号及び同第5,714,352号、ならびに米国特許出願公開番号2002/0197266A1を参照のこと)。
ヒトにおける治療応用のための理想的な選択である一方で、ヒト抗体、特にヒトモノクローナル抗体は通常、マウスモノクローナル抗体よりも生成するのが難しい。しかしながら、マウスモノクローナル抗体はヒトに投与すると短時間で宿主抗体反応を誘導し、それは抗体・細胞毒性剤コンジュゲートの治療的または診断的潜在性を低下させ得る。これらの複雑な事態を回避するために、モノクローナル抗体は好ましくはヒト免疫系によって「異物」として認識されない。
この目的で、ファージディスプレイを用いて抗体を生成することができる。この点で、標準の分子生物学及び組換えDNA法(たとえば、Sambrook,et al.(eds.),Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3.sup.rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2001)を参照のこと)を用いて抗体の抗原結合可変(V)ドメインをコードするファージライブラリを生成することができる。所望の特異性を持つ可変領域をコードするファージを所望の抗原に対する特異的な結合について選択し、選択された可変ドメインを含む完全なヒト抗体を再構成する。再構成された抗体をコードする核酸配列をハイブリドーマ作出に使用される骨髄腫細胞のような好適な細胞株に導入するので、モノクローナル抗体の特徴を有するヒト抗体がその細胞によって分泌される(たとえば、Janeway,et al.,上記,Huse,et al.,上記,及び米国特許第6,265,150号を参照のこと)。或いは、モノクローナル抗体は特定のヒト重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるマウスから生成することができる。そのような方法は当該技術で既知であり、たとえば、米国特許第5,545,806号及び同第5,569,825号,ならびにJaneway,et al.,上記に記載されている。
最も好ましくは、抗体はヒト化抗体である。本明細書で使用されるとき、「ヒト化」抗体は、抗体の抗原結合ループを形成するマウスモノクローナル抗体の相補性決定領域(CDR)がヒト抗体分子のフレームワークに移植されるものである。マウス及びヒトの抗体のフレームワークの類似性のおかげで、このアプローチが、ヒト抗体と抗原性で同一であるが、CDR配列が由来するマウスモノクローナル抗体と同じ抗原を結合するモノクローナル抗体を作出することは当該技術で一般に受け入れられている。ヒト化抗体を生成する方法は当該技術で周知であり、たとえば、Janeway,et al.,上記,米国特許第5,225,539号、同第5,585,089号及び同第5,693,761号,欧州特許第0239400号B1,ならびに英国特許第2188638号にて詳細に記載されている。ヒト化抗体は米国特許第5,639,641号及びPedersen,et al.,J.Mol.Biol.,235:959−973(1994)に記載された抗体再表面化法を用いても生成することができる。本発明の組成物のコンジュゲートで採用される抗体は最も好ましくはヒト化モノクローナル抗体である一方で、上記で記載されているようなヒトモノクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体も本発明の範囲の中にある。
少なくとも1つの抗原結合部位を有するので標的細胞の表面に存在する少なくとも1つの抗原または受容体を認識し、それに結合する抗体断片も本発明の範囲の中にある。この点で、インタクトの抗体分子のタンパク質分解切断は抗原を認識し、結合する能力を保持する種々の抗体断片を作出することができる。たとえば、プロテアーゼであるパパインによる抗体分子の限定された消化は通常、3つの断片を生じ、そのうちの2つは同一であり、それらが親抗体分子の抗原結合活性を保持しているのでFab断片と呼ばれる。酵素ペプシンによる抗体分子の切断は普通、2つの抗体断片を生じ、そのうちの1つは抗体分子の双方の抗原結合アームを保持するので、F(ab’)2断片と呼ばれる。F(ab’)2断片のジチオスレイトールまたはメルカプトエチルアミンによる還元はFab’断片と呼ばれる断片を生じる。合成ペプチドを介して抗体軽鎖のVドメインに連結される抗体重鎖の可変(V)ドメインを含む切り詰めたFab断片から成る単鎖可変領域断片(sFv)抗体断片は日常の組換えDNA技術の技法(たとえば、Janeway,et al.上記を参照のこと)を用いて生成することができる。同様に、ジスルフィドで安定化した可変領域断片(dsFv)は組換えDNA技術(たとえば、Reiter,et al.,Protein Engineering,7:697−704(1994)を参照のこと)によって調製することができる。しかしながら、本発明の文脈における抗体断片は抗体断片のこれらの例となる種類には限定されない。所望の細胞表面の受容体または抗原を認識し、且つそれに結合する任意の好適な抗体断片を採用することができる。抗体断片は、たとえば、Parham,J.Immunol.,131:2895−2902(1983),Spring,et al.,J.Immunol.,113:470−478(1974),及びNisonoff,et al.,Arch.Biochem.Biophys.,89:230−244(1960)にてさらに記載されている。抗体・抗原結合は、たとえば、放射線免疫アッセイ(RIA)、ELISA、ウエスタンブロット、免疫沈降、及び競合阻害アッセイのような当該技術で既知の好適な方法を用いてアッセイすることができる(たとえば、Janeway,et al.,上記,及び米国特許出願公開番号2002/0197266 A1を参照のこと)。
加えて、抗体はキメラ抗体またはその抗原結合断片であることができる。「キメラ」によって、抗体が少なくとも2つの異なる種から得られるまたはそれに由来する少なくとも2つの免疫グロブリンまたはそれらの断片(たとえば、マウスの免疫グロブリン可変領域と組み合わせたヒトの免疫グロブリン定常領域のような2つの異なる免疫グロブリン)を含むことを意味する。抗体はまた、たとえば、ラクダ抗体(たとえば、Desmyter,et al.,Nature Struct.Biol.,3:752,(1996)を参照のこと)またはサメ抗体、たとえば、新しい抗原受容体(IgNAR)(たとえば、Greenberg,et al.,Nature,374:168(1995),及びStanfield,et al.,Science,305:1770−1773(2004)を参照のこと)のようなドメイン抗体(dAb)またはその抗原結合断片であることもできる。
本発明の文脈では任意の好適な抗体を使用することができる。たとえば、モノクローナル抗体J5は、急性リンパ芽球性白血病共通抗原(CALLA)に特異的であるマウスIgG2a抗体であり(Ritz,et al.,Nature,283:583−585(1980))、CALLAを発現している細胞(たとえば、急性リンパ芽球性白血病細胞)を標的とするのに使用することができる。モノクローナル抗体MY9は、CD33抗原に特異的に結合するマウスIgG1抗体であり(Griffin, et al.Leukemia Res.,8:521(1984))、CD33を発現している細胞(たとえば、急性骨髄性白血病(AML)細胞)を標的とするのに使用することができる。特定の実施形態では、MY9抗体は取り除かれたN末端またはC末端の残基を有する。
同様に、モノクローナル抗体である抗B4(B4とも呼ばれる)はB細胞上のCD19抗原に結合するマウスIgG1抗体であり(Nadler et al.,J.Immunol.,131:244−250(1983))、CD19を発現しているB細胞または病んだ細胞(たとえば、非ホジキンリンパ腫細胞及び慢性リンパ芽球性白血病細胞)を標的とするのに使用することができる。N901は、小細胞肺癌を含む神経内分泌起源の細胞で見いだされたCD56(神経細胞接着分子)抗原に結合するマウスモノクローナル抗体であり、それは神経内分泌起源の細胞に薬剤を標的化するためのコンジュゲートで使用することができる。J5抗体、MY9抗体及びB4抗体は、コンジュゲートの一部として使用されるのに先立って好ましくは再表面化される、またはヒト化される。抗体の再表面化またはヒト化は、たとえば、Roguska,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:969−73(1994)に記載されている。
加えて、モノクローナル抗体C242はCanAg抗原(たとえば、米国特許第5,552,293号を参照のこと)に結合し、たとえば、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌及び胃癌のようなCanAgを発現している腫瘍にコンジュゲートを標的化するのに使用することができる。HuC242はモノクローナル抗体C242のヒト化形態である(たとえば、米国特許第5,552,293号を参照のこと)。HuC242が産生されるハイブリドーマはECACC特定番号90012601で寄託されている。HuC242はCDR移植法(たとえば、米国特許第5,585,089号、同第5,693,761号及び同第5,693,762号を参照のこと)または再表面化技術(たとえば、米国特許第5,639,641号を参照のこと)を用いて調製することができる。HuC242を用いて、たとえば、結腸直腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌及び胃癌の細胞のようなCanAgを発現している腫瘍細胞にコンジュゲートを標的化することができる。
卵巣癌及び前立腺癌の細胞を標的化するには、抗MUC1抗体をコンジュゲートにおける細胞結合剤として使用することができる。抗MUC1抗体には、たとえば、抗−HMFG−2(たとえば、Taylor−Papadimitriou,et al.,Int.J.Cancer,28:17−21(1981)を参照のこと),hCTMO1(たとえば、van H of et al.,Cancer Res.,56:5179−5185(1996)を参照のこと)、及びDS6が挙げられる。前立腺癌細胞も、たとえば、J591のような抗前立腺特異的膜抗原(PSMA)を細胞結合剤として使用することによりコンジュゲートによって標的化することができる(たとえば、Liu,et al.,Cancer Res.,57:3629−3634(1997)を参照のこと)。さらに、たとえば、乳癌、前立腺癌及び卵巣癌のような、Her2抗原を発現している癌細胞は、抗Her2抗体、たとえば、トラスツズマブを細胞結合剤として使用することによりコンジュゲートによって標的化することができる。表皮増殖因子受容体(EGFR)及びたとえば、III型欠失変異体であるEGFRvIIIのようなその変異体を発現している細胞は、抗EGFR抗体を使用することによりコンジュゲートによって標的化することができる。抗EGFR抗体は国際特許出願番号PCT/US11/058,385及びPCT/US11/058,378に記載されている。抗EGFRvIII抗体は米国特許第7,736,644号及び同第7,628,986号及び米国特許出願公開2010/0111979、2009/0240038、2009/0175887、2009/0156790、及び2009/0155282に記載されている。たとえば、米国特許第7,982,024号に記載されたもののような、インスリン様増殖因子受容体に結合する抗IGF−IR抗体もコンジュゲートで使用することができる。CD27L、クリプト、CD138、CD38、EphA2、インテグリン、CD37、葉酸塩、CD20、PSGR、NGEP、PSCA、TMEFF2、STEAP1、エンドグリン、及びHer3に結合する抗体もコンジュゲートで使用することができる。
一実施形態では、抗体は、huN901、huMy9−6、huB4、huC242、抗HER2抗体(たとえば、トラスツズマブ)、ビバツズマブ、シブロツズマブ、リツキシマブ、huDS6、国際特許出願公開WO2010/124797に記載された抗メソテリン抗体(たとえば、MF−T)、米国特許出願公開2010/0093980に記載された抗クリプト抗体(たとえば、huB3F6)、米国特許出願公開2007/0183971に記載された抗CD138(たとえば、huB−B4)、国際特許出願番号PCT/US11/058,385及びPCT/US11/058,378に記載された抗EGFR抗体(たとえば、EGFR−7)、米国特許第7,736,644号及び同第7,628,986号及び米国特許出願公開2010/0111979、2009/0240038、2009/0175887、2009/0156790及び2009/0155282に記載された抗EGFRvIII抗体、国際特許出願公開WO2011/039721及びWO2011/039724に記載されたヒト化EphA2抗体(たとえば、2H11R35R74);国際特許出願公開WO2008/047242に記載された抗CD38抗体(たとえば、hu38SB19),国際特許出願公開WO2011/106528及び米国特許出願公開2012/0009181に記載された抗葉酸抗体(たとえば、huMov19);米国特許第5,958,872号、同第6,596,743号、及び同第7,982,024号に記載された抗IGF1R抗体;米国特許出願公開2011/0256153に記載された抗CD37抗体(たとえば、huCD37−3);米国出願公開2006/0127407に記載された抗インテグリンαvβ6抗体(たとえば、CNTO95);ならびに国際特許出願公開WO2012/019024に記載された抗Her3抗体から成る群から選択される。一実施形態では、細胞結合剤はEGFR2に結合する抗体またはその抗原結合断片(たとえば、その教示全体が参照によって本明細書に組み入れられるUS2014/030820に記載されたもの)である。別の実施形態では、細胞結合剤は、FGFR2及びFGFR4に結合する抗体またはその抗原結合断片(たとえば、その教示全体が参照によって本明細書に組み入れられるUS2014/301946に記載されたもの)である。
特に好まれる抗体は本明細書に記載されているヒト化モノクローナル抗体である。例には、huN901、huMy9−6、huB4、huC242、ヒト化モノクローナル抗−Her2抗体(たとえば、トラスツズマブ)、ビバツズマブ、シブロツズマブ、CNTO95、huDS6、及びリツキシマブ(たとえば、米国特許第5,639,641号及び同第5,665,357号、米国仮特許出願番号60/424,332(米国特許第7,557,189号に関連する)、国際(PCT)特許出願公開WO02/16401、Pedersen,et al.,上記,Roguska,et al.,上記,Liu,et al.,上記,Nadler,et al.,上記,Colomer,et al.,Cancer Invest.,19:49−56(2001),Heider,et al.,Eur.J.Cancer,31A:2385−2391(1995),Welt,et al.,J.Clin.Oncol.,12:1193−1203(1994),ならびにMaloney,et al.,Blood,90:2188−2195(1997)を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。他のヒト化モノクローナル抗体は当該技術で既知であり、本発明と併せて使用することができる。
一実施形態では、細胞結合剤はhuMy9−6、または米国特許第7,342,110号及び同第7,557,189号(参照によって本明細書に組み入れられる)に記載されている他の関連する抗体である。
別の実施形態では、細胞結合剤は、米国特許第8,557,966号及び同第9,133,275号に記載された抗葉酸受容体抗体である。これら特許のそれぞれの教示はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
別の実施形態では、細胞結合剤はヒト化抗葉酸抗体、またはヒト葉酸受容体1(FOLR1)を特異的に結合するその抗原結合断片であり、その際、抗体は、(a)GYFMN(配列番号1)を含む重鎖CDR1;RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(配列番号2)を含む重鎖CDR2;及びYDGSRAMDY(配列番号3)を含む重鎖CDR3と、(b)KASQSVSFAGTSLMH(配列番号4)を含む軽鎖CDR1;RASNLEA(配列番号5)を含む軽鎖CDR2;及びQQSREYPYT(配列番号6)を含む軽鎖CDR3を含み;その際、Xaa1はK、Q、H及びRから選択され、Xaa2はQ、H、N及びRから選択され、Xaa3はG、E、T、S、A及びVから選択される。好ましくは重鎖CDR2配列はRIHPYDGDTFYNQKFQG(配列番号7)を含む。
別の実施形態では、抗葉酸抗体は、QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGR IHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYD GSRAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号8)のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、ヒト葉酸受容体1を特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
別の実施形態では、抗葉酸抗体は、2010年4月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号PTA−10772及びPTA−10773または10774を有するプラスミドDNAによってコードされるヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
別の実施形態では、抗葉酸抗体は、
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDG DTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQG TTVTVSS(配列番号24)に対して少なくとも約90%、95%、99%または100%同一である重鎖可変ドメインと、
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRL LIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPY TFGGGTKLEIKR(配列番号9);または
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRL LIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPY TFGGGTKLEIKR(配列番号10)に対して少なくとも約90%、95%、99%または100%同一である軽鎖可変ドメインとを含むヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDG DTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQG TTVTVSS(配列番号24)に対して少なくとも約90%、95%、99%または100%同一である重鎖可変ドメインと、
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRL LIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPY TFGGGTKLEIKR(配列番号9);または
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRL LIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPY TFGGGTKLEIKR(配列番号10)に対して少なくとも約90%、95%、99%または100%同一である軽鎖可変ドメインとを含むヒト化抗体またはその抗原結合断片である。
一実施形態では、細胞結合剤はGCCに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は配列番号11〜16のCDR配列を含む。一実施形態では、抗GCC抗体はそれぞれ配列番号17及び配列番号18に対して少なくとも95%同一であるVH及びVLの配列を有する。別の実施形態では、抗GCC抗体はそれぞれ配列番号17及び配列番号18であるVH及びVLの配列を有する。さらに別の実施形態では、抗GCC抗体は配列番号19の重鎖アミノ酸配列と配列番号20の軽鎖アミノ酸配列とを含む。一実施形態では、抗GCC抗体は、IgG1の重鎖(配列番号19)においてFcγRIIIbを結合するのに重要であるELLGをPVAで置き換える重鎖アミノ酸配列と配列番号20の軽鎖アミノ酸配列とを含む。
一実施形態では、細胞結合剤は抗GCC抗体またはその抗原結合断片ではない。
細胞結合剤は好ましくは抗体である一方で、細胞結合剤は非抗体分子であることもできる。好適な非抗体分子には、たとえば、インターフェロン(たとえば、アルファ、ベータ、またはガンマインターフェロン)、リンホカイン(たとえば、インターロイキン2(IL−2)、IL−3、IL−4、またはIL−6)、ホルモン(たとえば、インスリン)、増殖因子(たとえば、EGF、TGF−アルファ、FGF、及びVEGF)、コロニー刺激因子(たとえば、G−CSF、M−CSF、及びGM−CSF(たとえば、Burgess、Immunology Today、5:155−158(1984)を参照のこと)、ソマトスタチン、及びトランスフェリン(たとえば、O’Keefe,et al.、J.Biol.Chem.、260:932−937(1985)を参照のこと)が挙げられる。たとえば、骨髄系細胞に結合するGM−CSFを細胞結合剤として用いて急性骨髄性白血病細胞を標的とすることができる。加えて、活性化T細胞に結合するIL−2を移植の移植片拒絶の防止、移植片対宿主病の治療及び予防、及び急性T細胞白血病の治療に使用することができる。表皮増殖因子(EGF)を用いて肺癌及び頭頚部癌のような扁平上皮癌を標的化することができる。ソマトスタチンを用いて神経芽細胞腫の細胞及び他の腫瘍細胞型を標的とすることができる。
特定の実施形態では、本発明の方法で使用することができる細胞結合剤(たとえば、抗体)は、アミン反応基を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と共有結合を形成することができる遊離のアミン−NH2基(たとえば、1以上のリシン残基におけるイプシロンアミノ基)を含む。
細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物
「細胞毒性剤」は本明細書で使用されるとき、細胞の死を結果的に生じる、細胞死を誘導するまたは細胞の生存率を低下させる任意の化合物を指す。一実施形態では、細胞毒性剤はベンゾジアゼピン二量体化合物である。別の実施形態では、細胞毒性剤はインドリノベンゾジアゼピン二量体化合物である。好ましくは、インドリノベンゾジアゼピン二量体化合物は細胞結合剤におけるアミン基(たとえば、リシンのアミン基)と共有結合を形成することができるアミン反応基を有する。
「細胞毒性剤」は本明細書で使用されるとき、細胞の死を結果的に生じる、細胞死を誘導するまたは細胞の生存率を低下させる任意の化合物を指す。一実施形態では、細胞毒性剤はベンゾジアゼピン二量体化合物である。別の実施形態では、細胞毒性剤はインドリノベンゾジアゼピン二量体化合物である。好ましくは、インドリノベンゾジアゼピン二量体化合物は細胞結合剤におけるアミン基(たとえば、リシンのアミン基)と共有結合を形成することができるアミン反応基を有する。
特定の実施形態では、細胞毒性剤はアミン反応基を有するリンカーと反応してそれに連結されたアミン反応基を有する細胞毒性剤・リンカー化合物を形成することができる。得られる細胞毒性剤・リンカー化合物は次いで細胞結合剤と反応して細胞結合剤・細胞結合剤コンジュゲートを形成することができる。
本明細書で使用されるとき、「アミン反応基」はアミン基と容易に反応して共有結合を形成することができる官能基を指す。一実施形態では、アミン反応基は反応性エステル基である。反応性エステル基の例には、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニル(たとえば、2または4−ニトロフェニル)エステル、ジニトロフェニル(たとえば、2,4−ジニトロフェニル)エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル(たとえば、4−スルホ−2,3,5,6−テトラフルオロフェニル)エステル、及びペンタフルオロフェニルエステルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、反応性エステル基はN−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはN−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルである。
第31の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29または第30の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は、以下の構造式:
の1つまたは薬学上許容できるその塩によって表され、式中、
Lは、以下の式
−NR5−P−C(=O)−(CRaRb)m−C(=O)E(A1);または
−NR5−P−C(=O)−(CRaRb)m−S−Zs1 (A3)によって表され、
その際、
R5は−Hまたは(C1−C3)アルキルであり、
Pは2〜20のアミノ酸残基を含有するアミノ酸残基またはペプチドであり、
Ra及びRbはそれぞれの存在についてそれぞれ独立して−H、(C1−C3)アルキルまたは荷電した置換基またはイオン化できる基Q(好ましくはQは−SO3Mである)であり、
mは1〜6の整数であり、
Zs1は以下の式:
のいずれか1つから選択され、
その際、
qは1〜5の整数であり、
Mは−Hまたはカチオンであり、
−C(=O)Eは反応性エステル基を表す。
Lは、以下の式
−NR5−P−C(=O)−(CRaRb)m−C(=O)E(A1);または
−NR5−P−C(=O)−(CRaRb)m−S−Zs1 (A3)によって表され、
その際、
R5は−Hまたは(C1−C3)アルキルであり、
Pは2〜20のアミノ酸残基を含有するアミノ酸残基またはペプチドであり、
Ra及びRbはそれぞれの存在についてそれぞれ独立して−H、(C1−C3)アルキルまたは荷電した置換基またはイオン化できる基Q(好ましくはQは−SO3Mである)であり、
mは1〜6の整数であり、
Zs1は以下の式:
その際、
qは1〜5の整数であり、
Mは−Hまたはカチオンであり、
−C(=O)Eは反応性エステル基を表す。
第32の具体的な実施形態では、上記に記載されている式(I)または(II)の化合物について、Ra及びRbは双方ともHであり、R5はHまたはMeであり、残りの可変記号は第31の具体的な実施形態にて記載されたとおりである。
第33の具体的な実施形態では、上記に記載されている式(I)または(II)の化合物について、Pは2〜5のアミノ酸を含有するペプチドであり;残りの可変記号は第31及び第32の具体的な実施形態にて記載されたとおりである。一実施形態では、ペプチドはプロテアーゼによって切断可能であり、好ましくは腫瘍組織で発現されているプロテアーゼによって切断可能である。別の実施形態では、Pは、Gly−Gly−Gly、Ala−Val、Val−Ala、Val−Cit、Val−Lys、Phe−Lys、Lys−Lys、Ala−Lys、Phe−Cit、Leu−Cit、Ile−Cit、Phe−Ala、Phe−N9−トシル−Arg、Phe−N9−ニトロ−Arg、Phe−Phe−Lys、D−Phe−Phe−Lys、Gly−Phe−Lys、Leu−Ala−Leu、Ile−Ala−Leu、Val−Ala−Val、Ala−Leu−Ala−Leu(配列番号21)、β−Ala−Leu−Ala−Leu(配列番号22)、Gly−Phe−Leu−Gly(配列番号23)、Val−Arg、Arg−Val、Arg−Arg、Val−D−Cit、Val−D−Lys、Val−D−Arg、D−Val−Cit、D−Val−Lys、D−Val−Arg、D−Val−D−Cit、D−Val−D−Lys、D−Val−D−Arg、D−Arg−D−Arg、Ala−Ala、Ala−D−Ala、D−Ala−Ala、D−Ala−D−Ala、Ala−Met、及びMet−Alaから選択される。好ましくは、Pは、Gly−Gly−Gly、Ala−Val、Ala−Ala、Ala−D−Ala、D−Ala−Ala、またはD−Ala−D−Alaである。
第34の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29または第30の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の構造式:
の1つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
第35の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29または第30の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の構造式:
の1つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
一実施形態では、本明細書に記載されている化合物(第31、第32、第33、第34、または第35の具体的な実施形態に記載されている化合物)については、−C(=O)Eによって表される反応性エステル基は、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニル(たとえば、2または4−ニトロフェニル)エステル、ジニトロフェニル(たとえば、2,4−ジニトロフェニル)エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル(たとえば、4−スルホ−2,3,5,6−テトラフルオロフェニル)エステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択される。さらに具体的には、反応性エステル基は以下の式:
によって表され、式中、UはHまたは−SO3Mである。一層さらに具体的には、反応性エステル基は以下の式:
によって表される。
第36の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29または第30の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の構造式:
または薬学上許容できるその塩によって表される。
一実施形態では、第36の実施形態に記載されている方法については、構造式(Ie)の化合物は(IIe)の化合物をスルホン化剤と反応させることによって調製される。具体的な実施形態では、スルホン化剤はNaHSO3またはKHSO3である。別の具体的な実施形態では、第36の実施形態に記載されている方法については、構造式(Ie)の化合物は、構造式(Ie)の化合物を細胞結合剤と反応させる前に精製することなくその場で(IIe)の化合物をスルホン化剤と反応させることによって調製される。一実施形態では、式(IIe)の化合物とスルホン化剤(たとえば、NaHSO3またはKHSO3)の間のスルホン化反応は、1.9〜5.0、2.9〜4.0、2.9〜3.7、3.1〜3.5、3.2〜3.4のpHでの水溶液にて実施される。具体的な実施形態では、スルホン化反応はpH3.3の水溶液にて実施される。一実施形態では、スルホン化反応はジメチルアセトアミド(DMA)と水にて実施される。
第37の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29または第30の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の構造式:
または薬学上許容できるその塩によって表される。
第38の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29または第30の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の構造式:
の1つまたは薬学上許容できるその塩によって表され、式中、
Rx1及びRx2は独立して(C1−C6)アルキルであり;
Re1は−Hまたは(C1−C6)アルキルであり;
Re2は−(CH2−CH2−O)n−Rkであり;
nは2〜6の整数であり;
Rkは−Hまたは−Meであり;
Zs1は以下の式:
のいずれか1つから選択され、その際、
qは1〜5の整数であり;
Mは−Hまたはカチオンであり;
−C(=O)Eは反応性エステル基を表す。
Rx1及びRx2は独立して(C1−C6)アルキルであり;
Re1は−Hまたは(C1−C6)アルキルであり;
Re2は−(CH2−CH2−O)n−Rkであり;
nは2〜6の整数であり;
Rkは−Hまたは−Meであり;
Zs1は以下の式:
qは1〜5の整数であり;
Mは−Hまたはカチオンであり;
−C(=O)Eは反応性エステル基を表す。
第39の具体的な実施形態では、構造式(III)、(IV)、(V)及び(VI)によって表される化合物については、Re1はHまたはMeであり;Rx1及びRx2は独立して−(CH2)p−(CRfRg)−であり、その際、Rf及びRgはそれぞれ独立して−Hまたは(C1−C4)アルキルであり;pは0、1、2または3であり;残りの可変記号は第38の具体的な実施形態にて上記に記載されたとおりである。好ましくは、Rf及びRgは同一であり、または異なり、−H及び−Meから選択される。
第40の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29または第30の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の式:
の1つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
第41の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29または第30の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の式:
の1つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
第42の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29または第30の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の式:
の1つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
第43の具体的な実施形態では、本明細書に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29または第30の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は以下の式:
の1つまたは薬学上許容できるその塩によって表される。
特定の実施形態では、上記に記載されている構造式(I)、(III)または(V)によって表される化合物は、それぞれ上記に記載されている構造式(II)、(IV)または(VI)の化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される。
特定の実施形態では、構造式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)または(Ie)によって表される化合物はそれぞれ、構造式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)及び(IIe)によって表される化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される。
特定の実施形態では、構造式(IIIa)、(IIIb)、または(IIIc)によって表される化合物はそれぞれ、構造式(IVa)、(IVb)、または(IVc)によって表される化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される。
特定の実施形態では、構造式(Va)、(Vb)、または(Vc)によって表される化合物はそれぞれ、構造式(VIa)、(VIb)、または(VIc)によって表される化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される。
特定の実施形態では、上記に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、第31、第32、第33、第34、第35、第37、第38、第39、第40、第41、または第43、の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は、構造式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(VIa)、(VIb)または(VIc)によって表され、方法はさらに細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートをスルホン化試薬と反応させることを含む。一実施形態では、スルホン化試薬はNaHSO3またはKHSO3である。
特定の実施形態では、上記に記載されている本発明の方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、第31、第32、第33、第34、第35、第37、第38、第39、第40、第41、または第43の具体的な実施形態に記載されている方法)については、細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物は、構造式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(VIa)、(VIb)または(VIc)によって表され、方法はさらに、スルホン化試薬の存在下で構造式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(VIa)、(VIb)または(VIc)によって表される細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させることを含む。一実施形態では、スルホン化試薬はNaHSO3またはKHSO3である。
特定の実施形態では、構造式(IIIa)、(IIIb)、(Va)または(Vb)によって表される化合物は、以下の構造式:
の1つによって表される化合物または薬学上許容できるその塩を、以下の構造式:
の1つによって表されるリンカー化合物と反応させることによって調製される。
特定の実施形態では、構造式(IIIc)または(Vc)の化合物は、以下の構造式:
によって表される化合物または薬学上許容できるその塩を、以下の構造式:
のリンカー化合物と反応させることによって調製される。
一実施形態では、本明細書に記載されている化合物(たとえば、式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(V)、(Va)、(Vb)、(Vc)、(VI)、(VIa)、(VIb)、または(VIc)の化合物)については、Mは、−H、Na+またはK+である。一実施形態では、MはNa+またはK+である。別の実施形態では、MはNa+である。さらに別の実施形態では、MはK+である。
他の好適な細胞毒性剤には、たとえば、マイタンシノイド及びコンジュゲート可能なアンサマイトシン(たとえば、2011年11月3日に出願された国際特許出願番号PCT/US11/59131、及び米国特許第9,090,629号を参照のこと)、タキソイド、CC−1065及びCC−1065類似体、及びドラスタチン及びドラスタチン類似体が挙げられる。本発明の具体的な実施形態では、細胞毒性剤はマイタンシノール及びマイタンシノール類似体を含むマイタンシノイドである。マイタンシノイドは微小管形成を阻害し、哺乳類細胞に対して高度に毒性である化合物である。好適なマイタンシノール類似体の例には、修飾された芳香環を有するもの及び他の位置で修飾を有するものが挙げられる。そのようなマイタンシノイドは、たとえば、米国特許第4,256,746号、同第4,294,757号、同第4,307,016号、同第4,313,946号、同第4,315,929号、同第4,322,348号、同第4,331,598号、同第4,361,650号、同第4,362,663号、同第4,364,866号、同第4,424,219号、同第4,371,533号、同第4,450,254号、同第5,475,092号、同第5,585,499号、同第5,846,545号、及び同第6,333,410号に記載されている。
修飾された芳香環を有するマイタンシノール類似体の例には、(1)C−19−デクロロ(米国特許第4,256,746号)(アンサマイトシンP2のLAH還元によって調製される)、(2)C−20−ヒドロキシ(またはC−20−デメチル)+/−C−19−デクロロ(米国特許第4,361,650号及び同第4,307,016号)(StreptomycesもしくはActinomycesを用いた脱メチル化またはLAHを用いた脱塩素化によって調製される)、及び(3)C−20−デメトキシ、C−20−アシルオキシ(−−OCOR)、+/−デクロロ(米国特許第4,294,757号)(塩化アシルを用いたアシル化によって調製される)が挙げられる。
芳香環以外の位置の修飾を有するマイタンシノール類似体の例には、(1)C−9−SH(米国特許第4,424,219号)(H2SまたはP2S5によるマイタンシノールの還元によって調製される)、(2)C−14−アルコキシメチル(デメトキシ/CH2OR)(米国特許第4,331,598号)、(3)C−14−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル(CH2OHまたはCH2OAc)(米国特許第4,450,254号)(Nocardiaから調製される)、(4)C−15−ヒドロキシ/アシルオキシ(米国特許第4,364,866号)(Streptomycesによるマイタンシノールの変換によって調製される)、(5)C−15−メトキシ(米国特許第4,313,946号及び同第4,315,929号)(Trewia nudifloraから単離される)、(6)C−18−N−デメチル(米国特許第4,362,663号及び同第4,322,348号)(Streptomycesによるマイタンシノールの脱メチル化によって調製される)、及び(7)4,5−デオキシ(米国特許第4,371,533号)(マイタンシノール三塩化チタン/LAH還元によって調製される)が挙げられる。
本発明の具体的な実施形態では、本発明のプロセスで使用することができる細胞毒性剤は、N2’−デアセチル−N2’−(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−マイタンシンとしても知られるチオール含有のマイタンシノイドDM1である。DM1の構造を以下に示す。
本発明の別の具体的な実施形態では、本発明のプロセスで使用することができる細胞毒性剤は、N2’−デアセチル−N2’−(4−メチル−4−メルカプト−1−オキソペンチル)−マイタンシンとしても知られるチオール含有のマイタンシノイドDM4である。DM4の構造を以下に示す。
たとえば、イオウ原子を持つ炭素原子上でモノアルキル置換またはジアルキル置換を持つチオール及びジスルフィドを含有するマイタンシノイドを含む他のマイタンシノイドが本発明の文脈で使用されてもよい。特に好まれるのは、C−3位にて(a)C−14ヒドロキシメチル、C−15ヒドロキシまたはC−20デメチル官能性を有し、且つ(b)ヒンダードスルフヒドリル基を持つアシル基を伴ったアシル化されたアミノ酸側鎖を有するマイタンシノイドであり、その際、チオール官能性を持つアシル基の炭素原子は1または2の置換基を有し、前記置換基は、1〜10の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキルまたはアルケニル、3〜10の炭素原子を有する環状のアルキルまたはアルケニル、フェニル、置換されたフェニル、または複素環芳香族ラジカルまたはヘテロシクロアルキルラジカルであり、さらに、置換基の1つはHであることができ、アシル基はカルボニル官能基とイオウ原子の間で少なくとも炭素原子3つの直鎖長を有する。
本明細書に記載されている本発明がさらに完全に理解されるために、以下の実施例が示される。これらの実施例は説明目的だけのためのものであり、どんな方法でも本発明を限定するようには解釈されるべきではないことが理解されるべきである。
本発明に含まれるのはまた、本明細書に記載されている方法(たとえば、第1、第2または第3の実施形態、または第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、第18、第19、第20、第21、第22、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、第30、第31、第32、第33、第34、第35、第36、第37、第38、第39、第40、第41、第42、第43の具体的な実施形態に記載されている方法)によって調製される細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートである。
一実施形態では、本発明の方法によって調製されるコンジュゲートは以下の構造式:
の1つまたは薬学上許容できるその塩によって表され、式中、CBA−NH2は細胞結合剤であり;Mは、−HまたはNa+もしくはK+のような薬学上許容できるカチオンであり;rは1〜10の整数である。
実施例1
化合物1a
(5−アミノ−1,3−フェニレン)ジメタノール(1.01g,6.59ミリモル)の無水ジメチルホルムアミド(16.48mL)と無水テトラヒドロフラン(16.48ml)における撹拌された溶液に、4−メチル−4−(メチルジスルファニル)ペンタン酸(1.281g,6.59ミリモル)と、N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩(2.53g,13.19ミリモル)と、4−ジメチルアミノピリジン(0.081g,0.659ミリモル)を加えた。得られた混合物を室温で18時間撹拌した。この反応は、飽和塩化アンモニウム溶液で反応を止め、酢酸エチル(3×50mL)で抽出した。有機抽出物を水及びブラインで洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を濾過し、真空で濃縮し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィ(酢酸エチル/ヘキサン)によって精製して白色固形物(0.70g、収率32%)として化合物1aを得た。1H−NMR(400MHz,DMSO−d6:δ9.90(s,1H),7.43(s,2H),6.93(s,1H),5.16(t,2H,J=5.7Hz),4.44(d,4H,J=5.7Hz),2.43(s,3H),2.41−2.38(m,2H),1.92−1.88(m,2H),1.29(s,6H).MS(m/z),分析値330.0(M+1)+。
(5−アミノ−1,3−フェニレン)ジメタノール(1.01g,6.59ミリモル)の無水ジメチルホルムアミド(16.48mL)と無水テトラヒドロフラン(16.48ml)における撹拌された溶液に、4−メチル−4−(メチルジスルファニル)ペンタン酸(1.281g,6.59ミリモル)と、N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩(2.53g,13.19ミリモル)と、4−ジメチルアミノピリジン(0.081g,0.659ミリモル)を加えた。得られた混合物を室温で18時間撹拌した。この反応は、飽和塩化アンモニウム溶液で反応を止め、酢酸エチル(3×50mL)で抽出した。有機抽出物を水及びブラインで洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を濾過し、真空で濃縮し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィ(酢酸エチル/ヘキサン)によって精製して白色固形物(0.70g、収率32%)として化合物1aを得た。1H−NMR(400MHz,DMSO−d6:δ9.90(s,1H),7.43(s,2H),6.93(s,1H),5.16(t,2H,J=5.7Hz),4.44(d,4H,J=5.7Hz),2.43(s,3H),2.41−2.38(m,2H),1.92−1.88(m,2H),1.29(s,6H).MS(m/z),分析値330.0(M+1)+。
化合物1a(219mg,0.665ミリモル)の冷却した(−10℃)無水ジクロロメタン(6.65mL)溶液にトリエチルアミン(463μl,3.32ミリモル)を加え、その後、無水メタンスルホン酸(298mg,1.662ミリモル)を一滴ずつ加えた。混合物を−10℃で2時間撹拌し、次いで氷水で混合物の反応を止め、冷却した酢酸エチル(2×30mL)で抽出した。有機抽出物を氷水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗精製のジメシレートを得た。
粗精製のジメシレート(227mg,0.467ミリモル)及びIGN単量体A(303mg,1.028ミリモル)を無水DMF(3.11mL)に溶解した。炭酸カリウム(161mg,1.169ミリモル)を加え、混合物を室温で18時間撹拌した。脱イオン水を加え、得られた沈殿物を濾過し、水ですすいだ。固形物をジクロロメタンに再溶解し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗精製の残留物をシリカゲルクロマトグラフィ(メタノール/ジクロロメタン)によって精製して化合物1b(227mg、収率36%)を得た。MS(m/z),分析値882.5(M+1)+。
化合物1b(227mg,0.167ミリモル)の無水1,2−ジクロロエタン(3.346mL)懸濁液にトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(37.3mg,0.167ミリモル)を加えた。混合物を室温で1時間撹拌し、飽和塩化アンモニウム溶液で反応を止めた。混合物をジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗精製の残留物をRP−HPLC(C18、水/アセトニトリル)によって精製した。所望の生成物を含有する分画をジクロロメタンで抽出し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して化合物1c(35mg、収率19%)を得た。MS(m/z),分析値884.3(M+1)+。
化合物1c(18mg,0.017ミリモル)のアセトニトリル(921μL)とメタノール(658μL)の溶液にリン酸ナトリウム緩衝液中の(132μL,0.75M,pH6.5)中のトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(17.51mg,0.060ミリモル)(飽和重炭酸ナトリウム溶液(0.2mL)で中和した)を加えた。混合物を室温で3.5時間撹拌し、次いでジクロロメタンと脱イオン水で希釈した。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗精製のチオールを得た。MS(m/z),分析値838.3(M+1)+。
工程5に由来する粗精製のチオール(15.5mg,0.018ミリモル)を2−プロパノール(1.23mL)に溶解した。脱イオン水(617μL)及び重亜硫酸ナトリウム(5.77mg,0.055ミリモル)を混合物に加え、室温で混合物を5時間撹拌した。反応物をアセトン/ドライアイス槽にて凍結し、凍結乾燥し、RP−HPLC(C18、脱イオン水/アセトニトリル)によって精製した。所望の生成物を含有する分画を凍結し、凍結乾燥して化合物(12S,12aS)−9−((3−(4−メルカプト−4−メチルペンタンアミド)−5−((((R)−8−メトキシ−6−オキソ−11,12,12a,13−テトラヒドロ−6H−ベンゾ[5,6][1,4]ジアゼピノ[1,2−a]インドール−9−イル)オキシ)メチル)ベンジル)オキシ)−8−メトキシ−6−オキソ−11,12,12a,13−テトラヒドロ−6H−ベンゾ[5,6][1,4]ジアゼピノ[1,2−a]インドール−12−スルホン酸(化合物1d)(6.6mg、収率39%)を得た。MS(m/z)、分析値918.2(M−1)−。
実施例2
2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(((S)−1−(((S)−1−((3−((((S)−8−メトキシ−6−オキソ−11,12,12a,13−テトラヒドロ−6H−ベンゾ[5,6][1,4]ジアゼピノ[1,2−a]インドール−9−イル)オキシ)メチル)−5−((((R)−8−メトキシ−6−オキソ−12a,13−ジヒドロ−6H−ベンゾ[5,6][1,4]ジアゼピノ[1,2−a]インドール−9−イル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−6−オキソヘキサノエート、化合物90の合成。
工程1
(S)−2−(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸(5g,22.40ミリモル)及び(S)−tert−ブチル2−アミノプロパノエート塩酸塩(4.48g,24.64ミリモル)を無水DMF(44.8mL)に溶解した。EDC・HCl(4.72g,24.64ミリモル)とHOBt(3.43g,22.40ミリモル)とDIPEA(9.75mL,56.0ミリモル)とを加えた。反応物をアルゴンのもと室温にて一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、次いで飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。粗精製の油をシリカゲルクロマトグラフィ(ヘキサン/酢酸エチル)を介して精製して化合物2aを得た(6.7g、収率85%)。1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ7.38−7.31(m,5H),6.53−6.42(m,1H),5.42−5.33(m,1H),5.14(s,2H),4.48−4.41(m,1H),4.32−4.20(m,1H),1.49(s,9H),1.42(d,3H,J=6.8Hz),1.38(d,3H,J=7.2Hz)。
2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(((S)−1−(((S)−1−((3−((((S)−8−メトキシ−6−オキソ−11,12,12a,13−テトラヒドロ−6H−ベンゾ[5,6][1,4]ジアゼピノ[1,2−a]インドール−9−イル)オキシ)メチル)−5−((((R)−8−メトキシ−6−オキソ−12a,13−ジヒドロ−6H−ベンゾ[5,6][1,4]ジアゼピノ[1,2−a]インドール−9−イル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−6−オキソヘキサノエート、化合物90の合成。
(S)−2−(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸(5g,22.40ミリモル)及び(S)−tert−ブチル2−アミノプロパノエート塩酸塩(4.48g,24.64ミリモル)を無水DMF(44.8mL)に溶解した。EDC・HCl(4.72g,24.64ミリモル)とHOBt(3.43g,22.40ミリモル)とDIPEA(9.75mL,56.0ミリモル)とを加えた。反応物をアルゴンのもと室温にて一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、次いで飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。粗精製の油をシリカゲルクロマトグラフィ(ヘキサン/酢酸エチル)を介して精製して化合物2aを得た(6.7g、収率85%)。1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ7.38−7.31(m,5H),6.53−6.42(m,1H),5.42−5.33(m,1H),5.14(s,2H),4.48−4.41(m,1H),4.32−4.20(m,1H),1.49(s,9H),1.42(d,3H,J=6.8Hz),1.38(d,3H,J=7.2Hz)。
化合物2a(6.7g,19.12ミリモル)をメタノール(60.7mL)と水(3.03mL)に溶解した。溶液をアルゴンで5分間パージした。炭素上のパラジウム(湿った,10%)(1.017g,0.956ミリモル)をゆっくり加えた。反応物を水素の雰囲気下で一晩撹拌した。セライトを介して溶液を濾過し、メタノールですすぎ、濃縮した。それをメタノール及びアセトニトリルと共に共沸し、得られた油を高真空に直接置いて化合物2b(4.02g、収率97%)を得た。これは次の工程で直接使用される。1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ7.78−7.63(m,1H),4.49−4.42(m,1H),3.55−3.50(m,1H),1.73(s,2H),1.48(s,9H),1.39(d,3H,J=7.2Hz),1.36(d,3H,J=6.8Hz)。
化合物2b(4.02g,18.59ミリモル)及びモノメチルアジペート(3.03mL,20.45ミリモル)を無水DMF(62.0mL)に溶解した。EDC・HCl(3.92g,20.45ミリモル)とHOBt(2.85g,18.59ミリモル)とDIPEA(6.49mL,37.2ミリモル)を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。反応物をジクロロメタン/メタノール(150mL、5:1)で希釈し、飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム及びブラインで洗浄した。それを硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、揮散させた。化合物をアセトニトリル(5×)と共に共沸し、次いで35℃にて高真空に送り込み、化合物2cを得た(6.66g、収率100%)。精製することなく粗精製物質を次の工程で利用した。1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ6.75(d,1H,J=6.8Hz),6.44(d,1H,J=6.8Hz),4.52−4.44(m,1H),4.43−4.36(m,1H),3.65(s,3H),2.35−2.29(m,2H),2.25−2.18(m,2H),1.71−1.60(m,4H),1.45(s,9H),1.36(t,6H,J=6.0Hz)。
化合物2c(5.91g,16.5ミリモル)をTFA(28.6mL,372ミリモル)及び脱イオン水(1.5mL)にて室温で3時間撹拌した。反応混合物をアセトニトリルで濃縮し、高真空に置いて粘着性固形物(5.88g、収率100%)として粗精製の化合物2dを得た。1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ7.21(d,1H,J=6.8Hz),6.81(d,1H,J=7.6Hz),4.69−4.60(m,1H),4.59−4.51(m,1H),3.69(s,3H),2.40−2.33(m,2H),2.31−2.24(m,2H),1.72−1.63(m,4H),1.51−1.45(m,3H),1.42−1.37(m,3H)。
化合物2d(5.6g,18.52ミリモル)を無水ジクロロメタン(118mL)と無水メタノール(58.8mL)に溶解した。(5−アミノ−1,3−フェニレン)ジメタノール(2.70g,17.64ミリモル)とEEDQ(8.72g,35.3ミリモル)を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。溶媒を揮散させ、酢酸エチルを加えた。得られたスラリーを濾過し、酢酸エチルで洗浄し、真空/N2下で乾燥させて化合物2e(2.79g、収率36%)を得た。1H−NMR(400MHz,DMSO−d6):δ9.82(s,1H),8.05,(d,1H,J=9.2Hz),8.01(d,1H,J=7.2Hz),7.46(s,2H),6.95(3,1H),5.21−5.12(m,2H),4.47−4.42(m,4H),4.40−4.33(m,1H),4.33−4.24(m,1H),3.58(s,3H),2.33−2.26(m,2H),2.16−2.09(m,2H),1.54−1.46(m,4H),1.30(d,3H,J=7.2Hz),1.22(d,3H,J=4.4Hz)。
化合物2e(0.52g,1.189ミリモル)と四臭化炭素(1.183g,3.57ミリモル)を無水DMF(11.89mL)に溶解した。トリフェニルホスフィン(0.935g,3.57ミリモル)を加え、アルゴンのもとで反応物を4時間撹拌した。反応混合物をDCM/MeOH(10:1)で希釈し、水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗精製物質をシリカゲルクロマトグラフィ(DCM/MeOH)によって精製して化合物2f(262mg、収率39%)を得た。1H−NMR(400MHz,DMSO−d6):δ10.01(s,1H),8.11(d,1H,J=6.8Hz),8.03(d,1H,J=6.8Hz),7.67(s,2H),7.21(s,1H),4.70−4.64(m,4H),4.40−4.32(m,1H),4.31−4.23(m,1H),3.58(s,3H),2.34−2.26(m,2H),2.18−2.10(m,2H),1.55−1.45(m,4H),1.31(d,3H,J=7.2Hz),1.21(d,3H,J=7.2Hz)。
二臭化化合物2fとIGN単量体化合物AをDMFに溶解した。炭酸カリウムを加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に水を加え、生成物を沈殿させた。室温でスラリーを撹拌し、ついで濾過し、真空/N2下で乾燥させた。粗精製物質をシリカゲルクロマトグラフィ(ジクロロメタン/メタノール)によって精製して化合物2g(336mg、収率74%)を得た。LCMS=5.91分(15分法)。MS(m/z):990.6(M+1)+。
ジイミン化合物2gを1,2−ジクロロエタンに溶解した。NaBH(OAc)3(STAB)を反応混合物に加え、室温にて1時間撹拌した。反応物をCH2Cl2で希釈し、飽和NH4Cl溶液で反応を止めた。層を分離し、ブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濃縮した。RPHPLC(C18カラム,アセトニトリル/水)を介して粗精製物質を精製し、化合物2h(85.5mg、収率25%)を得た。LCMS=6.64分(15分法)。MS(m/z):992.6(M+1)+。
化合物2hを1,2−ジクロロエタンに溶解した。トリメチルスタンナノールを反応混合物に加え、80℃で一晩加熱した。次いで反応混合物をRTに冷却し、水で希釈した。水性層を1MのHClでpH約4に酸性化した。混合物をCH2Cl2/MeOHで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濃縮した。シリカのプラグに粗精製物質を通して化合物2i(48.8mg、収率80%)を得た。LCMS=5.89分(15分法)。MS(m/z):978.6(M+1)+。
酸化合物2iとN−ヒドロキシスクシンアミドのCH2Cl2における撹拌した溶液にRTでEDC・HClを加えた。反応混合物を2時間撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。RPHPLC(C18カラム,アセトニトリル/水)を介して粗精製物質を精製し、2,5−ジオキソピロリジン−1−イル 6−(((S)−1−(((S)−1−((3−((((S)−8−メトキシ−6−オキソ−11,12,12a,13−テトラヒドロ−6H−ベンゾ[5,6][1,4]ジアゼピノ[1,2−a]インドール−9−イル)オキシ)メチル)−5−((((R)−8−メトキシ−6−オキソ−12a,13−ジヒドロ−6H−ベンゾ[5,6][1,4]ジアゼピノ[1,2−a]インドール−9−イル)オキシ)メチル)フェニル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−1−オキソプロパン−2−イル)アミノ)−6−オキソヘキサノエート、化合物2j(8.2mg,収率30%)を得た。LCMS=6.64分(15分法)。MS(m/z):1075.4(M+1)+
実施例3
コンジュゲート:以前のプロトコール
AbX、ヒト抗GCC抗体、5F9(配列番号19の重鎖アミノ酸配列と配列番号20の軽鎖アミノ酸配列を有する)をコンジュゲートに先立って15mMのHEPES、pH8.5に緩衝液交換した。次いで化合物(IIe)のスルホン化形態を用いてAbX−(Ie)コンジュゲートを調製した。90/10の有機溶液:水溶液にて5倍モル過剰の重亜硫酸ナトリウム及び50mMのコハク酸塩(pH5.0)と共に化合物(IIe)を室温で3時間インキュベートし、その後4℃で一晩インキュベートすることによって化合物(Ie)を先ずスルホン化した。次いで、15mMのHEPES、pH8.5における2.0mg/mLのAbX抗体と、抗体に基づいた特定のモル過剰での化合物(Ie)の添加を用いてコンジュゲート反応を行った(代表的なコンジュゲートについては表1を参照のこと)。コンジュゲート反応物は最終的な90/10の15mMのHEPES、pH8.5とDMAの水性:有機の組成を有し、製剤化緩衝液(10mMのヒスチジン、50mMの塩化ナトリウム、8.5%スクロース、0.01%Tween−20、50μMの重亜硫酸ナトリウム、pH6.2)への精製に先立って、25℃の水槽にて4時間インキュベートした。
コンジュゲート:以前のプロトコール
AbX、ヒト抗GCC抗体、5F9(配列番号19の重鎖アミノ酸配列と配列番号20の軽鎖アミノ酸配列を有する)をコンジュゲートに先立って15mMのHEPES、pH8.5に緩衝液交換した。次いで化合物(IIe)のスルホン化形態を用いてAbX−(Ie)コンジュゲートを調製した。90/10の有機溶液:水溶液にて5倍モル過剰の重亜硫酸ナトリウム及び50mMのコハク酸塩(pH5.0)と共に化合物(IIe)を室温で3時間インキュベートし、その後4℃で一晩インキュベートすることによって化合物(Ie)を先ずスルホン化した。次いで、15mMのHEPES、pH8.5における2.0mg/mLのAbX抗体と、抗体に基づいた特定のモル過剰での化合物(Ie)の添加を用いてコンジュゲート反応を行った(代表的なコンジュゲートについては表1を参照のこと)。コンジュゲート反応物は最終的な90/10の15mMのHEPES、pH8.5とDMAの水性:有機の組成を有し、製剤化緩衝液(10mMのヒスチジン、50mMの塩化ナトリウム、8.5%スクロース、0.01%Tween−20、50μMの重亜硫酸ナトリウム、pH6.2)への精製に先立って、25℃の水槽にて4時間インキュベートした。
コンジュゲート:最適化されたプロトコール
化合物(Ie)の等張強度、伝導性、pH、反応濃度及びモル当量を含む種々のパラメータを調べて所望のAbX−(Ie)コンジュゲートの収率を最適化した。75mMのEPPS、pH8.0緩衝液を利用する最適化されたプロトコールはこれらの研究から明らかになった。標準の基盤プロトコールに類似して、AbX−(Ie)コンジュゲートは化合物(IIe)のスルホン化形態(前のセクションで記載されているように調製される)である化合物(Ie)を用いて作製された。最適化されたコンジュゲート反応は、75mMのEPPS、pH8.0における2.0mg/mLのAbX抗体と、抗体に基づく特定のモル過剰での化合物(Ie)の添加とを用いて実施された(代表的なコンジュゲートについては表2を参照のこと)。コンジュゲート反応物は最終的な90/10の75mMのEPPS、pH8.0とDMAの水性:有機の組成を有し、製剤化緩衝液(10mMのヒスチジン、50mMの塩化ナトリウム、8.5%スクロース、0.01%Tween−20、50μMの重亜硫酸ナトリウム、pH6.2)への精製に先立って、25℃の水槽にて4時間インキュベートした。
化合物(Ie)の等張強度、伝導性、pH、反応濃度及びモル当量を含む種々のパラメータを調べて所望のAbX−(Ie)コンジュゲートの収率を最適化した。75mMのEPPS、pH8.0緩衝液を利用する最適化されたプロトコールはこれらの研究から明らかになった。標準の基盤プロトコールに類似して、AbX−(Ie)コンジュゲートは化合物(IIe)のスルホン化形態(前のセクションで記載されているように調製される)である化合物(Ie)を用いて作製された。最適化されたコンジュゲート反応は、75mMのEPPS、pH8.0における2.0mg/mLのAbX抗体と、抗体に基づく特定のモル過剰での化合物(Ie)の添加とを用いて実施された(代表的なコンジュゲートについては表2を参照のこと)。コンジュゲート反応物は最終的な90/10の75mMのEPPS、pH8.0とDMAの水性:有機の組成を有し、製剤化緩衝液(10mMのヒスチジン、50mMの塩化ナトリウム、8.5%スクロース、0.01%Tween−20、50μMの重亜硫酸ナトリウム、pH6.2)への精製に先立って、25℃の水槽にて4時間インキュベートした。
表2に示すように、コンジュゲートの収率は、pH8.5でのイオン強度が低い緩衝液を使用する前のプロトコールに比べてpH8.0でのイオン強度が高い緩衝液の使用が関与するプロトコールによって24%から64%に上昇し、約2倍の上昇だった。
精製
20mMのヒスチジン、50mMの塩化ナトリウム、8.5%スクロース、0.01%Tween−20、50μMの重亜硫酸ナトリウム、pH6.2によって平衡化したセファデックスG−25NAPカラムを用いてAbX−(Ie)コンジュゲートの反応混合物を精製した。0.22μmのPVDF注射器フィルターを用いて、精製されたコンジュゲートを濾過し、4℃にて新しい製剤化緩衝液に対して一晩透析し、その後、新しい製剤化緩衝液を用いて常温にて4時間透析した。分析前に0.22μmのPVDF注射器フィルターを用いて、コンジュゲートを再濾過した。
20mMのヒスチジン、50mMの塩化ナトリウム、8.5%スクロース、0.01%Tween−20、50μMの重亜硫酸ナトリウム、pH6.2によって平衡化したセファデックスG−25NAPカラムを用いてAbX−(Ie)コンジュゲートの反応混合物を精製した。0.22μmのPVDF注射器フィルターを用いて、精製されたコンジュゲートを濾過し、4℃にて新しい製剤化緩衝液に対して一晩透析し、その後、新しい製剤化緩衝液を用いて常温にて4時間透析した。分析前に0.22μmのPVDF注射器フィルターを用いて、コンジュゲートを再濾過した。
分析方法
精製したコンジュゲート試料における抗体及び細胞毒性剤(D)の濃度は280nm及び330nmでの吸光度の値を用いるUV/Visによって決定した。抗体及び細胞毒性剤は双方とも280nmで吸収するので、各部分に起因する総シグナルの一部を検討するには2項方程式が必要とされた。細胞毒性剤であるインドリノベンゾジアゼピン(IGN)のみが330nmで吸収するので、その波長での濃度は細胞毒性剤にのみ起因し得る。コンジュゲートした部分の吸光係数の値を表3でリストにする。
精製したコンジュゲート試料における抗体及び細胞毒性剤(D)の濃度は280nm及び330nmでの吸光度の値を用いるUV/Visによって決定した。抗体及び細胞毒性剤は双方とも280nmで吸収するので、各部分に起因する総シグナルの一部を検討するには2項方程式が必要とされた。細胞毒性剤であるインドリノベンゾジアゼピン(IGN)のみが330nmで吸収するので、その波長での濃度は細胞毒性剤にのみ起因し得る。コンジュゲートした部分の吸光係数の値を表3でリストにする。
各波長での各構成成分の寄与を説明する以下の代数的表現を用いて抗体及び細胞毒性剤の成分を定量した。
CD=A330/ε330nmIGN
CAb=(A280−(ε280nmIGN/ε330nmIGN)×A330)/ε280nmAb
CD=A330/ε330nmIGN
CAb=(A280−(ε280nmIGN/ε330nmIGN)×A330)/ε280nmAb
AxはXnmの波長での吸光度の値であり、CAbは抗体(すなわち、AbX)のモル濃度であり、CDは細胞毒性剤のモル濃度である。細胞毒性剤:Abの比(DAR)は上記のモル濃度の比として算出された。AbX及び細胞毒性剤のmg/mL(g/L)濃度は表3でリストにした分子量を用いて算出された。
単量体コンジュゲートの割合を決定すること
精製したAbX−細胞毒性剤試料における単量体コンジュゲートの比率を、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)を用いたHPLC解析を介して決定した。SECカラム(TSK GEL G3000SW×l 5μm,7.8mm×30cm,部品番号08541;推奨ガードカラムTSK GEL,4cm,部品番号08543,TOSOH Biosciences,King of Prussia,PA)を備え、400mMの過塩素酸ナトリウムと50mMのリン酸ナトリウムと5%のイソプロパノールとの定組成移動相と共に0.5mL/分で測定するHPLC機器におよそ10〜100μgのAbX−細胞毒性剤コンジュゲートを注入した。280nM及び330nmの波長で吸光度シグナルを30分間収集した。
精製したAbX−細胞毒性剤試料における単量体コンジュゲートの比率を、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)を用いたHPLC解析を介して決定した。SECカラム(TSK GEL G3000SW×l 5μm,7.8mm×30cm,部品番号08541;推奨ガードカラムTSK GEL,4cm,部品番号08543,TOSOH Biosciences,King of Prussia,PA)を備え、400mMの過塩素酸ナトリウムと50mMのリン酸ナトリウムと5%のイソプロパノールとの定組成移動相と共に0.5mL/分で測定するHPLC機器におよそ10〜100μgのAbX−細胞毒性剤コンジュゲートを注入した。280nM及び330nmの波長で吸光度シグナルを30分間収集した。
AbX抗体単量体は通常約17分で溶出した一方で、AbX−細胞毒性剤コンジュゲート単量体は約17分と約19分でのピークを持つダブレットとして溶出することが多かった。高分子量種(HMW、たとえば、二量体、集合体)及び低分子量種(LMW、断片)は通常それぞれ約12分及び約24分で溶出した。
%単量体抗体(またはコンジュゲート)は17分ピーク(または17/19ダブレット)の280nmピーク面積から算出し、合わせたタンパク質ピークすべての面積と比較した。
単量体ピークにおけるDARも、上記セクションで示したCD及びCAbの方程式にて280nm及び330nmでのシグナルのピーク面積をA280及びA330の空欄に代入し、次いでCD/CAbを分けることによって決定される。
未コンジュゲートの細胞毒性剤の割合を決定すること
精製したコンジュゲート試料に存在する未コンジュゲートの細胞毒性剤(「遊離の薬剤」)の量は、直列SECカラム及びC−18逆相カラム(「二重カラム」)を用いたUPLC解析を介して決定した。2つのWaters Acquity UPLCタンパク質BEH SECカラム(1.7μm,4.6×30mm,部品番号186005793,Waters Corporation,Milford,MA)を順次接続してインタクトのコンジュゲートを遊離の薬剤から分離し、次いでそれをWaters Cortecs UPLC C−18カラム(2.1×50mm,部品番号186007093)に導いて遊離のCDA種を分離し、定量した。アセトニトリル(ACN)で20%(v/v)ACNに希釈することによってコンジュゲートを調製し、カラムシリーズに注入し(25μL)、表4でリストにした勾配に従って流した。
精製したコンジュゲート試料に存在する未コンジュゲートの細胞毒性剤(「遊離の薬剤」)の量は、直列SECカラム及びC−18逆相カラム(「二重カラム」)を用いたUPLC解析を介して決定した。2つのWaters Acquity UPLCタンパク質BEH SECカラム(1.7μm,4.6×30mm,部品番号186005793,Waters Corporation,Milford,MA)を順次接続してインタクトのコンジュゲートを遊離の薬剤から分離し、次いでそれをWaters Cortecs UPLC C−18カラム(2.1×50mm,部品番号186007093)に導いて遊離のCDA種を分離し、定量した。アセトニトリル(ACN)で20%(v/v)ACNに希釈することによってコンジュゲートを調製し、カラムシリーズに注入し(25μL)、表4でリストにした勾配に従って流した。
カラムは2.2分でインラインSECからC−18に変え、14.0分でインラインSECに戻した。シグナルは265nmで収集した。化合物(Ie)に由来する標準曲線を用い、以下の式:
ng遊離=(AUC265nm+11805)/4888
%遊離CDA=ng遊離/ng注入
を用いて、2.2〜14.0分のウインドウで見いだされたピークから試料に存在する遊離の薬剤の量を算出した。
ng遊離=(AUC265nm+11805)/4888
%遊離CDA=ng遊離/ng注入
を用いて、2.2〜14.0分のウインドウで見いだされたピークから試料に存在する遊離の薬剤の量を算出した。
表5に示すように、pH8でのイオン強度の高い緩衝液を用いたコンジュゲートはpH8.5でのイオン強度の低い緩衝液を用いたコンジュゲートに比べて反応収率の有意な上昇を生じる。
実施例5
実施例3に記載されている、75mMのEPPS、pH8.0の緩衝液を利用するプロトコールを用いて5F9−PVAdG−(Ie)コンジュゲートを調製した。5F9−PVAdG抗体は、IgG1の重鎖(配列番号9)にてFcγRIIIbを結合するのに重要であるELLGを類似の位置にてIgG2で高度に保存されたアミノ酸であるPVAで置き換えるアミノ酸置換を含有する(Vidarsson,et al.,IgG subclasses and allotypes:from structure to effector functions,Frontiers in Immunology,5(520):1−17(2014))。
実施例3に記載されている、75mMのEPPS、pH8.0の緩衝液を利用するプロトコールを用いて5F9−PVAdG−(Ie)コンジュゲートを調製した。5F9−PVAdG抗体は、IgG1の重鎖(配列番号9)にてFcγRIIIbを結合するのに重要であるELLGを類似の位置にてIgG2で高度に保存されたアミノ酸であるPVAで置き換えるアミノ酸置換を含有する(Vidarsson,et al.,IgG subclasses and allotypes:from structure to effector functions,Frontiers in Immunology,5(520):1−17(2014))。
コンジュゲート反応は、抗体に基づいた特定のモル過剰での化合物(IIe)のスルホン化形態の添加と共に、75mMのEPPS、pH8.0における2.0mg/mLでの5F9−PVAdG抗体を用いて実施した(代表的なコンジュゲートについては表6を参照のこと)。コンジュゲート反応は最終的な90/10の75mMのEPPS、pH8.0とDMAの水性:有機の組成を有し、製剤化緩衝液(10mMのヒスチジン、50mMの塩化ナトリウム、8.5%スクロース、0.01%Tween−20、50μMの重亜硫酸ナトリウム、pH6.2)への精製に先立って、25℃の水槽にて4時間インキュベートした。
10mMのヒスチジン、50mMの塩化ナトリウム、8.5%スクロース、0.01%Tween−20、50μMの重亜硫酸ナトリウム、pH6.2によって平衡化したセファデックスG−25HiPrepカラムを用いて5F9−PVAdG−(Ie)コンジュゲートの反応混合物を精製した。解析の前に0.22μmのPVDF注射器フィルターを用いて、精製したコンジュゲートを濾過した。
実施例6
最適化したスルホン化
化合物(IIe)を以下のようにスルホン化して化合物(Ie)を生成した。3.75mLの50mMコハク酸ナトリウム、pH3.3溶液に6.11mL量のDMAを加えた。水槽にて混合し、10℃に平衡化した後、DMA中21.5mMの化合物(IIe)ストック1.39mL(30.0マイクロモルの化合物(IIe))を加え、混合した。この添加に続いて、20mMの重炭酸ナトリウム水溶液3.75mL(2.5当量、75マイクロモル)を反応物に導入した。混合した後、反応を10℃で15.5時間進め、精製することなく直ちに次の工程で使用した。反応混合物の液体クロマトグラフィ(逆相)解析は2.4%の残りの未反応化合物(IIe)を伴って92.4%の化合物(Ie)への変換を示した。
最適化したスルホン化
化合物(IIe)を以下のようにスルホン化して化合物(Ie)を生成した。3.75mLの50mMコハク酸ナトリウム、pH3.3溶液に6.11mL量のDMAを加えた。水槽にて混合し、10℃に平衡化した後、DMA中21.5mMの化合物(IIe)ストック1.39mL(30.0マイクロモルの化合物(IIe))を加え、混合した。この添加に続いて、20mMの重炭酸ナトリウム水溶液3.75mL(2.5当量、75マイクロモル)を反応物に導入した。混合した後、反応を10℃で15.5時間進め、精製することなく直ちに次の工程で使用した。反応混合物の液体クロマトグラフィ(逆相)解析は2.4%の残りの未反応化合物(IIe)を伴って92.4%の化合物(Ie)への変換を示した。
コンジュゲート後の反応停止
コンジュゲート後のイオン強度の上昇が高分子量(HMW)種の形成の低下を生じる条件を決定するために、以下の最適化を行った。5F9抗体(2mg/mL)を22℃にて80〜90分間、3.8モル当量の化合物(Ie)にコンジュゲートさせた。コンジュゲート反応物の最終組成は体積で15%のDMAを伴った130mMのEPPS、pH8.7で構成された。コンジュゲート反応が完了次第直ちに、表7で詳述されているような指示された体積の反応停止溶液でアリコートを希釈した。22℃で保持して指示された時間、パーセントHMW種の変化をモニターした。この知見に基づいて、300、500または700mMのEPPS反応停止溶液を用いた2倍希釈、750mMのEPPSを用いた1.4〜1.6倍希釈、及び750mMのEPPS/150mMのヒスチジン塩酸塩を用いた1.4〜1.6倍希釈を選択した。以下のコンジュゲート例では、750mMのEPPS/150mMのヒスチジン塩酸塩を用いた1.5倍希釈を用いた。表7は粗精製の5F9−(Ie)コンジュゲートの安定性に対する反応停止溶液の影響を示す。粗精製の5F9−(Ie)コンジュゲートを特定の時間量の間、様々な反応停止溶液と共にインキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィによってパーセント分子量種における変化を測定した。
コンジュゲート後のイオン強度の上昇が高分子量(HMW)種の形成の低下を生じる条件を決定するために、以下の最適化を行った。5F9抗体(2mg/mL)を22℃にて80〜90分間、3.8モル当量の化合物(Ie)にコンジュゲートさせた。コンジュゲート反応物の最終組成は体積で15%のDMAを伴った130mMのEPPS、pH8.7で構成された。コンジュゲート反応が完了次第直ちに、表7で詳述されているような指示された体積の反応停止溶液でアリコートを希釈した。22℃で保持して指示された時間、パーセントHMW種の変化をモニターした。この知見に基づいて、300、500または700mMのEPPS反応停止溶液を用いた2倍希釈、750mMのEPPSを用いた1.4〜1.6倍希釈、及び750mMのEPPS/150mMのヒスチジン塩酸塩を用いた1.4〜1.6倍希釈を選択した。以下のコンジュゲート例では、750mMのEPPS/150mMのヒスチジン塩酸塩を用いた1.5倍希釈を用いた。表7は粗精製の5F9−(Ie)コンジュゲートの安定性に対する反応停止溶液の影響を示す。粗精製の5F9−(Ie)コンジュゲートを特定の時間量の間、様々な反応停止溶液と共にインキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィによってパーセント分子量種における変化を測定した。
最適化したコンジュゲート及び精製
130mMのEPPS、pH8.7を325mL含有する頂部撹拌機を備えた1Lのジャケット付きガラス反応器に68.6mLのDMAを加えた。溶液の混合及び22℃への平衡化に続いて、130mMのEPPS、pH8.7中10.0mg/mLの5F9抗体の溶液100mLを反応器に導入し、15分間混合した。その後、2mMの化合物(Ie)の溶液12.8mL(25.5マイクロモル、5F9抗体の3.7当量;以前記載された最適化されたスルホン化プロトコールを用いて調製された)を反応溶液に導入した。22℃で60分間撹拌した後、150mMのヒスチジン塩酸塩及び750mMのEPPSを含有する水溶液250mLを反応容器に移した。十分に混合することに続いて、Millipore Optiscale 47 Express SHC 0.5/0.2μMのフィルターを介してこの物質を濾過した。次いでTangenX 0.02m2 HyStream 30 kD Sius LSN TFFカセットによる限外濾過によって粗精製の反応混合物を2.5mg/mLの計算されたバルクタンパク質の濃度に濃縮した。濃縮工程に続いて、50mMヒスチジン、6.7w/v(重量/体積)%のスクロース、0.1v/v(体積/体積)%のポリソルベート80、50μM重亜硫酸ナトリウム、pH5.5の緩衝液4.8Lに対して溶液を透析濾過した。透析濾過の後、0.1v/v(体積/体積)%のポリソルベート80の最終濃度でポリソルベート80を保持液溶液に加え、得られた溶液をMillipore Optiscale 47 Express SHC 0.5/0.2μMのフィルターで濾過した。2℃〜8℃での2日間の保存に続いて、追加の50mMヒスチジン、6.7w/v%のスクロース、0.1v/v%のポリソルベート80、50μM重亜硫酸ナトリウム、pH5.5の緩衝液の必要容量の添加によって溶液を1.0mg/mLのコンジュゲートに希釈した。次いでMillipore Optiscale 47 Durapore 0.22μMフィルターを介してこの溶液を濾過し、1.0mg/mLのコンジュゲート818mLを得た。最終的なコンジュゲートの測定されたDARは97.4%の単量体によるUV/Vis及びSECによる2.5%HMWによって2.6である。生成物の最終的な収率は82%だった。
130mMのEPPS、pH8.7を325mL含有する頂部撹拌機を備えた1Lのジャケット付きガラス反応器に68.6mLのDMAを加えた。溶液の混合及び22℃への平衡化に続いて、130mMのEPPS、pH8.7中10.0mg/mLの5F9抗体の溶液100mLを反応器に導入し、15分間混合した。その後、2mMの化合物(Ie)の溶液12.8mL(25.5マイクロモル、5F9抗体の3.7当量;以前記載された最適化されたスルホン化プロトコールを用いて調製された)を反応溶液に導入した。22℃で60分間撹拌した後、150mMのヒスチジン塩酸塩及び750mMのEPPSを含有する水溶液250mLを反応容器に移した。十分に混合することに続いて、Millipore Optiscale 47 Express SHC 0.5/0.2μMのフィルターを介してこの物質を濾過した。次いでTangenX 0.02m2 HyStream 30 kD Sius LSN TFFカセットによる限外濾過によって粗精製の反応混合物を2.5mg/mLの計算されたバルクタンパク質の濃度に濃縮した。濃縮工程に続いて、50mMヒスチジン、6.7w/v(重量/体積)%のスクロース、0.1v/v(体積/体積)%のポリソルベート80、50μM重亜硫酸ナトリウム、pH5.5の緩衝液4.8Lに対して溶液を透析濾過した。透析濾過の後、0.1v/v(体積/体積)%のポリソルベート80の最終濃度でポリソルベート80を保持液溶液に加え、得られた溶液をMillipore Optiscale 47 Express SHC 0.5/0.2μMのフィルターで濾過した。2℃〜8℃での2日間の保存に続いて、追加の50mMヒスチジン、6.7w/v%のスクロース、0.1v/v%のポリソルベート80、50μM重亜硫酸ナトリウム、pH5.5の緩衝液の必要容量の添加によって溶液を1.0mg/mLのコンジュゲートに希釈した。次いでMillipore Optiscale 47 Durapore 0.22μMフィルターを介してこの溶液を濾過し、1.0mg/mLのコンジュゲート818mLを得た。最終的なコンジュゲートの測定されたDARは97.4%の単量体によるUV/Vis及びSECによる2.5%HMWによって2.6である。生成物の最終的な収率は82%だった。
分析
精製したコンジュゲートにおける抗体及び細胞毒性剤(Ie)の濃度は280nm及び330nmでの吸光度の値を用いたUV/Visによって決定した。抗体及び細胞毒性剤は双方とも280nmで吸収するので、各部分に起因する総シグナルの一部を検討するには2項方程式が必要とされた。細胞毒性剤であるインドリノベンゾジアゼピン(IGN)のみが330nmで吸収するので、その波長での濃度は細胞毒性剤にのみ起因し得る。この実施例で使用したコンジュゲートした部分の吸光係数の値はそれぞれ、280nm及び330nmで34150及び16270M−1cm−1である。
精製したコンジュゲートにおける抗体及び細胞毒性剤(Ie)の濃度は280nm及び330nmでの吸光度の値を用いたUV/Visによって決定した。抗体及び細胞毒性剤は双方とも280nmで吸収するので、各部分に起因する総シグナルの一部を検討するには2項方程式が必要とされた。細胞毒性剤であるインドリノベンゾジアゼピン(IGN)のみが330nmで吸収するので、その波長での濃度は細胞毒性剤にのみ起因し得る。この実施例で使用したコンジュゲートした部分の吸光係数の値はそれぞれ、280nm及び330nmで34150及び16270M−1cm−1である。
各波長での各構成成分の寄与を説明する以下の代数的表現を用いて抗体及び細胞毒性剤の成分を定量した。
CD=A330/ε330nmIGN
CAb=(A280−(ε280nmIGN/ε330nmIGN)×A330)/ε280nmAb
CD=A330/ε330nmIGN
CAb=(A280−(ε280nmIGN/ε330nmIGN)×A330)/ε280nmAb
AxはXnmの波長での吸光度の値であり、CAbは抗体(すなわち、AbX)のモル濃度であり、CDは細胞毒性剤のモル濃度である。細胞毒性剤:Abの比(DAR)は上記のモル濃度の比とし算出した。AbXのmg/mL(g/L)濃度は144887g/モルの分子量を用いて算出した。
Claims (119)
- 細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製する方法であって、イオン強度が高い緩衝溶液の存在下で4〜9の間のpHにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と前記細胞結合剤を反応させる工程を含み、前記細胞結合剤はアミン反応基を有する前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物との共有結合を形成するリシンε−NH2基を含む、前記方法。
- 前記pHが7.3〜8.7の間である請求項1に記載の方法。
- 前記pHが7.3〜8.4の間である請求項1に記載の方法。
- 前記pHが7.6〜8.4の間である請求項1に記載の方法。
- 前記pHが7.7〜8.3の間である請求項1に記載の方法。
- 前記pHが7.8〜8.2の間である請求項1に記載の方法。
- 前記pHが7.9〜8.1の間である請求項1に記載の方法。
- 前記pHが8.0である請求項1に記載の方法。
- 前記pHが8.5〜8.9の間である請求項1に記載の方法。
- 前記pHが8.6〜8.8の間である請求項1に記載の方法。
- 前記pHが8.7である請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が20mM〜500mMのイオン強度を有する請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が50mM〜100mMのイオン強度を有する請求項12に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が60mM〜90mMのイオン強度を有する請求項12に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が70mM〜80mMのイオン強度を有する請求項12に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が75mMのイオン強度を有する請求項12に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が100nM〜200mMのイオン強度を有する請求項12に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が100nM〜160nMのイオン強度を有する請求項12に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が120nM〜140nMのイオン強度を有する請求項12に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が130nMのイオン強度を有する請求項12に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が7.8〜8.9の間のpH及び50mM〜200mMの間のイオン強度を有する請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が7.8〜8.2の間のpH及び70mM〜80mMの間のイオン強度を有する請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が8.0のpH及び75mMのイオン強度を有する請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が8.5〜8.9の間のpH及び120mM〜140mMの間のイオン強度を有する請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が8.7のpH及び130mMのイオン強度を有する請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、MES((2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸))緩衝液、ビス−トリスメタン(2−[ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオール)緩衝液、ADA(N−(2−アセトアミド)イミノジ酢酸)緩衝液、ACES(N−−2−アミノエタンスルホン酸)緩衝液、PIPES(ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸))、MOPSO(β−ヒドロキシ−4−モルフォリンプロパンスルホン酸)緩衝液、ビス−トリスプロパン(1,3−ビス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)プロパン)緩衝液、BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸)、TES(N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−アミノエタンスルホン酸)緩衝液、HEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸)緩衝液、DIPSO、(3−(N,N−ビス[2−ヒドロキシエチル]アミノ)−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸またはN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)、MOBS(4−(N−モルフォリノ)ブタンスルホン酸)緩衝液、TAPSO(3−[[1,3−ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−2−イル]アミノ]−2−ヒドロキシプロパン−1−スルホン酸)緩衝液、トリズマ(トリスまたは2−アミノ−2−(ヒドロキシメチル)−1,3−プロパンジオール)緩衝液、HEPPSO(N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸))緩衝液、POPSO(ピペラジン−1,4−ビス−(2−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸)無水物)緩衝液、EPPS(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−プロパンスルホン酸)緩衝液、トリシン(N−(2−ヒドロキシ−1,1−ビス(ヒドロキシメチル)エチル)グリシン)緩衝液、gly−gly、ビシン(2−(ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ)酢酸)緩衝液、HEPBS(N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(4−ブタンスルホン酸))緩衝液、TAPS(3−[[1,3−ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−2−イル]アミノ]プロパン−1−スルホン酸)緩衝液、AMPD(2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール)緩衝液、TABS(N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−4−アミノブタンスルホン酸)緩衝液、AMPSO(N−(1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル)−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)緩衝液、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液がEPPS緩衝液である請求項26に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、7.8〜8.9の間のpHを有する50mM〜200mMのEPPS緩衝液である請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、7.8〜8.2の間のpHを有する70mM〜80mMのEPPS緩衝液である請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、8.0のpHを有する75mMのEPPS緩衝液である請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、8.5〜8.9の間のpHを有する120mM〜140mMのEPPS緩衝液である請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、8.7のpHを有する130mMのEPPS緩衝液である請求項1に記載の方法。
- 細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製する方法であって、7.3〜9.0のpHを有する緩衝溶液にて細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と細胞結合剤を反応させる工程を含み、前記細胞結合剤はアミン反応基を有する前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物との共有結合を形成するリシンε−NH2基を含む、前記方法。
- 前記緩衝溶液の前記pHが7.3〜8.4の間である請求項33に記載の方法。
- 前記pHが7.6〜8.4の間である請求項33に記載の方法。
- 前記pHが7.7〜8.3の間である請求項33に記載の方法。
- 前記pHが7.8〜8.2の間である請求項33に記載の方法。
- 前記pHが7.9〜8.1の間である請求項33に記載の方法。
- 前記pHが8.0である請求項33に記載の方法。
- 前記pHが8.5〜8.9の間である請求項33に記載の方法。
- 前記pHが8.6〜8.8の間である請求項33に記載の方法。
- 前記pHが8.7である請求項33に記載の方法。
- 細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートを調製する方法であって、高濃度の緩衝溶液の存在下で4〜9のpHにて細胞結合剤との共有結合を形成することができる反応基を有する細胞毒性剤または細胞毒性剤・リンカー化合物と前記細胞結合剤を反応させる工程を含み、前記細胞結合剤はアミン反応基を有する前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物との共有結合を形成するリシンε−NH2基を含む、前記方法。
- 前記緩衝溶液の前記濃度が、20mM〜750mMの間、20mM〜500mMの間、20mM〜200mM、25mM〜150mMの間、50mM〜150mMの間、50mM〜100mMの間、100mM〜200mMの間、または100mM〜150mMの間である請求項43に記載の方法。
- 前記pHが、7.3〜8.9の間、7.3〜8.4、7.6〜8.4の間、7.7〜8.3の間、7.8〜8.2の間、8.5〜8.9、または8.6〜8.8の間である請求項43または44に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、20mM〜200mMの間の濃度及び7.1〜8.5の間のpHを有する請求項43に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、50mM〜150mMの間の濃度及び7.6〜8.4の間のpHを有する請求項43に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、50mM〜100mMの間の濃度及び7.7〜8.3の間のpHを有する請求項43に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、60mM〜90mMの間の濃度及び7.8〜8.2の間のpHを有する請求項43に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、70mM〜80mMの間の濃度及び7.9〜8.1の間のpHを有する請求項43に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、50mM〜200mMの間の濃度及び7.8〜8.9の間のpHを有する請求項43に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、110mM〜150mMの間の濃度及び8.5〜8.9の間のpHを有する請求項43に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、120mM〜140mMの間の濃度及び8.6〜8.8の間のpHを有する請求項43に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、MES((2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸))緩衝液、ビス−トリスメタン(2−[ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−1,3−ジオール)緩衝液、ADA(N−(2−アセトアミド)イミノジ酢酸)緩衝液、ACES(N−−2−アミノエタンスルホン酸)緩衝液、PIPES(ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸))、MOPSO(β−ヒドロキシ−4−モルフォリンプロパンスルホン酸)緩衝液、ビス−トリスプロパン(1,3−ビス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)プロパン)緩衝液、BES(N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸)TES(N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]−2−アミノエタンスルホン酸)緩衝液、HEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸)緩衝液、DIPSO、(3−(N,N−ビス[2−ヒドロキシエチル]アミノ)−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸またはN,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)、MOBS(4−(N−モルフォリノ)ブタンスルホン酸)緩衝液、TAPSO(3−[[1,3−ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−2−イル]アミノ]−2−ヒドロキシプロパン−1−スルホン酸)緩衝液、トリズマ(トリスまたは2−アミノ−2−(ヒドロキシメチル)−1,3−プロパンジオール)緩衝液、HEPPSO(N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸))緩衝液、POPSO(ピペラジン−1,4−ビス−(2−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸)無水物)緩衝液、EPPS(4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−プロパンスルホン酸)緩衝液、トリシン(N−(2−ヒドロキシ−1,1−ビス(ヒドロキシメチル)エチル)グリシン)緩衝液、gly−gly、ビシン(2−(ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ)酢酸)緩衝液、HEPBS(N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−(4−ブタンスルホン酸))緩衝液、TAPS(3−[[1,3−ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)プロパン−2−イル]アミノ]プロパン−1−スルホン酸)緩衝液、AMPD(2−アミノ−2−メチル−1,3−プロパンジオール)緩衝液、TABS(N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−4−アミノブタンスルホン酸)緩衝液、AMPSO(N−(1,1−ジメチル−2−ヒドロキシエチル)−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)緩衝液、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項33〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記緩衝溶液がEPPS緩衝液である請求項54に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が75mMのEPPS緩衝液である請求項54に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が130mMのEPPS緩衝液である請求項54に記載の方法。
- さらに、前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物の前記細胞結合剤との反応の後、イオン強度が高い反応停止溶液を混合する工程を含む、請求項1〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応停止溶液が、200mM〜3000mMの間、200mM〜2000mMの間、200mM〜1000mMの間、500mM〜1000mMの間、550mM〜1000mMの間、または600mM〜1000mMの間のイオン強度を有する請求項58に記載の方法。
- 前記反応停止溶液が700mM〜1000mMの間のイオン強度を有する請求項58に記載の方法。
- 前記反応停止溶液がEPPSを含む請求項58〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応停止溶液がEPPSとヒスチジン塩酸塩とを含む請求項58〜60のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物の前記細胞結合剤との反応の後で高濃度緩衝液を含む反応停止溶液を混合する工程を含む請求項1〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応停止溶液における前記緩衝液の前記濃度が、200mM〜3000mMの間、200nM〜2000mMの間、200mM〜1000mMの間、500mM〜1000mMの間、550mM〜1000mMの間、または600mM〜1000mMの間である請求項63に記載の方法。
- 前記混合に続いて、前記緩衝液の前記最終濃度が、150mM〜750mMの間、150mM〜600mMの間、200mM〜500nMの間、200mM〜400nMの間、または250mM〜350mMの間である請求項63または64に記載の方法。
- 前記反応停止溶液が5〜9の間のpHを有する請求項58〜65のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応停止溶液が5〜7の間のpHを有する請求項66に記載の方法。
- 前記反応停止溶液が5〜6の間のpHを有する請求項66に記載の方法。
- 前記反応停止溶液が5.5のpHを有する請求項66に記載の方法。
- 前記反応停止溶液が750mMのEPPS及び150mMのヒスチジン塩酸塩を含む請求項69に記載の方法。
- 前記反応停止緩衝液の前記添加が高分子量種の前記量を低下させる請求項58〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が以下の構造式:
Lは、以下の式:
−NR5−P−C(=O)−(CRaRb)m−C(=O)E (A1);または
−NR5−P−C(=O)−(CRaRb)m−S−Zs1 (A3);によって表され、
その際、
R5は−Hまたは(C1−C3)アルキルであり;
Pは2〜20の間のアミノ酸残基を含有するアミノ酸残基またはペプチドであり;
Ra及びRbは各存在について、それぞれ独立して−H、(C1−C3)アルキル、または荷電した置換基またはイオン化できる基Qであり;
mは1〜6の整数であり;
Zs1は以下の式:
qは1〜5の整数であり;
Mは−Hまたはカチオンであり;
−C(=O)Eは反応性エステル基を表す、請求項1〜71のいずれか1項に記載の方法。 - Ra及びRbが双方ともHであり、R5がHまたはMeである請求項72に記載の方法。
- Pが2〜5のアミノ酸残基を含有するペプチドである請求項72または73に記載の方法。
- Pがプロテアーゼによって切断できるペプチドである請求項74に記載の方法。
- Pが腫瘍組織で発現されるプロテアーゼによって切断できるペプチドである請求項75に記載の方法。
- Pが、Gly−Gly−Gly、Ala−Val、Val−Ala、Val−Cit、Val−Lys、Phe−Lys、Lys−Lys、Ala−Lys、Phe−Cit、Leu−Cit、Ile−Cit、Phe−Ala、Phe−N9−トシル−Arg、Phe−N9−ニトロ−Arg、Phe−Phe−Lys、D−Phe−Phe−Lys、Gly−Phe−Lys、Leu−Ala−Leu、Ile−Ala−Leu、Val−Ala−Val、Ala−Leu−Ala−Leu(配列番号21)、β−Ala−Leu−Ala−Leu(配列番号22)、Gly−Phe−Leu−Gly(配列番号23)、Val−Arg、Arg−Val、Arg−Arg、Val−D−Cit、Val−D−Lys、Val−D−Arg、D−Val−Cit、D−Val−Lys、D−Val−Arg、D−Val−D−Cit、D−Val−D−Lys、D−Val−D−Arg、D−Arg−D−Arg、Ala−Ala、Ala−D−Ala、D−Ala−Ala、D−Ala−D−Ala、Ala−Met、及びMet−Alaから選択される請求項72〜74のいずれか1項に記載の方法。
- Pが、Gly−Gly−Gly、Ala−Val、Ala−Ala、Ala−D−Ala、D−Ala−Ala、またはD−Ala−D−Alaである請求項77に記載の方法。
- Qが−SO3Mである請求項72〜78のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応性エステル基が、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニル(たとえば、2または4−ニトロフェニル)エステル、ジニトロフェニル(たとえば、2,4−ジニトロフェニル)エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル(たとえば、4−スルホ−2,3,5,6−テトラフルオロフェニル)エステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択される請求項72〜81のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、構造式(II)の前記化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される構造式(I)によって表される請求項72〜79及び82〜84のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が構造式(II)によって表され、前記方法がさらに前記細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートをスルホン化試薬と反応させることを含む請求項72〜79及び82〜84のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が構造式(II)によって表され、前記方法が、スルホン化試薬の存在下で構造式(II)によって表される前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物と前記細胞結合剤を反応させることを含む請求項72〜79及び82〜84のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートをスルホン化試薬と反応させることを含む請求項81〜84及び86のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、スルホン化試薬の存在下で前記細胞結合剤を前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物と反応させることを含む、請求項81〜84及び86のいずれか1項に記載の方法。
- Re1がHまたはMeであり;Rx1及びRx2が独立して−(CH2)p−(CRfRg)−であり、その際、Rf及びRgはそれぞれ独立して−Hまたは(C1−C4)アルキルであり;pは0、1、2または3である請求項94に記載の方法。
- Rf及びRgが同一であり、または異なり、且つ−H及び−Meから選択される請求項95に記載の方法。
- 前記反応性エステル基が、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニル(たとえば、2または4−ニトロフェニル)エステル、ジニトロフェニル(たとえば、2,4−ジニトロフェニル)エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル(たとえば、4−スルホ−2,3,5,6−テトラフルオロフェニル)エステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択される請求項94〜98のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、構造式(IV)の前記化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される構造式(III)によって表される請求項94〜96及び99〜101のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、構造式(VI)の前記化合物をスルホン化試薬と反応させることによって調製される構造式(V)によって表される請求項94〜96及び99〜101のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、構造式(IV)または(VI)によって表され、前記方法がさらに、前記細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートをスルホン化試薬と反応させることを含む請求項94〜96及び99〜101のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物が、構造式(IV)または(VI)によって表され、前記方法が、スルホン化試薬の存在下で構造式(IV)または(VI)によって表される前記化合物を反応させることを含む請求項94〜96及び99〜101のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲートをスルホン化試薬と反応させることを含む請求項98〜101及び103のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、スルホン化試薬の存在下で前記細胞結合剤を前記細胞毒性剤または前記細胞毒性剤・リンカー化合物と反応させることを含む請求項98〜101及び103のいずれか1項に記載の方法。
- 前記スルホン化試薬がNaHSO3である請求項87〜93及び104〜113のいずれか1項に記載の方法。
- Mが−H、Na+またはK+である請求項72〜113のいずれか1項に記載の方法。
- MがNa+である請求項115に記載の方法。
- 前記細胞結合剤が抗体である請求項1〜116のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項117に記載の方法。
- 前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項118に記載の方法。
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