KR20180105233A - 세포 결합제-세포독성제 접합체를 제조하기 위한 효율적인 방법 - Google Patents

세포 결합제-세포독성제 접합체를 제조하기 위한 효율적인 방법 Download PDF

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KR20180105233A
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Abstract

본 발명은 세포 결합제 세포독성제 접합체를 제조하는 신규한 방법을 제공한다. 상기 방법은 높은 이온 강도를 갖는 완충 용액의 존재 하에, 4 내지 9의 pH에서 세포 결합제와 공유 결합을 형성 가능한 반응기를 갖는 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 세포 결합제를 반응시키는 단계를 포함하되, 세포 결합제는 아민-반응기를 갖는 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 공유 결합을 형성하는 라이신 ε-NH2기를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법에 따라 제조된 세포 결합제-세포독성제 접합체가 또한 본 발명에 포함된다.

Description

세포 결합제-세포독성제 접합체를 제조하기 위한 효율적인 방법
관련 출원
본 출원은 2016년 2월 5일자로 출원된 미국 가출원 제62/292,018호의 35 U.S.C. §119(e) 하에 출원인의 이득을 주장하며, 이 기초 출원의 모든 도면, 식, 명세서 및 청구범위를 비롯한 전체 내용이 참고로 본 명세서에 편입된다.
인돌리노벤조다이아제핀 이량체 화합물의 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate: ADC)는 생체내에서 높은 역가 및/또는 높은 치료 지수(최소 유효 용량에 대한 최대 내성 용량의 비)를 갖는 것으로 제시되었다. 인돌리노벤조다이아제핀 이량체 화합물은 일반적으로 소수성이며, 그리고 접합 반응(conjugation reaction) 동안 항체의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 소정의 환경 하에, 접합 반응은 매우 낮은 반응 수율을 갖는데, 이것은 ADC의 대규모 생산을 위하여 적합하지 않다.
이상의 내용을 감안해서, 대규모 생산에 적합한 세포 결합제-세포독성제 접합체를 제조하기 위한 효율적인 방법을 개발할 충족되지 않은 요구가 있다.
본 발명은 세포 결합제-세포독성제 접합체를 제조하는 신규하고 효율적인 방법을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은, 높은 이온 강도를 갖는 완충 용액의 존재 하에 4 내지 9의 pH에서, 세포 결합제와 공유 결합을 형성 가능한 반응기(예컨대, 아민-반응기)를 가진 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 세포 결합제를 반응시키는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은, 7.3 내지 8.4의 pH를 갖는 완충 용액에서, 세포 결합제와 공유 결합을 형성 가능한 반응기(예컨대, 아민-반응기)를 가진 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 세포 결합제를 반응시키는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은, 고농도 완충 용액의 존재 하에 4 내지 9의 pH에서, 세포 결합제와 공유 결합을 형성 가능한 반응기(예컨대, 아민-반응기)를 가진 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 세포 결합제를 반응시키는 단계를 포함한다.
놀랍게도, 인돌리노벤조다이아제핀 이량체 화합물과 항체의 접합 반응이 7.3 내지 8.4의 pH에서 높은 이온 강도를 갖는 완충 용액에서 수행될 경우, 접합 반응이 더 높은 pH에서 낮은 이온 강도를 갖는 완충 용액에서 수행될 경우에 비해서 접합 반응이 상당히 더 효율적인 것으로 판명되었다. 본 발명의 방법은 고순도 및/또는 안정성을 갖는 세포 결합제-세포독성제 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 방법을 이용해서 제조된 세포 결합제세포독성제 접합체에 관한 것이다.
본 발명은 세포 결합제-세포독성제 접합체를 제조하는 신규한 방법을 제공한다.
제1 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은, 높은 이온 강도를 갖는 완충 용액의 존재 하에 4 내지 9의 pH에서, 세포 결합제와 공유 결합을 형성 가능한 반응기(예컨대, 아민-반응기)를 가진 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 세포 결합제를 반응시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용액의 "이온 강도"는 용액 중 이온의 농도이다. 이것은 용액에 존재하는 모든 이온의 농도의 함수이다. 이온 강도(I)는 이하의 방정식을 이용해서 계산될 수 있다:
Figure pct00001
Ci는 용액에 존재하는 이온 i의 몰 농도이고, zi는 이의 전하수이며, 합계는 용액 중의 모든 이온에 대해서 취해진다. 용액의 양이온과 음이온이 각각 +1 및 -1 전하를 가질 경우, 이온 강도는 용액의 농도와 동등하다.
일 실시형태에 있어서, 완충 용액의 이온 강도는 20mM 내지 500mM, 바람직하게는 20mM 내지 200mM, 25mM 내지 150mM, 50mM 내지 150mM, 50mM 내지 100mM, 또는 100mM 내지 200mM이다. 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 이온 강도는 60mM 내지 90mM, 또는 70mM 내지 80mM이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 이온 강도는 75mM이다. 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 이온 강도는 100mM 내지 160mM 또는 120mM 내지 140mM이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 이온 강도는 130mM이다.
다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 7.1 내지 8.7, 바람직하게는 7.3 내지 8.7, 7.1 내지 8.5, 7.3 내지 8.4, 7.6 내지 8.4, 7.7 내지 8.3, 7.8 내지 8.2이다. 일 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 7.9 내지 8.1이다. 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.0이다. 일 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.5 내지 8.9이다. 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.6 내지 8.8이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.7이다.
제2 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은, 7.3 내지 9.0의 pH를 갖는 완충 용액 중에서, 세포 결합제와 공유 결합을 형성 가능한 반응기(예컨대, 아민-반응기)를 갖는 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 세포 결합제를 반응시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 7.3 내지 8.4, 7.6 내지 8.4, 7.7 내지 8.3, 또는 7.8 내지 8.2이다. 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 7.9 내지 8.1이다. 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.0이다. 일 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.5 내지 8.9이다. 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.6 내지 8.8이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.7이다.
제1 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 20mM 내지 200mM의 이온 강도 및 7.1 내지 8.5의 pH를 갖는다.
제2 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 50mM 내지 150mM의 이온 강도 및 7.6 내지 8.4의 pH를 갖는다.
제3 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 50mM 내지 100mM의 이온 강도 및 7.7 내지 8.3의 pH를 갖는다.
제4 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 60mM 내지 90mM의 이온 강도 및 7.8 내지 8.2의 pH를 갖는다.
제5 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 70mM 내지 80mM의 이온 강도 및 7.9 내지 8.1의 pH를 갖는다.
제6 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 75mM의 이온 강도 및 8.0의 pH를 갖는다.
제7 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 50mM 내지 200mM의 이온 강도 및 7.8 내지 8.9의 pH를 갖는다.
제8 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 110mM 내지 150mM의 이온 강도 및 8.5 내지 8.9의 pH를 갖는다.
제9 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 120mM 내지 140mM의 이온 강도 및 8.6 내지 8.8의 pH를 갖는다.
제10 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 130mM의 이온 강도 및 8.7의 pH를 갖는다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 완충 용액이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 적합한 완충 용액은, 예를 들어, 시트르산염 완충제, 아세트산염 완충제, 숙신산염 완충제, 및 인산염 완충제를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
제11 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태, 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10 특정 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 MES((2-(N-몰폴리노)에탄설폰산)) 완충제, 비스-트리스 메탄 (2-[비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-다이올) 완충제, ADA(N-(2-아세트아미도)이미노다이아세트산) 완충제, ACES(N--2-아미노에탄설폰산) 완충제, PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MOPSO(β-하이드록시-4-몰폴린프로판설폰산) 완충제, 비스-트리스 프로판(1,3-비스(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판) 완충제, BES(N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산), TES(N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설폰산) 완충제, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산) 완충제, DIPSO(3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시프로판설폰산또는 N,N-비스(2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산), MOBS(4-(N-몰폴리노)부탄설폰산) 완충제, TAPSO(3-[[1,3-다이하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]-2-하이드록시프로판-1-설폰산) 완충제, 트라이즈마(트리스 또는 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판다이올) 완충제, HEPPSO(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-하이드록시프로판설폰산)) 완충제, POPSO(피페라진-1,4-비스-(2-하이드록시-프로판-설폰산) 탈수물) 완충제, EPPS(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-프로판설폰산) 완충제, 트라이신(N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글리신) 완충제, gly-gly, 바이신(2-(비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산) 완충제, HEPBS(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산)) 완충제, TAPS(3-[[1,3-다이하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]프로판-1-설폰산) 완충제, AMPD(2-아미노-2-메틸-1,3-프로판다이올) 완충제, TABS(N-트리스(하이드록시메틸)메틸-4-아미노부탄설폰산) 완충제, AMPSO(N-(1,1-다이메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산) 완충제 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 완충제는 HEPPSO(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-하이드록시프로판설폰산)) 완충제, POPSO(피페라진-1,4-비스-(2-하이드록시-프로판-설폰산) 탈수물) 완충제, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산) 완충제, EPPS(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-프로판설폰산) 완충제, TES(N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설폰산) 완충제, MES(2-(N-몰폴리노)에탄설폰산) 완충제 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제12 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태, 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10 특정 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 EPPS 완충제이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 완충 용액은 75mM의 EPPS 완충제이다.
제13 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 7.8 내지 8.9의 pH를 갖는 50mM 내지 200mM의 EPPS 완충제이다.
제14 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 7.8 내지 8.2의 pH를 갖는 60mM 내지 90mM의 EPPS 완충제이다.
제15 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 7.9 내지 8.1의 pH를 갖는 70mM 내지 80mM의 EPPS 완충제이다.
제16 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 8.0의 pH를 갖는 75mM의 EPPS 완충제이다.
제17 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 8.5 내지 8.9의 pH를 갖는 110mM 내지 150mM의 EPPS 완충제이다.
제18 특정 실시형태에 있어서, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 8.6 내지 8.8의 pH를 갖는 120mM 내지 140mM의 EPPS 완충제이다.
제19 특정 실시형태, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 8.7의 pH를 갖는 130mM의 EPPS 완충제이다.
제3 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 고농도 완충제의 존재 하에 4 내지 9의 pH에서 공유 결합을 형성 가능한 반응기(예컨대, 아민-반응기)를 갖는 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 세포 결합제를 반응시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 완충제의 농도는 20mM 내지 750mM이다. 다른 실시형태에 있어서, 완충제의 농도는 20mM 내지 500mM, 20mM 내지 200mM, 25mM 내지 150mM, 50mM 내지 150mM, 50mM 내지 100mM, 100mM 내지 200mM, 또는 100mM 내지 150mM이다.
일 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 7.3 내지 8.9, 7.3 내지 8.4, 7.6 내지 8.4, 7.7 내지 8.3, 또는 7.8 내지 8.2이다. 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 7.9 내지 8.1이다. 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.0이다. 일 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.5 내지 8.9이다. 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.6 내지 8.8이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액의 pH는 8.7이다.
제20 특정 실시형태에 있어서, 제3 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 20mM 내지 200mM의 농도 및 pH 7.1 내지 8.5의 pH를 갖는다.
제21 특정 실시형태에 있어서, 제3 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 50mM 내지 150mM의 농도 및 pH 7.6 내지 8.4의 pH를 갖는다.
제22 특정 실시형태, 제1 또는 제2 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 50mM 내지 100mM의 농도 및 pH 7.7 내지 8.3의 pH를 갖는다.
제23 특정 실시형태에 있어서, 제3 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 60mM 내지 90mM의 농도 및 pH 7.8 내지 8.2의 pH를 갖는다.
제24 특정 실시형태에 있어서, 제3 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 70mM 내지 80mM의 농도 및 pH 7.9 내지 8.1의 pH를 갖는다.
제25 특정 실시형태에 있어서, 제3 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 75mM의 농도 및 8.0의 pH를 갖는다.
제26 특정 실시형태에 있어서, 제3 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 50mM 내지 200mM의 농도 및 pH 7.8 내지 8.9의 pH를 갖는다.
제27 특정 실시형태에 있어서, 제3 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 110mM 내지 150mM의 농도 및 pH 8.5 내지 8.9의 pH를 갖는다.
제28 특정 실시형태에 있어서, 제3 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 120mM 내지 140mM의 농도 및 pH 8.6 내지 8.8의 pH를 갖는다.
제29 특정 실시형태에 있어서, 제3 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 완충 용액은 130mM의 농도 및 8.7의 pH를 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에 사용되는 완충 용액은 완충제의 이온 강도를 유지시키기 위하여 불활성 염을 더 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 완충 용액은 염화나트륨을 더 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 위에서 기재된 본 발명의 방법에 대하여, 세포 결합제와 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물의 반응은 소량의 유기 용매의 존재 하에 수행된다. 더욱 구체적으로, 유기 용매는 다이메틸아세트아마이드(DMA)이다. 유기 용매(예컨대, DMA)는 완충 용액과 유기 용매의 총 용적 중 1 용적% 내지 20 용적%, 1 내지 15 용적%, 2 내지 15% 용적%, 5 내지 15 용적%, 8 내지 12 용적%, 또는 10 내지 20 용적%의 양으로 존재할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 유기 용매(예컨대, DMA)는 완충 용액과 유기 용매의 총 용적 중 10 용적%의 양으로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 유기 용매(예컨대, DMA)는 완충 용액과 유기 용매의 총 용적 중 15 용적%의 양으로 존재한다.
일 실시형태에 있어서, 위에서 기재된 본 발명의 방법에 대하여, 반응은 2분 내지 1주, 1시간 내지 48시간, 1시간 내지 36시간, 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 12시간, 1시간 내지 8시간, 5시간 내지 15시간, 6시간 내지 14시간, 4시간 내지 8시간, 5시간 내지 7시간, 1시간 내지 5시간, 1시간 내지 4시간, 1시간 내지 2시간, 30분 내지 2시간, 5분 내지 30분, 또는 2시간 내지 5시간 동안 진행되도록 허용된다. 일 실시형태에 있어서, 반응은 2시간 내지 6시간 또는 3시간 내지 5시간 동안 진행되도록 허용된다. 일 실시형태에 있어서, 반응은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간 등 동안 진행되도록 허용된다. 다른 실시형태에 있어서, 반응은 4시간 동안 진행되도록 허용된다.
세포 결합제와 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물의 반응은 임의의 적합한 온도에서 수행될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 반응은 10℃ 내지 50℃, 10℃ 내지 40℃, 또는 10℃ 내지 30℃의 온도에서 수행될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 반응은 15℃ 내지 30℃, 20℃ 내지 30℃, 15℃ 내지 25℃, 16℃ 내지 24℃, 17℃ 내지 23℃, 18℃ 내지 22℃ 또는 19℃ 내지 21℃의 온도에서 수행될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 반응은 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃ 또는 25℃에서 수행될 수 있다.
세포 결합제와 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물의 접합 반응으로부터 형성된 접합체는 저장 시 또는 접합 반응의 완결과 정제 단계 사이의 시간 동안 고분자량 종을 형성하는 경향을 지닐 수 있다. 고분자량 종의 형성을 경감시키기 위하여, ?칭 용액(quenching solution)이 접합체를 안정화시키기 위하여 접합 반응 후에 첨가될 수 있다.
제30 특정 실시형태에 있어서, 상기 제1, 제2 또는 제3 실시형태에(예컨대, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28 또는 제29 특정 실시형태에) 기재된 방법은 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 세포 결합제의 반응 후에 높은 이온 강도를 갖는 ?칭 용액을 첨가하는 단계를 더 포함한다.
또한 제30 특정 실시형태에 있어서, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 세포 결합제의 반응 후에 고농도 완충제를 포함하는 ?칭 용액을 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 200mM 내지 3000mM, 200mM 내지 2000nM, 200mM 내지 1000mM, 500mM 내지 1000mM, 550mM 내지 1000mM, 또는 600mM 내지 1000mM의 이온 강도를 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 700mM 내지 1000mM의 이온 강도를 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 900mM의 이온 강도를 갖는다.
다른 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 200mM 내지 3000mM, 200mM 내지 2000mM, 200mM 내지 1000mM, 500mM 내지 1000mM, 550mM 내지 1000mM, 또는 600mM 내지 1000mM의 농도를 갖는 완충제를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 700mM 내지 1000mM의 농도를 갖는 완충제를 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 750mM의 농도를 갖는 완충제를 갖는다.
다른 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 세포 결합제의 반응 후에 반응 혼합물과 혼합되고, 이 혼합에 이어서 완충제에 대한 최종 농도는 150mM 내지 750mM, 150mM 내지 600mM, 200mM 내지 500nM, 200mM 내지 400nM, 250mM 내지 350mM이다.
몇몇 실시형태에 있어서, ?칭 용액 중의 완충제는 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 세포 결합제의 접합 반응에서 사용되는 완충제와 동일하다.
본 명세서에 기재된 ?칭 용액은 완충제, 이의 염 또는 조합물을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 완충제 또는 염이 사용될 수 있다. 예시적인 완충제는 MES((2-(N-몰폴리노)에탄설폰산)) 완충제, 비스-트리스 메탄 (2-[비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-다이올) 완충제, ADA(N-(2-아세트아미도)이미노다이아세트산) 완충제, ACES(N--2-아미노에탄설폰산) 완충제, PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MOPSO(β-하이드록시-4-몰폴린프로판설폰산) 완충제, 비스-트리스 프로판(1,3-비스(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판) 완충제, BES(N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산), TES(N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설폰산) 완충제, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산) 완충제, DIPSO(3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시프로판설폰산또는 N,N-비스(2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산), MOBS(4-(N-몰폴리노)부탄설폰산) 완충제, TAPSO(3-[[1,3-다이하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]-2-하이드록시프로판-1-설폰산) 완충제, 트라이즈마(트리스 또는 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판다이올) 완충제, HEPPSO(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-하이드록시프로판설폰산)) 완충제, POPSO(피페라진-1,4-비스-(2-하이드록시-프로판-설폰산) 탈수물) 완충제, EPPS(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-프로판설폰산) 완충제, 트라이신(N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글리신) 완충제, gly-gly, 바이신(2-(비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산) 완충제, HEPBS(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산)) 완충제, TAPS(3-[[1,3-다이하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]프로판-1-설폰산) 완충제, AMPD(2-아미노-2-메틸-1,3-프로판다이올) 완충제, TABS(N-트리스(하이드록시메틸)메틸-4-아미노부탄설폰산) 완충제, AMPSO(N-(1,1-다이메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산) 완충제 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에 있어서, 완충제는 HEPPSO(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-하이드록시프로판설폰산)) 완충제, POPSO(피페라진-1,4-비스-(2-하이드록시-프로판-설폰산) 탈수물) 완충제, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산) 완충제, EPPS(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-프로판설폰산) 완충제, TES(N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설폰산) 완충제, MES(2-(N-몰폴리노)에탄설폰산) 완충제 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 염은 NaCl, KCl, 및 히스티딘 염산염을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 EPPS를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 EPPS 및 히스티딘 염산염을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 5 내지 9, 5 내지 7 또는 5 내지 6의 pH를 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 5.5의 pH를 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 반응 혼합물과 혼합되기 전의 ?칭 용액은 750mM의 EPPS 및 150mM의 히스티딘 염산염을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, ?칭 용액은 EPPS 및 히스티딘 염산염을 포함하고, 그리고 ?칭 용액을 반응 혼합물과 혼합한 후에, 얻어진 혼합물은 200mM 내지 400mM의 EPPS 및 40 내지 60mM의 히스티딘 염산염을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 얻어진 혼합물은 250mM 내지 350mM의 EPPS 및 40 내지 60mM의 히스티딘 염산염을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 얻어진 혼합물은 300mM 내지 350mM의 EPPS 및 45mM 내지 55mM의 히스티딘 염산염을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 세포 결합제-세포독성제 접합체는 정제 단계를 거친다. 이 점에서, 세포 결합제-세포독성제 접합체는 멤브레인-기반 접선 유동 여과 공정인 접선 유동 여과(TFF), 비-흡착 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 흡착 여과, 선택적 석출 또는 임의의 기타 적합한 정제 공정뿐만 아니라, 이들의 조합을 이용해서 혼합물의 다른 성분(예컨대, 유리 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물 및 반응 부산물)으로부터 정제될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 세포 결합제-세포독성제 접합체는 단일의 정제 단계(예컨대, TFF)를 이용해서 정제된다. 바람직하게는, 접합체는 단일의 정제 단계(예컨대, TFF)를 이용해서 적절한 제형으로 정제되고 교환된다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 세포 결합제세포 독성제 접합체는 2개의 순차적인 정제 단계를 이용해서 정제된다. 예를 들어, 접합체는 먼저 선택적 석출, 흡착 여과, 흡착 크로마토그래피 또는 비-흡착 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있고, 이어서 TFF에 의한 정제에 의해 정제될 수 있다. 당업자라면 세포 결합제-세포독성제 접합체의 정제가 세포독성제에 화학적으로 커플링된 세포 결합제를 포함하는 적합한 접합체의 단리를 가능하게 함을 인식할 것이다.
펠리콘(Pellicon) 유형 시스템(밀리포어사(Millipore), 매사추세츠주 빌레리카 소재), 사토콘 카세트(Sartocon Cassette) 시스템(사토리우스 아게(Sartorius AG), 뉴욕주 에지우드 소재), 탄겐엑스 카세트(TangenX cassette)(탄겐엑스 테크놀로지 코포레이션(TangenX Technology Corporation), 매사추세츠주 스루스버리 소재) 및 센트라세트(Centrasette) 유형 시스템(팔 코프.(Pall Corp.), 뉴욕주 이스트 힐 소재)을 비롯한 임의의 적합한 TFF 시스템이 정제를 위하여 사용될 수 있다.
임의의 적합한 흡착 크로마토그래피 수지가 정제를 위하여 사용될 수 있으며, 여기서 수지는 세포 결합제-세포독성제 접합체를 보유하고 불순물의 방출을 허용할 수 있거나, 또는 불순물을 보유하고 세포 결합제-세포독성제 접합체의 방출을 허용할 수 있다. 바람직한 흡착 크로마토그래피 수지는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 소수성 전하 유도 크로마토그래피(hydrophobic charge induction chromatography: HCIC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography: HIC), 이온교환 크로마토그래피, 혼합된 모드 이온교환 크로마토그래피, 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography: IMAC), 염료 리간드 크로마토그래피, 친화도크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 하이드록시아파타이트 수지의 예는 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT 유형 I 및 유형 II, 바이오-래드 라보라토리즈사, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재), HA 울트로겔(Ultrogel) 하이드록시아파타이트(팔 코프., 뉴욕주 이스트 힐 소재), 및 세라믹 플루오로아파타이트(CFT 유형 I 및 유형 II, 바이오-래드 라보라토리즈사(Bio-Rad Laboratories), 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)를 포함한다. 적합한 HCIC 수지의 예는 MEP 하이퍼셀(Hypercel) 수지(팔 코프., 뉴욕주 이스트 힐 소재)이다. 적합한 HIC 수지의 예는 부틸-세파로스(Butyl-Sepharose), 헥실-세파로스(Hexyl-Sepaharose), 페닐-세파로스(Phenyl-Sepharose) 및 옥틸 세파로스(Octyl Sepharose) 수지(모두 GE 헬스케어사(GE Healthcare) 제품, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)뿐만 아니라, 매크로-프렙(Macro-prep) 메틸 및 매크로-프렙 t-부틸 수지(바이오래드 라보라토리즈사, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)를 포함한다. 적합한 이온교환 수지의 예는 SP-세파로스, CM-세파로스, 및 Q-세파로스 수지(모두 GE 헬스케어사 제품, 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 및 우노스피어(Unosphere) S 수지(바이오-래드 라보라토리즈사, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)를 포함한다. 적합한 혼합 모드 이온교환기의 예는 베이커본드(Bakerbond) ABx 수지(JT 베이커사(JT Baker), 뉴저지주 필립스버그 소재)를 포함한다. 적합한 IMAC 수지의 예는 킬레이팅 세파로스(Chelating Sepharose) 수지(GE 헬스케어사, 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 및 프로피니티(Profinity) IMAC 수지(바이오-래드 라보라토리즈사, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)를 포함한다. 적합한 염료 리간드 수지의 예는 블루 세파로스(Blue Sepharose) 수지(GE 헬스케어사, 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 및 아피-겔 블루(Affi-gel Blue) 수지(바이오-래드 라보라토리즈사, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)를 포함한다. 적합한 친화도 수지의 예는 프로테인 A 세파로스(Protein A Sepharose) 수지(예컨대, 맙셀렉트(MabSelect), GE 헬스케어사, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)(여기서 세포 결합제는 항체임), 및 렉틴 친화도 수지, 예컨대, 렌틸 렉틴 세파로스(Lentil Lectin Sepharose)(GE 헬스케어사, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)(여기서 세포 결합제는 적절한 렉틴 결합 부위를 보유함)를 포함한다. 대안적으로 세포 결합제에 특이적인 항체가 사용될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, 세파로스 4 패스트 플로(Sepharose 4 Fast Flow) 수지(GE 헬스케어사, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에 고정화될 수 있다. 적합한 역상 수지의 예는 C4, C8, 및 C18 수지(그레이스 비닥사(Grace Vydac), 캘리포니아주 헤스페리아 소재)를 포함한다.
임의의 적합한 비-흡착 크로마토그래피 수지가 정제를 위하여 사용될 수 있다. 적합한 비-흡착 크로마토그래피 수지의 예는, 세파텍스(SEPHADEX)TM G-25, G-50, G-100, 세파크릴(SEPHACRYL)TM 수지(예컨대, S-200 및 S-300), 수퍼덱스(SUPERDEX)TM 수지(예컨대, 수퍼덱스TM 75 및 수퍼덱스TM 200), BIO-GEL® 수지(예컨대, P-6, P-10, P-30, P-60 및 P-100), 및 당업자에게 공지된 기타의 것들을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 접합체는 적합한 제형 완충제에 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 결합제-세포독성제 접합체는 실질적으로 고순도 및 안정성을 갖는다. 본 발명의 일 양상에 있어서, 실질적으로 고순도의 세포 결합제-세포독성제 접합체는 이하의 특징들 중 하나 이상을 갖는다: (a) 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만(예컨대, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이하)의 항체 단편화, (b) 90% 초과(예컨대, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상), 바람직하게는 95% 초과의 접합체 종이 단량체성임, (c) 접합체 제제 중의 미접합 링커 수준이 (전체 링커에 대해서) 약 10% 미만(예컨대, 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0% 이하)임, (d) 10% 미만(예컨대, 약 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0% 이하)의 접합체 종이 가교결합됨, (e) 접합체 제제 중의 유리 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물의 수준이 (전체 세포독성제에 대한 ㏖/㏖) 약 2% 미만(예컨대, 약 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 또는 0% 이하)임, (f) 약 10% 미만, 약 5% 미만(예컨대, 약 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0% 이하)의 고분자량 종; 및/또는 (g) 저장 시(예컨대, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 또는 약 5년 후) 유리 세포독성제의 수준의 실질적인 증가 없음. 유리 세포독성제의 수준의 "실질적인 증가"는 소정의 보존 시간(예컨대, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 또는 약 5년) 후에, 유리 세포독성제의 수준의 증가가 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.1%, 약 1.2%, 약 1.3%, 약 1.4%, 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8%, 약 1.9%, 약 2.0%, 약 2.2%, 약 2.5%, 약 2.7%, 약 3.0%, 약 3.2%, 약 3.5%, 약 3.7%, 또는 약 4.0% 미만인 것을 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "미접합 링커"는 이작용성 가교결합 시약과 공유 결합되는 세포 결합제를 지칭하며, 여기서 세포 결합제는 이작용성 가교결합 시약의 링커를 통해서 세포독성제에 공유 결합되지 않는다(즉, "미접합 링커"는 CBA-L로 나타낼 수 있으며, 여기서 CBA는 세포 결합제를 나타내고, L은 이작용성 가교결합 시약을 나타낸다. 이와 대조적으로,세포 결합제 세포독성제 접합체는 CBA-L-D로 나타낼 수 있되, 여기서 D는 세포독성제를 나타낸다).
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "고분자량 종" 또는 "HMW"는 분자량이 높은 항체-함유 또는 접합체-함유 종을 지칭한다. 고분자량 종은 이량체, 삼량체, 항체 또는 접합체의 응집체에 의해 형성되는 기타 고차의 올리고머, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 고분자량 종은 SEC-HPLC에 의해 결정되는 그의 양에 의해 식별될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 세포 결합제-세포독성제 접합체 중의 세포 결합제에 대한 세포독성제의 평균 몰비(즉, DAR)는 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 1.5 내지 5, 2 내지 7, 또는 3 내지 5이다. 다른 실시형태에 있어서, DAR은 1.5 내지 3.5, 2 내지 3, 2.1 내지 2.9, 2.2 내지 2.8, 2.3 내지 2.7, 또는 2.4 내지 2.6이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 접합체에 대한 DAR은 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.5, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3.0이다. 일 실시형태에 있어서, DAR은 2.5이다. 다른 실시형태에 있어서, DAR은 2.7이다.
DAR값은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, DAR값은 항체 및 세포독성제 각각에 대한 파장에서의 흡광도를 이용하는 UV/Vis 분광법에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, DAR값은 질량 분광법 및/또는 HPLC에 의해 결정될 수 있다.
세포 결합제
본 발명의 방법에서 사용하기 위하여, 세포 결합제는 전형적으로 세포, 바람직하게는 동물 세포(예컨대, 인간 세포)에 결합하는 임의의 적합한 제제일 수 있다. 세포 결합제는 바람직하게는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 적합한 세포 결합제는, 예를 들어, 항체(예컨대, 단클론성 항체 및 이의 단편), 인터페론(예컨대 알파., 베타., 감마.), 림포카인(예컨대, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6), 호르몬(예컨대, 인슐린, TRH(갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬), MSH(멜라닌세포-자극 호르몬), 스테로이드 호르몬, 예컨대, 안드로겐 및 에스트로겐), 성장 인자 및 집락-자극 인자, 예컨대, EGF, TGF-알파, FGF, VEGF, G-CSF, M-CSF 및 GM-CSF(Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984)), 영양소-수송 분자(예컨대, 트랜스페린), 비타민(예컨대, 엽산염) 및 세포의 표면 상에 표적 분자를 구체적으로 결합시키는 기타 임의의 제제 및 분자를 포함한다.
세포 결합제가 항체인 경우, 이것은 폴리펩타이드 또는 글리코토프이고 그리고 막관통 분자(예컨대, 수용체) 또는 리간드, 예컨대, 성장 인자일 수 있는 항원에 결합한다. 예시적인 항원은 분자, 예컨대, 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지방단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 혈액응고 인자, 예컨대, 인자 vmc, 인자 IX, 조직 인자(TF), 및 폰 빌레브란드 인자(von Willebrands factor); 항-혈액응고 인자, 예컨대, 단백질 C; 심방 나트륨이노 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대, 우로키나제 또는 인간 소변 또는 조직형 플라스미노겐 활성제(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 인간 대식세포 염증 단백질(MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민; 뮬러리안-저해 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴렉신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩타이드; 미생물 단백질(microbial protein), 예컨대, 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA), 예컨대, CTLA-4; 인히빈(inhibin); 액티빈(activin); 혈관내피 성장 인자(VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양 인자, 예컨대, 골-유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대, NGF-베타.; 혈소판-유래성장 인자(PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대, aFGF 및 bFGF; 상피 성장 인자(EGF); 형질전환 성장 인자(TGF), 예컨대, TGF-알파 및 TGF-베타, 예컨대, TGF-.베타.1, TGF-.베타.2, TGF-.베타.3, TGF-.베타.4, 또는 TGF-.베타.5 포함; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I); 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; EpCAM; GD3; FLT3; PSMA; PSCA; MUC1; MUC16; STEAP; CEA; TENB2; EphA 수용체; EphB 수용체; 엽산염 수용체; FOLR1; 메소텔린; 크립토; αvβ6; 인테그린; VEGF, VEGFR; EGFR; 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR)(예컨대, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4); 트랜스페린 수용체; IRTA1; IRTA2; IRTA3; IRTA4; IRTA5; CD 단백질, 예컨대, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, CD103, CD105, CD123, CD134, CD137, CD138, CD152, 구아닐릴 고리화효소 C(GCC), 또는 미국 특허 출원 공개 제2008/0171040호 또는 미국 특허 출원 공개 제2008/0305044호(이들의 전문이 참고로 편입됨)에 개시된 1종 이상의 종양-관련 항원 또는 세포-표면 수용체에 결합되는 항체; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대, 인터페론-알파, -베타 및 -감마 집락 자극 인자(CSF), 예컨대, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨(IL), 예컨대, IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 분해 가속 인자; 바이러스 항원, 예를 들어, HIV 외피(envelope)의 일부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신(addressin); 조절 단백질; 인테그린, 예컨대, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대, HER2, HER3, 또는 HER4 수용체; 엔도글린; c-Met; IGF1R; 전립선 항원, 예컨대, PCA3, PSA, PSGR, NGEP, PSMA, PSCA, TMEFF2, 및 STEAP1; LGR5; B7H4; 및 위에서 나열된 폴리펩타이드 중 임의의 것의 단편을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 항원은 GCC가 아니다.
또한, 골수성 세포에 결합할 수 있는 GM-CSF는 급성 골수성 백혈병으로부터 병든 세포에 세포 결합제로서 사용될 수 있다. 활성화된 T-세포에 결합할 수 있는 IL-2는 이식편 거부 반응의 예방을 위하여, 이식편-대-숙주 질환의 치료 및 예방을 위하여, 그리고 급성 T-세포 백혈병의 치료를 위하여 사용될 수 있다. 멜라닌세포에 결합할 수 있는 MSH는, 흑색종을 향하여 지향된 항체일 수 있으므로 흑색종의 치료에 사용될 수 있다. 엽산은 난소 및 기타 종양에 발현된 엽산염 수용체를 표적화하는데 사용될 수 있다. 상피 성장 인자는 폐암 및 두경부암과 같은 편평암을 표적화하는데 사용될 수 있다. 소마토스타틴은 신경모세포종 및 기타 종양 유형을 표적화하는데 사용될 수 있다.
유방 및 고환의 암은 세포 결합제로서 에스트로겐(또는 에스트로겐 유사체) 또는 안드로겐(또는 안드로겐 유사체)으로 각각 성공적으로 표적화될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "항체"는, 임의의 면역글로불린, 임의의 면역글로불린 단편, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, dsFv, sFv, 미니바디, 다이아바디, 트라이바디, 테트라바디, 프로바디(Parham, J. Immunol., 131: 2895-2902 (1983); Spring et al. J. Immunol., 113: 470-478 (1974); Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244 (1960), Kim et al., Mol. Cancer Ther., 7: 2486-2497 (2008), Carter, Nature Revs., 6: 343-357 (2006), 미국 특허 제8,399,219호), 또는 면역글로불린 키메라(이것은 세포의 표면 상의 항원에 결합될 수 있음)(예컨대, 상보성 결정 영역(CDR)을 함유함)를 지칭한다. 임의의 적합한 항체는 세포 결합제로서 사용될 수 있다. 당업자라면 적절한 항체의 선택은 표적화될 세포 집단에 좌우될 것임을 인식할 것이다. 이와 관련하여, 특정 세포 집단(전형적으로 그리고 바람직하게는 병든 세포 집단)에서 선택적으로 발현되는 세포 표면 분자(즉, 항원)의 유형 및 수는 본 발명의 조성물에 사용하기 위한 적절한 항체의 선택을 지배할 것이다. 세포 표면 발현 프로파일은 종양 세포 유형을 비롯하여 다양한 세포 유형에 대해 알려져 있거나, 또는 알려져 있지 않은 경우, 일상적인 분자 생물학 및 조직 화학 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있지만, 가장 바람직하게는 단클론성 항체이다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "다클론성" 항체는 전형적으로 면역화된 동물의 혈청에 함유된, 이종 집단의 항체 분자를 지칭한다. "단클론성" 항체는 특정 항원에 특이적인 항체 분자의 동질 집단을 지칭한다. 단클론성 항체는 전형적으로 B 림프구("B 세포")의 단일 클론에 의해 생성된다. 단클론성 항체는 표준 하이브리도마 수법을 비롯하여 당업자에게 공지된 다양한 수법을 이용해서 얻어질 수 있다(예컨대, 문헌[Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), 및 C. A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, N.Y. (2001)] 참조). 요약하면, 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마 방법은 전형적으로 임의의 적합한 동물, 전형적으로 그리고 바람직하게는 마우스에 항원(즉, "면역원")을 주입하는 것을 포함한다. 이 동물은 이어서 희생되고, 비장으로부터 단리된 B 세포가 인간 골수종 세포와 융합된다. 하이브리드 세포(즉, "하이브리도마")가 생성되며, 이 하이브리드 세포는 무한히 증식하고 시험 관내에서 원하는 특이성을 갖는 항체의 고역가를 연속적으로 분비한다. 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 원하는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA), 웨스턴 블롯 분석 및 방사면역측정법을 포함한다. 하이브리도마의 집단은 개별 클론을 단리시키기 위해 스크리닝되며, 각각은 단일 항체 종을 항원에 분비한다. 각각의 하이브리도마는 단일 B 세포와의 융합으로부터 유래된 클론이기 때문에, 생성된 모든 항체 분자는 항원 결합 부위 및 아이소타입을 비롯하여 구조가 동일하다. 단클론성 항체는 또한 EBV-하이브리도마 수법(예컨대, 문헌[Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2): 361-67 (1984), 및 Roder et al., Methods Enzymol., 121: 140-67 (1986)] 참조), 박테리오파지 벡터 발현 시스템(예컨대, 문헌[Huse et al., Science, 246: 1275-81 (1989)] 참조), 또는 항체 단편, 예를 들어, Fab 및 scFv(단일 사슬 가변 영역)를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리(예컨대, 미국 특허 제5,885,793호 및 제5,969,108호, 및 국제 특허 출원 공개 WO 92/01047 및 WO 99/06587 참조)를 비롯하여 기타 적합한 수법을 이용해서 생성될 수 있다.
단클론성 항체는 임의의 적합한 동물로부터 단리되거나 임의의 적합한 동물에서 생산될 수 있지만, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 마우스 또는 인간, 가장 바람직하게는 인간에서 생산된다. 마우스에서 항체를 생산하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 본 명세서에 기재되어 있다. 인간 항체와 관련하여, 당업자라면 다클론성 항체가 적절한 항원으로 백신 접종되거나 면역화된 인간 대상체의 혈청으로부터 단리될 수 있음을 인식할 것이다. 대안적으로, 인간 항체는 마우스와 같은 비인간 동물에서 인간 항체를 생산하기 위한 공지된 수법을 적응시킴으로써 생성될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호 및 제5,714,352호, 그리고 미국 특허 출원 공개 제2002/0197266 A1호 참조).
인간의 치료적 응용에 이상적인 선택이지만, 인간 항체, 특히 인간 단일 클론 항체는 전형적으로 마우스 단클론성 항체보다 생성하기가 더 어렵다. 그러나, 마우스 단클론성 항체는 인간에게 투여될 때 신속한 숙주 항체 반응을 유도하여, 항체-세포독성제 접합체의 치료 또는 진단 잠재력을 감소시킬 수 있다. 이러한 문제를 피하기 위해, 단클론성 항체는 바람직하게는 인간 면역계에 의해 "이물"로 인식되지 않는다.
이를 위해, 파지 디스플레이를 사용하여 항체를 생성할 수 있다. 이와 관련하여, 항체의 항원-결합 가변(V) 도메인을 암호화하는 파지 라이브러리는 표준 분자 생물학 및 재조합 DNA 수법을 이용해서 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)] 참조). 원하는 특이성을 갖는 가변 영역을 암호화하는 파지는 원하는 항원에 대한 특이적 결합을 위해 선택되고, 선택된 가변 도메인을 포함하는 완전한 인간 항체가 재구성된다. 단클론성 항체의 특성을 갖는 인간 항체가 세포에 의해 분비되도록, 재구성된 항체를 암호화하는 핵산 서열을 하이브리도마 생산에 사용된 골수종 세포와 같은 적합한 세포주에 도입한다(예컨대, 문헌[Janeway et al., 상기 참조, Huse et al., 상기 참조], 및 미국 특허 제6,265,150호 참조). 대안적으로, 단클론성 항체는 특정 인간 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 유전자에 대해 형질 전환된 마우스로부터 생성될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제5,545,806호 및 제5,569,825호, 및 문헌[Janeway et al., 상기 참조]에 기재되어 있다.
가장 바람직하게는, 항체는 인간화 항체이다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "인간화된" 항체는, 항체의 항원 결합 루프를 형성하는 마우스의 단클론성 항체의 상보성 결정 영역(CDR)이 인간 항체 분자의 프레임워크에 이식된 것이다. 마우스 및 인간 항체의 프레임워크의 유사성으로 인해, 이 접근법은 인간 항체와 항원적으로 동일하지만 CDR 서열이 유래되는 마우스 단클론성 항체와 동일한 항원에 결합하는 단클론 항체를 생산한다는 것은 당업계에서 일반적으로 수용되고 있다. 인간화된 항체를 생성시키는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Janeway et al., 상기 참조], 미국 특허 제5,225,539호, 제5,585,089호 및 제5,693,761호, 유럽 특허 제0239400 B1호 및 영국 특허 제2188638호에 상세히 기술되어 있다. 인간화 항체는 또한 미국 특허 제5,639,641호 및 문헌[Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235: 959-973 (1994)]에 기재된 항체 표면 치환 수법을 사용하여 생성될 수 있다. 본 발명의 조성물의 접합체에 사용되는 항체는 인간화 단클론성 항체가 가장 바람직하지만, 위에서 기재된 바와 같이 인간 단클론성 항체 및 마우스 단클론성 항체도 본 발명의 범위에 속한다.
적어도 하나의 항원 결합 부위를 가지며 따라서 표적 세포의 표면 상에 존재하는 적어도 하나의 항원 또는 수용체를 인식하고 결합하는 항체 단편도 본 발명의 범위 내이다. 이와 관련하여, 무손상 항체 분자의 단백질 분해성 절단은 항원을 인식하고 결합하는 능력을 보유하는 다양한 항체 단편을 생산할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 파파인을 갖는 항체 분자의 제한된 분해는 전형적으로 3개의 단편을 생산하며, 이들 중 2개는 동일하고 모 항체 분자의 항원 결합 활성을 보유하기 때문에 Fab 단편으로 지칭된다. 효소 펩신으로 항체 분자를 절단하면 통상적으로 항체 분자의 항원-결합 아암을 둘 다 보유하는 2개의 항체 단편이 생산되므로, F(ab')2 단편으로 지칭된다. 다이티오트레이톨 또는 머캅토에틸아민을 사용한 F(ab')2 단편의 환원은 Fab' 단편으로 지칭되는 단편을 생산한다. 합성 펩타이드를 통해 경쇄 항체의 V 도메인에 연결된 항체 중쇄의 가변(V) 도메인을 포함하는 절두된 Fab 단편으로 이루어진 단일-사슬 가변 영역 단편(sFv) 항체 단편이 통상의 재조합 DNA 수법(예컨대, Janeway et al., 상기 참조)을 사용하여 생산될 수 있다. 마찬가지로, 다이설파이드-안정화된 가변 영역 단편(dsFv)은 재조합 DNA 수법(예를 들어, 문헌[Reiter et al., Protein Engineering, 7: 697-704 (1994)] 참조)에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 본 발명의 맥락에서의 항체 단편은 이러한 예시적인 유형의 항체 단편으로 제한되지 않는다. 원하는 세포 표면 수용체 또는 항원을 인식하고 결합하는 임의의 적합한 항체 단편이 사용될 수 있다. 항체 단편은, 예를 들어, 문헌[Parham, J. Immunol., 131: 2895-2902 (1983), Spring et al., J. Immunol., 113: 470-478 (1974), 및 Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244 (1960)]에 더욱 기재되어 있다. 항체-항원 결합은, 예를 들어, 방사면역측정법(RIA), ELISA, 웨스턴 블롯, 면역침강 및 경쟁 저해 검정(예컨대, Janeway et al., 상기 참조, 및 미국 특허 출원 공개 제2002/0197266 A1호 참조)과 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 검정될 수 있다.
또한, 항체는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. "키메라"란, 항체가 적어도 2개의 상이한 종(예컨대, 뮤린 면역 글로불린 가변 영역과 결합된 인간 면역글로불린 불변 영역과 같은 2개의 상이한 면역글로불린)으로부터 얻어지거나 유래된 적어도 2개의 면역 글로불린 또는 이의 단편을 포함하는 것을 의미한다. 항체는 또한 예를 들어 낙타 항체와 같은 도메인 항체(dAb) 또는 이의 항원 결합 단편(예컨대, 문헌[Desmyter et al., Nature Struct. Biol., 3: 752, (1996)] 참조), 또는 예를 들어 새로운 항원 수용체(IgNAR)와 같은 상어 항체(예컨대, 문헌[Greenberg et al., Nature, 374: 168 (1995), 및 Stanfield etal., Science, 305: 1770-1773 (2004] 참조)일 수 있다.
임의의 적합한 항체가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단클론성 항체 J5는 공통 급성 림프구성 백혈병 항원(CALLA)에 특이적인 뮤린 IgG2a 항체(Ritz et al., Nature, 283: 583-585 (1980))이고, 그리고 CALLA(예컨대, 급성 림프구성 백혈병 세포)를 발현하는 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 단클론성 항체 MY9는 CD33 항원에 특이적으로 결합하는 뮤린 IgG1 항체(Griffin et al., Leukemia Res., 8: 521 (1984))이고, 그리고 CD33(예컨대, 급성 골수성 백혈병(AML) 세포)를 발현하는 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, MY9 항체는 N-말단 또는 C-말단 잔기를 제거하였다.
마찬가지로, 단클론성 항체 항-B4(또한 B4로 지칭됨)는 B 세포 상의 CD19 항원에 결합하는 뮤린 IgG1 항체(Nadler et al., J. Immunol., 131: 244-250 (1983))이고, 그리고 CD19를 발현하는 B 세포 또는 병든 세포(예컨대, 비호지킨 림프종 세포 및 만성 림프구성 백혈병 세포)를 표적화하는 데 사용될 수 있다. N901은 신경내분비종양 기원 세포에 약물을 표적으로 하기 위해 접합체에 사용될 수 있는 소세포 폐 종양을 비롯한 신경내분비종양 기원 세포에서 발견되는 CD56(신경 세포 부착 분자) 항원에 결합하는 마우스 단클론성 항체이다. J5, MY9 및 B4 항체는 바람직하게는 접합체의 일부로서 이의 사용 전에 재표면화되거나 또는 인간화된다. 항체의 재표면화 또는 인간화는, 예를 들어, 문헌[Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 969-73 (1994)]에 기재되어 있다.
또한, 단클론성 항체 C242는 CanAg 항원에 결합하고(예컨대, 미국 특허 제5,552,293호 참조), 그리고 결장직장암, 췌장암, 비소세포 폐암 및 위암과 같은 CanAg 발현 종양에 접합체를 표적화하는데 사용될 수 있다. HuC242는 단클론성 항체 C242의 인간화 형태이다(예컨대, 미국 특허 제5,552,293호 참조). HuC242가 생산되는 하이브리도마는 ECACC 식별 번호 90012601로 기탁되어 있다. HuC242는 CDR-이식 방법(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호 및 제5,693,762호 참조) 또는 재표면화 수법(예컨대, 미국 특허 제5,639,641호 참조)을 이용해서 제조될 수 있다. HuC242는, 예를 들어, 결장직장암 세포, 췌장암 세포, 비소세포폐암 세포 및 위암 세포와 같은, CanAg 항원을 발현하는 종양 세포에 접합체를 표적화시키는데 사용될 수 있다.
난소암 및 전립선암 세포를 표적으로 하기 위해, 항-MUC1 항체가 접합체의 세포 결합제로서 사용될 수 있다. 항-MUC1 항체는, 예를 들어, 항-HMFG-2(예컨대, 문헌[Taylor-Papadimitriou et al., Int. J. Cancer, 28: 17-21 (1981)] 참조), hCTMO1(예컨대, 문헌[van H of et al., Cancer Res., 56: 5179-5185 (1996)] 참조), 및 DS6을 포함한다. 전립선암 세포는 또한 J591과 같은 항-전립선-특이적 막 항원(PSMA)을 세포 결합제로서 사용해서 접합체를 표적화할 수 있다(예컨대, 문헌[Liu et al., Cancer Res., 57: 3629-3634 (1997)] 참조). 또한, 유방암, 전립선암 및 난소암과 같은 Her2 항원을 발현하는 암세포는 항-Her2 항체, 예컨대, 트라스투주맙을 세포 결합제로 사용하여 접합체를 표적으로 할 수 있다. 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 이의 변이형, 예를 들어, III 형 결실 돌연변이인 EGFRvIII을 발현하는 세포는 항-EGFR 항체를 사용하여 접합체를 표적화할 수 있다. 항-EGFR 항체는 국제 특허 출원 제PCT/US11/058,385호 및 제PCT/US11/058,378호에 기재되어 있다. 항-EGFRvIII 항체는 미국 특허 제7,736,644호 및 제7,628,986호 및 미국 출원 공개 제2010/0111979호, 제2009/0240038호, 제2009/0175887호, 제2009/0156790호 및 제2009/0155282호에 기재되어 있다. 미국 특허 제7,982,024호에 기재된 것과 같은 인슐린-유사 성장 인자 수용에 결합하는 항-IGF-IR 항체가 또한 접합체에 사용될 수 있다. CD27L, 크립토(Cripto), CD138, CD38, EphA2, 인테그린, CD37, 엽산염, CD20, PSGR, NGEP, PSCA, TMEFF2, STEAP1, 엔도글린 및 Her3에 결합하는 항체가 또한 접합체에 사용될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 항체는 huN901, huMy9-6, huB4, huC242, 항-HER2 항체(예컨대, 트라스투주맙), 비바투주맙, 시브로투주맙, 리툭시맙, huDS6, 국제 특허 출원 공개 WO 2010/124797에 기재된 항-메소텔린 항체(예컨대, MF-T), 미국 특허 출원 공개 제2010/0093980호에 기재된 항-크립토 항체(예컨대, huB3F6), 미국 특허 출원 공개 제2007/0183971호에 기재된 항-CD138 항체(예컨대, huB-B4), 국제 특허 출원 제PCT/US11/058,385호 및 제PCT/US11/058,378호에 기재된 항-EGFR 항체(예컨대, EGFR-7), 미국 특허 제7,736,644호 및 제7,628,986호 및 미국 특허 출원 공개 제2010/0111979호, 제2009/0240038호, 제2009/0175887호, 제2009/0156790호 및 제2009/0155282호에 기재된 항-EGFRvIII 항체, 국제 특허 출원 공개 WO 2011/039721호 및 제WO2011/039724호에 기재된 인간화 EphA2 항체(예컨대, 2H11R35R74); 국제 특허 출원 공개 WO 2008/047242에 기재된 항-CD38 항체(예컨대, hu38SB19), 국제 특허 출원 공개 WO 2011/106528 및 미국 특허 출원 공개 제2012/0009181호에 기재된 항엽산염 항체(예컨대, huMov19); 미국 특허 제5,958,872호, 제6,596,743호 및 제7,982,024호에 기재된 항-IGF1R 항체; 미국 특허 출원 공개 제2011/0256153호에 기재된 항-CD37 항체(예컨대, huCD37-3); 미국 출원 공개 제2006/0127407호에 기재된 항-인테그린 αvβ6 항체(예컨대, CNTO95); 및 국제 특허 출원 공개 WO 2012/019024에 기재된 항-Her3 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, 세포 결합제는 FGFR2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예컨대, US2014/030820에 기재된 것, 이 문헌의 전체 교시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)이다. 다른 실시형태에 있어서, 세포 결합제는 FGFR2 및 FGFR4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예컨대, US 2014/301946에 기재된 것, 이 문헌의 전체 교시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)이다.
특히 바람직한 항체는 본 명세서에 기재된 인간화 단클론성 항체이다. 그 예는 huN901, huMy9-6, huB4, huC242, 인간화 단클론성 항-Her2 항체(예컨대, 트라스투주맙), 비바투주맙, 시브로투주맙, CNTO95, huDS6, 및 리툭시맙을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다(예컨대, 미국 특허 제5,639,641호 및 제5,665,357호, 미국 가특허 출원 제60/424,332호(이것은 미국 특허 제7,557,189호와 관련됨), 국제(PCT) 특허 출원 공개 WO 02/16401, Pedersen et al., 상기 참조, Roguska et al., 상기 참조, Liu et al., 상기 참조, Nadler et al., 상기 참조, Colomer et al., Cancer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider et al., Eur. J. Cancer, 31A: 2385-2391 (1995), Welt et al., J. Clin. Oncol., 12: 1193-1203 (1994), 및 Maloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997)). 기타 인간화 단클론성 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 세포 결합제는 huMy9-6, 또는 미국 특허 제7,342,110호 및 제7,557,189호(본 명세서에 참고로 편입됨)에 기재되어 있는 기타 관련된 항체이다.
다른 실시형태에 있어서, 세포 결합제는 미국 특허 제8,557,966호 및 제9,133,275호에 기재된 항엽산염 수용체 항체이다. 이들 특허의 각각의 교시내용은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다.
다른 실시형태에 있어서, 세포 결합제는 인간 엽산염 수용체 1(FOLR1)에 특이적으로 결합되는 인간화 항엽산염 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체는, (a) GYFMN(서열번호 1)을 포함하는 중쇄 CDR1; RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(서열번호 2)을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 YDGSRAMDY(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및 (b) KASQSVSFAGTSLMH(서열번호 4)를 포함하는 경쇄 CDR1; RASNLEA(서열번호 5)를 포함하는 경쇄 CDR2; 및 QQSREYPYT(서열번호 6)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하되; 여기서 Xaa1은 K, Q, H 및 R로부터 선택되고; Xaa2는 Q, H, N 및 R로부터 선택되며; 그리고 Xaa3은 G, E, T, S, A 및 V로부터 선택된다. 바람직하게는, 중쇄 CDR2 서열은 RIHPYDGDTFYNQKFQG(서열번호 7)를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 항엽산염 항체는 하기 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 인간 엽산염 수용체 1에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다:
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGR IHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYD GSRAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 8).
다른 실시형태에 있어서, 항엽산염 항체는 2010년 4월 7일에 ATCC에 기탁되어 ATCC 기탁 번호 PTA-10772 및 PTA-10773 또는 10774를 갖는 플라스미드 DNA에 의해 암호화된 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에 있어서, 항엽산염 항체는, QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDG DTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQG TTVTVSS(서열번호 24)와 적어도 약 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역, 및 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRL LIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPY TFGGGTKLEIKR(서열번호 9); 또는 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRL LIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPY TFGGGTKLEIKR(서열번호 10)과 적어도 약 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일 실시형태에 있어서, 세포 결합제는 GCC에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일 실시형태에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 11 내지 16의 CDR 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 항-GCC 항체는 서열번호 17 및 서열번호 18과 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 서열을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 항-GCC 항체는 각각 서열번호 17 및 서열번호 18인 VH 및 VL 서열을 갖는다. 또 다른 실시형태에 있어서, 항-GCC 항체는 서열번호 19의 중쇄 아미노산 서열과 서열번호 20의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 항-GCC 항체는 FcγRIIIb를 결합하는데 중요한 IgG1의 중쇄(서열번호 19)의 ELLG를 PVA로 교체한 중쇄 아미노산 서열; 및 서열번호 20의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
Figure pct00002
일 실시형태에 있어서, 세포 결합제는 항-GCC 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 아니다.
세포 결합제는 바람직하게는 항체이지만, 세포 결합제는 또한 비-항체 분자일 수 있다. 적합한 비-항체 분자는, 예를 들어, 인터페론(예컨대, 알파, 베타, 또는 감마 인터페론), 림포카인(예컨대, 인터류킨 2 (IL-2), IL-3, IL-4, 또는 IL-6), 호르몬(예컨대, 인슐린), 성장 인자(예컨대, EGF, TGF-알파, FGF, 및 VEGF), 집락-자극 인자(예컨대, G-CSF, M-CSF 및 GM-CSF(예컨대, 문헌[Burgess, Immunology Today, 5: 155-158 (1984)] 참조), 소마토스타틴 및 트랜스페린(예컨대, 문헌[O'Keefe et al., J. Biol. Chem., 260: 932-937 (1985)] 참조)을 포함한다. 예를 들어, 골수성 세포에 결합하는 GM-CSF는, 급성 골수성 백혈병 세포를 표적화하도록 세포 결합제로서 사용될 수 있다. 또한, 활성화된 T-세포에 결합하는 IL-2는, 이식편 거부 반응의 예방을 위하여, 이식편-대-숙주 질환의 치료 및 예방을 위하여, 그리고 급성 T-세포 백혈병의 치료를 위하여 사용될 수 있다. 상피 성장 인자(EGF)는 폐암 및 두경부암과 같은 편평암을 표적화하는데 사용될 수 있다. 소마토스타틴은 신경모세포종 세포 및 기타 종양 세포 유형을 표적화하는데 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 세포 결합제(예컨대, 항체)는 아민-반응기를 갖는 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 공유 결합을 형성할 수 있는 유리 아민-NH2기(예컨대, 1개 이상의 라이신 잔기 상에 엡실론 아미노기)를 포함한다.
세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물
본 명세서에서 이용되는 바와 같이 용어 "세포독성제"는, 세포사를 초래하거나, 세포사를 유도하거나, 또는 세포 생존능을 저감시키는 임의의 화합물을 지칭한다. 일 실시형태에 있어서, 세포독성제는 벤조다이아제핀 이량체 화합물이다. 다른 실시형태에 있어서, 세포독성제는 인돌리노벤조다이아제핀 이량체 화합물이다. 바람직하게는, 인돌리노벤조다이아제핀 이량체 화합물은 세포 결합제 상의 아민기(예컨대, 라이신 아민기)와 공유 결합을 형성할 수 있는 아민-반응기를 갖는다.
소정의 실시형태에 있어서, 세포독성제는 아민-반응기를 갖는 링커와 반응하여 아민-반응기가 부착된 세포독성제-링커 화합물을 형성할 수 있다. 이어서 얻어진 세포독성제-링커 화합물은 세포 결합제와 반응하여 세포 결합제-세포독성제 접합체를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "아민-반응기"는 아민기와 용이하게 반응하여 공유결합을 형성할 수 있는 작용기를 지칭한다. 일 실시형태에 있어서, 아민-반응기는 반응성 에스터기이다. 반응성 에스터기의 예는 N-하이드록시숙신이미드 에스터, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터, 나이트로페닐(예컨대, 2 또는 4-나이트로페닐) 에스터, 다이나이트로페닐(예컨대, 2,4-다이나이트로페닐) 에스터, 설포-테트라플루오로페닐(예컨대, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 에스터, 및 펜타플루오로페닐 에스터를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에 있어서, 반응성 에스터기는 N-하이드록시숙신이미드 에스터 또는 N-하이드록시설포숙신이미드 에스터이다.
제31 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00003
식 중
L은 하기 화학식으로 표시되고:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)E (A1); 또는
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1 (A3);
식 중,
R5는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
P는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 함유하는 아미노산 잔기 또는 펩타이드이며;
Ra 및 Rb는, 각 경우에, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환기 또는 이온성 기 Q(바람직하게는 Q는 -SO3M임)이고;
m은 1 내지 6의 정수이며; 그리고
Zs1은 하기 화학식 중 어느 하나로부터 선택된다:
Figure pct00004
식 중,
q는 1 내지 5의 정수이고;
M은 -H 또는 양이온이며; 그리고
-C(=O)E는 반응성 에스터기를 나타낸다.
제32 특정 실시형태에 있어서, 위에서 기재된 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물에 대하여, Ra 및 Rb는 둘 다 H이고; R5는 H 또는 Me이며; 그리고 나머지 변수는 제31 특정 실시형태에서 기재된 바와 같다.
제33 특정 실시형태에 있어서, 위에서 기재된 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물에 대하여, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드이고; 그리고 나머지 변수는 제31 또는 제32 특정 실시형태에 기재된 바와 같다. 일 실시형태에 있어서, 펩타이드는 프로테아제에 의해 절단 가능하며, 바람직하게는 종양 조직에 발현된 프로테아제에 의해 절단 가능하다. 다른 실시형태에 있어서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-나이트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열번호 21), b-Ala-Leu-Ala-Leu (서열번호 22), Gly-Phe-Leu-Gly (서열번호 23), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 및 Met-Ala로부터 선택된다. 바람직하게는, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala로부터 선택된다.
제34 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 또는 제30 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00005
.
제35 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29 또는 제30 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나로 표시되거나, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00006
.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 화합물(예컨대, 제31, 제32, 제33, 제34 또는 제35 특정 실시형태에 기재된 화합물)에 대하여, -C(=O)E로 표시된 반응성 에스터기는 N-하이드록시숙신이미드 에스터, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터, 나이트로페닐(예컨대, 2 또는 4-나이트로페닐) 에스터, 다이나이트로페닐(예컨대, 2,4-다이나이트로페닐) 에스터, 설포-테트라플루오로페닐(예컨대, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 에스터, 및 펜타플루오로페닐 에스터로부터 선택된다. 더욱 구체적으로, 반응성 에스터기는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00007
식 중, U는 H 또는 -SO3M이다. 더욱더 구체적으로, 반응성 에스터기는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00008
.
제36 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29 또는 제30 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식으로 표시되거나, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00009
.
일 실시형태에 있어서, 제36 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 구조식 (Ie)의 화합물은 (IIe)의 화합물을 설폰화제와 반응시킴으로써 제조된다. 특정 실시형태에 있어서, 설폰화제는 NaHSO3 또는 KHSO3이다. 다른 특정 실시형태에 있어서, 제36 실시형태에 기재된 방법에 대하여, 구조식 (Ie)의 화합물은 구조식 (Ie)의 화합물이 세포 결합제와 반응하기 전에 정제 없이 동소에서 설포화제와 (IIe)의 화합물을 반응시킴으로써 제조된다. 일 실시형태에 있어서, 식 (IIe)의 화합물과 설폰화제(예컨대, NaHSO3 또는 KHSO3) 간의 설폰화 반응은 1.9 내지 5.0, 2.9 내지 4.0, 2.9 내지 3.7, 3.1 내지 3.5, 3.2 내지 3.4의 pH에서 수용액 중에서 수행된다. 특정 실시형태에 있어서, 설폰화 반응은 pH 3.3에서 수성 용액 중에서 수행된다. 일 실시형태에 있어서, 설폰화 반응은 다이메틸아세트아마이드(DMA) 및 물 중에서 수행된다.
제37 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29 또는 제30 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식으로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00010
.
제38 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29 또는 제30 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나로 표시되거나 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00011
Figure pct00012
식 중,
Rx1 및 Rx2는 독립적으로 (C1-C6)알킬이고;
Re1은 -H 또는 (C1-C6)알킬이며;
Re2는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
n은 2 내지 6의 정수이며;
Rk는 -H 또는 -Me이고;
Zs1은 하기 화학식 중 어느 하나로부터 선택된다:
Figure pct00013
식 중,
q는 1 내지 5의 정수이고;
M은 -H 또는 양이온이며; 그리고
-C(=O)E는 반응성 에스터기를 나타낸다.
제39 특정 실시형태에 있어서, 구조식 (III), (IV), (V) 및 (VI)으로 표시되는 화합물에 대하여, Re1은 H 또는 Me이고; Rx1 및 Rx2는 독립적으로 -(CH2)p-(CRfRg)-이며, 여기서 Rf 및 Rg는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; p는 0, 1, 2 또는 3이며; 나머지 변수는 제 38 특정 실시형태에 기재된 바와 같다. 바람직하게는, Rf 및 Rg는 동일 또는 상이하고, -H 및 -Me로부터 선택된다.
제40 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29 또는 제30 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 하기 화학식 중 하나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00014
Figure pct00015
제41 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29 또는 제30 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 하기 화학식 중 하나로 표시된다:
Figure pct00016
제42 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29 또는 제30 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 하기 화학식 중 하나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00017
제43 특정 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29 또는 제30 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 하기 화학식 중 하나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00018
소정의 실시형태에 있어서, 위에서 기재된 구조식 (I), (III) 또는 (V)로 표시되는 화합물은 각각 위에서 기재된 구조식 (II), (IV) 또는 (VI)의 화합물을 설폰화 시약과 반응시킴으로써 제조된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "설폰화 시약"은 이하의 변형을 시행할 수 있는 시약이다.
Figure pct00019
.
일 실시형태에 있어서, 설폰화 시약은 NaHSO3이다.
소정의 실시형태에 있어서, 구조식 (Ia), (Ib), (Ic), (Id) 또는 (Ie)로 표시되는 화합물은 각각 구조식 (IIa), (IIb), (IIc), (IId) 및 (IIe)로 표시되는 화합물을 설폰화 시약과 반응시킴으로써 제조된다.
소정의 실시형태에 있어서, 구조식 (IIIa), (IIIb) 또는 (IIIc)로 표시되는 화합물은, 각각 구조식 (IVa), (IVb) 또는 (IVc)로 표시되는 화합물을 설폰화 시약과 반응시킴으로써 제조된다.
소정의 실시형태에 있어서, 구조식 (Va), (Vb) 또는 (Vc)로 표시되는 화합물은 각각 구조식 (VIa), (VIb) 또는 (VIc)로 표시되는 화합물을 설폰화 시약과 반응시킴으로써 제조된다.
소정의 실시형태에 있어서, 위에서 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제13, 제15, 제16, 제17, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41 또는 제43 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 구조식 (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IV), (IVa), (IVb), (IVc), (VIa), (VIb) 또는 (VIc)로 표시되며, 방법은 세포 결합제-세포독성제 접합체를 설폰화 시약과 반응시키는 단계를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 설폰화 시약은 NaHSO3 또는 KHSO3이다.
소정의 실시형태에 있어서, 위에서 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제13, 제15, 제16, 제17, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, , 제37, 제38, 제39, 제40, 제41 또는 제43 특정 실시형태에 기재된 방법)에 대하여, 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 구조식 (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IV), (IVa), (IVb), (IVc), (VIa), (VIb) 또는 (VIc)로 표시되고, 방법은 설폰화 시약의 존재 하에 세포 결합제를 구조식 (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IV), (IVa), (IVb), (IVc), (VIa), (VIb) 또는 (VIc)로 표시된 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 설폰화 시약은 NaHSO3 또는 KHSO3이다.
소정의 실시형태에 있어서, 구조식 (IIIa), (IIIb), (Va) 또는 (Vb)로 표시되는 화합물은, 하기 구조식 중 하나로 표시되는 화합물:
Figure pct00020
또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을, 하기 구조식 중 하나로 표시되는 링커 화합물과 반응시킴으로써 제조된다:
Figure pct00021
소정의 실시형태에 있어서, 구조식 (IIIc) 또는 (Vc)의 화합물은 하기 구조식으로 표시되는 화합물:
Figure pct00022
또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을, 하기 구조식의 링커 화합물과 반응시킴으로써 제조된다:
Figure pct00023
.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 화합물(예컨대, 화학식 (I), (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IV), (IVa), (IVb), (IVc), (V), (Va), (Vb), (Vc), (VI), (VIa), (VIb), 또는 (VIc)의 화합물)에 대하여, M은 -H, Na+ 또는 K+이다. 일 실시형태에 있어서, M은 Na+ 또는 K+이다. 다른 실시형태에 있어서, M은 Na+이다. 또 다른 실시형태에 있어서, M은 K+이다.
기타 적합한 세포독성제는, 예를 들어, 메이탄시노이드 및 접합 가능한 안사미토신(예를 들어, 국제 특허 출원 제PCT/US11/59131호(출원일: 2011년 11월 3일) 및 미국 특허 제9,090,629호 참조), 탁소이드, CC-1065 및 CC-1065 유사체, 및 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체를 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 세포독성제는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체를 비롯한 메이탄시노이드이다. 메이탄시노이드는 미세소관 형성을 저해하고 포유류 세포에 고도로 독성인 화합물이다. 적합한 메이탄시놀 유사체의 예는 변형된 방향족 고리를 갖는 것들과 다른 위치에 변형을 갖는 것들을 포함한다. 이러한 메이탄시노이드는, 예를 들어, 미국 특허 제4,256,746호, 제4,294,757호, 제4,307,016호, 제4,313,946호, 제4,315,929호, 제4,322,348호, 제4,331,598호, 제4,361,650호, 제4,362,663호, 제4,364,866호, 제4,424,219호, 제4,371,533호, 제4,450,254호, 제5,475,092호, 제5,585,499호, 제5,846,545호 및 제6,333,410호에 기재되어 있다.
변형된 방향족 고리를 갖는 메이탄시놀 유사체의 예는 (1) C-19-데클로로(미국 특허 제4,256,746호)(안사미토신 P2의 LAH 환원에 의해 제조됨), (2) C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸)+/-C-19-데클로로(미국 특허 제4,361,650호 및 제4,307,016호)(스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 악티노마이세스(Actinomyces)를 이용한 탈메틸화 또는 LAH를 이용한 탈염소화에 의해 제조됨), (3) C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(--OCOR), +/-데클로로(미국 특허 제4,294,757호)(염화아실을 이용한 아실화에 의해 제조됨)를 포함한다.
방향족 고리 이외의 위치에 변형을 갖는 메이탄시놀 유사체의 예는, (1) C-9-SH(미국 특허 제4,424,219호)(메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조됨), (2) C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 제4,331,598호), (3) C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 제4,450,254호)(노카르디아(Nocardia)로부터 제조), (4) C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 제4,364,866호)(스트렙토마이세스에 의해 메이탄시놀의 전환에 의해 제조), (5) C-15-메톡시(미국 특허 제4,313,946호 및 제4,315,929호)(트레위아 누디플로라(Trewia nudiflora)로부터 단리됨), (6) C-18-N-데메틸(미국 특허 제4,362,663호 및 제4,322,348호)(스트렙토마이세스에 의해 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨), 및 (7) 4,5-데옥시(미국 특허 제4,371,533호)(메이탄시놀의 삼염화티타늄/LAH 환원에 의해 제조됨)를 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 세포독성제는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있으며, N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신으로서도 알려진 티올-함유 메이탄시노이드 DM1이다. DM1의 구조는 이하에 표시되어 있다:
Figure pct00024
.
본 발명의 다른 특정 실시형태에 있어서, 세포독성제는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있으며 N2'-데아세틸-N2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신으로도 알려진 티올-함유 메이탄시노이드 DM1이다. DM4의 구조는 이하에 표시되어 있다:
Figure pct00025
.
예를 들어, 티올 및 황 원자를 보유하는 탄소 원자 상에 모노 또는 다이-알킬 치환을 보유하는 다이설파이드-함유 메이탄시노이드 및 티올을 비롯하여 기타 메이탄시노이드가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. (a) C-14 하이드록시메틸, C-15 하이드록시 또는 C-20 데스메틸 작용기, 및 (b) 장해된 설피드릴기를 보유하는 아실기를 갖는 아실화된 아미노 곁사슬을 C-3 위치에 갖는 메이탄시노이드가 특히 바람직하며, 여기서 티올 작용기를 보유하는 아실기의 탄소 원자는 1개 또는 2개의 치환기를 갖고, 상기 치환기는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알켄일, 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 환식 알킬 또는 알켄일, 페닐, 치환된 페닐, 또는 복소환식 방향족 또는 헤테로사이클로알킬 라디칼을 보유하며, 또한 치환기 중 하나는 H일 수 있고, 아실기는 카보닐 작용기와 황 원자 사이에 적어도 3개의 탄소 원자의 선형 사슬 길이를 갖는다.
본 명세서에 기재된 본 발명을 더욱 완전히 이해할 수 있도록, 이하의 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시적인 목적일 뿐이며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다.
또한 본 명세서에 기재된 임의의 방법(예컨대, 제1, 제2 또는 제3 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23, 제24, 제25, 제26, 제27, 제28, 제29, 제30, 제31, 제32, 제33, 제34, 제35, 제36, 제37, 제38, 제39, 제40, 제41, 제42, 제43 특정 실시형태에 기재된 방법)에 의해 제조된 세포 결합제-세포독성제 접합체가 본 발명에 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 접합체는 하기 구조식 중 하나로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
식 중, CBA-NH2는 세포 결합제이고; M은 -H 또는 약제학적으로 허용 가능한 양이온, 예컨대, Na+ 또는 K+이며; 그리고 r은 1 내지 10의 정수이다.
실시예
실시예 1.
Figure pct00029
화합물 1a :
무수 다이메틸폼아마이드(16.48 ㎖) 및 무수 테트라하이드로퓨란(16.48 ㎖) 중 (5-아미노-1,3-페닐렌)다이메탄올(1.01g, 6.59 m㏖)의 교반된 용액에 4-메틸-4-(메틸다이설파닐)펜탄산(1.281g, 6.59 m㏖), N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드 염산염(2.53g, 13.19 m㏖) 및 4-다이메틸아미노피리딘(0.081g, 0.659 m㏖)을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 18시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 반응물을 포화 염화암모늄 용액으로 반응 중지시키고, 에틸 아세테이트(3x50㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 물 및 염수로 세척하고, 이어서 무수 황산나트륨 위에서 건조시켰다. 이 용액을 여과시키고 진공 중 농축시키고, 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(에틸 아세테이트/헥산)에 의해 정제시켜 화합물 1a를 백색 고체로서 수득하였다(0.70g, 32% 수율). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6: δ 9.90 (s, 1H), 7.43 (s, 2H), 6.93 (s, 1H), 5.16 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 4.44 (d, 4H, J = 5.7 Hz), 2.43 (s, 3H), 2.41-2.38 (m, 2H), 1.92-1.88 (m, 2H), 1.29 (s, 6H). MS(m/z), 확인치 330.0 (M + 1)+.
Figure pct00030
화합물 1b :
무수 다이클로로메탄(6.65 ㎖) 중 화합물 1a(219㎎, 0.665 m㏖)의 냉각된(-10℃) 용액에 트라이에틸아민(463㎕, 3.32 m㏖)을 첨가하고 나서 메탄설폰산 무수물(298㎎, 1.662 m㏖)을 적가하였다. 이 혼합물을 -10℃에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 이 혼합물을 빙수로 반응 중지시키고 냉 에틸 아세테이트(2 x 30 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 빙수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 후 감압 하에 농축시켜 조질의 다이메실레이트를 수득하였다.
조질의 다이메실레이트(227㎎, 0.467 m㏖) 및 IGN 단량체 A(303㎎, 1.028 m㏖)를 무수 DMF(3.11 ㎖)에 용해시켰다. 탄산칼륨(161mg, 1.169 m㏖)을 첨가하고, 이 혼합물을 18시간 동안 실온에서 교반하였다. 탈이온수를 첨가하고, 얻어진 석출물을 여과시키고, 물로 헹구었다. 고체를 다이클로로메탄에 재용해시키고, 물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(메탄올/다이클로로메탄)에 의해 정제시켜 화합물 1b(227㎎, 36% 수율)를 제공하였다. MS(m/z), 확인치 882.5 (M + 1)+.
Figure pct00031
화합물 1c :
무수 1,2-다이클로로에탄(3.346 ㎖) 중 화합물 1b(227㎎, 0.167 m㏖)의 현탁액에 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드(37.3㎎, 0.167 m㏖)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 이때 포화 염화암모늄 용액으로 반응 중지시켰다. 이 혼합물을 다이클로로메탄으로 추출하고, 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 조질의 잔사를 RP-HPLC(C18, 물/아세토나이트릴)에 의해 정제시켰다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 다이클로로메탄으로 추출하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시키고 농축시켜, 화합물 1c(35㎎, 19% 수율)를 제공하였다. MS(m/z), 확인치 884.3 (M + 1)+.
Figure pct00032
화합물 1d :
아세토나이트릴(921㎕) 및 메탄올(658㎕) 중 화합물 1c(18㎎, 0.017 m㏖)의 용액에 트리스(2-카복시에틸)포스핀 염산염(17.51㎎, 0.060m㏖)(인산나트륨 완충제(132㎕, 0.75M, pH 6.5) 중 포화 중탄산나트륨 용액(0.2 ㎖)으로 중화시킴)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 3.5시간 동안 교반하고 나서, 다이클로로메탄 및 탈이온수로 희석시켰다. 유기층을 분액시키고 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 후 감압 하에 농축시켜 조질의 티올을 수득하였다. MS(m/z), 확인치 838.3 (M + 1)+.
단계 5로부터의 조질의 티올(15.5㎎, 0.018 m㏖)을 2-프로판올(1.23㎖)에 용해시켰다. 탈이온수(617㎕) 및 아황산수소나트륨(5.77㎎, 0.055 m㏖)을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 이 반응물을 아세톤/건조 빙욕에서 냉동시키고, 동결건조 후, RP-HPLC(C18, 탈이온수/아세토나이트릴)에 의해 정제시켰다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 냉동시키고, 동결건조시켜 화합물 (12S,12aS)-9-((3-(4-머캅토-4-메틸펜탄아미도)-5-((((R)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)벤질)옥시)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-12-설폰산(화합물 1d)(6.6㎎, 39% 수율)을 제공하였다. MS(m/z), 확인치 918.2 (M - 1)-.
실시예 2
2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((R)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸) 페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-6-옥소헥사노에이트, 화합물 90의 합성.
Figure pct00033
단계 1: (S)-2-(((벤질옥시)카보닐)아미노)프로판산(5g, 22.40 m㏖) 및 (S)-tert-부틸 2-아미노프로판산 염산염(4.48g, 24.64 m㏖)을 무수 DMF(44.8㎖)에 용해시켰다. EDC·HCl(4.72g, 24.64 m㏖), HOBt(3.43g, 22.40 m㏖) 및 DIPEA(9.75㎖, 56.0 m㏖)를 첨가하였다. 이 반응물을 아르곤 하에 실온에서 하룻밤 교반하였다. 이 반응 혼합물을 다이클로로메탄으로 희석시키고, 이어서 포화 염화암모늄, 포화 중탄산나트륨, 물, 및 염수로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨 위에서 건조시키고 농축시켰다. 조질의 오일을 실리카겔 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트)를 통해서 정제시켜 화합물 2a(6.7g, 85% 수율)를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.38-7.31 (m, 5H), 6.53-6.42 (m, 1H), 5.42-5.33 (m, 1H), 5.14 (s, 2H), 4.48-4.41 (m, 1H), 4.32-4.20 (m, 1H), 1.49 (s, 9H), 1.42 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 1.38 (d, 3H, J = 7.2 Hz).
Figure pct00034
단계 2: 화합물 2a(6.7g, 19.12 m㏖)를 메탄올(60.7 ㎖) 및 물(3.03㎖)에 용해시켰다. 이 용액을 5분 동안 아르곤으로 퍼지시켰다. 탄소 상의 팔라듐(습식, 10%)(1.017g, 0.956 m㏖)을 서서히 첨가하였다. 반웅물을 수소 분위기 하에 하룻밤 교반하였다. 이 용액을 셀라이트(Celite)를 통해서 여과시키고, 메탄올로 헹구고 농축시켰다. 이것을 메탄올 및 아세토나이트릴과 공비혼합하고 얻어진 오일을 고진공 하에 직접 배치하여 화합물 2b(4.02g, 97% 수율)를 제공하였으며, 이것을 다음 단계에서 직접 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.78-7.63 (m, 1H), 4.49-4.42 (m, 1H), 3.55-3.50 (m, 1H), 1.73 (s, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.39 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.36 (d, 3H, J = 6.8 Hz).
Figure pct00035
단계 3: 화합물 2b(4.02g, 18.59 m㏖) 및 모노 메틸아디페이트(3.03㎖, 20.45 m㏖)를 무수 DMF(62.0 ㎖)에 용해시켰다. EDC·HCl(3.92g, 20.45 m㏖), HOBt(2.85g, 18.59 m㏖) 및 DIPEA(6.49㎖, 37.2 m㏖)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 이 반응물을 다이클로로메탄/메탄올(150㎖, 5:1)로 희석시키고 포화 염화암모늄, 포화 중탄산나트륨 및 염수로 세척하였다. 이것을 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 이 화합물을 아세토나이트릴(5x)과 공비혼합하고, 이어서 고진공에서 35℃에서 펌핑하여 화합물 2c(6.66g, 100% 수율)를 제공하였다. 조질의 물질을 정제 없이 다음 단계에서 취하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.75 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 6.44 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 4.52-4.44 (m, 1H), 4.43-4.36 (m, 1H), 3.65 (s, 3H), 2.35-2.29 (m, 2H), 2.25-2.18 (m, 2H), 1.71-1.60 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.36 (t, 6H, J = 6.0 Hz).
Figure pct00036
단계 4: 화합물 2c(5.91g, 16.5 m㏖)를 TFA(28.6㎖, 372 m㏖) 및 탈이온수(1.5 ㎖) 중에서 실온에 3시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 아세토나이트릴과 농축시키고, 고진공 하에 배치하여 조질의 화합물 2d를 점착성의 고체로서 제공하였다(5.88g, 100% 수율). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.21 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 6.81 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 4.69-4.60 (m, 1H), 4.59-4.51 (m, 1H), 3.69 (s, 3H), 2.40-2.33 (m, 2H), 2.31-2.24 (m, 2H), 1.72-1.63 (m, 4H), 1.51-1.45 (m, 3H), 1.42-1.37 (m, 3H).
Figure pct00037
단계 5: 화합물 2d(5.6g, 18.52 m㏖)를 무수 다이클로로메탄(118㎖) 및 무수 메탄올 (58.8 ㎖)에 용해시켰다. (5-아미노-1,3-페닐렌)다이메탄올(2.70g, 17.64 m㏖) 및 EEDQ(8.72g, 35.3 m㏖)를 첨가하고, 이 반응물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 용매를 스트리핑하고 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 얻어진 슬러리를 여과시키고 에틸 아세테이트로 건조시키고 진공/N2 하에 건조시켜 화합물 2e(2.79g, 36% 수율)를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.82 (s, 1H), 8.05, (d, 1H, J = 9.2 Hz), 8.01 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 7.46 (s, 2H), 6.95 (3, 1H), 5.21-5.12 (m, 2H), 4.47-4.42 (m, 4H), 4.40-4.33 (m, 1H), 4.33-4.24 (m, 1H), 3.58 (s, 3H), 2.33-2.26 (m, 2H), 2.16-2.09 (m, 2H), 1.54-1.46 (m, 4H), 1.30 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.22 (d, 3H, J = 4.4 Hz).
Figure pct00038
단계 6: 화합물 2e(0.52g, 1.189 m㏖) 및 사브로민화탄소(1.183g, 3.57 m㏖)를 무수 DMF(11.89 ㎖)에 용해시켰다. 트라이페닐포스핀(0.935g, 3.57 m㏖)을 첨가하고, 이 반응물을 아르곤 하에 4시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 DCM/MeOH(10:1)로 희석시키고, 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 위에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 조질의 물질을 실리카겔 크로마토그래피(DCM/MeOH)에 의해 정제시켜 화합물 2f(262㎎, 39% 수율)를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.01 (s, 1H), 8.11 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 8.03 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.67 (s, 2H), 7.21 (s, 1H), 4.70-4.64 (m, 4H), 4.40-4.32 (m, 1H), 4.31-4.23 (m, 1H), 3.58 (s, 3H), 2.34-2.26 (m, 2H), 2.18-2.10 (m, 2H), 1.55-1.45 (m, 4H), 1.31 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.21 (d, 3H, J = 7.2 Hz).
Figure pct00039
단계 7: 다이브로마이드 화합물 2f 및 IGN 단량체 화합물 A를 DMF에 용해시켰다. 탄산칼륨을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 물을 이 반응 혼합물에 첨가시켜 생성물을 석출시켰다. 슬러리를 실온에서 교반하고, 이어서 여과시키고 진공/N2 하에 건조시켰다. 조질의 물질을 실리카겔 크로마토그래피(다이클로로메탄/메탄올)에 의해 정제시켜 화합물 2g(336㎎, 74% 수율)를 제공하였다. LCMS = 5.91분(15분 방법). MS(m/z): 990.6 (M + 1)+.
Figure pct00040
단계 8: 다이이민 화합물 2g를 1,2-다이클로로에탄에 용해시켰다. NaBH(OAc)3(STAB)를 이 반응 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 CH2Cl2로 희석시키고, 포화 NH4Cl 용액으로 ?칭시켰다. 층들을 분액시키고, 염수로 세척하고 Na2SO4 위에서 건조시키고 농축시켰다. 조질의 물질을 RPHPLC(C18 칼럼, 아세토나이트릴/물)를 통해 정제시켜 화합물 2h(85.5㎎, 25% 수율)를 제공하였다. LCMS = 6.64분(15분 방법). MS(m/z): 992.6 (M + 1)+.
Figure pct00041
단계 9: 화합물 2h를 1,2-다이클로로에탄에 용해시켰다. 트라이메틸스탄난올을 이 반응 혼합물에 첨가하고, 80℃에서 하룻밤 가열하였다. 이 반응 혼합물을 이어서 실온으로 냉각시키고 물로 희석시켰다. 수성 층을 1M HCl을 이용해서 pH 대략 4의 pH로 산성화시켰다. 이 혼합물을 CH2Cl2/MeOH로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고 Na2SO4 위에서 건조시키고 농축시켰다. 조질의 물질을 실리카 플러그를 통과시켜 화합물 2i(48.8㎎, 80% 수율)를 제공하였다. LCMS = 5.89분(15분 방법). MS(m/z): 978.6 (M + 1)+.
Figure pct00042
단계 10: EDC·HCl을 실온에서 CH2Cl2 중 산 화합물 2i 및 N-하이드록시숙신이미드의 교반된 용액에 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 이 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석시키고 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 위에서 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 조질의 물질을 RPHPLC(C18 칼럼, 아세토나이트릴/물)를 통해서 정제시켜 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((R)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸) 페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-6-옥소헥사노에이트, 화합물 2j(8.2㎎, 30% 수율)를 제공하였다. LCMS = 6.64분(15분 방법). MS(m/z): 1075.4 (M + 1)+.
실시예 3
접합: 종래 프로토콜
AbX, 인간 항-GCC 항체, 5F9(서열번호 19의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 20의 경쇄 아미노산 서열을 지님)를 접합 전에 15mM HEPES(pH 8.5)로 완충제 교환하였다. 이어서 AbX-(Ie) 접합체는 화합물 (IIe)의 설폰화 형태를 이용해서 제조하였다. 화합물 (Ie)는 처음에 주위 온도에서 3시간 동안 90/10 유기:수성 용액 중 5-배 몰 과량의 아황산수소나트륨 및 50mM 숙시네이트(pH 5.0)로 화합물 (IIe)의 항온 처리를 통해 설폰화하고 나서 4℃에서 하룻밤 항온처리하였다. 이어서 15mM HEPES(pH 8.5) 중 2.0 ㎎/㎖의 AbX 항체를 이용해서 접합 반응을 수행하고, 항체에 기초하여 특정 몰 과량(대표적인 접합에 대해서 표 1 참조)에서 화합물 (Ie)의 첨가를 행하였다. 접합 반응은 15mM HEPES(pH 8.5) 및 DMA의 최종 90/10 수성:유기 조성을 지녔으며, 제형 완충제(10mM의 히스티딘, 50mM 염화나트륨, 8.5% 수크로스, 0.01% 트윈(Tween)-20, 50㎛ 아황산수소나트륨, pH 6.2)로 정제 전에 4시간 동안 25℃에서 수욕에서 항온처리하였다.
Figure pct00043
접합: 최적화된 프로토콜
등장성 강도, 전도도, pH, 반응 농도 및 화합물 (Ie)의 몰 당량을 비롯한 각종 파라미터를 조사하여 목적하는 AbX-(Ie) 접합체의 수율을 최적화하였다. 75mM의 EPPS, pH 8.0 완충제를 이용하는 최적화된 프로토콜이 이들 연구로부터 부각되었다. 표준 플랫폼 프로토콜과 유사하게, AbX-(Ie) 접합체는 화합물 (IIe)의 설폰화된 형태인 화합물 (Ie)를 이용해서 제조하였다(이전의 부문에서 기재된 바와 같이 제조됨). 최적화된 접합 반응은 75mM의 EPPS(pH 8.0) 중 2.0 ㎎/㎖의 AbX 항체를 이용하고, 항체에 기초한 특정 몰 과량에서 화합물 (Ie)의 첨가하여 수행하였다(대표적인 접합에 대해서 표 2 참조). 접합 반응은 75mM의 EPPS, pH 8.0 및 DMA의 최종 90/10 수성:유기 조성을 지녔으며, 제형 완충제(10mM의 히스티딘, 50mM 염화나트륨, 8.5% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50㎛ 아황산수소나트륨, pH 6.2)로의 정제 전에 25℃에서 4시간 동안 수욕에서 항온처리하였다.
Figure pct00044
표 2에 도시된 바와 같이, 접합 수율은 24%에서 64%로 대략 2배 증가되었고, 프로토콜은 pH 8.5에서 낮은 이온 강도를 갖는 완충제를 이용하는 기존의 프로토콜에 비해서 pH 8.0에서 높은 이온 강도를 갖는 완충제의 이용을 포함한다.
정제
AbX-(Ie) 접합 반응 혼합물은 20mM의 히스티딘, 50mM 염화나트륨, 8.5% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 및 50μM 아황산수소나트륨(pH 6.2)으로 평형화된 세파덱스 G-25 NAP 칼럼을 이용해서 정제시켰다. 정제된 접합체는 0.22㎛ PVDF 주사기 필터(syringe filter)를 이용해서 여과시키고, 4℃에서 새로운 제형 완충제에 대해서 하룻밤 투석하고 나서, 새로운 제형 완충제를 이용해서 4시간 동안 주위 온도에서 투석하였다. 접합체는 분석 전에 0.22㎛ PVDF 주사기 필터를 이용해서 재여과하였다.
분석 방법:
정제된 접합체 샘플 중 항체 및 세포독성제 (D)의 농도는 280㎚ 및 330㎚에서의 흡광도값을 이용해서 UV/Vis에 의해 결정하였다. 항체와 세포독성제는 둘 다 280㎚에서 흡광하므로, 각 모이어티에 기인된 총 신호의 부분을 고려하기 위하여 이항방정식이 요구되었다. 세포독성제인 인돌리노벤조다이아제핀(IGN)만이 330㎚에서 흡광하므로, 그 파장에서의 농도는 세포독성제에 단독으로 기인될 수 있다. 접합된 모이어티의 흡광 계수(extinction co-efficient)값은 표 3에 나열되어 있다.
항체 및 세포독성제 성분은 각 파장에서 각 구성성분의 기여도를 고려한 이하의 대수식을 이용해서 정량화되었다:
Figure pct00045
Ax는 X㎚ 파장에서의 흡광도값이고, 반면에 CAb는 항체(즉, AbX)의 몰 농도이며 CD는 세포독성제의 몰 농도이다. 세포독성제:Ab의 비(DAR)는 상기 몰 농도들의 비로서 계산되었다. AbX 및 세포독성제의 ㎎/㎖(g/ℓ) 농도는 표 3에 나열된 분자량을 이용해서 계산되었다.
Figure pct00046
단량체성 접합체의 퍼센트의 결정
정제된 AbX-세포독성제 샘플 중의 단량체성 접합체의 퍼센트는 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하는 HPLC 분석을 통해서 결정하였다. 대략 10 내지 100㎍의 AbX-세포독성제 접합체를 SEC 칼럼(TSK GEL G3000SWxl 5㎛, 7.8 mm x 30 cm, 파트 번호 08541; 권장된 가드 칼럼 TSK GEL, 4 cm, 파트 번호 08543, 토소 바이오사이언시스사(TOSOH Biosciences), 팬실베니아주 킹오브프러시아 소재)이 부착된 HPLC 기기에 주입하고, 400mM 과염소산나트륨, 50mM 인산나트륨, 5% 아이소프로판올의 등용매용리 이동상으로 분당 0.5㎖에서 가동시켰다. 흡광 신호는 280㎚ 및 330㎚ 파장에서 30분 동안 수집하였다.
AbX 항체 단량체는 전형적으로 대략 17분에 용리된 한편, AbX-세포독성제 접합체 단량체는 종종 대략 17분 및 대략 19분에서 피크를 갖는 이중항으로서 용리되었다. 고분자량 종(HMW, 예컨대, 이량체, 응집체) 및 저분자량 종(LMW, 예컨대, 단편)은 전형적으로 각각 대략 12분 및 대략 24분에 용리되었다.
단량체성 항체(또는 접합체)%는 17분 피크(또는 17/19 이중항)의 280㎚ 피크 면적으로부터 계산하고, 합한 단백질 피크 전체의 면적과 비교하였다.
단량체 피크에 대한 DAR은 또한 280㎚ 및 330㎚ 신호의 피크 면적을 상기 부문에 나타낸 CD 및 CAb 방정식 중의 A280 및 A330 공간으로 차감하고 나서 CD/CAb를 나눔으로써 결정하였다.
미접합 세포독성제의 퍼센트의 결정
정제된 접합체 샘플에 존재하는 미접합 세포독성제("유리 약물")의 양은 탠덤 SEC 및 C-18 역상 칼럼("이중-칼럼")을 이용한 UPLC 분석을 이용해서 결정하였다. 2개의 워터스 액퀴티 UPLC 프로테인 BEH SEC 칼럼(Waters Acquity UPLC Protein BEH SEC column)(1.7㎛, 4.6 x 30 mm, 파트 번호 186005793, 워터스 코포레이션(Waters Corporation), 매사추세츠주 밀포드 소재)을 직렬로 접속하여 유리 약물로부터 무손상 접합체를 분리시키고, 이어서 워터스 코텍스(Waters Cortecs)UPLC C-18 칼럼(2.1 x 50 mm, 파트 번호 186007093)에 통과시켜 유리 CDA 종을 분리시키고 정량하였다. 접합체는 아세토나이트릴(ACN)로 20% (v/v) ACN으로 희석시켜 제조하고 상기 칼럼 시리즈(25㎕)에 주입하고, 표 4에 나열된 구배에 따라서 가동시켰다:
Figure pct00047
칼럼을 2.2분에 인-라인 SEC에서 C-18로 전환하고 14.0분에 도로 인-라인 SEC로 되돌렸다. 신호는 265㎚에서 수집하였다. 화합물 (Ie)로부터 유도된 표준 곡선을 이용해서, 하기 식을 이용하여 2.2 내지 14.0에서 발견된 피크로부터 샘플에 존재하는 유리 약물의 양을 계산하였다:
ng유리 = (AUC265 nm + 11805) / 4888
유리 CDA% = ng유리 / ng주입
실시예 4.
인간화 항체 Ab1 및 뮤린 항체인 뮤린 My9-6과 화합물 (Ie)의 접합체는 실시예 3에 기재된 프로토콜에 따라서 제조하였다. 그 결과는 표 5에 표시되어 있다.
Figure pct00048
표 5에 나타낸 바와 같이, pH 8에서 높은 이온 강도 완충제를 이용한 접합은 pH 8.5에서 낮은 이온 강도를 갖는 완충제를 이용한 접합에 비해서 반응 수율의 유의한 증가를 가져온다.
<---------->
실시예 5
5F9-PVAdG-(Ie) 접합체를 제조하기 위하여 75mM의 EPPS, pH 8.0 완충제를 이용하는 실시예 3에 기재된 프로토콜을 이용하였다. 5F9-PVAdG 항체는 유사한 위치에서 IgG2 내에 고도로 보존된 아미노산인 FcγRIIIb를 결합하는데 중요한 IgG1의 중쇄(서열번호 9) 내의 ELLG를 PVA로 교체하는 아미노산 치환을 함유한다(Vidarsson et al., IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions, Frontiers in Immunology, 5(520): 1-17(2014)).
접합 반응은 항체에 기초하여 특정 몰 과잉으로 화합물 (IIe)의 설폰화된 형태의 첨가에 의해 75mM의 EPPS(pH 8.0) 중 2.0 ㎎/㎖의 5F9 PVAdG 항체를 이용해서 수행하였다(대표적인 접합에 대해서 표 6 참조). 접합 반응물은 최종 90/10의 수성:유기 조성의 75mM의 EPPS(pH 8.0) 및 DMA를 가졌고, 제형 완충제(10mM의 히스티딘, 50mM 염화나트륨, 8.5% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50μM 아황산수소나트륨, pH 6.2)로 정제시키기 전에 4시간 동안 25℃에서 수욕에서 항온처리하였다.
5F9-PVAdG-(Ie) 접합 반응 혼합물은 10mM의 히스티딘, 50mM 염화나트륨, 8.5% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50μM 아황산수소나트륨(pH 6.2)으로 평형화된 세파덱스 G-25 HiPrep 칼럼을 이용해서 정제시켰다. 정제된 접합체는 분석 전에 0.22㎛ PVDF 주사기 필터를 사용해서 여과시켰다.
Figure pct00049
실시예 6
최적화된 설폰화
화합물(IIe)은 화합물 (Ie)을 생성하기 위하여 다음과 같이 설폰화되었다. 3.75㎖의 50mM 숙신산나트륨, pH 3.3 용액에, 6.11㎖의 양의 DMA를 첨가하였다. 수욕에 10℃로 혼합 및 평형화 후에, DMA 중 21.5mM 화합물(IIe) 스톡 용액(30.0㏖ 화합물 (IIe)) 1.39㎖를 첨가하고 혼합하였다. 이 첨가 후에, 3.75㎖의 20mM 수성 아황산수소나트륨 용액(2.5 당량, 75㎛㏖)을 반응물에 도입하였다. 혼합 후에, 반응을 10℃에서 15.5시간 동안 진행하고, 정제 없이 다음 단계에서 즉시 사용하였다. 반응 혼합물의 액체 크로마토그래피(역상) 분석은 화합물(Ie)로의 92.4% 전환을 나타내었고 2.4%는 나머지 미반응 화합물 (IIe)이었다.
접합 후 ?치
접합 후 이온 강도의 증가가 고분자량(HMW) 종의 형성의 감소를 초래하는 조건을 결정하기 위하여, 다음의 최적화가 수행되었다. 5F9 항체(2 mg/㎖)를 22℃에서 80 내지 90분 동안 3.8몰 당량의 화합물(Ie)에 접합시켰다. 접합 반응의 최종 조성은 DMA 15 용적%와 함께 130mM의 EPPS(pH 8.7)를 포함하였다. 접합 반응의 완결 즉시, 분취액을 표 7에 상세히 나타낸 바와 같은 표시된 용적의 ?치 용액으로 희석시켰다. HMW 종의 퍼센트의 변화를 22℃에서의 유지 시 표시된 시간 동안 모니터링하였다. 이 확인에 기초하여, 300, 500, 또는 700mM의 EPPS ?치 용액을 이용한 2-배 희석, 750mM의 EPPS를 이용한 1.4 내지 1.6-배 희석, 그리고 750mM의 EPPS/150mM의 히스티딘 염산염을 이용한 1.4 내지 1.6-배 희석을 선택하였다. 이하의 접합예에서, 750mM의 EPPS/150mM 히스티딘 염산염을 이용한 1.5-배 희석을 사용하였다. 표 7은 조질의 5F9-(Ie) 접합체의 안정성에 대한 ?치 용액의 효과를 나타낸다. 조질의 5F9-(Ie) 접합체는 특정된 양의 시간에 대해서 상이한 ?치 용액으로 항온처리하였고 분자량종 퍼센트의 변화는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정하였다.
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
최적화된 접합 및 정제
325㎖의 130mM의 EPPS(pH 8.7)를 함유하는 오버헤드 교반기가 장착된 1ℓ 재킷 부착된 유리 반응기에, 68.6㎖의 DMA를 첨가하였다. 22℃로 용액의 혼합 및 평형화시킨 후, 130mM의 EPPS(pH 8.7) 중 5F9 항체의 10.0 ㎎/㎖ 용액 100㎖를 반응기에 도입하고 15분 동안 혼합하였다. 이어서 2mM 화합물 (Ie) 용액(25.5㎛㏖, 3.7 당량의 5F9 항체; 앞서 기재된 최적화된 설폰화 프로토콜을 이용해서 제조됨) 12.8㎖를 이 반응 용액에 도입하였다. 22℃에서 60분 동안 교반 후, 150mM의 히스티딘 염산염 및 750mM의 EPPS를 함유하는 수성 용액 250㎖를 반응 용기로 옮겼다. 철저하게 혼합한 후에, 이 물질을 밀리포어 옵티스케일 47 익스프레스 SHC(Millipore Optiscale 47 Express SHC) 0.5/0.2㎛ 필터를 통해서 여과시켰다. 이어서 조질의 반응물혼합물을 탄겐엑스 0.02 m2 하이스트림 30 kD 시우스 LSN TFF(TangenX 0.02 m2 HyStream 30 kD Sius LSN TFF) 카세트를 이용한 한외 여과에 의해 2.5 ㎎/㎖의 계산된 벌크 단백질 농도로 농축시켰다. 농축 단계 후에, 용액을 4.8ℓ의 50mM의 히스티딘, 6.7 w/v(중량/용적)% 수크로스, 0.1 v/v(용적/용적)% 폴리솔베이트-80, 50㎛ 아황산수소나트륨, pH 5.5 완충제에 대해서 정용여과시켰다. 정용여과 후, 투석유물(retentate) 용액에 폴리솔베이트-80을 0.1 v/v(용적/용적)%의 폴리솔베이트-80의 최종 농도로 첨가하고, 얻어진 용액을 밀리포어 옵티스케일 47 익스프레스 SHC 0.5/0.2㎛ 필터로 여과시켰다. 2 내지 8℃에서 2일 동안 저장 후, 용액을 필요한 용적의 추가의 50mM의 히스티딘, 6.7 w/v% 수크로스, 0.1 v/v% 폴리솔베이트-80, 50㎛ 아황산수소나트륨, pH 5.5 완충제의 첨가 후에 1.0 ㎎/㎖ 접합체로 희석시켰다. 이어서 이 용액을 밀리포어 옵티스케일 47 듀라포어(Durapore) 0.22㎛ 필터를 통해 여과시켜 818㎖의 1.0 ㎎/㎖ 접합체를 제공하였다. 최종 접합체의 측정된 DAR은 UV/vis에 의해 2.6이고 SEC에 의해 97.4% 단량체 및 2.5% HMW를 지녔다. 생성물의 최종 수율은 82%였다.
분석:
정제된 접합체 샘플 중의 항체 및 세포독성제(Ie)의 농도는 280㎚ 및 330㎚에서의 흡광도값을 이용해서 UV/Vis에 의해 결정되었다. 항체 및 세포독성제는 둘 다 280㎚에서 흡수하므로, 이항방정식은 각 모이어티에 기인된 총 신호의 부분을 고려하도록 요구되었다. 세포독성제인 인돌리노벤조다이아제핀(IGN)만이 330㎚에서 흡수하므로, 그 파장에서의 농도는 세포독성제에 단독으로 기인될 수 있다. 이 예에서 사용된 접합된 모이어티의 흡광 계수값은 각각 280 및 330㎚에서 34150 및 16270 M-1cm-1이다.
항체 및 세포독성제 성분은 각 파장에서 각 구성성분의 기여도를 고려한 이하의 대수식을 이용해서 정량화되었다:
Figure pct00053
Ax는 X㎚ 파장에서의 흡광도값이고, 반면에 CAb는 항체(즉, AbX)의 몰 농도이며 CD는 세포독성제의 몰 농도이다. 세포독성제:Ab의 비(DAR)는 상기 몰 농도들의 비로서 계산되었다. AbX의 ㎎/㎖(g/ℓ) 농도는 144887 g/㏖의 분자량을 사용해서 계산되었다.
SEQUENCE LISTING <110> IMMUNOGEN, INC. <120> EFFICIENT PROCESS FOR PREPARING CELL-BINDING AGENT CYTOTOXIC AGENT CONJUGATES <130> WO 2017/136623 <140> PCT/US2017/016344 <141> 2017-02-03 <150> US 62/292018 <151> 2016-02-05 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> FOLR1 antibody heavy chain CDR1 <400> 1 Gly Tyr Phe Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> FOLR1 antibody heavy chain CDR2 <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Lys, Gln, His, or Arg <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Gln, His, Asn, or Arg <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Gly, GLu, Thr, Ser, Ala, or Val <400> 2 Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> FOLR1 antibody heavy chain CDR3 <400> 3 Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <220> <223> FOLR1 antibody light chain CDR1 <400> 4 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe 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300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> FOLR1 antibody light chain variable domain <400> 9 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> artificial <220> <223> FOLR1 antibody light chain variable domain <400> 10 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> 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Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 20 <211> 233 <212> PRT <213> artificial <220> <223> anti-GCC antibody light chain <400> 20 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val 35 40 45 Ser Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser 85 90 95 Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 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Claims (119)

  1. 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법으로서, 높은 이온 강도를 갖는 완충 용액의 존재 하에 4 내지 9의 pH에서, 세포 결합제와 공유 결합을 형성 가능한 반응기를 갖는 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 상기 세포 결합제를 반응시키는 단계를 포함하되, 상기 세포 결합제는 아민-반응기를 갖는 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물과 공유 결합을 형성하는 라이신 ε-NH2기를 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 pH는 7.3 내지 8.7인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 pH는 7.3 내지 8.4인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 pH는 7.6 내지 8.4인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 pH는 7.7 내지 8.3인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 pH는 7.8 내지 8.2인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 pH는 7.9 내지 8.1인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 pH는 8.0인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 pH는 8.5 내지 8.9인인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 pH는 8.6 내지 8.8인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 pH는 8.7인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충 용액은 20mM 내지 500mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 완충 용액은 50mM 내지 100mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 완충 용액은 60mM 내지 90mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 완충 용액은 70mM 내지 80mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 완충 용액은 75mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 완충 용액은 100nM 내지 200mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 완충 용액은 100nM 내지 160nM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 완충 용액은 120nM 내지 140nM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 완충 용액은 130nM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 완충 용액은 7.8 내지 8.9의 pH 및 50mM 내지 200mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 완충제는 7.8 내지 8.2의 pH 및 70mM 내지 80mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 완충제는 8.0의 pH 및 75mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 완충제는 8.5 내지 8.9의 pH 및 120mM 내지 140mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 완충제는 8.7의 pH 및 130mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충 용액은 MES((2-(N-몰폴리노)에탄설폰산)) 완충제, 비스-트리스 메탄 (2-[비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-다이올) 완충제, ADA(N-(2-아세트아미도)이미노다이아세트산) 완충제, ACES(N--2-아미노에탄설폰산) 완충제, PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MOPSO(β-하이드록시-4-몰폴린프로판설폰산) 완충제, 비스-트리스 프로판(1,3-비스(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판) 완충제, BES(N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산), TES(N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설폰산) 완충제, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산) 완충제, DIPSO(3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시프로판설폰산또는 N,N-비스(2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산), MOBS(4-(N-몰폴리노)부탄설폰산) 완충제, TAPSO(3-[[1,3-다이하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]-2-하이드록시프로판-1-설폰산) 완충제, 트라이즈마(트리스 또는 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판다이올) 완충제, HEPPSO(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-하이드록시프로판설폰산)) 완충제, POPSO(피페라진-1,4-비스-(2-하이드록시-프로판-설폰산) 탈수물) 완충제, EPPS(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-프로판설폰산) 완충제, 트라이신(N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글리신) 완충제, gly-gly, 바이신(2-(비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산) 완충제, HEPBS(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산)) 완충제, TAPS(3-[[1,3-다이하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]프로판-1-설폰산) 완충제, AMPD(2-아미노-2-메틸-1,3-프로판다이올) 완충제, TABS(N-트리스(하이드록시메틸)메틸-4-아미노부탄설폰산) 완충제, AMPSO(N-(1,1-다이메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산) 완충제 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 완충 용액은 EPPS 완충제인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 완충 용액은 7.8 내지 8.9의 pH를 갖는 50mM 내지 200mM의 EPPS 완충제인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 완충 용액은 7.8 내지 8.2의 pH를 갖는 70mM 내지 80mM의 EPPS 완충제인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 완충 용액은 8.0의 pH를 갖는 75mM의 EPPS 완충제인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  31. 제1항에 있어서, 상기 완충 용액은 8.5 내지 8.9의 pH를 갖는 120mM 내지 140mM의 EPPS인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 완충 용액은 8.7의 pH를 갖는 130mM의 EPPS 완충제인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  33. 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법으로서, 7.3 내지 9.0의 pH를 갖는 완충 용액에서 세포 결합제를 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 반응시키는 단계를 포함하되, 상기 세포 결합제는 아민-반응기를 갖는 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물과 공유 결합을 형성하는 라이신 ε-NH2기를 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 완충 용액의 상기 pH는 7.3 내지 8.4인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 pH는 7.6 내지 8.4인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 pH는 7.7 내지 8.3인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 pH는 7.8 내지 8.2인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  38. 제33항에 있어서, 상기 pH는 7.9 내지 8.1인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  39. 제33항에 있어서, 상기 pH는 8.0인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  40. 제33항에 있어서, 상기 pH는 8.5 내지 8.9인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  41. 제33항에 있어서, 상기 pH는 8.6 내지 8.8인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  42. 제33항에 있어서, 상기 pH는 8.7인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  43. 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법으로서, 고농도 완충 용액의 존재 하에 4 내지 9의 pH에서, 세포 결합제와 공유 결합을 형성 가능한 반응기를 갖는 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 상기 세포 결합제를 반응시키는 단계를 포함하되, 상기 세포 결합제는 아민-반응기를 갖는 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물과 공유 결합을 형성하는 라이신 ε-NH2기를 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 완충 용액의 농도가 20mM 내지 750mM, 20mM 내지 500mM, 20mM 내지 200mM, 25mM 내지 150mM, 50mM 내지 150mM, 50mM 내지 100mM, 100mM 내지 200mM, 또는 100mM 내지 150mM인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 pH는 7.3 내지 8.9, 7.3 내지 8.4, 7.6 내지 8.4, 7.7 내지 8.3, 7.8 내지 8.2, 8.5 내지 8.9, 또는 8.6 내지 8.8인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 완충 용액은 20mM 내지 200mM의 농도 및 7.1 내지 8.5의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  47. 제43항에 있어서, 상기 완충 용액은 50mM 내지 150mM의 농도 및 7.6 내지 8.4의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  48. 제43항에 있어서, 상기 완충 용액은 50mM 내지 100mM의 농도 및 7.7 내지 8.3의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  49. 제43항에 있어서, 상기 완충 용액은 60mM 내지 90mM의 농도 및 7.8 내지 8.2의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  50. 제43항에 있어서, 상기 완충 용액은 70mM 내지 80mM의 농도 및 7.9 내지 8.1의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  51. 제43항에 있어서, 상기 완충 용액은 50mM 내지 200mM의 농도 및n 7.8 내지 8.9의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  52. 제43항에 있어서, 상기 완충 용액은 110mM 내지 150mM의 농도 및 8.5 내지 8.9의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  53. 제43항에 있어서, 상기 완충 용액은 120mM 내지 140mM의 농도 및 8.6 내지 8.8의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  54. 제33항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충 용액은 MES((2-(N-몰폴리노)에탄설폰산)) 완충제, 비스-트리스 메탄 (2-[비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-(하이드록시메틸)프로판-1,3-다이올) 완충제, ADA(N-(2-아세트아미도)이미노다이아세트산) 완충제, ACES(N--2-아미노에탄설폰산) 완충제, PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MOPSO(β-하이드록시-4-몰폴린프로판설폰산) 완충제, 비스-트리스 프로판(1,3-비스(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판) 완충제, BES(N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산), TES(N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설폰산) 완충제, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산) 완충제, DIPSO(3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시프로판설폰산또는 N,N-비스(2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산), MOBS(4-(N-몰폴리노)부탄설폰산) 완충제, TAPSO(3-[[1,3-다이하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]-2-하이드록시프로판-1-설폰산) 완충제, 트라이즈마(트리스 또는 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판다이올) 완충제, HEPPSO(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-하이드록시프로판설폰산)) 완충제, POPSO(피페라진-1,4-비스-(2-하이드록시-프로판-설폰산) 탈수물) 완충제, EPPS(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-프로판설폰산) 완충제, 트라이신(N-(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)글리신) 완충제, gly-gly, 바이신(2-(비스(2-하이드록시에틸)아미노)아세트산) 완충제, HEPBS(N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산)) 완충제, TAPS(3-[[1,3-다이하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]프로판-1-설폰산) 완충제, AMPD(2-아미노-2-메틸-1,3-프로판다이올) 완충제, TABS(N-트리스(하이드록시메틸)메틸-4-아미노부탄설폰산) 완충제, AMPSO(N-(1,1-다이메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산) 완충제 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 완충 용액은 EPPS 완충제인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 완충 용액은 75mM의 EPPS 완충제인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  57. 제54항에 있어서, 상기 완충 용액은 130mM의 EPPS 완충제인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물과 상기 세포 결합제의 반응 후에 높은 이온 강도를 갖는 ?칭 용액을 혼합하는 단계를 더 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 ?칭 용액은 200mM 내지 3000mM, 200mM 내지 2000mM, 200mM 내지 1000mM, 500mM 내지 1000mM, 550mM 내지 1000mM, 또는 600mM 내지 1000mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 ?칭 용액은 700mM 내지 1000mM의 이온 강도를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ?칭 용액은 EPPS를 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  62. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ?칭 용액은 EPPS 및 히스티딘 염산염을 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  63. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물과 상기 세포 결합제의 상기 반응 후에 고농도 완충제를 포함하는 ?칭 용액을 혼합하는 단계를 더 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 ?칭 용액 중 상기 완충제의 농도가 200mM 내지 3000mM, 200nM 내지 2000mM, 200mM 내지 1000mM, 500mM 내지 1000mM, 550mM 내지 1000mM, 또는 600mM 내지 1000mM인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 혼합 후에, 상기 완충제의 최종 농도가 150mM 내지 750mM, 150mM 내지 600mM, 200mM 내지 500nM, 200mM 내지 400nM, 또는 250mM 내지 350mM인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  66. 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ?칭 용액은 5 내지 9의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 ?칭 용액은 5 내지 7의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 ?칭 용액은 5 내지 6의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  69. 제66항에 있어서, 상기 ?칭 용액은 5.5의 pH를 갖는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 ?칭 용액은 750mM의 EPPS 및 150mM의 히스티딘 염산염을 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  71. 제58항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ?칭 완충제의 첨가는 고분자량 종의 양을 저감시키는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00054

    식 중,
    L은 하기 화학식으로 표시되되:
    -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)E (A1); 또는
    -NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1 (A3);
    식 중,
    R5는 -H 또는 (C1-C3)알킬이고;
    P는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 함유하는 아미노산 잔기 또는 펩타이드이며;
    Ra 및 Rb는, 각 경우에, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환기 또는 이온성 기 Q이고;
    m은 1 내지 6의 정수이며; 그리고
    Zs1은 하기 화학식 중 어느 하나로부터 선택된다:
    Figure pct00055

    식 중,
    q는 1 내지 5의 정수이고;
    M은 -H 또는 양이온이며; 그리고
    -C(=O)E는 반응성 에스터기를 나타낸다.
  73. 제72항에 있어서, Ra 및 Rb는 둘 다 H이고; 그리고 R5는 H 또는 Me인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  75. 제74항에 있어서, P는 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  76. 제75항에 있어서, P는 종양 조직에서 발현된 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  77. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-나이트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (서열번호 21), b-Ala-Leu-Ala-Leu (서열번호 22), Gly-Phe-Leu-Gly (서열번호 23), Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 및 Met-Ala로부터 선택되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  78. 제77항에 있어서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 또는 D-Ala-D-Ala인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  79. 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, Q는 -SO3M인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  80. 제72항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 화학식 중 하나로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00056
    .
  81. 제72항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00057
    .
  82. 제72항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응성 에스터기는 N-하이드록시숙신이미드 에스터, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터, 나이트로페닐(예컨대, 2 또는 4-나이트로페닐) 에스터, 다이나이트로페닐(예컨대, 2,4-다이나이트로페닐) 에스터, 설포-테트라플루오로페닐(예컨대, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 에스터, 및 펜타플루오로페닐 에스터로부터 선택되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 반응성 에스터기는 하기 화학식으로 표시되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00058

    식 중, U는 H 또는 -SO3M이다.
  84. 제82항에 있어서, 상기 반응성 에스터기는 하기 화학식으로 표시되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00059
    .
  85. 제72항에 있어서, 상기 세포독성제는 하기 구조식으로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00060
    .
  86. 제72항에 있어서, 상기 세포독성제는 하기 구조식으로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00061
    .
  87. 제72항 내지 제79항 및 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 상기 구조식 (II)의 화합물을 설폰화 시약과 반응시킴으로써 제조된 구조식 (I)로 표시되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  88. 제80항 및 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설폰화 시약과 반응시킴으로써 제조되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00062
    .
  89. 제85항에 있어서, 상기 세포독성제는 하기 화학식 중 하나로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설폰화 시약과 반응시킴으로써 제조되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00063
    .
  90. 제72항 내지 제79항 및 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 구조식 (II)로 표시되고, 그리고 상기 방법은 상기 세포 결합제-세포독성제 접합체를 설폰화 시약과 반응시키는 단계를 더 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  91. 제72항 내지 제79항 및 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 구조식 (II)로 표시되고, 그리고 상기 방법은 상기 세포 결합제를 상기 구조식 (II)로 표시되는 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물과 설폰화 시약의 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  92. 제81항 내지 제84항 및 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포 결합제-세포독성제 접합체를 설폰화 시약과 반응시키는 단계를 더 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  93. 제81항 내지 제84항 및 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포 결합제를 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물과 설폰화 시약의 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  94. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식으로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00064

    식 중,
    Rx1 및 Rx2는 독립적으로 (C1-C6)알킬이고;
    Re1은 -H 또는 (C1-C6)알킬이며;
    Re2는 -(CH2-CH2-O)n-Rk이고;
    n은 2 내지 6의 정수이며;
    Rk는 -H 또는 -Me이고;
    Zs1은 하기 화학식 중 어느 하나로부터 선택된다:
    Figure pct00065

    식 중,
    q는 1 내지 5의 정수이고;
    M은 -H 또는 양이온이며; 그리고
    -C(=O)E는 반응성 에스터기이다.
  95. 제94항에 있어서, Re1는 H 또는 Me이고; Rx1 및 Rx2는 독립적으로 -(CH2)p-(CRfRg)-이되, Rf 및 Rg는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C4)알킬이고; 그리고 p는 0, 1, 2 또는 3인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  96. 제95항에 있어서, Rf 및 Rg는 동일 또는 상이하고 -H 및 -Me로부터 선택되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  97. 제94항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 화학식 중 하나로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00066
    .
  98. 제94항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 화학식 중 하나로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00067

    Figure pct00068
    .
  99. 제94항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응성 에스터기는 N-하이드록시숙신이미드 에스터, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터, 나이트로페닐(예컨대, 2 또는 4-나이트로페닐) 에스터, 다이나이트로페닐(예컨대, 2,4-다이나이트로페닐) 에스터, 설포-테트라플루오로페닐(예컨대, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 에스터, 및 펜타플루오로페닐 에스터로부터 선택되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 반응성 에스터기는 하기 화학식으로 표시되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00069

    식 중, U는 H 또는 -SO3M이다.
  101. 제100항에 있어서, 상기 반응성 에스터기는 하기 화학식으로 표시되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00070
    .
  102. 제94항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00071
    .
  103. 제94항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나로 표시되거나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00072

    Figure pct00073
    .
  104. 제94항 내지 제96항 및 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 상기 구조식 (IV)의 화합물을 설폰화 시약과 반응시킴으로써 제조된 구조식 (III)으로 표시되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  105. 제94항 내지 제96항 및 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 상기 구조식 (VI)의 화합물을 설폰화 시약과 반응시킴으로써 제조된 구조식 (V)로 표시되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  106. 제97항 및 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설폰화 시약과 반응시킴으로써 제조되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00074

    Figure pct00075
    .
  107. 제97항 및 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나로 표시되는 세포독성제 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    Figure pct00076

    중 하나로 표시되는 세포독성제 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 하기 구조식:
    Figure pct00077

    중 하나로 표시되는 링커 화합물과 반응시킴으로써 제조되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  108. 제102항에 있어서, 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식 중 하나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 설폰화 시약과 반응시킴으로써 제조되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법:
    Figure pct00078
    .
  109. 제102항에 있어서, 상기 세포독성제-링커 화합물은 하기 구조식:
    Figure pct00079

    으로 표시되는 세포독성제 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을, 하기 구조식:
    Figure pct00080

    의 링커 화합물과 반응시킴으로써 제조되는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  110. 제94항 내지 제96항 및 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 상기 세포독성제-링커 화합물은 구조식 (IV) 또는 (VI)으로 표시되고, 그리고 상기 방법은 상기 세포 결합제-세포독성제 접합체를 설폰화 시약과 반응시키는 단계를 더 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  111. 제94항 내지 제96항 및 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물은 구조식 (IV) 또는 (VI)으로 표시되고, 그리고 상기 방법은 구조식 (IV) 또는 (VI)으로 표시되는 화합물을 설폰화 시약의 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  112. 제98항 내지 제101항 및 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포 결합제-세포독성제 접합체를 설폰화 시약과 반응시키는 단계를 더 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  113. 제98항 내지 제101항 및 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포 결합제를 상기 세포독성제 또는 세포독성제-링커 화합물과 설폰화 시약의 존재 하에 반응시키는 단계를 포함하는, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  114. 제87항 내지 제93항 및 제104항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설폰화 시약은 NaHSO3인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  115. 제72항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, M은 -H, Na+ 또는 K+인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  116. 제115항에 있어서, M은 Na+인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  117. 제1항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 결합제는 항체인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 항체는 인간화 단클론성 항체인, 세포 결합제-세포독성제 접합체의 제조 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170088905A (ko) * 2014-11-19 2017-08-02 이뮤노젠 아이엔씨 세포 결합 작용제-세포독성 작용제 접합체를 제조하기 위한 공정
KR102617264B1 (ko) 2016-10-19 2023-12-29 인벤라 인코포레이티드 항체 구조물
EA201991204A1 (ru) 2016-12-22 2019-12-30 Университа Дельи Студи Манья Греча Катандзаро Моноклональное антитело против уникального сиалогликозилированного опухолеассоциированного эпитопа cd43
JP2021527047A (ja) 2018-06-05 2021-10-11 キングス・カレッジ・ロンドン 消化管系へのペイロード送達のための、ｂｔｎｌ３／８を標的とする構築物
KR20210061995A (ko) * 2018-06-26 2021-05-28 이뮤노젠 아이엔씨 Adam9를 표적으로 하는 면역콘쥬게이트 및 이를 이용하는 방법들

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
IL111748A0 (en) 1993-12-03 1995-01-24 Zeneca Ltd Proteins
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5958872A (en) 1996-04-01 1999-09-28 Apoptosis Technology, Inc. Active survival domains of IGF-IR and methods of use
EP1005569A2 (en) 1997-08-01 2000-06-07 MorphoSys AG Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
TW593241B (en) 1999-04-20 2004-06-21 Hoffmann La Roche Carbamic acid derivatives
US20020197266A1 (en) 2000-02-08 2002-12-26 Waldemar Debinski Immunotherapy using interleukin 13 receptor subunit alpha 2
US6596503B1 (en) 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
PT1399483E (pt) 2001-01-05 2010-07-20 Pfizer Anticorpos contra o receptor do factor i de crescimento tipo insulina
HUE026914T2 (en) 2002-11-07 2016-08-29 Immunogen Inc Anti-CD33 antibodies and a method of treating acute myeloid leukemia
CN104059147A (zh) 2003-06-27 2014-09-24 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
US20060045877A1 (en) 2004-08-30 2006-03-02 Goldmakher Viktor S Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
EP1817341A2 (en) 2004-11-29 2007-08-15 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
PT1819359E (pt) 2004-12-09 2015-05-28 Janssen Biotech Inc Imunoconjugados anti-integrina, métodos para a sua produção e sua utilização
AU2006220709B2 (en) 2005-03-04 2012-09-06 Biogen Ma Inc. Methods of humanizing immunoglobulin variable regions through rational modification of complementarity determining residues
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CN102481341B (zh) 2009-02-23 2017-05-17 希托马克斯医疗有限公司 蛋白原及其使用方法
UY32560A (es) 2009-04-29 2010-11-30 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
AR078470A1 (es) 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis Anticuerpos que se unen especificamente al receptor epha2
AR078471A1 (es) 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis COMPUESTOS MAITANSINOIDES Y EL USO DE ESTOS PARA PREPARAR CONJUGADOS CON UN ANTICUERPO LOS CUALES SE UTILIZAN COMO AGENTES ANTICANCERIGENOS Y EL PROCEDIMIENTO DE PREPARACIoN DE ESTOS CONJUGADOS
KR101580713B1 (ko) 2010-02-24 2015-12-29 이뮤노젠 아이엔씨 엽산염 수용체 1 항체와 면역접합체 및 이들의 용도
CN102971012B (zh) 2010-03-12 2016-05-04 伊缪诺金公司 Cd37结合分子及其免疫缀合物
WO2012019024A2 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
BR112013010853A2 (pt) 2010-11-03 2016-08-16 Immunogen Inc "agentes citotóxicos compreendendo derivados de ansamitocina, composição farmacêutica e uso destes"
EP2663571B1 (en) 2011-01-10 2015-08-12 Scintomics GmbH Triazacyclononane-based phosphinate ligand and its use for molecular imaging
EP3666289A1 (en) * 2011-02-15 2020-06-17 ImmunoGen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
KR20220009505A (ko) * 2011-03-29 2022-01-24 이뮤노젠 아이엔씨 일-단계 방법에 의한 메이탄시노이드 항체 접합체의 제조
JP6209159B2 (ja) * 2011-06-21 2017-10-04 イミュノジェン・インコーポレーテッド ペプチドリンカーを有する新規メイタンシノイド誘導体およびその結合体
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates

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