ES2214494T3 - Estructuras de fijacion dirigidas contra el antigeno ca55.1. - Google Patents

Abstract

LOS ANTICUERPOS QUE RECONOCEN UN ANTIGENO ASOCIADO A TUMOR DESIGNADO COMO CA55.1 TAL COMO HIBRIDOMA 55.1 REGISTRADO CON EL NUMERO DE REGISTRO DE ECACC DE 93081901 EN EL QUE LAS REGIONES DETERMINANTES COMPLEMENTARIAS TIENES LAS SIGUIENTES SECUENCIAS: A) CADENA PESADA: CDR1: G Y W I H (SEQ ID NO: 27);; CDR2, E V N P S T G R S D Y N E K F K N (SEQ ID NO: 28); CDR (POR) : E R A Y G Y D D A M D Y (SEQ ID NO: 29); B) CADENA LIGERA: CDR1: K S S Q S L L N S T R T K N Y L A (SEQ ID NO: 30); CDR2: W A S T R T S (SEQ ID NO: 31); CDR3: K Q SYTLRT (SEQ ID NO: 32); O UNO DE SUS ANALOGOS CONSERVANTES. EL PEPTIDO ACERHRGSGWC (SEQ ID NO: 26), QUE APARECE SOBRE LA SUPERFICIE DE BACTERIOFAGO NCIMB NUMERO 40638, ES UNA REPLICA DEL ANTIGENO ASOCIADO A TUMOR CA55.1.

Description

Estructuras de fijación dirigidas contra el antígeno CA55.1

La presente invención se refiere a un nuevo antígeno asociado con tumores (CA55.1) útil para el diagnóstico y la terapia del cáncer.

Está establecido que la transformación de células de tejidos normales en células tumorales está asociada con un cambio en la estructura de carbohidratos en la superficie celular. Muchas de tales estructuras de carbohidratos de la superficie celular sirven como antígenos y las estructuras tumorales modificadas representan un tipo del denominado antígeno asociado a los tumores (véase Altered Glycosylation in Tumour Cells, compiladores Reading, Hakamori y Marcus 1988, Arthur R. Liss publ.). Tales antígenos pueden aprovecharse por ejemplo por la generación de anticuerpos monoespecíficos utilizando tecnología de hibridoma. La tecnología de hibridoma para el aislamiento y la producción de anticuerpos monoclonales está actualmente bien establecida y fue descrita por primera vez por Kohler y Milstein (Nature, 256, 495-497, 1975).

Los antígenos asociados a tumores han sido consignados en relación con enfermedades tumorales humanas; por ejemplo, han sido demostrados CEA (antígeno del carcinoma embrionario, Gold y Freedman, J. Exp. Med., 121, 439, 1965), GICA (antígeno del cáncer gastrointestinal) que lleva el epítope CA19.9, y el epítope C242.2 en CA50 (Larson et al, Int. J. Cancer, 42, 877-882, 1988), particularmente en carcinomas gastrointestinales. Todos estos antígenos están presentes en la superficie de las células tumorales y pueden demostrarse también en el suero sanguíneo.

El concepto de la utilización de tales anticuerpos para direccionamiento a antígenos asociados con tumores en el tratamiento del cáncer ha sido apreciado desde hace más de diez años (Herlyn et al. (1980) Cancer Research 40, 717). Pueden utilizarse anticuerpos para direccionar diversos agentes químicos y biológicos al tumor, y tales conjugados han sido particularmente satisfactorios en la formación de la base para muchos métodos de diagnóstico tanto in vitro como in vivo. El uso de inmunoconjugados en la terapia del cáncer es también prometedor (Lord et al. (1985) Trends in Biotechnology 3, 175; Vitetta et al (1987) Science 238, 1098). Este enfoque es técnicamente más exigente que las aplicaciones de diagnóstico, y requiere que los antígenos asociados al tumor que son direccionados en tales enfoques inmunoterapéuticos, sean altamente específicos para el tumor y no se expresen a niveles significativos en los tejidos humanos vitales. Al mismo tiempo que la propiedad de tener una distribución específica en el tejido asociado al tumor, el destino metabólico del antígeno en la célula tumoral propiamente dicha es también una propiedad importante. Se ha encontrado que la potencia de diversos conjugados de anticuerpos monoclonales y sus derivados depende de las tasas de internalización del antígeno asociado al tumor desde la superficie de la membrana de la célula. En particular, ciertos conjugados, a saber las inmunotoxinas, requieren una internalización rápida y continua de la molécula de antígeno desde la superficie de la célula tumoral para ser farmacéuticamente eficaces. Para usos afines de conjugados de inmunotoxinas o fármacos, es deseable una tasa de integración o endocitosis alta, pero para otros usos, tales como la terapia con profármacos enzimáticos o radioterapia dirigida a anticuerpos no es una característica esencial.

Para ser útil en el tratamiento del cáncer, se cree que un antígeno específico de un tumor tiene, por regla general, que: 1) expresarse en niveles significativos en la superficie de la mayoría de las células tumorales (generalmente > 10.000 moléculas por célula) y; 2) expresarse a niveles bajos o ser indetectable en los tejidos vitales normales.

Existe necesidad de antígenos nuevos y mejorados específicos de tumores útiles en el diagnóstico y la terapia del cáncer.

La presente invención está basada en el descubrimiento del antígeno asociado a tumores designado CA55.1 (como se define en esta memoria). El antígeno exhibe varias propiedades que hacen del mismo una diana superior para inmunoterapia o diagnóstico de ciertos cánceres que los antígenos específicos de tumores conocidos. El mismo se expresa en una mayoría de tumores colorrectales, y es expresado sólo débilmente o está ausente en el tejido normal del colon. Adicionalmente, después de la fijación del anticuerpo al CA55.1 fijado a las células, el complejo así formado sufre endocitosis o se internaliza en las células tumorales a una tasa elevada.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una estructura de fijación de antígeno que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que reconocen el antígeno CA55.1, en la cual el antígeno posee:

a) tres especies dominantes que tienen pesos moleculares por SDS-PAGE comprendidos en los intervalos de aproximadamente 48 a aproximadamente 52 kD, aproximadamente 58 kD a 72 kD y aproximadamente 88 kD a 92 kD;

b) una localización subcelular en la fracción de membrana de las células tumorales COLO 205 (ATCC no. CCL 222);

c) una estructura compleja de carbohidratos enlazados a N;

y en la cual la estructura de fijación del antígeno tiene al menos una de las propiedades siguientes:

\newpage

i) la estructura de fijación de antígeno inhibe competitivamente la fijación del anticuerpo monoclonal 55.1 (ECACC no. 93081901) al antígeno CA55.1 o;

ii) el péptido ACEHRGSGWC (SEQ ID NO: 26), tal como se presenta en la superficie del bacteriófago NCIMB No. 40638, se fija a la estructura de fijación de antígeno con una fijación eficaz de 10 pM o menos cuando se incuba con la estructura de fijación de antígeno recubierta en fase sólida o;

iii) el péptido ACEHRGSGWC (SEQ ID NO: 26), tal como se presenta en la superficie del bacteriófago NCIMB No. 40638, a una concentración eficaz de 200 nM o menos, cuando se preincuba con la estructura de fijación de antígeno, inhibe competitivamente la fijación de la estructura de fijación de antígeno a las células Colo 205 recubiertas en fase sólida (ATCC no. CCL 222).

Estudios de fijación de lectinas en el antígeno CA55.1 purificado demuestran que el carbohidrato CA55.1 es un oligosacárido enlazado a N del tipo complejo sin residuos de ácido siálico enlazados \alpha(2-6) o \alpha(2-3) a galactosa. Un ensayo para reconocimiento de CA55.1 (por inhibición competitiva de la fijación del anticuerpo 55.1) se expone más adelante en el Ejemplo 7 de esta memoria. Ensayos para medida de la fijación en presencia del fago ACEHRGSGWC (SEQ ID NO: 26) se exponen en el Ejemplo 14. Una localización subcelular en la fracción de membrana significa que el antígeno está presente en una fracción de membrana producida a partir de células enteras por un método tal como el descrito en el Ejemplo 7.1a.

En la búsqueda de nuevos antagonistas de la fijación de MAb 55.1 a su antígeno, se generaron genotecas de secuencias peptídicas aleatorias de presentación del bacteriófago M13 en el término N de la proteína pIII menor de recubrimiento del fago, y se escrutaron contra MAb 55.1 inmovilizado sobre poliestireno. Como resultado de tal escrutinio, se encontró que un fago que tiene la secuencia ACEHRGSGWC (código de aminoácidos de una sola letra; (SEQ ID NO: 26)) en el término N de pIII inhibe la fijación de MAb 55.1 a su antígeno en las células Colo 205.

Existen ya ejemplos en la bibliografía de miméticos peptídicos que se seleccionan a partir de genotecas de presentación de péptidos de fago escrutadas contra proteínas de fijación de carbohidratos, que incluyen ligandos peptídicos para la proteína de fijación de manosa concanavalina A (con A) (Scott et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pp. 5398-5402, 1992; y asimismo Oldenburg et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pp. 5393-5397, 1992), y un MAb anti-carbohidratos (Hoess et al, Gene, vol. 128, pp. 43-49, 1993). Los resultados independientes de los dos grupos que estudiaron con A mostraron un fuerte consenso en las secuencias peptídicas seleccionadas, con inclusión del motivo repetido YPY; el escrutinio contra el MAb dio como resultado la selección de un motivo PWLY repetido. Ha habido cierta especulación en el sentido de que las cadenas laterales aromáticas seleccionadas por ambas proteínas de fijación de carbohidratos están apiladas unas contra otras en una configuración estereoquímica similar a anillos de azúcar. En contraste, la estructura seleccionada por MAb 55.1 carece de las propiedades hidrófobas y conformacionales de los ligandos arriba descritos, se seleccionó a partir de una genoteca de péptidos nominalmente cíclicos, y no se observó selección alguna en el escrutinio de MAb 55.1 contra genotecas peptídicas lineales generadas en el laboratorio de los autores (los otros grupos seleccionaron ligantes a partir de genotecas de péptidos lineales). Una investigación de la secuencia de ACEHRGSGWC en bases de datos de secuencias proteínicas no ha conseguido demostrar homología con ningún péptido conocido, por lo que la secuencia fijada por MAb 55.1 es nueva.

Una estructura de fijación de antígeno es generalmente un anticuerpo (o fragmento del mismo o constructo de anticuerpos modificado tal como scFv) y se define como cualquier secuencia de proteína que reconocerá y fijará el antígeno CA55.1. Preferiblemente, la afinidad de fijación para el antígeno CA55.1 es al menos 10E-5M, más preferiblemente la afinidad de fijación para el antígeno CA55.1 es al menos 10E-6M, más preferiblemente la afinidad de fijación para el antígeno CA55.1 es al menos 10E-7M, más preferiblemente la afinidad de fijación para el antígeno CA55.1 es al menos 10E-8M, más preferiblemente la afinidad de fijación para el antígeno CA55.1 es al menos 10E-9M, más preferiblemente la afinidad de fijación para el antígeno CA55.1 es al menos 10E-10M, y especialmente la afinidad de fijación para el antígeno CA55.1 es al menos 10E-11M. La secuencia proteínica de la estructura de fijación del antígeno se deriva normalmente de una inmunoglobulina o un dominio de inmunoglobulina de la superfamilia de las inmunoglobulinas y puede ser o bien la molécula natural completa, un fragmento de la misma o una especie transformada por ingeniería genética que retiene únicamente aquellas características estructurales del repliegue (sic) de inmunoglobulinas que permiten la fijación productiva al antígeno. Preferentemente, la estructura de fijación de antígeno está basada en las CDRs del anticuerpo 55.1. Las CDRs o regiones determinantes de la complementariedad son aquellas secuencias dentro de los bucles hipervariables de los dominios variables de anticuerpo que se supone son críticos en la determinación de la especificidad de la interacción antígeno-anticuerpo (Kabat et al, (1987) en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept Health and Human Services, Washington DC); sin embargo, el término CDRs, como se define en esta memoria, incluye residuos de entramado donde éstos contribuyen a la fijación. Para el anticuerpo 55.1, las CDRs se determinaron por homología con las secuencias hipervariables de otros anticuerpos murinos.

Las CDRs de la Cadena Pesada son:

1

Las CDRs de la Cadena Ligera son:

2

De acuerdo un aspecto de la presente invención, se proporciona una estructura de fijación de antígeno que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que reconocen el antígeno CA55.1, en las cuales las CDRs tienen las secuencias siguientes:

a) cadena pesada

3

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b) cadena ligera

4

o un análogo conservador de las mismas.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una estructura de fijación de antígeno que tiene la estructura siguiente, opcionalmente humanizada:

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una secuencia de cadena pesada (SEQ ID NO: 33):

5

y;

\newpage

una secuencia de cadena ligera (SEQ ID NO: 34):

6

o uno cualquiera de los constructos siguientes de la misma:

F(ab')2; F(ab'), Fab, Fv, Fv & V-min monocatenario o;

un análogo conservador de la misma.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo que se hibrida en condiciones rigurosas a una secuencia polinucleotídica que codifica CDR3 de la cadena pesada o ligera del anticuerpo 55.1 (ECACC, no. de depósito 93081901).

Preferiblemente, el polinucleótido codifica dos (especialmente tres) CDRs de la cadena pesada o ligera del anticuerpo 55.1. un ensayo de hibridación se expone más adelante en esta memoria en el Ejemplo 10.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica al menos la región variable de la cadena pesada o una cadena ligera de una estructura de fijación de antígeno como se define anteriormente en esta memoria.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una estructura de fijación de antígeno que tiene una secuencia codificada por una secuencia polinucleotídica como se define anteriormente en esta memoria.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una estructura de fijación de antígeno que tiene al menos una CDR3 del anticuerpo 55.1 (depósito ECACC no. 93081901) o un análogo conservador del mismo. Preferiblemente, la estructura de fijación de antígeno tiene al menos 3 CDRs (más preferiblemente 4 CDRs, más preferiblemente 5 CDRs y especialmente 6 CDRs) del anticuerpo 55.1 o análogos conservadores del mismo.

Un análogo conservador es una secuencia proteínica que retiene las propiedades de fijación de la estructura de fijación de antígeno, pero difiere en secuencia por una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras. Para los propósitos de este documento, una sustitución de aminoácidos conservadora es una sustitución cuya probabilidad de existir en la naturaleza es mayor que diez veces la probabilidad de que dicha sustitución ocurra por azar (tal como se define por los métodos computacionales descritos por Dayhoff et al, Atlas of Protein Sequence and Structure, 1971, páginas 95-96 y Figura 9-10).

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo que tiene una estructura de fijación de antígeno como se describe anteriormente en esta memoria.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se describe anteriormente en esta memoria, caracterizado porque está humanizado.

Un anticuerpo, fragmento relacionado o estructura de fijación de anticuerpo humanizado es un polipéptido compuesto en gran parte de un entramado estructural de secuencias de inmunoglobulinas derivadas humanas que soportan secuencias de aminoácidos derivados no humanos en y alrededor del sitio de fijación de antígeno (regiones determinantes de la complementariedad o CDRs). La metodología apropiada ha sido descrita por ejemplo en detalle en el documento WO 91/09967, EP 0328404, y Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 10029, Mountain y Adair (1989) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 10, 1 (1992), aunque se contemplan también métodos de humanización alternativos, tales como el chapeado con anticuerpo de residuos de superficie (EP 519596, Merck/NIH, Padlan et al). La preparación de fragmentos de anticuerpo quiméricos humanizados del anticuerpo 55.1 se describe en el Ejemplo 3 de esta memoria.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una célula hospedadora transformada con una secuencia polinucleotídica o de un animal no humano transgénico o planta transgénica desarrollado(a) a partir de la célula hospedadora en la cual la secuencia polinucleotídica codifica al menos la región variable de la cadena pesada o la cadena ligera de una estructura de fijación de antígeno como se define anteriormente en esta memoria.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el hibridoma 55.1 depositado como ECACC, depósito no. 93081901.

El hibridoma 55.1 se depositó en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido, el 19 de agosto de 1993 bajo el no. de referencia de depósito 93081901 de acuerdo con el Tratado de Budapest.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el fago ACEHRGSGWC depositado como NCIMB No. 40638.

El fago ACEHRGSGWC se depositó en The National Collections of Industrial and Marine Bacteria, 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Escocia, Reino Unido, el 10 de mayo de 1994 bajo el número de referencia de depósito NCIMB 40638 de acuerdo con el Tratado de Budapest.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de producción de al menos una región variable de una cadena pesada o ligera de una estructura de fijación de antígeno como se define anteriormente en esta memoria que comprende:

a) transformar una célula hospedadora con una secuencia polinucleotídica que codifica al menos la región variable de la cadena pesada o ligera de la estructura de fijación de antígeno y, opcionalmente, desarrollar la célula hospedadora transformada en una planta transgénica;

b) someter la célula hospedadora o la planta transgénica a condiciones conducentes a la expresión, y opcionalmente la secreción, de al menos la región variable, y opcionalmente;

c) purificar al menos parcialmente la región variable.

Preferiblemente, ambas regiones variables de la cadena pesada y ligera se expresan en la misma célula y se ensamblan de este modo para formar una estructura de fijación de antígeno.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de producción del anticuerpo monoclonal 55.1 que comprende:

a) cultivar el hibridoma 55.1 depositado como depósito ECACC no. 93081901 en un medio en condiciones conducentes a la expresión de un anticuerpo a partir del mismo y;

b) obtener el anticuerpo 55.1 a partir del medio de cultivo y opcionalmente;

c) preparar un fragmento F(ab')2 del anticuerpo 55.1 por digestión enzimática.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una conjugado que comprende un resto efector (preferiblemente una toxina, pero también una enzima o un ligando radiactivo) y una estructura de fijación de antígeno o anticuerpo como se describe anteriormente en esta memoria.

Se apreciará que el conjugado de la presente invención no está constituido necesariamente por una molécula efectora y una molécula anticuerpo. Por ejemplo, el conjugado puede comprender más de una molécula efectora por molécula de anticuerpo.

Cuando la molécula efectora es una toxina, este resto de toxina comprende generalmente un componente que posee propiedades citotóxicas y por consiguiente es capaz de matar las células subsiguientemente a su internalización.

El resto de toxina y el resto de fijación de antígeno pueden acoplarse directamente uno a otro, o los mismos se pueden acoplar indirectamente. El resto de toxina y la estructura de fijación de antígeno se acoplan, en general, de tal manera que la geometría del conjugado permite que la estructura de fijación de antígeno se fije a su célula diana. Ventajosamente, el resto de toxina y la estructura de fijación de antígeno están acoplados de tal modo que el conjugado es extracelularmente estable, e intracelularmente inestable de modo que el resto de toxina y la estructura de fijación de antígeno permanecen acoplados fuera de la célula diana, pero después de la internalización, se libera el resto de toxina. Así pues, ventajosamente, el conjugado tiene un sitio intracelularmente escindible/extracelularmente estable.

Ejemplos de conjugados en los cuales el resto de toxina está acoplado directamente al resto de fijación de la célula diana, incluyen aquéllos en los cuales el resto de toxina y la estructura de fijación de antígeno están acoplados por un puente disulfuro formado entre un grupo tiol en el resto de toxina y un grupo tiol en la estructura de fijación de antígeno. Detalles de la preparación y propiedades de inmunotoxinas y otros conjugados se dan en la Solicitud de Patente Europea EP 528527 (no. de publicación) cuyo contenido se incorpora en esta memoria por referencia a ella.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una inmunotoxina como se describe anteriormente en esta memoria.

Se apreciará que la dosis y el régimen de dosificación dependerán del resto de toxina particular empleado, la población de la célula diana y la historia del paciente. La dosis del conjugado administrada estará comprendida típicamente en el intervalo de 0,1 a 1 mg/kg de peso del paciente.

Los conjugados de la presente invención se administrarán normalmente en la forma de una composición farmacéutica. Así, de acuerdo con la presente invención, se proporcionará también una composición farmacéutica que comprende un conjugado (como se define en esta memoria) en asociación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Un ejemplo de una formulación de este tipo se da en esta memoria en el Ejemplo 9.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse en una diversidad de formas de dosificación. Generalmente, los conjugados de la presente invención se administrarán por vía parenteral, preferiblemente por vía intravenosa. Una composición farmacéutica parenteral particular es una que se formula en una forma unitaria de dosificación que es adecuada para administración por inyección. Así, composiciones particularmente adecuadas comprenden una solución, emulsión o suspensión de la inmunotoxina en asociación con un vehículo o diluyente parenteral farmacéuticamente aceptable. Vehículos o diluyentes adecuados incluyen vehículos acuosos, por ejemplo agua o solución salina, y vehículos no acuosos, por ejemplo aceites fijos o liposomas. Las composiciones pueden incluir agentes que mejoran la estabilidad del conjugado en la composición. Por ejemplo, la composición puede incluir un tampón, por ejemplo Tween. La concentración del conjugado variará, pero en general, el conjugado se formulará a concentraciones de aproximadamente 1 a 10 mg/dosis.

El anticuerpo 55.1 es selectivo para células tumorales pancreáticas y colorrectales, y se ha encontrado que conjugados que incorporan este anticuerpo son inmunotoxinas potentes que son selectivas para las células de tumor colorrectal.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión que codifica una estructura de fijación de antígeno como se define anteriormente en esta memoria.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de expresión que codifica al menos la región variable de una cadena pesada o ligera de una estructura de fijación de antígeno como se define anteriormente en esta memoria.

Células de mamífero (CHO, COS, mieloma) han sido utilizadas como hospedadores para la co-expresión de los cDNAs de las cadenas H y L del anticuerpo y fragmentos de los mismos para producir proteína con la actividad de fijación especificada (Bebbington, C., 1991, Methods, vol. 2, p. 136-145, y Adair J., 1992, Immunological Reviews, vol. 130). Los cDNAs pueden introducirse en plásmidos y pueden dejarse integrar en el DNA cromosómico. Los plásmidos requieren un marcador seleccionable para mantenimiento en hospedadores transfectados, un promotor eucariota eficiente para permitir un nivel alto de transcripción a partir de los cDNAs, sitios de enzimas de restricción convenientes para clonación y poliadenidación, y señales de terminación de la transcripción para la estabilidad de los mensajes. Varios vectores de este tipo han sido descritos en la bibliografía (Bebbington, C. et al, 1992, Bio/Technology, vol. 10, p. 169-175, y Wright, A. 1991, Methods, vol. 2, p. 125-135) y existen vectores disponibles comercialmente, tales como pRc/CHV (Invitrogen Corp., véase Figura 8), que satisfacen los criterios necesarios.

La expresión de una gama de fragmentos de anticuerpo en E. coli está bien documentada (revisado por Pluckthun A. Immunological Reviews, 1992, vol. 130, p. 151-188 y Skerra, Current Opinion in Immunology, 1993, vol. 5, p. 256-262). Ha sido descrita la expresión intracelular de cadenas Fd y L (Cabilly, S., 1989, Gene, vol. 85, p. 553-557) pero esto puede requerir el replegamiento y la re-asociación in vitro de las cadenas (Buchner, J y Rudolph, R., 1991, Bio/Technology, vol. 9, p. 157-162) para producir actividad de fijación. Una vía más eficiente para obtener fragmentos activos de anticuerpos es por secreción periplásmica (Better, M. et al, 1988, Science, vol. 240, p. 1041-1043). Los componentes de las cadenas H y L del fragmento de anticuerpo se co-expresan a partir de un solo plásmido. Cada cadena de anticuerpo está provista de un péptido conductor bacteriano que la dirige al periplasma de E. coli, en el cual el conductor se escinde y las cadenas libres se asocian para producir fragmentos de anticuerpo solubles y activos. Se cree que este proceso mimetiza el proceso natural en las células eucariotas, en el cual las cadenas de anticuerpos expresadas pasan al lumen del ER antes de la asociación en anticuerpos enteros. Este proceso da a menudo como resultado la presencia de actividad de fijación en el sobrenadante de cultivo.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedadora transformada con un vector como se describe anteriormente en esta memoria que es compatible con la expresión en ella.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una célula hospedadora transformada con una secuencia polinucleotídica como se define anteriormente en esta memoria.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de producción de al menos una región variable de una cadena pesada o ligera de una estructura de fijación de antígeno como se define anteriormente en esta memoria, que comprende:

a) transformar una célula hospedadora con una secuencia polinucleotídica que codifica al menos la región variable;

b) someter la célula hospedadora a condiciones conducentes a la expresión, y opcionalmente la secreción, de al menos la región variable, y opcionalmente;

c) purificar al menos parcialmente la región variable.

Preferiblemente, ambas regiones variables de la cadena pesada y ligera se expresan en la misma célula hospedadora y se ensamblan de este modo para formar una estructura de fijación de antígeno.

Algunos sistemas de expresión implican transformar una célula hospedadora con un vector; sistemas de este tipo son bien conocidos, tal como por ejemplo en E. coli, levadura y hospedadores mamíferos (véase Methods in Enzymology 185, Academic Press 1990). Se contemplan también otros sistemas de expresión, tales como por ejemplo mamíferos no humanos transgénicos en los cuales el gen de interés, cortado preferiblemente de un vector y preferiblemente en asociación con un promotor de mamífero para direccionar la proteína expresada a la leche del animal, se introduce en el pronúcleo de un cigoto de mamífero (usualmente por microinyección en uno de los dos núcleos (usualmente el núcleo masculino) existentes en el pronúcleo) y después de ello se implanta en una madre de acogida. Una proporción de los animales producidos por la madre de acogida llevará y expresará el gen introducido que se ha integrado en un cromosoma. Usualmente, el gen integrado se pasa a la progenie por reproducción convencional, permitiendo así la expansión fácil del stock. Preferiblemente, la proteína de interés se recoge simplemente de la leche de los animales transgénicos hembra. Se remite al lector a las publicaciones siguientes: Simons et al. (1988), Bio/Technology 6: 179-183, Wright et al. (1991) Bio/Technology 9: 830-834; US 4.873.191 y US 5.322.775. La manipulación de embriones de ratón se describe en Hogan et al, "Manipulating the Mouse Embryo; a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory 1986.

Se contempla también la tecnología de plantas transgénicas, por ejemplo, tal como se describe en las publicaciones siguientes: Swain W.F. (1991) TIBTECH 9: 107-109; Ma J.K.C. et al (1994) Eur. J. Immunology 24: 131-138, Hiatt A. et al (1992) FEBS Letters 307: 71-75; Hein M.B. et al (1991) Biotechnology Progress 7: 455-461; Duering K. (1990) Plant Molecular Biology 15: 281-294.

Si se desea, los genes hospedadores pueden desactivarse o modificarse utilizando procedimientos estándar como se esquematizan resumidamente más adelante y como se describe por ejemplo en "Gene Targeting; A Practical Approach", IRL Press 1993. El gen diana o porción del mismo se somete preferiblemente a clonación en un vector con un marcador de selección (tal como Neo) insertado en el gen para desactivar su función. El vector se linealiza y se transforma luego (usualmente por electroporación) en células del tallo embrionario (ES) (v.g. derivadas de una variedad de ratón 129/Ola) y después de ello tiene lugar sucesos de recombinación homóloga en una proporción de las células del tallo. Las células del tallo que contienen la desactivación génica se expanden y se inyectan en un blastocisto (tal como por ejemplo de un ratón C57BL/6J) y se implantan en una madre de acogida para su desarrollo. La progenie quimérica puede identificarse por los marcadores de color de la cubierta. Se reproducen las quimeras para comprobar la contribución de las células ES a la línea germinal por apareamiento con ratones que llevan marcadores genéticos que permiten hacer una distinción entre los gametos derivados de ES y los derivados del blastocisto hospedador. La mitad de los gametos derivados de las células ES llevarán la modificación génica. Se escruta la progenie (v.g. por transferencia Southern) para identificar aquellos individuos que llevan la rotura génica (aproximadamente el 50% de la progenie). Esta progenie seleccionada será heterocigótica y por consiguiente puede reproducirse con otro heterocigoto y seleccionarse después de ello descendencia homocigótica (aproximadamente 25% de la progenie). Los animales transgénicos con un gen inoperante o desactivado ("knockout") pueden cruzarse con animales transgénicos producidos por técnicas conocidas tales como microinyección de DNA en los pronúcleos, fusión de esferoplastos (Jakobovits et al. (1993) Nature 362: 251-258) o transfección mediada por lípidos (Lamb et al. (1993) Nature Genetics 5: 22-29) de las células ES para producir animales transgénicos con un gen endógeno knockout y reemplazamiento de genes extraños.

Las células ES que contienen una rotura génica direccionada pueden modificarse ulteriormente por transformación con la secuencia del gen diana que contiene una alteración específica, que está preferiblemente clonada en un vector y linealizada antes de la transformación. Después de la recombinación homóloga, el gen alterado se introduce en el genoma. Estas células del tallo embrionario pueden utilizarse subsiguientemente para crear organismos transgénicos como se ha descrito arriba.

La expresión "célula hospedadora" incluye cualquier célula procariota o eucariota adecuada para tecnología de expresión tal como por ejemplo bacterias, levaduras, células vegetales y cigotos, oocitos, blastocistos, células del tallo embrionario y cualesquiera otras células de mamífero no humano adecuadas para tecnología transgénica. Si el contexto lo permite, la expresión "célula hospedadora" incluye también una planta o mamífero no humano transgénico desarrollado a partir de cigotos, oocitos, blastocistos, células del tallo embrionario, de mamífero no humano, células vegetales y cualesquiera otras células adecuadas transformadas para tecnología transgénica.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de producción del anticuerpo monoclonal 55.1 que comprende:

a) cultivar el hibridoma 55.1 depositado como depósito ECACC no. 93081901 y;

b) obtener el anticuerpo 55.1 a partir del medio de cultivo y opcionalmente;

c) preparar un fragmento F(ab')2 del anticuerpo 55.1 por digestión enzimática.

Otro aspecto de la invención proporciona una estructura de fijación de antígeno que es el anticuerpo producido por el hibridoma 55.1 depositado como depósito ECACC no. 93081901.

La presente invención permite el direccionamiento de una toxina a células que presentan el antígeno CA55.1 por direccionamiento de un conjugado de inmunotoxina que comprende una toxina y una estructura de fijación de antígeno como se define anteriormente en esta memoria.

Como se menciona en esta memoria, el conjugado es capaz de destruir las células de tumores gastrointestinales. Así, el conjugado (o "inmunotoxina") es capaz de suministrar el resto de toxina a la célula tumoral de tal modo que el resto de toxina pueda ejercer sus propiedades citotóxicas. Por consiguiente, el conjugado será capaz en general de fijarse a las células tumorales (a través del resto de fijación de la célula diana que se fija a las células tumorales) y permitir que el resto de toxina pase al interior de la célula, es decir permitir que el resto de toxina se "internalice". Conjugados particularmente eficaces tendrán, en general, las propiedades siguientes:

1. La estructura de fijación del antígeno debe ser capaz de fijarse a un antígeno de la superficie de la célula tumoral.

2. El antígeno de la superficie celular debe estar presente en alto número de copias en las células tumorales, por ejemplo, al menos diez mil por célula.

3. El antígeno no debe expresarse en alto número de copias en las células normales.

4. El complejo anticuerpo: antígeno debe internalizarse eficazmente a fin de que el resto de toxina pueda ejercer su citotoxicidad intracelularmente.

5. El conjugado debe estar construido preferiblemente de tal manera que el mismo sea suficientemente estable para permanecer intacto en la sangre durante un periodo suficientemente largo para suministrar el resto de toxina a las células tumorales y ser además suficientemente escindible para permitir la liberación del resto de toxina una vez que el resto de toxina se encuentra en el interior de la célula.

En general, el intervalo de dosificación para un conjugado de este tipo se determina como una proporción de una dosis tóxica establecida (v.g. la dosis máxima tolerada). Comúnmente, este enfoque se utiliza también en el hombre. Típicamente, el intervalo de dosificación sería 50-5000 \mug/kg.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un anticuerpo como se describe anteriormente en esta memoria en un método de diagnóstico in vitro.

Un método de diagnóstico es el inmunoensayo. Un inmunoensayo para una prueba in vitro basada en el nuevo anticuerpo de acuerdo con la invención puede diseñarse en conformidad con los métodos inmunológicos convencionales de la técnica, utilizando el anticuerpo de acuerdo con la invención en una forma marcada o sin marcar y determinando la formación del complejo del anticuerpo con especies antigénicas específicas en la muestra a ensayar. En un caso, el anticuerpo puede marcarse con un marcador detectable, tal como un radiomarcador, un producto quimiominiscente, un producto fluorescente o un marcador enzimático. Alternativamente, el anticuerpo se detecta por la vía de un complejo formado con una sustancia marcada o por técnicas sin marcación, tales como métodos de biosensores basados v.g. en la resonancia del plasmón superficial. La muestra puede encontrarse por ejemplo en la forma de un fluido corporal, tal como suero, o una preparación tisular (ensayo histoquímico).

Para el diagnóstico del cáncer in vitro, la estructura de fijación de antígeno puede conjugarse con enzimas tales como peroxidasa de rábano picante y luciferasa bacteriana que pueden generar una señal que puede medirse, o a marcadores fluorescentes o radioisótopos que pueden detectarse y cuantificarse directamente. En un sistema de inmunoensayo estándar, tales conjugados proporcionan un medio de medir la presencia o ausencia de CA55.1 en los tejidos corporales y proporciona por consiguiente un ensayo rápido y conveniente para el diagnóstico de la enfermedad tumoral. Véanse las descripciones generales de la metodología implicada en Enzyme Immunoassay, E.T. Ilaggio, CRC Press y US 3690 8334, US 3791 932, US 3817 837, US 3850 578, US 3853 987, US 3867 517, US 3901 654, US 3935 074, US 3984 533, US 3996 345 y US 4098 876.

Para la terapia del cáncer, aunque la estructura de fijación de antígeno podría utilizarse sin modificación ulterior, las realizaciones preferidas implican una estructura de fijación de antígeno que pueda conjugarse con agentes tóxicos que pueden matar las células cancerosas o las células que se encuentran en la proximidad inmediata de aquellas células cancerosas que llevan el antígeno CA55.1. En la realización preferida, la estructura de fijación de antígeno está conjugada a una toxina proteínica tal como ricina, toxina de la difteria, enterotoxina estafilocócica, exotoxina de Pseudomonas, abrina u otra proteína desactivadora ribosómica. Estas proteínas pueden enlazarse a la estructura de fijación de antígeno sea químicamente utilizando un agente de reticulación química o genéticamente por la construcción de una proteína de fusión que contiene una secuencia lineal de aminoácidos simple de la totalidad o una parte de la estructura de fijación de antígeno y la totalidad o una parte de la toxina proteínica. Dado que CA55.1 se internaliza rápidamente, la toxina proteínica entra selectivamente en las células tumorales y conduce a su muerte.

La muerte celular selectiva de las células tumorales puede conseguirse también por conjugación de la estructura de fijación de antígeno sea directamente o por derivatización química con formadores de quelatos macrocíclicos que contienen radioisótopos de alta energía tales como 90 Y, 131I y 111In. La estructura de fijación de antígeno sirve para localizar el isótopo en el tumor y la radiación emitida por el isótopo destruye el DNA de las células circundantes y mata el tumor.

La muerte selectiva de las células tumorales puede conseguirse también por conjugación de la estructura de fijación de antígeno a fármacos citotóxicos y citostáticos tales como metotrexato, clorambucil, adriamicina, daunorrubicina y vincristina. Estos fármacos han sido utilizados en la clínica durante muchos años y la terapia que proporcionan los mismos está limitada a menudo por una toxicidad inespecífica. La conjugación de estos fármacos con la estructura de fijación del antígeno CA55.1 permite que estos fármacos se localicen en el sitio del tumor y aumentar así la dosis de fármaco que puede suministrarse al tumor sin incurrir en efectos secundarios inaceptables por la acción de dichos fármacos sobre otros tejidos tales como la médula ósea o el sistema nervioso.

La destrucción selectiva de las células tumorales puede conseguirse también por conjugación de la estructura de fijación de antígeno a una enzima que es capaz de catalizar la conversión de una dosis no tóxica de un profármaco en un compuesto fármaco tóxico potente. La administración del conjugado conduce a la localización de la actividad enzimática en el sitio del tumor. La administración subsiguiente del profármaco conduce a la producción local del fármaco tóxico y la muerte selectiva en el sitio del tumor. Este enfoque se describe en los documentos WO 88/07378, US 4.975.278 y WO 89/10140.

Otra aplicación es en el uso de CA55.1 para aislar estructuras de fijación de antígeno que pueden utilizarse para aislar anticuerpos adicionales, idiotípicos para los anticuerpos específicos de CA55.1. Estos anticuerpos pueden utilizarse luego como vacunas de tumor para inducir o reforzar una respuesta inmune natural a los tumores portadores de CA55.1. Un ejemplo de este enfoque se da en Nepom et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. (1984) 81, 2864.

La técnica para producir las estructuras de fijación del antígeno CA55.1 se describe en el Ejemplo 1 y Ejemplo 2, e implica en el primer caso la producción de muchos millares de anticuerpos monoclonales contra una célula tumoral portadora del antígeno CA55.1 y el escrutinio posterior de aquellos anticuerpos particulares que reaccionan específicamente con CA55.1 (Ejemplo 6). Esta tecnología se practica por regla general utilizando la fusión de células del bazo de roedores que han sido inmunizados con el antígeno CA55.1 o células de preparaciones de membrana de células que expresan el antígeno CA55.1 tales como COLO 205 (ATCC CCL 222, Can. Res. [1978] 38, 13455) y una línea de células de mieloma de roedor tal como Sp/2 (ECACC cat. no. 85110503, Methods in Enzymol [1981] 73B, 3). El producto de esta fusión es una línea de células de hibridoma de roedor que expresará un anticuerpo monoclonal de roedor tal como el anticuerpo murino IgG1 55.1. En los usos arriba descritos, la estructura de fijación de antígeno más ventajosa para una aplicación particular no siempre es el anticuerpo monoclonal de roedor intacto producido por la tecnología de fusión de hibridoma, y la molécula se modifica óptimamente después al tiempo que se retiene la especificidad de fijación original para CA55.1.

En particular, el anticuerpo de roedor, durante la administración repetida in vivo en el hombre, sea como la estructura de fijación de antígeno sola o como un conjugado, producirá una respuesta inmune en el receptor contra el anticuerpo de roedor; la respuesta HAMA. La respuesta HAMA limitará la eficacia de la composición farmacéutica si se requiere una dosis repetida. La inmunogenecidad de la estructura de fijación de antígeno puede reducirse por modificación química de la estructura de fijación de anticuerpo con un polímero hidrófilo tal como polietilenglicol o por utilización de los métodos de ingeniería genética para hacer la estructura de fijación de anticuerpo más afín a la humana. Por ejemplo, pueden emplearse las secuencias génicas para los dominios variables del anticuerpo de roedor que fijan CA55.1 en sustitución de los dominios variables de una proteína de mieloma humana, produciendo así un anticuerpo recombinante quimérico. Estos procedimientos se detallan en los documentos EP 194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 y WO 86/01533. Alternativamente, las secuencias génicas de las regiones determinantes de la complementariedad o CDR's del anticuerpo de roedor de fijación a CA55.1 pueden aislarse o sintetizarse y emplearse en sustitución de las regiones de secuencia correspondientes de un gen de anticuerpo humano homólogo, produciendo un anticuerpo humano con la especificidad del anticuerpo original de roedor. Estos procedimientos se describen en los documentos EP 023940, WO 90/07861 y WO 91/09967. Alternativamente, un gran número de los residuos de superficie del dominio variable del anticuerpo de roedor pueden cambiarse por aquellos residuos que se encuentran normalmente en un anticuerpo humano homólogo, produciendo un anticuerpo de roedor que tiene un "chapado" superficial de residuos y que será reconocido por consiguiente como propio por el cuerpo humano. Este enfoque ha sido demostrado por Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28, 489.

La eficacia de la estructura de fijación de anticuerpos se mejora en muchas aplicaciones por reducción del tamaño de la estructura de fijación de anticuerpos, mejorando por consiguiente la penetración tisular y otras propiedades farmacodinámicas de la composición farmacéutica. Esto puede conseguirse por eliminación de la región Fc de la molécula de anticuerpo, sea enzimáticamente (Ejemplo 4) o por métodos de ingeniería genética para producir un fragmento recombinante Fab' o F(ab)2 (Ejemplo 3.3).

Pueden utilizarse también métodos de ingeniería genética para reducir ulteriormente el tamaño de la estructura de fijación de antígeno. El Fv que contiene las CDRs puede transformarse por ingeniería genética y expresarse en aislamiento y reticularse químicamente por ejemplo por el uso de puentes disulfuro. Alternativamente, tanto los dominios de la cadena ligera como los de la cadena pesada que constituyen la estructura de Fv pueden producirse como una cadena polipeptídica simple (SCFv) por fusión de los dominios Fv con una secuencia enlazadora peptídica a partir del término C natural de un dominio al término N del otro dominio (véase el Ejemplo 3.3 y los documentos PCT/US/87/02208 y US 4704692). Alternativamente, un dominio Fv simple puede expresarse en aislamiento formando un anticuerpo de dominio simple o dAb como ha sido descrito por Ward et al, Nature (1989) 341, 544. Otro tipo de estructura de fijación de antígeno es un constructo V-min como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 94/12625 (inventores, Slater & Timms).

La invención se ilustra por los ejemplos no limitantes siguientes, en los cuales:

La Figura 1 muestra la densidad de células y la concentración de IgG en cultivo del hibridoma 55.1 en medio que contiene suero;

la Figura 2 muestra la densidad de células y la concentración de IgG en cultivo del hibridoma 55.1 en medio exento de proteínas;

la Figura 3 muestra un mapa plasmídico de pICI 1646;

la Figura 4 muestra la endocitosis de CA55.1;

la Figura 5 muestra el efecto anti-tumor in vivo del conjugado anticuerpo 55.1-ricina;

la Figura 6 muestra una representación de una transferencia Western de células Colo 205 tratadas con PNGasa;

las Figuras 7a y 7b muestran representaciones de transferencias Western con las lectinas DSA y GNA;

la Figura 8 muestra un mapa del plásmido pRc/CMV;

la Figura 9 muestra una transferencia Western que demuestra la expresión de Fab' y F(ab')_{2};

la Figura 10 muestra datos ELISA sobre la fijación de Fab y F(ab')_{2};

la Figura 11 muestra una transferencia Western que demuestra la expresión de scFv;

la Figura 12 muestra datos ELISA sobre la fijación de scFv;

la Figura 13 muestra la especificidad de la fijación directa del fago ACEHRGSGWC al anticuerpo 55.1;

la Figura 14 muestra la especificidad de fijación del fago ACEHRGSGWC en un ensayo de competición;

las Figuras 15 y 16 muestran las secuencias de cDNA de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 55.1. Obsérvese la presencia de secuencias secretoras del péptido conductor que están presentes en las cadenas de anticuerpo maduras. Las secuencias conductoras se representan en el código de aminoácidos de 3 letras y las secuencias maduras en el código de una sola letra.

La Figura 17 muestra un diagrama de flujo para la generación de anticuerpos para el antígeno 55.1.

La Figura 18 muestra la secuencia de DNA bicatenario del marcador c-myc utilizado para la detección de anticuerpos.

La Tabla 1 muestra la densidad de células y la concentración de IgG en cultivo del hibridoma 55.1 en medio que contiene suero;

la Tabla 2 muestra la densidad de células y la concentración de IgG en cultivo del hibridoma 55.1 en medio exento de proteínas;

la Tabla 3 muestra la reactividad del anticuerpo 55.1 con tumores colorrectales; y,

la Tabla 4 muestra las proporciones de tinción de tejidos normales con el anticuerpo 55.1.

Abreviaturas

SDS-PAGE es electroforesis en dodecilsulfato de sodio (SDS)-gel de poliacrilamida (PAGE).

TABLA 1 Crecimiento y producción de IgG a partir de 55.1 en FBS al 5% en cultivo en frascos rotativos

7

TABLA 2 Crecimiento y producción de IgG a partir de 55.1 en medio exento de proteínas en cultivo en frascos rotativos

8

TABLA 3 Reactividad con el Tumor Colo-Rectal Humano 55.1

9

TABLA 4 Proporción de la Tinción de Tejidos Normales con 55.1

	Registro de inmunihistologia	% de Tejidos teñidos
	-	59
	+/-	26
	+	14
	++	1

Ejemplo 1 Preparación del anticuerpo 55.1 y anticuerpos que reaccionan cruzadamente con CA55.1

Desde su comienzo en 1976, la generación de anticuerpos monoclonales se ha aplicado a la investigación de antígenos selectivos de las células cancerosas. Al contrario que la generación de anticuerpos para un antígeno totalmente purificado, este proceso implica inmunizar ratones con una preparación menos pura, y aplicar luego una cascada de escrutinio a fin de identificar los anticuerpos de la especificidad requerida. Los anticuerpos identificados de esta manera pueden utilizarse luego para identificar el antígeno selectivo del cáncer por procedimientos bien conocidos por una persona experta en la técnica.

Una vez identificado el antígeno, pueden generarse anticuerpos ulteriores con especificidad similar por inmunización de animales con una preparación enriquecida de dicho antígeno (preparada por ejemplo por el método descrito en el Ejemplo 11), fusión de las células del bazo de estos animales con una línea de células de mieloma adecuada como se describe más adelante y escrutinio de los hibridomas resultantes en cuanto a la producción de anticuerpos monoclonales que reaccionan cruzadamente con el anticuerpo monoclonal 55.1 por el método descrito en los Ejemplos 6 y 7.

1.1 Establecimiento de la línea de células de hibridoma y producción de 120/466.034.017.023.023.003; Preparación de células de bazo establecidas

Una línea de células de carcinoma colorrectal humano, COLO 205, obtenible comercialmente de la American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, Md. EE.UU., bajo el No. de acceso CCL222, se cultivó rutinariamente en medio exento de suero. Las células se cosecharon cuando alcanzaron una densidad aproximada de 7 X 10e5, y se lavaron luego 3 veces en medio basal (exento de proteínas) Iscoves para inmunización.

Se inmunizaron por vía intraperitoneal ratones BALB/c, de 8 a 10 semanas, con una dosis de sensibilización de 100 \mug de membranas derivadas de células COLO 205 suspendidas en 0,1 ml de solución salina tamponada con fosfato y 0,1 ml de Adyuvante Completo de Freund. Dos semanas después, y de nuevo 4 semanas después, los animales se reforzaron con otras dosis adicionales de 100 \mug de membranas COLO 205 suspendidas en solución salina tamponada con fosfato y Adyuvante Incompleto de Freund's. Seis semanas después de la segunda inmunización de refuerzo, se administró a los ratones una inmunización intraperitoneal final de 100 \mug de membranas COLO 205 suspendidas en solución salina tamponada con fosfato sola y se sacrificaron 4 días después, extirpándose posteriormente los bazos. Los bazos se disociaron luego en una suspensión de células simple por inyección de la modificación de Dulbecco de medio de Eagle en el saco del bazo.

1.2 Preparación del hibridoma

Se mezclaron 1,95 X 10e^{8} células del bazo de la suspensión de células arriba descrita con 2,136 X 10e^{7} células de mieloma de la línea de células de mieloma de ratón NSO (disponible de la European Collection of Animal Cell Cultures bajo el No. de acceso 85110503). Se centrifugó el tubo, y se decantó totalmente el líquido. Se añadieron luego lentamente al tubo (durante 1 min con agitación constante) 1 ml de solución de PEG a 37ºC (PEG1500 Boehringer) con agitación constante y se agitó luego durante un minuto más. La fusión se interrumpió por adición de la Modificación de Dulbecco del Medio de Eagle de acuerdo con el esquema siguiente: 2 ml durante los 2 primeros minutos, 8 ml durante los 4 minutos siguientes, y otros 10 ml durante 2 minutos. El tubo se centrifugó luego y se resuspendió en 30 ml de DMEM con 10% de suero de ternero fetal. Se distribuyeron partes alícuotas de 50 \mul en los pocillos de 6 cápsulas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Después de 24 horas, se añadieron 50 \mul de DMEM por pocillo con 10% de suero de ternero fetal y suplementos de hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT) de concentración doble. Se suministraron a cada pocillo 200 \mul de DMEM con 10% de suero de ternero fetal y suplementos de hipoxantina/aminopterina/timidina (HAT) de concentración simple 7 días después.

1.3 Escrutinio de los hibridomas de anticuerpos

El medio agotado del día 13 anterior se ensayó respecto a anticuerpos COLO 205 positivos/colon normal negativos. En forma resumida, los pocillos de dos series de inmunoplacas Nunc Maxisorp se recubrieron con 10e^{5} células/pocillo de células COLO 205; volumen de recubrimiento 100 \mul o membranas derivadas de colon normal (10 \mug/ml, 100 \mul por pocillo). Las placas se centrifugaron y se añadieron 100 \mul de aldehído glutárico al 0,2% en PBS, después de lo cual se incubaron durante 20 min a la temperatura ambiente. Las placas se lavaron luego con PBS-Tween y se bloquearon con 0,1% de gelatina de porcino en PBS, 200 \mul por pocillo. Se añadió luego el medio de cultivo agotado arriba mencionado del día 13 a los pocillos recubiertos de ambas series de placas, 50 \mul/pocillo. Después de incubación durante 2 horas a la temperatura ambiente, se añadió IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa (Sigma, IgG anti-ratón de cabra, molécula entera, absorbida con proteínas de suero de rata, A8924)) diluida (1/2000) en 0,1% Tween 20-PBS, a razón de 100 \mul/pocillo, y se incubó durante 2 horas a la temperatura ambiente. Se añadió luego el sustrato, en la forma de 90 \mug de OPD disuelta en 100 ml de tampón citrato/fosfato, pH 4,5, más 15 \mul de peróxido de hidrógeno al 30%, a razón de 100 \mul/pocillo y se incubó a la temperatura ambiente durante 15 minutos. La reacción se paró luego con adición de 50 \mul de ácido cítrico (0,5 M) y se midió la absorbancia a 450 nm.

Cuando se escrutan los productos de hibridomas respecto a su capacidad de fijación a dianas específicas, es ventajoso utilizar un segundo anticuerpo antiespecie marcado que refleja en primer lugar las características deseables requeridas de un producto de hibridoma y en segundo lugar no excluye (es decir no reacciona con) los productos de hibridoma que puedan tener estas características. Específicamente, el caso del descubrimiento de 55.1, los autores de la invención procuraron excluir los anticuerpos monoclonales IgM del estudio ulterior, debido a que estas moléculas forman parte de la respuesta humoral precoz y son generalmente de baja afinidad y especificidad deficiente. Para conseguir esto, los autores escrutaron varios conjugados IgG anti-ratón-peroxidasa disponibles comercialmente en cuanto a su capacidad de reaccionar con IgM murina, y desecharon luego cualesquiera preparaciones que exhibieran esta característica. Sin embargo, los autores de esta invención no trataron de excluir subclase alguna de anticuerpos monoclonales IgG. Así pues, el paso inmediatamente siguiente emprendido por los autores de la invención fue determinar la capacidad de los conjugados comerciales remanentes para reaccionar con IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 murinas. No se encontró preparación alguna disponible comercialmente que no reaccionara con la IgM murina y reaccionara a la vez igualmente con todas las subclases de IgG murina. Para resolver esto, los autores mejoraron luego el reactivo óptimo de IgG anti-ratón por adición de uno o más conjugados anti-subclase específicos. La preparación final reconocía de modo igualmente satisfactorio las cuatro subclases reconocidas de IgG murina.

Se ensayaron aproximadamente 600 clones de hibridoma. Inicialmente, 165 de éstos reaccionaban con las células COLO 250. Se demostró que 43 de ellos reaccionaban también con la membrana de colon humana normal, y se desecharon. Un clon establecido a partir de uno de los hibridomas remanentes se designó 120/466 y determinó su isotipo como clase IgG1. El hibridoma 120/466 se sometió luego a varios pasos de subclonación para producir eventualmente un anticuerpo monoclonal final estable que producía un clon designado como 120/466.034.017.023.023.003, que se conoció finalmente como 55.1.

Así, el hibridoma 120/466 se clonó primeramente, dando como resultado un clon denominado 120/466.034. Este clon se clonó a su vez para formar el clon 120/466.034.017; este clon se clonó a su vez para formar el clon 120/466.034.017.023; este clon se clonó a su vez para formar el clon 120/466.034.017.023.023; este clon se clonó a su vez para formar el clon 120/466.034.017.023.023.003. En todas estas clonaciones, la suspensión de hibridoma se diluyó en medio de cultivo complementado con hipoxantina/timidina (HT) a una densidad de 2,5 células/ml. Se distribuyeron 200 \mul (una células) (sic) en cada pocillo de una cápsula de cultivo de 96 pocillos. Después de 5-7 días, de detectaron clones monocelulares por inspección visual en un microscopio. El día 17 se cambió el medio y se analizaron partes alícuotas de medios agotados en cuanto a cantidad de anticuerpos que se fijaban a las células COLO 205 pero no a las membranas normales por ELISA como se ha descrito arriba. Los clones óptimos en términos de reacción positiva en el ensayo ELISA de COLO 205 que retenían reacción negativa en el ELISA de las células normales se seleccionaron y se congelaron en viales en nitrógeno líquido para el desarrollo ulterior.

El ensayo de la clonación de 120/466.034.017 indicó que el 66% de las células producían anticuerpos que reaccionaban con las células COLO 205. El ensayo de la clonación de 120/466.034.017.023 indicó que el 100% de las células producen anticuerpos que reaccionaban con las células COLO 205. El ensayo de la clonación de 120/466.034.017.023.023 indicó que el 100% de las células producían anticuerpos que reaccionaban con las células COLO 205. Después de la clonación, los hibridomas que reaccionaban con las células COLO 205 y que no reaccionaban con la membrana de colon humano normal se evaluaron luego como sigue para identificar 55.1.

Los anticuerpos secretados por los hibridomas (medios agotados procedentes de 10^{7} células cultivadas en matraces de 75 cm^{2} durante aproximadamente 7 días) se evaluaron por inmunohistología (como se describe en el Ejemplo 6) sobre secciones tisulares de 4 tumores de colon obtenidos de 4 pacientes diferentes con cáncer colorrectal primario. Los anticuerpos que se fijaban fuertemente (++, véase el Ejemplo 6) a al menos 2 de estos tumores se evaluaron por inmunohistología en cuanto a reactividad sobre un panel mayor de secciones de tumor colorrectal procedentes de 10 pacientes diferentes. Los anticuerpos que se fijaban fuertemente (++) a al menos 5 de estos tumores se evaluaron ulteriormente.

En esta etapa, los sobrenadantes de hibridoma se titularon contra el panel de 10 tumores colorrectales para determinar la dilución máxima del sobrenadante que daba reactividad fuerte (++) frente a al menos el 50% de los tumores. Se designó ésta como la ``concentración de trabajo'' y se utilizó para escrutar una serie de paneles de tejidos normales. Para minimizar el escrutinio de tejidos normales, se ideó una cascada de escrutinio de tejidos normales en 4 pasos, en la cual se escrutaron primeramente los tejidos más críticos. Los hibridomas se desecharon si el anticuerpo que secretaban los mismos no cumplía los criterios de reactividad en cada paso de la cascada. Los pasos de la cascada, los tejidos y los criterios de selección fueron:

Paso	Tejidos de:	Criterios para progresión
1	Corazón/nervio	Ausencia de reactividad con cualquiera
2	Cerebro, riñón, suprarrenal	reactividad < ++ con cualquiera
3	Pulmón, hígado, páncreas, músculo	reactividad < ++ con 2 de éstos
4	Colon, bazo, estómago, ganglio linfático, vejiga	reactividad < ++ con 4 de éstos
	urinaria, paratiroides, piel, ovario, testículos

Esta cascada de escrutinio condujo a la identificación del anticuerpo 55.1.

Ejemplo 2 Preparación del anticuerpo 55.1 a partir de la línea de células depositada ECACC No. 93081901 2.1 Preparación a partir de medio que contiene suero

Una ampolla crioconservada de 1 ml se retiró del almacenamiento en nitrógeno líquido y se descongeló rápidamente en un baño de agua a 37ºC. El contenido se transfirió asépticamente a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml. Las células se resuspendierón por adición gota a gota de 10 ml de Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 10% (v/v) de suero de ternero fetal (FCS) acompañado por mezcladura suave. La suspensión se centrifugó a 50 x g durante 10 min y el sobrenadante se retiró asépticamente, después de lo cual se resuspendió el sedimento en 10 ml de DMEM y 10% de FCS en un matraz de cultivo de tejidos de 25 ml pre-gasificado con 95% aire/5% dióxido de carbono. El matraz se incubó a 37ºC en la oscuridad.

Después de 3 días, se sub-cultivó el matraz por paso del contenido del matraz entero a un matraz mayor de 75 ml y dilución con DMEM + 10% FCS (densidad final viable = 2,5 X 10E5 células/ml). La expansión ulterior a matraces de 162 ml se realizó de una manera similar, excepto que la concentración de FCS se redujo a 5%.

Los sobrenadantes de cultivo para la purificación se prepararon en cultivos rotativos de 250 ml y 500 ml en matraces rotativos de 490 ml y 850 ml respectivamente. Los cultivos se sembraron a 2,6 X 10E5 células viables/ml en matraces rotativos pregasificados, que se hicieron girar a 3 rpm y se incubaron a 37ºC. Los cultivos se dejaron crecer hasta madurez y se recogieron 309 horas después de la incubación, cuando la viabilidad celular era 0% y la concentración de IgG había alcanzado un máximo (Tabla 1 y Figura 1).

2.2 Preparación a partir de medio exento de proteínas

Los cultivos en matraces rotativos en 5% de FBS se adaptaron a crecimiento exento de proteínas y productividad por sometimiento a pasos seriados en Medio II de Hibridoma Exento de Proteínas Gibco (PFHMII, número de catálogo 074-03600P) complementado con FBS. La concentración de FBS se redujo en pasos de 50% una vez que se estableció el crecimiento próspero después de cada reducción sucesiva. Los cultivos se sembraron a 3 X 10E5 células viables/ml y no se dejaron crecer más allá de 1 X 10E6 células viables/ml durante el proceso de adaptación. Una vez apartados para crecimiento exento de proteínas, se prepararon sobrenadantes de cultivo para purificación en cultivos rotativos de 250 ml y 500 ml como anteriormente. Los cultivos se sembraron a 2,0 X 10E5 células viables/ml en matraces rotativos pre-gasificados, que se hicieron girar a 3 rpm y se incubaron a 37ºC. Los cultivos se dejaron crecer hasta madurez y se recogieron 236 horas después de la inoculación, cuando la viabilidad de las células era 0%, y la concentración de inmunoglobulina G (IgG) era máxima (véase Tabla 2 y Ejemplo 2).

2.3 Tratamiento de las cosechas de cultivo

Después de la cosecha, los sobrenadantes de cultivo en matraces rotativos se clarificaron por centrifugación a 60 g durante 30 minutos. Los sobrenadantes clarificados se guardaron en condiciones estériles a 4ºC en la oscuridad hasta purificación.

2.4 Purificación de 55.1

El anticuerpo 55.1 ha sido aislado a partir de sobrenadantes de cultivo de células por adsorción en y elución de Proteína A.

5 litros de sobrenadante del cultivo de células del anticuerpo 55.1, desarrollados en un medio nutriente exento de suero, que contenía aproximadamente 80 mg Ab/litro, se hicieron 1,5 M de glicina/3 M de cloruro de sodio por adición, con agitación, de 562,5 g de glicina + 876,6 g de cloruro de sodio. El pH de la solución de ajustó a 8,9 con hidróxido de sodio 5 M. La solución resultante se filtró por bombeo a través de un prefiltro (filtro de cartucho Millipore "Polygard"), seguido por un filtro de 0,45 \mu (filtro de cartucho de PVDF Millipore Millidisk).

Un cartucho de 500 mg de capacidad nominal de IgG Nygene Protein A de 500 ml de volumen de lecho se lavó con 4 volúmenes de lecho de tampón 1,5 M glicina/3 M cloruro de sodio de pH 8,9 prefiltrado a través de 0,45 \mu a un caudal de 500 ml/minuto utilizando una bomba peristáltica.

Todos los tampones utilizados subsiguientemente con el cartucho Nygene se prefiltrarón a través de un filtro de 0,45 \mu.

El sobrenadante de cultivo de 55.1 filtrado, a pH 8,9, se bombeó a través del cartucho, asimismo a 500 ml/min, y la columna se lavó con los 5 volúmenes de lecho del tampón glicina/sal común hasta que la totalidad del indicador medio de rojo de metilo se eliminó del cartucho. El cartucho se lavó luego con 1 volumen de lecho de PBS al mismo caudal, seguido por elución del anticuerpo 55.1 con 3 volúmenes de lecho de citrato de sodio 100 mM de pH 2,8 a un caudal de 250 ml/min, recogiéndose fracciones de 50 ml y observando la presencia del Ab por UV A280 nm. Todas las fracciones que contenían el anticuerpo se agruparon y se neutralizaron con hidróxido de sodio 1 M.

El efluente de la columna glicina/sal común y los lavados se reciclaron a través del cartucho de Proteína A para producir un 15% más de anticuerpo en el lavado subsiguiente con citrato.

La totalidad del anticuerpo agrupado se cambió de tampón a tampón PBS. La SDS-PAGE del anticuerpo agrupado exhibió una pureza mayor que 90%, con una producción de 360 mg de anticuerpo.

Ejemplo 3 Producción de estructuras de fijación de anticuerpo por el uso de tecnología de DNA recombinante 3.1 Determinación de las secuencias de cDNA de las cadenas pesada y ligera de 55.1

El ejemplo siguiente describe la construcción de una genoteca de cDNA a partir del hibridoma 55.1, el aislamiento de clones específicos de cDNA codificantes de las proteínas de la cadena pesada y ligera y la determinación de la secuencia completa de DNA de estos clones.

3.1 (a) Preparación de mRNA a partir de células de hibridoma

Existen varios procedimientos para el aislamiento de mRNA poliA+ a partir de células eucariotas (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª edición, 1989, capítulo 8, p. 3, a que se hace referencia en lo sucesivo como Maniatis). Un método de este tipo es proporcionado en forma de estuche por Pharmacia y está basado en la lisis de un número relativamente pequeño de células (10^{7} o menos) seguido por fijación de mRNA poliA+ a una columna de oligo-dT. Los componentes celulares no deseados se eliminan por lavado con una concentración baja de sal común antes de la elución del mRNA en solución concentrada de sal común a temperatura elevada.

Se preparó mRNA a partir de 10^{7} células de hibridoma 55.1 utilizando el estuche de mRNA Quickprep (Pharmacia Biotechnology Ltd.). La concentración del mRNA se estimó por barrido de una muestra desde 300 a 220 nm en un espectrofotómetro Uvikon 930 (Kontron Instruments) y utilización de un coeficiente de extinción de 40 \mug/ml a 260 nm. El mRNA se guardó como partes alícuotas de 2,5 \mug precipitadas en etanol.

3.1 (b) Síntesis y clonación del cDNA

El método utilizado para la síntesis de cDNA se basó en el de Gubler y Hofman, que está ligado a la transcripción inversa a partir de mRNA cebado seguida por tratamiento con RNAsa H para proporcionar el cebado y la síntesis de la segunda cadena por DNA-polimerasa I. Otros métodos para la síntesis de cDNA se revisan en Maniatis (capítulo 8).

Una muestra de 5 \mug de mRNA se cebó con oligo-dT (mezcla de 12-18meros, Pharmacia Biotechnology Ltd., 0,5 \mug) en una solución de 10 \mul que contenía 2,5 u de inhibidor de RNAsa placentaria (Life Technologies Ltd.) preparado con agua exenta de RNAsa por incubación a 70ºC seguida por enfriamiento en hielo. La síntesis del cDNA de la primera cadena se realizó luego por adición de 4 \mul de tampón 5 x H-RT (Tris 250 mM, pH 8,3, KCl 200 mM, MgCl_{2} 30 mM y 0,5 mg/ml de BSA), 2 \mul de DTT (ditiotreitol) 0,1 M, 1 \mul de mezcla de dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP a 20 mM), 4 \mul de transcriptasa inversa Superscript (Life Technologies Ltd.) e incubación a 42ºC durante 1 hora. Para la reacción de la segunda cadena, se añadieron 1,5 \mul de mezcla de dNTP (como arriba), 92,5 \mul de agua exenta de RNAsa, 30 \mul de tampón de reacción 5x (Tris 125 mM, pH 7,5, KCl 500 mM, MgCl_{2} 25 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 50 mM y 0,5 mg/ml de \beta-NAD), 1 \mul de DNA-ligasa T4 (10 u, Life Technologies Ltd.), 4 \mul de DNA-polimerasa I (40 u, Life Technologies Ltd.) y 1 \mul de RNAsa H (2,7 u, Life Technologies Ltd.), y se continuó la incubación a 16ºC durante 2 horas más. Para asegurar que se había preparado cDNA de extremos romos, se realizó una incubación final a 16ºC durante 5 minutos después de añadir 2 \mul de DNA-polimerasa T4 (10 u, Life Technologies Ltd.). La actividad enzimática se interrumpió luego por incubación a 70ºC durante 10 minutos.

Para preparar el cDNA para la clonación, la solución anterior se extrajo contra un volumen igual de fenol y la fase acuosa resultante se extrajo con un volumen igual de fenol:cloroformo (50:50 v:v) a fin de eliminar las proteínas antes de la purificación por cromatografía en columna giratoria utilizando Sepharose C4-LB en una columna adquirida de Pharmacia Biotechnology Ltd. y utilizada de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El cDNA purificado se mezcló luego con 5 \mul de adaptadores EcoRI/NotI (Pharmacia Biotechnology Ltd.), 1 \mul de solución de ATP (5 mM) y 30 \mul de DNA-ligasa T4 (10 u, Pharmacia Biotechnology Ltd.) y se incubó a 12ºC durante una noche. El cDNA más los adaptadores se fosforiló luego por adición de 10 \mul de solución de ATP (5 mM) y 1 \mul de polinucleótido-quinasa T4 (10U Pharmacia Biotechnology Ltd.) e incubación a 37ºC durante 30 minutos. Una vez más, la solución se extrajo contra volúmenes iguales de fenol y fenol:cloroformo y se purificó por cromatografía en columna giratoria para eliminar los adaptadores en exceso. En esta etapa, el cDNA está listo para clonación en un plásmido o vector de fago apropiado.

Se utilizó pBluescript (Stratagene Cloning Systems) para la construcción de una genoteca de cDNA. Este vector fagémido tiene un sitio de clonación EcoRI único, el gen de resistencia a la ampicilina, y a la vez orígenes de replicación ColEI y fI para aislamiento de DNA bi- o monocatenario. Se digirieron 5 \mug de DNA pBluescript KS hasta digestión completa con 30 u de EcoRI (Promega Corporation) en una solución que contenía Tris-HCl 90 mM, pH 7,5, HgCl_{2} 10 mM, NaCl 50 mM a 37ºC durante 45 minutos. Se añadieron luego 2 \mul de fosfatasa alcalina intestinal de ternero (2 u,Boehringer Mannheim) para eliminar los grupos 5'-fosfato y se continuó la incubación a 37ºC durante 30 minutos más. Se destruyó la actividad de fosfatasa por incubación a 70ºC durante 10 minutos.

Se ligaron 5 \mul del cDNA más adaptadores con 25 ng de pBluescript tratado con EcoRI/CIP en una solución que contenía Tris-HCl 30 mM, pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM y 1,5 u de DNA-ligasa T4 (Promega Corporation) a 16ºC durante 2,5 horas. Se utilizaron partes alícuotas de 5 \mul y 2,5 \mul de esta reacción para transformar 100 \mul y 50 \mul de células competentes de E.coli DH5\alpha (Life Technologies Ltd.) respectivamente utilizando el protocolo proporcionado con las células. Las células transformadas se extendieron en L-agar más 100 \mug/ml de ampicilina, IPTG 1 mM y 0,2% de X-gal y se incubaron durante una noche a 37ºC. Los clones que contenían inserciones de cDNA se seleccionaron sobre la base de la producción de colonias blancas en el medio anterior en comparación con el color azul generado por las células que contenían el plásmido originario. Se recogieron por duplicado Doscientas colonias blancas en lotes de 50 sobre discos de nitrocelulosa (Schleicher & Schull) depositados sobre placas de L-agar más ampicilina. Una tercera serie de placas sin filtros se aplicó en bandas para formar un stock madre de las colonias seleccionadas. Después de incubación durante una noche a 37ºC, se retiraron los filtros de nitrocelulosa y se procesaron de acuerdo con el método de Grunstein y Hogness (Maniatis, capítulo 1, p. 102) para lisar las células bacterianas in situ. Los filtros se depositaron sobre papel 3 MM (Whatman) impregnado en los diversos reactivos -10% SDS durante 2 minutos, NaOH 3 M, NaCl 1 M durante 5 minutos y Tris 1 M, pH 6,8 durante 2 \times 2 minutos. Los filtros que contenían las células lisadas se transfirieron a papel 3 MM humedecido con 20 X SSC (NaCl 3 M, citrato de sodio 0,3 M) y el DNA se reticuló a los filtros por exposición a luz UV en un aparato Stratalinker 2400 (Stratagene Ltd.) ajustado a autorreticulación (120.000 \muJoules). Los filtros se secaron al aire antes de su uso en sondeo (véase más adelante). Las placas de stock madre se guardaron a 4ºC hasta que se necesitaron.

3.1 (c) Escrutinio de la genoteca de cDNA

Para generar sondas eficaces para escrutinio de la genoteca de cDNA, se aislaron los DNAs de la región variable de las cadenas pesada y ligera de 55.1 por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Saiki, R. et al, 1985, Science, Vol 230, p 1350-1354). Esto fue posible debido a la disponibilidad de datos de secuencias de proteínas N-terminales para ambas cadenas (véase arriba). Estos datos se utilizaron para el diseño de iniciadores 5' PCR (SEQ ID NO: 1-4). Se sintetizaron dos iniciadores para cada secuencia, uno de ellos basado en los codones existentes más frecuentemente para las regiones V de ratón determinadas a partir de secuencias publicadas (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª edición, 1987, Kabat E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. y Gottesman, K.S., publicado por el Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., y al que se hace referencia en lo sucesivo como Kabat) (SEQ ID NO: 1 y 3) y otro que incluía degeneración en ciertas posiciones base para cubrir varias opciones de codones (SEQ ID NO: 2 y 4). Los iniciadores PCR para el extremo 3' (SEQ ID NO: 5 y 6) eran complementarios a las secuencias publicadas en Kabat para las regiones 5' de CHI de IgG1 y el término 3' de Ck respectivamente. El isotipo de la cadena pesada había sido determinado por ensayo (véase arriba) y la secuencia de la proteína VL N-terminal indicaba que la cadena ligera era el isotipo kappa. Estos iniciadores de la región constante 3' podrían utilizarse también como sondas de escrutinio en sí mismos.

3.1 (d) Síntesis de oligonucleótidos

Todas las secuencias de oligonucleótidos utilizadas se prepararon en sintetizadores de DNA Applied Biosystems 380B o 394, a partir de nucleósido-2-cianoetil-N,N-di-isopropil-fosforamiditos protegidos con base en 5' dimetoxitritilo y nucleósidos protegidos enlazados a soportes de vidrio de poros controlados en una escala de 0,2 \mumol, de acuerdo con protocolos suministrados por Applied Biosystems Inc.

Como alternativa, los oligonucleótidos pueden prepararse manualmente por los métodos descritos por Atkinson y Smith en "Oligonucleotide Synthesis, a manual approach" (M.T. Gait, compilador, IRL Press, Oxford, Washington DC, páginas 35-81).

Cada oligonucleótido sintetizado, después de escisión del soporte sólido y eliminación de todos los grupos protectores, se disolvió en agua bidestilada (1 ml).

3.1 (e) Generación de sondas

Se generaron fragmentos de DNA de la región variable a partir de cDNA utilizando PCR. Se añadió 1 \mul de cDNA a una mezcla de reacción de 100 \mul que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, 0,1% de gelatina, MgCl_{2} 1,5 mM, 1,25 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 1 \muM de cada uno de los pares de oligonucleótidos apropiados y 2,5 u de DNA-polimerasa Taq (Amplitaq, Perkin-Elmer Cetus). Cada mezcla de reacción se cubrió con 100 \mul de aceite mineral y se incubó a 94ºC durante 1,5 minutos, a 50ºc durante 1,0 minutos y 72ºC durante 2,0 minutos, durante 25 ciclos más 10 minutos a 72ºC. Se dispusieron también reacciones de control sin cantidad alguna de DNA.

Las reacciones PCR se analizaron haciendo pasar una muestra de 5 \mul de cada una sobre un gel de agarosa al 0,8% (Pharmacia Biotechnology) que se tiñó subsiguientemente en 1 \mug/ml de solución de bromuro de etidio (Sigma Chemical Company Ltd.) y el DNA se visualizó en un transiluminador UV. La presencia de una banda de aproximadamente 400 pb era visible en todas las PCRs con cDNA de 55.1 presente, lo que indicaba la multiplicación satisfactoria de las regiones variables. La ausencia una banda de DNA en las regiones de control indicaba que los reactivos utilizados no contenían DNA contaminante.

Cada producto PCR se purificó por el uso de un microconcentrador Centricon 100 (Amicon Ltd.). Se añadió cada mezcla de reacción a un concentrador y se aumentó el volumen a 2 ml por adición de agua bidestilada. La unidad se centrifugó luego a 2000 rpm durante 5 minutos y se desechó el "flujo directo". El producto retenido se diluyó nuevamente a 2 ml y se re-centrifugó la unidad. Se repitió el proceso una tercera vez. Este procedimiento da como resultado la eliminación de los oligómeros en exceso y los componentes tampón del DNA multiplicado.

Los fragmentos VH y VL multiplicados se utilizaron para generar sondas de hibridación específicas para los clones cDNA de las cadenas pesada y ligera. Se generaron sondas radiomarcadas utilizando un estuche QuickPrime T7 (Pharmacia Biotechnology Ltd.) como sigue: se añadieron 5 \mul (\sim50 ng) del producto PCR purificado a 32 \mul de agua bidestilada y el todo se incubó a 100ºC durante 2 minutos para desnaturalizar el DNA bicatenario. Esta muestra se enfrió luego en hielo antes de añadir 10 \mul de mezcla de reactivos (una solución acuosa tamponada que contenía dATP, dGTP, dTTP e iniciadores oligonucleotídicos aleatorios, fundamentalmente 9-meros), 2 \mul de dCTP \alpha 32P (20 \muCi, 3000 Ci/mmol, NEN), y 1 \mul de polimerasa T7 (4-8 u). La mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 20 minutos antes de añadirla a 10 ml de 6 X SSC (NaCl 1 M, citrato de sodio 0,1 M), 0,1% de SDS (dodecil-sulfato de sodio) y 0,25% de Marvel™ (leche en polvo desecada y con bajo contenido de grasa) que se utilizó luego como solución de sonda.

3.1 (f) Sondeo de las genotecas

Los filtros procesados que contenían los clones seleccionados (véase arriba) se pre-hibridarón en lotes duplicados cada uno en 90 ml de 6 x SSC, 0,1% de SDS, 0,25% de Marvel™ a 65ºC durante 3 horas en un horno de hibridación Techne HB-1 utilizando tubos rotatorios de vidrio. Cada serie duplicada se sondó luego en 10 ml de solución de sonda (una serie con la sonda VH y la otra con VL) a 65ºC durante una noche en el mismo aparato. Después de la incubación, se lavó cada serie de filtros en 100 ml de 6 X SSC, 0,1% SDS a 65ºC durante 15 minutos, 100 ml de 3 X SSC, 0,1% SDS a 65ºC durante 30 minutos y 100 ml de 1 X SSC, 0,1% SDS a 65ºC durante 30 minutos en el mismo aparato. Los filtros lavados se secaron luego al aire y se sometieron a autorradiografía utilizando MP Hyperfilm™ (Amersham International) en conjunción con una pantalla rápida intensificadora de wolframato a -70ºC. Después del revelado de la película en un procesador de película Kodak automático, dos clones potenciales de cDNA de la cadena pesada y un clon potencial de cDNA de la cadena ligera se identificaron claramente por hibridación de la sonda pertinente. La frecuencia de los clones de cDNA de anticuerpos identificada es típica de las genotecas de hibridoma de cDNA (Levy, S. et al, 1987, Gene, vol 54, p 167-173).

3.1 (g) Análisis de la secuencia de DNA de los clones de cDNA

Los clones de cDNA potenciales de la cadena pesada y ligera identificados por hibridación se recogieron de la placa maestra y se utilizaron para preparación de DNA plasmídico en gran escala. Cada clon se utilizó para inocular 200 ml de caldo L más ampicilina en un matraz cónico de 500 ml. Los cultivos se incubaron, con agitación mediante sacudidas a 37ºC durante una noche. Después del crecimiento, las células de cada cultivo se redujeron a un sedimento por centrifugación a 5000 X g durante 10 minutos en una centrífuga Sorvall RC5C con rotor GS3 a 4ºC. El sedimento de células procedente de cada cultivo se resuspendió en 20 ml de tampón TE y se centrifugó de nuevo a 2000 X g durante 10 minutos en una centrífuga Sorvall RC5C con rotor SS-34 en un tubo Oak-Ridge a 4ºC. Cada sedimento de células lavado se resuspendió en 3 ml de sacarosa al 25% enfriada en hielo, Tris 50 mM, pH 8,0, y se dejó en hielo. Se añadió solución reciente de lisozima (1,0 ml a 10 mg/ml), se mezcló el contenido por rotación del tubo y se continuó la incubación durante 5 minutos. Se añadió solución de etilenodiamina-tetraacetato de sodio (EDTA) (1,0 ml a 0,5 mM, pH 8,5) y el contenido se mezcló suavemente. Por último, se añadieron 5,0 ml de solución de Triton X enfriada en hielo (0,1% Triton X-100, EDTA 62,5 mM, Tris 50 mM, pH 8,0), se mezcló suavemente el contenido y se continuó la incubación en hielo durante 10 minutos más. El residuo de células se redujo luego a un sedimento por centrifugación a 39.000 X g durante 30 minutos en una centrífuga Sorvall RC5C con rotor SS-34 a 4ºC. El sobrenadante que contenía el DNA plasmídico se añadió a 16 g de cloruro de cesio y 150 \mul de solución de bromuro de etidio (10 mg/ml) y el volumen se incrementó a 18,5 ml por adición de tampón TE. Esta solución se transfirió a un tubo de centrífuga de polipropileno con tapón de cápsula de 18,5 ml (Sorvall Instruments). El tubo se cerró herméticamente y se centrifugó a 180.000 X g durante 16 horas un rotor Sorvall TV865B (de titanio, vertical) y centrífuga OTD65B a 18ºC.

Después de la centrifugación, el DNA plasmídico era visible como una banda diferenciada de color anaranjado en el gradiente de densidad CsCl/EtBR que se había formado. El DNA plasmídico se retiró del gradiente utilizando una jeringuilla hipodérmica para perforar la pared del tubo. La muestra tomada del gradiente se diluyó 3-4 veces con tampón TE y se precipitó el DNA por adición de un volumen igual de alcohol ispropílico e incubación de hielo durante 10 minutos. El DNA precipitado se redujo a un sedimento por centrifugación a 17.000 X g en una centrífuga Sorvall RC5C con rotor SS-34 a 4ºC y se desechó el sobrenadante. El sedimento resultante se lavó en etanol al 70% (v/v) y se re-centrifugó durante 5 minutos. El sedimento se secó luego a vacío, se resuspendió en 1,8 ml de tampón TE y 200 \mul de solución de acetato de sodio 3 M y se extrajo con un volumen igual de fenol utilizando centrifugación a 17.000 X g durante 2 minutos para separar las fases. La fase acuosa se re-extrajo con un volumen igual de cloroformo antes de precipitar el DNA por adición de un volumen igual de etanol a -20ºC e incubación en hielo durante 10 minutos. El DNA purificado se redujo a un sedimento como anteriormente, se lavó en etanol al 70% y el sedimento se secó a vacío. El sedimento secado se resuspendió en 500 \mul de agua bidestilada y se estimó la concentración de DNA por barrido de una muestra diluida desde 300 a 220 nm en un espectrofotómetro UV utilizando un coeficiente de extinción de 50 \mug/ml/DO a 260 nm.

Este DNA plasmídico purificado se utilizó luego para análisis de la secuencia de DNA. El DNA bicatenario puede utilizarse para análisis de la secuencia del DNA por el método de terminación de cadenas didesoxi de Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1977, p 5463) utilizando un estuche de secuenciación patentado tal como el estuche Sequenase suministrado por United States Biochemical Company y utilizado de acuerdo con los protocolos proporcionados.

Partes alícuotas (2-4 \mug) de DNA plasmídico de los clones de cDNA de las cadenas pesada y ligera se utilizaron para análisis de la secuencia de DNA. Cada parte alícuota se desnaturalizó inicialmente por incubación con NaOH 0,2 M, EDTA 0,2 mM en un volumen final de 100 \mul a la temperatura ambiente durante 10 minutos. El DNA desnaturalizado se precipitó luego por adición de 10 \mul de acetato de sodio 3 M (pH 5,0) y 275 \mul de etanol, e incubación en hielo durante 10 minutos. El DNA precipitado se recuperó como se describe anteriormente para el DNA plasmídico. El DNA desnaturalizado se cebó luego para secuenciación por incubación de cada uno con 0,5 pmoles de un iniciador apropiado en presencia de tampón de reacción Sequenase (Tris 40 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 25 mM, NaCl 50 mM) y dimetil-sulfóxido (DMSO) al 10% a 65ºC durante 2 minutos, seguido por enfriamiento gradual hasta por debajo de 30ºC. Estos moldes cebados se utilizaron luego en reacciones de secuenciación de acuerdo con los protocolos proporcionados con DMSO al 10% añadido a las mezclas de marcación y terminación.

Las reacciones de secuenciación se realizaron por autorradiografía después de electroforesis en gel de poli-acrilamida de alta resolución (Sanger y Coulson, 1978, FEBS Lett. 87, p. 107).

Las secuencias completas de las cadenas pesada y ligera de los cDNAs clonados se dan a continuación (SEQ ID NO: 23 para el cDNA de la cadena H, SEQ ID NO: 36 para los aminoácidos con alineamiento entre ellos en la Figura 15 y análogamente SEQ ID NO: 24 muestra el cDNA de la cadena L, SEQ ID NO: 37 muestra la secuencia de aminoácidos y la Figura 16 muestra la alineación entre ellos). La autenticidad de estas secuencias codificantes se confirmó por comparación con la secuencia de proteínas N-terminal deducida de la proteína del anticuerpo purificada. La secuencia de DNA confirma también que el anticuerpo es un isotipo IgG1 kappa.

3.2 Expresión del anticuerpo 55.1 entero en células de mieloma

El ejemplo siguiente describe la expresión del anticuerpo 55.1 a partir de células de mieloma utilizando secuencias clonadas en pRc/CMV (Figura 8).

pRc/CMV (Fig. 8) utiliza las secuencias intensificadora/promotora del gen precoz inmediato del citomegalovirus (CMV) humano para la transcripción de alto nivel, un gen de resistencia a la neomicina para la selección de líneas de células estables resistentes al sulfato de Geneticina (G418), sitios de enzimas de resticción únicos (HindIII, BstXI, NotI, XbaI y ApaI) aguas debajo de la secuencia promotora y las secuencias de señal de poliadenilación/terminación de la transcripción procedentes de la hormona de crecimiento de los bovinos 3' respecto a los sitios de clonación.

3.2 (a) Subclonación en pRc/CMV

Los cDNAs de 55.1 son escindibles, intactos, por el vector pBluescript en un fragmento NotI. Cada fragmento puede clonarse subsiguientemente en el sitio NotI de pRc/CMV independientemente para permitir la expresión del promotor CMV.

Partes alícuotas de los diversos DNAs, pRc/CMV (3 \mug), p55.1H (5 \mug) y p55.1L (10 \mug), se digieren por separado en una solución que contiene NotI (5 u/\mug), Tris-acetato 10 mM (pH 7,5), acetato de magnesio 10 mM, acetato de potasio 50 mM y 0,1% de Triton X-100 que se incuba a 37ºC durante un mínimo de 1 hora. Además, el material digerido con NotI de pRc/CMV se trata subsiguientemente con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (2 u, Pharmacia Biotechnology Ltd.) en la misma solución a 37ºC durante 40 minutos y desactivación de la enzima a 80ºC durante 15 minutos. Esto tiene por objeto impedir la recircularización del vector después de la ligación. El resultado de la digestión completa se realiza por electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos de DNA apropiados (banda de vector pRc/CMV, 5,5 Kpb, e inserciones H y L de 55.1, 1,5 Kpb y 800 pb respectivamente) se escinden a partir del gel y se purifican como anteriormente.

Cada fragmento de cDNA de 55.1 se liga, como se ha descrito arriba, con el fragmento vector pRc/CMV en reacciones separadas. El DNA ligado se utiliza para transformar células DH5\alpha competentes, y los clones resistentes a la ampicilina se recogen para preparación de DNA plasmídico y análisis de enzimas de restricción con NotI para identificar los clones pRc/CMV con las inserciones de las cadenas H y L de 55.1. Se utiliza luego la PCR para identificar subsiguientemente clones con la orientación de inserción correcta para la expresión a partir de aquéllos que tienen la inserción NotI apropiada. Una colonia de cada clon supuesto se suspende de nuevo en 1 ml de agua bidestilada. Las células se reducen luego a un sedimento por microcentrifugación a 6000 rpm durante un minuto, se desechan 800 \mul del sobrenadante y el sedimento de células se resuspende en los 200 \mul restantes. Las células se desintegran luego por incubación a 100ºC durante un minuto y el material insoluble se reduce a un sedimento a 12000 rpm en una microcentrífuga durante 2 minutos. Se utiliza luego 1 \mul del sobrenadante clarificado en una reacción PCR de 20 \mul que contiene un iniciador promotor T7 (SEQ ID NO: 7) y o bien un iniciador interno de la cadena H (SEQ ID NO: 8) para los clones de la cadena H o un iniciador interno de la cadena L (SEQ ID NO: 6) para los clones de la cadena L, dNTPs 200 \muM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,01% de gelatina y 0,5 u de polimerasa Taq (Amplitaq) y se recubren con 20 \mul de aceite mineral ligero (Sigma Chemical Company Ltd.). Se disponen reacciones de control sin DNA alguno para detectar la contaminación de las soluciones de reactivos. Todas las reacciones se incuban a 94ºC durante 1,5 minutos, 50ºC durante 1,0 minutos, y 72ºC durante 2 minutos durante 20 ciclos más 10 minutos a 72ºC en un termocontrolador programable (Techne PHC-1). Los puntos PCR se analizan por paso de la mezcla de reacción entera sobre un gel de agarosa 0,8%. Los clones con la orientación correcta de los fragmentos para la expresión se identifican por la presencia de un producto PCR (\sim900 pb para la cadena H y \sim600 pb para la cadena L) cuando se comparan con reacciones de control. Los clones con la orientación incorrecta de los fragmentos no dan un producto PCR debido a que ambos oligonucleótidos inician la misma cadena de DNA. Un solo clon de la cadena H con la orientación correcta se designa pRc/55.1H y un clon con la cadena L correcta pRc/55.1L.

Las preparaciones de plásmidos en gran escala como se ha descrito arriba se analizan utilizando estos clones para proporcionar DNA suficiente para transfección de células de mieloma. Antes de la transfección, se digiere una muestra (50 \mug) de cada DNA plasmídico (pRc/55.1H, pRc/55.1L y pRc/CMV) hasta digestión completa con BglII en una solución que contiene 25 u de BglII, Tris-HCl 6 mM, pH 7,9, MgCl_{2} 6 mM, NaCl 100 mM y DTT 1 mM a 37ºC durante un mínimo de 1 hora. BglII causa la linealización del DNA plasmídico en un punto situado fuera de las secuencias de anticuerpos y elementos de control importantes y debería facilitar la integración de la casete de expresión en el genoma hospedador.

3.2 (b) Transfección de las células de mieloma

Existen varios métodos para la introducción de DNA en células eucariotas (Bebbington, C. 1991, Methods, vol 2, p 136-145). La electroporación ha llegado a ser un método utilizado rutinariamente en fecha más reciente, reemplazando a la coprecipitación de DNA con fosfato de calcio. Sin embargo, el último método tiene la ventaja de producir una mayor frecuencia de integración del DNA plasmídico en el DNA cromosómico y se ve favorecido en este caso cuando se requiere la cointegración de dos plásmidos, cada uno de los cuales lleva el mismo marcador de resistencia. Se espera que una proporción de colonias resistentes a G418 producidas después de co-transfección de los plásmidos que llevan las cadenas H y L expresará moléculas de anticuerpo funcionales. Células de mieloma NSO (Methods in Enzymology, 1981, 73B, p. 3. ECACC cat. no. 85110503) son una célula hospedadora adecuada para este trabajo debido a la ausencia de cualquier proteína endógena de anticuerpo secretada.

El procedimiento utilizado está basado en el de Gorman (1986, DNA Cloning, vol 2, p 143, Academic Press, Nueva York). Células NSO en crecimiento exponencial en medio no selectivo (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco, Life Technologies Ltd, más 10% de suero de ternero fetal procedente de una fuente acreditada) se siembran en cápsulas petri de 9 cm a una densidad de 5 \times 10^{5} por cápsula en 10 ml de medio de crecimiento no selectivo y se incuban a 37ºC durante 24 h. Inmediatamente antes de la transfección, el DNA plasmídico se co-precipita con fosfato de calcio. El DNA plasmídico linealizado (pRc/55.1H y pRc/55.1L) se mezcla en proporciones iguales (2,5, 5 ó 10 \mug de cada uno) en 0,5 ml de solución acuosa que contiene CaCl_{2} 62 mM. Cada mezcla se añade luego gota a gota a 0,5 ml de solución 2 x HBS (NaCl 280 mM, Na_{2}HPO_{4} 2,8 mM, Hepes 46 mM, pH 7,1) con agitación continua. Se borbotea luego aire a través de la mezcla para favorecer la formación del precipitado fosfato de calcio-DNA.

Se retira el medio de crecimiento de las células NSO, que se lavan luego con 10 ml de medio exento de suero, que se desecha también. El precipitado fosfato de calcio-DNA se añade a una cápsula petri de células junto con 1 ml de medio exento de suero. Se utilizan varias proporciones diferentes de los dos plásmidos de expresión y dos cantidades diferentes (5 y 10 \mug) de pRc/CMV como controles. Se prepara también un control sin DNA alguno. Las células se incuban en presencia del precipitado durante 4 h a 37ºC con sacudidas ocasionales para evitar que se resequen áreas de la placa. El precipitado se separa luego de las células y se reemplaza con 3 ml de glicerol al 15% en 1 x HBS durante 1,5 minutos a 37ºC antes del lavado con 10 ml de medio exento de suero. Las células se incuban luego en 10 ml de medio no selectivo a 37ºC durante 24 h.

El medio selectivo (DMEM más 10% FCS y 1,5 mg/ml de sulfato de geneticina G418, Life Technologies Ltd.) se aplica a las células transfectadas después de 24 h y las células se mantienen bajo esta selección hasta la aparición de colonias resistentes a G418. Se recogen luego las colonias y se sub-cultivan bajo selección con G418 para el análisis de la expresión de anticuerpos por ELISA (véase más adelante).

3.3 Expresión de fragmentos de 55.1 en E. coli

Los ejemplos siguientes describen la expresión de fragmentos quiméricos Fab' y F(ab')2 (con regiones humanas constantes) y un Fv monocatenario (scFV) de 55.1 procedente de vectores plasmídicos en E. coli.

3.3 (a) Sistemas vectores

Vectores de expresión plasmídicos que permiten la secreción de fragmentos de anticuerpo en el periplasma de E. coli han sido descritos por varios grupos (Skerra, A. et al, 1991, Bio/Technology vol 9, p 273-278. Carter, P. et al, 1992, Bio/Technology vol 10, p 163-167. Better M. et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol 90 p 457-461). Éstos están constituidos generalmente por un promotor regulable (lac araB, lpp, etc) que dirige la co-expresión de fragmentos de cadena Fd' y L, cada uno con su propia secuencia conductora de secreción (pelB, ompA, etc) en un fondo vector (pAT153, pUC19, etc) que permite la selección y replicación dentro de un hospedante E. coli seleccionado. Los autores de la presente invención han construido un vector de este tipo por introducción de un elemento promotor/represor araB/C derivado por PCR a partir de Salmonella typhimurium en un vector basado en pAT153 con un gen de resistencia a Tc, secuencia terminadora de la transcripción T4 y función de estabilidad (ilegible) (ref). Dos secuencias conductoras pelB y secuencias CH1 y CK humanas se derivaron de pSW1FabD1.3 (Skerra, A. et al 1991, Anal. Biochem. vol 196, p 151-155). Adicionalmente, las secuencias conductoras pelB se modificaron por mutagénesis orientada para introducir sitios de restricción únicos. La secuencia pelB situada aguas arriba del fragmento de la cadena H se modificó para introducir un sitio NcoI único, a saber

5' ...TCGCTGCCCAACCAGCCATGGCC 3'

donde la base subrayada representa una sustitución de G por C con respecto a la secuencia original para crear el sitio NcoI (CCATGG).

Un vector con una secuencia conductora pelB simple que incluye el sitio NcoI arriba mencionado y las características del otro vector (pICI266) ha sido depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en las National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1 RY, Escocia, Reino
Unido.

Análogamente, se introdujo una SfiI única en la segunda secuencia conductora pelB aguas arriba de la cadena L, es decir

5' ...TCGCGGCCCAACGGCCCAGGCC 3'

donde las bases subrayadas representan sustituciones de bases que introducen el sitio SfiI (GGCCCAACCGGCC) e impiden la creación de un segundo sitio NcoI. Este último cambio requiere la sustitución de un aminoácido (Met a Gln) que no se espera afecte a la secreción dado que la porción C-terminal (Ala-Gln-Ala) es ahora idéntica a la del conductor ompA.

Estas modificaciones permiten la inserción de regiones V de anticuerpo aguas arriba de y en marco con las regiones C apropiadas en un fragmento NcoI-BstEII para VH y un fragmento SfiI-XhoI para VL. Este plásmido tiene la ventaja sobre los vectores descritos previamente de que las regiones V de diferentes anticuerpos pueden insertarse sin sustituciones de aminoácidos N-terminales.

La secuencia CH1 se modificó también a partir del vector original pSW1Fab por la re-introducción de un residuo cys para la interacción de la cadena L, la bisagra completa y una extensión en CH2 para promover la dimerización. Esto se consiguió por inserción de secuencias sintéticas de oligonucleótidos entre los sitios SalI y SphI de la secuencia original (SEQ ID NO: 9 y 10) seguido por inserción de secuencias de oligonucleótidos sintéticos adicionales (SEQ ID NO: 11 y 12) entre los sitios PmlI y HpaI de la primera inserción.

El residuo cys C-terminal en CK se restauró también por mutagénesis orientada para permitir la interacción covalente entre las cadenas Fd y L.

El plásmido pICI1646 se muestra en la Figura 2.

3.3 (b) Generación de clones que expresan Fab' y F(ab')2 de 55.1 3.3 (b)i Aislamiento de fragmentos de la región V de 55.1

Se diseñaron oligonucleótidos sintéticos (SEQ ID NO: 13-16) para aislar las regiones VH y VL de 55.1 a partir de clones de cDNA utilizando PCR. Los oligonucleótidos introducen también los sitios de clonación apropiados (NcoI y BstEII para VH y SfiI y XhoI para VL) a fin de permitir la clonación subsiguiente en pICI1646.

Se dispusieron PCRs que contenían 15 ng de DNA molde (clon de cDNA de la cadena H o L de 55.1 en pBluescript), 100 pmoles de cada oligonucleótido (SEQ ID NO: 13 y 14 para VH y SEQ ID NO: 15 y 16 para VL), en una reacción de 100 \mul que contenía dNTPs 200 \muM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,01% de gelatina y 2,5 u de polimerasa Taq (Amplitaq) y se cubrieron con 100 \mul de aceite mineral ligero. Se generaron reacciones de control sin cantidad alguna de DNA a fin de detectar la contaminación de las soluciones de reactivos. Todas las reacciones se incubaron a 94ºC durante 1,5 minutos, 50ºC durante 1,0 minutos, 72ºC durante 2 minutos durante 20 ciclos más 10 minutos a 72ºC en un termocontrolador programable (Techne PHC-1). Las PCRs se analizaron haciendo pasar una muestra de 5 \mul sobre un gel de agarosa al 0,8%.

El resto de las reacciones PCR que contenían fragmentos VH y VL se purificaron para eliminar los oligonucleótidos en exceso utilizando microconcentradores Centricon 100 con 3 lavados en 2 ml de agua bidestilada a 1000 x g durante 5 minutos cada uno (como se describe arriba). El producto retenido que contenía los fragmentos aislados de la región V se retuvo y el DNA se precipitó en etanol al 70% y acetato de sodio 0,3 M en hielo durante 10 minutos. Cada DNA se redujo luego a un sedimento por microcentrifugación a 13000 rpm durante 10 minutos, se lavaron los sedimentos en etanol al 70% y se secaron a vacío.

3.3 (b)ii Digestión con restricción del fragmento VH de 55.1

El producto VH de 55.1 aislado por PCR se digirió luego con BstEII por resuspensión en 200 \mul de una solución que contenía Tris-acetato 10 mM, pH 7,5, acetato de magnesio 10 mM, acetato de potasio 50 mM y 25 u de PstEII que se incubó a 65ºC durante 1 hora. Esta reacción se enfrió luego en hielo y se efectuó una digestión con NcoI por duplicación de las concentraciones de los componentes del tampón, adición de 50 u de NcoI e incubación a 37ºC durante 1 hora. El DNA de digerido se trató con resina Strataclean (Stratagene Ltd.) de acuerdo con los protocolos proporcionados para eliminar la contaminación de proteínas. El DNA se precipitó con etanol y se resuspendió luego en 20 \mul de agua bidestilada estéril.

El fragmento digerido se sometió luego a electro-foresis en un gel de agarosa GTG SeaPlaque al 0,75% (FMC Bio-Products) y cada fragmento se purificó del gel por extracción con fenol de acuerdo con el protocolo proporcionado. El DNA se precipitó luego con etanol y se resuspendió en 10 \mul de agua destilada estéril. Una muestra de 1 \mul de cada fragmento se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,8% para estimación de la concentración de DNA.

3.3 (b)iii Clonación del fragmento VH de 55.1 en pICI1646

Una muestra de 5 \mug de DNA de pICI1646 se digirió con BstEII y NcoI como para el fragmento VH de 55.1 anterior. El DNA digerido se purificó y se estimó la concentración de DNA como anteriormente.

Se generó luego una reacción de ligación de 10 \mul que contenía 100 ng del fragmento vector BstEII-NcoI, 50 ng del fragmento VH de 55.1 BstEII-NcoI y 2,5 u de DNA-ligasa T4 en Tris-HCl 30 mM, pH 7,8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM y ATP 1 mM. La reacción de ligación se incubó a 16ºC durante 2 horas antes de utilizar una parte alícuota de 1 \mul para transformar 20 \mul de células DH5\alpha de E. coli competentes (Life Technologies Ltd.) de acuerdo con los protocolos proporcionados por el suministrador. Las células transformadas se extendieron sobre una placa de agar L que contenía 10 \mug/ml de tetraciclina, que se incubó luego a 37ºC durante una noche.

Se recogieron seis colonias resistentes a la tetraciclina a partir de la placa de agar y se inoculó cada una en 10 ml de caldo L más 10 \mug/ml de tetraciclina. Estos cultivos se incubaron a 37ºC, con sacudidas, durante una noche antes de utilizarlos para preparación del DNA plasmídico empleando el método de Birnboim y Doly como se especifica en Maniatis (capítulo 1, p 38). Los clones potenciales VH de 55.1 se seleccionaron sobre la base de adquisición de un sitio de resticción único DraIII cuando se compararon con el plásmido originario. Se realizaron preparaciones de plásmido en mayor escala utilizando centrifugación en gradiente de densidad CsCl/EtBr (véase anteriormente bajo "Análisis de la secuencia de DNA de los clones de cDNA") a partir de 4 clones de este tipo y los clones se comprobaron por análisis de la secuencia de DNA de acuerdo con el método de Sanger como se proporciona en el estuche Sequenase (United States Biochemical Corp.). Un clon con la secuencia correcta se designó pICI1655.

3.3(b)iv Subclonación del fragmento VL de 55.1 en pICI1655

El fragmento VL de 55.1 aislado y el DNA plasmídico de pICI1655 (\sim5 \mug de cada uno) se digirieron con 25 u de SfiI en reacciones de 200 \mul que contenían Tris-HCl 10 mM, pH 7,9, MgCl_{2} 10 mM, NaCl 50 mM y DTT 1 mM, y se incubaron a 50ºC durante 1 hora. Subsiguientemente, se añadieron 24 u de XhoI a cada mezcla de digestión y se continuó la incubación a 37ºC durante 1 hora. Los productos resultantes de las digestiones se trataron luego con resina Strataclean, se precipitó el DNA con etanol, se resuspendió en 20 \mul de agua bidestilada estéril, se sometió a electroforesis en un gel de agarosa GTG SeaPlaque al 0,75% y el vector apropiado y los fragmentos VL se aislaron como se ha especificado arriba. La concentración de los fragmentos de DNA aislados se estimó después de hacer pasar partes alícuotas de 1 \mul sobre un gel de agarosa al 0,8%.

Se generó una ligación que contenía 100 ng del fragmento SfiI-XhoI de pICI1655 y 50 ng de fragmento SfiI-XhoI VL de 55.1 en las condiciones utilizadas para el VH de 55.1 anteriormente. La ligación se incubó a 16ºC durante 3 horas antes de utilizar 1 \mul para transformar las células DH5\alpha competentes en resistentes a la tetraciclina. Se seleccionaron ocho colonias resistentes a la tetraciclina para preparación de DNA plasmídico en pequeña escala. Estos DNA se escrutaron respecto a la pérdida de un sitio SstI único cuando se compararon con el vector originario. Se seleccionaron clones potenciales F(ab')2 de 55.1 para la preparación de DNA plasmídico en mayor escala y confirmación por análisis de los datos de secuencia de DNA como se ha detallado anteriormente. Un clon con las secuencias predichas de DNA de la región V de 55.1 se designó pICI1656.

3.3 (b)v Estudios de la expresión

Para el análisis de la expresión de los fragmentos de anticuerpo, se utilizó el DNA de pICI1656 para transformar las cepas de E. coli MC1000 (ATCC No. 39531) y MC1061 (ATCC No. 53338) [Casadaban, M.J. y Cohen, S.N., 1980, J. Mol. Biol., vol 138, p 179-207]. Éstas son cepas ara- que no son capaces de metabolizar la arabinosa utilizada para inducir la expresión a partir del promotor araB. Se prepararon células competentes a partir de estas dos cepas y se transformaron para resistencia a la tetraciclina de acuerdo con los métodos citados en Maniatis (capítulo 1, p 74-84). Los clones puros en cada cepa se utilizaron luego para análisis de la expresión por transferencia Western y ELISA de los sobrenadantes de cultivo.

3.3 (b)vi Preparación de los sobrenadantes de cultivo

Se inocularon MC1000 (pICI1656) y MC1061 (pICI1656) en 10 ml de caldo 2 X YT más 10 \mug/ml de tetraciclina y se incubaron a 37ºC, con sacudidas, durante una noche. Los cultivos nocturnos se pusieron luego (1 en 100) en 100 ml de caldo 2 X YT más tetraciclina. Estos cultivos se incubaron a 37ºC, con sacudidas durante 3 horas. Pasado este tiempo, se desconectó el calentador de la incubadora y se dejó que la temperatura descendiera hasta la del ambiente (25ºC) gradualmente (\sim1 hora). Se recogió una muestra de 10 ml de cada cultivo y se midió el valor DO_{540} (\sim0,7). Se centrifugó la muestra (10 minutos a 2500 X g) para reducir las células a un sedimento, y el sobrenadante se guardó a 4ºC como la muestra pre-inducción.

Se añadió solución de arabinosa (20% p/v) a cada cultivo hasta una concentración final de 1% (p/v) y continuó la incubación a la temperatura ambiente durante 3 horas. Después de este período, se tomó una segunda muestra de 10 ml (se midió el valor DO_{540}) (\sim0,85) y se centrifugó la muestra para reducir las células a un sedimento. El sobrenadante se guardó a 4ºC (muestra post-inducción).

3.3 (b)vii Análisis por transferencia Western

Se mezclaron partes alícuotas (15 \mul) de cada muestra sobrenadante con un volumen igual de tampón de muestra (Tris 62,5 mM, pH 6,8, 1% SDS, 10% de sacarosa y 0,05% de azul de bromofenol) con y sin reductor (DTT 50 mM). Las muestras se incubaron a 100ºC durante 15 minutos antes de electroforesis en un gel en gradiente de acrilamida 8-18% (sistema de gel Excel, de Pharmacia Biotechnology Products) en un aparato Multiphor (LKB Produkter AB) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Después de la electroforesis, las proteínas separadas se transfirieron a una membrana Hybond C-Super (Amersham International) utilizando un aparato Novablot (LKB Produkter AB) de acuerdo con los protocolos proporcionados por el fabricante. Después de la transferencia, la membrana se secó al aire.

La presencia de fragmentos de anticuerpo se detectó por el uso de un conjugado anticuerpo Cx anti-humano-peroxidasa (Sigma Chemical Company, producto A7164) con el sistema de detección ECL (Amersham International).

Los resultados del análisis por transferencia Western se muestran en la Figura 9. La expresión de fragmentos de anticuerpo es claramente detectable por la presencia de una señal en las muestras post-inducción comparadas con las muestras pre-inducción en blanco. En presencia de reductor, se detecta una sola banda de \sim25 kD que es coherente con las cadenas ligeras libres. En ausencia de reductor se ven bandas adicionales de \sim50 kD y 100 kD que son coherentes con la asociación covalente de cadenas de anticuerpos en los fragmentos Fab' y F(ab')2.

3.3 (b)viii Análisis ELISA

Están disponibles procedimientos estándar para el ensayo ELISA en "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", compiladores Burdon, R.H. y van Kippenberg, P.H., volumen 15, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Tijssen, P., 1985, Elsevier Science Publishers B.V. Otra fuente de información es "Antibodies-A Laboratoy Manual", Harlow, E. y Lane, D.P. 1988, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory.

Las muestras sobrenadantes se utilizaron en un ensayo ELISA para detectar la fijación a las células COLO 205 (Semple, T. et al, 1978, Cancer Res., vol 38, p 1345-1355, ATCC No. CCL 322). Las células COLO 205 cultivadas en medio exento de suero (Zeneca Pharmaceuticals ref. M1) se fijaron a placas de microtitulación de 96 pocillos (10^{5} células por pocillo) utilizando aldehído glutárico (solución al 0,1% v/v en PBS). Los sobrenadantes de cultivo se añadieron a los pocillos y se incubaron a 4ºC durante \sim70 horas para permitir la fijación de los fragmentos de anticuerpo. Después de lavado del PBS con 1% (p/v) de BSA y 0,5% (v/v) de Tween 20, se utilizó el conjugado anticuerpo Cx anti-humano-peroxidasa (véase arriba) para detectar los fragmentos de anticuerpo fijados utilizando o-fenilenodiamina (Sigma Chemical Company Ltd.) para revelado del color que se midió luego en un lector de placas ThermoMax (Molecular Devices) a 490 nm. Los resultados del ensayo ELISA se muestran en la Fig. 10. La fijación específica a COLO 205 por los fragmentos del anticuerpo 55.1 se detecta en sobrenadantes de cultivo MC1000 y MC1061 inducidos (pICI1654) comparados con muestras no inducidas y controles con la expresión de otros fragmentos de anticuerpo con especificidades alternativas de COLO 205.

3.3 (c) Generación de un scFv de 55.1

La generación rápida de fragmentos scFv de los anticuerpos utilizando PCR ha sido descrita (Davis, G.T. et al, 1991, Bio/Technology, vol 9, p 165-169). La construcción está basada en el enlace de las regiones VH y VL del anticuerpo por un enlazador flexible de péptidos que permite el plegado de las regiones V en una conformación activa. Se generan por PCR regiones VH y VL separadas que contienen el fragmento enlazador, y se utiliza luego la complementariedad de las regiones del enlazador para crear un gen que codifica el scFv en una PCR subsiguiente.

3.3 (c)i Construcción de un clon que expresa scFv de 55.1

Se diseñaron oligonucleótidos (SEQ ID NO: 13 y 16-20) para actuar como iniciadores de PCR. El oligonucleótido 20 codifica una secuencia enlazadora (Gly4Ser)3 y tiene también complementariedad para la región 5' de las regiones VL del anticuerpo en su extremo 3'. El oligonucleótido 21 es el complemento de la secuencia enlazadora y tiene complementariedad para la región 3' de las secuencias VH del anticuerpo. Otro oligonucleótido (SEQ ID NO: 21) se diseñó para ser complementario a la región 3' de VL de 55.1 con la adición de codones de terminación de la traducción en marco y un sitio de clonación EcoRI.

Las regiones VH y VL de 55.1 se aislaron por PCR como se ha descrito arriba en la construcción del clon de expresión de F(ab')2 de 55.1 utilizando los oligonucleótidos 13 y 17 para VH y 16 y 18 para VL. Estos fragmentos (\sim0,2 pmoles de cada uno) se mezclaron con los oligonucleótidos 19 y 20 (0,1 pmoles de cada uno) en una reacción PCR de 50 \mul que contenía dNTPs 200 \muM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,01% de gelatina y 1,25 u de polimerasa Taq (Amplitaq) y cubierta con 50 \mul de aceite mineral ligero. Se generó también una reacción de control sin las regiones V. Estas reacciones se incubaron a 94ºC durante 1 minuto y 63ºC durante 4 minutos durante 7 ciclos. Después de esta incubación, se añadieron 50 \mul más de una disolución que contenía 100 pmoles de los oligonucleótidos 13 y 21 y dNTPs 200 \muM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,01% de gelatina y 1,25 u de polimerasa Taq (Amplitaq) y se continuó la incubación a 94ºC durante 1,5 minutos, 50ºC durante 1,0 minutos y 72ºC durante 2,5 minutos durante 25 ciclos más 10 minutos a 72ºC.

El análisis de las reacciones PCR por electroforesis en gel de agarosa confirmó la presencia de un fragmento supuesto scFv (\sim750 pb) en comparación con la reacción PCR de control. El fragmento se purificó, se digirió con NcoI y EcoRI y se clonó en pICI1646 por los procedimientos descritos para la construcción del clon de expresión de F(ab')2 anteriormente. Los clones capaces de expresar el scFv se identificaron subsiguientemente por la presencia de un fragmento NcoI-EcoRI de 750 pb y se confirmaron por análisis de la secuencia de DNA.

3.3 (c)ii Inserción de una secuencia marcadora

La detección del fragmento scFv en transferencia Western y ELISA no es posible con reactivos convencionales. Por adición de un péptido marcador en el termino c, podrían facilitarse dichos análisis. Un decapéptido marcador c-myc reconocido por el anticuerpo procedente del hibridoma myc1-9E10 (al que se hace referencia también como 9E10, Munro, S. y Pelham H., 1986, Cell, vol 46, p 291-300, ECACC No. 85-102202, ATCC No. CRL 1729) puede utilizarse para tales propósitos. Este marcador está disponible sobre un fragmento XhoI-EcoRI del plásmido pSW1D1.3VH.VK.marcador (Ward, E.S. et al, 1989, Nature, vol 341, p 544-546) o puede sintetizarse como un par de oligonucleótidos complementarios (véase la Figura 18 y SEQ ID NO: 25 y 35).

Un fragmento XhoI-EcoRI de pSW1D1.3VH.VK.marcador se purificó y se clonó en el clon de expresión de scFv descrito arriba digerido con XhoI y EcoRI utilizando técnicas estándar. La presencia del marcador en el término c del scFv se confirmó por análisis de la secuencia de DNA. Un clon con la construcción correcta se designó pICI1657.

3.3 (c)iii Estudios de expresión

Después de la transformación de las cepas MC1000 y MC1061 con el DNA del plásmido pICI1657, se realiza el análisis de la expresión por transferencia Western (Figura 11) y el ensayo ELISA (Figura 12) de los sobrenadantes de cultivo como se ha descrito arriba excepto que la detección se realiza por incubación con el anticuerpo 9E10 seguido por una incubación adicional durante 2 horas con un conjugado anticuerpo anti-ratón-peroxidasa (Sigma Chemical Company, producto A9044) antes de la adicción de un sustrato oxidable.

Ejemplo 4 Preparación de estructuras de fijación del antígeno F(ab)_{2} derivadas enzimáticamente

El anticuerpo 55.1 se escindió satisfactoriamente por proteólisis utilizando papaína para producir el fragmento

\hbox{F(ab)2 como se expone a
continuación.}

15 mg de anticuerpo 55.1 a una concentración de 3 mg/ml se dializaron contra tampón EDTA 3mM/acetato de sodio 100mM de pH 5,5 durante una noche a 4ºC. Se diluyeron 2 mg (= 200 \mul) de papaína [suspensión de 10 mg/ml obtenida de Boehringer Mannhein GmbH, Mannhein, Alemania, Cat. No. 108014] con 200 \mul de EDTA 3 mM/acetato de sodio 100 mM/cisteína 100 mM de pH 5,5, y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. El exceso de cisteína se separó de la papaína reducida por cromatografía del material digerido, a 4ºC, en una columna de 5 ml de Sephadex G25 [Pharmacia, Uppsala, Suecia] en tampón EDTA 3 mM/cloruro de sodio 100 mM, pH 5,5. Se recogieron las fracciones y se observaron por adsorción UV (A 280 nm) para localizar la papaína reducida eluida. La concentración de papaína reducida se calculó utilizando un coeficiente de extinción de 2,5.

Se añadió una parte alícuota de 500 \mug de papaína reducida al anticuerpo 55.1 predializado en una relación de enzima a anticuerpo de 1 en 30. Se purgó luego el recipiente con nitrógeno y la mezcla se incubó durante 20 h a 37ºC en un baño de agua. La reacción ulterior se interrumpió por la adicción de 0,5 ml de N-etil-maleimida 100 mM.

El material digerido bruto se sometió a intercambio en tampón glicina 1,5 M/cloruro de sodio 3 M, pH 8,9, por diálisis durante una noche a 4ºC y se cargó en una columna de 5 ml de Proteín A Fast Flow Sepharose [Pharmacia, Uppsala, Suecia], equilibrada previamente en el mismo tampón. La columna se lavó con 3 volúmenes de columna de tampón glicina/sal común, 3 volúmenes de columna de fosfato de sodio 100 mM de pH 6,0 y por último 3 volúmenes de columna de citrato de sodio 100 mM de pH 3,0, recogiendo las fracciones y observando el eluyente por absorbancia UV a 280 nm. El F(ab)2 no se fija a la Proteína A y se eluye en el lavado glicina/sal común, en tanto que los fragmentos menores se eluyen en el lavado de fosfato y el anticuerpo sin digerir en el lavado con citrato, como se determina por SDS-PAGE. Las fracciones que contenían F(ab)2 se agruparon y se dializaron en solución salina tampoanada con fosfato (fosfato de sodio/cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2) que contenía EDTA 3 mM para almacenamiento.

Ejemplo 5 Preparación de inmunoconjugados 5.1 Inmunoconjugados del anticuerpo 55.1

Una solución del anticuerpo monoclonal 55.1 (200 mg) en solución salina tampoanada con fosfato (fosfato de sodio/cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2) a 4,4 mg/ml se concentró hasta 12 mg/ml por filtración a través de membrana (membrana Amicon YM10, Amicon Ltd., Stonehouse, Gloucs., Reino Unido) a 4ºC. El concentrado se diluyó con 0,5 volúmenes de tampón de borato (borato de sodio 100 mM, pH 9,1). La concentración de proteína se determinó por observación de la absorbancia a 280 nm, apreciándose que el pH de la solución mixta era 8,8 \pm 0,1.

Se disolvió N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-buti-rato (el "enlazador") en dimetilformamida redestilada seca o acetonitrilo con una concentración de 10 mg/ml. Se añadió inmediatamente a la solución concentrada de anticuerpo una parte alícuota de esta solución (0,352 ml), que contenía 3,52 mg de N-succinimidil-3-(2-piridil-ditio)-butirato. La solución resultante se mezcló y se dejó luego en reposo a 15ºC durante 1 hora. La solución se desaló después por cromatografía de permeación en gel en una columna de 2,6 \times 58 cm de G25 Sephadex (Pharmacia, Uppsala, Suecia) utilizando un caudal de 2 ml/min y un tampón fosfato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 150 mM/EDTA 1 mM, de pH 8,0, para eliminar los reactivos en exceso e intercambiar el tampón del anticuerpo derivatizado. Alternativamente, los productos de reacción pueden separarse por filtración en flujo cruzado. Se reunió el anticuerpo derivatizado desalado y se determinó la concentración de proteína por observación de la absorbancia UV a 280 nm. La extensión de la derivatización con el enlazador se determinó por la adición de un exceso de ditiotreitol y observación de la liberación de grupos tiopiridilo libres a 343 nm. Se encontró que la extensión de derivatización era 4 a 6 grupos enlazadores por mol de anticuerpo.

Se redujo ricina A recombinante por tratamiento de una solución de ricina A en tampón de fosfato a pH 8 con ditiotreitol en exceso y se concentró por filtración en flujo cruzado. Los reactivos en exceso se eliminaron por cromatografía de permeación en gel en una columna de 2,6 \times 58 cm de G25 Sephadex (Pharmacia, Uppsala, Suecia) utilizando un caudal de 2 ml/min y un tampón fosfato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 150 mM/EDTA 1 mM,

\hbox{pH 8,0.}

La ricina A recombinante se conjugó al anticuerpo derivatizado por mezcla de ricina A recombinante preparada (190 mg) y soluciones de anticuerpo derivatizado (190 mg) en una relación 1:1 p/p de ricina A/anticuerpo derivatizado. Se añadió glicerol al 20% v/v y el recipiente se purgó con argón. La solución resultante se mantuvo a 15ºC durante 40 a 65 horas.

Se añadió luego cisteína a una concentración final de 0,2 mM (y un exceso al menos 10 veces molar sobre los grupos enlazadores en el anticuerpo) con objeto de proteger terminalmente el exceso de grupos enlazadores en el anticuerpo. La solución se mezcló y se mantuvo a 20ºC durante 2-3 horas. Después de la protección terminal con cisteína, se analizó una muestra de la inmunotoxina resultante por tratamiento con ditiotreitol en exceso, y se observó a 343 nm para cuantificar la culminación de la reacción.

La solución que contenía el conjugado se concentró luego por filtración a través de membrana (membrana Amicon YM10, Amicon Ltd., Stonehouse, Gloucs., Reino Unido) y se aplicó a una columna cromatográfica de permeación en gel de 2,6 \times 50 cm (Pharmacia HR300 Sephacryl, Pharmacia, Uppsala, Suecia) a un caudal de 3 ml/min en tampón fosfato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 25 mM/EDTA 1 mM. La eficiencia de este paso se observó por medida en línea de la absorción UV del efluente de la columna a 280 nm y da como resultado la separación de la inmunotoxina y el anticuerpo no conjugado de la ricina A no conjugada. El pico que contenía la mezcla de inmunotoxina y anticuerpo se reunió y se determinó la concentración de proteína por observación de la absorbancia a 280 nm.

La solución resultante que contenía a la vez el anticuerpo no conjugado y la inmunotoxina se ajustó a pH 6,3 por la adición de HCl 1 M y se aplicó a una columna de 8 \times 26 cm de matriz de colorante triazina Mimetic A6XL, (ACL plc, Cambridge, Reino Unido), a un caudal de 1,5 ml/min. La columna se lavó con 100 ml de tampón inicial que eluye el anticuerpo no conjugado y se eluyó la inmunotoxina con tampón inicial que contenía cloruro de sodio 0,5 M. La solución de inmunotoxina se dializó contra solución salina tamponada con fosfato, se filtró a través de un filtro de 0,22 micrómetros y se guardó a 4ºC.

La pureza de la inmunotoxina se determinó por electroforesis en SDS-poliacrilamida y contenía un total de 45 mg de inmunotoxina con la composición: 50 a 60% de derivado mono-ricina A, 10 a 30% de derivado di-ricina A, 5 a 15% de derivado tri-ricina A y <10% de anticuerpo no derivatizado.

Alternativamente, el paso de filtración en gel (eliminación de la r-ricina A residual) y el paso de cromatografía de afinidad de colorante (eliminación del anticuerpo 55.1 residual) pueden transponerse en la secuencia de purificación. En esta variación del método, la mezcla de conjugación, inmediatamente después del bloqueo con cisteína de los restos enlazadores que no han reaccionado (como se describe arriba) se diluye a una conductividad inferior a 5 mS con agua destilada. Se ajusta luego el pH a 6,0 con ácido acético 1 M y se clarifica la solución por filtración a través de membrana. Se aplica luego la solución a la columna de ligando de colorante (2,5 ml gel/mg de r-ricina A utilizados en la mezcla de conjugación). La columna se lava luego con acetato de sodio al 0,68% de pH 6,0 hasta que el anticuerpo 55.1 no conjugado se ha lavado a través de la columna. La inmunotoxina y la r-ricina A residual pueden eluirse luego de la columna en tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,0, 0,5 M con respecto a la concentración de cloruro de sodio. Este producto eluido se concentra luego por filtración en flujo cruzado utilizando un sistema de ultrafiltración en cartucho espiral y se aplica a una columna de Sephacryl S300HR (2,5 ml de gel por cada mg de anticuerpo utilizado en la reacción de conjugación original, y en un volumen <5% del volumen total de la columna). La columna puede equilibrarse en cualquier tampón de formulación adecuado tal como solución salina tamponada con fosfato de pH 7,2.

5.2 Inmunoconjugados de anticuerpo 55.1 F(ab)2

El fragmento F(ab)2 purificado se derivatizó inicialmente con ácido 3-(2-piridilditio)propiónico-N-hidroxisuccini-
mido-éster (SPDP, Sigma Chemical Company, St. Louis, EE.UU., Cat. No. P 3415). Se añadió un exceso molar de 8 veces de SPDP en acetonitrilo (10 mg/ml) a 90 mg de proteína F(ab)2 en borato de sodio 50 mH, cloruro de sodio 300 mM, pH 8,9 a una concentración de 4 mg/ml. Después de mezclar bien, se dejó transcurrir la derivatización a 24ºC durante 60 min sin agitación adicional. Se obtuvo un nivel de derivatización comprendido entre3 y 4 mol enlazador/mol fragmento de anticuerpo.

Se eliminó el exceso de enlazador por cromatografía de permeación en gel utilizando una columna de 200 ml de Pharmacia Sephadex G-25 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) equilibrada con fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, ácido etileno-diamina-tetraacético 1 mM, pH 8,0.

Se añadieron 100 mg de la cadena A de ricina purificada exenta de reductor al fragmento F(ab)2 derivatizado en el tampón de fosfato 50 mM llevado a 20% (v/v) conrespecto a glicerol. El recipiente se purgó con nitrógeno exento de oxígeno antes de una mezcladura concienzuda. La reacción del conjugado se dejó transcurrir luego a 24ºC durante

\hbox{48
h.}

Los grupos enlazadores activados residuales en el fragmento F(ab)2 se bloquearon luego por tratamiento de la mezcla de reacción conjugada con cisteína 0,2 mM a una concentración de proteína de 4 mg/ml.

Los 25 mg de conjugado obtenidos después de la reacción de conjugación se purificaron de r-ricina residual y cisteína como se describe en el ejemplo anterior utilizando cromatografía en gel que implicaba una columna de 150 ml de Sephacryl S-300HR equilibrada con solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2. El F(ab)2 residual se separó por cromatografía de afinidad de colorante (ACL Mimetic Blue). La columna Mimetic Blue de 50 ml se equilibró en tampón de fosfato de sodio 50 mM, de pH 6,5. La mezcla de conjugado bruto se aplicó a la columna y el F(ab)2 no conjugado se lavó a su través con el tampón de fosfato 50 mM. El conjugado se eluyó con tampón de fosfato de sodio 50 mM de pH 6,5, con respecto a cloruro de sodio 500 mM. El rendimiento global del procedimiento fue 20%.

Ejemplo 6 Selectividad del Anticuerpo 55.1

La selectividad de una inmunotoxina es de importancia fundamental; el fracaso en fijarse a un antígeno asociado a tumor daría como resultado la falta de eficacia, y el direccionamiento no deseado a un tejido normal podría dar como resultado toxicidad para el tejido. Para evaluar la selectividad, se han escrutado muchos tejidos normales y tumorales humanos respecto a reactividad con el anticuerpo 55.1, utilizando inmunohistología indirecta sensible en tres etapas sobre secciones criostáticas congeladas fijadas con acetona.

La inmunohistología se llevó a cabo sobre secciones de tejido humano obtenidas o bien en cirugía de resección o post-mortem. Para preservar la morfología y antigenicidad óptimas, los tejidos se obtuvieron lo más recientes posible, se cortaron en pequeños fragmentos (aproximadamente 1 cm^{2}) y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido antes de guardarlos a -80ºC. Se cortaron secciones de 6 \muM de tejido en un criostato, se montaron sobre portaobjetos con unión a Vector (Vector Labs) y se fijaron en acetona enfriada con hielo durante 2 minutos antes de envolverlos en papel metalizado y guardarlos a -80ºC. Se dejó que los portaobjetos se descongelaran a la temperatura ambiente antes de desenvolverlos del papel metalizado inmediatamente antes de su utilización. Cada sección se perfiló con una Pluma PAP, y se añadieron a cada sección o bien 100 \mul de anticuerpo 55.1 diluido a 5 \mug/ml en Solución Salina Tamponada con Tris (TBS), 100 \mul de control MOPC isotipo (Sigma, Chemical Company, St. Louis, EE.UU., Cat. No. M 9269) a 5 \mug/ml en TBS, o 100 \mul de un control positivo apropiado tal como LP34 (Dako). Todas las incubaciones subsiguientes se realizaron a la temperatura ambiente durante 30 minutos en una cámara humidificada: todos los pasos de lavado se efectuaron en TBS con 2 cambios. Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron y se añadieron a cada sección 100 \mul de reactivo de segundo anticuerpo, que comprendía 1/50 inmunoglobulinas de conejo anti-ratón conjugadas a peroxidasa de rábano picante (Dako Patts) y 1/5 suero humano normal (Sigma) en TBS. Los portaobjetos se incubaron de nuevo y se lavaron en TBS. Se añadió a cada sección un anticuerpo de detección final, 100 \mul de inmunoglobulina de cerdo anti-conejo conjugada a peroxidasa de rábano picante (dilución 1/50 con suero humano normal 1/5 en TBS), se incubó y se lavó concienzudamente. El sustrato DAB se preparó utilizando una tableta de DAB (Sigma) con 17 \mul de peróxido de hidrógeno en 17 ml de TBS, y se añadió gota a gota a través de un papel de filtro Whatman Número 4. Después de 3 minutos de incubación, se vació cuidadosamente el exceso de DAB de los portaobjetos y los portaobjetos se lavaron en TBS. Después de contratinción con Hematoxilina de Mayer, las secciones de deshidrataron en alcoholes y xileno, y se montaron en E-Z Mount (Shandon) antes del examen bajo un microscopio.

Las áreas de fijación de anticuerpos se visualizaron por su tinción parda en la sección. Se utilizó un sistema de registro para evaluar el grado de fijación del anticuerpo 55.1 a los tejidos:

+++	= fijación de anticuerpo a > 75% de los tumores
++	= fijación de anticuerpo a 50-75% de las células tumorales
+	= fijación de anticuerpo a 25-50% de las células tumorales
+/-	= fijación de anticuerpo no focal a una pequeña área de células tumorales
-	= ausencia de tinción

Los datos del estudio de un panel de 18 tumores colo-rrectales individuales indicaron que el anticuerpo 55.1 se fija fuertemente a alrededor del 80% de los tumores (Tabla 3).

El análisis ulterior de la tinción reveló que en aproximadamente 50% de los tumores (aquéllos que tenían registros de ++ y +++), más del 50% de las células se teñían positivamente, y que la tinción era evidente en las membranas celulares baso-laterales y apicales. Así pues, una gran proporción de las células epiteliales dentro de un tumor particular deberían ser susceptibles de direccionamiento. Adicionalmente, la expresión baso-lateral debería favorecer el direccionamiento eficaz desde la sangre al antígeno.

Una extensa gama de tejidos humanos normales se han escrutado respecto a reactividad con 55.1 como se expone en la Tabla 4. Anticuerpos selectivos de este tipo son raros; únicamente 10/65.000 sobrenadantes de anticuerpo generados o escrutados, durante la invención de 55.1 han exhibido dicha extensión mínima de reactividad con los tejidos normales.

Ejemplo 7 Ensayo para la fijación competitiva a CA55.1 7-1 (a) Producción de preparaciones de membrana COLO 205 solubles

Todos los materiales utilizados deberían ser de la máxima calidad disponible. Se suspendió un sedimento de 10E9 células COLO 205 en 7 ml de tampón de lisis enfriado en hielo (2,5% Tween 40, Tris 10 mM, NaCl 0,14 M, PMSF 1 mM, NEM 1 mM, Pepstatina 100 \muM, pH 7,4) para dar un volumen total de 10 ml. La solución resultante se agitó durante 1 hora en un baño de hielo. Las células se homogeneizaron luego y se centrifugaron durante 10 min a 1500 g y 4ºC. El sobrenadante se aspiró y se centrifugó durante 1 hora a 100.000 g y 4ºC. Se añadieron al sedimento 5 ml de tampón de solubilización (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, octilglucosido 50 mM, NEM 10 mM, PMSF 1 mM, Leupeptina 0,1 mM, pH 7,4) y la suspensión resultante se agitó suavemente durante 30 minutos a 4ºC. La solución se centrifugó luego durante 20 minutos a 30.000 g. El sobrenadante, la preparación de membrana COLO 205 solubilizada, se aspiró y se guardó a 4ºC.

7.1 (b) ELISA de competición

Todos los materiales utilizados deberían ser de la máxima calidad disponible. Se diluye la preparación de membrana COLO 205 solubilizada en relación 1 a 100 con tampón de recubrimiento (Tris 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,4) para generar la solución stock de antígeno. Se pipetean en una placa de microtitulación 50 \mul de la solución stock de antígeno en seis pocillos por MAb para la medida. Se agita suavemente 2 h a la temperatura ambiente, o durante una noche a 4ºC. Se añaden 50 \mul de tampón de fijación (0,5% de aldehído glutárico en tampón de recubrimiento) a cada pocillo, se deja en reposo durante 3 minutos, se lava la placa con TBS (Tris 50 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 7,4). Se añaden 200 \mul de tampón de bloqueo (3% BSA en tampón de recubrimiento) a cada pocillo y se agita suavemente durante 1 h a la temperatura ambiente. Se preparan soluciones stock de MAb 55.1, marcadas con biotina (Charo et al. 1991, J. Biol. Chem. 266, p 1415-1421), y el MAb TEST en tampón de anticuerpos (1% BSA en tampón de recubrimiento). Estas soluciones stock se combinan luego para generar seis soluciones de anticuerpo que contienen los dos MAbs en las relaciones siguientes:

Solución de anticuerpo 1: 2 mg/ml 55.1 y 200 mg/ml MAb TEST.

Solución de anticuerpo 2: 2 mg/ml 55.1 y 20 mg/ml MAb TEST.

Solución de anticuerpo 3: 2 mg/ml 55.1 y 2 mg/ml MAb TEST.

Solución de anticuerpo 4: 2 mg/ml 55.1 y 0,2 mg/ml MAb TEST.

Solución de anticuerpo 5: 2 mg/ml 55.1 y 0,02 mg/ml MAb TEST.

Solución de anticuerpo 6: 2 mg/ml 55.1.

Al final del paso de bloqueo, la placa se lavó con TBS, y se pusieron 100 \mul de cada una de las soluciones de anticuerpo en un solo pocillo en cada fila. La placa se agitó luego suavemente durante 2 horas a la temperatura ambiente. Se lavó luego la placa con TBS, y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de solución del segundo anticuerpo (1 mg/ml de MAb enlazado con peroxidasa anti-biotina en tampón de anticuerpos) y se agitó suavemente durante 1 hora. A 99,5 ml de tampón citrato-fosfato (0,5 g ácido cítrico, 1.7g de hidrogenofostato disódico dodecahidratado en 100 ml de agua Milli-O) se añaden 0,5 ml de solución de peróxido de hidrógeno (1 g de Urea peróxido de hidrógeno (sic), en 15 ml de tampón citrato-fosfato) y 80 mg de dihidrocloruro de O-fenilenodiamina, para preparar la solución sustrato. La placa se lavó luego con TBS y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de solución sustrato, después de lo cual se agitó suavemente. Se observa el desarrollo del color a 495 nm. Cuando se alcanza una absorbancia máxima de 0,7 AUFS, se añaden a cada pocillo 50 \mul de solución de parada, se agita la placa suavemente durante 5 minutos y se lee la absorbancia final. La inhibición de la fijación de 55.1 por el MAb TEST se demuestra por una disminución dependiente de la concentración de MAb TEST en el color desarrollado.

Ejemplo 8 Actividad in vivo de los inmunoconjugados contra CA55.1

Las propiedades esenciales de un anticuerpo para que el mismo produzca una inmunotoxina eficaz cuando se conjuga con la ricina A, son que el mismo debe fijarse a un determinante de la membrana celular en las células tumorales y facilitar el suministro de la ricina A a través de la membrana celular y a los ribosomas a fin de inhibir la síntesis de proteínas e inducir citotoxicidad.

Se ha demostrado que el antígeno 55.1 está presente a niveles altos en varias líneas de células de tumores colorrectales que incluyen COLO 205, utilizando citometría de flujo. Se han utilizado células COLO 205 para escrutinio de rutina durante estudios de internalización y citotoxicidad. Cuando se conjugó el anticuerpo 55.1 a la ricina A recombinante, se generó una inmunotoxina de gran potencia, con un valor CI50 de 1 \times 10^{-11} M contra las células COLO 205.

La endocitosis de la fijación de 55.1 a COLO 205 se demostró como sigue. Una suspensión celular de células COLO 205 se concentró a 20 millones de células por ml en medio de cultivo. Se añadió anticuerpo yodado a 1 \mug/ml y se incubó durante 1 hora a 4ºC. Las células se lavaron dos veces por centrifugación a 4ºC y se diluyeron luego en medio reciente hasta 1 millón de células por ml. Se añadieron luego 1,5 ml de la suspensión de células a placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, seguido por incubación a 37ºC. Se retiraron muestras de 1 ml para su procesamiento a intervalos. Las células y los sobrenadantes de medio se separaron por centrifugación. Algunos sedimentos de células se trataron para separar el anticuerpo fijado a la superficie utilizando pepsina acidificada (10 mg/ml, pH 2,5, 1 ml/sedimento a 37ºC durante 40 min). Las células se lavaron luego por centrifugación. Los sobrenadantes del medio se trataron con TCA para determinar la radiactividad asociada a las proteínas. Se midió en todos los casos la radiactividad de los sedimentos de células, sedimentos de células tratados con pepsina, medios y precipitados de TCA de los medios. De este modo, se cuantificaron los anticuerpos en la superficie, internalizados y desprendidos (con inclusión de los productos de graduación).

Comparado con los anticuerpos de control que no se internalizan, 55.1 se internaliza eficazmente en las células COLO 205, atravesando aproximadamente el 25% del anticuerpo fijado a las células la membrana celular durante una incubación de 4 horas in vitro y 40% después de un período de incubación de 20 horas (Figura 4).

La potencia in vivo de 55.1:ricina A se ha evaluado en modelos de tumores humanos desarrollados como aloinjertos subcutáneos en ratones atímicos "desnudos".

El ensayo anti-tumor primario se llevó a cabo en grupos de 10 ratones implantados subcutáneamente en el costado izquierdo con 5 X 10E6 células COLO 205. Se dejó que los tumores crecieran hasta 0,5-0,7 cm de diámetro, usualmente 5-7 días después de la implantación. En este momento, se dosificó por vía intravenosa 1 mg/kg de 55.1:inmunotoxina de ricina A una vez al día durante tres días. Los grupos de control recibieron únicamente dosis iv de solución salina.

Este régimen produjo una respuesta anti-tumoral muy sustancial con evidencia clara de regresiones del tumor y curaciones completas en unos cuantos animales. En un experimento de este tipo, se curaron de sus tumores 2/10 ratones. De los ratones restantes, 4/10 tenían retardos moderados del crecimiento (10 días) y 4 tenían retardos prolongados del crecimiento del tumor, mayores que 30 días (Figura 5).

Así pues, 55.1:ricina A es un agente citotóxico selectivo y altamente potente in vivo y actúa por direccionamiento a e internalización en las células Colo 205 dentro de los aloinjertos de tumores sólidos. 55.1:ricina A es considerablemente más activo, en tales modelos, que los agentes anti-cáncer convencionales tales como 5-fluorouracilo.

Ejemplo 9 Composición farmacéutica

A continuación se ilustra una forma de dosificación farmacéutica representativa que contiene una inmunotoxina de la presente invención que puede utilizarse para propósito terapéutico en humanos.

Solución inyectable

Una solución acuosa estéril, para inyección, que contiene:

Inmunotoxina ricina A/anticuerpo 55.1

\dotl

1,0 mg

Acetato de sodio trihidratado

\dotl

6,8 mg

Cloruro de sodio

\dotl

7,2 mg

Tween 20

\dotl

0,05 mg por ml de solución Ejemplo 10 Hibridación de secuencias de DNA afines a la secuencia de DNA CDR3 de 55.1 10.1 Ensayo de Hibridación

Un método para detectar ácidos nucleicos que contienen secuencias afines al gen de la cadena pesada del anticuerpo 55.1. Estos ácidos nucleicos pueden estar presentes en una diversidad de formas tales como el DNA de colonias bacterianas o el DNA/RNA de células eucariotas fijadas a una membrana como se ha descrito anteriormente en el escrutinio de un genoteca de cDNA o como fragmentos de ácido nucleico purificado separados por electroforesis en gel y transferidos luego a una membrana adecuada como para las técnicas de hibridación Northern (Maniatis, capítulo 7, p 39) o Southern (Maniatis, capítulo 9, p 31).

10.2 Sonda de hibridación

Pueden generarse sondas de hibridación a partir de cualquier fragmento del DNA o RNA codificante de la cadena H de 55.1, más específicamente de la región variable, en particular de la región codificante CDR3 de esta región. Puede utilizarse un oligonucleótido sintético (SEQ ID No: 22) o su secuencia complementaria como sonda específica para la región codificante DR3.

Puede generarse una sonda de hibridación a partir de un oligonucleótido sintético por adición de un grupo 5'-fosfato radiactivo procedente de 32P-ATP por la acción de polinucleótido-quinasa T4. Se añaden 20 pmoles del oligonucleótido a una reacción de 20 \mul que contiene Tris 100 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, Spermidina 0,1 mM, DTT 20 mM, ATP 7,55 M, 0,55 mg de 32P-ATP y 2,5 u de polinucleótido-quinasa T4 (Pharmacia Biotechnology Ltd., Uppsala, Suecia). La reacción se incuba durante 30 minutos a 370C y luego durante 10 minutos a 70ºC antes de su uso en hibridación. Métodos para la generación de sondas de hibridación a partir de oligonucleótidos (capítulo 11) o de fragmentos de DNA y RNA (capítulo 10) se dan en Maniatis. Están disponibles también varios estuches patentados para estos procedimientos.

10.3 Condiciones de hibridación

Filtros que contienen el ácido nucleico se pre-hibridan en 100 ml de una solución que contiene 6 x SSC, 0,1% de SDS y 0,25% de Marvel™ a 65ºC durante un mínimo de 1 hora en un recipiente cerrado adecuado. Un aparato de hibridación patentado tal como el modelo HB-1 (Techne Ltd.) proporciona condiciones reproducibles para el experimento.

La solución de pre-hibridación se reemplaza luego por 10 ml de una solución de sonda que contiene 6 X SSC, 0,1% de SDS, 0,25% de Marvel y la sonda oligonucleotídica generada anteriormente. Los filtros se incuban en esta solución durante 5 minutos a 65ºC antes de dejar que la temperatura descienda gradualmente hasta por debajo de 30ºC. La solución de sonda se desecha luego y los filtros se lavan en 100 ml de 6 X SSC, 0,1% SDS a la temperatura ambiente durante 5 minutos. Se realizan luego lavados adicionales en lotes recientes de la misma solución a 30ºC y luego en incrementos de 10ºC hasta 60ºC durante 5 minutos por lavado.

Después del lavado, se secan los filtros y se utilizan para exponer una película de rayos X tal como Hyperfilm MP (Amersham International) a -70ºC en una casete de película hermética a la luz utilizando un filtro intensificador rápido de wolframato para mejorar la imagen fotográfica. La película se expone luego durante un periodo adecuado (normalmente durante una noche) antes de su desarrollo para revelar la imagen fotográfica de las áreas radiactivas en los filtros. Las secuencias de ácido nucleico afines se identifican por la presencia de una imagen fotográfica comparada con secuencias sin relación alguna que no deben producir una imagen. Idealmente, las secuencias afines aparecerán positivas a la temperatura de lavado máxima (60ºC). Sin embargo, las secuencias afines pueden exhibir carácter positivo sólo a las temperaturas de lavado más bajas (50, 40 ó 30ºC).

Estos resultados dependerán también de la naturaleza de la sonda utilizada. Las sondas de fragmentos de ácido nucleico más largas precisarán ser hibridadas durante periodos más largos a alta temperatura, pero pueden mantenerse fijadas a secuencias afines a temperaturas de lavado más altas y/o a concentraciones más bajas de sal común. Las sondas oligonucleotídicas más cortas, mezcladas o degeneradas pueden requerir condiciones de lavado menos severas tales como temperaturas inferiores y/o concentraciones mayores de Na^{+}. Una exposición de las consideraciones para protocolos de hibridación se proporciona en Maniatis (capítulo 11).

Ejemplo 11 Análisis del antígeno asociado a tumores CA55.1 11.1 Solubilización de CA55.1 procedente de las células COLO 205

Todos los materiales utilizados deberían ser de la máxima calidad disponible. Un sedimento de 10E9 células COLO 205 se suspendió en 7 ml de tampón de lisis enfriado en hielo (2,5% Tween 40, Tris 10 mM, NaCl 0,14M, PMSF 1 mM, NEM 1 mM, Pepstatina 100 \muM, pH 7,4) para dar un volumen total de 10 ml. La solución resultante se agitó durante 1 hora en un baño de hielo. Las células se homogeneizaron luego y se centrifugaron durante 10 min a 1500 g y 4ºC. El sobrenadante se aspiró y se centrifugó durante 1 hora a 100.000 g y 4ºC. Se añadieron al sedimento 5 ml de tampón de solubilización (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, octilglucosido 50 mM, NEM 10 mM, PMSF 1 mM, leupeptina 0,1 mM, pH 7,4) y la suspensión resultante se agitó suavemente durante 30 minutos a 4ºC. La solución se centrifugó luego durante 20 minutos a 30.000 g. El sobrenadante, la preparación de membrana COLO 205 solubilizada se aspiró y se guardó a 4ºC.

11.2 Purificación de CA55.1 por afinidad

Se acopló MAb 55.1 a Sepharosa 4B activada con CNBr utilizando el protocolo estándar de Pharmacia (Inserción contenida en Sepharosa Activada con CNBr de Pharmacia, Cat. Log. No. 17-0430-01, Pharmacia AB, Uppsala, Suecia). La matriz se equilibró luego en tampón de fijación (Tris 25 mM, NaCl 150 mM, Octilglucosido 50 mM, pH 7,0). El lisado de células que contenían el antígeno 55.1 se añadió luego a la matriz y se mezcló, cabeza con cabeza, a 4ºC durante una noche. La matriz se lavó luego con 6 volúmenes de columna de tampón de lavado (Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0). Los antígenos 55.1 se eluyeron luego por lavado de la matriz con 3 volúmenes de columna de tampón de elución (Tris 25 mM, NaCl 150 mM, tiocianato de sodio 5M, pH 7,0). Las fracciones que contenían el CA55.1 se identificaron por Transferencia Western utilizando el anticuerpo 55.1 como se describe más adelante.

11.3 SDS-PAGE y transferencias Western de CA55.1

Las muestras a analizar para reactividad de MAb 55.1 se cargan en un ExcelGel™ de Pharmacia premoldeado (poliacrilamida en gradiente 8-18%) y se pasan de acuerdo con el protocolo sugerido por Pharmacia utilizando las condiciones recomendadas (600 voltios, 50 mA y 30W durante 90 minutos, 15ºC, véase la inserción en Pharmacia ExcelGel Pack, cat. no. 80-1255-53, Pharmacia, Uppsala, Suecia). El gel se separó de la hoja de plástico de respaldo y se sometió a electrotransferencia sobre una membrana de PVDF a 2,5 mA/cm^{2} durante 10-12 min. Después de la electrotransferencia, la membrana de PVDF se transfirió luego a tampón de bloqueo, 3% de BSA en tampón de TBS (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4), y se agitó suavemente durante 1 hora. La membrana se enjuagó luego brevemente con tampón de anticuerpos (1% BSA en TBS), y se transfirió a tampón de anticuerpos que contenía MAb 55.1 a una concentración de 2 mg/l. La membrana de PVDF se agitó suavemente durante 2 horas.

La membrana se enjuagó luego brevemente con agua Milli-Q™ (agua desionizada de alta calidad) y se lavó tres veces durante 5 minutos en tampón de anticuerpos. La membrana de PVDF se transfirió luego a tampón de anticuerpos que contenía MAb anti-ratón enlazado a peroxidasa de rábano picante a una concentración de 1 mg/l. La membrana de PVDF se agitó luego suavemente durante 1 h. La membrana de PVDF se enjuagó luego brevemente con agua Milli-Q y se lavó tres veces 5 minutos en tampón de anticuerpos, y por último se lavó durante 5 minutos con TBS. Cuando se hubo completado el paso de lavado final, se añadieron juntas la solución de revelado del color de HRP (60 mg de 4-cloro-1-naftol en 20 ml de metanol enfriado en hielo; preparado menos de 5 min antes de su utilización y guardado en la oscuridad) y la solución de peróxido (60 \mul de H_{2}O_{2} al 30% enfriada en hielo en 100 ml de TBS, preparado inmediatamente antes de su utilización) y la membrana se transfirió inmediatamente a la solución resultante. Cuando se hubo revelado el color, la reacción se interrumpió por lavado de la membrana en 2 lavados de 5 minutos en agua Milli-Q™. La membrana se secó luego al aire sobre papel de seda y se guardó.

Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 6. CA55.1 pasa como tres bandas dominantes de pesos moleculares comprendidos en los intervalos de aproximadamente 48 a 52 kD, aproximadamente 58 kD a 72 kD y aproximadamente 88 kD a 92 kD.

11.4 Tratamiento con PNGasa F, tratamiento con sialidasa y transferencias de lectina

La naturaleza carbohidratada del epítope CA55.1 se demostró por exhibición de los efectos de las enzimas PNGasa F y sialidasa sobre CA55.1 en Transferencias Western. La PNGasa F escinde específicamente un oligosacárido enlazado en N procedente de una glicoproteína entre el residuo asparagina y el residuo GlcNAc adyacente (X-GlcNAc-GlcNAc-Asn) y se cree que es totalmente específica para este enlace. La sialidasa escinde los ácidos siálicos terminales no reductores y es específica para una gama de enlaces alfa 2 \rightarrow 3, 6 ó 8.

11.4 (a) Tratamiento con PNGasa de CA55.1

Todos los materiales utilizados deberían ser de la máxima pureza disponible. A 40 \mul de la preparación de membrana COLO 205 se añadieron 40 \mul de tampón de desnaturalización (hidrogenofosfato de sodio 40 mM, 0,5% de SDS y 5% de 2-mercaptoetanol, pH 7,5), y la solución resultante se hirvió durante 2 minutos. Después de enfriar, se añadieron 2 \mul de Nonidet NP-40 (2,5% v/v). Se añadieron a esta solución 20 unidades de PNGasa F (N Glicosidasa F, Ex. Boehringer Mannheim Cat. Número 913782), seguido por 160 \mul de tampón de digestión (hidrogenofosfato de sodio 40 mM, pH 7,5) y 160 \mul de agua Milli-Q. La solución resultante se incubó luego durante 18 h a 37ºC.

11.4 (b) Tratamiento de CA55.1 con sialidasa

Todos los materiales utilizados deberían ser de la máxima pureza disponible. Se resuspendió sialidasa (0,1 unidades, Oxford Glycosystems cat. no. X-5011) en 10 \mul de tampón de acetato de sodio 500 mM, pH 5. La solución resultante se añadió a 40 \mul de la preparación de membrana COLO 205 y se incubó durante 18 h a 37ºC.

La preparación de membrana COLO 205 tratada con PNGasa F y sialidasa y una muestra de preparación de membrana sin tratar se sometieron luego a transferencia Western como se ha descrito arriba.

La Figura 6 muestra una representación de los resultados de la Transferencia Western. La pista 1 contiene la preparación de membrana COLO 205 sin tratar, la pista 2 la muestra tratada con PNGasa F y la pista 3 es la muestra tratada con sialidasa. La pista 1 muestra las tres especies positivas principales de MAb 55.1, con peso molecular de aproximadamente 48-52 kD, 58-72 kD y 88-92 kD. La pista 2 no contiene ninguna especie detectable. La pista 3 muestra la especie positiva de 55.1 con pesos moleculares de aproximadamente 48-52 kD, 58-72 kD y 88-92 kD. En la pista 3, las especies positivas de 55.1 se teñían más débilmente que la muestra de control en la pista 1. Esta reducción se cree que es debida a la precipitación parcial de la proteína durante la incubación de 18 h a 37ºC.

Estos resultados demuestran que el tratamiento de una preparación de membrana COLO 205 con PNGasa F elimina la reactividad con MAb 55.1, pero que el tratamiento con sialidasa no elimina totalmente la reactividad con MAb 55.1. Por consiguiente, MAb 55.1 reconoce un oligosacárido enlazado a N y que los residuos terminales de ácido siálico no son necesarios para el reconocimiento.

11.4 (c) Transferencia con lectina de las glicoproteínas positivas de MAb 55.1 purificadas por afinidad

La estructura parcial de la porción carbohidratada del antígeno CA55.1 puede inferirse del uso de proteínas que reconocen específicamente diversos motivos estructurales de carbohidrato. Estas proteínas o lectinas pueden marcarse con enzimas que permiten visualizar su localización en las transferencias SDS-PAGE.

Todos los materiales utilizados deberían ser de la máxima pureza disponible. La preparación de membrana COLO 205 soluble se enriqueció en glicoproteínas positivas a MAb 55.1 por fijación, lavado y elución desde una columna de afinidad acoplada a MAb 55.1. Esta fracción enriquecida, junto con los controles de glicoproteína recomendados, se sometió luego a transferencia Western y se sondó utilizando lectinas DIG marcadas de Boehringer Mannheim de acuerdo con los protocolos de los fabricantes (Estuche de Diferenciación de Glicanos DIG, Boehringer Mannheim cat. no. 1210238).

La Figura 7 muestra una representación de la reactividad de cuatro glicoproteínas de control y positivas a MAb 55.1 con aglutinina de Datura stramonium (DSA) y aglutinina de Galanthus nivalis (GNA). La Figura 7a muestra que DSA reacciona cruzadamente con las dos glicoproteínas de peso molecular alto positivas a MAb 55.1, 58-72 kD y 88-92 kD, cargadas en las pistas 6 y 7. No se observó reactividad cruzada alguna con la glicoproteína de peso molecular más bajo positiva a MAb 55.1, 48-52 kD; esta falta de reactividad cruzada es debida probablemente a carga insuficiente.

La Figura 7B muestra que no existe ninguna reactividad cruzada detectable entre GNA y las glicoproteínas positivas a MAb 55.1 cargadas en las pistas 6 y 7. En ambos casos, la pista 7 tiene una carga 5 veces mayor que la pista 6 y las reactividades cruzadas correctas se observaron para los controles de glicoproteína.

La lectina DSA reacciona cruzadamente con galactosa-beta(1-4)-N-acetilglucosamina, estando presente este di-sacárido en glicanos complejos e híbridos enlazados a N. DSA reconoce también este disacárido en glicanos enlazados a O. La lectina GNA reacciona cruzadamente con residuos manosa enlazados terminalmente en glicanos ricos en manosa e híbridos enlazados a N. Esta lectina reaccionará también cruzadamente con los residuos manosa terminales en los glicanos enlazados a O. Dado que las preparaciones de membrana COLO 205 tratadas por PNGasa no son positivas a MAb 55.1, MAb 55.1 reconoce un glicano enlazado a N. El resultado positivo con DSA demuestra que este glicano contiene el disacárido galactosa-beta(1-4)-N-acetilglucosamina. El resultado negativo con GNA demuestra que el glicano positivo a MAb 55.1 no contiene un grupo manosa terminal, y por consiguiente no puede ser de los tipos ricos en manosa o híbridos. Estos resultados demuestran en su conjunto que MAb 55.1 reconoce un glicano complejo enlazado a N, que contiene la unidad de disacárido galactosa-beta(1-4)-N-acetilglucosamina.

Ejemplo 12 Propagación, titulación y almacenamiento del fago que presenta la secuencia ACEHRGSGWC (fago ACEHRGSGWC)

El fago ACEHRGSGWC (NCIMB No. 40638; SEQ ID No 26) se propagó en la cepa TG1 de E. coli K12 (depositada con el fago en NCIMB) como sigue. Células TG1 tomadas de colonias simples, mantenidas sobre placas de agar en medio mínimo (preparadas como se describe más adelante) para mantener el pilus F, se dejaron crecer en cultivo líquido hasta fase estacionaria a 37ºC, con agitación mediante sacudidas, en caldo 2 X YT (levadura-triptona) (Difco). Partes alícuotas del cultivo en fase estacionaria (2 ml) se inocularon en matraces recientes que contenían 100 ml de caldo 2 X YT y se dejaron crecer, con sacudidas a 37ºC hasta la fase mid-log. Se añadió el fago ACEHRGSGWC (10E11 unidades formadoras de placas) a los cultivos y los matraces se dejaron en reposo durante 10 min a 37ºC para permitir la adsorción del fago a los pili F de E. coli y la inserción del DNA vírico. Los cultivos se incubaron luego a 37ºC con sacudidas durante 5 h para permitir que tuviera lugar la replicación del fago.

Las células se separaron del sobrenadante que contenía el fago por centrifugación a 10000 rpm durante 10 min a 4ºC en un rotor Sorvall GSA o similar. El sobrenadante se calentó a 65ºC durante 15 min para matar cualesquiera células residuales, después de lo cual se añadió una solución de polietilenglicol (PEG) al 20% p/v en NaCl 2,5M a 20 ml por 100 ml de sobrenadante de cultivo. La mezcla se agitó enérgicamente mediante sacudidas y se incubó durante al menos 4 h a 4ºC para precipitar las partículas de fago. Los fagos se cosecharon por centrifugación como anteriormente, se desechó el sobrenadante, y los sedimentos de fago se resuspendierón en Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (TBS) a 1 ml por 100 ml de sobrenadante del cultivo original. En caso necesario, los fagos se reprecipitarón con PEG como anteriormente para obtener preparaciones más altamente purificadas. Los fagos se guardaron en TBS, a -20ºC, o a 4ºC en presencia de 0,02% p/v de azida de sodio sin diferencia perceptible alguna en la viabilidad subsiguiente.

Se prepararon placas de medio mínimo por tratamiento en autoclave de agar al 1,8% p/v (Difco) en 400 ml de agua. Después de enfriar a aproximadamente 50º, se añadieron los siguientes ingredientes: 5 X M9 sales (sic) (100 ml); sulfato de magnesio 1M (500 microlitros); cloruro de calcio 0,1M (500 microlitros); 4 mg/ml de tiamina (500 microlitros); 20% p/v de glucosa (5 ml).

Ejemplo 13 Titulación de los números de fago ACEHRGSGWC

Los números de fago ACEHRGSGWC viables (SEQ ID No. 26) se estimaron a partir de los números de unidades formadoras de placas presentes en células indicadoras de E. coli que habían crecido en cultivo sólido. Las células de la cepa TG1 de E. coli se dejaron crecer hasta fase mid-log como se ha descrito arriba, y se infectaron partes alícuotas de 200 microlitros con partes alícuotas de 50 microlitros de una dilución seriada de fago en TBS que contenía 1 mg/ml de seroalbúmina bovina (TBS-BSA). Las células se mantuvieron a la temperatura ambiente durante 10 min para permitir la adsorción del fago y la inyección de DNA vírico, se diluyeron a 4 ml con 0,75% p/v de Bacto-Agar (Difco) en caldo 2 x YT mantenido a 48ºC, y se vertieron inmediatamente después en cápsulas Petri de 90 mm de diámetro llenadas previamente con 20 ml de Bacto-Agar al 1,5% en caldo 2 X YT. Las placas se incubaron durante una noche a 37ºC para desarrollar placas de fago que se contaron para estimar los números de fago viables en las suspensiones stock que se ensayaron.

Ejemplo 14 Determinación de la especificidad de fijación del fago ACEHRGSGWC por ELISA 14.1 Especificidad de la fijación directa a MAb 55.1

La especificidad se determinó por fijación directa del fago en suspensión a MAb 55.1 (ECACC No. 93081901), Mab 19.9 (hibridoma ATCC No. NS 1116 ND) y Mab C242 (Kabi-Pharmacia, Uppsala, Suecia) inmovilizados en poli-estireno como sigue. Pocillos de placas de microtitulación de poliestireno (Nunc, Life Technologies Ltd, Reino Unido) se recubrieron durante una noche a 4ºC con partes alícuotas de 50 microlitros de MAb a 0,1 mg/ml en tampón de bicarbonato de sodio 0,1M, 0,02% de azida de sodio, pH 8,6 (bicarbonato-azida). Las placas se bloquearon durante 2 h a la temperatura ambiente con partes alícuotas de 400 microlitros de BSA de 30 mg/ml en bicarbonato-azida, seguido por tres lavados con 400 microlitros de TBS-BSA por pocillo, durando cada lavado 5 min.

Se aplicaron diluciones seriadas del fago ACEHRGSGWC en partes alícuotas de 100 microlitros de TBS-BSA a las placas recubiertas con anticuerpo y se incubaron durante una noche a 4ºC, después de lo cual se lavaron las placas con 3 partes alícuotas de 400 microlitros de TBS-BSA que contenían 0,05% p/v de Tween 20 (TBS-BSA-Tween). Se añadió a cada pocillo conjugado de peroxidasa de rábano picante-anti-M13 de oveja (Pharmacia, Milton Keynes, Reino Unido) a dilución 1:2500 en TBS-BSA en partes alícuotas de 100 microlitros y se incubó durante 2 h a la temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo con 3 partes alícuotas de 400 ml de TBS-BSA-Tween y se revelaron con partes alícuotas de 200 microlitros de sustrato OPD (10 mg de orto-fenilenodiamina, 12,5 microlitros de solución de peróxido de hidrógeno al 30% por 25 ml de tampón citrato-fosfato 0,1M, pH 5,0). Las reacciones de color se interrumpieron por la adición de partes alícuotas de 50 microlitros de ácido cítrico 0,5M y se leyó la absorbancia a 450 nm.

Los resultados (Fig. 13) demostraron que la fijación del fago ACEHRGSGWC a MAb 55.1 era específica y saturable. La semi-saturación de la fijación del fago ACEHRGSGWC a MAb 55.1 ocurría para 2 x 10E7 de entrada de fago en un volumen de 100 microlitros.

Una medida de la afinidad de fijación se dedujo del número de Avogadro, donde una solución 1 molar contendrá 6 x 10E23 moléculas de soluto por litro o 6 x 10E19 por 100 microlitros. Trabajando a partir de este número, 2 x 10E7 fagos por 100 microlitros corresponden a una concentración de 0,3 pM de partículas de fago enteras o 1,5 pM de péptido presentado por el fago (existen aproximadamente 5 moléculas pIII presentes en cada partícula de fago M13). Así, puede deducirse que el valor CE50, es decir la concentración de péptido-fago requerida para 50% de saturación de MAb 55.1 se encuentra en la región de 1 pM.

14.2 Especificidad de fijación a MAb 55.1 en el ensayo de competición de COLO 205

Se determinó la especificidad por un ensayo en el cual el fago ACEHRGSGWC competía con MAb 55.1 en solución para el epítope del MAb inmovilizado en poliestireno. Se recubrieron los pocillos de placas de microtitulación durante 30 min con partes alícuotas de 100 microlitros de 10.5 células COLO 205 (ATCC No. CCL 222) en solución salina tamponada con fosfato (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,4) (PBS), se fijaron por adición de un volumen igual de aldehído glutárico al 1% v/v en PBS durante 15 min y se bloquearon con BSA al 10% p/v en PBS (PBS-BSA) durante 2 horas, realizándose todas las operaciones a la temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces durante 5 minutos con partes alícuotas de 400 microlitros de PBS por pocillo y se guardaron en una caja húmeda a 4ºC hasta que fueron necesarias (hasta 1 mes después del recubrimiento).

Se incubaron diluciones seriadas del fago ACEHRGSGWC durante una noche a 4ºC con MAbs 55.1, 19.9 y C242, todos ellos a 20 microgramos/ml en 250 microlitros de PBS que contenía 10% p/v de BSA y 0,005% p/v de Tween 20 (tampón diluyente de fago), después de lo cual se pipetearón partes alícuotas duplicadas de 100 microlitros en pocillos de placas COLO 205 preparadas y se incubaron durante 3 horas a la temperatura ambiente para permitir la interacción entre las sustancias reaccionantes. Las placas se lavaron durante 3 \times 5 min con PBS que contenía 0,05% p/v de Tween 20 (tampón PBS-Tween) y se añadieron a cada pocillo partes alícuotas de 100 microlitros de conjugado IgG anti-ratón de conejo/peroxidasa de rábano picante (Sigma, Poole, Reino Unido) a dilución 1:1000 en tampón diluyente de fago. Las placas se incubaron durante 2 h a la temperatura ambiente, se lavaron tres veces durante 5 min con tampón PBS-Tween y se reveló el color con sustrato OPD.

Los resultados (Fig. 14) demostraron que la fijación de MAb 55.1 a las células COLO 205, pero no la de MAbs 19.9 y C242 era susceptible de inhibición por el fago ACEHRGSGWC, con un valor CI50 de 10E12 entradas de fago en un volumen de 100 microlitros.

Se dedujo una medida de la afinidad de fijación, como anteriormente, del número de Avogadro. Si 6 x 10E19 moléculas de soluto por 100 microlitros corresponde a una solución 1 molar, entonces 10E12 partículas de fago en 100 microlitros corresponden a una concentración 16,7 nM de partículas enteras o 80 nM de péptido presentado por el fago. Así pues, puede deducirse que el valor CI50, es decir la concentración de fago requerida para conseguir 50% de inhibición de la fijación de MAb 55.1 a su antígeno en las células COLO 205 es del orden de 20-100 nM.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Zeneca Limited

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(B)

CALLE: 15 Stanhope Gate

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(C)

CIUDAD: Londres

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(E)

PAÍS: Reino Unido

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): SW1P 3JF

\vskip0.333000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 0707 323 400

\vskip0.333000\baselineskip

(H)

TELEFAX: 0707 323 7454

\vskip0.333000\baselineskip

(I)

TÉLEX: 94028500ICICG

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 37

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(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9324819.3

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-DIC-1993

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(vi)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9411089.7

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-JUN-1994

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGTCCAAC TGCAGCAGCC TGGGGCTGA

\hfill

29

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CARGTCCARC TGCARCARCC TGGGGCTGA

\hfill

29

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATATTGTGA TGTCTCAGTC TCCA

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATATTGTGA TGTCTCAGTC TNCC

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGATCCAGGG GCCAGTGGAT AGACAGATGG

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGAAGATG GATACAGTTG GTGCAGCATC

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATACGACT CACTATAGGG

\hfill

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACTTCTGGG ACTGTACATA TTCAAGGCCT CGAGCCACAA TC

\hfill

42

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 74 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGACAAGAA AGTTGAGCCC AAATCTTGTG ACAAGACGCA CACGTGCGGA GGTTAATAAG

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCGTTAA CATG

\hfill

74

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 66 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAACGCTAG CTTATTAACC TCCGCACGTG TGCGTCTTGT CACAAGATTT GGGCTCAACT

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTTG

\hfill

66

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGCCCGCCG TGCCCGGCTC CGGAACTGCT GGGTGGCCCG TAATAGCTAG CGTT

\hfill

54

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACGCTAGCT ATTACGGGCC ACCCAGCAGT TCCGGAGCCG GGCACGGCGG GCAC

\hfill

54

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAACCAGCCA TGGCCCAGGT CCAACTGCAG CAGCCCTGGGG

\hfill

40

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGCAGAGG AGACGGTGAC CGAGGTTCCT

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTGTTATTA CTCGCGGCCC AACCGGCCCA GGCCGACATT GTGATGTCAC AGTCTCCATC

\hfill

60

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCAGCCCGT TTGATCTCGA GCTTGGTGCC

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCCTTGGCC

\hfill

32

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACATTGAGC TCACCCAGTC TCCA

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACCACGGT CACCGTCTCC TCAGGTGGCG GTGGCTCGGG CGGTGGTGGG TCGGGTGGCG

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGATCTGA CATTGAGCTC ACCCAGTCTC CA

\hfill

92

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 93 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAGACTGG GTGAGCTCAA TGTCAGATCC GCCGCCACCC GACCCACCAC CGCCCGAGCC

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCGCCACCT GAGGAGACGG TGACCGTGGT CCC

\hfill

93

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTAGGAATT CGAGCTGGAT CCTTACTATT TGATCTCGAG CTTGG

\hfill

45

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAGGGCCT ATGGTTACGA CGATGCTATG GACTAC

\hfill

36

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1572 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

10

11

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 940 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 82 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGAGATCAA ACGGGAACAA AAACTCATCT CAGAAGAGGA TCTGAATTAA TAATGATCAA

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGGTAATAA GGATCCAGCT

\hfill

82

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Cys Glu His Arg Gly Ser Gly Trp Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Trp Ile His}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Val Asn Pro Ser Thr Gly Arg Ser Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys}

\sac{Asn}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Arg Ala Tyr Gly Tyr Asp Asp Ala Met Asp Tyr}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu}

\sac{Ala}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ala Ser Thr Arg Thr Ser}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Ser Tyr Thr Leu Arg Thr}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 445 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

13

14

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 219 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 82 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCGAGCT GGATCCTTAT TACCGTTTGA TCATTATTAA TTCAGATCCT CTTCTGAGAT

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGTTTTTGT TCCCGTTTGA TC

\hfill

82

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 464 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 239 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

19

20

21

22

23

Claims (15)

1. Una estructura de fijación de antígeno que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que reconocen el antígeno CA55.1, en la cual el antígeno posee:

a) tres especies dominantes que tienen pesos moleculares por SDS-PAGE comprendidos en los intervalos de aproximadamente 48 a aproximadamente 52 kD, aproximadamente 58 kD a 72 kD y aproximadamente 88 kD a 92 kD;

b) una localización subcelular en la fracción de membrana de las células tumorales COLO 205 (ATCC No. CCL 222) y,

c) una estructura compleja de carbohidratos enlazados a N;

y en la cual la estructura de fijación del antígeno tiene al menos una de las propiedades siguientes:

i) la estructura de fijación de antígeno inhibe competitivamente la fijación del anticuerpo monoclonal 55.1 (ECACC No. 93081901) al antígeno CA55.1, o;

ii) el péptido ACEHRGSGWC (SEQ ID NO: 26), tal como se presenta en la superficie del bacteriófago NCIMB No. 40638, se fija a la estructura de fijación de antígeno con una fijación eficaz de 10 pM o menos cuando se incuba con la estructura de fijación de antígeno recubierta en fase sólida, o;

iii) el péptido ACEHRGSGWC (SEQ ID NO: 26), tal como se presenta en la superficie del bacteriófago NCIMB No. 40638, a una concentración eficaz de 200 nM o menos, cuando se preincuba con la estructura de fijación de antígeno, inhibe competitivamente la fijación de la estructura de fijación de antígeno a las células Colo 205 recubiertas en fase sólida (ATCC no. CCL 222).

2. Una estructura de fijación de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que reconocen el antígeno CA55.1, en la cual las CDRs tienen las secuencias siguientes:

a) cadena pesada

24

b) cadena ligera

25

o un análogo conservador de las mismas.

3. Una estructura de fijación de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la estructura siguiente, opcionalmente humanizada:

\newpage

una secuencia de cadena pesada (SEQ ID NO: 33):

26

27

28

y;

\newpage

una secuencia de cadena ligera (SQ ID NO: 34):

280

o uno cualquiera de los constructos siguientes de la misma:

F(ab')2; F(ab'), Fab, Fv, Fv & V-min monocatenario o;

un análogo conservador de la misma.

4. Una secuencia polinucleotídica que codifica al menos la región variable de la cadena pesada o la cadena ligera de una estructura de fijación de antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un vector de expresión que codifica al menos la región variable de la cadena pesada o ligera de una estructura de fijación de antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. Una célula hospedadora transformada con una secuencia polinucleotídica o un animal no humano transgénico o planta transgénica desarrollado(a) a partir de la célula hospedadora, en la cual la secuencia polinucleotídica codifica al menos la región variable de la cadena pesada o la cadena ligera de una estructura de fijación de antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

7. El hibridoma 55.1 depositado como depósito ECACC No. 93081901.

8. El fago ACEHRGSGWC depositado como NCIMB No. 40638.

9. Un método de producción de al menos una región variable de una cadena pesada o ligera de una estructura de fijación de antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende:

a) transformar una célula hospedadora con una secuencia polinucleotídica que codifica al menos la región variable de la cadena pesada o ligera de la estructura de fijación de antígeno y, opcionalmente, desarrollar la célula hospedadora transformada en una planta transgénica;

b) someter la célula hospedadora o la planta transgénica a condiciones conducentes a la expresión, y opcionalmente la secreción, de al menos la región variable, y opcionalmente;

c) purificar al menos parcialmente la región variable.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el cual las regiones variables tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera se expresan en la misma célula y se ensamblan de este modo para formar una estructura de fijación de antígeno.

11. Un método de producción del anticuerpo monoclonal 55.1 que comprende:

a) cultivar el hibridoma 55.1 depositado como depósito ECACC no. 93081901 en un medio en condiciones conducentes a la expresión de un anticuerpo a partir del mismo y;

b) obtener el anticuerpo 55.1 a partir del medio de cultivo y opcionalmente;

c) preparar un fragmento F(ab')2 del anticuerpo 55.1 por digestión enzimática.

12. Un conjugado de inmunotoxina que comprende una toxina y una estructura de fijación de antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

13. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado de inmunotoxina que comprende una toxina y una estructura de fijación de antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

14. Una estructura de fijación de antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 que es el anticuerpo producido por el hibridoma 55.1 depositado como depósito ECACC No. 93081901.

15. El uso de una estructura de fijación de antígeno como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en un método de diagnóstico in vitro.