JPH06505399A - 抗ヒト脂肪乳球人化抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

抗ヒト脂肪乳球入化抗体 盈五二盆互 本発明は、ヒト脂肪礼法（ＨＭＦＧ）に特異性を有する人体抗体分子（ＨＡＭ） および組換えＤＮＡ技術を用いるそれらの製造方法に関する。 Ｋ五二！皇 「人体抗体分子Ｊ　（ＲＡＭ）の語は、非ヒト橿からの免疫グロブリンに由来す る抗原結合部位を有する分子であり１分子の残部の免疫グロブリン由来部分はヒ ト免疫グロブリンに由来する分子を意味して使用される。抗原決定部位は、１ま たは２以上のヒト定常ドメインに融合した非ヒト免疫グロブリンからの完全可変 ドメインか、またはヒト可変ドメインにおける適当なフレームワーク領域に接合 された１または２以上の＃Ｉ補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれかから構成される 。ｒＭＡｂＪの略号はモノクローナル抗体の意味で使用される。 ＨＪＩＭｉ書中、＠文のダ１用は番号によつた２　これらの番号は角括ｎｏを付 して示す。 報文は明細書の末尾に番号順に一覧表とした。 天然の免疫グロブリンは、古くから、様々なフラグメントをもつことが知られて いる。たとえば、Ｆｅｂ、Ｆａｂ’　、Ｆ　（ａｂ’　）２およびＦｃであり、 これらは酵素的切断によって誘導できる。天然の免疫グロブリンは一般的に、Ｙ 型の分子からなり、各腕部の外端に向けて抗原結合部位を宵する。この構造の残 部、およびとくにＹの幹の部分は、免疫グロブリンに伴うエフェクター機能を仲 介する。 天然の免疫グロブリンは、アッセイに１診断に、またもっと限られた範囲である が治療に使用されてきた。しかしながら、このような利用は、とくに治療の場合 。 天然の免疫グロブリンのポリクローナル性が妨げとなってきたのである。治療剤 としての免疫グロブリンの可能性を現実のものとする重要な一歩は、一定の特異 性を有するモノクローナル抗体の製造方法の発見であった［］、Ｌかしながら、 大部分のＭＡｂは、鰯歯類牌臓細胞と１１１１類骨髄腫細胞との融合によるＩ＼ イブリドーマによって製造される。ヒ）ＭＡＩ）の製造についての報告は極めて 少ない。 利用できるＭ　Ａ　ｂの大部分はｍｉｉａｇ源であるから、これらは本来ヒトに 抗原性を示し、したがってＨＡＭＡ（ヒト抗−マウス抗体）反応と呼ばれる望ま しくない免疫応答を生じることがある。それ故、治療剤としての誓書１１ＭＡｂ の使用には。 人体がそのＭＡＩ）に対して免疫応答を開始し、それを完全に排除してしまうか または少なくともその効果を低減させるという事実による。固有の限界がある。 したがって、非ヒトＭ　Ａ　’ｂのヒトでの抗原性を低下させる提案が行われて きた。 このような技術は一般に、「人体」技術と呼ぶことができる。これらの技術には 一般に、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作する組換えＤ ＮＡ技術が包含される ＭＡＩ）を人体する初期の方法は、ある抗体の完全可変ドメインからなる抗原結 合部位が第二の抗体に由来する定常ドメインに融合されたキメラ抗体の製造に関 するものであった。このようなキメラ化操作の実施方法は、ＥＰ−Ａ−０１２０ ６９４号（Ｃｅｌｌｔａｃｈ　Ｌｌｍｉｔａｄ）、　Ｅ　Ｐ−Ａ−０１２５０２ ３号（Ｇｅｎｅｎｔｅｅｈ　Ｉｎｃ、）、　Ｅ　Ｐ−Ａ−０１７１４９６号（Ｒ ｅｓ、　Ｄｅｗ、　Ｃｏｒｐ、ｊａｐａｎ）、　Ｅ　Ｐ−Ａ−０１７３４９４号 （Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖａｒｉｉｔｙ）およびＥＰ−Ａ−０１９４２７６ 号（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）に記載されている。 ＥＰ−Ａ−０１９４２７６号には、マウスＭＡｂからの可変ドメインとヒト免疫 グロブリンからの定常ドメインを有する抗体分子の製造方法が開示されている。 また。 マウスＭＡＪ　ヒト免疫グロブリンのＣＨＩおよびＣＬドメイン、ならびにヒト 免疫グロブリンのＦｃ部分の代わりに非免疫グロブリン由来蛋白質からなる抗体 分子の製造も記載されている。 以後、キメラ抗体に関するその他の多くの特許が公開されていて、たとえば腫瘍 特異的キメラ抗体に関するものがある。これらの出願の中でもとくに、ＷＯ−Ａ −’８７１０２６７１号（Ｉｎｔ、Ｇｅｔ１εＢ、Ｉｎｃ、）、ＥＰ−Ａ−０２ ５６８５４号（ＣｅｎｒｏｃｏｒＬ　ＥＰ−Ａ−０２６６６６３号（Ｉｎｔ、Ｇ ｅｎ、Ｅｎｇ、Ｉｎｃ、　＆　Ｏｎｅｏｇｅｎ）、　ＷＯ−Ａ−８９１０Ｏ９９ ９号（ｒｎｔ、Ｇｅｎ、Ｅｎｇ、　Ｉｎｃ、）およびＥＰ−Ａ−０３３２４２４ 号（Ｈｙｂｒｊｅｅｃｈ　Ｉｎｃ、）を挙げることができる。 しかしながら、これらの人体キメラ抗体もなお、かなりの比率の非ヒトアミノ酸 配列、すなわち完全可変ドメインを含有する。したがって、このような大化抗体 も。 ある程度のＨＡ　Ｍ　Ａ反応を、と（に長期間にわたって投与した場合に、銹発 することがある［２］。 Ｅ　Ｐ−Ａ−０２３９４００号ｆｆ１ｎｔｅｒ）に記載されている別のアプロー チでは、マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、長いオリゴヌクレオチド を用いる特定部（ｉ　（’ｌ　突然ＲＫ　Ｉｃよって、ヒト免疫グロブリンの可 変ドメインのフレームワーク領域上に接合された。このようなＣＤＲ接合接合人 体抗体含有する非ヒトアミノ酸配列の比率がもっと低い点で、大化牛メラ抗体に 比べてＨＡＭＡ反応はさらに生じ難いように腎われる。）（およびＬ鎖可変ドメ インのそれぞれに３１ＩｌのＣＤＲ（ＣＤＲＩ。 ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）がある。 ＣＤＲ接合人化人体ｂに関する初期の仕事は１合成抗原ＮＰまたはＮＩＰを認識 するＭＡｂに対して行われた。しかしながらその後、リゾチームを認識するマウ スＭＡ＋）およびと）Ｔ＄ｉ胞上の抗原を認識するうｙ）ＭＡ１１＋をそれぞれ 人体した例が記載されている［３．４］、ヒトＴ細胞上の抗原に対するＣＤＲ接 合抗体の製造もＷＯ−Ａ−８９１０７４５２号（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｆｌｅｓｅａ ｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ）に記載されている。最近。 インターロイ牛ン２受容体に結合する人体ＣＤＲ接合抗体の製造が報告されてい るＣ５］、最近になって、さらに抗ウィルス［６，７］、抗腫瘍〔８］および抗 Ｔ細胞［９およびＥＰ−Ａ−０４０３１５６号］抗原に対してＷ！異性を有する 人体ＣＤＲ接合抗体の例が報告された。 われわれの係属中の国ｗＡ特許明細書第ＷＯ−Ａ−９１１０９９６７号は、一般 的な抗体のＣＤＲ接合に関するものである。 免疫グロブリン、およびとくにＭＡｂが、癌の診断および処置に極めて有用であ る可能性は広（示唆されている［ｌＱ、１１］、したがって、腫瘍特異的抗原に 同けられた免疫グロブリンおよびＭＡｂの製造の試みは、極めて活動的に行われ ている。現在までに、様々なヒト癌腫に対する１００を越えるＷ造が、腫瘍の診 断および処置の様々な局面で使用されてきた［１２］。 細胞表面抗原を認識するキメラモノクローナル抗体の製造に関しては、多数の論 文が発表されている。たとえば腫瘍関連抗原に対する特異性を維持した遺伝子操 作マウス／ヒト牟メラ抗体が報告されている［１３およびＷＯ−Ａ−８９１０ｌ 　７８３号］、Ｊ’Ｊｆの急性りンバ球性白血病抗原に対して特異的な組換えマ ウス／ヒトキメラ七ツクローナル抗体も発表されている［ｔａ］。 及五旦！ｎ 本発明者らは、抗−ヒト脂肪礼法（ＨＭＦＧ）マウスＭＡｂ　ＣＴＭＯＩ　［１ ５］から誘導されるＨＭＦＧに対する大化抗体を製造した。 本発明は人体抗体分子（ＲＡ　Ｍ　）に関し、ヒト脂肪礼法（ＨＭＦＧ）に対し て特異性を有して、可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）はマ ウスモ／　９　Ｈ−ｆ　／ｌ／抗体ＣＴＭＯＩ　（ＣＴＭＯＩＭＡｔ＋）から誘 導され、）（ＡＭの残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンまたは そのｇＩＳｔ体から誘導された。 ＲＡＭを提供する。 ＨＡＭは牛メラ人化抗体またはＣＤＲ接合接合人体抗体構成することができる。 ＲＡＭがＣＤＲ接合接合人体抗体なる場合は、ＨまたはＬ鎖可変ドメインのそれ ぞれは、ｌまたは２個のみのＣＴＭＯＩ誘導ＣＤＲから構成されてもよい、しか しなか伝スべての３つのＨおよびＬｉ１ｌＣＤＲがＣＴＭＯＩから誘導されるの が好ましＣＴ　Ｍ　Ｏ１ｓｒ　Ａ　ｂは、ＨＭＦＧｆ）ｉｌｌ関連ｖＬ原に対し て産生された■ｇＧ１−カーｉパ型のマウスＭＡＩ）であり、広範に見当されて いる［１５］、ＣＴＭＯＩ　ＭＡｔ＋は、乳癌、卵巣癌および非小細胞肺癌を認 識することが明らかにされている。それは標的細胞中に迅速にインターナライズ することが示されている。（ＴＭＯＩとカリヶマイシン（Ｃａｌｉｅｈａａ■１ ｃｉｎ）の接合体は適当な細胞系に特異性の高い細胞傷害作用を発揮する（ＵＳ Ｐ５０５３３９４号参照）。 乳癌患者の血液中に（＝、高レベルで循環している。ＣＴＭＯＩ　ＭＡＩ）によ って認識される抗原が検出されている。これは、薬物動力学およびインビボでの 腫瘍の局在に悪影響を与える可能性が考えられる。しかしながら、卵巣癌患者の 血液中の循環抗体のレベルは、乳癌患者の場合よりも低い、したがって９本発明 のＲＡＭは卵巣癌の処置にとくに有用であろうと思われる。 ＣＴＭＯＩ　ＭＡｂは、ＨＭＦＧの冬型上皮ｔ、ｆン（ＰＥＭ）を認識すルト考 えられている。したがって１本発明は好ましくはＭＭＦＧのＰＥＭを認識するＨ ＡＭを提供する。 驚くべきことに、　ＣＴＭＯＩ　ＭＡ　ｂの人体はその結合活性またはインター ナリゼーシ冒ンに有害な影響を実質的に与えず、とくにＣＤＲ接合によって、マ ウス抗体よりも裏好な結合およびインターナリゼーシ１ン特性を宵するＨＡＭを 創製できることが見出されたのである（以下の表１参賊）、これは、ある種のヒ ト癌腫たとえば卵巣、乳房、子宮および肺の癌腫の治療および診断の両者に有用 なＲＡＭを産生ずる。 本発明のＨＡＭは組換えＤＮＡ技術によって製造されるのが好ましい。 本発明のＨＡＭは、完全長のＨおよびＬ鎖；そのフラグメントたとえばＦａｂ。 Ｆａｂ’　、Ｆ　（ａｂ’　）２およびＦｖフラグメント；単一鎖抗体フラグメ ントたとえば単一鎖Ｆｖ；ＬｆｌｌもしくはＨ＠そ／マーもしくはダイ７−；ま たはこれらの任！のらのもしくはＣＴＭＯＩ　ＭＡＩ＋と同じ特異性をもつ他の 分子の７ラグメントもしくは類縁体カシら構成することができる。 ！（ＡＭの残りの非ＣＴＭＯＩ免疫グロブリン誘導部分は適当なヒト免疫グロブ リンから誘導できる。たとえば、ＨＡＭがＣＤＲ接合）（Ａ　Ｍである場合には 、抗原結合領域が誘導された（ＴＭＯｌドナー抗体のクラスまたは型を考慮して 、適当な可変領域フレームワーク配列が使用される。好ましくは、使用したヒト フレームワークの型はドナー抗体（ＣＴＭＯ１はＩｇＧ１−カッパである）と同 一または類似のクラスまたは型であることが好ましい、フレームワークは、ドナ ー抗体配列と（にＣＤＲと空間的に近接したまたは隣接した位置で、ホモロジー が最大または至適になるように選択するのが有利である。ＣＤＲ接合ＲＡＭの構 築に使用できるヒト７Ｌ／−Ａ７−’）ノ例には、ＬＡＹ、ＰＯＭ、ＴＵＲ，Ｔ Ｅ　Ｉ、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥｌおよびＥＵがあ゛る［１６］　、ＫＯＬおよ びＮＥＷＭはＨＮ３の構築に遺している。 ＲＥｒはＬｔｌｉの構築に適している。ＥＵはＨ鎖およびＬ鎖両者の構築にとく に適している。ＥＵフレームワークをＨおよびＬ饋両可変ドメインについてのヒ トフレームワークとして使用することは、そのＣＴＭＯＩ　ＭＡＩ）との高レベ ルのポモロジーの点で、好ましい。 ）ｆＡＭのＬまたはＨ鎖可変領域は、適宜、ヒトＬまたはＨ鎖定常ドメインに融 合できる（本明細書で使用される「Ｈ鎖定常ドメイン」の謳は、とくに特定され ない限り、蝶番領域を包含するものと理解すべきである）、ＲＡＭのヒト定常ド メインは、存在する場合には、抗体の提案される機能、とくに要求されるエフェ クター機能を考慮して選択される。たとえば、Ｈ饋可変領域に融合したＨ鎖定常 ドメインは。 ヒトＩｇＡ、ｒｇＧまたは１ｇＭドメインをすることができる。ヒトＩｇＧドメ インの使用が好ましい、ＲＡＭが治療目的を意図され、抗体エフ１クタ一機能を 要求される場合は、ＩｇＧ１およびＩ　ｆＧ３アインタイプドメインが使用でき る。また。 ＲＡＭに抗体エフェクター機能が要求されない目的が意図される場合、たとえば 造影１診断または細胞傷害性の標的化の目的では、１ｇＧ２およびＥ　ｇＧ４ア イソタイプドメインが使用できる。Ｌ鎖司変領域に融合できるＬ鎖ヒト定常ドメ インには。 ヒトラムダまたは、とくにヒトカブパ鎖が包含される。 別法として、ヒト定常ドメインの類縁体も有利に使用できる。これらには、相当 するヒトドメインにさらに１個もしくは２１１以上のアミノ酸を含有するそれら の定常ドメイン、または相当するヒト定メインミ存在するアミノ酸の１個もしく は２１１！以上が欠失もしくは変化したそれらの定常ドメインが包含される。こ のようなドメインは、たとえば、特定オリゴヌクレオチドの突然変異によって得 られる１本発明においては、Ｈ＠定常ドメインのとくにＩＩｒ眉な類縁体は、１ ｇＧ４定常ドメインにおいて相当する天然辷トドメインの２４１位置のセリン残 基がプロリン残基に変化したものである。 ＲＡＭの残部はヒト免疫グロブリンからの蛋白質配列のみからなる必要はない。 たとえば、ヒト免疫グロブリン鎖の部分をフードするＤＮＡ配列がポリペプチド エフェクターまたはレポーター分子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに融合し た遺伝子を構築することができる。 本発明の軍二のｒＪ様によれば１本発明の蒐−の態様のＨＡＭの製造方法が提供 される。すなわち。 （ａ）　”１変ドメインのＣＤＲの少なくとも１つがＣＴＭＯＩ　ＭＡｔ＋から 誘導され、抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンから誘 導される可変ドメインからなる抗体ＨまたはＬ鎖をコードするＤＮＡ配列を有す るオペロンを発現ベクター内に作製し。 （ｂ）可変ドメインのＣＤＨの少なくとも１つがＣＴＭＯＩ　ＭＡｂから誘導さ れ、抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンから誘導され る可変ドメインからなる相補性抗体ＨまたはＬ鎖をコードするＤＮＡ配列を有す るオペ　ロンを発現ベクター内に作製し。 （ｅ）両オペロンで宿主細胞をトランスフェクトし。 （ｄ）トランスフェクトされた細胞系を培養してＲＡＭを産生させる。 方法である。 細胞系は、茅−のベクターがＬ饋由来ポリペプチドをコードするオペロンを含有 し７軍二のベクターがＨ鎮由来ポリペプチドをコードするオペロンを含有する２ つのベクターでトランスフェクトすることができる。ベクターは、各ポリペプチ ド鎖が可能な限り間等に発現することを保証するために、フード配列と選択マー カーが関与する部分を除いて同一であることが好ましい。 別法として、Ｌ鎮およびＨ値由来ポリペプチドの両者をコードするオペロンを包 含する単一のベクターを使用することもできる。 さらに他の態様において１本発明はまた１本発明のＨＡＭのＨおよびＬ鎖をコー ドするＤＮＡ配列５　これらのＤＮＡ配７１１を含有するクローニングおよび発 現ベクター、これらのＤＮＡ配列でトランスフオームされた宿主細胞、ならびト ランス７寸−ムされた宿主細胞中でこれらのＤＮＡ配列を発現させることからな るＨまたはＬ鎖および抗体分子の製造方法を包含する。 ベクターを構築する一般的方法、トランスフェクシ１ン法および培養方法はそれ 目体よく知られている［１７．１８］。 ＣＴＭＯＩのＨ鎖およびＬｌｌ可変ドメインアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配 列（および相当する帰納されたアミノ酸配列）（＝、以下の配列表にそれぞれ配 列番号ｌおよび配列番号２として掲げる。 ヒト免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡは、任意の適当な方法で得ることが できる。たとえば、好ましいヒトアクセプターフレームワーク、たとえなＬＡＹ 。 ＰＯＭ、ＫＯＬ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ，ＴＥＩおよびＮ　Ｅ　Ｗ　Ｍ　）７　 ｉ　／　ｌｉ配列ハ。 本技術分野の研究者には広く利用できる。これらのアミノ酸配列をコードする相 当するＤＮＡ配列は、遺伝子暗号を逆に適用して推定または帰納できる。同様に ヒト定常領域ドメインのアミノ酸配列もよく知られていて、それらをフードする ＤＮＡ配列も容易に帰納できる。 ＣＤＲ接合生成物をコードするＤＮＡ配列の１１造には１分子生物学の標準技術 を使用することができる。所望のＤＮＡ配列はオリゴスクレオチド合成技術を用 いて完全にまたは部分的に合成することができる。特定部位の突然変異およびポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を適宜使用することも可能である。たとえば 、特定オリゴヌクレオチドの合成［１９］を使用できる。また、荊から存在する 可変ドメイン領域の特定オリゴヌクレオチドの合成Ｃ３，４］　も使用可能であ る。ギャップのあるオリゴヌクレオチドの７４ＤＮＡポリメラーゼによる酵素充 填［５］も使用できる。 キメラまたはＣＤＲ接合ＨおよびＬｌｌをコードするＤＮＡ配列の発現には、任 意の適当な宿主細胞／ベクター系が使用できる。細胞たとえば大腸菌および他の 微生物系は、とくに抗体フラグメントたとえばＦｖ、ｔａｂおよびＦａｂ’　フ ラグメントならびに単一鎖抗体フラグメントたとえば単一鎖Ｆｖの発現に使用で きる。真核ｍａたとえば哺乳Ｈａ主！ＩＪ！発現系は、完全な抗体分子を含めた 。より大きなキメラまたはＣＤＲ接合抗体生成物の産生に使用できる。適当な哺 乳類宿主細胞には。 ＣＨＯ細胞および骨髄腫またはハイプリドーマ系たとえばＮ５ＯＪＩＩＩ胞が包 含される。 本発明のさらに他の態様においては、エフェクターまたはレポーター分子に接合 したＨＡＭからなる接合体分子が提供される。すなわち５本発明のＲＡ　Ｍには たとえば、エフェクター分子たとえばＩＩＩＩ胞傷害剤もしくは静菌剤、または レポーター基たとえばヒト生体内部にあっても検出可能な放射性核種もしくは複 合放射性核種のような原子または分子を付着させることができる。たとえば、Ｈ ＡＭには、金属原子を結合できる巨大環のよ＾な有機基、リジンのようなト牟シ ン、以下に定義されるような抗腫瘍剤を、共有架橋構造によって付着させること ができる。別法として。 機能性非免疫グロブリン蛋白質たとえば酵素もしくはトキンン分子が、完全分子 のＦｃフラグメント、ＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインを１喚した。またはペプチ ド結合によって付着したＨＡＭの製造には９組換えＤＮＡ技術の操作も使用でき る。 本発明のこの態様にと（に有用な接合体分子は、メチルトリチオ抗腫瘍剤に接合 したＨＡＭである。特定のメチルトリチオ抗腫瘍剤としては、ＬＬ−Ｅ３３２８ ｇ複合体のＣ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４，β１．β２．γ１．δｌおよび偽アグリコ ン成分のノスルフイド類縁体ならびにそれらのｍ導体、またＢＢＭ−１６７５， ＰＲ−９００４０５、ＦＲ−９００４０６，ＰＤ１１４７５９．ＰＤ１１５０２ ８．ＣＬ−１５７７Ａ、ＣＬ−１５７７８，ＣＬ−１５７７Ｄ、ＣＬ−１５７７ ＥおよびＣＬ−１７２４抗腫瘍抗生物質のジスルフィド類縁体ならびにそれらの 誘導体を挙げることができる。 ＬＬ−Ｅ３３２８８ｆｆ合体として包括して知られている一部の抗細菌剤および 抗腫瘍剤は、ＵＳＰ４９７０１９８号（１９９０）に記載されていて９本発明の 接合体分子の出発原料の一部であるジスルフィド抗腫瘍剤の製造に使用される。 ＵＳＰ４９７０１（１８号には、ＬＬ−Ｅ３３２８８？１合体、その成分、すな わち。 ＬＬ−Ｅ３３２８８α１計、ＬＬ−Ｅ３３２８８α１’、ＬＬ−Ｅ３３２８８α ２８′。 ＬＬ−Ｅ３３２８８α２に、ＬＬ−Ｅ３３２８８α３′１′、ＬＬ−Ｅ３３２８ ８α３１゜ＬＬ−Ｅ３３２８８ａ４会’、ＬＬ−Ｅ３３２８８β１”、ＬＬ−Ｅ ３３２８８β１’。 ＬＬ−Ｅ３３２８８β２針、ＬＬ−Ｅ３３２８８β２’、ＬＬ−Ｅ３３２８８６ １Ｂ′。 ＬＬ−Ｅ３３２８８δ１’、ＬＬ−２３３２８８６１’、ならびに新規な株Ｍｉ ｃｒｏｍｏｎｏ−ｓｐｏｒａ　ｅｃｈＬｎｏｓｐｏｒａ　ｓｓｐ　ｅａｌｉｃｈ ｅｎｓｌｇまたはその天然もしくは誘発変異株を用いた通気培養法によるそれら の製造方法が記載されている。υ５Ｐ４９７０１９８号にはまた。上に挙げた成 分の一部の推定構造が開示されている。 さらにいくつかのＬＬ−Ｅ３３２８８複合体（カリヶマイシン類）がＵＳＰ４９ ３９２４４号（１９９０）に記載され請求されていて、同様に本発明の接合体分 子の製造に有用である。この特許には、一連のＬＬ−Ｅ３３２８８ブロモおよび ヨード偽アグリコンも記載されていて、これらは化学的方法で製造されている。 この特許にはまたさらに、上述のすべての抗腫瘍抗生物質からの水素化ホウ素ナ トリウムによるＣｔｔのケトンのヒドロキシル基への還元によって得られるジヒ ドロ誘導体も記載されている。 ＬＬ−Ｅ３３２８８ファミリー抗Ｉ！Ｉ瘍抗生物質のさらに他のメンバーが、Ｕ ＳＰ５０７９２３３号（１９９２）に記載され請求されていて、これらもさらに 本発明の接合体分子の製造に有用である。この特許には、化学的方法で製造され た。数置のＬ　Ｌ−Ｅ　３３２８１３複合体メンバーのＮ−アシル誘導体が記載 されている。 本発明の接合体分子の製造に有用な他の抗生物質としては。 １）ニスベラマイシンＢ　ＢＭ−１６７５［Ｍ、Ｉｏｎｉｓｈｉら、ｊ、＾ｎｔ ｊｂｉｏｔｌｃｓ、　ｆｆａ：１６０５（１１８５）　；　Ｍ、　Ｋｏｎｉｓｈ ［ら、ＵＫ特許明細書２，１４１．４２５Ａ、およびＵＳＰ４３７：ｌ５６６　 （１９８４）、Ｕ　Ｓ　Ｐ　４５５４１６２号、Ｄ、Ｗ、Ｆｒｙら、Ｉｎｖｅｓ ｔｉｇａｔｉｏｎａｌ　ＮｅｗＳ）ＣＬ−１５７７ＤおよびＣＬ−１５７７Ｅ抗 生物質抗腫瘍化合物６）抗微生物活性および抗腫瘍活性を宵するＮ−アセチルニ スベラマイシンＡＩ。 ＬＬ−Ｅ３３２８ｇ複合体、それらのジヒドロおよびＮ−アシル相対物、ならび にのＨＡＭ　（以下Ｈｕ　：　ＣＴ−Ｍ−０１）を、上記特許および特許８願の 化合物に導入することが可能で１本発明の接合体分子が形成される。 スキームＩにおいて、ＣＨ，−Ｓ　Ｓ　Ｓ−ｗは抗腫瘍抗生物質であり、ｓｐは 直鎖または分岐鎖の２価もしくは３価の（Ｃ１〜ｃ１８）基、２缶もしくは３伍 のアリールもしくはヘテロアリール基、２価もしくは３亡の（Ｃ，〜ｃ、８）シ クロアルキルもしくはへテロ／クロアルキル基、２価もしくは３価のアリールも しくはヘテロアリール−アルキル（Ｃ，〜ｃ、８）基、２価もしくは３価のシク ロアルキル−もしくはヘテロｌクロアルキルアルキル−アルキル（Ｃ１〜ｃ１８ ）基、または２価もしくは３価の（Ｃ２〜Ｃ１９）不飽和アルキル基であり、ｓ ｐが３価の基の場合にはそれはさらにアミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ 、ヘテロアリールアミノ、カルボキシル、低級アルコキ／ｌＩｌ：ドク牛シ、チ オールまたは低級アルキルチオ基によって置換されていてもよく；Ｑはハロゲン 、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシル６カルポキシアルデヒド、ヒドロキシ 、チオール、＋２−へロアセチルオキシ、低級アルキルジ力ルボ牛シｔＪ　−Ｃ ＯＮ　ＨＮ　Ｈ２，−Ｎ　ＨＣＯＮＨＮＨ２，−ＮＨＣＳ　Ｎ　ＨＮ　Ｈ＆−Ｏ ＮＭ２．−ＣＯＮ３゜ である。 スキーム■からの生成物がＨｕ　：　ＣＴ−Ｍ−０１に変換できるかまたはそれ と直接反応できる少なくとも１個の官能基を含有する限り、上述の特許および特 許出願の抗腫瘍抗生物質の標的化型を、以下のスキーム■に示すように、生成さ せることが式中、Ｑ、ｓｐ、およびＷは先に定義した通りで、Ｈｕ　：　ＣＴ− Ｍ−０１１２ＲＡＭ。 そのフラグメント、またはそれらの類縁体であり、Ｙは蛋白質の側鎖アミ／、カ ルボキシもしくはチオール基、炭水化物残基古来のアルデヒド、またはアミノア ルキルチオ基であり、ｎは１〜１００の整数であり、２は基ＱおよびＹの共有結 合反応からｒＩＫ接またはついで還元後に形成され、Ｚは−ＣＯＮ）（−、−Ｃ ＯＮＨＮ−ＣＨ−。 Ｃ０ＮＨＮＨＣＨ２−、−ＮＨ−ＣｏＮＨＮ−ＣＨ−、−Ｎｌ（ＣＯＮＨＮＩ（ Ｃ）１２−、−ＮＨＣ３ＮＨＮ＝ＣＨ−、−ＮＨＣ３ＮＨＮＨＣＨ＊−、−０Ｎ −ＣＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣＨ２−、−Ｎ−ＣＨ−、−ＣＯ２−、−ＮＨＣＨ ２ＣＯ２−、−５Ｓ−。 であり１ｍは（１１〜１５である。 上記スキームｎを参照しながら一例を示せば、Ｅ−３３２８８７１１の３−メル カプトプロピオン酸誘導体（Ｑ−＊Ｃ０２Ｈ，５ｐｆｉ、ＣＨ２ＣＨ２−）は、 その活性化ヒドロキシスクシンイミド’１１　（Ｑ−ＣＯ２ＳＬｌ、５Ｐ−ＣＨ ２ＣＨ２−）に変換された場合。 Ｈｕ　：　ＣＴ−ＭＯ１の一部のりジン残基のεアミ７基（たとえばＹｍ−ＮＨ ，ｎ諺５０〜１００利用できるリジン残基から）との反応に使用することが可能 であり。 水性緩衝溶液中ｐＨ７，０〜９．５．温度４℃〜４０”Ｃで、Ｉ白質骨格に沿っ てうングムな位置に抗生物質が付着した本発明の接合分子が生成する（Ｚ−−Ｎ ＨＣＯ−。 ５ｐ＝−ＣＨ２ＣＨ２−、ｍ−１〜１０）、この様式で、利用可能なりジン残基 の一部分のみが置換される９高負荷は一般に、抗生物質免疫活性の保持との適合 性が考えられないからである。ｒＩ！Ｉしくランダムに置換された免疫接合体は また。３−メルカプトプロピオン酸誘導体から、他のカルボキシル基活性化剤た とえば様々なカルＢジイミドまたは相当するアシルアジドを用いて製造できる。 別法として、Ｅ３３２８８７１’の３−メルカプトプロピオン酸誘導体（Ｑ＝Ｈ ２ＮＮＨＣＯ−，５ｐ−ＣＨ２ＣＨ２−）を、ＵＳＰ４６７１９５８号の記載に 従い、緩衝水性溶液中ｐ）［４〜７゜温度４℃〜４０℃で、過ヨウ素酸酸化抗体 （Ｙ−−ＣＨＯ，Ｎ−１〜１５）と反応させるとフルデヒド富能基（抗体のＦｃ ５分上に位置する炭水化物残基のｖｒｃ−ジオールの切断で誘導）とのみ反応し 、蛋白質骨格に沿った特定の位置での薬剤置換を含有するＨｕ　：　ＣＴ−Ｍ− ０１が生成する（Ｚ−−ＣＨ−ＮＮＨＣＯ−，５ｐ−−ＣＨ２ＣＨ２−、ｍｍ０ ．５〜１０）、１１剤構造の部分としての他のアルデヒド反応性基もスキーム■ の生成物を生成させるため１本発明に使用できる。このような官能基は好ましく は、それらに限定されるものではないが、酸性水性条件下にアルデヒドと反応す る基である。塩基性条件下での蛋白質リジンの反応性は十分大きいので、それら のアミンはスキーム■の生成物と、モノクローナル抗体に存在するアルデヒドに 関し競合する。別のアルデヒド反応性基には、たとえばチオセミカルバジド、チ オセミカルバジド、および〇−置換ヒドロ牛ジルアミン官１１１１Ｅがある。 本発明の接合体分子の構築は、スキーム■に略述された順序に限定されるもので はない、以下のスキーム■に従い、Ｈｕ　：　ＣＴ−Ｍ−０１抗体をまず修飾し てチオール基を含有させ、ついで本発明に＊Ｎな抗腫瘍抗生物質と反応させるこ 七もできる。 式中、　Ｈｕ　：　ＣＴ−にτ−０１，Ｙ、Ｑ、Ｓｐ、Ｗ、ｎ、およびｍは先に 定義した通りであり、Ｐは水素または２−（ピリジルチオ）である、ただし、Ｙ がＨｕ：ＣＴ−、Ｍ−０１の骨格アミノ酸残基に由来するチオールである場合に は、ｚ−ｓｐは両者で共有結合である。 上記スキーム−を参照しながら一例を示せば、Ｈｕ　：　ＣＴ−Ｍ−０１モノク ローナル抗体は３−（２−ジチオピリジル）プロピオン酸エステルと反応させ、 蛋白質をリジン残基を介して修飾する（Ｙ＝−ＮＨ２，ｎ−５０〜Ｚｏｏ、Ｑ− −ＣＯ２Ｓｕ、３ｐ−−ＣＨ２ＣＨ２−、Ｐ−２−ピリジルチオ）、たとえばジ チオスレイトールで還元したと、中間体が得られ（Ｚ＝−ＮＨＣＯ−，５ＧＩ− −ＣＨ２ＣＨ２−、Ｐ−Ｈ，ｍ−１〜１５）、これを抗腫瘍抗生物質と反応させ て本発明の免疫接合体を生成させることができる。同様に、２−イミノチオラン をＨｕ　：　ＣＴ−Ｍ−０１と反応させて、ｊ１元工程を要さずに、蛋白質の表 面に直接チオール基を導入しくＺ−−ＮＨＣＯ−，５ｐ＝−（ＣＨ２）３−、Ｐ −Ｈ，ｍ−１〜ｌ　５）、　この中間体を上述のようＩｃ、　ＣＨ３−８ＳＳ− Ｗと反応鎖せることができる。別法として、Ｈｕ　：　ＣＴ−Ｍ−０１の構造中 に。 システィン残基としてダイマー型で存在する固有のスルフヒドリル基を、直接、 スキームｍの反応に与らせるために使用できる。このようなスルフヒドリル基は 、旧来の方法で、酵素消化とネイティブモ／りａ−ナル抗体の還元によって暴露 される（Ｈｕ：ＣＴ−Ｍ−０１ｍＦｍｂ’　７５グ／７ト、Ｚ−３ｐ−結合、Ｙ −３Ｈ）。 本発明の好ましい実施態様は１式 の蛋白質−８剤複合体であり、ＬＬ−Ｅ３３２ＢＢと命名された一部の抗腫瘍抗 生物質（ＣＨ２−５ｓｓ−ｗ）から。 ジチオメチル残基を１式Ｑ−５ｐ−５Ｈの化合物（式中、Ｓｐは、ｌ［鎖状もし くは分岐状の２価もしくは３価の（Ｃ２〜Ｃ１ｏ）ＰＩ３基、または２価もしく は３価の（Ｃａ−Ｃｓ）アリールアルキルもしくはヘテロアリール−アルキル基 であり、ｓｐが３価の基である場合には、それはさらにアミノ、ヘテロアリール アミノ、ヒトａ牛シ、またはチオール基で置換されていてもよ＜、Ｑはカルボ牛 シル、低級アル亭ルジヵルボキシル無水物、−ＣＯ２Ｓｕ、−ＣＯＮＨＮＨ２， まりｃｔである）の化合物で置換して、一般式ｏ−５ｐ−ｓ　ｓ−ｗ　（式中、 Ｑ、ｓｐ、　およびＷは先に定義した通りである）を生成させ、ついでＱ−３Ｉ ＋−５Ｓ−ＷをＨｕ　：　ＣＴ−Ｍ−０１−（Ｙ）ｎ（式中、Ｙは抗体上の側鎖 アミ／基。 または抗体の炭水化物基の酸化によって生成させたアルデヒドであって、ｎは１ 〜１００の整数である）と反応させて１式（式中、Ｑ、ＳＰ、および、Ｗは先に 定義した通りであり、２は基ＱおよびＹの共有結合反応から直接または続く還元 後に形成され、２は−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＮ−ＣＨ−、−ＣＯＮＨＮ）ＩＣ Ｈ２−、またはであり１ｍは０．１〜１５である）を生成させる方法によって製 造される。 本発明はまた２本発明のＩ（ＡＭ、と（にＨＡＭがエフェクターまたはレポータ ー分子に接合してなる接合体分子を含有する治療用および診断用組成物、ならび にこのような組成物の治療および診断における使用を包含する。このような治療 用および診断用組成物は通常９本発明のＲＡＭとたとえばインビボ用の医薬的に 許容される賦形剤、希釈剤または担体と七もに含有する。 治償的および診断的使用には通常１本発明のＲＡＭの！！藁的有効量をヒト対象 に投与する。投与すべき正確な用量は、ＲＡＭの意図された使用ならびに患者の 年齢および状態によって変動するが１通常は約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、たと えば約１ｍｇ〜５００ｍｇである。ＨＡＭは単回投与とすることも、また長期間 にわたって連続投与することもできる。薬用量が適宜反復される。ＲＡＭは、任 意の適当な経路での慣用の実務に従い処方できるが、一般的には、たとえば静脈 内、ａ腔内または筋肉的投与のために、液体剤形（たとえば、威麿された生理的 に許容される緩衝液中、抗体の溶液）とすることができる。 本発明の軍−の態様のＨＡＭおよび本発明の箪二の態様の方法においては、ＨＡ ＭのＨおよびＬ鎖可変ドメインはＣＴＭＯＩ　ＭＡｔ）の全可変ドメインからな るか。 ＊たｌＳＣＴＭＯＩ　ＭＡｂの１．２もしくはすべてのＣＤＲにヒト可変ドメイ ンのフレームワーク領域が接合してなる。すなわち、ＨＡＭはキメラ式化抗体、 またはＣＤＲ接合接合人体抗体なる。 ＨＡＭがＣＤＲ接合接合人体抗体る場合には、ＣＤＨに加えて、特異的な可変領 域フレームワーク残基を相当する非ヒトすなわちＣＴＭＯＩマウス残基に変える ことができる１本発明のＣＤＲ接合接合人体抗体ましくは我々の国際特許明細書 Ｗ○−Ａ−９１１０９９６７において定義されたＣＤＲ接合接合人体抗体含する ことが好ましい、　ＷＯ−Ａ−９１１０９９６７の開示を参考として本明細書に 導入する。 好ましくは、Ｌ鑓４）ＣＤＲは、ＣＤＲＩ　（残基２４〜３４）およびＣＤＲ２ （！！基５０〜５６）においてＫｉｂｉｔ　ＣＴＭＯＩ　ＭＡｂ　ＣＤＲ，なら びに構造ループ残基（残基９１〜９６）Ｃまたｉｔ　ＣＤ　Ｒ３中のＫａｂａｔ 　ＣＴＭＯＩ　ＭＡｂ　ＣＤＲ残基に相当する（上に挙げた残基および本田１の 他の場所に表れる名称はＫ　ａｂａｔの符号法［１６］に従う）、さらに、Ｌ＠ は、ｌ！１ａｌＥ１．２．３，３６，３７，４５．４ｇ。 ４９．６０，６３，７０．８４，８５．８７および１０８の１個または２個以上 に。 マウスＣＴＭＯＩ残基をもっていてもよい、好ましい実施態様においては、ヒト フＬ／−４７−９に：、ＥＵをＩｌ’眉した場合、Ｌ鑓１ｔｃＤＲ１，ＣＤＲ２ およびＣＤＲ３（ＤすべてでＫａｂａｔ　ＣＴＭＯＩ　ＭＡｂ　ＣＤＲからなり 、好ましくはさらに２位置３゜３６．３７，４５．４８．６３および１０８にお いてＣＴＭＯＩ残基を有する。とくに付加的なＣＴＭＯＩ残基は１位置３，３６ ．６３および１０８のみにあることが好ましい。 Ｈ鎖１７３　ＣＤ　ＲＲ１好ましくは、ＣＤＩＩ（２５−３５）、ＣＤＲ２（５ ０〜６５）およびＣＤＲ３（９４〜１００）（ＤすべてでＫａｂａｔ　ＣＴＭＯ Ｉ　ＭＡｂ　ＣＤＲに相当する。さらにＨ鎖は、残基２，６，２３，３７，４８ ，４９，６７．６９，７３゜７６．７８，８０．８８．９１および９４の１個ま たは２個以上において、７ウスＣＴＭＯＩ残基をもっていてもよい、とくに好ま しい実施態様においては、使用したヒトフレームワークがＥＵの場合、ＨＩｌフ レームワークは、２，３７．７１および７３において、さらにとくに位置４８． ６７および６９において、付加的なＣＴＭｏｌ　ＭＡｂ残基からなる。 さらにＥＵは、とくにイディオシンクロティ１りなＪ領域を残基１０３〜１１３ に有し、残基１０３〜１１３には、マウスアミノ酸、コンセンサスヒトＪ領域ま たは両者の適当な組合せを包含することが有用である。Ｅυフレームワークを使 用する場合、好ましくは残基９４，１０３，１０４，１０５および１０７はマウ ス残基とする。これらの残基の場合、ヒト配列には、マウス配列がＥυ残基より も頻繁に見出されるからである。 図１はプラスミドｐＲＲ６２の模式的ダイアグラムであり。 図２はプラスミドｐＡＬ４１の模式的グイ７グラムであり。 図３はプラスミドｐＭＲＲ０１７の模式的グイ７グラムであり。 図４はプラスミドｐＨＭＣ３４の模式的ダイアグラムであり。 図５はプラスミドｐＭＲＲＯ１１の模式的ダイアグラムであり。 ｌＩ！Ｊ６はプラスミドｐＨＭｃ３２の模式的ダイアグラムであり。 ｒＩ！Ｊ７はプラスミドｐＭＲＲｏ　２２の模式的ダイアグラムであり。 ｒＩ！Ｊ８はプラスミドｐＭＲＲｏ　１４の模式的グイ７グラムであり。 図９はプラスミドｐＭＭＣ３３の模式的ダイアグラムであり。 図１ＯはプラスミドｐＭＲＲＯＯ１の模式的ダイアグラムであり。 図１１はプラスミドｐＨＭｃ３６の模式的グイ７グラムであり。 図１２はプラスミドｐ）（ＭＣ３８の模式的グイ７グラムであり。 図１３はプラスミドＤＨＭＣ４０の模式的グイ７グラムであり。 ！１ｌｉ１４はプラスミドｐＨＭｃ４１の模式的グイ７グラムであり。 １１５はプラスミドＤＨＭＣ４２の模式的グイ７グラムであり。 図１６はｇＨ１コード配列のけいせいにおけるオリゴヌクレオチドＨ１〜Ｈ８の アラインメントを示し。 図１７はプラスミドＤＡＬ５１の模式的ダイアグラムであり。 図１８はプラスミドｐＡＬ５２の模式的ダイアグラムであり。 図１９はプラスミドｐＭＲＲｏ　Ｉ　Ｏの模式的ダイアグラムであり。 図２０はプラスミドｐＡＬ４７の模式的ダイアグラムであり。 図２１はプラスミドＤＡＬ４ｇの模式的ダイアグラムであり。 図２２は一過性発現キメラ抗体についての直接結合ＥＬ　Ｉ　ＳＡのグラフであ り。 図２３は一過性発現ＣＤＲ接合抗体の直接結合ＥＬＩＳＡのグラフであり。 １！＋２４は一過性発現率メラおよびＣＤＲ接合抗体についての直接結合ＥＬ　 ｒ　ＳＡのグラフであり。 図２５は、ヒト卵巣異種移植腫瘍をもつヌードマウスを５それぞれＮ−７セチル カリケマイシン７１′の４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸ジスルフィド のヒドロキシスクシンイミド誘導体に接合させた式化ＣＤＲ接合ＣＴＭＯＩおヨ ヒマウスＣＴＭＯＩ抗体で処置した場合の腫瘍サイズに対する影響を比較したグ ラフである。 で、請求の範囲に対するいかなる意味での限定とも考えるべきではない。 Ｃ７Ｍ０１キメラＨの　クローニングおよびｓＩｇＣＴＭＯＩのＨ５ｌ可変ドメ インはポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローニングされた。これは、以下に記載 するように、単一工程での牟メラバージ盲ンの構築を可能にする。 ポリアデニル化ＲＮＡは、グアニジニウムインチオシアネート／塩化リチウム法 ［１７］を用いＣＴＭＯＩハイブリドーマ細胞系から単離された。二本鎖ｅＤＮ Ａを合成し、ＶＨ遺伝子のＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。２４の５’ｌｌｌ 相プライマーのセットを合成してＶＨドメインのマウスリーダー配列［１６］内 の配列を補充し、ＢｓｔＥ］Ｉ制隔部位を導入した。１２０３′逆相プライ７− のセットを合成し。 ＶＨのフレームワーク４領域〔２ｏ］を補充し、Ａｐａｌ制限部位を包含させた 。 基本的な５゛プライマーの配列は配列表に配列番号３として掲げる、２４のプラ イマーのセットは、以下のようにこのプライマーに基づくものである。２４プラ イマーの一グループでは、残基２７はＣとして残した。４つのプライマーの３つ のサブグループでは、残基２５はＧとして残すか、ＣまたはＴに変化させた。各 サブグループ中、４つのプライマーは残基２８が興なり、Ａ、Ｃ，ＧまたはＴで あった。 ＮＩ＆２ＳがＣｔたはＴのサブグループでは、６番目のアミノ酸はＨｌｇである 。 １２のプライ７−の宵二のグループでは、残基２７はＧに変化させる、４つのプ ライマーの軍三のサブグループでは、残基２５はＧのまま七するか、ＣまたはＴ ｋ。 変える。各サブグループ中、４つのプライマーは、Ａ、Ｃ，ＧまたはＴとしたＭ Ｍ２８で異なる。残基２５がＣまたはＧの場合アミノ酸６はＧｌｎ、残基２５が Ｔの場合アミノ酸残基Ｇは旧＄である。残基２８がＴまたはＣの場合、アミノ酸 残基７はＣｙｓである。！ｌ基２８がＧの場合、アミ７ｍ！ｌ基７はｒｒｐであ る。 基本的３’　ＰＣＲプライマーの配列は、配列表に配列番号４として掲げる。１ ２のプライマーのセットは、以下のようにこのプライマーに基づ（ものである、 １！ｉ基５はＧとして残すか、ＡまたはＴに変化させることができた。！！ｌ基 １１は、Ａのままにするか、Ｇに変化させる。！ｌｌｉ２は、へのままにするか 、Ｃに変化させる。 ＣＴＭＯＩ　ＶＨのＰＣＲ増幅は、以下の条件を用いて実施した。 各プライ？−１０ｐｍｏｌｅ；ｃＤＮＡ２０ｎｇ；Ｔａｑポリメラーゼ０．５Ｕ ：９４℃１分；５０”０２分ニア２℃３分：４０サイクル。 ＰＣＲ増暢増幅（フラグメントはＢｓｔＥｆｒおよびＡｐｉｌで制限し、ついで アダプターにリゲートしてリーダー配列の再構築、５’　ＨＩｎｄｌｌ［制限酵 素部位を付加した。 使用したアダプターの配列は配列表に配列番号５として掲げる。これは、一部、 マウス抗ＴＡＧ−７２モノクローナル抗体８７２．３のＶＨドメインのリーダー アミノ酸配列をフードする（ＷＯ−Ａ−８９７０１７８３）。 ついで適応されたフラグメントを、ベクターｐＥ１００４のＨ１ｎｄＩＩＩ　／ 　Ａ　Ｐ！　Ｉ部位にクローニングして１図１に示すプラスミドｐＲＲ６２を得 た。プラスミドｐＲＲ６２は５ｖ４０複製の起源、続いてｌｉ　ＣＭＶ−Ｍ　Ｉ 　Ｅプロモーター／エンハンサ−領域から構成される。このプロモーター／エン ハンサ−はＣＴＭＯ１ノＨＩ［可１”ドメインがヒトｇ４定常ドメインに融合し てなるキメラＨ鎖をコードするヌクレオチド配列を制御する。コード配列の下流 はポリ式サイトおよびｔｐｔ遺伝子である５ｐＲＲ６２の数個の独立のクローン のＨ鑓可変領域の配列を決定した。ＣＴＭＯＩ　ＶＨについてのＤＮＡ配列およ び帰納されたアミノ酸配列を配列番号１に示す、ＣＴ　Ｍ　ＯＩキメラＬ　の　 子クローニングおよびＩ＊ポリアデニル化ＲＮＡは、グアニジニウムインチオシ アネート／塩化リチウム法［１７］を用いＣＴＭＯＩハイブリドーマ細胞系から 単離された。二本鎖ｅＤＮＡを合成し［２１］、ＣＤＮＡライブラリーをプラス ミドｐｓｐｓ４［２２］中に。 ＥｃａＲＩリンカ−を用いて構築した。マウス免疫グロブリンＬ鎖定常領域に相 補性のスクリーニングプローブはＰＣＲ増幅によって合成した。Ｌｌｌプローブ はマウスカッパＬ鎖定常領域〔２３〕をコードする３１８ｂｐＰＣＲフラグメン トであった。 プローブはランダムへ牛ソヌクレオチドプライミングにより（ｇ”Ｐ）Ａｒｐで 放射標識し、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。 Ｌ鎖の完全リーダー、可変および定常ドメインをフードするクローンを単離し。 ｐＲＢ６３と命名した。 Ｌ鎖の可変ドメインをコードするｐＲＢ６３のフラグメントをＢｓｔｂｒ／ｌｐ Ｈで制限し、プラスミドｐＭＲＲｏ　１０のＢｓｔｂｌ／ＳｐＨ部位の間にリゲ ートし。 図２に示すプラスミドｐＡＬ４１を生成させた。プラスミドｐＡＬ４１は、グル タミンシンテターゼｃＤＮＡとその下流のｈＣＭＶ−ＭｒＥプクそ一ター／エン ハンサー領域から構成される。このプロモーター／エンハンサ−領域はＣＴＭＯ ＩのＬ鎖可変ドメインがヒトＣＫ定常ドメインに融合してなる牛メラＬ鎖をコー ドするヌクレオチド配列を制御する。コード配列の下流はポリ式サイトである。 ヌクレオチド配列分析は読み終り操作によって実施した［２４］、　ｐＲＲ６２ 中のＶＨコード配列インサートおよびｐＡＬ４１中のＶＬコード配列を完全に配 列決定した。ＣＴＭＯＩのＨおよびＬｌｌの非ブロセフシング可変ドメインのＤ ＮＡおよび予測されたアミノ酸配列をそれぞれ、説明の末尾に添付した配列表に 、配列番号１および２として掲げる。 配列１は、ｖＨドメインのコード配列および予測されるアミノ酸配列を示す、Ｈ 鎖のリーダー配列は、配列番号１に示すように、残基１から残基工９３！でであ る。 配列２は、ＶＬドメインのコード配列とともに、予測されるアミ／１ｊＩｌ配列 を示す。 ＬｆｌＩのリーダー配列は、配列番号２に示すように、ＨＭｘから残基２ｏまで である。 推側されたアミノ酸配列をＵべたところ、他の特性づけられた免疫グロブリン遺 伝子とかなりのホモクジ−が明らかＩこされた。ＣＴＭＯＩ　ＭＡｂはＩｇＧ１ −カッパ抗体であることが確認された。 ｈｃＭＶ−ＭＩＥブｃ＋％−１−４１び＊１５Ｌ１１％有する。ｐＡＬ４１（Ｄ ＣｌｉＩ−ＥｅａＲＩフラグメントを１図３に示すプラスミドｐＭＲＲ０１７に クローニングした。プラスミドｐＭＲＲｏ　１７は、ＧＳ！二遺伝子（ＷＯ−Ａ −８７７０４４６２）　。 ｈｃＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサ−領域、ポリリンカー配列およびポ リ式サイトを有する。これにより図４に示すプラスミドｐＨＭｃ３４が生成した 。このプラスミドｐＨＭＣ３４では、キメラＬ鎖遺伝子はｔｔｃＭＶ−ＭＩＥプ ロモーター／エン八ンへ−配列によって制御される。 ｖＨドメインをコードする配列を含有するＨｉｎｄｌｎ−Ａｐａｒフラグメント は、プラスミドｐＲＲ６２（ｌｉｉｉｌｌ）から切り出した。このフラグメント をプラスミドｐＭＲＲｏｌｌのＨ（ｎｄｍおよびＡ東ｒ部位の間に押入した。プ ラスミドｐＭＲＲｏ　１１は１ｌｌｆｆ５ニ示す、これは、ｈＣＭＶ−ＭｆＥプ ａモーｙ−７ｘンハンｖ−ＨＬ　ＳＶ４０ポリアデニル化記列、ｇｐｔｆｆｉ伝 子、および可変ドメインを欠くヒトＩｇＧＬＨ鎖をコードする配列から構成され る。このようにして製造されたプラスミド、ｐＨＭＣ３２は図６に示す、ｈＣＭ Ｖ−ＭＩ　Ｅプロモーター／エンハンサ−の制御下にキメラｌ（＠　：＋−ド配 列を有する。このキメラＨ鎖は、ヒト１ｇＧ１定常ドメインに融合した。ＣＴＭ ＯＩ　ＭＡｂからのＶＨドメインを有する。 上又立互！！！ ｐＲＲ６２（図１）　？ＤＨｉｎｄｌＩＩ−ＡｐａＩ　７９りｆｉ　ント１ｔ、 　ｈＣＭ’Ｖ−Ｍｒ　Ｅプロモーター、ポリリンカーサイト、およびヒトＥ　ｇ Ｇ２抗体の３つの定常ドメインをコ−ドするヌクレオチドコード配列を含有する プラスミドのＨＩｎｄｍおよｄＡｐａ１部位の間に挿入した。これにより、プラ スミドｐＭＲＲｏ　２２が得られた。これは。 ヒトＩｇＧ２定常ドメインに連結した。ＣＴＭＯＩ可変ドメインを有するキメラ Ｈ鎖をコードする。 上ｌ１土！！！ ｐＲＲ６２（図１）のＨｉｎｄＩＩ［−Ａｐｉｌ　７ラグメントを、プラスミド ｐＭＲＲｏ　１４のＨｉｎｄｍおよびＡｐ！１部位の間に挿入し、プラスミドｐ ＨＭＣ３３を製造した。 プラスミドｐＭＲＲｏ　１４およびプラスミドｐＨＭＣ３３はそれぞれ図８およ び９に示す、プラスミドｐＭＲＲＯ１４はｈＣＭＶ−ＭＩＥブＣ２％−９、ボ’ Ｊ’Ｊンカーサイト、およびヒトｒ　ｇＧ４抗体の３つの定常ドメインをコード するヌクレオチドコード配列を有する。プラスミドｐＨＭＣ３３は、：Ｉ−ド配 列がＣＴＭＯＩ可変ドメインと、ヒト［ｇＧ１定富定常インの代わりにヒトＩｇ Ｇ４定常ドメインを有するキメラＨ＃ｌＩをコードするほかは、プラスミドｐＨ ＭＣ３２と間−である。 艮良ＩＬ立土！！生 プラスミドｐＨＭＣ３３からＨｉｎｄｍ−ＡｐａＩフラグメントを単離した０図 １０に示したプラスミドｐＭＲＲｏ　Ｏ１をＨｉｎｄｍおよびＡｐａｒで消化し た。大きい方のフラグメントを単離し、プラスミドｐＨＭＣ３３のＨｌｎｄｍ− Ａｐａｌ　７ラグメントにリゲートし、ｌ！１ｉｌｌｌに示すプラスミドｐＨＭ Ｃ３５を生成させた。プラスミドｐＨＭＣ３５は、コード配列がＣＴＭＯＩ可変 ドメインと、ヒト１ｇＧ１定常ドメインの代わりに変化ヒｚｇＧ４（以下、ｆｇ Ｇ４Ｐと呼ぶ）定常ドメインを有する亭メラＨ鎖をコードするほかは、プラスミ ドｐＨＭＣ３２とほぼ間−である。 定常ドメインにおける変化は１位置２４１における螺番領域のセリン残基のプク リン残基への変化からなる。この変化は、他の場合にはＩ　ｔＧ４定常ドメイン で時に認められる８０ＫＤ半抗体の形成が排除されるので有利である。 キメラＨおよびＬＩｌｌベクター 問−ベクター内にＨおよびＬの両鎖をフードするオペロンを有するベクターを構 築した。 ｈＣＭＶ−ＭＩＥブクモーター／エンハンサ−１＋メラＬ鑓コ一ド配列およびＳ Ｖ４　Ｉｔ！すＡサイトドＧＳミニ遺伝子をもつＮｏｔＩ−Ｓａ１１フラグメン トを、プラスミドＩ）ＨＭＣ３４（図４）から切り出した。ｆｉＣＭＶ−ＭＩＥ プロモーター／エンハンサ−をもつＮｏｔ　Ｉ　−ＨＩｎｄｍフラグメントを、 プラスミドｐＨＭｃ３５（図１１〉から切り出した。変化１　ｇＧＡＨ鎖コード 配列およびＳＶ４０ポリＡサイトをもッＨｉｎｄｍ−Ｓ　ｉｔ　＋フラグメント をプラスミドｐＨＭ、、；、３５（図１１）から切り出した。これらの３つの７ ラグメントを互いにリゲートし１図１２に示すプラスミドｐＭＭＣ３８を製造し た。これは、変化１　ｇＧＡＨ鎖とともにキメラし鎖の発現をコードする。 プラスミドｐＨＭＣ３２，ｐＭＲＲＯ２２およびｐＨＭＣ３３をＨｉｎｄｍおよ びＥｅｏＲＩで消化し、キメラＨ鎖コード配列を含有するフラグメントを単離し た。単離されたフラグメントをそれぞれ、ｐＨＭＣ３３（図１２）の大きい方の Ｈｌｎｄｌｌ−３ｍｌｌフラグメントおよびＳＶ４０ポリＡ頌域からなるＥｃｏ ＲＩ−５ａ１１フラグメントとリゲートした。このリゲーシ■ンにより、プラス ミドｐＨＭＣ４０，ｐＨＭＣ４１およびｐＨＭＣ４２が生成した（それぞれ１ｉ ｌ１１３〜１５に示す）、ｐＨＭ（。 ４０はＩｇＧ１定常ドメインを有するＨｉｌｌをコードする。ｐＨＭ（４１はＩ 　ｇＧ２定常ドメインを、ｐＨＭＣ３３はＩ　ｇＧ４定常ドメインをコードする 。 ＣＤＲＡ　体生成物の　。 ＣＤＲ接合の実施には、ＥＵヒヒト体フラグメント〔１６］の使用することに決 定した。ＣＤＲ接合に用いた戦略は、我々の国際特許ＷＯ−Ａ−９１１０９９６ ７に示した通りである。 ２つのＣＤＲ接合Ｈ１ｌを設計した。第一のｇＨｌにおいては、すべての３つの ＣＤＲ（Ｋａｂ息ｔ［＋６］によって定義された）をマウス残基に変化させた。 さらに。 Ｋ鳳ｂａｔのＣＤＲの外側の残基である２、３７，７１，７３，９４，１０３， １０４゜１０５および１０７もマウス残基に変化させた。第二のｐＨ２において は、ｇＨｌのマウス残基に加えて、ＶＨドメインのパフキングを改良する観点か ら、残基４８゜６７および６９を変化させた。 ２つのＣＤＲ接合ＬＩ［も設計した。第一のｇＬｌにおいては、すべての３つの ＣＤＲ（Ｋｉｂｉｔ　［１６］によって定義された）をマウス残基に変化させた 。さらに。 Ｋ　ａｂｕｔのＣＤＲの外側の残基である３、３６．６３および１０８もマウス 残基に変化させた。第二のｇＬ２においては、ｇＬｌのマウス残基に加えて、バ ッキングを改良する観点から１Ｍ基３７．４５および４８を変化させた。 ｇＨ１可変ドメインをコードするヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドＨ１ 〜Ｈ８を用いるオリゴスクレオチドアッセンブリーによって製造した。これらの オリゴヌクレオチドの配列はこの記述の末尾の配列表に、配列番号６〜１３とし て掲げる。これらのオリゴヌクレオチドを組立てて、ｇＨ１コード配列を製造す る方法は図１６に示す、このｇＨ１配列によってコードされるアミノ酸配列は、 配列番号１４に掲げた配列中に示す。 ｐＨ２可変ドメインをコードするヌクレオチド配列も、オリゴスクレオチドＨ１ ゜Ｈ２，Ｈ３Ａ、Ｈ４，Ｈ５，）（６Ａ、Ｈ７およびＨ８を用いるオリゴヌクレ オチドアッセンブリーによって製造した。オリゴヌクレオチドＨ３Ａはオリゴヌ クレオチドＨ３（配列番号８）とは、残基５５〜５７がＧＴＧからＧＣＡに便化 され、残基６１〜６３がＡＴＴからＣＴＧに変化された点で相違する。オリゴヌ クレオチドＨ・６ＡはオリゴヌクレオチドＨ６（配列番号１１）とは、残基７０ 〜７２がＴＡＣか基８９においてｒＬＥがＬＥＵに変化したほかは、配列番号１ ４として示した配列と同じ配列をフードする。 ｇＬｌ可変ドメインをコードするヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドし１ 〜Ｌ８を用いるオリゴヌクレオチドアッセンブリーによって製造した。これらの オ可変ドメインコード配列によってフードされるアミノ酸配列は、配列表に配列 番号２０として掲げる。 によって製造した。オリゴヌクレオチドＬ２ＡはオリゴヌクレオチドＬ２（配列 番〜２７がＣＡＧからＣＴＣに変化され、残基４９〜５２がＡＡＧからＣＡＧに 変化され、残基５９〜６１がＣＡＴからＡＴＣに変化された点で相違する。すな わち。 ｇＬ２可変ドメインは、残基２３においてＧｌｎがＶａｌに変化し、残基６２に お０てＧｌｎがＬｅｕに変化し、残基６０においてＬｙｓがＧｉｎに変化し、残 基７３においてはＭｅｔがＩｌａに変化したたほかは、配列番号２３として示し た配列と同じ配列をツー遺伝子アブセンブリ−には、ｌｐｍｏｌｅのＨ２〜Ｈ７ またはＬ２〜Ｌ７を１０５０”Ｃ１分、７２℃１分）行った。得られたフラグメ ントを、ＶＬではＨｉｎｄｍとＡ９工Ｉにより、ＶＨではＢＳ＋ｂｌおよび５ｐ ｒｘにより切断した。 ｇＨｌおよびｐＨ２をフードするヌクレオチド配列は、Ｈｉｎｄｍ−Ａｐａｌル ミｌフラグメントプラスミドｐＭＲＲｏ　１４　（図８）にクローニングして、 プラスミドｐＡＬ５１およびｐＡＬ５２　（それぞれ図１７および１８）を製造 した。 ｇＬｌおよびｇＬ２をコードするヌクレオチド配列は、Ｈｉｎｄｍ−Ａｐｉｒフ ラグメントとしてプラスミドｐＭＲＲＯ１０（Ｇｉｆｔ　９）にクローニングし て、プラスミドｐＡＬ４７およびｐＡＬ４ｇ　（それぞれ図２０および２１）を 製造した。 キメラ　キメラまたはＣＤＲＡ　キメラ　体の−゛性性態以下プラスミド： ｐＨＭＣ３８，ｐＨＭＣ３３，ｐＨＭＣ３３およびｐＨＭＣ４２ならびに以下の プラスミド対： ｐＡＬ４７．ｐＨＭＣ３３；ｐＡＬ４８．　ｐＨＭＣ３３；ｐＡＬ５１．ｐＡＬ ４１　；ｐＡｔｓ２．Ｉ）ＡＬ４１　；およびｐＡＬ４８．ｐＡＬ４１をそれぞ れ、一過性発現のために、ＣＨＯ−Ｌ７６１ｈ細胞にトランスフェクトまたはコ トランスフェクトした。 単一のトランスフェクト細胞から得られた培養上清についての、アッセンブリー ＥＬ　ｒ　ＳＡにより、これらは組立てられた抗体を含むことが示された。 抗体収率の定量のためのアブセンブリ−ＥＬＩＳＡには、ヤギＦ（ａｂ’）２抗 −ヒトＩｇＧＦｃでコートしたミクロウェルプレートを使用した。トランスフェ クトした培養上清とインキコベートしたのち、結合したキメラまたはＣＤＲ接合 抗体を。 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−接合７ウス抗−ヒトＩｇ抗体により、 基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用い２発色させた。サンプル中 のキメラまたはＣＤＲ接合全抗体のｉ［は、精製キメラ８７２．３γ４抗体［２ ５］の希釈系列から作成した検量曲線より外挿した。 −過性発　キメラまたはＣＤＲ合抗体の　合活性−過性発現抗体の結合活性を測 定するための直接結合ＥＬ　Ｉ　ＳＡは次のように実施した。 アフィニティーカラムは、慣用方法により、ＣＴＭＯＩ　Ｍｋｂを適当なりロマ トグラフィー媒体に付着させて間装した。第一の方法では、プールしたヒト尿を 直接、アフィニティーカラムに適用下、第二の方法モは、ヒト乳汁を低ｉ！ＡＲ 心分離に付し、スキムミルクからクリームを分離した。ついで、スキムミルクを 高速遠心分離に付し、水性および脂質成分を調製した。水性成分をアフィニティ ーカラムに適用した。 アフィニティーカラムに負荷されたならば、２つの方法のいずれの場合も、カラ ム分−を高および低ｐＨで溶出し、中和し、ＣＴＭＯＩ　ＭＡｂとの反応性を７ フセイした。プールされた分画はＣＴＭＯＩ　ＭＡｂで認識される冬型上皮ムチ ン（ＰＥＭ）を含有した。 ミクロタイタープレートを、上述のようにして搏られたＰＥＭでコートした。つ いで、ミクロタイタープレートを培養上清の希釈系列とイン牛エベートした。キ メラまたはＣＤＲ接合抗体の結合を、ＨＲＰ接合マウス抗ヒ）ＩｇＧ抗体で発色 させ。 定量した。 単一トランスフェクト細胞からの上清に対する直接結合ＥＬ　Ｉ　ＳＡの結果を １図２２に示す、これらのアッセイにより、すべての上清はＰＥＭに結合できる 抗体を含有したことが確認される。結合活性には有意な差は認められなかった。 二重のトランスフェクトした細胞からの上清に対する直接結合ＥＬ　Ｉ　ＳＡで は。 上清はＰＥＭに結合できる抗体を含有したこと、およびキメラ／キメラ抗体は（ １ずれのＣＤＲ接合／キメラ抗体よりも良好な結合を示したことが確認される。 競合結合アッセイは、上述のようにして得られたＰＥＭでコートしたポリスチレ ンビーズを用いて実施した。ＣＴＭＯＩ　ＭＡｂは１２５１で放射標識して、ｐ ＨＭＣ４０（ＩｇＧ１）でトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体 と競合させるのに使用した。キメラ抗体の効力はＣＴＭＯＩ　ＭＡｂの８４〜１ ０２％であった。 ＣＤＲ合　ＣＤＲ合抗体の一過性発現 以下のプラスミド対： ｐＡＬ４７．ｐＡＬ５１　：　ｐＡＬ４フ、ｐＡＬ５２；ｐＡＬ４８．ｐＡＬ５ １；およびｐＡＬ４８．ｐＡＬ５２　；ヲ、ＣＨＯ−Ｌ　７６１　ｈ細胞にコト ランスフエクトした。 二ＩＮ＋トランスフェクトした細胞系によって産生された培養上清に対して直接 結合アッセイを実施した。 これらのアッセイの結果は図２３に、キメラ／ＣＤＲ接合抗体における一部の結 果とともに示す。 上述したすべての直接結合アッセイから、一過性発現によって産生された各種抗 体の結合活性の順序は次のように決定された：ｃＬｃＨ３＞ｇＬｌ　ｅｈ＝ｇＬ １　ｇＨ２＞ｃＬｇＨ２＝ｇＬ２Ｈ２＝ｇＬ１ｇＨ１諺ｇＬ２ｅＨ＞ｇＬ２ｇＨ １（式中、ｃＬ露キメラＬ鎖； ｃＨｗａキメラＨ鎖； ｇＬｌ−アミノ酸変化が最も少ないＣＤＲ接合し鎖；ｇＬ２−アミノ酸変化が最 も多いＣＤＲ接合り鎖；ｇＨｌ−アミノ酸変化が最も少ないＣＤＲ接合Ｈ鎖；ｇ Ｈ２−アミノ酸変化が最も多いＣＤＲ接合Ｈ鎖）活性の高い変異体（ｃＬｃＨ， ｇＬｌｃＨ，ｇＬ１ｇＨ２およびｇＬ２ｇＨ２）を、ＣＴＭＯＩ　ＭＡＩ）とと もに、競合酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）で試験した。 ミクロウェルプレートを上述のようにして得られたＰＥＭでコートした。ＣＴＭ ＯＩ　ＭＡｔ）をビオチン化し、上に挙げた４つの変異体との競合に使用した。 結合したビオチン化ＣＴＭＯＩ　ＭＡｂを、ストレトプトアビジンーＨＲＰ接合 体ならびにＴＭＢで発色させ、定量した。 競合ＥＩＡの結果を図２４に示す１図２４は、ｇＬｌｅＨの組合せがｃＬｃＨの 組合せよりも大きな活性を示すほかは、上に掲げた結合活性のランキングと同一 であった。 したがって、ＣＴＭＯＩ　ＭＡｂと同じ抗原を認識する。キメラ、キメラ／ＣＤ Ｒ接合およびＣＤＲ接合抗体の製造に成功したことが明らかである。 ＣＤＲ”ＣＴＭＯＩ　のインビボ　合およびインターナリゼーン１ンｇＬ１ｇＨ ２１ｇＧ２　ＣＴＭＯＩ　（以下、　ｈｕｌ　：ＣＴＭＯｌ）およびｇＬ１ｇＨ ２１ｇＧ４Ｐ　ＣＴＭＯＩ　（以下、ｈｕ：ｃＴＭＯｌ）抗体変異体を発現する 安定なＮＳＯ細胞系を、ｐＡＬ４７の大きな（７，８ｋｂｐ）Ｎｏｔｌ／Ｂａｍ Ｈ１フラグメントをｐＡＬ５２からの２．４ｋｂｐＮｏｔｌ／Ａｐｍｌフラグメ ントおよび１ｇＧ２定常ドメインをもつ１．９ｋｂｐＢａｍＨ１／Ａｐａｌ　（ 部分）フラグメントまたは適宜１１Ｇ４Ｐ定常ドメインをもつ２ｋｂｐＡｐａｌ ／Ｂａ寵Ｈｌフラグメントのいずれかをリゲートして組立てた二重遺伝子発現プ ラスミドのエレクトロポレーシ１ンによって、ＮＳＯ細胞にトランスフェクトし て作成した。 各培養細胞系の上清からプロティンＡセファロースクロートゲラフイーによって 精製した抗体を、放射ｔｌｌｌＬ　（”’Ｉ　”Ｉ　、慣用の連続晶露法を用い てＭＸ−１またはＭＣＦ−７乳癌細胞とインキュベートした。比較のために、す べての試験で、放射標識マウスＣＴＭＯＩを使用した。抗体はすべて２μｇ／細 胞百万個でイン牛１ベートした。細胞への抗体の総結合および細胞による抗体の ピーク正味取り込みを測定した。結果は以下の表１に示す１両細胞系について、 各ＣＤＲ接合抗体は１マウス型よりも艮好な結合およびインターナリゼーン璽ン を示した。 表土 抗体　細胞系　総結合（０℃）　ピーク正味取り込み細　）　（細胞） ｈｕｔ：ＣＴＭＯＩ　ＭＣＦ−７６５０，０００１５０，０００ｈｕ　：　ＣＴ ＭＯＩ　ＭＣＦ−７４５０，０００９０，０００マウスｃＴＭｏ　Ｉ　ＭＣＦ− ７３００，Ｇｏｏ　Ｔｏ、０００ｈｕｌ：ＣＴＭＯＩ　ＭＸ−１１，２００，Ｏ ＯＯ１５０，０００ｈ　ｕ　：　ＣＴＭＯＩ　ＭＸ−１１，１００，ＯＯＯ１５ ０，０００マウスＣＴＭ０１．　ＭＸ−１１１００，０００８０，Ｇｏ。 ｆｉｕ、（ＴＭＯＩと抗腫瘍抗生物質の接合体のインビボ抗腫瘍活性ｈｕ：ｃＴ ＭＯ１をＮ−アセチルカリケマイシンγ１１の４−メルカプト−４−メチル−ペ ンタン酸ジスルフィドのヒドロキシスクシンイミド誘導体に、以下のように接合 させた。 Ｎ−アセチルカリケマイシン　１１の４−メルカプト−４−メチル−ペンクン　 ジスルニエエ区！止旦皇底 Ｎ−アセチル力リケマイシンγ１’（ＵＳＰ５０７９２３３号）をアセトニトリ ル中に２ｍｇ／ｍｌの濃度に取り、これに−１５℃で５モル当量の４−メルカプ ト−４−メチル−ベンクン酸および６モル当量のトリエチルアミンを加えた。− １５℃において２４時間反応させたのち、Ｃ，＋１−ＨＰＬＣでチェックした（ 反応が未完了であれば、４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸およびトリエ チルアミンを加える）。 反応が完結したならば、減圧下に揮発性有機物を蒸発させ、粗生成物をクロロホ ルム中１〜５％のメタノール勾配を用いてＢ　Ｉｏ−５ｉｌＡ上クロマトグラフ ィーに付した０口Ｃで調べて純粋な分画を集め、蒸発させてガラス状とした。生 成物のＩＨ−ＮＭＲは、Ｎ−７セチルカリケマイシンγＩＩに類似したが、−Ｓ ＳＳＭｅの吸収は消失し１期待されたようにメチル−ペンタン酸残基の吸収を示 した。ＦＡＢ−ＭＳにより、ｍ／ｚ−１４７８（Ｍ＋Ｈ）および１５００　（Ｍ ＋Ｎａ）を与えた。 Ｎ−アセチルカリケマイシンγｌ

【の４−メルカプト−４−メチル−ペンタン　 ジスルフィドのヒドロキシスクシンイミド　導体の合上述のＮ−アセチルカリケ マイシンγ１１の４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸ジスルフィド誘導体 をアセトニトリル中に５　ｍ　ｇ　／　ｍｌの濃度に取り、これに室温で３モル 当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび５モル当量の１−（３−ツメチルア ミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を加えた。１時間後１反応を Ｃ１＠−ＨＰＬＣでチェ１りした［反応が未完了であれば、さらに１−（３−ジ メチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を加える］２反応が 完結したならば、減圧下に揮発性有機物を蒸発させ、粗生成物をクロロホルム中 ０〜５％のメタノール勾配を用いてＢ　Ｉｏ−３ＩＩＡ上クロマトグラフィーに 付した。ｔｉｃにより評価して純粋な分画を集め、蒸発させてガラス状とした。 ’Ｈ−ＮＭＲは、上述の生成物に嘔似したが１期待されたようにスクシンイミド の吸収が存在した。ＦＡＢ−ＭＳにより、ｍ／ｚ−１５７５（Ｍ＋）（）および １５９７　（Ｍ＋Ｎｍ）を与えた。 Ｎ−アセチルカリケマイシン　ＩＩの４−メルカプト−４−メチル−ペンタン　 ジスルフィドのヒドロキシスクシンイミド　を　いたｈｕ：ｃＴＭＯｌ　のｐＨ 約７．４のリン酸緩衝液中ｈｕ：ｃＴＭＯ１に、２〜６モル当量の上記Ｎ−アセ チルカリケマイシンγ１１の４−メルカプト−４−メチル−ペンクン酸ジスルフ ィドのヒドロキシスクシンイミド誘導体を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中 、最終ＤＭＦｆｉ度が１０〜１５％になるようにして、添加した０反応完結後（ ２〜２４時間）＋　ｐＨ７，４のリン酸りｌ衝液を用い脱塩カラムを通して、低 分子量有機物質を除去した。生成物をゲル排除カラム上クロマトグラフィーによ ってさらに精製し。 濃縮すると、抗体１分子あたりの平均負荷がカリヶマイシン誘導体１〜３分子の モノマー生成物が得られた。 抗　活性のインビボ試験 ヌードマウスに皮下移植したヒト卵巣異種腫瘍、０ｖＣａｒ３を、ｈｕ：ＣＴＭ ｏ１接合体のインビボにおける有効性の試験に使用した０間じカリヶマイシンを 含有するマウスＣＴＭＯＩ接合体についても比較のために試験した。腫瘍は無胸 腺マウスの皮下に移植し、試験サンプルは数種の投与量レベルでｑ４日×３スケ ジ１−ルにより、腹腔内（ＩＰ）に接種した。投与は腫瘍の移植後２〜３Ｂに開 始し、各群毎に６匹、対照群に１０匹のマウスを使用した。腫瘍の移植後、４２ 日間週１回腫瘍の直径を測定して腫瘍の大きさを決定した。有意な抗腫瘍活性は 、各群における非処置対照に比べて平均した腫瘍の大きさの持続した５８％阻害 、および６５％を越える生存率とした。薬剤当量ｌおよび３μｇの両用量で、ｈ ｕ：ＣＴ〜１０１接合体は宵意な膿瘍生育阻止を示した（図２５）、いずれの試 験群でも、４２日ノ観察期間内に死亡は認められなかった。全試験群ともｎ−１ ，対照群ｎ−１０，ＷＡ！ｌのバーは各データ点での士標準誤差平均である。 狂里Ｘ獣 １、ＫＱｈ＋１１ｒ＆ｈＭｓｔａｒｎ、Ｎａｔｕｒａ２６５，４９５−４９７． １９７５２、Ｂｅｇｅｎｔ　ｉｔ　ａｔ、　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　６ ２．４８７．１９９０３、Ｖｅ由ｏｅｙｓｎ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ、 　２９３．１５３４−１５３６．１９８８４、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ、Ｎ ａｔｕｒｅ、３３２，３２３，３２４．１９ａ８５、　ＱｕＨｎ　ｅｔ　ｉｆ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＬＩＳＡ、８６，１ｏ０２９−１０ ０３３．１９１５９ａｎｄ　Ｗｅ−Ａ−９０１０７８８６１６、Ｔａｍｐｅｇｔ ｅｔａｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９，２６６−２７１．１９９１７、Ｃ ｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓａｔ、、　ＬＩＳ Ａ、　ＢＢ、　２Ｅ１６９−２８７３．１９９１８、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ　ａｔ 　ｉｆ、　１９９１　ｉｎ　Ｅｐｅｎａｔｏｓ、　Ａ、Ａ、、　（ａｄ、）、　 −＠ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａｐｐｌｉｃａｔｊｏｎｓ 　ｉｎ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ”９、Ｇｏｒｍａｎａｔａｌ、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、８８．４１８１４８ａ５． １９９１１０、　Ｅｈｒｌｉｃｈ、　Ｐ、、　Ｃｏ１１ｅｃｔｅｄ　５ｔｕｄｉ ｅｓ　ｏｎ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、　２．　Ｊｏｈｎ　Ｖｌ／１ｌａｙ@＆　５ｏ ｎｓ。 ＮａｗＹｏｒｋ、１９８６ １３、Ｓａｈａｇａｎ　ａｔ　ａｔ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３７．３ ．１０６６−１０７４．１９８６１４、　ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ　ａｔ　ａｌ、　 Ｃａｎｃａｒ　Ｒｅｓ、、　４７．９９９−１００５．１９Ｂ７１５、Ａｂｏｕ ｄ−Ｐｉｒａｋ　ｅｔ　ａｔ、ＣａｎｃｅｒＦｌｅｓ、、ａＢ、３１８Ｂ−３１ ９６，１９１３８１ｓ、　Ｋａｂａｔ　ａｔ　ａｔ、　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏ ｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔ＠ｒｅｓ煤 A　ＵＳ ｏａｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉ ＣＥＪＳ、　ＮＩＨ，ＬＩＳＡ、　１９１３７　ａｎｄＷｕ、　Ｔ、Ｔ、　ａｎ ｄ　Ｋａｂａｔ、　Ｅ、Ａ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。、１３２，２１１−２ ５０．１９７０１７、Ｍａｎｉａｔｉｓａｔａｌ、ＭｏｌａｃｕｌａｒＣｌｏｎ ｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ市ｏｕｒ、ＮａｗＹｏｒｋ。 １１３、Ｐｒｉｍｒｏｓｅ　ａｎｄ　Ｏｌｄ、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌａｓ　ｏずＧｅ ｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ。 ０式ロー、１９８０ １９、　Ｊｏｎａｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、　５４．７５−８２．１９ ８６２０、０ｒｌａｎｄｉ　ｅｔ　ａｌ、　ＰｒｏＣ，Ｎａｆｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、、　ＬＩＳＡ、　８６．３８３３−３＆３７．１９８X ２１、　ＧｕｂｌｅｒａｎｄＨｏｆｆｍａｎ、Ｇａｎｇ、２５．２６３−２６９ ．１９８３２２、　Ｍｅｆｆｏｎ　ａｔ　ａｌ、　Ｎｕｃ、　Ａｃｔｄｓ、　Ｒ ａｓ、、　１２．７０３５−７０５６．１９８４２３、Ｍａｘ　ａｔ　ａｔ、　 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５６．５１１６−５１２０．１９８１２４ 、Ｓａｎｇｅｒａｔａｌ、ＰＮＡＳ、７４．５４６３−５４６７．１９７７２５ 、Ｃａ１ｃｈａｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、、　ＵＳＡ、　８１５．３１３３３−３８３７．１X８９゜ 【配列表】 配列番号＝１ 配列の！！！：槁酸および帰納された蛋白質配列配列の長さ：４１６塩基 鑓の数ニー重鎮 トポロジー二直鎖状 分子種：ｃＤＮＡ ｇ原生物：マウス、直接実験的起源 細胞系の名称：ハイプリドーマＣＴＭＯＩ配列の性質：ｃＴＭＯ１！ツクローナ ル抗体のＨ鎮の可変ドメインのコード配列配列の特徴　！ｍａｉｌ−１９のリー ダー配列配列： 入ＴＧＧ入Ａ　ＴＧＧ　ＡＧＣＴＧｍ；　ＣＴＣＴＴＴ　ＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣ ＴＣ丁ＣＣＣτλ　入ＣＣＡＣＡ　ＧｉＭｅｔ　にｌｕ　Ｔｒｐ　ｓｉｒ丁＝ｐ 　Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　Ｌ億ｕ　Ｓａｔ　Ｖａｌτｈｒ　 Ｔｈｒ　ＧｌｙＧＴＣＣＡＴ　ＴＧＣＣＡＧ　ＡＴＣＣＡＣＣＴＧ　ＣＡＧ　Ｃ Ａ（ａτごＺλαゴＧ＾ＧσＧＣτＧん−Ｖａｌ　Ｈｌｓ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｘ １ｍ　Ｇｉｎ　ＸＡｕ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕシｕ 　ｖａＩＬｙｓＣＣＴ　Ｇ（：Ｇ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＧＴＣ，ＡＡＧ　ＡＴＡ　 ＴＣＣＴＧＣＡＡＧ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＧＧＣＴＡＣＡ（ＣＴＴＣＰｒｏ　Ｇｌ ｙ　Ａｌａ　ｓｉｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　工１ｍ　５ａｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌ ａ　Ｓａｔ　Ｇｌｙ　Ｔｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈ−ＡＣ’ｒ　ＧＡＣＴＡＣＴｋＴ　Ａ ＴＡ　ＡＡＣ’ｒＧＣＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＣＡ Ｇ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　１X２ Ｔｈｒ　Ａ！ＩＰ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｘ１＠Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｍａｔ　ｔ、ｙｓ 　にＧｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　にＧｉｎ　Ｇｌｙ　kａｕ　６４ ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＧＧＡ　ＴＧＧ　ＡＴｒ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　 ＡＧＣＧＧＴ　ＭＴ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　ＴＡＣＡＡＴ　２４O Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　ＩＩｓ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　にｌｙ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ@Ｂ。 ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＴＴＣＡＡＧ　ＧＧＣＡＡＧ　ＧＣＣＡＣＡ　ＴＴＧ　ＡＣＴ 　ＧＴＡ　ＧＡＣＡＣＡ　ＴＣＣＴＣＣＡＧＣ２Ｂ８Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈａｆ 、ｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌ４ｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｇｐ　 Ｔｈｒ　Ｂｙ　Ｓａｒ　５ｅｒ　X６ ＡＣＡ　ＧＣＣＴＡＣＡＴ’Ｇ　ＣＡＧ　ＣＴＣｋＧＣＡＧＣＣＴＧ　ＡＣＡ　 ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＧＡＣＡＣＴ　ＧＣＴ　ＧＴＣ３３６Ｔｈｒ　＾１ａ１ｍｒ　 Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｌｓｕ　Ｓ＠ｒ　Ｓ＠ｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　 Ａｇｐ　丁ｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　P１２ 丁Ａ丁丁ＴＣ’ｌ’Ｇτ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＡＣＣＴ ＡＴ　丁＾ＣＴＡＴ　ＧＣＴ　Ａ丁ＧＧ＾ＣＴ＾Ｃコ８４？ｙｒ　Ｐｈａ　ＣＹ ！ｌ　Ａｌａ　Ａｒｇ　ＧＩＬＩ　ＬＹ＠　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔ’Ｙｒ 　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｍａｔ　Ａｓｐ　sｙｒ　１２１１ ’！’ＧＧ　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＧＧＡ　ＡＣＣＴＣＡ　にＴＣＡＣＴ　ＧＴＣＴ ＣＣＧＣ４１６Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔ ｈｒ　Ｖａｌ　５ｅｒ　Ａｌａ　１３ｇ配列番号：２ 配列の型：核酸および帰納された蛋白質配列配列の長さ・３９９塙基 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 分子種：ｃＤＮ＾ ｇｊＩ庄物ニアウス、ｒｌ直接実験的起源細胞系名称：ハイブリドーマＣＴＭＯ Ｉ配列の性質：ＣＴＭ０１モノクローナル抗体のし鎖の可変ドメインのコード配 列配列の特徴：！ｌ基１〜２ｏのリーダー配列配列： ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＴＧＣＣＴＡ　ＧＣｒＧＡＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＧＧＧ　ＣＴＧ 　Ｃ′ｒＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣＴＧＧ　ＡＴＣＣＣＴ　４ｇＮ＠ｔ　Ａｒｇ　ＣＹ ｓし■＾ｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　（：１ｙ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌし ＝ｕ　Ｔｒｐ　Ｘ１偕Ｐｒｏ　１６ＧＧＡ　ＧＣＣＡＴｒ　ＧＧＧ　ＧＡＴＡＴ ｒ　ｃＴＧ　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＧＣＴ　（：ＣＡ　ＣＣＣＴＣＴ　ｌ１ ｍ　ＣＣＴ　９U Ｃ１ｙ　Ａｌａ　ＩＩ＠　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　 Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｐｒｏ@３２ ＧＴＣＡＣＴ　Ｃ（：’ｒ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＴＣＡ　實Ａ　ＴＣＣＡＴｒ　Ｔ ＣＣ賀；ＣＡＧＧ−ゴＡＧＴ　ＡＡＧ　ＡＧＴ　１４４Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　５ｅｒ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓ＠ｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ 　５＠ｒ　１；ｅｒ　Ｌｙｓｓ　Ｓ■秩@４８ Ｃ？ＯＣＴ＋ｒ　ＣＡＴ　ＡＣＴ　ＡＡＴ　ＧＧＣＧＡＣＡＣＴ　ＴｒＣＴＴＧ 　ＴＡＴ　”ＮＡＧ　？！’ＣＣＴＧ　ＣＡＧ　Ａ（：に　P９２ シｕ　！、ｅｕ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＧＩＹＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｌ ｅｕ　’ｒｙｒ↑ｒｐ　Ｐｈａ　−ｕ　Ｇｉｎ＾ｒ９６４ＣＣＡ　ＧＧＣＣＡＧ 　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ｃＴＣｃＴＧ　ＡＴＡ　？ＡＴＣＧＧ　Ａ’ｒ’Ｃ ＴＣＣＡＡＣＣＴＴ　ＧＣＣ２４０Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　 Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ｒｌ＠↑ｙｒ　Ａｒｇ　Ｍａｔ　Ｓ＠ｒ　Ａｓｎ　Ｌ ｅｕ＾ｌａ　８O 丁ＣＣＧＧＡ　ＧＴＣＣＣＡ　にＡＣＡＧＧ　？！’ＣＡＧＴ　ＧＧＣＡＧＴＧ ＧＧ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＴＴＣ２ＢＢＳ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ 　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｈ＠Ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓ＠ｒ　 Ｇｌｙ　Ｔｈｒ＾ｌａ　Ｐｈｅ　９U ＡＣＡ　ＣＴＣＡＧＡ　ＧＴＣＡＧＴ　ＡＧＡ　にＴＧ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　Ｇｋ Ｇ　ＧＡＴ　ＧＴ’Ｇ　ＧＧＴ　ＧＴｒ　ＴＡＴ　ＴＡＣコR６ 丁ｈｒ　Ｌｓｕ　Ａｒｇ　ＶａＩ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　 Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ@１１２ ？ＧＴ’　ＡＴＧ　ＣＡＡ　ＣＡＴ　ｃＴＡ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　Ｃ（Ｔ　ＴＴＣ ＡＣＧ　’ｆＴｃ　ＧＧＴ　にｃＴ　ＧＧＧ　ＡＣＣＡＡＧ@３８４ Ｃｙｓｉ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｈｌｍ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠ Ｔｙｒ　Ｐｈ＠Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｕｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　P２＋１ ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣＧＧ　３９９Ｌａｕ　（：ｌｙ　Ｌｅｕ　 Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ｌコ。 配列番号：３ 配列の型：核酸および相当するアミノ酸配列配列の長さ・２８＃ｉ基 鑓の数ニー重鎖 トポロジー二ｌ！鎖状 分子橿二合成りＮＡ 配列の性質：マウスＶＨドメインのＰＣＲ増幅のための５゛順相プライ７−配列 の神徹：マウスＶＨドメインのリーダーＥ’ＰＩと＃ｉ腑性、践基７〜１３に纒 人されたＢＢ　ｔＥＩＩ制限部位 配列： ＧＧＴＧＧＣＧ　ＧＴ＾＾ＣＣＡＣＡ　ＧＧＴ　ＧＴＣＣＡＧ　ＴＣｌ　２ＢＶ ａｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｂａｒ　７配列番号＝４ 配列の１！２：核酸配列 配列の長さ：３６塩基 鎖の数ニー木端 トポロジー二直鎖状 分子Ｎ：合成りＮＡ Ｅ列の性質：マウスＶＨドメインのＰＣＲ増幅のための３°ミ相プライマ一配列 の特徴＝マウスｖＨフレームワーク４と＃ｉ補性、残基２５〜３ｏおけるＡｐｅ Ｉ制隈部位を含む 配列： ＡｃＴＧＧＣＡＩ：ＡＧ　ｋＡＧＴｃＧＧｋｃ；Ｔ　ＴＣ；ＣＴＴＣＣＣＧＧ　 にＴＡＧＡＣ）６記列番号：５ 配列の型：核酸および相当するア！／Ｗｌ配列配Ｆ１のＪｌ　：　５０ｐａｌ　 （センス鎖）および５１塩基（アンチセンスＩＩ）鎖の数二二重鎮 トポａジー：直鎖状 分子種：合成りＮＡ 配列の性質：マウスＶＨドメインのリーダー配列アダプター配列の特徴ニア９ス モノクローナル抗体８７２．３０ＶＨドメインのリーダー配列を一部コードする Ｈ１ｎｄ！ｎ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントからなる配列： ＡＧＣｌｒＴ（：ＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＧＡＡ　ＴＣ；Ｇ　ＡＧＣＴＧＧに ＴＣＴｒＴ　ＣＴＣＴｒＣ實ＣＣＴＧ　ＴＣＧ　５０ＡＣにＣ；ＣＧ　ＧＴＧＧ 　’ｒＡＣＣＴＩ’　ＡＣＣＴＣＧ　ＡＣＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＧＡ（：　ＡＡＧ 　ＡＡＧ　ＧＡＣＡにＣＣＡＴｒf　５１ Ｍ＠ｔ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｓ＠ｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　 Ｐｈ＠Ｌ＠ｕ　Ｓ＠ｒ　１２ｆ！列番号−６ 配列の！！！：ヌクレオチド 配列の長さ：２１ 鏑の歓ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 分子ａ：合成オリゴスクレオチド 配列の性質：　ＣＤＲ接合Ｈ鎖のアッセンブリーに使用配列の特徴：！ｌ基７〜 ２６におけるＨＩｎｄｍ部位Ｉ！列− ＧＣＣ；ＣＧＣｋＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣ２／１配列番号・７ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：９６ 鎖の数ニ一本鎖 トポロジー１１状 分子ｆｌ：ｌ：合成オリダメクレオ チド配列質：ＣＤＲｔ１合Ｈ鎖のアブセンブリ−に使用配列： 配列番号＝８ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：９６ 鎖の数ニ一本膳 トポロジー：直鎖状 分子種：合成ｔリゴヌクレオチド 配列の性質：　ＣＤＲ接合Ｈ饋のアッセンブリーに使用配列； 配列番号＝９ 配列のｆｆｉ：ヌクレオチド 配列の長さ二８９ 鎖の数ニ一本膳 トポロジー二直饋状 分子種：合成オリゴヌクレオチド 配列の性質：　ＣＤＲ接合Ｈ鎖のアッセンブリーに使用配列の特徴：残基７８〜 ８３におけるＡｐ虐１ｇ位記列： 配列番号：ｌＯ 配列の型：Ｘクレオチド 配列の長さ：９６ 鎖の数ニ一本膳 トポロジー：直鎮状 分子ｍ：合成オリゴヌクレオチド 配列の性質：ＣＤＲ１１合Ｈ鎖の７１センブリ−に使用配列： 配列の性質：ＣＤＲ接合し鎖のアッセンブリーに使用配列： 配列番号・１７ 配列の型：Ｘクレオチド 配列の長さ＝９０ 鎖の数ニ一本縫 トポａジー：直鎖状 分子ＩＩに合成オリゴヌクレオチド 配列の性質：　（ＤＲ横接合鎮のアッセンブリーに使用配列番号＝１８ 配列の型＝ヌクレオチド 配列の長さ＝９９ 鎖の数ニ一本膳 トポａジー：直鎖状 分子種７含成オリゴヌクレオチド 配列の性質：　ＣＤＲ接合Ｌａｌのアブセンブリ−に使用配列＝ 配列番号：１９ 配列の型二Ｘクレオチド 配列の長さ：８１ 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直鎖状 分子Ｎ二合成オリゴヌクレオチド 配列の性質：　ＣＤＲ接合り鎖のアッセンブリーに使用配列の特徴：残基７０〜 ７５におけるＢ＠ｔＢ１部位記列部 位同列号：２０ 配列のＷｌ：ヌクレオチド 配列の長さ：８１ 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直鎖状 分子種：合成オリゴヌクレオチド 配列の性質：　ＣＤＲ接合り鎖のアッセンブリーに使用配列： 配列番号＝２１ 配列のＩ！！、Ｘクレオチド 鎖の数ニー末鎖 トポａジー：直鎮状 分子槽：合成オリゴヌクレオチド 配列の性質：　ＣＤＲ接合り鎖のアッセンブリーに使用配列番号：２２ 配列の！！！：ヌクレオチド 配列の長さ・２１ 鎖の数ニ一本膳 トヂａノー：ｆｉｌｉＪＩ状 分子種７含成オリゴヌクレオチド 配列の性質　ＣＤＲ接合し鎮のアブセンブリ−に使用配列の行黴：残基７〜１２ のＳｐＨ部位配列 ＣＣＧＧＣＣＣにＴＡ　ＣＧＴＴＴｒＡＣＴＴ　Ｃ、２１配列番号：２３ 配列の型二アミノ酸 配列の長さ：１３３ 分子種：免疫グロブリンし鎖可変ドメイン配列の特徴：残！＆４４〜５９．７５ 〜８１および１１４〜１２２におけるＣＤＲ配列二 Ｍｅｔ　５ｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｔｒｐし＝ｕ　Ｔｈｒ　P６ 、Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｘ１ｅ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ 　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｓｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｓｅ秩@コ２ ＾１ａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　）ｌｅ　 Ｔ’ｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｑ　Ｓｅｒ　ＳＣｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅ秩@４８ Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｓｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　 Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　丁ｒｐ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ@６４ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　 Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ@１１０ ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　Ａｒｑ　Ｐｈ＠Ｓｅｒ　Ｃ１ｙ　Ｓ ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　X６ Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　工１ｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　 Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈ＠＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　P１２ Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　ＨＬｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　 Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ@１２８ Ｖａｌ　ＧＬｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　１ココＦＩＧ、　２ 腫瘍サイズ　（ｍ９） 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　４９１００　Ａ 　９１６４−４ＣＣＯ７Ｋ　１３１００　８３１８−４Ｈ１５／１２　８３１８ −４Ｈ Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４Ｂ（７２）発明者　オーウェンズ、レイモ ンド、ジョンイギリス国アールジー９１エスエツチ オツクスフオードシヤー、ヘンリイ　−オン　−　テームズ、ハミルトン　アベ ニュー　２３ （７２）発明者　ペイカー、テレンス、シーワードイギリス国ティーダブリュ１ ９５ジエイエフ　ミドルセックス、スティンズ、レイズベリイ、ガーソン　レー ン　４．ザ　メイズ Ｉ （７２）発明者　リョンズ、アラン、ハワードイギリス国ニスエル６３エックス エヌ バークシャー、メイドンヘッド、ウッドランズ　パーク、ビューモント　クロー ス（７２）発明者　ハマン、フィリップ、アール。 アメリカ合衆国１０９２３　ニューヨーク州ガーナービル、アリス　ストリート 　９ （７２）発明者　メネンデツ、アナ、ティー。 アメリカ合衆国１０９５１　ニューヨーク州モンシイ、カウントリイ　クラブ　 レーン（７２）発明者　ヒンマン、ロイス、エム。 アメリカ合衆国１０５９１　ニューヨーク州ノース　タリイタウン、バーウッド 　アベニュー　１２６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト脂肪乳球（ＨＭＦＧ）に対して特異性を有し，可変領域の少なくとも１ つの相補性決定領域（ＣＤＲ）はマウスモノクローナル抗体ＣＴＭ０１（ＣＴＭ ０１ＭＡｂ）から誘導され，残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリ ンまたはその類縁体から誘導される，人化抗体分子（ＨＡＭ）２．キメラ人化抗 体である「請求項１」記載のＨＡＭ３．ＣＤＲ接合人化抗体である「請求項１」 記載のＨＡＭ４．組換えＤＮＡ技術によって製造される「請求項１〜３」のいず れかに記載のＨＡＭ ５．完全抗体分子，またはＦａｂ，Ｆａｂ′，Ｆ（８ｂ′）２もしくはＦｖフラ グメント，または単一鎖抗体フラグメントから構成される「請求項１〜４」のい ずれかに記載のＨＡＭ ６．Ｈ鎖および／またはＬ鎖は，ＬＡＹ，ＰＯＭ，ＴＵＲ，ＴＥＩ，ＫＯＬ，Ｎ ＥＷＭ，ＲＥＩまたはＥＵヒト可変領域フレームワークから構成される「請求項 ３〜５」のいずれかに記載のＣＤＲ接合ＨＡＭ７．Ｈ鎖およびＬ鎖の両者とも， ＥＵヒト可変領域フレームワークから構成される「請求項３〜５」のいずれかに 記載のＣＤＲ接合ＨＡＭ８．Ｌ鎖可変領域の位置２４〜３４（ＣＤＲ１），５０ 〜５６（ＣＤＲ２），および９１〜９６または８９〜９７（ＣＤＲ３）にＣＴＭ Ｏ１ＭＡｂＣＤＲを有する「請求項３〜７」のいずれかに記載のＣＤＲ接合ＨＡ Ｍ９．Ｌ鎖可変領域のさらに位置１，２，３，３６，３７，４５，４８，４９， ６０，６３，７０，８４，８５，８７および１０８の１個または２個以上におい て，ＣＴＭ０１ＭＡｂ残基からなる「請求項３〜８」のいずれかに記載のＣＤＲ 接合ＨＡＭ １０．Ｈ鎖可変領域の位置２６〜３５（ＣＤＲ１），５０〜６５（ＣＤＲ２）お よび９４〜１００（ＣＤＲ３）にＣＴＭＯ１ＭＡｂＣＤＲを有する「請求項３〜 ９」のいずれかに記載のＣＤＲ接合ＨＡＭ１１．Ｈ鎖はさらに、位置２，６，２ ３，３７，４８，４９，６７，６９，７３，７６，７８，８０，８８，９１およ び９４の１個または２個以上においてＣＴＭＯ１　ＭＡｂ残基を有する「請求項 ３〜１０」のいずれかに記載のＣＤＲ接合ＨＡＭ １２．Ｌ鎖可変領域の位置２４〜３４（ＣＤＲ１），５０〜５６（ＣＤＲ２）お よび９１〜９６または８９〜９７（ＣＤＲ３）にＣＴＭＯ１　ＭＡｂＣＤＲを， ならびにＨ鎖可変領域の位置２６〜３５（ＣＤＲ１），５０〜６５（ＣＤＲ２） および９４〜１００（ＣＤＲ３）にＣＴＭＯ１　ＭＡｂＣＤＲを有し，さらにＬ 鎖の位置３，３６，６３および１０８，または位置３，３６，３７，４５，４８ ，６３および１０８においてＣＴＭＯ１　ＭＡｂ残基，ならびにＨ鎖の位置２， ３７，７１，７３，９４，１０３，１０４，１０５および１０７，または位置２ ，３７，４８，６７，６９，７１，７３，９４，１０３，１０４，１０５および １０７においてＣＴＭＯ１　ＭＡｂ残基からなる「請求項７」記載のＣＤＲ接合 ＨＡＭ １３．付加的なＣＴＭＯ１ＭＡｂ残基はＬ鎖の位置３，３６，３７，４５，４８ ，８３および１０８，ならびにＨ鎖の２，３７，４８，６７，６９，７１，７３ ，９４，１０３，１０４，１０５および１０７に存在する「請求項１２」記載の ＣＤＲ接合ＨＡＭ １４．Ｈ鎖可変ドメインに融合したヒトＩｇＧのＨ鎖定常領域またはそれらの類 縁体を有する「請求項１２または１３」記載のＣＤＲ接合ＨＡＭ１５．ＩｇＧの Ｈ鎖定常領域はヒトＩｇＧ４定常領域またはそれらの類縁体である「請求項Ｉ４ 」記載のＣＤＲ接合ＨＡＭ１６．ＩｇＧ４Ｈ鎖定常領域は，位置２４１にプロリ ン残基を含有するヒトＩｇＧ４Ｈ鎖定常領域である「請求項１５」記載のＣＤＲ 接合ＨＡＭ１７．Ｌ鎖可変ドメインに融合したヒトカッパ鎖定常領域を有する「 請求項１５または１６」記載のＣＤＲ接合ＨＡＭ １８．「請求項１〜１７」のいずれかに記載のＨＡＭを製造するにあたり，（ａ ）可変ドメインのＣＤＲの少なくとも１つがＣＴＭＯ１　ＭＡｂから誘導され， 抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンから誘導される可 変ドメインからなる抗体ＨまたはＬ鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオベロン を発現ベクター内に作製し， （ｂ）可変ドメインのＣＤＲの少なくとも１つがＣＴＭＯ１　ＭＡｂから誘導さ れ，抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンから誘導され る可変ドメインからなる相補性抗体ＨまたはＬ鎖をコードするＤＮＡ配列を有す るオペロンを発現ベクター内に作製し，（ｃ）そのまたは各オペロンで宿主細胞 をトランスフェクトし，（ｄ）トランスフェクトされた細胞系を培養してＨＡＭ を産生させる方法１９．Ｈ鎖およびＬ鎖コード配列は同一ベクター上に存在する 「請求項１８」記載の方法 ２０．Ｈ鎖およびＬ鎖コード配列は別個のベクター上に存在する「請求項１９」 記載の方法 ２１．抗体フラグメントの製造にあたり，宿主細胞として細菌宿主細胞を使用す る「請求項１８〜２０」のいずれかに記載の方法２２．宿主細胞は哺乳動物宿主 細胞である「請求項１８〜２０」のいずれかに記載の方法 ２３．「請求項１〜１７」のいずれかに記載のＨＡＭがエフェクターまたはレポ ーター分子に接合された接合体分子 ２４．エフェクター分子はメチルトリチオ抗腫瘍剤である「請求項２３」記載の 接合体分子 ２５．メチルトリチオ抗腫瘍剤は，ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体のα１，α２，α ３，α４，β１，β２，γ１，δ１および偽アグリコン成分ならびにそれらの誘 導体，ＢＢＭ−１６７５，ＦＲ−９００４０５，ＦＲ−９００４０６，ＰＤＩ１ ４７５９，ＰＤ１１５０２８，ＣＬ−１５７アＡ，ＣＬ−１５７７Ｂ，ＣＬ−１ ５７７Ｄ，ＣＬ−１５７７ＥおよびＣＬ−１ア２４抗腫瘍抗生物質およぼそれら の誘導体のジスルフィド類縁体である「請求項２４」記載の接合体分子２６．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される「請求項２５」記載の接合体分子であり，式ＣＨ３−ＳＳＳ−Ｗ（式 中，ＣＨ３−ＳＳＳ−Ｗは，ＬＬ−Ｅ３３２８８α１ｅｒ，α１Ｉ，α２Ｂｒ， α３Ｂｒ，α３Ｉ，α４Ｂｒ，β１Ｂｒ，β１Ｉ，β２Ｂｒ，β２Ｉ，γ１Ｂｒ ，γ１Ｉ，δ１Ｉ，そのヨードまたはブロモ偽アグリコン，それらのジヒドロお よびＮ−アシル相対物，ならびにＢＢＭ−１６７５，ＦＲ−９００４０５，ＦＲ −９００４０６，ＰＤ１１４７５９，ＰＤ１１５０２８，ＣＬ−１５７７Ａ，Ｃ Ｌ−１５７７Ｂ，ＣＬ−１５７７Ｄ，ＣＬ−１５７７Ｅ，ＣＬ−１７２４または それらのＮ−アシル相対物である）から，ＣＨ３−ＳＳＳ−Ｗを一般式Ｑ−ＳＰ −ＳＨ［式中，ＳＰは直鎖または分岐鎖の２価もしくは３価の（Ｃ１〜Ｃ１８） 基，２価もしくは３価のアリールもしくはヘテロアリール基，２価もしくは３価 の（Ｃ３〜Ｃ１８）シクロアルキルもしくはヘテロシク６アルキル基，２価もし くは３価のアリールもしくはヘテロアリール−アルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）基，２ 価もしくは３価のシクロアルキル−もしくはヘテロシクロアルキルアルキル−ア ルキル（Ｃ１〜Ｃ１８）基，または２価もしくは３価の（Ｃ２〜Ｃ１８）不飽和 アルキル基であり，Ｓｐが３価の基の場合にはそれはきらにアミノ，アルキアミ ノ，アリールアミノ，ヘテロアリールアミノ，カルボキシル，低級アルコキシ， ヒドロキシ，チオールまたは低級アルキルチオ基によって置換されていてもよく ：Ｑはハロゲン，アミノ，アルキルアミノ，カルボキシル，カルボキシアルデヒ ド，ヒドロキシ，チオール，α−ハロアセチルオキシ，低吸アルキルジカルボキ シル，−ＣＯＮＨＮＨ２，−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２．−ＮＨＣＳＮＨＮＨ２，−Ｏ ＮＨ２，−ＣＯＮ３，▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等 があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等がありま す▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数 式、化学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼▲数式、化学 式、表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼ であるか，またはついでそれに変換可能な基である］と反応させ，式Ｑ−Ｓｐ− ＳＳ−Ｗ（式中，Ｏ，Ｓｐ，およびＷは先に定義した選りである）の中間体化合 物を得， Ｏ−Ｓｐ−ＳＳ−Ｗを，式Ｈｕ：ＣＴ−Ｍ−０１（Ｙ）ｎ（式中Ｈｕ：ＣＴ−Ｍ −０１「請求項１〜１７」記載のＨＡＭであり，Ｙは，蛋白質の側鎖アミノ，カ ルボキシルもしくはチオール基，糖蛋白質炭水化物残基由来のアルデヒド，また はアミノアルキルチオ基であり、ｎは１〜１００の整数である）の分子と反応さ せて，式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中，Ｙ，ＳＰ，Ｗ，およびｎは先に定義した通りであり，Ｚは基ＱおよびＹ の共有結合反応から直接またはついで還元後に形成され，Ｚは−ＣＯＮＨ−，− ＣＯＮＨＮ＝ＣＨ−，ＣＯＮＨＮＨＣＨ２−，−ＮＨＣＳＮＨＮ＝ＣＨ−，−Ｎ ＨＣＨ２−，−Ｎ＝ＣＨ−，一ＣＯ２−，−ＮＨＣＨ２ＣＯ２−，−ＳＳ−，▲ 数式、化学式、表等があります▼ であり，ｍは０，１〜１５である）の化合物を生成させることにより製造される 接合体分子 ２７．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される「請求項２６」記載の接合体であり，ＬＬ−Ｅ３３２８８（ＣＨ３− ＳＳＳ−Ｗ）と命名された抗腫瘍抗生質の群から，ジチオメチル残基を式Ｑ−Ｓ Ｐ−ＳＨ［式中，ＳＰは直鎖たは分岐鎖の２価もしくは３価の（Ｃ２〜Ｃ１０） 基，または２価もしくは３価のアリールもしくはヘテロアリールアルキル基（Ｃ ２〜Ｃ５）基であり，ＳＰが３価の基の場合にはそれはさらにアミノ，へテアリ ールアミノ，ヒドロキシ，またはチオール基によって置換されていてもよく；Ｑ はカルボキシル，低級アルキルジカルボキシル無水物，−ＣＯＮＨＮＨ２，また は▲数式、化学式、表等があります▼　▲数式、化学式、表等があります▼であ るか，またはついでそれに変換可能な基である）の化合物で置換して，一般式Ｑ −Ｓｐ−ＳＳ−Ｗ（式中，Ｑ，Ｓｐ，およびＷは先に定義した通りである）の中 間体化合物を生成させ， Ｑ−ＳＰ−ＳＳ−Ｗを，式Ｈｕ：ＣＴ−Ｍ−０１（Ｙ）ｎ（式中，Ｙは，抗体上 の側鎖アミノ基，または抗体の炭水化物基の酸化により生成するアルデヒドであ り，ｎは１〜１００の整数である）の分子と反応させて，式▲数式、化学式、表 等があります▼ （式中，Ｙ，Ｓｐ，Ｗ，およびｎは先に定義した通りであり，Ｚは基ＱおよびＹ の共有結合反応から直接またはついで還元後に形成され，Ｚは−ＣＯＮＨ−，− ＣＯＮＨＮ＝ＣＨ−，ＣＯＮＨＮＨＣＨ２−，またはであり，ｍは０．１〜１５ である）の化合物を生成させることにより製造きれる接合体 ２８．ＣＨ３−ＳＳＳ−Ｗは，ＬＬ−Ｅ３３２８８γ１Ｉと命名された抗腫瘍抗 生物質である「請求項２７」記載の接合体 ２９．ＣＨ３−ＳＳＳ−Ｗは，ＬＬ−Ｅ３３２８８αＩＩと命名きれた抗腫瘍抗 生物質である「請求項２７」記載の接合体 ３０．ＣＨ３−ＳＳＳ−Ｗは，ＬＬ−Ｅ３３２８８α３Ｉと命名された抗腫瘍抗 生物質である「請求項２７」記載の接合体 ３１．ＣＨ３−ＳＳＳ−Ｗは，Ｎ−アセチルＬＬ−Ｅ３３２８８γ１Ｉと命名さ れた抗腫瘍抗生物質である「請求１２７」記載の接合体３２．ＣＨ３−ＳＳＳ− Ｗは，ヨードＬＬ−Ｅ３３２８８偽アグリコンと命名された抗腫瘍抗生物質であ る「請求項２７」記載の接合体３３．Ｑはカルボキシル基のヒドロキシスクシン イミドエステルであり，Ｓｐは−ＣＨ２ＣＨ２−であり，Ｙは−ＮＨ２であり， Ｚは−ＣＯＮＨ−であり，ｍは０，５〜１５である「請求項２７」記載の接合体 。 ３４．Ｑはカルボキシル基のヒドロキシスクシンイミドエステルであり，Ｓｐは −ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−であり，Ｙは−ＮＨ２であり，Ｚは−ＣＯＮＨ−であ り，ｍは０．５〜１５である「請求項２７」記載の接合体３５．Ｑはカルボシル 基の４−ニトロフェニルエステル，ＳＰは−ＣＨ２ＣＨ２−，Ｙは−ＮＨ２，Ｚ は−ＣＯＮＨ−，ｍは０．５〜１５である「請求項２７」記載の接合体 ３６．Ｑはカルボキシル基のヒドロキシスクシンイミドエステルであり，Ｓｐは −ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−であり，Ｙは−ＮＨ２であり，Ｚは−ＣＯＮＨ−であ り，ｍは０．５−１５である「請求項２７」記載の接合体３７．Ｑはカルボキシ ル基のヒドロキシスクシンイミドエステルであり，ＳＰは▲数式、化学式、表等 があります▼ であり、Ｙは−ＮＨ２であり，Ｚは−ＣＯＮＨ−であり，ｍは０．５〜１５であ る「請求項２７」記載の接合体 ３８．ＱはＣＯＮＨＮＨ２，Ｓｐは−ＣＨ２ＣＨ２−，Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−Ｃ ＯＮＨＮ＝ＣＨ−，ｍは０，１〜１０である「請求項２７」記載の接合体３９． ＯはＣＯＮＨＮＨ２，Ｓｐは−ＣＨ２ＣＨ２−、Ｙは−ＣＨ，Ｚは−ＣＯＮＨＮ ＨＣＨ２−，ｍは０．１〜１０である「請求項２７」記載の接合体４０．ＱはＣ ＯＮＨＮＨ２，ＳＰはＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−，Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−ＣＯＮＨ Ｎ＝ＣＨ−，ｍは０．１〜１０である「請求項２７」記載の接合体４１．ＱはＣ ＯＮＨＮＨ２，ＳｐはＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−，Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−ＣＯＮＨ ＮＨＣＨ２−，ｍは０．１〜１０である「請求項２７」記載の接合体４２．Ｑは ＣＯＮＨＮＨ２，ＳＰはＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−、Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−ＣＯＮ ＨＮ＝ＣＨ−，ｍは０．１〜１０である「請求項２７」記載の接合体４３．Ｑは ＣＯＮＨＮＨ２，ＳＰはＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−，Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−ＣＯＮ ＨＮＨＣＨ２−，ｍは０．１〜１０である「請求項２７」記載の接合体４４．Ｑ はＣＯＮＨＮＨ２，ＳＰは ▲数式、化学式、表等があります▼ Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−ＣＯＮＨＮ＝ＣＨ−，ｍは０．１〜１０である「請求項２ ７」記載の接合体 ４５．ＱはＣＯＮＨＮＨ２，ＳＰは ▲数式、化学式、表等があります▼ Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−ＣＯＮＨＮＨＣＨ２−，ｍは０．１〜１０である「請求項 ２７」記載の接合体 ４６．ＱはＣＯＮＨＮＨ２，Ｓｐは ▲数式、化学式、表等があります▼ Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−ＣＯＮＨＮ＝ＣＨ−，ｍは０．１〜１０である「請求項２ ７」記載の接合体 ４７．ＱはＣＯＮＨＮＨ２，Ｓｐは ▲数式、化学式、表等があります▼ Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−ＣＯＮＨＮＨＣＨ２−，ｍは０．１〜１０である「請求項 ２７」記載の接合体 ４８．ＣＨ３−ＳＳＳ−ＷはＬＬ−Ｅ３３２８８γ１Ｉ，ＱはＣＯＮＨＮＨ２， ＳＰは−ＣＨ２ＣＨ２−，Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−ＣＯＮＨＮ＝ＣＨ−，ｍは０． １〜１０である「請求項３８」記載の接合体 ４９．ＣＨ３−ＳＳＳ−ＷはＬＬ−Ｅ３３２８８α３Ｉ，ｑはＣＯＮＨＮＨ２， ＳＰは−ＣＨ２ＣＨ２−，Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−ＣＯＮＨＮＨＣＨ２−，ｍは０ ．１〜１０である「請求項３９」記載の接合体 ５０．ＣＨ３−ＳＳＳ−ＷはＬＬ−Ｅ３３２８８γ１Ｉであり，Ｑはヒドロキシ スクシンイミドカルボニルであり，ＳＰは−ＣＨ２ＣＨ２−であり，Ｙは−ＣＨ Ｏであり，Ｚは−ＣＯＮＨ−であり，ｍは０．５〜１５である「請求項３３」記 載の接合体５１．ＣＨ３−ＳＳＳ−ＷはＮ−アセチルＬＬ−Ｅ３３２８８γ１Ｉ ，Ｑはヒドロキシスクシンイミドカルボニル，Ｓｐは−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）− ，Ｙは−ＮＨ２−，Ｚは−ＣＯＮＨ−，ｍは０．５〜１５である「請求項３４」 記載の接合体５２．ＣＨ３−ＳＳＳ−ＷはＮ−アセチルＬＬ−Ｅ３３２８８γ１ Ｉ，Ｑはヒドロキシスクシンイミドカルボニル，Ｓｐは−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２ −，Ｙは−ＮＨ２−，Ｚは−ＣＯＮＨ−，ｍは０．５〜１５である「請求項３６ 」記載の接合体５３．ＣＨ３−ＳＳＳ−ＷはＮ−アセチルＬＬ−Ｅ３３２８８γ １Ｉ，Ｑはヒドロキシスクシンイミドカルボニル，Ｓｐは▲数式、化学式、表等 があります▼ Ｙは−ＣＨＯ，Ｚは−ＣＯＮＮＨ＝ＣＨ−，ｍは０．１〜１０である「請求項４ ４」記載の接合体 ５４．「請求項１」記載のＨＡＭを医薬的に許容きれる賦形剤，希釈剤または担 体とともに含有する医薬組成物 ５５．ＨＡＭはエフェクターまたはレポーター分子に接合している「請求項５４ 」記載の医薬組成物 ５６．「請求項１」記載のＨＡＭの医薬的有効量を投与するヒト対象における癌 腫の処置方法発明の詳細な説明