JP3633613B2 - 表面抗原に関連したｃ‐ｅｒｂＢ‐２（ＨＥＲ‐２／ｎｅｕ）に対する免疫毒素 - Google Patents
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Description
発明の背景
発明の分野
本発明は一般的には腫瘍性疾患の措置の分野に関するものである。より具体的には、本発明は新しい免疫接合体および腫瘍性疾患の措置に使用する方法に関するものである。
先行技術の説明
西側社会においては、腫瘍性疾患は人の死および罹病の主要な原因のひとつである。腫瘍状態、例えば、疾患あるいは「ガン」は少なくともそのひとつの特性、つまり、細胞成長抑制プロセスにおける欠陥を有している。
正常な細胞が悪性細胞に変わるプロセスはここ数十年、集中的な研究の対象となっている。より最近、ガン・プロセスにおける腫瘍遺伝子の役割に、研究の焦点が絞られてきている。腫瘍遺伝子は真核細胞を腫瘍細胞と似た形で成長するように変質させてしまう能力を有する遺伝子である。
腫瘍遺伝子は、正常な遺伝子、または原・腫瘍遺伝子が突然変異し、再構成され、あるいは増幅された場合につくられる。こうした腫瘍遺伝子のひとつはｃ−erbB−２（HER−2/neu）原・腫瘍遺伝子である。以後、この腫瘍遺伝子はｃ−erbB−２と呼ぶ。この遺伝子は表皮成長因子受容体と類似した蛋白質をコード表現する。この原・腫瘍遺伝子の増幅は、不規制細胞の成長により一連の細胞状態をもたらす。
抗体は、通常、外来抗原または抗原性決定子に反応して、動物の免疫システムによってつくりだされる蛋白質である。抗体はそれに対して向けられている特定の抗原と結合する。特殊なモノクローナル抗体の開発は研究者に対して、定義された抗原を過剰に表現する細胞に治療剤を選択的に向けさせることができる手段を提供する。
腫瘍形成性形質変換におけるｃ−erbB−２原・真核細胞の過剰表現の問題が研究の対象となっている。いくつかの乳房悪性腫瘍およびいくつかの卵巣悪性腫瘍などを含むいくつかのタイプのヒトの癌も増幅されたｃ−erbB−２遺伝子を有している。さらに、ｃ−erbB−２の増幅と、それに続く過剰表現が疾病診断と関連づけられている。したがって、ｃ−erbB−２腫瘍遺伝子の過剰表現を示す細胞に化学的治療剤を選択的に向かわせて、その蛋白質を過剰表現する細胞の成長を調節するための方法に関する強いニーズと要望が存在している。本発明はこうした目的を達成するための手段を提供するものである。
発明の要約
本発明は、たとえば抗原結合領域など、ｃ−erbB−２蛋白質に対しての結合特性を示す細胞標的部分と、毒素あるいは成長抑制剤など、細胞成長抑制剤との結合体で構成される新しい組成物を提供する。こうした組成物は細胞成長調節剤をｃ−erbB−２蛋白質を過剰に表現している腫瘍細胞に選択的に向かわせる免疫毒素として作用することができる。
したがって、本発明のひとつの実施例において、TAb 250モノクローナル抗体など、ｃ−erbB−２蛋白質に対しての結合特性を有する標的部分と細胞毒性部分との接合体で構成されている物質の新しい組成物が提供される。この細胞毒性部分は毒素、細胞致死剤、あるいは生物学的反応修飾子などである。ひとつの特殊な実施例において、細胞毒性部分はゲロニン（gelonin）である。
本発明によるもうひとつの実施例は、腫瘍状態、例えば、ｃ−erbB−２腫瘍遺伝子の増幅、あるいは過剰表現によって特徴づけられる疾患などを処理するための、そうした措置を必要とする個人に対して、本発明による免疫毒素を細胞を殺すのに必要な量だけ投与するステップで構成される方法を提供する。
別の実施例は、イン・ビトロで腫瘍細胞を殺し、その後、ホストに再導入する方法を提供する。例えば、骨髄の悪性腫瘍性状態の措置においては、腫瘍性疾患を有する個人から骨髄を取り出し、本発明による組成物で処理する。
本発明のさらに別の実施例においては、腫瘍性疾患の再発を阻止する方法が提供される。再発は、目標の毒素例えば、TAb 250抗体−ゲロニンなどの免疫毒素を細胞を殺すのに有効な量だけ投与することによって阻止される。
本発明のさらに別の実施例において、ｃ−erbB−２蛋白質に対する結合親和性を有する標的部分と細胞毒性部分との溶融構造で構成されている組成物を提供する。好ましくは、この標的部分は、ｃ−erbB−２、例えばTAb 250の細胞外エピトープを識別する抗体であり、そして、細胞毒性部分は、ゲロニンなどの標的部分とは別個に適用されると、比較的不活性である。本発明の他の実施例において、本発明による標的毒素を哺乳動物に投与することによって、腫瘍を持っているその哺乳動物の生き残り時間を延長する方法、および本発明による標的毒素を投与することによって腫瘍の成長速度を遅らせる方法が提供されている。通常、標的毒素は、抗体結合分節（segment）など、免疫性結合領域によって標的とされる。さらに、基本的にはモノクローナル抗体に接合された細胞毒性部分によって構成される免疫毒素を含む医薬品組成物が提供されている。もっとも好ましいくは、この抗体はTAb 250であり、細胞毒性部分はゲロニンである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ELISAで測定された、ZME抗体、TAb 250抗体またはTAb 250とゲロニンの接合体の、SKOV−３細胞に対する影響を示している。
図２は、TAb 250ゲロニン構造のSKOV−３細胞上での細胞毒性を示している。
図３は、SKOV−３細胞上での適切な抗体と不適切な抗体との上記接合体との競合を示している。
図４は、TAb 250−ゲロニンの容量応答関係およびSKOV−３細胞に対する影響を示している。
図５は、TAb 250およびTAb 250−ゲロニン接合体のSKOV−３細胞に対する細胞毒性を示している。
図６は、種々の細胞株に内部化するTAb 250抗体の能力を示している。
図７は、MTTアッセイにおけるTAb 250−ゲロニン免疫接合体の細胞毒性を示している。
発明の詳細な説明
ここで使われている細胞標的部分は、細胞上、通常はその表面に表現されているｃ−erbB−２蛋白質に選択的に結合する。これは、ｃ−erbB−２蛋白質に特に結合するリガンドと、抗原結合領域、例えば、完全な抗体、あるいはそのエピトープ結合フラグメントに結合するリガンドの両方を含んでいる。これには固定的な抗体分子、キメラバージョン、単鎖、およびエピトープ結合性およびアフィニティを保持する修飾抗体フラグメントの両方を含んでいる。
ここで使われている「免疫グロブリン」あるいは「抗体ペプチド」とは、免疫グロブリンあるいは抗体全体、または免疫グロブリン分子の機能的結合フラグメントを意味している。こうしたペプチドの例としては、完全な抗体分子、Fab,F（ab′）2,CDRs,VL,VHおよびひとつの抗体のいずれかの他の部分、特に抗原結合特性またはアフィニティを示すものを含んでいる。例えば、IgG抗体分子は、それぞれ２つの重鎖に対するジスルフィド結合によって結合された２つの軽鎖によって構成されている。これら２つの重鎖自体は、その抗原のヒンジ領域として知られている領域でジスルフィド結合によって相互に結合されている。単一のIgG分子は通常、150−160KD程度の分子量を有しており、２つの抗原結合部位を有している。これらの分子のフラグメント、たとえば、重鎖、あるいは軽鎖だけでも、場合によって抗原と結合する場合がある。抗体、抗体のフラグメント、および個々の鎖は機能的に免疫グロブリンと同等である場合がある。
通常の抗体の重鎖、または軽鎖はＮ−末端（NH2）可変（Ｖ）領域、およびＣ−末端（−COOH）不変（Ｃ）領域を有している。重鎖可変領域はVH（例えば、Ｖγを含む）と称され、軽鎖可変領域はVL（ＶκまたはＶλを含む）と称される。これら可変領域は抗体の同族抗原に結合する分子の一部であり、Fc領域（Ｃ領域の第二および第三ドメイン）はその抗体のエフェクター機能（例えば、補体固定、オプソニン化）を決定する。完全な長さの免疫グロブリン、あるいは抗体の「軽鎖」（通常、約25Kd、約214個のアミノ酸）は、Ｎ−末端（通常約110個のアミノ酸で構成される）の可変領域遺伝子、およびCOOH−末端のκ（カッパー）またはλ（ラムダ）不変領域遺伝子によってコード表現される。完全な長さの免疫グロブリンまたは抗体「重鎖」（通常は約50Kd、約446個のアミノ酸で構成される）も、同様に、可変領域遺伝子（通常、約116個のアミノ酸をコード表現する）および、不変領域遺伝子のひとつ、たとえば、ガンマ（330個程度のアミノ酸をコード表現する）によってコード表現される。通常、「VL」はVLおよび／またはJL（Ｊまたは結合領域）遺伝子部分によってコード表現される軽鎖の部分を含み、「VH」はVHおよび／またはDH（Ｄあるいは多様性領域）およびJH遺伝子部分によってコード表現される重鎖の部分を含んでいる。基本的には、引用により本文に組み入れているRoitt,et al.,Immunology,Chapter 6（2 d ed.1989）と、Paul,Fundamental Immunology,Raven Press（2 d ed.1989）参照。
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変領域は、補足性決定領域またはCDRとも呼ばれる３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域によって構成されている。このフレームワーク領域およびCDRの範囲は定義されている（引用によって本文に組み入れている“Sequences of Protein of Immunological Interest,"E.Kabat,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,（1987）参照）。異なった軽鎖あるいは重鎖のフレームワーク領域の配列は種の内部で比較的よく保存されている。構成軽鎖および重鎖の結合フレームワーク領域である、ひとつの抗体のフレームワーク領域はCDRを三次元空間に位置付け、揃えるのに寄与している。これらのCDRは抗原のエピトープへの結合に基本的に関与している。これらのCRDは、通常、CDR1,CDR2およびCDR3と呼ばれ、Ｎ−末端から順々に番号が付されている。
２つのタイプの軽鎖κおよびλはアイソタイプと呼ばれる。アイソタイプの決定因子は通常、一般にCL、Ｃκまたは特にＣλとも呼ばれる軽鎖の不変領域に存在している。CHとも呼ばれる重鎖分子の不変領域はその抗体のアイソタイプを決定する。抗体は重鎖のアイソタイプに基づいて、IgM,IgD,IgG,IgAおよびIgEに分類される。これらのアイソタイプはそれぞれ、重鎖不変領域のミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）およびイプシロン（ε）部分においてコード表現される。さらに、多数のγサブタイプが存在する。
重鎖アイソタイプはオプソニン化や補体固定など、抗体の種々のエフェクター機能を決定する。加えて、重鎖アイソタイプはその抗体の分泌形態である。分泌されたIgG,IgDおよびIgEアイソタイプは、通常、単一ユニットまたは単量体形態で見いだされる。分泌されたIgMアイソタイプは五量体形態で、そして、分泌されたIgAは単量体および二量体形態で見いだされる場合がある。
Ｆ（ab′）２フラグメントは重鎖不変領域のＣ−末端部分を欠いており、そして、通常、110KD程度の分子量を有している。それは二つの抗原結合部位およびヒンジ領域の鎖間ジスルフィド結合を保持しているが、完全なIgG分子のエフェクター機能は有していない。Ｆ（ab′）２フラグメントは、HarlowおよびLane,infraに述べられているような標準的な方法を用いて、pH3.0−3.5でペプシンによる蛋白質分解消化によってIgG分子から得ることもできる。
「Fab」フラグメントはジスルフィド結合によって結合された軽鎖および重鎖のＮ−末端部分とによって構成されている。それは通常、50kD程度の分子量を有しており、単一抗原結合部位を含んでいる。Fabフラグメントは限定還元によってＦ（ab′）２フラグメントから、あるいは還元剤の存在下でパパインによる消化によって抗体全体から得ることができる（HarlowおよびLane,infra参照）。ある種のケースでは、大気中の酸素の存在の下でパパインの活性を維持するのに必要な還元剤の濃度は、抗体に対する鎖間結合を完全に還元するのに十分である。これは抗原認識能力の喪失をもたらす場合がある。こうした問題を回避するためには、パパインを活性化し、そして、抗原結合活性を維持できる程度の濃度の抗原を含んだバッファーに交換する方法がある。抗体の消化は通常、パパインの非活性化を防ぐために、不活性雰囲気ガスの存在下で行われる。以下の手順はこのプロセスの一例である。
Ａ） パパインの活性化:10mg/ml NH4SO4懸濁液の形態で提供されるパパインを、最終濃度が2mg/mlとなるように、10mM EDTA,20mMシステイン,pH＝8.0に溶解する。この溶液からガスを抜き、窒素の存在下、室温で２時間培養する。
Ｂ） 活性化されたパパインは20mM NaPO4,pH＝7.0,150mM NaCl,10mM NaCl,10mM EDTA,30μM DTTに内部に入れられる。
Ｃ） 抗体の消化：抗体100mg毎に1mgの活性化パパインを加え、その溶液を大過剰の20mM NaPO4,pH＝7.0,150mM NaCl,10mM EDTA,30μM DTTで、継続的にヘリウム・スパージングを行いながら透析を行う。透析は、消化の過程での還元剤のモル過剰を維持するために行われる。
Ｄ） 室温で２−４時間放置した後、ヨードアセトアミドを加えて消化を終わらせる。
Ｅ） 標準的なクロマトグラフィー法を用いて、未消化あるいは部分的に消化された抗体からFabフラグメントを分離する。
ここで用いられている「Fab」あるいはいずれかの他の抗体フラグメントという用語は、本発明の場合、「抗体」あるいは「免疫グロブリン」におけるとの同様の分類を持っている。したがって、「哺乳類」Fab蛋白質、「キメラ性Fab」などは、一般の使用法における対応する定義と同じような意味で、さらに以下の諸項において規定されているような意味で用いられている。
ここで用いられている「キメラ性抗体」または「キメラ性ペプチド」とは、ペプチドの一部が最初の遺伝子ソースから誘導される抗体あるいはペプチド内の対応する配列から誘導される、その配列とあるいは構造的に一致しているアミノ酸配列を有しており、その鎖の残りの部分が他の遺伝子ソースと構造的に一致している抗体あるいは抗体ペプチドのことを指している。例えば、キメラ性重鎖抗体ペプチドはネズミの可変領域とヒトの不変領域とによって構成することができる。これら２つの遺伝子ソースは通常２つの別個の種であるが、場合によっては、ひとつの種である場合もある。
キメラ性抗体あるいはペプチドは通常は、分子および／または細胞組み替え技術を用いてつくられる。多くの例で、キメラ性抗体はひとつの哺乳動物種から得られた抗体の可変領域と同様の挙動を示す軽鎖および重鎖両方の可変領域を有しており、不変および／またはフレームワーク部分は第二の、異なった哺乳動物種から得られる抗体内の配列と構造が同じである。
しかしながら、ここで使われているキメラ性抗体の定義は上の例に限定されるものではない。キメラ性抗体とは、その軽鎖および重鎖のいずれか一方、または両方が、抗体のソースが異なったクラスのものであるか、異なった抗体反応を示すか、あるいは別の起源の種であるかどうかには関係なく、さらに、融点が可変境界と不変境界のいずれにあるかには関係なく、種々のソースからの抗体内の配列を模倣する配列の組み合わせで構成されている。例えば、キメラ性抗体はそのフレームワークおよびCDRが異なったソースからのものである抗体を含む場合がある。例えば、非ヒトCDRが「ヒト化抗体」をつくるために、ヒトの不変領域に結合されたヒトのフレームワーク領域に一体化される。例えば、PCT出願公開No.WO 87/02671、米国特許第4,816,597、ヨーロッパ特許出願0173494、Jones,et al.,Nature,321:522−525（1986）、およびVerhoeyen,et al.,Science,239:1534−1536（1988）参照。これらはすべて引用により本文に組み入れている。
ここで使われている「ヒト様フレームワーク領域」という用語は各抗体鎖のフレームワーク領域を意味しており、通常、少なくとも、約70個のアミノ酸残基、典型的には75−85個、あるいはそれ以上の残基で構成されている。ヒト様フレームワーク領域のアミノ酸残基は少なくとも約80％、好ましくは約80−85％であり、より好ましくは、ヒト免疫グロブリン内のものと、85％以上、構造などが同じである。この他の内発的抗体との共通した特徴は、副次的な免疫反応、例えば、「自己」マーカーに対する反応を減少させるメカニズムだけを導入する標的部分を発生させるので有益である。
ここで使われている「ヒト化」あるいは「ヒト様免疫グロブリン」という用語は、ヒト様フレームワーク領域とヒト免疫グロブリン不変領域と構造などが基本的に一致している、例えば、少なくとも約80％以上、好ましくは約85−90％以上、そして最も好ましくは約95％あるいはそれ以上の同一性を有している不変領域で構成されている免疫グロブリンを指している。したがって、おそらくCDRを除いて、ヒト様免疫グロブリンのほとんどの部分は、ひとつ、あるいはそれ以上の自然なヒト免疫グロブリン配列の対応部分と基本的には構造などが同一である。
ここで使われている「ハイブリッド抗体」という用語は、各鎖が哺乳動物抗体鎖に関して個別的には同様であるが、組み合わせ自体は新しい集合を示しており、したがって、２つの異なった抗原がその抗体によって認識されるような抗体を指している。ハイブリッド抗体においては、重鎖と軽鎖によるひとつの対は、例えばエピトープなど、ひとつの抗原識別特性に対して発生する抗体内に見いだされるものと同様であるが、他の重鎖と軽鎖の対は別のエピトープに対して発生する抗体内に見いだされる対と同様である。これによって多機能性結合価、例えば、少なくとも２つの異なったエピトープと同時に結合する能力をもたらしてくれる。こうしたハイブリッドは、もちろん、キメラ性鎖を用いても形成することができる。
ここで使われている「モノクローナル抗体」という用語は個別抗原決定因子を認識する抗体構成を意味している。それは、抗体の供給源や、そのつくられ方を限定することは意図していない。
先行技術で用いられている標準的な方法を用いて、ｃ−erbB−２に特有なモノクローナル抗体をつくりだすハイブリドーマから異なった領域およびCDRを誘導することができる。最終的に望ましいキメラ性抗体を表現することができる、本発明による核酸配列は、多様なヌクレオチド配列（遺伝子性またはcDNA、合成オリゴヌクレオチドなど）および構成因子（V,J,DおよびＣ領域など）を用い、そして種々の技術を使って形成することができる。適当な遺伝子性配列を結合させるのは、今日では一般的な生産方法であるが、cDNA配列も用いることができる（ヨーロッパ特許公報No.0239400およびeichmann,L.,et al.,Nature,332:323−327（1988）参照。両方とも引用により本文に組み入れる）。
ヒトの不変領域DNA配列は好ましくは、不死化Ｂ−細胞から分離される（例えば、引用により本文に組み入れているHeiter,etal.Cell,22:197−207（1980）参照）るが、他の種々のソースから分離あるいは合成することも可能である。ヒト免疫グロブリンＣγ１遺伝子はEllison,et al.,Nucl.Acid.Res.,10:4071（1982）;Beidler,et al.,J.Immunol.,141:4053（1988）;Liu,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:3439（1987）（すべて引用により本文に組み入れる）に述べられている。
本発明による免疫グロブリンをつくりだすためのCDRは好ましくは望ましい抗原、ｃ−erbB−２蛋白質に結合することができるモノクローナル抗体から誘導され、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、あるいは他の公知の方法で抗体をつくりだすことができる脊椎動物ホスト細胞などを含むいずれか適切な哺乳動物ソース内でつくられる。DNA配列のための適切なソース細胞および免疫グロブリン表現および分泌のためのホスト細胞は、アメリカ・タイプ培養コレクション（“ATCC"）（“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas"第５版（1985）Rockville,Maryland,U.S.A.,引用により本文に組み入れる）など、いろいろな供給源から入手することができる。
ここで具体的に述べられているキメラ性抗体ペプチドに加えて、他の「実質的には同様」修飾免疫グロブリンは、当業者に公知のDNA組み替え技術を用いて設計、製造することができる。これらの遺伝子の修飾は部位指向変異誘発（site−directet mutagenesis）（GillmanおよびSmith,Gene,8:81−97（1979）およびRoberts,S.,et al.,Nature,328:731−734（1987）参照、いずれも引用により本文に組み入れる）など、種々の公知の手法によって容易に行うことができる。これらの修飾にはアミノ酸の追加、消去、置換、好ましくは、適切な性質や生物学的活性を保持しつつ、ポリペプチドの配列における保存的、あるいはその他の変化を含む。別の方法として、一次抗体構造の一部だけを含み、結合および／またはエフェクター活性を有するむポリペプチド・フラグメントもつくることができる。また、多くの遺伝子と同様、免疫グロブリン関連遺伝子は、それぞれひとつまたは複数の別個の生物学的活性を有する個別の機能性領域を含んでいるので、これらの遺伝子を他の遺伝子からの機能性領域に溶融させて、新しい性質または新しい性質の組み合わせを有する蛋白質（免疫毒素など）をつくりだすことができる。
クローンされた可変および不変領域とプラスミドから分離して、pSV2−neo、あるいはpRSV−gptなどの哺乳動物表現ベクターに結紮することによって、機能性転写単位を形成することができる。そして、これらの表現ベクターをホスト細胞にトランスフェクトすることができる。SP2/0またはP3X細胞などのマウス骨髄腫はそれらが内発性免疫グロブリン蛋白質を分泌せず、免疫グロブリン表現に用いられるすべての構成因子を持っているので、好ましいホストである。骨髄腫細胞は上に述べたような適切な手法を用いて、トランスフェクトすることができる。
他のタイプの、他のホスト細胞に固有のプロモーターおよびエンハンサーが先行技術において知られている。Kameyoma,K.,et al.,supra参照。例えば、キメラ性抗体アミノ酸配列をコード表現するDNA配列をイースト・プロモーターおよびエンハンサーに結合させて、先行技術で公知の方法を用いてイースト菌にトランスフェクトさせることができる。Kriegler,supra参照。
この同じ方式を、ひとつの哺乳動物種などのひとつのソース、および異なった哺乳動物種などの他のソースのフレームワーク領域から、ｃ−erbB−２固有CDRを分離するために適用することができる。次にCDRをフレームワーク領域および不変領域に結紮させて、キメラ性抗体を形成することが可能である。それぞれ引用により本文に組み入れる、PCT No.GB88/00731（1989）、および1991年12月12日出願のU.S.S.N.07/808,462参照。CDRは、例えば、ヒト・フレームワークおよび不変領域で構成される表現ベクターにクローンすることができる。
別の例は、マウスなど、ひとつの種の重鎖および／または軽鎖CDR1,CDR2およびCDR3と、ｃ−erbB−２に固有な抗体をコード表現するヒト重鎖のフレームワーク領域で構成される、組み替えDNA配列である。他の可能性としては、ｃ−erbB−２に固有なCDRを用いるか、ひとつの哺乳動物種からのCDR1およびCDR3を含む可変領域の一部を用い、次のこの配列を、第二の哺乳動物種の、第一の哺乳動物のCDR3に対するフレームワーク部分をコード表現している別の配列に結紮し、あるいは、第一の哺乳動物種から誘導され、第二の哺乳動物種のフレームワーク内に、第一の種から誘導された可変領域DNA配列と第二の種から誘導された不変領域とが分散されているｃ−erbB−２固有重鎖CDRをコード表現する組み替えDNA配列で、ホスト細胞株をトランスフェクトするなどの方法である。
抗体配列で構成されている組み替えDNA表現ベクターはホスト細胞へのエレクトロポレーション（elctroporation）によってトランスフェクトすることもできる。標準的な選択手順は、ｃ−erbB−２固有キメラ性抗体をつくりだすクローンを分離するために用いられている。
抗体は大腸菌などのバクテリアからの単鎖抗体など、適切な形態で表現することができる。すべて引用により本文に組み入れているPluckthun,Biotechnology,9:545（1991）;Huse,et al.,Science,246:1275（1989）；およびWard,et al.,Nature,341:544（1989）参照。
これら抗体ペプチド配列は、Taqポリメラーゼなどの、熱的に安定したDNAポリメラーゼ、およびポリメラーゼとオリゴヌクレオチドプライマーを用いて特定のDNA配列を増幅するための用いられる技術であるポリメラーゼ鎖反応またはPCRの使用することによって、クローニングのために増幅することも可能である。これらはすべて、引用により本文に組み入れているPCR Protocols,ed.Innis,et al.,Academic Press,Inc.（1990）に記載されている。また、引用により本文に組み入れているOrlandi,supraおよびLarrick,et al.,Biotechnology,7:934（1989）も参照。
（ここでは単にｃ−erbB−２とも記されている）ｃ−erbB−２蛋白質は、分子量185Kd（キロドルトン）で、タイロシンキナーゼ活性を有する糖蛋白質膜であり、表皮成長因子受容体（EGFR）に関連しているが、それとは別個のものである。EGFR蛋白質と同様、ｃ−erbB−２蛋白質は、２つのシステインを豊富に含む反復クラスター、トランスメンブレイン・ドメイン（transmembrane domain）と、細胞内キナーゼ領域を含む細胞外ドメインを有している。さらに、ｃ−erbB−２蛋白質のアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列と同様に、引用により本文に組み入れているCoussens、et al.,Science,203:1132（1985）によって述べられている。
ｃ−erbB−２蛋白質は1985に３つの異なった研究グループ:Semba,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6497（その遺伝子をｃ−erbB−２と命名）;Coussens,et al.,supra（その遺伝子をHER−２と命名）、そして、King,et al.,Science,229:1132（その遺伝子をｖ−erbB関連と命名）によって発表されたｃ−erbB−２腫瘍遺伝子によってコード表現される。したがって、ｃ−erbB−２遺伝子配列と、その対応する蛋白質配列は先行技術において公知であり、発表されている。ｃ−erbB−２蛋白質は明確な細胞内設計、トランスメンブレイン設計、および細胞外領域を有している。通常、本発明による標的部分は、腫瘍細胞の外部に露出される筈の細胞外領域に結合する。この標的部分は、通常、リガンド結合領域、あるいはエピトープなどの抗原認識分を含む、そこに見いだされるひとつ、あるいは複数の特徴を識別する。エピトープは通常、直線ペプチド配列決定子あるいは立体配座性決定子など、純粋なポリペプチド・エピトープを指して使われることが多いが、含水炭素成分を有するエピトープを指して使われる場合もある。これらエピトープは、したがって、結合蛋白質／含水炭素成分、あるいは含水炭素成分だけを含んでいる場合がある。この蛋白質に対する他の修飾は、正常なものであれ、異常なものであれ、重要なエピトープ性決定子を提供するであろう。
ｃ−erbB−２蛋白質の検出は、ここに述べられているような、ｃ−erbB−２蛋白質に固有の抗体を用いる公知の免疫アッセイを用いて行うことができる。こうした抗体は、例えば、カリフォルニア州テメキュラのChemicon International Inc.などから入手することができ、あるいは、標準的な免疫的手順によって作成することもできる。例えば、ここに引用により本文に組み入れているHarlowおよびLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,N.Y.（1988）参照。
ここでは、ｃ−erbB−２蛋白質の定義に、例えば、ヒトのｃ−erbB−２蛋白質に免疫学的に関連のある蛋白質など、他のホスト・システムから開発された蛋白質も含むことを意図している。例えば、関連するラットの遺伝子（neuと命名されている）は、Schecter,et al.,Science,229:976（1985）に報告されている。
抗体の作用を容易に発揮させることができる有益なエピトープには標的細胞の上に見いだされる細胞外エピトープが含まれる。これらのエピトープは、一般的には腫瘍細胞上に見いだされる蛋白質の直線、あるいは立体配座エピトープなど、蛋白質エピトープである。他の有用なエピトープとしては、含水炭素、および、ｃ−erbB−２蛋白質上に見いだされ、通常、ポスト−トランスレーショナル（post−translational）な修飾部位を含む非蛋白性成分を含む。過剰に表現されたｃ−erbB−２に対する結合特性を示す抗体および他の結合領域も、この蛋白質のフラグメントに対して発生する。
ｃ−erbB−２の細胞外部分に対して、マウスのモノクローナル抗体がつくられている。そうした抗体の一例はメリーランド州ロックビルのアメリカ・タイプ培養コレクション（American Type Culture Collection:ATCC）にNo.HB10646の番号で寄託されているTAb 250である。
また、ｃ−erbB−２表現細胞に対する親和性および特殊性を示す他のいずれかの標的方法からも標的部分を誘導することができる。例えば、ｃ−erbB−２蛋白質によって識別され、結合されるリガンドも有益な標的部分であろう。例えば、EGF受容体のためのリガンドとして機能するらしく、さらに、ｃ−erbB−２蛋白質に対する結合特性を有するように見える分子であるCRIPTOについて述べているCiccodicola,et al.（1989）Embo J.8:1987−1991;Ciardiello,et al.（1991）Cancer Research 51:1051−1054;およびCiardiello et al.（1991）P.N.A.S.USA 88:7792−7796参照。
なお、ここで述べられている配列には、置換、付加、および／または消去などの変異によるこれらの配列の変異体、あるいはいずれか他の、そこから誘導された、あるいは類似している配列に対する基本的に同様の結合活性を有する配列も含まれている。
本発明の場合、抗体あるいはペプチドが、例えば、競合的アッセイ、飽和アッセイ、またはELISAあるいはRIAなどの標準的な免疫アッセイなど、標準的な抗体−抗原、あるいは抗原−受容体アッセイなどで測定、または判定された場合に、ｃ−erbB−２と結合する、または結合することができる場合に、それらの抗体あるいは抗体はｃ−erbB−２に対して特殊性を有するものと判断される。特殊性に関するこの定義は、単一の重鎖および／または軽鎖、CDR、溶融蛋白質、または重鎖および／または軽鎖のフラグメントなどは、それらがｃ−erbB−２蛋白質と結合するか、あるいは、相補的な可変領域および不変領域を有する免疫グロブリン立体配座内に適切に組み込まれた場合、特にｃ−erbB−２蛋白質と結合することができる場合にも適用される。
競合アッセイの場合、抗体あるいはペプチド・フラグメントの抗原と結合する能力は、そのペプチドの、その抗原と結合することが知られている化合物の結合能力と競合する能力を探知することによって判定される。いろいろな種類の競合アッセイが知られており、ここでも検討の対象となっている。また、抑制因子が不在の場合にテスト化合物の結合力を測定するアッセイも用いることができる。例えば、ひとつの分子あるいは他の化合物のｃ−erbB−２蛋白質と結合する能力は、問題の分子を直接ラベルするか、あるいはラベルしない場合は、種々のサンドウィッチ・アッセイ形式を用いて間接的に検出することができる。競合結合アッセイなどのいろいろなタイプの結合アッセイが知られている（例えば、引用により本文に組み入れている米国特許第3,376,110、第4,016,043、HarlowおよびLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,N.Y.（1988）、およびColigan,et al.（eds）,Current Protocol in Immunology,Wiley and Sons,N.Y参照）。競合アッセイを用いる以外のテスト化合物のひとつの成分との結合を測定するためのアッセイも用いることができる。例えば、ｃ−erbB−２蛋白質の存在を確認するために、免疫グロブリンを用いることもできる。ELISAなど、モノクローナル抗体アッセイのための標準的な手順を用いることもできる（HarlowおよびLane,supra参照）。ここに用いることができる種々の信号発生システムをさらに詳しく知るためには、ここに引用により本文に組み入れている、米国特許第4,391,904参照。
さらに、結合部分のｃ−erbB−２に対する結合特性は、その親和性によって判定することができる。その部分の解離定数（KD＝1/K、ここでＫは親和定数）は、１μＭ以下、好ましくは100nM以下、そして最も好ましくは1nM以下である。抗体分子は通常はその下方範囲でKDを有している。KD＝［Ｒ−Ｌ］／［Ｒ］［Ｌ］で、ここで［Ｒ］，［Ｌ］および［Ｒ−Ｌ］はそれぞれ均衡時の受容体またはｃ−erbB−２［Ｒ］、リガンド、抗体またはペプチド（Ｌ）、および受容体−リガンド複合体（Ｒ−Ｌ）の濃度である。通常、リガンドあるいはペプチドと、受容体または抗原との間の結合作用は静電引力、ファンデルワールス力、そして水素結合など、可逆的な、非共有結合などを含む。
他のアッセイ形式としては、ダウン・モジュレーション（down modulation）、内部化、あるいはフォスフォリル化傾向の増大など、ここに引用により本文に組み入れている1991年１月18日に出願された米国特許出願第07/644,361に述べられているような相互作用がもたらす種々に生理学的、あるいは化学的変化の存在、あるいは不存在の検出などが含まれる。Receptor−Effector Coupling−A Practical Approach,ed.Hulme,IRL Press,Oxford（1990）参照。
ｃ−erbB−２蛋白質に特有の好ましいペプチドは、ｃ−erbB−２蛋白質を表現している腫瘍細胞と接触する状態で置かれると、ｃ−erbB−２蛋白質のフォスフォリル化傾向の増大を誘発する。「ｃ−erbB−２蛋白質のフォスフォリル化傾向の増大を誘発する」分子とは、その分子が不在の時に起きるもの以上の、蛋白質へのフォスフェートへの組み込みにおける検出可能な増大を引き起こす分子のことを意味している。通常、こうした検出可能な増大とは、コントロールと対比して２倍以上のフォスフォリル化の増大、好ましくは３倍以上の増大のことである。フォスフォリル化は受容体のフォスフォリル化を検出するために従来の技術で知られている方法で測定することができる。例えば、ここで引用により本文に組み入れている、Cooper,et al.,Methods in Enzymology,99:387−402（1983）;AntoniadesおよびPantazis,Methods in Enzymology,147:36−40（1987）；およびLesniak,et al.,Methods in Enzymology,150:717−723（1987）参照。
通常、フォスフォリル化は完全な細胞のイン・ビボでのフォスフォリオル化（Lesniak,supra）、あるいはイン・ビトロでの自動フォスフォリル化反応によって測定することができる。例えば、イン・ビボでのフォスフォリル化の測定のためには、ｃ−erbB−２蛋白質を持つ細胞が放射性物質でラベルされたフォスフェートに接触する状態で配置されるアッセイを実施することができる。イン・ビボでのアッセイにおけるｃ−erbB−２蛋白質受容体のフォスフォリル化を検出するためには、ラベルされたフォスフェートと共に12時間から18時間程度テスト細胞を培養するのが有利である。これらの細胞は２つ、あるいはそれ以上のバッチに分けられ、一部は受容体のフォルフォリル化を増大すると予想される分子に露出され、一部はコントロールとして分離される。それら画分はその後免疫沈降され、受容体が、例えばSDSポリアクリルアミドゲルまたはオートラジオグラフィーによって識別され、フォスフォリル化における増大は、コントロール画分と比較して、テスト分子に露出された画分のバックグランドにおいて２倍以上の増大があった場合に、統計的に有意であるとみなされる。
イン・ビトロでの自動フォスフォリル化を測定するためには、細胞、または細胞抽出物をｃ−erbB−２に特殊な作用を発揮するペプチドの存在、あるいは不存在下で培養することができる。抗ｃ−erbB−２抗体による免疫沈降に続いて、この免疫複合体をγ32P−ATPによって培養し、SDS−PAGEオートラジオグラフィーによって分析する。
ｃ−erbB−２蛋白質に固有に作用を発揮するもうひとつの好ましいペプチドは、ｃ−erbB−２のダウン・モジュレーションを引き起こすものである。「ｃ−erbB−２蛋白質に対するダウン・モジュレーション」は、腫瘍細胞上でのｃ−erbB−２受容体の検出可能な減少によって判定される。こうしたダウン・モジュレーションは、その腫瘍細胞上でｃ−erbB−２受容体蛋白質に結合する、あるいはそれを識別する抗体、または他の固有結合性を有する部分の能力の低下によって検出される。例えば、ダウン・モジュレーションは、ｃ−erbB−２蛋白質受容体を保有している腫瘍細胞を特定のペプチドで培養し、その細胞を洗浄し、次に、それらの細胞をラベルされた（好ましくは放射性物質でラベルされた）ｃ−erbB−２蛋白質に固有の作用を発揮する抗体に接触させることによって判定することができる。ラベルされた抗ｃ−erbB−２抗体のｃ−erbB−２蛋白質に固有な作用を発揮するペプチドに露出された細胞への結合の程度は、抗体のコントロール細胞（つまり、ｃ−erbB−２固有ペプチドに露出されなかったペプチド）への結合の程度と比較される。好ましくは、これらのアッセイの場合、これらの細胞は洗浄後、ラベルされた抗ｃ−erbB−２交代に直接摂取される。
観察されるダウン・モジュレーションは、通常、用量に依存し、つまり、ダウン・モジュレーションの程度は、ｃ−erbB−２蛋白質に露出されたｃ−erbB−２蛋白質に固有なペプチドの量の増大に伴って増大する。処理された細胞の抗ｃ−erbB−２抗体に対する結合の程度が、コントロール細胞の場合と比較して90％以上の減少を引き起こすペプチドが好ましい。
ｃ−erbB−２蛋白質に対して特有の作用を発揮するもうひとつの好ましいペプチドは、ｃ−erbB−２蛋白質を表現する腫瘍細胞と結合し、そうした腫瘍細胞と接触する状態で置かれると内部化されるものである。「内部化」は、細胞の細胞質においてペプチドが封鎖された場合に起きる。一度内部化されると、受容体および／またはペプチドが細胞リゾソーム内で劣化するか、あるいは細胞表面に循環される。リガンド−受容体複合体の内部化を判定するための方法も、ここに引ようにより本文に組み入れている、Haigler,et al.,J.Biol.Chem.,255:1239−1241（1980）に述べられている。
細胞成長調節因子とは、それが標的とする細胞の成長に影響を及ぼす分子のことである。通常、この調節因子は標的の細胞内に内部化されねばならないが、この機能は通常、標的部分から発生する内部化によってもたらされる。
調節は、通常、代謝または成長速度の減少、好ましくは、細胞毒性影響の減少として行われるが、代謝や成長速度の大幅な増大も有益である。代謝または成長速度の大幅な増大が起きた時は、そうした傾向を示す細胞だけを殺す短期毒性も組み合わせで用いることができる。
代謝や成長速度を低下させる調節因子の場合、その調節因子が高い活性を有しているなど、強力である方が望ましい。この毒素は無機または単純な有機分子を含んでいるが、通常、生物の分子の方がより強力である。ウィルス性または菌毒素も存在しているが、特定のバクテリア性または植物性毒素は知られているものの中では最も高い活性を持っている。成長抑制は、核酸合成、蛋白質合成、および細胞代謝など、一般的なものであれ、特殊なものであれ、多数の基本的な細胞機能を阻止することによって起こすことができる。例えば、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素は真核細胞における蛋白質合成を非可逆的に抑制することによってその作用を発揮する。両方の例とも、蛋白質合成において基本的な役割を果す伸長因子２を酵素的に非活性化する。他の伸長因子も他の毒素の標的とされる場合がある。対照的に、リシンはリボゾームに直接作用し、285rRNAに作用する植物毒素である。
好ましくは、成長調節因子は高い代謝回転数を持つ酵素活性を有しており、したがって、非常に少数の分子が内部化されるだけでも、標的の細胞を殺すことができる。引用により本文に組み入れている、Pastain,et al.,Science 254:1173−1177参照。
ゲロニンはゲロニウム・マルチフォーラムの種子から精製された糖蛋白（分子量：約29−30,000Kd）であり、強力なリボゾーム非活性化植物毒素のタイプに属する。このタイプに属する他のものとしては、アブリン、リシン、およびモデシンの鎖などを含んでいる群のものである。ゲロリンは、アブリンおよびリシンと同様、哺乳動物リボソームの60Sサブユニットを破壊することによって蛋白質合成を抑制する。ゲロニンは化学的および物理的処理に対しては安定的である。さらに、ゲロニン自体は細胞には結合せず、単独で投与された場合、通常は非毒性（濃度が高い場合を除いて）であり。実験室で取り扱う場合は安全である。リボソームの非活性化は非可逆的であり、補助因子が関与するようには思われず、効率的に行われるので、これはゲロニンが酵素的に作用することを示唆している。
ゲロニンおよびリシンは蛋白質合成を抑制し、蛋白質の重量ベースでは最も活性の高い毒素である。ゲロニンは蛋白質合成の抑止においては、リシンＡ鎖と比較して、10−1000倍も活性が高い。リシンおよびアブリンなどのペプチドは、毒性単位であるＡ鎖と、細胞に結合することによって作用するＢ鎖との２つの鎖により構成されている。リシンおよびアブリンとは違って、ゲロニンは単鎖で構成されており、そして、細胞に結合するためのＢ鎖がないので、それ自体は比較的不活性で、普通の細胞に対しては、非毒性である。結合あるいは標的部分に接合されない場合、細胞に対する影響がずっと低いというこの特徴は、本発明のいろいろな実施例における重要な特徴である。この状況に応じて異なって現れる毒性はｃ−erbB−２を表現する細胞に対する高い選択性を実現する上には極めて重要である。
哺乳動物細胞は天然のゲロニン分子に結合する、および／またはそれを内部化する能力を明らかに欠いている。ある種の腫瘍細胞上に存在する腫瘍関連抗原に向けられたモノクローナル抗体TAb 250など、腫瘍標的試薬とゲロニンの接合体はゲロニンをその細胞に結合させるための方法と、ゲロニン−抗体複合体の内部化のためのルートの両方を提供する。
免疫毒素の細胞毒性部分は細胞毒性薬あるいはバクテリア性または植物性由来の酵素活性毒素、あるいはそうした毒素の酵素活性フラグメント（「Ａ鎖」）であってもよい。酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントが好ましく、ゲロニン、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非活性フラグメント、（シュードモナス・アルギノーサからの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ、アブリンＡ鎖、メドクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アラウライト ホーディイ（Aleurites fordii）蛋白質、ダイアンシン蛋白質、ヒトイアカ アメリカナ（Phytoiacca americana）蛋白質（PAP I,PAP IIおよびPAP−Ｓ）、モルモディカチャランティアインヒビター、カルシン（curcin）、クロチン、サポナリアオフィシナリス・インヒビター（saponaria officinalis inhibitor）、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノミシン、およびエノミシンなどがその具体例である。活性毒素はいろいろなメカニズムを通じてその作用を発揮し、そのそれぞれは細胞生理および成長に影響を及ぼす。これらの毒素は代謝インヒビターまたは毒素、核酸合成インヒビター、蛋白質合成インヒビター、あるいは異常または悪性機能の他の仲介者などとして機能する。もっとも好ましいのは、ゲロニンとの接合体である。
活性フラグメントおよい誘導体にはゲロニンの全長構造と同じ核構造を有しているが主要配列全体を欠いている化合物を含んでいる。これらのフラグメントまたは誘導体は、ゲロニンと同じ、あるいはそれより改善された生物学的、あるいは細胞毒性活性を有している。ゲロニン・フラグメントまたは誘導体はウサギ網状赤血球細胞溶解物アッセイを用いて、当業者によって、簡単に判定することができる。
TAb 250抗体に結合され、本発明において用いることができる生物学的応答修飾子としては、IL−1,IL−２、インターフェロン（α、β、またはγ）、TNF,LT,TGF−βおよびIL−６などのリンフォカインおよびサイトカインなどである。これら生物学的応答修飾子は腫瘍細胞に対していろいろな影響を及ぼす。こうした影響の中には、直接の作用によって殺される腫瘍細胞の増大、および、ホスト細胞防衛仲介プロセスの増大によって殺される腫瘍細胞の増大などがある。抗体TAb 250とこれら生物学的応答修飾子との接合体は選択的局在化、またはｃ−erbB−２を過剰表現する腫瘍または細胞への移行を可能にし、したがって、改良された抗増殖効果をもたらす。非標的細胞の毒性につながる不特定効果は、選択された細胞成長伝達因子が標的成分がないときは効果を発揮しないので、最小限に押さえられる。
本発明において有益な細胞毒性薬（およびその誘導体）には、アドリアマイシン、シス−プラチナ複合体、ブレオマイシン、およびメソトレキセートなどがある。これらの細胞毒性薬は再発性腫瘍の治療的管理のためには有益であるが、副作用が激しく、非標的細胞の受ける損傷も激しいので、その使用法は非常に難しい。TAb 250抗体は、腫瘍への伝達と、腫瘍細胞自体への侵入をしやすくるための両方の効率的な手段を提供してくれ、こうした薬剤の有益なキャリアとしての役割を果すことができる。さらに、特定の抗体による細胞毒性薬の腫瘍への伝達は肝臓や骨髄などｃ−erbB−２を過剰表現しない鋭敏な場所を、化学治療剤の悪性の作用から保護してくれる。伝達システムとしてのTAb 250に接合された薬剤の使用は、すべての薬剤部分が腫瘍細胞に集中する抗体に接合されており、通常、そこに内部化されるので、薬剤自体の用量を減らすことができる。
標的部分および細胞成長調節因子は、種々の高蛋白質結合剤を用いて接合することができる。こうした薬剤の例としては、Ｎ−サクシミジル３−（２−ピリジルジチオ）（プロピオネート）（SPDP）、２−IT,4−サクシミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエン（SMPT）、ジメチルアジピミデートなどイミドエステルの二機能性誘導体、HCl、ジサクシミジルスベレートなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、ビス（ｐ−ジアドベンゾイル）ヘキサンジアミドなどのビスホアジド化合物、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミドなどのビスホジアゾニウム誘導体、トルエン2,6−ジイソチアネート、および1,5−ジフロオロ−2,4−ジニトロベンゼンなどのビス−活性ふっ素化合物などである。
これらの研究で使用するに先立って、SP2/0−Agl4細胞は、まず、0.1μg/mlの天然ゲロニンの存在下で成長される。数か月間のうちに、ゲロニンの濃度は、細胞が10mg/mlのレベルで維持できるようになるまで、徐々に増やされていく。次に、10mg/mlの存在下での限定希釈によってそれらの細胞のクローニングが行われ、その結果できるゲロニンに抵抗性を有するクローンが拡大される。次に、２つの継代（passage）のために、ゲロニンが培養媒体からゲロニンが取り除かれ、その後、その細胞が再びゲロニンに露出されて、安定的に抵抗性のあるクローンの成長が確認される。キメラ性TAb 250の生産およびその活性を確認するためのテストを実施した後、抗体をつくりだすゲロニンに抵抗性のあるSP2/0細胞が成長され、TAb 250抗体に関するcDNAが制限エンドヌクレアーゼによる培養によってトータルDNAから取り除かれる。それと平行して、最適化されたゲロニンを表現するJM105大腸菌からのcDNAが取り出され、精製され、そしてHind IIIおよびEcoR Iによる消化を行った後にそのDNAをコード表現するゲロニンが取り出される。このゲロニン遺伝子は重鎖フラグメントに結紮され、この挿入物がゲロニンに抵抗性を有するSP2/0細胞に入れられる。この細胞は、次に、限定希釈によってサブクローンされ、それらのクローンはキメラ性抗体生産およびそのゲロニン成分のためにスクリーニングされる。最後に、ポジティブ・クローンが拡大されて、組み替え溶融蛋白質がイン・ビトロ細胞毒性アッセイおよびイン・ビボ繊維分散、薬理力学的、治療的、および毒性に関する実験の両方において使用、テストされる。TAb 250−ゲロニン溶融蛋白質の性質を前に述べたTAb 250ゲロニン構造の特性とを比較して、それぞれの長所と欠陥の判定が行われる。こうした研究の結果に基づいて、キメラ性TAb 250ゲロニン溶融蛋白質のフェーズＩ臨床調査を、進行した乳癌を持つ患者の体内で行うことができる。腫瘍細胞、例えば、ｃ−erbB−２腫瘍遺伝子が望ましくないレベルで表現されている腫瘍を持っていると診断された個人に対して、本発明による免疫毒素を投与すると、細胞毒性薬を、それらの細胞を殺すのに必要な場所にその細胞毒性薬に移行させ、集中させることが可能になる。このように、細胞毒性薬を標的に移行させ、他の器官、組織、および細胞に対する不特定な毒性が除去、最小限化、あるいは少なくとも減少される。
イン・ビボで治療のために用いられる場合、本発明による免疫毒素は、治療的に効果のある量、つまり腫瘍による負担を除去するかあるいは減少する量で、患者あるいは動物に投与される。それらは通常、経皮的に、好ましくは静脈注射によって投与されるが、他の投与ルートも最適であれば用いられる。これらの用量および用量に関する処方は癌の性質（一次性か、転移したものか）、およびその密度、その治療指数などの特定の免疫毒性の特性、患者、および患者の病歴やその他の要素に依存する。投与される免疫毒性の量は通常、0.1から10mg/kg程度の範囲である。こうした調整は、措置の否定的な影響に対するバランスを考慮に入れつつ、最適な有効性が得られるまで続けられる。引用により本文に組み入れているRemington′s Pharmaceutical Science,17th Ed.（1990）Mark Publishing Co.,Easton,Penn.;およびGoodmandおよびGilman′s:The Pharmacological Basis of Therapeutics 8th Ed（1990）Pergamon Press参照。
経皮投与を行うためには、免疫毒素は最も一般的には、薬学的に受け入れ可能な経皮投与ベヒクルとの組み合わせによる、ユニット投与による注射可能な形態（溶液、懸濁液、およびエマルジョン）の形で処方される。そうしたベヒクルは非毒性で、治療上の効果をもたないものであることが好ましい。そうしたベヒクルの実例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース液、および５％ヒト血清アルブミンなどがある。固定オイルおよびエチルオレエートなどの非水性ベクトルも用いることが可能である。キャリアとしてリボソームの使用も可能である。これらのベヒクルは、緩衝剤や保存剤など、等張性および化学的安定性を強化する物質などの添加物を多少含んでいてもよい。免疫毒素は通常、そうしたベクトル内で0.1mg/ml−10mg ml程度の濃度で調製される。
本発明による免疫毒素はイン・ビトロの方法でも用いることができる。例えば、そうした方法を骨髄の腫瘍細胞を殺すのに用いることができる。この方法では、まず、骨髄を腫瘍性疾患を有する固体から取り出す。次に、その骨髄を細胞毒性的に有効な量の本発明による免疫毒素で処理して、残留腫瘍細胞を取り除く。処理された骨髄は、すべての内発性同種毒性細胞を取り除くための集中的な化学療法および／または放射線治療を受けた後、免疫システムを再確立するために患者に再投与される。
本発明による免疫毒素は、腫瘍を持った哺乳動物の生き残り時間を延長したり、哺乳動物が体内に持っている癌細胞によって構成される腫瘍の成長速度を遅らせるために用いることもできる。例えば、皮下あるいは腹膜内で成長しているヒトの腫瘍の異種移植を受けたヌード・マウスをいろいろな用量の免疫毒素、抗体のみ、毒素のみ、あるいは25−100mg/kgの範囲の食塩水で処理する。腫瘍成長抑止は皮下腫瘍の物理的な大きさの変化や、SKOV−３細胞などの腹膜内腫瘍をもったマウスの生き残り期間の延長を手がかりに測定することができる。そうした研究は、霊長類を含む他の哺乳動物に適用できる方法論の確立に役立つであろう。
以下の実例は、本発明による免疫毒素の調製、特徴付け、および使用法に関する詳細な説明である。これらの例はいずれの意味においても、本発明を限定することは意図していない。
実施例１
ゲロニンの精製
ゲロニンを分離するための手順はStirpe,et al.,I,Biol.Chem.,255,6947−53（1980）に述べられている。ゲルマニウム マルチフォーラム（Gelonium multiflorum）の種子の外皮をとり、その実をホモジナイザーで、5mMリン酸ナトリウム（pH7.4）を含む0.14M NaCl 8容積分と共に砕く。この均一化されたものを一昼夜４℃の温度で継続的に撹拌しながら放置し、氷上で冷やして、０℃の温度で、20分間、35,000回遠心分離にかける。上済液を取り除いて、5mMリン酸ナトリウム（pH6.5）で透析してから、pm10フィルターを用いて遠心分離する。サンプルを5mMリン酸ナトリウム（pH6.5）で均衡化させたCM−52イオン交換カラム（20×1.5cm）上で層状に置く。このイオン交換樹脂に結合した物質を400mlの０−0.3M線形勾配を持つNaClで、４℃の温度下、１時間あたり25mlの割合で溶出させた。5ml画分が集められた。各画分を電子顕微鏡で観察した。ゲロニンは画分55−70で溶出し、最後の主要溶出ピークであった。画分55−70が集められ、二重に蒸留された水で透析され、凍結乾燥の方法で濃縮された。各製剤の純度および分子量を、TSK3000ゲル浸透カラムを用い、50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4および15％ナトリウム・ドデシルスルフェート−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（SDS−ページ）によって、高圧液体クロマトグラフィーで検査した。ゲロニンは単一の帯として移動し、その分子量は29,000−30,000ドルトンと推定された。
実施例２
ゲロニン活性のアッセイ
ゲロニンの活性は無細胞蛋白質合成抑止アッセイによって観察された。この無細胞蛋白質合成抑止アッセイは、50μｌウサギ細胞質溶解物に以下の成分（0.5mlの0.2Mトリス−HCl（pH7.8）、8.9mlのエチレン・グリコール、および0.25mlの1M HCl）を追加し、追加する度によくかき回した。
0.375M KCl,10mM Mg（CH3CO2）２、15mMグリコース、0.25−10mMアミノ酸（ロイシンを除く）、5mM ATP,1mM GTP,50mMトリス−HCl（pH7.6）、10μｌクレアチニンフォスフェート−クレアチニンフォスフォキナーゼ、12μl 3Hロイシン（Amersham,74mCi/mmol）で構成される塩−アミノ酸エネルギー混合体（SAEM）に、いろいろの濃度のゲロニン混合物を含む液体1.5μｌを加える。この混合物を30℃の温度で60分間培養した。3H−ロイシンのとり込みが、グラスファイバーフィルター上に合成された蛋白質を沈殿させ、10％TCAおよびアセトンで洗浄し、そして、アクアゾルシンチレーション液を用いるベータカウンターでその放射能を測定することによって観察した。これら抗体との接合には特殊な活性が４×103U/mg以上のゲロニンを用いられた。ゲロニンの活性の単位は、無細胞アッセイにおいて［14C］ロイシンの蛋白質への取り込みを50％抑制するゲロニンの量を基準としている。
実施例３
TAb 250の２−IT修飾ゲロニンのゲロニン製剤との接合
リン酸緩衝食塩水をセントリトリップ10コンセントレータで10mg/ml程度に濃縮した。トリエタノールアミンヒドクロライド（TEA/HCl）,pH8.0、およびEDTAが加えられ、最終的な濃度が60mM TEA/HClおよび1mM EDTA,pH8.0に調整された。そして、この最終的な濃度の溶液1mMに２−イミノチオラン・ストック溶液（1mM EDTAを含む60mM TEA/HClに500mM）を加え、そのサンプルを窒素ガス流の存在下で、４℃の温度下で、撹拌しながら90分間培養した。過剰なイミノチオランは0.01M Na2HPO4,0.0018M KH2PO4,0.0034M KCl,0.001M EDTAおよび0.17M NaClを含むフォスフェート−EDTA緩衝液で予め均衡化したシェパディクスＧ−25（１×24cm）のカラム上でのゲルろ過によって除去した。蛋白質の含有率を調べるために画分を、バイド−ラッド（Bio−Rad）アッセイを用いてマイクロタイター板で分析した。空隙容積にゲロニンが溶出した。これらの画分を集めて、４℃の温度で保存した。
実施例４
モノクロナール抗体の調製
完全のフロイド・アジュバンド内で1:1の割合でエマルジョン化した２×106−１×107NIH3T3T細胞（Ｃ−erbB−２でトランスフェクトされたNIH373細胞）を皮下（i.p.）および腹膜（s.c）に投与して、BALB/cマウスを免疫化した。供試動物には２週間から４週間に一度づつ、追加刺激を与えた。ELISA（以下に説明）内でポジティブ・タイターが検出されたら、融合４日前に最終的な皮下または静脈注射を行った。脾臓細胞をRPMI1640,10％FBSおよび2mM L−グルタミン内で保存されていたP3−X63Ag8.653骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ上澄液のポジティブ反応性をELISA（下記参照）内でテストしたところ、４℃での未固定NIH3T3およびNIH3T3T細胞を用いた間接免疫蛍光法と、それに次いで行われたフローサイトメトリック分析によって、細胞外ドメイン反応性が検出された。このモノクローナル抗体TAb 250はどのソースからでも得ることができる。最も好ましくは、本発明で用いられる抗ｃ−erbB−２抗体はヒトの抗体か、マウスの抗体のいずれかである。
TAb 250をつくりだすハイブリドーマ細胞は2L継続潅流バイオリアクター内で成長される。バイオリアクターからの細胞上澄液をろ過して、蛋白質−Ｇトリオ・システム内を通過させ、その後で、イオン交換クロマトグラフィーを行う。その物質を、次ぎに濃縮し、無菌ろ過する。最終的な生成物に関するテストとしては、総DNA、蛋白質純度、pH、（IEF）、総蛋白質、内毒素、能力、同一性、および蛋白質−Ｇ抗原に関するテストが含まれる。
本発明は、なかんずく、ハイブリッド抗体、あるいはヒト化またはヒト状抗体を含むキメラ性抗体を用いる。好ましい実施例において、マウスTAb 250抗体のひとつの配列から、種々の配列が発生し、それらは基本的にはマウスTAb 250抗体の配列と同一である。BACh−250はそのようなキメラ性抗体である。
実施例５
ELISAアッセイ
無菌96−ウェル・プレートを無菌PBS内で1mg/mlの仔ウシ・コラーゲンで37℃の温度下で２時間前処理した。NIH3T3T細胞（ベクターで形質転換されたNIH353細胞）を80％の融合度まで成長させ、温パックのバーセン（Puck′s Versene）（PBS内で0.02％EDTA）で取り出し、洗浄し、37℃で一昼夜処理したウェル内に0.5−１×106細胞/mlの割合で入れた。プレートを静かに洗浄して、10％中性緩衝化フォルマリンで処理し、その後、１％仔ウシ血清アルブミンBSA/PBSでブロッキングした。次ぎにサンプル上澄液または抗体希釈液をプレートに加えて、37℃の温度で２時間培養し、その後、アルカリフォスフォターゼ接合ヤギ・抗マウスIgG Fc−固有二次抗体で、37℃の温度で１時間培養した。プレートをPBSで洗浄し、パラ−ニトロフェニルフォスフェートおよびジエタノールアミン基質を加えて、さらに室温で15分間培養し、そしてA405を測定した。ネガティブ・コントロール抗体に対する吸収度より0.2−1.0以上高い吸収度でトランスフェクトされた細胞と反応した上澄液または抗体がポジティブとみなされた。
実施例６
125 I−TAb 250の調製と取扱
メーカーの処方に基づいてヨード粒（Priece）を用いて、TAb 250を放射性ラベルした。基質なしのNa125I（400uCiのIMS.30,Amersham）を３ヨード粒の存在下で、100mM Na−フォスフェート緩衝液（200μl,pH7.4）中で、25ug TAb 250と反応させた。この操作によって、ヨード原子とIgG分子の比率は約1:1になった。この取り込みは時々かき回しながら、7.5分間、室温で進行させられた。反応混合物をビーズから取り除き、５分後に、体積をNa−フォスフェート緩衝液で0.5mlに調節し、特殊な活性（以下参照）を評価するために、２μｌを取り出した。残りは、0.1％BSAおよび0.02％アジドを含むPBSで均衡化したNAP−５カラム（Pharmacia）を用いたゲルろ過で脱塩した。放射性ラベル抗体を1mlのカラム緩衝液で溶出して、４℃の温度で、最大６週間保存したが、結合活性のロスは認められなかった。この脱塩された物質は、95％以上がTCA沈殿可能であったので、取り込まれない要素は基本的に含まれていなかった。
放射性物質でラベルした抗体の特殊な活性は、この脱塩ステップの前に、TCA沈殿によって評価された。こうして、２μｌの反応混合物をカラム緩衝液内で500倍に希釈して、２画分を等しい体積の氷冷20％TCAと混合した。氷上に25分放置した後、遠心分離（10分、3000×ｇ）で沈殿物を収集した。上澄液とペレットを別個にカウントし、取り込みはTCA−沈殿可能カウントのパーセントを基準として判定された。個別の沃素化で達成された取り込みの程度は27％から45％の範囲で、特殊活性の評価値は3.9−7.2uCi/ugであった。それぞれの結合実験の前に、結合バッファで均衡化したNAP−５カラムを用いたゲルろ過によって、適切な量の125I−TAb 250の脱塩を行った。この手順により、アジドと、通常、98％以上のTCA−沈殿可能な物質とが取り除かれた。
実施例７
細胞培養
ヒト乳房悪性腫瘍細胞株系統SKBR−3,MDA−MB−453およびMDA−MB−231、およびヒト卵巣悪性腫瘍細胞系統SKOV−３が用いられた。SKBR−3,MDA−Ｍ−231,MDA−MB−453が10％FBSおよび2mML −グルタミンを補足した最小限必要な培地中で維持された。MDA−MB−453細胞のための培養液は１％の不可欠ではないアミノ酸および１％ビタミンも含んでいた。SKOV−３細胞は10％FBSおよび2mM L−グルタミンを補足したIscove社の修正ダルベッコ培養液中で培養された。すべての培養株は５％または10％CO2の存在下で、37℃の温度で培養された。
実施例８
125 I−TAb 250の内部化
125I−TAb 250の内部化を、酸に感受性のある部分と、感受性のない部分における放射能の量を判定することによって判定した。細胞を取り出して、125I−TAb 250単独（6ng/mlから153ng/ml）、および過剰な、ラベルされていないTAb 250で氷冷結合緩衝液中に再懸濁され、不特定（non−specific）結合を判定した。放射性物質でラベルした抗体の細胞表面結合が均衡状態に達した後、細胞を200×ｇで４℃の温度で、５分間ペレット化し、非結合抗体を取り除くために、氷冷結合緩衝液によって、三度洗浄した。この細胞ペレットを氷冷結合培養液内で再懸濁させ、画分をとって、最初の125I−TAb 250表面結合の量を判定した。放射性物質でラベルした抗体の内部化を開始するために、これらの細胞を37℃に暖めた。15分間から150分間の間に、画分を取り出し、遠心分離（1400×g,5分間、４℃）で収集した。分離され、循環された抗体を含む上澄液が集められた。酸洗浄（100μl/チューブPBS、１％グルコース、pH1）で、ペレットの２度、再懸濁させた。表面結合抗体を含む上澄液を集め、カウントした。残りの細胞関連放射能を含んだチューブの先端を切り取って、カウントした。
図６は、モノクローナル抗体TAb 250がMDA−MB−231細胞に内部化されないことを示している（パネルＢ）。対照的に、SKBR−３細胞はTAb 250抗体を最も効率的に内部化（パネルＡ）し、その抗体のSKOV−３細胞およびMDA−MB−453内への取り込みは中間程度であることを示している（それぞれ、パネルＣおよびＤ）。
実施例９
SPDPによるモノクローナル抗体TAb 250の修飾
ジメチルフォルムアミド内のＮ−サクシミジル３−（２−ピリジルジチオ）（プロピネート）（SPDP）を3mg mlの細胞株溶液として、乾燥ジメチルフォルムアミド内で調製した。結晶性SPDPは加水分解を受けるので、化学的に反応性のあるクロスリンカーの実際の濃度は、二重ビーム分光計で260nmでの吸収度を分析することによって、分光法で判定したSPDP細胞株の濃度は、以上の式で計算した。
1.0mlのフォスフェート緩衝食塩水（PBS）内の１ミリグラムのモノクローナル抗体TAb 250をガラス・チューブに加えた。SPDP細胞株溶液を５モル程度過剰（10μｌ程度の細胞株溶液）の割合で、継続的にかき混ぜながら、チューブに加えた。この混合物を、室温で30分間培養し、培養期間中、５分毎に攪拌した。
過剰の未反応SPDPを0.5mM EDTA（緩衝液Ａ）を含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0で予め均衡させたセファデックスＧ−25カラム（１×24cm）上で、ゲルろ過クロマトグラフィーでサンプルから除去した。その一部（0.5ml）を集めて、ブラッドフォード色素結合アッセイ（Bradford,Anal.Biochem.72:248−254（1976））を用いて、その蛋白質含有率を分析した。Bio−TEKマイクロプレート・オーロリーダーを用いて、96−ウェル・プレート内で吸収度（600nm）が観察された。空隙容積（フラクション14−20）で溶出された抗体およびそれらのフラクションを集めて、４℃で保存した。蛋白質はセントリコン（Centricon）−30マイクロコンセントレータで濃縮された。このセントリコンレテンテートをEDTA（0.5mM）を含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。この抗体は最終体積0.5−0.75mlに濃縮された。
実施例10
SPDP−修飾モノクローナル抗体TAb 250とイミノチオラ ン修飾ゲロニンの接合体
２−IT修飾ゲロニンおよびTAb 250の接合体
SMPTと結合したTAb 250ゲロニンが、２−IT−修飾ゲロニンをSMPT−修飾モノクローナル抗体TAb 250に結合させることによって分離した。簡単に言うと、SMPTでTAb 250を修飾するために、1.0mlのPBS内の10mgの抗体を2X硼酸塩緩衝液（0.05M硼酸ナトリウム1.7％塩化ナトリウム、pH9.0）で1:1に希釈して、その抗体溶液に、乾燥DMF中の4mM SMPT 25μｌをゆっくりと加える。この反応物をN2の存在下で攪拌しながら２時間室温で培養する。さらに、これら反応物をフォスフェート−EDTA緩衝液、pH7.5を含むセファデックスＧ−25カラムを通過させることによって、過剰なSMPTが取り除かれ、そして、抗体ポジティブフラクションをBio−Radアッセイによって評価する。これらのフラクションを集めて、N2の存在下、４℃の温度で保存する。N2の存在下、27度の温度で、96時間、攪拌しながら、２−ITとのクロス−リンクを行う。最終的な生成物を、実例９でSPDPに関して述べたのと同様の手順で精製する。
実例１で述べたのと同様に調製された精製ゲロニン（PBS内に2mg/ml）の１ミリグラムを、実例３で述べたのと同様の方法で、イミノチオレインで修飾した。実例９で述べたように修飾されたモノクローナル抗体TAb 250を等量の修飾ゲロニンと混合した。この割合は、抗体に対してのゲロニンの５倍モル過剰に相当するこの混合物のpHを0.05M TEA/HCl緩衝液pH8.0を加えて7.0に調整し、そしてその混合物を窒素の存在下、４℃の温度で、20時間培養した。遊離スルフヒドリル基の残留を防ぐために、ヨードアセトアミド（0.1M）を最終濃度に調整されたもの2mMに加えて、培養をさらに１時間、25℃程度の温度で継続された。この反応混合物を４℃の温度で保存し、ゲルろ過で精製を行った。
実施例11
ゲロニン−モノクローナル抗体の精製TAb 250複合体
非接合ゲロニンと低分子量精製物を、PBSで予めろ過したセファデックスＳ−300カラム（1.6×31cm）上でゲルろ過を行うことによって、実例10の反応混合物から取り出した。
実例10からの反応混合物を、セファデックスカラムに入れる前に、セントリコン30マイクロ濃縮器によって1ml程度に濃縮された。このカラムはPBSによって洗浄した。1mlフラクションを集め、その蛋白質含有率を調べるために、その50μｌをブラッドフォードアッセイで分析した。
0.1M NaClを含む10mMフォスフェート緩衝液、pH7.2で予め均衡化させたブルーセロファロースCL−6Bカラム（１×24cm）上での親和性クロマトグラフィーによって取り出した。Ｓ−300溶離液を入れた後に、非接合抗体を完全に溶離するために、このカラムを同じ緩衝液30mlで洗浄した。
カラムに結合したゲロニン−接合抗体を10mMフォスフェート緩衝液、pH7.2内で、0.2−2M直接塩勾配のNaClで溶離した。この抗体−ゲロニン複合体は0.7M NaClで溶離した。溶離されたフラクションの蛋白質含有率をブラッドフォード・アッセイで判定した。蛋白質含有フラクションを集めて、５−20％勾配非還元ポリアクリルアミド・ゲルでの電気泳動によって、その溶離物のパターンが確認された。フロースルーピーク（フラクション14−20）は遊離抗体のみを含んでいるが、高塩分で溶離されたフラクションは、非接合ゲロニンまたは抗体を含まないTAb 250−ゲロニン接合体のみを含んでいた。最終的な生成物は1,2および３ゲロニン分子を結合したTAb 250を含んでいた。平均ゲロニン含有率は抗体１分子あたり1.5分子であった。基本的には純粋なゲロニン−TAb 250複合体のゲロニン活性を評価するために、ウサギ網状赤血球イン・ビトロ・トランスレーション・システムを用いた。このアッセイでの活性の一単位は、特別の処理をしないコントロールと比較して、蛋白質合成を50％抑制するのに必要な蛋白質の量として定義された。このアッセイを用いて、天然ゲロニンとTAb 250ゲロニン接合体の両方の特殊活性が、それぞれ、２×108U/mgおよび8.2×105U/mgと判定された。基本的に純粋なゲロニン−TAb 250抗体は網状赤血球溶解物アッセイで活性である。最初のサンプルを1:1000で希釈すると、蛋白質合成の50％抑制、つまり、14C−ロイシンの蛋白質への取り込みの50％抑制が起きた。したがって、最初の調製物の活性は1000U/mlであった。
本発明による組成物は、TAb 250モノクローナル抗体と細胞毒性部分との溶融構造を含んでいた。本発明による免疫毒素は、例えば、以下の方法で調製された。ＨおよびＬ鎖両方のTAb 250のＶ領域のヌクレオチド配列は簡単に判定することができる。例えば、カンジニウム（quandinium）・チオシアネートでTAb 250生産細胞から総RNAを抽出する。ポリＡ＋RNAはオリゴ（GT）セルロースクロマトグラフィーによって分離することができる。適切な遺伝子は、可逆転写およびPCR法などの標準的な技術で分離することができる。cDNAストランドはオリゴ−dTプライマーおよび可逆トランスクリプターゼを用いて合成することができる。こうしたcDNAストランドは、適切なプライマーによる標準的なPCR法によって増幅することができる。このメッセージのポリ−Ａテイル近くのプライマーは、ポリ−Ａ配列に基づく場合と、マウス免疫グロブリン内に見いだされる共通のアジュバンド配列のいずれかに基づいている。ウィスコンシン大学、バイオテクノロジー・センター、遺伝学コンピュータ・グループのDevereauxおよびそれに関連した配列データベース参照。遺伝子の他端のプライマーは、マウス免疫グロブリンに見いだされる共通配列から選択することもできる。Orlandi et al.（1989）PNAS 86:3833−3837およびLarrick et al.（1989）Bio/Technology 7:934−938参照。TAb 250重鎖遺伝子はATATAG CAGGAC CATATGの５′アップストリーム配列を有し、ATGAA CTTGG GGCTCからコーディングが開始される。また、TAb 250軽鎖遺伝子は５′アップストリーム配列TTTAC TTCCT TATTTを有し、ATGGG CATCA AGATGでコーディングが開始される。PCK技術によってこれら遺伝子を増幅するために、これらプライマーを用いることができ、プラズミド表現ベクターにクローンすることができる。
エレクトロポレーションによるDNAのマウス細胞へのト ランスフェクション
これらの遺伝子に対しては、標準的なトランスフェクション法を用いることができる。例えば、DNAはエレクトロポレーションによって、マウスハイブリドーマSp2/0−AG14内に導入することができる。１−２×103急速に成長するSP2/0−AG14細胞を洗浄して、1.0mlの無菌PBS内に再懸濁させる。この細胞懸濁液にキメラ性IgKおよびIgG1プラスミドを各30ミクログラムを加える。このDNA/細胞を予め冷却したショッキング クベットに移し、氷上で少なくとも５分間培養し、そして0.5kv/cm電子パルスを10msecだけ与えた（トランスフェクタ−300,BTX）。ショックを与えた後、このDNA/細胞混合体を10分間氷に戻し、５％NCTC−109および10％FCSを含んでいるDMEN 10ml内で希釈し、そして、室温で10分間培養した。最後に、これらの細胞を７％CO2を含む37℃培養器に移して48時間培養し、その後、１μg/mgキサンチンを含む選択的培地に移した。細胞は３×104細胞／ウェルの密度で、96−ウェル・プレートに入れ、TAb 250抗原ポジティブ標的細胞に結合した抗体を調査するために、ELISAによるアッセイが行われた。
実施例12
MTTアッセイ
３−（4,5−ジメチル／チアゾリル）−2,5−ジフェニルテトラゾニウムプロマイド（MTT）アッセイはベルセン（versene）1:5000で組織培養フラスコから細胞を取り出し、500×ｇで５分間遠心分離を行い、それらの細胞を１×105細胞/mlの濃度で培養液内に再懸濁した。細胞を100μl/ウェルの割合で96−ウェルマイクロタイタープレートに入れ、37℃の温度で、24時間、加湿CO2培養器内で培養した。
次の日、TAb 250またはTAb 250ゲロニンを加えた。最高濃度の抗体を最初のカラムのウェル内に入れたら、すぐに、マルチチャネルピペットを用いて、マイクロタイタープレート内で、抗体の1:2希釈を直接行った。次に、プレートを３日間培養してから、10μl/ウェルの割合でMTTを追加した。MTTはPBSの5mg/ml溶液として調製、ろ過殺菌して、暗所で４℃の温度で保存した。プレートは暗所で保存し、37℃の温度で、さらに４時間培養した。ウェルの内容物を0.04N HClおよび３％ナトリウムドデシルスルフェートと混ぜ合わせて溶解した。そして、酵素結合免疫吸収アッセイ（ELISA）リーダーを用いて判定した。
実施例13
CPA
細胞増殖アッセイ（CPA）は細胞数および成長性を判定することによって、細胞の成長の測定を行う。０日に、80−90％の融合度の細胞を組織培養フラスコから遊離して、200×ｇで、20℃の温度で６分間遠心分離を行ってペレット化し、その後、2mMグルタミンおよび10％仔ウシ胎児血清を含むMEMに6000細胞/mlの濃度で再懸濁させた。この細胞懸濁液を１ウェルあたり1mlの割合で24−ウェルプレートに加えた。このプレートを、５％CO2の存在下、37℃の温度で、24時間培養した。１日に、３つのウェルの細胞をPBSで洗浄して、PBS内に0.05％トリプシンを加えたもの1mlでプレートから遊離して、コウルターカウンターを用いて、500μｌをカウントした。残りのウェルには、20μl PBS,TAb 250、あるいはTAb 250−ゲロニンを、それぞれ図に示す濃度で加える。そして、プレートを培養器に戻し、図に示されている時点で、それら細胞をトリプシンで遊離し、１日のデータとしてカウトされる。のこりの500μｌの細胞を沃化プロピジウムで染色すると、フロー・サイトメトリーによって成長性を判定することができる。グラフの各点で、平均細胞数（ｎ＝３）が判定され、細胞数のパーセントをかけて、成長可能な細胞の数を求める。これをPBSで処理した生きた細胞の数で割って、Ｙ軸上のコントロールのパーセントを求める。
実施例14
ゲロニンおよびゲロニン−TAb 250抗体複合体の細胞毒 性
図１に示されているように、ZME抗体はSKOV−３細胞にほとんど影響を及ぼさない。対照的に、TAb 250−ゲロニン免疫接合体は高度に活性であった。
図２はSKOV−３細胞に対するTAb 250−ゲロニン免疫接合体の細胞毒性を、ゲロニンだけの場合と比較して示している。同じ濃度で、TAb 250−ゲロニン免疫接合体はゲロニンだけの場合と比較して10,000程度高い細胞毒性を示した。
図３は、不適切な抗体、ZMEモノクローナル抗体がTAb 250−ゲロニン免疫接合体の細胞毒性に関して、実質的な影響を及ぼさないことを示している。対照的に、TAb 250モノクローナル抗体の濃度を増大すると、容量に依存する形で、免疫接合体の細胞毒性は減少する。
図４は、SKOV−３細胞に対するTAb 250−ゲロニン免疫接合体の用量に対応した関係を示している。CPAアッセイの場合にも見られたように、0.1マイクログラム/ml以上の用量は６日間の使用で80％の抑止効果を生じた。
図５は、モノクローナル抗体TAb 250のみ、あるいは、TAb 250とゲロニンの接合体のSKOV−３細胞に対する影響を示している。図に示されているように、CPAにおけるTAb 250−免疫接合体による用量に依存した抑制効果が認められる。
図７は、４つの異なった細胞株に対するTAb 250−ゲロニン免疫接合体の影響を示している。この図で分かるように、最大の毒性はSKBR−３細胞株で観察された。SKOV−３細胞およびMDA−MB−453細胞では明らかであるが、MDA−MB−231細胞においては細胞毒性は認められなかった。このように、TAb 250−ゲロニン免疫接合体の細胞毒性は、これらの細胞内における細胞表面受容体数に関連している。
結論として、ここで開示されている本発明およびその実施例は、冒頭に述べたような目的を達成するのによく適合していることが分かるであろう。本発明の精神および範囲を逸脱せずに、方法および装置に一定の修飾を加えることは可能である。さらに、以下の各請求項の各要素あるいはステップは、基本的に同様の方法で基本的には同じ結果を達成するためのすべての同等の要素又はステップについても指しているものとして理解するべきである。
発明の分野
本発明は一般的には腫瘍性疾患の措置の分野に関するものである。より具体的には、本発明は新しい免疫接合体および腫瘍性疾患の措置に使用する方法に関するものである。
先行技術の説明
西側社会においては、腫瘍性疾患は人の死および罹病の主要な原因のひとつである。腫瘍状態、例えば、疾患あるいは「ガン」は少なくともそのひとつの特性、つまり、細胞成長抑制プロセスにおける欠陥を有している。
正常な細胞が悪性細胞に変わるプロセスはここ数十年、集中的な研究の対象となっている。より最近、ガン・プロセスにおける腫瘍遺伝子の役割に、研究の焦点が絞られてきている。腫瘍遺伝子は真核細胞を腫瘍細胞と似た形で成長するように変質させてしまう能力を有する遺伝子である。
腫瘍遺伝子は、正常な遺伝子、または原・腫瘍遺伝子が突然変異し、再構成され、あるいは増幅された場合につくられる。こうした腫瘍遺伝子のひとつはｃ−erbB−２（HER−2/neu）原・腫瘍遺伝子である。以後、この腫瘍遺伝子はｃ−erbB−２と呼ぶ。この遺伝子は表皮成長因子受容体と類似した蛋白質をコード表現する。この原・腫瘍遺伝子の増幅は、不規制細胞の成長により一連の細胞状態をもたらす。
抗体は、通常、外来抗原または抗原性決定子に反応して、動物の免疫システムによってつくりだされる蛋白質である。抗体はそれに対して向けられている特定の抗原と結合する。特殊なモノクローナル抗体の開発は研究者に対して、定義された抗原を過剰に表現する細胞に治療剤を選択的に向けさせることができる手段を提供する。
腫瘍形成性形質変換におけるｃ−erbB−２原・真核細胞の過剰表現の問題が研究の対象となっている。いくつかの乳房悪性腫瘍およびいくつかの卵巣悪性腫瘍などを含むいくつかのタイプのヒトの癌も増幅されたｃ−erbB−２遺伝子を有している。さらに、ｃ−erbB−２の増幅と、それに続く過剰表現が疾病診断と関連づけられている。したがって、ｃ−erbB−２腫瘍遺伝子の過剰表現を示す細胞に化学的治療剤を選択的に向かわせて、その蛋白質を過剰表現する細胞の成長を調節するための方法に関する強いニーズと要望が存在している。本発明はこうした目的を達成するための手段を提供するものである。
発明の要約
本発明は、たとえば抗原結合領域など、ｃ−erbB−２蛋白質に対しての結合特性を示す細胞標的部分と、毒素あるいは成長抑制剤など、細胞成長抑制剤との結合体で構成される新しい組成物を提供する。こうした組成物は細胞成長調節剤をｃ−erbB−２蛋白質を過剰に表現している腫瘍細胞に選択的に向かわせる免疫毒素として作用することができる。
したがって、本発明のひとつの実施例において、TAb 250モノクローナル抗体など、ｃ−erbB−２蛋白質に対しての結合特性を有する標的部分と細胞毒性部分との接合体で構成されている物質の新しい組成物が提供される。この細胞毒性部分は毒素、細胞致死剤、あるいは生物学的反応修飾子などである。ひとつの特殊な実施例において、細胞毒性部分はゲロニン（gelonin）である。
本発明によるもうひとつの実施例は、腫瘍状態、例えば、ｃ−erbB−２腫瘍遺伝子の増幅、あるいは過剰表現によって特徴づけられる疾患などを処理するための、そうした措置を必要とする個人に対して、本発明による免疫毒素を細胞を殺すのに必要な量だけ投与するステップで構成される方法を提供する。
別の実施例は、イン・ビトロで腫瘍細胞を殺し、その後、ホストに再導入する方法を提供する。例えば、骨髄の悪性腫瘍性状態の措置においては、腫瘍性疾患を有する個人から骨髄を取り出し、本発明による組成物で処理する。
本発明のさらに別の実施例においては、腫瘍性疾患の再発を阻止する方法が提供される。再発は、目標の毒素例えば、TAb 250抗体−ゲロニンなどの免疫毒素を細胞を殺すのに有効な量だけ投与することによって阻止される。
本発明のさらに別の実施例において、ｃ−erbB−２蛋白質に対する結合親和性を有する標的部分と細胞毒性部分との溶融構造で構成されている組成物を提供する。好ましくは、この標的部分は、ｃ−erbB−２、例えばTAb 250の細胞外エピトープを識別する抗体であり、そして、細胞毒性部分は、ゲロニンなどの標的部分とは別個に適用されると、比較的不活性である。本発明の他の実施例において、本発明による標的毒素を哺乳動物に投与することによって、腫瘍を持っているその哺乳動物の生き残り時間を延長する方法、および本発明による標的毒素を投与することによって腫瘍の成長速度を遅らせる方法が提供されている。通常、標的毒素は、抗体結合分節（segment）など、免疫性結合領域によって標的とされる。さらに、基本的にはモノクローナル抗体に接合された細胞毒性部分によって構成される免疫毒素を含む医薬品組成物が提供されている。もっとも好ましいくは、この抗体はTAb 250であり、細胞毒性部分はゲロニンである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ELISAで測定された、ZME抗体、TAb 250抗体またはTAb 250とゲロニンの接合体の、SKOV−３細胞に対する影響を示している。
図２は、TAb 250ゲロニン構造のSKOV−３細胞上での細胞毒性を示している。
図３は、SKOV−３細胞上での適切な抗体と不適切な抗体との上記接合体との競合を示している。
図４は、TAb 250−ゲロニンの容量応答関係およびSKOV−３細胞に対する影響を示している。
図５は、TAb 250およびTAb 250−ゲロニン接合体のSKOV−３細胞に対する細胞毒性を示している。
図６は、種々の細胞株に内部化するTAb 250抗体の能力を示している。
図７は、MTTアッセイにおけるTAb 250−ゲロニン免疫接合体の細胞毒性を示している。
発明の詳細な説明
ここで使われている細胞標的部分は、細胞上、通常はその表面に表現されているｃ−erbB−２蛋白質に選択的に結合する。これは、ｃ−erbB−２蛋白質に特に結合するリガンドと、抗原結合領域、例えば、完全な抗体、あるいはそのエピトープ結合フラグメントに結合するリガンドの両方を含んでいる。これには固定的な抗体分子、キメラバージョン、単鎖、およびエピトープ結合性およびアフィニティを保持する修飾抗体フラグメントの両方を含んでいる。
ここで使われている「免疫グロブリン」あるいは「抗体ペプチド」とは、免疫グロブリンあるいは抗体全体、または免疫グロブリン分子の機能的結合フラグメントを意味している。こうしたペプチドの例としては、完全な抗体分子、Fab,F（ab′）2,CDRs,VL,VHおよびひとつの抗体のいずれかの他の部分、特に抗原結合特性またはアフィニティを示すものを含んでいる。例えば、IgG抗体分子は、それぞれ２つの重鎖に対するジスルフィド結合によって結合された２つの軽鎖によって構成されている。これら２つの重鎖自体は、その抗原のヒンジ領域として知られている領域でジスルフィド結合によって相互に結合されている。単一のIgG分子は通常、150−160KD程度の分子量を有しており、２つの抗原結合部位を有している。これらの分子のフラグメント、たとえば、重鎖、あるいは軽鎖だけでも、場合によって抗原と結合する場合がある。抗体、抗体のフラグメント、および個々の鎖は機能的に免疫グロブリンと同等である場合がある。
通常の抗体の重鎖、または軽鎖はＮ−末端（NH2）可変（Ｖ）領域、およびＣ−末端（−COOH）不変（Ｃ）領域を有している。重鎖可変領域はVH（例えば、Ｖγを含む）と称され、軽鎖可変領域はVL（ＶκまたはＶλを含む）と称される。これら可変領域は抗体の同族抗原に結合する分子の一部であり、Fc領域（Ｃ領域の第二および第三ドメイン）はその抗体のエフェクター機能（例えば、補体固定、オプソニン化）を決定する。完全な長さの免疫グロブリン、あるいは抗体の「軽鎖」（通常、約25Kd、約214個のアミノ酸）は、Ｎ−末端（通常約110個のアミノ酸で構成される）の可変領域遺伝子、およびCOOH−末端のκ（カッパー）またはλ（ラムダ）不変領域遺伝子によってコード表現される。完全な長さの免疫グロブリンまたは抗体「重鎖」（通常は約50Kd、約446個のアミノ酸で構成される）も、同様に、可変領域遺伝子（通常、約116個のアミノ酸をコード表現する）および、不変領域遺伝子のひとつ、たとえば、ガンマ（330個程度のアミノ酸をコード表現する）によってコード表現される。通常、「VL」はVLおよび／またはJL（Ｊまたは結合領域）遺伝子部分によってコード表現される軽鎖の部分を含み、「VH」はVHおよび／またはDH（Ｄあるいは多様性領域）およびJH遺伝子部分によってコード表現される重鎖の部分を含んでいる。基本的には、引用により本文に組み入れているRoitt,et al.,Immunology,Chapter 6（2 d ed.1989）と、Paul,Fundamental Immunology,Raven Press（2 d ed.1989）参照。
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変領域は、補足性決定領域またはCDRとも呼ばれる３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域によって構成されている。このフレームワーク領域およびCDRの範囲は定義されている（引用によって本文に組み入れている“Sequences of Protein of Immunological Interest,"E.Kabat,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,（1987）参照）。異なった軽鎖あるいは重鎖のフレームワーク領域の配列は種の内部で比較的よく保存されている。構成軽鎖および重鎖の結合フレームワーク領域である、ひとつの抗体のフレームワーク領域はCDRを三次元空間に位置付け、揃えるのに寄与している。これらのCDRは抗原のエピトープへの結合に基本的に関与している。これらのCRDは、通常、CDR1,CDR2およびCDR3と呼ばれ、Ｎ−末端から順々に番号が付されている。
２つのタイプの軽鎖κおよびλはアイソタイプと呼ばれる。アイソタイプの決定因子は通常、一般にCL、Ｃκまたは特にＣλとも呼ばれる軽鎖の不変領域に存在している。CHとも呼ばれる重鎖分子の不変領域はその抗体のアイソタイプを決定する。抗体は重鎖のアイソタイプに基づいて、IgM,IgD,IgG,IgAおよびIgEに分類される。これらのアイソタイプはそれぞれ、重鎖不変領域のミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）およびイプシロン（ε）部分においてコード表現される。さらに、多数のγサブタイプが存在する。
重鎖アイソタイプはオプソニン化や補体固定など、抗体の種々のエフェクター機能を決定する。加えて、重鎖アイソタイプはその抗体の分泌形態である。分泌されたIgG,IgDおよびIgEアイソタイプは、通常、単一ユニットまたは単量体形態で見いだされる。分泌されたIgMアイソタイプは五量体形態で、そして、分泌されたIgAは単量体および二量体形態で見いだされる場合がある。
Ｆ（ab′）２フラグメントは重鎖不変領域のＣ−末端部分を欠いており、そして、通常、110KD程度の分子量を有している。それは二つの抗原結合部位およびヒンジ領域の鎖間ジスルフィド結合を保持しているが、完全なIgG分子のエフェクター機能は有していない。Ｆ（ab′）２フラグメントは、HarlowおよびLane,infraに述べられているような標準的な方法を用いて、pH3.0−3.5でペプシンによる蛋白質分解消化によってIgG分子から得ることもできる。
「Fab」フラグメントはジスルフィド結合によって結合された軽鎖および重鎖のＮ−末端部分とによって構成されている。それは通常、50kD程度の分子量を有しており、単一抗原結合部位を含んでいる。Fabフラグメントは限定還元によってＦ（ab′）２フラグメントから、あるいは還元剤の存在下でパパインによる消化によって抗体全体から得ることができる（HarlowおよびLane,infra参照）。ある種のケースでは、大気中の酸素の存在の下でパパインの活性を維持するのに必要な還元剤の濃度は、抗体に対する鎖間結合を完全に還元するのに十分である。これは抗原認識能力の喪失をもたらす場合がある。こうした問題を回避するためには、パパインを活性化し、そして、抗原結合活性を維持できる程度の濃度の抗原を含んだバッファーに交換する方法がある。抗体の消化は通常、パパインの非活性化を防ぐために、不活性雰囲気ガスの存在下で行われる。以下の手順はこのプロセスの一例である。
Ａ） パパインの活性化:10mg/ml NH4SO4懸濁液の形態で提供されるパパインを、最終濃度が2mg/mlとなるように、10mM EDTA,20mMシステイン,pH＝8.0に溶解する。この溶液からガスを抜き、窒素の存在下、室温で２時間培養する。
Ｂ） 活性化されたパパインは20mM NaPO4,pH＝7.0,150mM NaCl,10mM NaCl,10mM EDTA,30μM DTTに内部に入れられる。
Ｃ） 抗体の消化：抗体100mg毎に1mgの活性化パパインを加え、その溶液を大過剰の20mM NaPO4,pH＝7.0,150mM NaCl,10mM EDTA,30μM DTTで、継続的にヘリウム・スパージングを行いながら透析を行う。透析は、消化の過程での還元剤のモル過剰を維持するために行われる。
Ｄ） 室温で２−４時間放置した後、ヨードアセトアミドを加えて消化を終わらせる。
Ｅ） 標準的なクロマトグラフィー法を用いて、未消化あるいは部分的に消化された抗体からFabフラグメントを分離する。
ここで用いられている「Fab」あるいはいずれかの他の抗体フラグメントという用語は、本発明の場合、「抗体」あるいは「免疫グロブリン」におけるとの同様の分類を持っている。したがって、「哺乳類」Fab蛋白質、「キメラ性Fab」などは、一般の使用法における対応する定義と同じような意味で、さらに以下の諸項において規定されているような意味で用いられている。
ここで用いられている「キメラ性抗体」または「キメラ性ペプチド」とは、ペプチドの一部が最初の遺伝子ソースから誘導される抗体あるいはペプチド内の対応する配列から誘導される、その配列とあるいは構造的に一致しているアミノ酸配列を有しており、その鎖の残りの部分が他の遺伝子ソースと構造的に一致している抗体あるいは抗体ペプチドのことを指している。例えば、キメラ性重鎖抗体ペプチドはネズミの可変領域とヒトの不変領域とによって構成することができる。これら２つの遺伝子ソースは通常２つの別個の種であるが、場合によっては、ひとつの種である場合もある。
キメラ性抗体あるいはペプチドは通常は、分子および／または細胞組み替え技術を用いてつくられる。多くの例で、キメラ性抗体はひとつの哺乳動物種から得られた抗体の可変領域と同様の挙動を示す軽鎖および重鎖両方の可変領域を有しており、不変および／またはフレームワーク部分は第二の、異なった哺乳動物種から得られる抗体内の配列と構造が同じである。
しかしながら、ここで使われているキメラ性抗体の定義は上の例に限定されるものではない。キメラ性抗体とは、その軽鎖および重鎖のいずれか一方、または両方が、抗体のソースが異なったクラスのものであるか、異なった抗体反応を示すか、あるいは別の起源の種であるかどうかには関係なく、さらに、融点が可変境界と不変境界のいずれにあるかには関係なく、種々のソースからの抗体内の配列を模倣する配列の組み合わせで構成されている。例えば、キメラ性抗体はそのフレームワークおよびCDRが異なったソースからのものである抗体を含む場合がある。例えば、非ヒトCDRが「ヒト化抗体」をつくるために、ヒトの不変領域に結合されたヒトのフレームワーク領域に一体化される。例えば、PCT出願公開No.WO 87/02671、米国特許第4,816,597、ヨーロッパ特許出願0173494、Jones,et al.,Nature,321:522−525（1986）、およびVerhoeyen,et al.,Science,239:1534−1536（1988）参照。これらはすべて引用により本文に組み入れている。
ここで使われている「ヒト様フレームワーク領域」という用語は各抗体鎖のフレームワーク領域を意味しており、通常、少なくとも、約70個のアミノ酸残基、典型的には75−85個、あるいはそれ以上の残基で構成されている。ヒト様フレームワーク領域のアミノ酸残基は少なくとも約80％、好ましくは約80−85％であり、より好ましくは、ヒト免疫グロブリン内のものと、85％以上、構造などが同じである。この他の内発的抗体との共通した特徴は、副次的な免疫反応、例えば、「自己」マーカーに対する反応を減少させるメカニズムだけを導入する標的部分を発生させるので有益である。
ここで使われている「ヒト化」あるいは「ヒト様免疫グロブリン」という用語は、ヒト様フレームワーク領域とヒト免疫グロブリン不変領域と構造などが基本的に一致している、例えば、少なくとも約80％以上、好ましくは約85−90％以上、そして最も好ましくは約95％あるいはそれ以上の同一性を有している不変領域で構成されている免疫グロブリンを指している。したがって、おそらくCDRを除いて、ヒト様免疫グロブリンのほとんどの部分は、ひとつ、あるいはそれ以上の自然なヒト免疫グロブリン配列の対応部分と基本的には構造などが同一である。
ここで使われている「ハイブリッド抗体」という用語は、各鎖が哺乳動物抗体鎖に関して個別的には同様であるが、組み合わせ自体は新しい集合を示しており、したがって、２つの異なった抗原がその抗体によって認識されるような抗体を指している。ハイブリッド抗体においては、重鎖と軽鎖によるひとつの対は、例えばエピトープなど、ひとつの抗原識別特性に対して発生する抗体内に見いだされるものと同様であるが、他の重鎖と軽鎖の対は別のエピトープに対して発生する抗体内に見いだされる対と同様である。これによって多機能性結合価、例えば、少なくとも２つの異なったエピトープと同時に結合する能力をもたらしてくれる。こうしたハイブリッドは、もちろん、キメラ性鎖を用いても形成することができる。
ここで使われている「モノクローナル抗体」という用語は個別抗原決定因子を認識する抗体構成を意味している。それは、抗体の供給源や、そのつくられ方を限定することは意図していない。
先行技術で用いられている標準的な方法を用いて、ｃ−erbB−２に特有なモノクローナル抗体をつくりだすハイブリドーマから異なった領域およびCDRを誘導することができる。最終的に望ましいキメラ性抗体を表現することができる、本発明による核酸配列は、多様なヌクレオチド配列（遺伝子性またはcDNA、合成オリゴヌクレオチドなど）および構成因子（V,J,DおよびＣ領域など）を用い、そして種々の技術を使って形成することができる。適当な遺伝子性配列を結合させるのは、今日では一般的な生産方法であるが、cDNA配列も用いることができる（ヨーロッパ特許公報No.0239400およびeichmann,L.,et al.,Nature,332:323−327（1988）参照。両方とも引用により本文に組み入れる）。
ヒトの不変領域DNA配列は好ましくは、不死化Ｂ−細胞から分離される（例えば、引用により本文に組み入れているHeiter,etal.Cell,22:197−207（1980）参照）るが、他の種々のソースから分離あるいは合成することも可能である。ヒト免疫グロブリンＣγ１遺伝子はEllison,et al.,Nucl.Acid.Res.,10:4071（1982）;Beidler,et al.,J.Immunol.,141:4053（1988）;Liu,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:3439（1987）（すべて引用により本文に組み入れる）に述べられている。
本発明による免疫グロブリンをつくりだすためのCDRは好ましくは望ましい抗原、ｃ−erbB−２蛋白質に結合することができるモノクローナル抗体から誘導され、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、あるいは他の公知の方法で抗体をつくりだすことができる脊椎動物ホスト細胞などを含むいずれか適切な哺乳動物ソース内でつくられる。DNA配列のための適切なソース細胞および免疫グロブリン表現および分泌のためのホスト細胞は、アメリカ・タイプ培養コレクション（“ATCC"）（“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas"第５版（1985）Rockville,Maryland,U.S.A.,引用により本文に組み入れる）など、いろいろな供給源から入手することができる。
ここで具体的に述べられているキメラ性抗体ペプチドに加えて、他の「実質的には同様」修飾免疫グロブリンは、当業者に公知のDNA組み替え技術を用いて設計、製造することができる。これらの遺伝子の修飾は部位指向変異誘発（site−directet mutagenesis）（GillmanおよびSmith,Gene,8:81−97（1979）およびRoberts,S.,et al.,Nature,328:731−734（1987）参照、いずれも引用により本文に組み入れる）など、種々の公知の手法によって容易に行うことができる。これらの修飾にはアミノ酸の追加、消去、置換、好ましくは、適切な性質や生物学的活性を保持しつつ、ポリペプチドの配列における保存的、あるいはその他の変化を含む。別の方法として、一次抗体構造の一部だけを含み、結合および／またはエフェクター活性を有するむポリペプチド・フラグメントもつくることができる。また、多くの遺伝子と同様、免疫グロブリン関連遺伝子は、それぞれひとつまたは複数の別個の生物学的活性を有する個別の機能性領域を含んでいるので、これらの遺伝子を他の遺伝子からの機能性領域に溶融させて、新しい性質または新しい性質の組み合わせを有する蛋白質（免疫毒素など）をつくりだすことができる。
クローンされた可変および不変領域とプラスミドから分離して、pSV2−neo、あるいはpRSV−gptなどの哺乳動物表現ベクターに結紮することによって、機能性転写単位を形成することができる。そして、これらの表現ベクターをホスト細胞にトランスフェクトすることができる。SP2/0またはP3X細胞などのマウス骨髄腫はそれらが内発性免疫グロブリン蛋白質を分泌せず、免疫グロブリン表現に用いられるすべての構成因子を持っているので、好ましいホストである。骨髄腫細胞は上に述べたような適切な手法を用いて、トランスフェクトすることができる。
他のタイプの、他のホスト細胞に固有のプロモーターおよびエンハンサーが先行技術において知られている。Kameyoma,K.,et al.,supra参照。例えば、キメラ性抗体アミノ酸配列をコード表現するDNA配列をイースト・プロモーターおよびエンハンサーに結合させて、先行技術で公知の方法を用いてイースト菌にトランスフェクトさせることができる。Kriegler,supra参照。
この同じ方式を、ひとつの哺乳動物種などのひとつのソース、および異なった哺乳動物種などの他のソースのフレームワーク領域から、ｃ−erbB−２固有CDRを分離するために適用することができる。次にCDRをフレームワーク領域および不変領域に結紮させて、キメラ性抗体を形成することが可能である。それぞれ引用により本文に組み入れる、PCT No.GB88/00731（1989）、および1991年12月12日出願のU.S.S.N.07/808,462参照。CDRは、例えば、ヒト・フレームワークおよび不変領域で構成される表現ベクターにクローンすることができる。
別の例は、マウスなど、ひとつの種の重鎖および／または軽鎖CDR1,CDR2およびCDR3と、ｃ−erbB−２に固有な抗体をコード表現するヒト重鎖のフレームワーク領域で構成される、組み替えDNA配列である。他の可能性としては、ｃ−erbB−２に固有なCDRを用いるか、ひとつの哺乳動物種からのCDR1およびCDR3を含む可変領域の一部を用い、次のこの配列を、第二の哺乳動物種の、第一の哺乳動物のCDR3に対するフレームワーク部分をコード表現している別の配列に結紮し、あるいは、第一の哺乳動物種から誘導され、第二の哺乳動物種のフレームワーク内に、第一の種から誘導された可変領域DNA配列と第二の種から誘導された不変領域とが分散されているｃ−erbB−２固有重鎖CDRをコード表現する組み替えDNA配列で、ホスト細胞株をトランスフェクトするなどの方法である。
抗体配列で構成されている組み替えDNA表現ベクターはホスト細胞へのエレクトロポレーション（elctroporation）によってトランスフェクトすることもできる。標準的な選択手順は、ｃ−erbB−２固有キメラ性抗体をつくりだすクローンを分離するために用いられている。
抗体は大腸菌などのバクテリアからの単鎖抗体など、適切な形態で表現することができる。すべて引用により本文に組み入れているPluckthun,Biotechnology,9:545（1991）;Huse,et al.,Science,246:1275（1989）；およびWard,et al.,Nature,341:544（1989）参照。
これら抗体ペプチド配列は、Taqポリメラーゼなどの、熱的に安定したDNAポリメラーゼ、およびポリメラーゼとオリゴヌクレオチドプライマーを用いて特定のDNA配列を増幅するための用いられる技術であるポリメラーゼ鎖反応またはPCRの使用することによって、クローニングのために増幅することも可能である。これらはすべて、引用により本文に組み入れているPCR Protocols,ed.Innis,et al.,Academic Press,Inc.（1990）に記載されている。また、引用により本文に組み入れているOrlandi,supraおよびLarrick,et al.,Biotechnology,7:934（1989）も参照。
（ここでは単にｃ−erbB−２とも記されている）ｃ−erbB−２蛋白質は、分子量185Kd（キロドルトン）で、タイロシンキナーゼ活性を有する糖蛋白質膜であり、表皮成長因子受容体（EGFR）に関連しているが、それとは別個のものである。EGFR蛋白質と同様、ｃ−erbB−２蛋白質は、２つのシステインを豊富に含む反復クラスター、トランスメンブレイン・ドメイン（transmembrane domain）と、細胞内キナーゼ領域を含む細胞外ドメインを有している。さらに、ｃ−erbB−２蛋白質のアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列と同様に、引用により本文に組み入れているCoussens、et al.,Science,203:1132（1985）によって述べられている。
ｃ−erbB−２蛋白質は1985に３つの異なった研究グループ:Semba,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6497（その遺伝子をｃ−erbB−２と命名）;Coussens,et al.,supra（その遺伝子をHER−２と命名）、そして、King,et al.,Science,229:1132（その遺伝子をｖ−erbB関連と命名）によって発表されたｃ−erbB−２腫瘍遺伝子によってコード表現される。したがって、ｃ−erbB−２遺伝子配列と、その対応する蛋白質配列は先行技術において公知であり、発表されている。ｃ−erbB−２蛋白質は明確な細胞内設計、トランスメンブレイン設計、および細胞外領域を有している。通常、本発明による標的部分は、腫瘍細胞の外部に露出される筈の細胞外領域に結合する。この標的部分は、通常、リガンド結合領域、あるいはエピトープなどの抗原認識分を含む、そこに見いだされるひとつ、あるいは複数の特徴を識別する。エピトープは通常、直線ペプチド配列決定子あるいは立体配座性決定子など、純粋なポリペプチド・エピトープを指して使われることが多いが、含水炭素成分を有するエピトープを指して使われる場合もある。これらエピトープは、したがって、結合蛋白質／含水炭素成分、あるいは含水炭素成分だけを含んでいる場合がある。この蛋白質に対する他の修飾は、正常なものであれ、異常なものであれ、重要なエピトープ性決定子を提供するであろう。
ｃ−erbB−２蛋白質の検出は、ここに述べられているような、ｃ−erbB−２蛋白質に固有の抗体を用いる公知の免疫アッセイを用いて行うことができる。こうした抗体は、例えば、カリフォルニア州テメキュラのChemicon International Inc.などから入手することができ、あるいは、標準的な免疫的手順によって作成することもできる。例えば、ここに引用により本文に組み入れているHarlowおよびLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,N.Y.（1988）参照。
ここでは、ｃ−erbB−２蛋白質の定義に、例えば、ヒトのｃ−erbB−２蛋白質に免疫学的に関連のある蛋白質など、他のホスト・システムから開発された蛋白質も含むことを意図している。例えば、関連するラットの遺伝子（neuと命名されている）は、Schecter,et al.,Science,229:976（1985）に報告されている。
抗体の作用を容易に発揮させることができる有益なエピトープには標的細胞の上に見いだされる細胞外エピトープが含まれる。これらのエピトープは、一般的には腫瘍細胞上に見いだされる蛋白質の直線、あるいは立体配座エピトープなど、蛋白質エピトープである。他の有用なエピトープとしては、含水炭素、および、ｃ−erbB−２蛋白質上に見いだされ、通常、ポスト−トランスレーショナル（post−translational）な修飾部位を含む非蛋白性成分を含む。過剰に表現されたｃ−erbB−２に対する結合特性を示す抗体および他の結合領域も、この蛋白質のフラグメントに対して発生する。
ｃ−erbB−２の細胞外部分に対して、マウスのモノクローナル抗体がつくられている。そうした抗体の一例はメリーランド州ロックビルのアメリカ・タイプ培養コレクション（American Type Culture Collection:ATCC）にNo.HB10646の番号で寄託されているTAb 250である。
また、ｃ−erbB−２表現細胞に対する親和性および特殊性を示す他のいずれかの標的方法からも標的部分を誘導することができる。例えば、ｃ−erbB−２蛋白質によって識別され、結合されるリガンドも有益な標的部分であろう。例えば、EGF受容体のためのリガンドとして機能するらしく、さらに、ｃ−erbB−２蛋白質に対する結合特性を有するように見える分子であるCRIPTOについて述べているCiccodicola,et al.（1989）Embo J.8:1987−1991;Ciardiello,et al.（1991）Cancer Research 51:1051−1054;およびCiardiello et al.（1991）P.N.A.S.USA 88:7792−7796参照。
なお、ここで述べられている配列には、置換、付加、および／または消去などの変異によるこれらの配列の変異体、あるいはいずれか他の、そこから誘導された、あるいは類似している配列に対する基本的に同様の結合活性を有する配列も含まれている。
本発明の場合、抗体あるいはペプチドが、例えば、競合的アッセイ、飽和アッセイ、またはELISAあるいはRIAなどの標準的な免疫アッセイなど、標準的な抗体−抗原、あるいは抗原−受容体アッセイなどで測定、または判定された場合に、ｃ−erbB−２と結合する、または結合することができる場合に、それらの抗体あるいは抗体はｃ−erbB−２に対して特殊性を有するものと判断される。特殊性に関するこの定義は、単一の重鎖および／または軽鎖、CDR、溶融蛋白質、または重鎖および／または軽鎖のフラグメントなどは、それらがｃ−erbB−２蛋白質と結合するか、あるいは、相補的な可変領域および不変領域を有する免疫グロブリン立体配座内に適切に組み込まれた場合、特にｃ−erbB−２蛋白質と結合することができる場合にも適用される。
競合アッセイの場合、抗体あるいはペプチド・フラグメントの抗原と結合する能力は、そのペプチドの、その抗原と結合することが知られている化合物の結合能力と競合する能力を探知することによって判定される。いろいろな種類の競合アッセイが知られており、ここでも検討の対象となっている。また、抑制因子が不在の場合にテスト化合物の結合力を測定するアッセイも用いることができる。例えば、ひとつの分子あるいは他の化合物のｃ−erbB−２蛋白質と結合する能力は、問題の分子を直接ラベルするか、あるいはラベルしない場合は、種々のサンドウィッチ・アッセイ形式を用いて間接的に検出することができる。競合結合アッセイなどのいろいろなタイプの結合アッセイが知られている（例えば、引用により本文に組み入れている米国特許第3,376,110、第4,016,043、HarlowおよびLane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,N.Y.（1988）、およびColigan,et al.（eds）,Current Protocol in Immunology,Wiley and Sons,N.Y参照）。競合アッセイを用いる以外のテスト化合物のひとつの成分との結合を測定するためのアッセイも用いることができる。例えば、ｃ−erbB−２蛋白質の存在を確認するために、免疫グロブリンを用いることもできる。ELISAなど、モノクローナル抗体アッセイのための標準的な手順を用いることもできる（HarlowおよびLane,supra参照）。ここに用いることができる種々の信号発生システムをさらに詳しく知るためには、ここに引用により本文に組み入れている、米国特許第4,391,904参照。
さらに、結合部分のｃ−erbB−２に対する結合特性は、その親和性によって判定することができる。その部分の解離定数（KD＝1/K、ここでＫは親和定数）は、１μＭ以下、好ましくは100nM以下、そして最も好ましくは1nM以下である。抗体分子は通常はその下方範囲でKDを有している。KD＝［Ｒ−Ｌ］／［Ｒ］［Ｌ］で、ここで［Ｒ］，［Ｌ］および［Ｒ−Ｌ］はそれぞれ均衡時の受容体またはｃ−erbB−２［Ｒ］、リガンド、抗体またはペプチド（Ｌ）、および受容体−リガンド複合体（Ｒ−Ｌ）の濃度である。通常、リガンドあるいはペプチドと、受容体または抗原との間の結合作用は静電引力、ファンデルワールス力、そして水素結合など、可逆的な、非共有結合などを含む。
他のアッセイ形式としては、ダウン・モジュレーション（down modulation）、内部化、あるいはフォスフォリル化傾向の増大など、ここに引用により本文に組み入れている1991年１月18日に出願された米国特許出願第07/644,361に述べられているような相互作用がもたらす種々に生理学的、あるいは化学的変化の存在、あるいは不存在の検出などが含まれる。Receptor−Effector Coupling−A Practical Approach,ed.Hulme,IRL Press,Oxford（1990）参照。
ｃ−erbB−２蛋白質に特有の好ましいペプチドは、ｃ−erbB−２蛋白質を表現している腫瘍細胞と接触する状態で置かれると、ｃ−erbB−２蛋白質のフォスフォリル化傾向の増大を誘発する。「ｃ−erbB−２蛋白質のフォスフォリル化傾向の増大を誘発する」分子とは、その分子が不在の時に起きるもの以上の、蛋白質へのフォスフェートへの組み込みにおける検出可能な増大を引き起こす分子のことを意味している。通常、こうした検出可能な増大とは、コントロールと対比して２倍以上のフォスフォリル化の増大、好ましくは３倍以上の増大のことである。フォスフォリル化は受容体のフォスフォリル化を検出するために従来の技術で知られている方法で測定することができる。例えば、ここで引用により本文に組み入れている、Cooper,et al.,Methods in Enzymology,99:387−402（1983）;AntoniadesおよびPantazis,Methods in Enzymology,147:36−40（1987）；およびLesniak,et al.,Methods in Enzymology,150:717−723（1987）参照。
通常、フォスフォリル化は完全な細胞のイン・ビボでのフォスフォリオル化（Lesniak,supra）、あるいはイン・ビトロでの自動フォスフォリル化反応によって測定することができる。例えば、イン・ビボでのフォスフォリル化の測定のためには、ｃ−erbB−２蛋白質を持つ細胞が放射性物質でラベルされたフォスフェートに接触する状態で配置されるアッセイを実施することができる。イン・ビボでのアッセイにおけるｃ−erbB−２蛋白質受容体のフォスフォリル化を検出するためには、ラベルされたフォスフェートと共に12時間から18時間程度テスト細胞を培養するのが有利である。これらの細胞は２つ、あるいはそれ以上のバッチに分けられ、一部は受容体のフォルフォリル化を増大すると予想される分子に露出され、一部はコントロールとして分離される。それら画分はその後免疫沈降され、受容体が、例えばSDSポリアクリルアミドゲルまたはオートラジオグラフィーによって識別され、フォスフォリル化における増大は、コントロール画分と比較して、テスト分子に露出された画分のバックグランドにおいて２倍以上の増大があった場合に、統計的に有意であるとみなされる。
イン・ビトロでの自動フォスフォリル化を測定するためには、細胞、または細胞抽出物をｃ−erbB−２に特殊な作用を発揮するペプチドの存在、あるいは不存在下で培養することができる。抗ｃ−erbB−２抗体による免疫沈降に続いて、この免疫複合体をγ32P−ATPによって培養し、SDS−PAGEオートラジオグラフィーによって分析する。
ｃ−erbB−２蛋白質に固有に作用を発揮するもうひとつの好ましいペプチドは、ｃ−erbB−２のダウン・モジュレーションを引き起こすものである。「ｃ−erbB−２蛋白質に対するダウン・モジュレーション」は、腫瘍細胞上でのｃ−erbB−２受容体の検出可能な減少によって判定される。こうしたダウン・モジュレーションは、その腫瘍細胞上でｃ−erbB−２受容体蛋白質に結合する、あるいはそれを識別する抗体、または他の固有結合性を有する部分の能力の低下によって検出される。例えば、ダウン・モジュレーションは、ｃ−erbB−２蛋白質受容体を保有している腫瘍細胞を特定のペプチドで培養し、その細胞を洗浄し、次に、それらの細胞をラベルされた（好ましくは放射性物質でラベルされた）ｃ−erbB−２蛋白質に固有の作用を発揮する抗体に接触させることによって判定することができる。ラベルされた抗ｃ−erbB−２抗体のｃ−erbB−２蛋白質に固有な作用を発揮するペプチドに露出された細胞への結合の程度は、抗体のコントロール細胞（つまり、ｃ−erbB−２固有ペプチドに露出されなかったペプチド）への結合の程度と比較される。好ましくは、これらのアッセイの場合、これらの細胞は洗浄後、ラベルされた抗ｃ−erbB−２交代に直接摂取される。
観察されるダウン・モジュレーションは、通常、用量に依存し、つまり、ダウン・モジュレーションの程度は、ｃ−erbB−２蛋白質に露出されたｃ−erbB−２蛋白質に固有なペプチドの量の増大に伴って増大する。処理された細胞の抗ｃ−erbB−２抗体に対する結合の程度が、コントロール細胞の場合と比較して90％以上の減少を引き起こすペプチドが好ましい。
ｃ−erbB−２蛋白質に対して特有の作用を発揮するもうひとつの好ましいペプチドは、ｃ−erbB−２蛋白質を表現する腫瘍細胞と結合し、そうした腫瘍細胞と接触する状態で置かれると内部化されるものである。「内部化」は、細胞の細胞質においてペプチドが封鎖された場合に起きる。一度内部化されると、受容体および／またはペプチドが細胞リゾソーム内で劣化するか、あるいは細胞表面に循環される。リガンド−受容体複合体の内部化を判定するための方法も、ここに引ようにより本文に組み入れている、Haigler,et al.,J.Biol.Chem.,255:1239−1241（1980）に述べられている。
細胞成長調節因子とは、それが標的とする細胞の成長に影響を及ぼす分子のことである。通常、この調節因子は標的の細胞内に内部化されねばならないが、この機能は通常、標的部分から発生する内部化によってもたらされる。
調節は、通常、代謝または成長速度の減少、好ましくは、細胞毒性影響の減少として行われるが、代謝や成長速度の大幅な増大も有益である。代謝または成長速度の大幅な増大が起きた時は、そうした傾向を示す細胞だけを殺す短期毒性も組み合わせで用いることができる。
代謝や成長速度を低下させる調節因子の場合、その調節因子が高い活性を有しているなど、強力である方が望ましい。この毒素は無機または単純な有機分子を含んでいるが、通常、生物の分子の方がより強力である。ウィルス性または菌毒素も存在しているが、特定のバクテリア性または植物性毒素は知られているものの中では最も高い活性を持っている。成長抑制は、核酸合成、蛋白質合成、および細胞代謝など、一般的なものであれ、特殊なものであれ、多数の基本的な細胞機能を阻止することによって起こすことができる。例えば、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素は真核細胞における蛋白質合成を非可逆的に抑制することによってその作用を発揮する。両方の例とも、蛋白質合成において基本的な役割を果す伸長因子２を酵素的に非活性化する。他の伸長因子も他の毒素の標的とされる場合がある。対照的に、リシンはリボゾームに直接作用し、285rRNAに作用する植物毒素である。
好ましくは、成長調節因子は高い代謝回転数を持つ酵素活性を有しており、したがって、非常に少数の分子が内部化されるだけでも、標的の細胞を殺すことができる。引用により本文に組み入れている、Pastain,et al.,Science 254:1173−1177参照。
ゲロニンはゲロニウム・マルチフォーラムの種子から精製された糖蛋白（分子量：約29−30,000Kd）であり、強力なリボゾーム非活性化植物毒素のタイプに属する。このタイプに属する他のものとしては、アブリン、リシン、およびモデシンの鎖などを含んでいる群のものである。ゲロリンは、アブリンおよびリシンと同様、哺乳動物リボソームの60Sサブユニットを破壊することによって蛋白質合成を抑制する。ゲロニンは化学的および物理的処理に対しては安定的である。さらに、ゲロニン自体は細胞には結合せず、単独で投与された場合、通常は非毒性（濃度が高い場合を除いて）であり。実験室で取り扱う場合は安全である。リボソームの非活性化は非可逆的であり、補助因子が関与するようには思われず、効率的に行われるので、これはゲロニンが酵素的に作用することを示唆している。
ゲロニンおよびリシンは蛋白質合成を抑制し、蛋白質の重量ベースでは最も活性の高い毒素である。ゲロニンは蛋白質合成の抑止においては、リシンＡ鎖と比較して、10−1000倍も活性が高い。リシンおよびアブリンなどのペプチドは、毒性単位であるＡ鎖と、細胞に結合することによって作用するＢ鎖との２つの鎖により構成されている。リシンおよびアブリンとは違って、ゲロニンは単鎖で構成されており、そして、細胞に結合するためのＢ鎖がないので、それ自体は比較的不活性で、普通の細胞に対しては、非毒性である。結合あるいは標的部分に接合されない場合、細胞に対する影響がずっと低いというこの特徴は、本発明のいろいろな実施例における重要な特徴である。この状況に応じて異なって現れる毒性はｃ−erbB−２を表現する細胞に対する高い選択性を実現する上には極めて重要である。
哺乳動物細胞は天然のゲロニン分子に結合する、および／またはそれを内部化する能力を明らかに欠いている。ある種の腫瘍細胞上に存在する腫瘍関連抗原に向けられたモノクローナル抗体TAb 250など、腫瘍標的試薬とゲロニンの接合体はゲロニンをその細胞に結合させるための方法と、ゲロニン−抗体複合体の内部化のためのルートの両方を提供する。
免疫毒素の細胞毒性部分は細胞毒性薬あるいはバクテリア性または植物性由来の酵素活性毒素、あるいはそうした毒素の酵素活性フラグメント（「Ａ鎖」）であってもよい。酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントが好ましく、ゲロニン、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非活性フラグメント、（シュードモナス・アルギノーサからの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ、アブリンＡ鎖、メドクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アラウライト ホーディイ（Aleurites fordii）蛋白質、ダイアンシン蛋白質、ヒトイアカ アメリカナ（Phytoiacca americana）蛋白質（PAP I,PAP IIおよびPAP−Ｓ）、モルモディカチャランティアインヒビター、カルシン（curcin）、クロチン、サポナリアオフィシナリス・インヒビター（saponaria officinalis inhibitor）、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノミシン、およびエノミシンなどがその具体例である。活性毒素はいろいろなメカニズムを通じてその作用を発揮し、そのそれぞれは細胞生理および成長に影響を及ぼす。これらの毒素は代謝インヒビターまたは毒素、核酸合成インヒビター、蛋白質合成インヒビター、あるいは異常または悪性機能の他の仲介者などとして機能する。もっとも好ましいのは、ゲロニンとの接合体である。
活性フラグメントおよい誘導体にはゲロニンの全長構造と同じ核構造を有しているが主要配列全体を欠いている化合物を含んでいる。これらのフラグメントまたは誘導体は、ゲロニンと同じ、あるいはそれより改善された生物学的、あるいは細胞毒性活性を有している。ゲロニン・フラグメントまたは誘導体はウサギ網状赤血球細胞溶解物アッセイを用いて、当業者によって、簡単に判定することができる。
TAb 250抗体に結合され、本発明において用いることができる生物学的応答修飾子としては、IL−1,IL−２、インターフェロン（α、β、またはγ）、TNF,LT,TGF−βおよびIL−６などのリンフォカインおよびサイトカインなどである。これら生物学的応答修飾子は腫瘍細胞に対していろいろな影響を及ぼす。こうした影響の中には、直接の作用によって殺される腫瘍細胞の増大、および、ホスト細胞防衛仲介プロセスの増大によって殺される腫瘍細胞の増大などがある。抗体TAb 250とこれら生物学的応答修飾子との接合体は選択的局在化、またはｃ−erbB−２を過剰表現する腫瘍または細胞への移行を可能にし、したがって、改良された抗増殖効果をもたらす。非標的細胞の毒性につながる不特定効果は、選択された細胞成長伝達因子が標的成分がないときは効果を発揮しないので、最小限に押さえられる。
本発明において有益な細胞毒性薬（およびその誘導体）には、アドリアマイシン、シス−プラチナ複合体、ブレオマイシン、およびメソトレキセートなどがある。これらの細胞毒性薬は再発性腫瘍の治療的管理のためには有益であるが、副作用が激しく、非標的細胞の受ける損傷も激しいので、その使用法は非常に難しい。TAb 250抗体は、腫瘍への伝達と、腫瘍細胞自体への侵入をしやすくるための両方の効率的な手段を提供してくれ、こうした薬剤の有益なキャリアとしての役割を果すことができる。さらに、特定の抗体による細胞毒性薬の腫瘍への伝達は肝臓や骨髄などｃ−erbB−２を過剰表現しない鋭敏な場所を、化学治療剤の悪性の作用から保護してくれる。伝達システムとしてのTAb 250に接合された薬剤の使用は、すべての薬剤部分が腫瘍細胞に集中する抗体に接合されており、通常、そこに内部化されるので、薬剤自体の用量を減らすことができる。
標的部分および細胞成長調節因子は、種々の高蛋白質結合剤を用いて接合することができる。こうした薬剤の例としては、Ｎ−サクシミジル３−（２−ピリジルジチオ）（プロピオネート）（SPDP）、２−IT,4−サクシミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエン（SMPT）、ジメチルアジピミデートなどイミドエステルの二機能性誘導体、HCl、ジサクシミジルスベレートなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、ビス（ｐ−ジアドベンゾイル）ヘキサンジアミドなどのビスホアジド化合物、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミドなどのビスホジアゾニウム誘導体、トルエン2,6−ジイソチアネート、および1,5−ジフロオロ−2,4−ジニトロベンゼンなどのビス−活性ふっ素化合物などである。
これらの研究で使用するに先立って、SP2/0−Agl4細胞は、まず、0.1μg/mlの天然ゲロニンの存在下で成長される。数か月間のうちに、ゲロニンの濃度は、細胞が10mg/mlのレベルで維持できるようになるまで、徐々に増やされていく。次に、10mg/mlの存在下での限定希釈によってそれらの細胞のクローニングが行われ、その結果できるゲロニンに抵抗性を有するクローンが拡大される。次に、２つの継代（passage）のために、ゲロニンが培養媒体からゲロニンが取り除かれ、その後、その細胞が再びゲロニンに露出されて、安定的に抵抗性のあるクローンの成長が確認される。キメラ性TAb 250の生産およびその活性を確認するためのテストを実施した後、抗体をつくりだすゲロニンに抵抗性のあるSP2/0細胞が成長され、TAb 250抗体に関するcDNAが制限エンドヌクレアーゼによる培養によってトータルDNAから取り除かれる。それと平行して、最適化されたゲロニンを表現するJM105大腸菌からのcDNAが取り出され、精製され、そしてHind IIIおよびEcoR Iによる消化を行った後にそのDNAをコード表現するゲロニンが取り出される。このゲロニン遺伝子は重鎖フラグメントに結紮され、この挿入物がゲロニンに抵抗性を有するSP2/0細胞に入れられる。この細胞は、次に、限定希釈によってサブクローンされ、それらのクローンはキメラ性抗体生産およびそのゲロニン成分のためにスクリーニングされる。最後に、ポジティブ・クローンが拡大されて、組み替え溶融蛋白質がイン・ビトロ細胞毒性アッセイおよびイン・ビボ繊維分散、薬理力学的、治療的、および毒性に関する実験の両方において使用、テストされる。TAb 250−ゲロニン溶融蛋白質の性質を前に述べたTAb 250ゲロニン構造の特性とを比較して、それぞれの長所と欠陥の判定が行われる。こうした研究の結果に基づいて、キメラ性TAb 250ゲロニン溶融蛋白質のフェーズＩ臨床調査を、進行した乳癌を持つ患者の体内で行うことができる。腫瘍細胞、例えば、ｃ−erbB−２腫瘍遺伝子が望ましくないレベルで表現されている腫瘍を持っていると診断された個人に対して、本発明による免疫毒素を投与すると、細胞毒性薬を、それらの細胞を殺すのに必要な場所にその細胞毒性薬に移行させ、集中させることが可能になる。このように、細胞毒性薬を標的に移行させ、他の器官、組織、および細胞に対する不特定な毒性が除去、最小限化、あるいは少なくとも減少される。
イン・ビボで治療のために用いられる場合、本発明による免疫毒素は、治療的に効果のある量、つまり腫瘍による負担を除去するかあるいは減少する量で、患者あるいは動物に投与される。それらは通常、経皮的に、好ましくは静脈注射によって投与されるが、他の投与ルートも最適であれば用いられる。これらの用量および用量に関する処方は癌の性質（一次性か、転移したものか）、およびその密度、その治療指数などの特定の免疫毒性の特性、患者、および患者の病歴やその他の要素に依存する。投与される免疫毒性の量は通常、0.1から10mg/kg程度の範囲である。こうした調整は、措置の否定的な影響に対するバランスを考慮に入れつつ、最適な有効性が得られるまで続けられる。引用により本文に組み入れているRemington′s Pharmaceutical Science,17th Ed.（1990）Mark Publishing Co.,Easton,Penn.;およびGoodmandおよびGilman′s:The Pharmacological Basis of Therapeutics 8th Ed（1990）Pergamon Press参照。
経皮投与を行うためには、免疫毒素は最も一般的には、薬学的に受け入れ可能な経皮投与ベヒクルとの組み合わせによる、ユニット投与による注射可能な形態（溶液、懸濁液、およびエマルジョン）の形で処方される。そうしたベヒクルは非毒性で、治療上の効果をもたないものであることが好ましい。そうしたベヒクルの実例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース液、および５％ヒト血清アルブミンなどがある。固定オイルおよびエチルオレエートなどの非水性ベクトルも用いることが可能である。キャリアとしてリボソームの使用も可能である。これらのベヒクルは、緩衝剤や保存剤など、等張性および化学的安定性を強化する物質などの添加物を多少含んでいてもよい。免疫毒素は通常、そうしたベクトル内で0.1mg/ml−10mg ml程度の濃度で調製される。
本発明による免疫毒素はイン・ビトロの方法でも用いることができる。例えば、そうした方法を骨髄の腫瘍細胞を殺すのに用いることができる。この方法では、まず、骨髄を腫瘍性疾患を有する固体から取り出す。次に、その骨髄を細胞毒性的に有効な量の本発明による免疫毒素で処理して、残留腫瘍細胞を取り除く。処理された骨髄は、すべての内発性同種毒性細胞を取り除くための集中的な化学療法および／または放射線治療を受けた後、免疫システムを再確立するために患者に再投与される。
本発明による免疫毒素は、腫瘍を持った哺乳動物の生き残り時間を延長したり、哺乳動物が体内に持っている癌細胞によって構成される腫瘍の成長速度を遅らせるために用いることもできる。例えば、皮下あるいは腹膜内で成長しているヒトの腫瘍の異種移植を受けたヌード・マウスをいろいろな用量の免疫毒素、抗体のみ、毒素のみ、あるいは25−100mg/kgの範囲の食塩水で処理する。腫瘍成長抑止は皮下腫瘍の物理的な大きさの変化や、SKOV−３細胞などの腹膜内腫瘍をもったマウスの生き残り期間の延長を手がかりに測定することができる。そうした研究は、霊長類を含む他の哺乳動物に適用できる方法論の確立に役立つであろう。
以下の実例は、本発明による免疫毒素の調製、特徴付け、および使用法に関する詳細な説明である。これらの例はいずれの意味においても、本発明を限定することは意図していない。
実施例１
ゲロニンの精製
ゲロニンを分離するための手順はStirpe,et al.,I,Biol.Chem.,255,6947−53（1980）に述べられている。ゲルマニウム マルチフォーラム（Gelonium multiflorum）の種子の外皮をとり、その実をホモジナイザーで、5mMリン酸ナトリウム（pH7.4）を含む0.14M NaCl 8容積分と共に砕く。この均一化されたものを一昼夜４℃の温度で継続的に撹拌しながら放置し、氷上で冷やして、０℃の温度で、20分間、35,000回遠心分離にかける。上済液を取り除いて、5mMリン酸ナトリウム（pH6.5）で透析してから、pm10フィルターを用いて遠心分離する。サンプルを5mMリン酸ナトリウム（pH6.5）で均衡化させたCM−52イオン交換カラム（20×1.5cm）上で層状に置く。このイオン交換樹脂に結合した物質を400mlの０−0.3M線形勾配を持つNaClで、４℃の温度下、１時間あたり25mlの割合で溶出させた。5ml画分が集められた。各画分を電子顕微鏡で観察した。ゲロニンは画分55−70で溶出し、最後の主要溶出ピークであった。画分55−70が集められ、二重に蒸留された水で透析され、凍結乾燥の方法で濃縮された。各製剤の純度および分子量を、TSK3000ゲル浸透カラムを用い、50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4および15％ナトリウム・ドデシルスルフェート−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（SDS−ページ）によって、高圧液体クロマトグラフィーで検査した。ゲロニンは単一の帯として移動し、その分子量は29,000−30,000ドルトンと推定された。
実施例２
ゲロニン活性のアッセイ
ゲロニンの活性は無細胞蛋白質合成抑止アッセイによって観察された。この無細胞蛋白質合成抑止アッセイは、50μｌウサギ細胞質溶解物に以下の成分（0.5mlの0.2Mトリス−HCl（pH7.8）、8.9mlのエチレン・グリコール、および0.25mlの1M HCl）を追加し、追加する度によくかき回した。
0.375M KCl,10mM Mg（CH3CO2）２、15mMグリコース、0.25−10mMアミノ酸（ロイシンを除く）、5mM ATP,1mM GTP,50mMトリス−HCl（pH7.6）、10μｌクレアチニンフォスフェート−クレアチニンフォスフォキナーゼ、12μl 3Hロイシン（Amersham,74mCi/mmol）で構成される塩−アミノ酸エネルギー混合体（SAEM）に、いろいろの濃度のゲロニン混合物を含む液体1.5μｌを加える。この混合物を30℃の温度で60分間培養した。3H−ロイシンのとり込みが、グラスファイバーフィルター上に合成された蛋白質を沈殿させ、10％TCAおよびアセトンで洗浄し、そして、アクアゾルシンチレーション液を用いるベータカウンターでその放射能を測定することによって観察した。これら抗体との接合には特殊な活性が４×103U/mg以上のゲロニンを用いられた。ゲロニンの活性の単位は、無細胞アッセイにおいて［14C］ロイシンの蛋白質への取り込みを50％抑制するゲロニンの量を基準としている。
実施例３
TAb 250の２−IT修飾ゲロニンのゲロニン製剤との接合
リン酸緩衝食塩水をセントリトリップ10コンセントレータで10mg/ml程度に濃縮した。トリエタノールアミンヒドクロライド（TEA/HCl）,pH8.0、およびEDTAが加えられ、最終的な濃度が60mM TEA/HClおよび1mM EDTA,pH8.0に調整された。そして、この最終的な濃度の溶液1mMに２−イミノチオラン・ストック溶液（1mM EDTAを含む60mM TEA/HClに500mM）を加え、そのサンプルを窒素ガス流の存在下で、４℃の温度下で、撹拌しながら90分間培養した。過剰なイミノチオランは0.01M Na2HPO4,0.0018M KH2PO4,0.0034M KCl,0.001M EDTAおよび0.17M NaClを含むフォスフェート−EDTA緩衝液で予め均衡化したシェパディクスＧ−25（１×24cm）のカラム上でのゲルろ過によって除去した。蛋白質の含有率を調べるために画分を、バイド−ラッド（Bio−Rad）アッセイを用いてマイクロタイター板で分析した。空隙容積にゲロニンが溶出した。これらの画分を集めて、４℃の温度で保存した。
実施例４
モノクロナール抗体の調製
完全のフロイド・アジュバンド内で1:1の割合でエマルジョン化した２×106−１×107NIH3T3T細胞（Ｃ−erbB−２でトランスフェクトされたNIH373細胞）を皮下（i.p.）および腹膜（s.c）に投与して、BALB/cマウスを免疫化した。供試動物には２週間から４週間に一度づつ、追加刺激を与えた。ELISA（以下に説明）内でポジティブ・タイターが検出されたら、融合４日前に最終的な皮下または静脈注射を行った。脾臓細胞をRPMI1640,10％FBSおよび2mM L−グルタミン内で保存されていたP3−X63Ag8.653骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ上澄液のポジティブ反応性をELISA（下記参照）内でテストしたところ、４℃での未固定NIH3T3およびNIH3T3T細胞を用いた間接免疫蛍光法と、それに次いで行われたフローサイトメトリック分析によって、細胞外ドメイン反応性が検出された。このモノクローナル抗体TAb 250はどのソースからでも得ることができる。最も好ましくは、本発明で用いられる抗ｃ−erbB−２抗体はヒトの抗体か、マウスの抗体のいずれかである。
TAb 250をつくりだすハイブリドーマ細胞は2L継続潅流バイオリアクター内で成長される。バイオリアクターからの細胞上澄液をろ過して、蛋白質−Ｇトリオ・システム内を通過させ、その後で、イオン交換クロマトグラフィーを行う。その物質を、次ぎに濃縮し、無菌ろ過する。最終的な生成物に関するテストとしては、総DNA、蛋白質純度、pH、（IEF）、総蛋白質、内毒素、能力、同一性、および蛋白質−Ｇ抗原に関するテストが含まれる。
本発明は、なかんずく、ハイブリッド抗体、あるいはヒト化またはヒト状抗体を含むキメラ性抗体を用いる。好ましい実施例において、マウスTAb 250抗体のひとつの配列から、種々の配列が発生し、それらは基本的にはマウスTAb 250抗体の配列と同一である。BACh−250はそのようなキメラ性抗体である。
実施例５
ELISAアッセイ
無菌96−ウェル・プレートを無菌PBS内で1mg/mlの仔ウシ・コラーゲンで37℃の温度下で２時間前処理した。NIH3T3T細胞（ベクターで形質転換されたNIH353細胞）を80％の融合度まで成長させ、温パックのバーセン（Puck′s Versene）（PBS内で0.02％EDTA）で取り出し、洗浄し、37℃で一昼夜処理したウェル内に0.5−１×106細胞/mlの割合で入れた。プレートを静かに洗浄して、10％中性緩衝化フォルマリンで処理し、その後、１％仔ウシ血清アルブミンBSA/PBSでブロッキングした。次ぎにサンプル上澄液または抗体希釈液をプレートに加えて、37℃の温度で２時間培養し、その後、アルカリフォスフォターゼ接合ヤギ・抗マウスIgG Fc−固有二次抗体で、37℃の温度で１時間培養した。プレートをPBSで洗浄し、パラ−ニトロフェニルフォスフェートおよびジエタノールアミン基質を加えて、さらに室温で15分間培養し、そしてA405を測定した。ネガティブ・コントロール抗体に対する吸収度より0.2−1.0以上高い吸収度でトランスフェクトされた細胞と反応した上澄液または抗体がポジティブとみなされた。
実施例６
125 I−TAb 250の調製と取扱
メーカーの処方に基づいてヨード粒（Priece）を用いて、TAb 250を放射性ラベルした。基質なしのNa125I（400uCiのIMS.30,Amersham）を３ヨード粒の存在下で、100mM Na−フォスフェート緩衝液（200μl,pH7.4）中で、25ug TAb 250と反応させた。この操作によって、ヨード原子とIgG分子の比率は約1:1になった。この取り込みは時々かき回しながら、7.5分間、室温で進行させられた。反応混合物をビーズから取り除き、５分後に、体積をNa−フォスフェート緩衝液で0.5mlに調節し、特殊な活性（以下参照）を評価するために、２μｌを取り出した。残りは、0.1％BSAおよび0.02％アジドを含むPBSで均衡化したNAP−５カラム（Pharmacia）を用いたゲルろ過で脱塩した。放射性ラベル抗体を1mlのカラム緩衝液で溶出して、４℃の温度で、最大６週間保存したが、結合活性のロスは認められなかった。この脱塩された物質は、95％以上がTCA沈殿可能であったので、取り込まれない要素は基本的に含まれていなかった。
放射性物質でラベルした抗体の特殊な活性は、この脱塩ステップの前に、TCA沈殿によって評価された。こうして、２μｌの反応混合物をカラム緩衝液内で500倍に希釈して、２画分を等しい体積の氷冷20％TCAと混合した。氷上に25分放置した後、遠心分離（10分、3000×ｇ）で沈殿物を収集した。上澄液とペレットを別個にカウントし、取り込みはTCA−沈殿可能カウントのパーセントを基準として判定された。個別の沃素化で達成された取り込みの程度は27％から45％の範囲で、特殊活性の評価値は3.9−7.2uCi/ugであった。それぞれの結合実験の前に、結合バッファで均衡化したNAP−５カラムを用いたゲルろ過によって、適切な量の125I−TAb 250の脱塩を行った。この手順により、アジドと、通常、98％以上のTCA−沈殿可能な物質とが取り除かれた。
実施例７
細胞培養
ヒト乳房悪性腫瘍細胞株系統SKBR−3,MDA−MB−453およびMDA−MB−231、およびヒト卵巣悪性腫瘍細胞系統SKOV−３が用いられた。SKBR−3,MDA−Ｍ−231,MDA−MB−453が10％FBSおよび2mML −グルタミンを補足した最小限必要な培地中で維持された。MDA−MB−453細胞のための培養液は１％の不可欠ではないアミノ酸および１％ビタミンも含んでいた。SKOV−３細胞は10％FBSおよび2mM L−グルタミンを補足したIscove社の修正ダルベッコ培養液中で培養された。すべての培養株は５％または10％CO2の存在下で、37℃の温度で培養された。
実施例８
125 I−TAb 250の内部化
125I−TAb 250の内部化を、酸に感受性のある部分と、感受性のない部分における放射能の量を判定することによって判定した。細胞を取り出して、125I−TAb 250単独（6ng/mlから153ng/ml）、および過剰な、ラベルされていないTAb 250で氷冷結合緩衝液中に再懸濁され、不特定（non−specific）結合を判定した。放射性物質でラベルした抗体の細胞表面結合が均衡状態に達した後、細胞を200×ｇで４℃の温度で、５分間ペレット化し、非結合抗体を取り除くために、氷冷結合緩衝液によって、三度洗浄した。この細胞ペレットを氷冷結合培養液内で再懸濁させ、画分をとって、最初の125I−TAb 250表面結合の量を判定した。放射性物質でラベルした抗体の内部化を開始するために、これらの細胞を37℃に暖めた。15分間から150分間の間に、画分を取り出し、遠心分離（1400×g,5分間、４℃）で収集した。分離され、循環された抗体を含む上澄液が集められた。酸洗浄（100μl/チューブPBS、１％グルコース、pH1）で、ペレットの２度、再懸濁させた。表面結合抗体を含む上澄液を集め、カウントした。残りの細胞関連放射能を含んだチューブの先端を切り取って、カウントした。
図６は、モノクローナル抗体TAb 250がMDA−MB−231細胞に内部化されないことを示している（パネルＢ）。対照的に、SKBR−３細胞はTAb 250抗体を最も効率的に内部化（パネルＡ）し、その抗体のSKOV−３細胞およびMDA−MB−453内への取り込みは中間程度であることを示している（それぞれ、パネルＣおよびＤ）。
実施例９
SPDPによるモノクローナル抗体TAb 250の修飾
ジメチルフォルムアミド内のＮ−サクシミジル３−（２−ピリジルジチオ）（プロピネート）（SPDP）を3mg mlの細胞株溶液として、乾燥ジメチルフォルムアミド内で調製した。結晶性SPDPは加水分解を受けるので、化学的に反応性のあるクロスリンカーの実際の濃度は、二重ビーム分光計で260nmでの吸収度を分析することによって、分光法で判定したSPDP細胞株の濃度は、以上の式で計算した。
過剰の未反応SPDPを0.5mM EDTA（緩衝液Ａ）を含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0で予め均衡させたセファデックスＧ−25カラム（１×24cm）上で、ゲルろ過クロマトグラフィーでサンプルから除去した。その一部（0.5ml）を集めて、ブラッドフォード色素結合アッセイ（Bradford,Anal.Biochem.72:248−254（1976））を用いて、その蛋白質含有率を分析した。Bio−TEKマイクロプレート・オーロリーダーを用いて、96−ウェル・プレート内で吸収度（600nm）が観察された。空隙容積（フラクション14−20）で溶出された抗体およびそれらのフラクションを集めて、４℃で保存した。蛋白質はセントリコン（Centricon）−30マイクロコンセントレータで濃縮された。このセントリコンレテンテートをEDTA（0.5mM）を含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。この抗体は最終体積0.5−0.75mlに濃縮された。
実施例10
SPDP−修飾モノクローナル抗体TAb 250とイミノチオラ ン修飾ゲロニンの接合体
２−IT修飾ゲロニンおよびTAb 250の接合体
SMPTと結合したTAb 250ゲロニンが、２−IT−修飾ゲロニンをSMPT−修飾モノクローナル抗体TAb 250に結合させることによって分離した。簡単に言うと、SMPTでTAb 250を修飾するために、1.0mlのPBS内の10mgの抗体を2X硼酸塩緩衝液（0.05M硼酸ナトリウム1.7％塩化ナトリウム、pH9.0）で1:1に希釈して、その抗体溶液に、乾燥DMF中の4mM SMPT 25μｌをゆっくりと加える。この反応物をN2の存在下で攪拌しながら２時間室温で培養する。さらに、これら反応物をフォスフェート−EDTA緩衝液、pH7.5を含むセファデックスＧ−25カラムを通過させることによって、過剰なSMPTが取り除かれ、そして、抗体ポジティブフラクションをBio−Radアッセイによって評価する。これらのフラクションを集めて、N2の存在下、４℃の温度で保存する。N2の存在下、27度の温度で、96時間、攪拌しながら、２−ITとのクロス−リンクを行う。最終的な生成物を、実例９でSPDPに関して述べたのと同様の手順で精製する。
実例１で述べたのと同様に調製された精製ゲロニン（PBS内に2mg/ml）の１ミリグラムを、実例３で述べたのと同様の方法で、イミノチオレインで修飾した。実例９で述べたように修飾されたモノクローナル抗体TAb 250を等量の修飾ゲロニンと混合した。この割合は、抗体に対してのゲロニンの５倍モル過剰に相当するこの混合物のpHを0.05M TEA/HCl緩衝液pH8.0を加えて7.0に調整し、そしてその混合物を窒素の存在下、４℃の温度で、20時間培養した。遊離スルフヒドリル基の残留を防ぐために、ヨードアセトアミド（0.1M）を最終濃度に調整されたもの2mMに加えて、培養をさらに１時間、25℃程度の温度で継続された。この反応混合物を４℃の温度で保存し、ゲルろ過で精製を行った。
実施例11
ゲロニン−モノクローナル抗体の精製TAb 250複合体
非接合ゲロニンと低分子量精製物を、PBSで予めろ過したセファデックスＳ−300カラム（1.6×31cm）上でゲルろ過を行うことによって、実例10の反応混合物から取り出した。
実例10からの反応混合物を、セファデックスカラムに入れる前に、セントリコン30マイクロ濃縮器によって1ml程度に濃縮された。このカラムはPBSによって洗浄した。1mlフラクションを集め、その蛋白質含有率を調べるために、その50μｌをブラッドフォードアッセイで分析した。
0.1M NaClを含む10mMフォスフェート緩衝液、pH7.2で予め均衡化させたブルーセロファロースCL−6Bカラム（１×24cm）上での親和性クロマトグラフィーによって取り出した。Ｓ−300溶離液を入れた後に、非接合抗体を完全に溶離するために、このカラムを同じ緩衝液30mlで洗浄した。
カラムに結合したゲロニン−接合抗体を10mMフォスフェート緩衝液、pH7.2内で、0.2−2M直接塩勾配のNaClで溶離した。この抗体−ゲロニン複合体は0.7M NaClで溶離した。溶離されたフラクションの蛋白質含有率をブラッドフォード・アッセイで判定した。蛋白質含有フラクションを集めて、５−20％勾配非還元ポリアクリルアミド・ゲルでの電気泳動によって、その溶離物のパターンが確認された。フロースルーピーク（フラクション14−20）は遊離抗体のみを含んでいるが、高塩分で溶離されたフラクションは、非接合ゲロニンまたは抗体を含まないTAb 250−ゲロニン接合体のみを含んでいた。最終的な生成物は1,2および３ゲロニン分子を結合したTAb 250を含んでいた。平均ゲロニン含有率は抗体１分子あたり1.5分子であった。基本的には純粋なゲロニン−TAb 250複合体のゲロニン活性を評価するために、ウサギ網状赤血球イン・ビトロ・トランスレーション・システムを用いた。このアッセイでの活性の一単位は、特別の処理をしないコントロールと比較して、蛋白質合成を50％抑制するのに必要な蛋白質の量として定義された。このアッセイを用いて、天然ゲロニンとTAb 250ゲロニン接合体の両方の特殊活性が、それぞれ、２×108U/mgおよび8.2×105U/mgと判定された。基本的に純粋なゲロニン−TAb 250抗体は網状赤血球溶解物アッセイで活性である。最初のサンプルを1:1000で希釈すると、蛋白質合成の50％抑制、つまり、14C−ロイシンの蛋白質への取り込みの50％抑制が起きた。したがって、最初の調製物の活性は1000U/mlであった。
本発明による組成物は、TAb 250モノクローナル抗体と細胞毒性部分との溶融構造を含んでいた。本発明による免疫毒素は、例えば、以下の方法で調製された。ＨおよびＬ鎖両方のTAb 250のＶ領域のヌクレオチド配列は簡単に判定することができる。例えば、カンジニウム（quandinium）・チオシアネートでTAb 250生産細胞から総RNAを抽出する。ポリＡ＋RNAはオリゴ（GT）セルロースクロマトグラフィーによって分離することができる。適切な遺伝子は、可逆転写およびPCR法などの標準的な技術で分離することができる。cDNAストランドはオリゴ−dTプライマーおよび可逆トランスクリプターゼを用いて合成することができる。こうしたcDNAストランドは、適切なプライマーによる標準的なPCR法によって増幅することができる。このメッセージのポリ−Ａテイル近くのプライマーは、ポリ−Ａ配列に基づく場合と、マウス免疫グロブリン内に見いだされる共通のアジュバンド配列のいずれかに基づいている。ウィスコンシン大学、バイオテクノロジー・センター、遺伝学コンピュータ・グループのDevereauxおよびそれに関連した配列データベース参照。遺伝子の他端のプライマーは、マウス免疫グロブリンに見いだされる共通配列から選択することもできる。Orlandi et al.（1989）PNAS 86:3833−3837およびLarrick et al.（1989）Bio/Technology 7:934−938参照。TAb 250重鎖遺伝子はATATAG CAGGAC CATATGの５′アップストリーム配列を有し、ATGAA CTTGG GGCTCからコーディングが開始される。また、TAb 250軽鎖遺伝子は５′アップストリーム配列TTTAC TTCCT TATTTを有し、ATGGG CATCA AGATGでコーディングが開始される。PCK技術によってこれら遺伝子を増幅するために、これらプライマーを用いることができ、プラズミド表現ベクターにクローンすることができる。
エレクトロポレーションによるDNAのマウス細胞へのト ランスフェクション
これらの遺伝子に対しては、標準的なトランスフェクション法を用いることができる。例えば、DNAはエレクトロポレーションによって、マウスハイブリドーマSp2/0−AG14内に導入することができる。１−２×103急速に成長するSP2/0−AG14細胞を洗浄して、1.0mlの無菌PBS内に再懸濁させる。この細胞懸濁液にキメラ性IgKおよびIgG1プラスミドを各30ミクログラムを加える。このDNA/細胞を予め冷却したショッキング クベットに移し、氷上で少なくとも５分間培養し、そして0.5kv/cm電子パルスを10msecだけ与えた（トランスフェクタ−300,BTX）。ショックを与えた後、このDNA/細胞混合体を10分間氷に戻し、５％NCTC−109および10％FCSを含んでいるDMEN 10ml内で希釈し、そして、室温で10分間培養した。最後に、これらの細胞を７％CO2を含む37℃培養器に移して48時間培養し、その後、１μg/mgキサンチンを含む選択的培地に移した。細胞は３×104細胞／ウェルの密度で、96−ウェル・プレートに入れ、TAb 250抗原ポジティブ標的細胞に結合した抗体を調査するために、ELISAによるアッセイが行われた。
実施例12
MTTアッセイ
３−（4,5−ジメチル／チアゾリル）−2,5−ジフェニルテトラゾニウムプロマイド（MTT）アッセイはベルセン（versene）1:5000で組織培養フラスコから細胞を取り出し、500×ｇで５分間遠心分離を行い、それらの細胞を１×105細胞/mlの濃度で培養液内に再懸濁した。細胞を100μl/ウェルの割合で96−ウェルマイクロタイタープレートに入れ、37℃の温度で、24時間、加湿CO2培養器内で培養した。
次の日、TAb 250またはTAb 250ゲロニンを加えた。最高濃度の抗体を最初のカラムのウェル内に入れたら、すぐに、マルチチャネルピペットを用いて、マイクロタイタープレート内で、抗体の1:2希釈を直接行った。次に、プレートを３日間培養してから、10μl/ウェルの割合でMTTを追加した。MTTはPBSの5mg/ml溶液として調製、ろ過殺菌して、暗所で４℃の温度で保存した。プレートは暗所で保存し、37℃の温度で、さらに４時間培養した。ウェルの内容物を0.04N HClおよび３％ナトリウムドデシルスルフェートと混ぜ合わせて溶解した。そして、酵素結合免疫吸収アッセイ（ELISA）リーダーを用いて判定した。
実施例13
CPA
細胞増殖アッセイ（CPA）は細胞数および成長性を判定することによって、細胞の成長の測定を行う。０日に、80−90％の融合度の細胞を組織培養フラスコから遊離して、200×ｇで、20℃の温度で６分間遠心分離を行ってペレット化し、その後、2mMグルタミンおよび10％仔ウシ胎児血清を含むMEMに6000細胞/mlの濃度で再懸濁させた。この細胞懸濁液を１ウェルあたり1mlの割合で24−ウェルプレートに加えた。このプレートを、５％CO2の存在下、37℃の温度で、24時間培養した。１日に、３つのウェルの細胞をPBSで洗浄して、PBS内に0.05％トリプシンを加えたもの1mlでプレートから遊離して、コウルターカウンターを用いて、500μｌをカウントした。残りのウェルには、20μl PBS,TAb 250、あるいはTAb 250−ゲロニンを、それぞれ図に示す濃度で加える。そして、プレートを培養器に戻し、図に示されている時点で、それら細胞をトリプシンで遊離し、１日のデータとしてカウトされる。のこりの500μｌの細胞を沃化プロピジウムで染色すると、フロー・サイトメトリーによって成長性を判定することができる。グラフの各点で、平均細胞数（ｎ＝３）が判定され、細胞数のパーセントをかけて、成長可能な細胞の数を求める。これをPBSで処理した生きた細胞の数で割って、Ｙ軸上のコントロールのパーセントを求める。
実施例14
ゲロニンおよびゲロニン−TAb 250抗体複合体の細胞毒 性
図１に示されているように、ZME抗体はSKOV−３細胞にほとんど影響を及ぼさない。対照的に、TAb 250−ゲロニン免疫接合体は高度に活性であった。
図２はSKOV−３細胞に対するTAb 250−ゲロニン免疫接合体の細胞毒性を、ゲロニンだけの場合と比較して示している。同じ濃度で、TAb 250−ゲロニン免疫接合体はゲロニンだけの場合と比較して10,000程度高い細胞毒性を示した。
図３は、不適切な抗体、ZMEモノクローナル抗体がTAb 250−ゲロニン免疫接合体の細胞毒性に関して、実質的な影響を及ぼさないことを示している。対照的に、TAb 250モノクローナル抗体の濃度を増大すると、容量に依存する形で、免疫接合体の細胞毒性は減少する。
図４は、SKOV−３細胞に対するTAb 250−ゲロニン免疫接合体の用量に対応した関係を示している。CPAアッセイの場合にも見られたように、0.1マイクログラム/ml以上の用量は６日間の使用で80％の抑止効果を生じた。
図５は、モノクローナル抗体TAb 250のみ、あるいは、TAb 250とゲロニンの接合体のSKOV−３細胞に対する影響を示している。図に示されているように、CPAにおけるTAb 250−免疫接合体による用量に依存した抑制効果が認められる。
図７は、４つの異なった細胞株に対するTAb 250−ゲロニン免疫接合体の影響を示している。この図で分かるように、最大の毒性はSKBR−３細胞株で観察された。SKOV−３細胞およびMDA−MB−453細胞では明らかであるが、MDA−MB−231細胞においては細胞毒性は認められなかった。このように、TAb 250−ゲロニン免疫接合体の細胞毒性は、これらの細胞内における細胞表面受容体数に関連している。
結論として、ここで開示されている本発明およびその実施例は、冒頭に述べたような目的を達成するのによく適合していることが分かるであろう。本発明の精神および範囲を逸脱せずに、方法および装置に一定の修飾を加えることは可能である。さらに、以下の各請求項の各要素あるいはステップは、基本的に同様の方法で基本的には同じ結果を達成するためのすべての同等の要素又はステップについても指しているものとして理解するべきである。
Claims (12)
- ｃ−erbB−２蛋白質に対する抗原ドメインに対して結合特性を示す抗体と植物由来の毒素の接合体により構成され、上記抗体が受託番号ATCC HB10646であるハイブリドーマにより生産されるTAB250であり、上記毒素がゲロニン、全長組み替えゲロニン、ゲロニンフラグメントおよびゲロニン誘導体により構成される群から選択される毒素である組成物。
- 上記結合特性がｃ−erbB−２の細胞外エピトープに対するものである請求項１の組成物。
- 上記植物由来毒素が、上記標的部分に接合されない場合、低い細胞影響を有する請求項１の組成物。
- 上記毒素が天然の毒素および組み替え毒素により構成される群から選択される請求項１の組成物。
- 上記接合体が上記抗体と上記植物由来毒素との間の融合蛋白質である請求項１の組成物。
- 請求項１の組成物よりなる腫瘍細胞を措置 するための医薬品組成物。
- さらに、薬学的に許容可能なベヒクルを含んでいる請求項１の組成物。
- 請求項７の単一投与（single dose）組成物。
- 有効な量の請求項１による組成物をin Vitroでの細胞に投与するステップで構成される腫瘍細胞を措置するための方法。
- 上記腫瘍細胞がｃ−erbB−２蛋白質の過剰表現によって特徴づけられる請求項９の方法。
- 上記細胞が哺乳動物悪性腫瘍細胞、卵巣悪性腫瘍、肺悪性腫瘍細胞、唾液腺悪性腫瘍細胞、胃癌細胞、結腸腺悪性腫瘍細胞、そして骨髄腫白血病細胞で構成される群から選択される請求項９の方法。
- 上記組成物が上記細胞の成長速度を遅らせる請求項９の措置法。
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