CN109072212B - 改善的分选酶 - Google Patents
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Abstract
本文报道包含与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少90%同一的氨基酸序列且包含突变D101S和K137S的分选酶。
Description
本发明属于分选酶领域。本文报道具有改善的酶活性的分选酶及在转酰胺基反应中使用该具有改善的酶活性的分选酶的方法。
背景技术
分选酶A(SrtA)是将蛋白质共价附着至细菌细胞壁的膜结合酶。SrtA底物上的特异性识别基序是LPXTG,由此该酶在苏氨酸和甘氨酸残基之间切割。肽聚糖上的识别基序是五甘氨酸基序。已显示N端上的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足以支持SrtA反应(Clancy,K.W.等,Peptide science 94(2010)385-396)。反应通过硫酯酰基-酶中间体进行,该中间体通过来自寡聚甘氨酸的胺亲核体的攻击而分解,将肽聚糖共价连接至蛋白质底物,并再生SrtA。SrtA可以用于将化学合成的肽共价缀合至重组表达的蛋白质。
WO 2010/087994中报道了用于连接的方法及其用途。Marvin,J.S.等(ActaPharmacol.Sinica 26(2005)649-658)报道了IgG样双特异性抗体的重组方法。WO 2013/003555中报道了用分选酶安装点击化学把手进行蛋白质连接。
Levary,D.A.等报道了分选酶A催化的蛋白质-蛋白质融合(PLOS ONE 6(2011))。Madej,M.P.等(Biotechnol.Bioeng.109(2012)1461-1470)报道了将抗表皮生长因子受体抗体改造为单链型式,并通过分选酶A介导的蛋白质连接进行标记。Ta,H.T.等报道了酶促单链抗体标记作为心血管疾病中靶分子成像和细胞归巢的通用方法(Cir.Res.109(2011)365-373)。Popp,M.等报道了产生和断裂肽键——使用分选酶的蛋白质改造(Angew.Chem.Int.Ed.Eng.50(2011)5024-5032)。WO 2010/099536中报道了对DOTA螯合物具有高亲和力的改造蛋白质。
已报道了阻断分选酶的逆反应的不同努力。Yamamura,Y.等(Chem.Commun.47(2011)4742-4744)报道了通过在底物识别位点附近引入β-发夹,在连接位点附近诱导β-发夹结构来增强分选酶A介导的蛋白质连接。
Biswas,T.等(Biochem.53(2014)2515-2524)报道了通过原型分选酶A分选LPXTG肽、不变底物残基在调节酶动力学中的作用及生产底物的构象特征。
Li,Y.M.等报道了通过使用分选酶来使蛋白质发生不可逆位点特异性肼解(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.53(2014)2198-2202)。
US 9,267,127中报道了显示增强的反应动力学和/或改变的底物偏好的进化分选酶及使用这类进化成键酶的方法。其中报道了包含与金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分选酶A的氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列的分选酶,其中分选酶的氨基酸序列包含选自P94S、P94R、E106G、F122Y、K154R、D160N、D165A、G174S、K190E和K196T的两个或多个突变。WO 2014/70865和WO 2015/42393中使用相同的进化分选酶。
Chen,I.等报道了用酵母展示进化成键酶的一般策略(Proc.Natl.Acad.Sci.USA108(2011)11399-11404)。
发明概述
本文报道具有改善的催化特性的金黄色葡萄球菌分选酶A。已发现,通过将突变D160S和K196S引入SEQ ID NO:01的野生型金黄色葡萄球菌分选酶A,可以改善该分选酶的催化特性(例如术语D160S指将EQ ID NO:01的160位的氨基酸残基D替换/突变为氨基酸残基S)。本文报道的分选酶具有5倍于来自金黄色葡萄球菌的野生型分选酶A的催化活性的催化活性(在本文所述测定中测定)。
本文报道的一个方面是分选酶,其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少90%同一的氨基酸序列,其中该氨基酸序列包含突变D101S和K137S,其中该分选酶在分选酶介导的偶联反应中具有比具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的分选酶高的催化活性(在本文所述测定中测定)。
本文报道的一个方面是分选酶,其包含与SEQ ID NO:01的金黄色葡萄球菌分选酶A的氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列,其中该氨基酸序列包含突变D160S和K196S(产生具有氨基酸序列SEQ ID NO:02的分选酶A)。
本文报道的一个方面是具有分选酶活性(即催化含有氨基酸序列LPXTG(SEQ IDNO:21)的第一化合物和在其N端含有二甘氨酸或三甘氨酸的第二化合物之间的肽键形成)的多肽,其与SEQ ID NO:01的金黄色葡萄球菌分选酶A的氨基酸序列至少90%同一,其中氨基酸序列包含突变D160S和K196S(产生具有氨基酸序列SEQ ID NO:02的分选酶A)。
在一个实施方案中,SEQ ID NO:01的分选酶/多肽进一步包含选自突变A61E、A61T、E106G、N107W、F144L和G167E的一个或多个突变。
在一个实施方案中,该分选酶/多肽包含突变:
i)D160S、K196S和E106G(SEQ ID NO:03);或
ii)D160S、K196S和N107W(SEQ ID NO:04);或
iii)D160S、K196S和F144L(SEQ ID NO:05);或
iv)D160S、K196S和G167E(SEQ ID NO:06);或
v)D160S、K196S、N107W和F144L(SEQ ID NO:07);或
vi)D160S、K196S、F144L和G167E(SEQ ID NO:08);或
vii)D160S、K196S、N107W和G167E(SEQ ID NO:09);或
viii)D160S、K196S、N107W、F144L和G167E(SEQ ID NO:10)。
本文报道的一个方面是具有氨基酸序列SEQ ID NO:02、或SEQ ID NO:03、或SEQID NO:04、或SEQ ID NO:05、或SEQ ID NO:06、或SEQ ID NO:07、或SEQ ID NO:08、或SEQ IDNO:09、或SEQ ID NO:10的分选酶/多肽。
本文报道的一个方面是分选酶,其包含与SEQ ID NO:11的缩短的金黄色葡萄球菌分选酶A的氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列,其中该氨基酸序列包含突变D101S和K137S(产生具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的缩短的分选酶A)。
本文报道的一个方面是具有分选酶活性(即催化含有氨基酸序列LPXTG(SEQ IDNO:21)的第一化合物和在其N端含有二甘氨酸或三甘氨酸的第二化合物之间的肽键形成)的多肽,其与SEQ ID NO:11的金黄色葡萄球菌分选酶A的氨基酸序列至少90%同一,其中氨基酸序列包含突变D101S和K137S(产生具有氨基酸序列SEQ ID NO:02的分选酶A)。
在一个实施方案中,SEQ ID NO:12的分选酶/多肽进一步包含选自突变A2E、A2T、E47G、N48W、F85L和G108E的一个或多个突变。
在一个实施方案中,该分选酶/多肽包含突变:
i)D101S、K137S和E47G(SEQ ID NO:13);或
ii)D101S、K137S和N48W(SEQ ID NO:14);或
iii)D101S、K137S和F85L(SEQ ID NO:15);或
iv)D101S、K137S和G108E(SEQ ID NO:16);或
v)D101S、K137S、N48W和F85L(SEQ ID NO:17);或
vi)D101S、K137S、F85L和G108E(SEQ ID NO:18);或
vii)D101S、K137S、N48W和G108E(SEQ ID NO:19);或
viii)D101S、K137S、N48W、F85L和G108E(SEQ ID NO:20)。
本文报道的一个方面是包含氨基酸序列SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、或SEQID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17、或SEQ ID NO:18、或SEQ IDNO:19、或SEQ ID NO:20的分选酶/多肽。
本文报道的一个方面是具有氨基酸序列SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:13、或SEQID NO:14、或SEQ ID NO:15、或SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17、或SEQ ID NO:18、或SEQ IDNO:19、或SEQ ID NO:20的分选酶/多肽。
本文报道的一个方面是用于产生多肽的方法,其包括将i)含有分选酶识别序列的第一多肽、ii)含有分选酶受体序列的第二多肽和iii)本文报道的分选酶/多肽一起孵育并由此产生该多肽的步骤。
在一个实施方案中,该方法包括以下步骤:
-将以下一起孵育
i)含有氨基酸序列LPXTG(SEQ ID NO:21)的第一多肽,其中X可以是任意氨基酸残基;
ii)含有选自I)在其N端为甘氨酰(glycinyl)化合物、II)在其N端为寡聚甘氨酸、III)在其N端为半胱氨酸氨基酸残基,之后跟随1至3个甘氨酸氨基酸残基、或IV)在其5个N端氨基酸残基内有赖氨酸氨基酸残基的分选酶受体序列的第二多肽;
iii)本文报道的分选酶/多肽;和
-从反应混合物回收多肽并由此产生多肽。
在一个实施方案中,该方法用于酶促缀合两种多肽。
在一个实施方案中,该第一多肽在其C端20个氨基酸残基内包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID NO:21),其中X可以是任意氨基酸残基。在一个实施方案中,该第一多肽在其C端20个氨基酸残基内包含氨基酸序列LPETG(SEQ ID NO:22)。
在一个实施方案中,该第二多肽在其N端具有氨基酸序列GG(SEQ ID NO:23)、GGG(SEQ ID NO:24)、CGG(SEQ ID NO:25)或KGG(SEQ ID NO:26)。
在一个实施方案中,第一多肽和第二多肽相互独立地选自抗体可变结构域、抗体重链Fab片段、抗体Fc区、标签、标记、毒素和非分选酶多肽。
发明详述
本发明至少部分基于这样的发现,通过将具有氨基酸序列SEQ ID NO:01的金黄色葡萄球菌全长野生型分选酶A的氨基酸残基D160和K196或具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的缩短的金黄色葡萄球菌分选酶A的残基D101和K137分别都突变为丝氨酸,可以改善分选酶的酶活性。
I.定义
如本文中所使用,所给出的氨基酸位置是各自在所提到的氨基酸序列中的(顺序)位置。
必须指出,除非文中另有明确说明,本文中及所附权利要求书中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此,例如,提到“一个细胞”包括多个这类细胞及本领域技术人员已知的其等同物,等等。另外,术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。还应指出,术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
此外,即使未明确公开,本文报道的方面和实施方案的所有可能的变形、组合和排列也都包含在内,并形成本发明的具体实施方案。这涵盖将来自一项或多项权利要求或来自相关描述部分的一个或多个限制、要素、条款、描述项引入另一项权利要求。例如,任一项权利要求都可以修改为包括见于从属于其的其他任一项权利要求中的一个或多个限制。此外,除非另有说明或除非对本领域普通技术人员而言显而易见会产生矛盾或不一致,在权利要求引用化合物或组合物时,应理解为包括为了本文公开的任何目的而使用该化合物或组合物的方法,且包括按照本文公开的任意制备方法或本领域已知的其他方法制备该化合物或组合物的方法。
在将特征呈现为列表时,应理解,也公开了各特征亚组以及单个特征,可从该组去除任意一个或多个特征而不扩大公开内容。
在给出范围时,该范围的终点明确作为单个数值包括以及公开。除非另有说明或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解显而易见,表示为范围的值包括和公开指向该范围内的任意具体值的所有实施方案而无需明确提到此具体值。另外,除非另有说明或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解显而易见,表示为范围的值包括该范围的给定终点之内的任意子范围,其中该子范围的终点以与该范围的终点相同的准确度表示。
术语“突变”指用不同的“替换”氨基酸残基替换预先确定的亲本氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基。该一个或多个替换残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码),且选自:丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬酰胺(Asn);天冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);谷氨酰胺(Gln);谷氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);组氨酸(His);异亮氨酸(Ile);亮氨酸(Leu);赖氨酸(Lys);甲硫氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro);丝氨酸(Ser);苏氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和缬氨酸(Val)。在一个实施方案中,该替换残基不是半胱氨酸。一个或多个非天然存在的氨基酸残基的取代也为本文所用的突变的定义所涵盖。“非天然存在的氨基酸残基”指除上文所列出的那些天然存在的氨基酸残基外的残基,其能够共价结合多肽链中的一个或多个邻近氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸、aib和其他氨基酸残基类似物,如Ellman等,Meth.Enzym.202(1991)301-336中所述的那些。为了产生这类非天然存在的氨基酸残基,可以使用Noren等(Science 244(1989)182)和/或Ellman等(上文)的方法。简言之,这些方法涉及用非天然存在的氨基酸残基化学活化阻抑型tRNA,然后体外转录和翻译RNA。非天然存在的氨基酸还可以通过化学肽合成掺入肽,然后使这些肽与重组产生的多肽(如抗体或抗体片段)融合。
术语“标记”指具有特异性结合特性的经肽键相互连接的氨基酸残基的序列。在一个实施方案中,该标记是亲和或纯化标记。在一个实施方案中,该标记选自Arg标记、His标记、Flag标记、3xFlag标记、Strep标记、HA标记、Nano标记、SBP标记、c-myc标记、S标记、SNUT标记、NusA、T7、硫氧还蛋白、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标记或MBP标记(参见例如Amau,J.等,Prot.Expr.Purif.48(2006)1-13)。在一个实施方案中,该标记选自SEQ ID NO:27(RRRRR)、SEQ ID NO:28(RRRRRR)、SEQ ID NO:29(HHHHHH)、SEQ ID NO:30(KDHLIHNVHKEFHAHAHNK)、SEQ ID NO:31(DYKDDDDK)、SEQ ID NO:32(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK)、SEQ ID NO:33(AWRHPQFGG)、SEQ ID NO:34(WSHPQFEK)、SEQID NO:35(MDVEAWLGAR)、SEQ ID NO:36(MDVEAWLGARVPLVET)、SEQ ID NO:37(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQ GQREP)、SEQ ID NO:38(EQKLISEEDL)、SEQ ID NO:39(KETAAAKFERQHMDS)、SEQ ID NO:40(KRRWKKNFIAVSAANRFK KISSSGAL)、SEQ ID NO:41(纤维素结合结构域)、SEQ ID NO:42(纤维素结合结构域)、SEQ ID NO:43(TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGK TYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ)、SEQ ID NO:44(GST标记)和SEQ ID NO:45(MBP标记)。
术语“位置”指多肽的氨基酸序列中的氨基酸残基的位置。位置可以顺次编号,例如在多肽中,或按照确定的型式(例如用于抗体编号的Kabat的EU指数)编号。在任何情况下,第一个氨基酸残基编号为1。
术语“分选酶”指具有分选酶活性的多肽,即分选酶是催化通过转酰胺基作用将第一多肽(的C端)缀合至第二多肽的N端的转肽反应的酶。该术语包括全长分选酶,例如全长天然存在的分选酶,其具有分选酶活性的片段,及其修饰(例如突变)变体。本领域技术人员能够容易地测定给定的多肽是否具有分选酶活性,例如通过将所讨论的多肽与第一和第二多肽(一个包含分选酶识别基序,一个包含分选酶受体基序)在适宜进行转肽作用的条件下孵育,并测定是否形成各转肽反应产物。分选酶多肽可以包含任意数目的氨基酸残基,只要它具有分选酶活性。这并不是指分选酶必须具有与野生型分选酶相同的活性。用适宜的测定可检测到分选酶活性即可。术语分选酶涵盖所有已知的分选酶,例如分选酶A、分选酶B、分选酶C和分选酶D类型的分选酶。在一个实施方案中,该分选酶是分选酶A。此分选酶A可以来自任意细菌物种或菌株。在一个实施方案中,该分选酶是金黄色葡萄球菌分选酶A。金黄色葡萄球菌野生型分选酶A的氨基酸序列已知,代表性序列保藏在例如公开SEQ ID NO:01的编码序列(可读框1)的检索号AF162687下:
或公开SEQ ID NO:46的编码序列的检索号WP_000759359.1下:
在一个实施方案中,该分选酶是酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)分选酶A。
II.突变分选酶A
本文报道具有改善的催化活性的金黄色葡萄球菌分选酶A。已发现,通过将突变D160S和K196S引入野生型金黄色葡萄球菌分选酶A(SEQ ID NO:01至SEQ ID NO:02),可以改善酶特性。使用本文报道的测定,本文报道的突变分选酶具有约5倍于来自金黄色葡萄球菌的野生型分选酶A的酶活性的酶活性。在本文报道的测定中,本领域已知的具有6个突变的参考突变体仅具有提高约4倍的活性。本文还涵盖金黄色葡萄球菌野生型分选酶A的缩短形式中各位置处的相同突变。在缩短形式中,可以突变相同的氨基酸残基,但由于氨基酸序列长度(即残基数)的差异,这些氨基酸残基在氨基酸序列中具有不同的绝对位置。
本文提供突变的金黄色葡萄球菌分选酶A。在一些实施方案中,该突变分选酶具有改善的催化特性,如改善(即更快)的反应动力学,因为它以比各野生型分选酶更高的速度和/或周转率催化转肽反应。在一些实施方案中,该突变分选酶具有改变的底物特异性,因为它以比各野生型分选酶改善(即更高)或降低(即更低)的亲和力或改善(即更特异)或降低(即特异性更低,更混乱)的特异性结合给定底物。
下表中总结本文报道的纯化的双突变分选酶的特性:
下表中总结从粗培养上清测定的本文报道的各个突变分选酶的特性:
与野生型酶相比相对活性变化至超过100%表示该突变体具有更高初速度。
与野生型酶相比相对稳定性变化至超过100%表示热处理后更多的酶保持活性,而变化至不到100%表示热处理后更少的酶保持活性。
与野生型酶相比对LPXTG(包含分选酶识别基序的多肽)的相对表观“Km”变化至超过100%表示,与在高底物浓度下的活性相比,该突变体在低底物浓度下具有更高的活性,而变化至不到100%表示,与在高底物浓度下的活性相比,该突变体在低底物浓度下具有更低的活性。
与野生型酶相比对GG(包含分选酶受体基序的多肽)的相对表观“Km”变化至超过100%表示,与在高底物浓度下的活性相比,该突变体在低底物浓度下具有更高的活性,而变化至不到100%表示,与在高底物浓度下的活性相比,该突变体在低底物浓度下具有更低的活性。
本文报道的一个方面是分选酶,其包含与SEQ ID NO:01的金黄色葡萄球菌分选酶A的氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列,且包含突变D160S和K196S。
在一个实施方案中,SEQ ID NO:01的分选酶进一步包含选自突变A61E、A61T、E106G、N107W、F144L和G167E的一个或多个突变。
在一个实施方案中,该分选酶包含突变:
i)D160S、K196S和E106G(SEQ ID NO:03);或
ii)D160S、K196S和N107W(SEQ ID NO:04);或
iii)D160S、K196S和F144L(SEQ ID NO:05);或
iv)D160S、K196S和G167E(SEQ ID NO:06);或
v)D160S、K196S、N107W和F144L(SEQ ID NO:07);或
vi)D160S、K196S、F144L和G167E(SEQ ID NO:08);或
vii)D160S、K196S、N107W和G167E(SEQ ID NO:09);或
viii)D160S、K196S、N107W、F144L和G167E(SEQ ID NO:10)。
本文提供突变分选酶,其包含与金黄色葡萄球菌的野生型分选酶A(SEQ ID NO:01)或其片段(SEQ ID NO:11)各自的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些实施方案中,该突变分选酶的氨基酸序列在SEQ ID NO:01中包含突变D160S和K196S,或在SEQ ID NO:11中包含D101S和K137S。在一个实施方案中,该突变分选酶包含一个或多个其他突变。例如,该突变分选酶可以相对于SEQ ID NO:01包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个突变(导致同一性超过90%),或相对于SEQ ID NO:11包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个突变(导致同一性超过90%)。在一个实施方案中,该突变分选酶相对于具有氨基酸序列SEQ ID NO:01的分选酶或具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的分选酶片段包含2、3、4、5、6或7个突变。在一个实施方案中,该突变分选酶的氨基酸序列与序列SEQ IDNO:01至少90%同一、至少95%同一、至少98%同一、至少99%同一、或超过99%同一。在一个实施方案中,该突变分选酶的氨基酸序列与序列SEQ ID NO:11至少90%同一、至少95%同一、至少98%同一、或超过98%同一。
在一个实施方案中,本文报道的(突变)分选酶对含有分选酶识别基序的多肽具有分别小于SEQ ID NO:01或SEQ ID NO:11的相应亲本分选酶对同一多肽的KM的KM值,对含有分选酶受体序列的多肽具有分别大于SEQ ID NO:01或SEQ ID NO:11的相应亲本分选酶对同一多肽的KM的KM值。
在一个实施方案中,本文报道的(突变)分选酶对含有分选酶识别基序的多肽具有分别与SEQ ID NO:01或SEQ ID NO:11的相应亲本分选酶对同一多肽的KM至少相同、或比其低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、或至少50倍的KM值。在一个实施方案中,本文报道的(突变)分选酶对含有分选酶受体序列的多肽具有与亲本分选酶对同一多肽的KM至少相同、比其高不超过2倍、不超过5倍、不超过10倍、或不超过20倍的KM值。
本文报道的突变分选酶的保持本文报道的突变分选酶的酶促特性的变体也是本发明的方面。
变体氨基酸序列偏离亲本或参考氨基酸序列。可以基于极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、成螺旋特性和/或两亲特性进行氨基酸取代,并用适宜的测定如欧洲专利申请EP14198535中所报道的测定针对酶活性筛选得到的变体。例如,带负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;带正电荷氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;具有相似亲水性值的含有不带电荷的极性头基(polar head group)的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。在某些实施方案中,可以按照下表进行保守取代。在保守取代中,第二列的同一区中和第三列的同一行中的氨基酸可以相互取代。某些保守取代是用来自第二列的同一区内第三列的另一行的氨基酸取代对应于第二列中的区的第三列的一行中的氨基酸。
在某些实施方案中,可以进行同源取代,同源取代是相似氨基酸的取代或替换,例如,碱性氨基酸取代或替换碱性氨基酸、酸性氨基酸取代或替换酸性氨基酸、极性氨基酸取代或替换极性氨基酸、及疏水性氨基酸取代或替换疏水性氨基酸。可将非同源取代引入亲本或参考序列,如从一类残基至另一类残基(例如非疏水性至疏水性氨基酸),或用非天然氨基酸或非经典氨基酸替换物取代天然存在的氨基酸。
分选酶活性测定
将纯化的分选酶或其变体与含有LPETG基序的葡萄糖脱氢酶(20μM)和含有N端甘氨酸的生物素衍生物(20μM))混合在含有200mM NaCl的50mM Tris缓冲液pH 7.5中。37℃孵育反应混合物2小时。通过加入10至40倍过量的抑制缓冲液(50mM Tris、pH 7.5、200mMNaCl、10mM CaCl2、5mM碘乙酰胺)终止反应。5000x g离心终止的反应混合物10分钟。将上清(50μL)加至100μL含有200mM NaCl、10mM CaCl2的50mM Tris缓冲液(pH 7.5),加至链霉抗生物素蛋白包被的多孔微量滴定板上,并在30℃、200转/分钟孵育30分钟。然后洗涤多孔微量滴定板5次,每次使用300μL洗涤缓冲液(50mM Tris、pH 7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mg/mL BSA、0.1%Triton X-100)。向孔中加入150μL测试缓冲液(0.2M柠檬酸钠、pH 5.8、0.3g/L 4-亚硝基苯胺、1mM CaCl2、30mM葡萄糖)。
在5分钟的时期内在620nm测量报道酶的动力学。报道酶的活性与所固定的酶的量成比例,所固定的酶的量与生物素化酶的量成比例,生物素化酶的量与分选酶的活性成比例。
III.使用分选酶A的酶促缀合
可以通过使用分选酶(尤其是分选酶A)来在体外获得包含两个在体内不共价结合的实体的共价缀合物。
转酰胺基酶通常催化酰基供体和亲核酰基受体间的肽键(酰胺键)形成。为了形成肽键,酰基受体必须含有NH2-CH2-部分。革兰氏阳性菌包括以下属:放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。
基于来自革兰氏阳性菌基因组的61种分选酶的序列比对和系统发生分析,将分选酶归入命名为A、B、C和D的4类(Dramsi,S.等,Res.Microbiol.l56(2005)289-297)。这些种类对应于以下亚家族,Comfort和Clubb(Comfort,D.和Clubb,R.T.,Infect.Immun.72(2004)2710-2722)也已将分选酶归入这些亚家族:A类(亚家族1)、B类(亚家族2)、C类(亚家族3)、D类(亚家族4和5)。前述参考文献公开了许多分选酶和识别基序(还参见Pallen,M.J.等,Trends Microbiol.9(2001)97-101)。通过此信息,本领域技术人员可以根据其序列和/或其他特征如Drami(上文)中所述的那些将分选酶分配至正确的种类。
分选酶A(SrtA)是具有转酰胺基酶活性的膜结合酶。它鉴定和分离自革兰氏阳性菌。在体内,分选酶A将蛋白质共价附着至细菌细胞壁。SrtA底物上的特异性识别基序是LPXTG(SEQ ID NO:21),由此该酶在苏氨酸和甘氨酸残基之间切割。肽聚糖上的识别基序是五甘氨酸基序。已显示N端上的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足以支持SrtA反应(Clancy,K.W.等,Peptide science 94(2010)385-396)。反应通过硫酯酰基-酶中间体进行,该中间体通过来自寡聚甘氨酸的胺亲核体的攻击而分解,将肽聚糖共价连接至蛋白质底物,并再生SrtA。SrtA可以用于将化学合成的肽共价缀合至重组表达的蛋白质。
许多革兰氏阳性菌用分选酶来将多种表面蛋白质(包括毒力因子)共价锚定至其细胞壁(肽聚糖)。分选酶是膜结合酶。野生型金黄色葡萄球菌分选酶A(SrtA)是具有N端跨膜区的206个氨基酸的多肽。在第一步中,分选酶A识别含有LPXTG(SEQ ID NO:21)氨基酸序列基序的底物蛋白质,并借助活性部位Cys切割Thr和Gly之间的酰胺键。此肽切割反应产生分选酶A-底物硫酯中间体。在第二步中,该硫酯酰基-酶中间体通过含有寡聚甘氨酸的第二底物多肽(对应于金黄色葡萄球菌中肽聚糖的五甘氨酸单位)的氨基的亲核攻击而分解,产生共价连接的细胞壁蛋白质,并再生分选酶A。在缺乏寡聚甘氨酸的情况下,酰基-酶中间体可以被水分子水解。
分选酶介导的连接/缀合已开始应用于多种蛋白质改造和生物缀合目的。此技术能够在LPXTG标记的重组或化学合成多肽中引入天然和合成的功能性。实例包括共价附着寡聚甘氨酸衍生的聚合物(例如PEG)、荧光团、维生素(例如生物素和叶酸)、脂质、糖类、核酸、合成肽和蛋白质(例如GFP)(参见例如Tsukiji,S.和Nagamune,T.,ChemBioChem 10(2009)787-798;Popp,M.W.L.和Ploegh,H.L.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.50(2011)5024-5032)。
对于酶促缀合,可以使用缺乏跨膜区(SrtA;金黄色葡萄球菌SrtA的氨基酸残基60-206)的可溶性截短分选酶A(SEQ ID NO:21;还参见Ton-That,H.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)12424-12429;Ilangovan,H.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)6056-6061)。
分选酶A介导的反应导致含有分选酶识别序列(分选酶基序)的种类与含有分选酶受体序列(例如一个或多个N端甘氨酸残基)的那些的连接。分选酶识别序列可以是氨基酸序列LPXTG(SEQ ID NO:21),但也可以与其不同。但是,用这类序列作为酰基供体的缺点是LPXT(SEQ ID NO:47)单位转移至亲核酰基供体释放出化学计量比量的含有至少一个N端甘氨酸残基的相应片段。所释放的含甘氨酸片段与预期酰基受体竞争酶促中间体,对酶促连接反应的进行不利。此外,虽然进行得相对慢,但酶促中间体以及含LPXTG底物的水解切割与反应竞争。在开始使用分选酶介导的反应时,只有在使用至少5mM浓度的含分选酶基序的酰基供体时才可获得有用的连接水平。
在某些实施方案中,该分选酶基序具有氨基酸序列LPX1TX2(SEQ ID NO:48),其中:i)X1选自氨基酸残基D、E、A、N、Q、K和R,ii)X2选自氨基酸残基丙氨酸和甘氨酸。在某些实施方案中,该分选酶基序是LPX1TG(SEQ ID NO:49)。在某些实施方案中,该分选酶基序是LPX1TA(SEQ ID NO:50)。X1具有前述含义。
具有分选酶转酰胺基活性的分选酶片段可以用于本文报道的方法。例如通过重组技术或蛋白水解消化产生亲本分选酶的片段,并测定肽键形成(即连接)速率,可以鉴定分选酶片段。片段可以包含亲本分选酶的约80%氨基酸序列,亲本分选酶的约70%、约60%、约50%、约40%或约30%氨基酸序列。在一些实施方案中,该片段缺乏亲本分选酶氨基酸序列的对分选酶的催化活性不重要的N端部分,例如该片段缺乏延伸至膜锚定序列末端的N段部分。在一些实施方案中,该片段包含亲本分选酶氨基酸序列的C端。在一些实施方案中,该片段包含分选酶的催化核心区。在一个实施方案中,该核心区是SEQ ID NO:01的金黄色葡萄球菌分选酶A的约60位至约206位。
在本文报道的方法中,在适于达到在包含分选酶识别序列的多肽的N端部分和包含分选酶受体序列的多肽的C段部分之间形成肽键的条件下,将含有分选酶识别序列的多肽(即酰基供体)和含有分选酶受体序列的多肽(即亲核/酰基受体)一起孵育。本文所用的术语“孵育”或其语法等同形式指使所列成分相互紧密靠近以允许分子间接触。例如,可以通过将它们加至一个反应容器来进行孵育。系统中的成分可以以多种方式混合,例如,通过震荡容器,将容器放在产生涡旋的仪器上,或用移液器反复混合。成分可以按任意顺序加至系统。
分选酶反应可以在任意方便的容器(例如管,如微量离心管、瓶、平皿)、微量滴定板(例如96孔板或384孔板)、载玻片、硅片、滤器、或具有在其上固定分子并可选地以阵列排列的表面(可选地包被)的任意固体或半固体支持物(参见例如US 6,261,776和Fodor,Nature 364(1993)555-556)、及微流装置(参见例如US 6,440,722;US 6,429,025;US 6,379,974;和US 6,316,781)中进行。
反应混合物通常不含细胞,且进一步不包含细菌细胞壁成分或完整细菌细胞壁。在一些实施方案中,通过一个或多个重组核苷酸序列在细胞中表达含有分选酶识别序列的多肽和/或含有分选酶受体序列的多肽,该核苷酸序列整合入细胞基因组或维持非整合状态(例如在质粒中)。
使反应混合物保持在可以进行分选酶反应的任意方便的温度下。在一些实施方案中,在约15℃和约50℃之间且包括约15℃和约50℃的温度下进行分选酶反应。在一个实施方案中,该孵育是在30℃至40℃的温度下进行。在一些实施方案中,在约23℃和约37℃之间且包括约23℃和约37℃的温度下进行分选酶反应。在一个实施方案中,该孵育是在约37℃的温度下进行。在某些实施方案中,该温度是室温(即约20℃至25℃)。可以通过在不同温度下重复进行相同的分选酶反应并测定连接速率来优化该温度。
可以使用任意方便的体积和成分。
在某些实施方案中,利用(摩尔)比1:1000或更大的分选酶和含有分选酶识别序列的多肽,或利用(摩尔)比1:1000或更大的分选酶和含有分选酶受体序列的多肽。在具体实施方案中,分选酶与含有分选酶识别序列的多肽或分选酶与含有分选酶受体序列的多肽的比值为约1:1,包括1:2或更大、1:3或更大、1:4或更大、1:5或更大、1:6或更大、1:7或更大、1:8或更大和1:9或更大。
在一些实施方案中,含有分选酶识别序列的多肽按从约10μM至约10mM的浓度存在。在一些实施方案中,含有分选酶识别序列的多肽按从约100μM至约1mM的浓度存在。在一些实施方案中,含有分选酶识别序列的多肽按从约100μM至约5mM的浓度存在。在一些实施方案中,含有分选酶识别序列的多肽按从约200μM至约1mM的浓度存在。在一些实施方案中,含有分选酶识别序列的多肽按从约200μM至约800μM的浓度存在。在一些实施方案中,含有分选酶识别序列的多肽按从约400μM至约600μM的浓度存在。
在某些实施方案中,含有分选酶受体序列的多肽按从约1μM至约500μM的浓度存在。在某些实施方案中,含有分选酶受体序列的多肽按从约15μM至约150μM的浓度存在。在某些实施方案中,含有分选酶受体序列的多肽按从约25μM至约100μM的浓度存在。在某些实施方案中,含有分选酶受体序列的多肽按从约40μM至约60μM的浓度存在。
在某些实施方案中,分选酶按从约1μM至约500μM的浓度存在。在某些实施方案中,分选酶按从约15μM至约150μM的浓度存在。在某些实施方案中,分选酶按从约25μM至约100μM的浓度存在。在某些实施方案中,分选酶按从约40μM至约60μM的浓度存在。
在某些实施方案中,该方法在包含水性环境的反应混合物中进行。通常可以利用含有适当缓冲剂和/或盐含量的水。在某些实施方案中,可以包含醇或有机溶剂。有机溶剂的量在连接过程中通常不明显酯化蛋白质或肽(例如,在加入醇或有机溶剂时,酯化的蛋白质或肽通常仅增加5%或更少)。醇和/或有机溶剂含量有时为20%或更少、15%或更少、10%或更少、或5%或更少,在利用更大量的醇或有机溶剂时,存在30%或更少、40%或更少、50%或更少、60%或更少、70%或更少、或80%或更少的醇或有机溶剂。在某些实施方案中,反应混合物仅包含醇或有机溶剂,如果存在,则仅存在有限量的水。
在一些实施方案中,该反应混合物包含缓冲液。本领域技术人员熟知可用于本文报道的方法的多种缓冲液。在一些实施方案中,该缓冲溶液包含钙离子。在某些实施方案中,该缓冲溶液不包含沉淀钙离子的物质。在一些实施方案中,该缓冲溶液不包含磷酸离子。在一些实施方案中,该缓冲溶液不包含螯合剂。
在一些实施方案中,该方法在6至8.5范围内的pH值进行。在一些实施方案中,该方法在6至8范围内的pH值进行。在一些实施方案中,该方法在6至7.5范围内的pH值进行。在一些实施方案中,该方法在6.5至8.5范围内的pH值进行。在一些实施方案中,该方法在7至8.5范围内的pH值进行。在一些实施方案中,该方法在7.5至8.5范围内的pH值进行。在一些实施方案中,该方法在7.0至8.5范围内的pH值进行。在一些实施方案中,该方法在7.3至7.8范围内的pH值进行。
在一些实施方案中,该反应在深共晶溶剂(deep eutectic solvent.)中进行。
在一个实施方案中,该深共晶溶剂包含氯化胆碱。在一个实施方案中,该深共晶溶剂是氯化胆碱与甘油的摩尔比1:2的混合物。在一个实施方案中,该深共晶溶剂包含水性共溶剂。在一个实施方案中,该深共晶溶剂包含至多30%(v/v)共溶剂。在一个实施方案中,该深共晶溶剂包含至多15%(v/v)共溶剂。在一个优选实施方案中,该深共晶溶剂是含有至多5%(v/v)水性共溶剂的氯化胆碱与甘油的摩尔比1:2的混合物。
在一个实施方案中,该深共晶溶剂是基于巯基的深共晶溶剂。在一个实施方案中,该基于巯基的深共晶溶剂包含:a)至少一种氢键受体;和b)至少一种脂肪族氢键供体,其包含i)至少一个巯基和ii)至少一个羟基或带负电荷氧原子或其盐,其中该至少一个氢键受体和该至少一个脂肪族氢键供体的摩尔比为2:1至1:10。在一个实施方案中,该至少一种氢键受体是氯化胆碱。在一个实施方案中,该至少一种氢键受体选自(2-羟乙基)三甲基铵盐、甲基三苯基膦盐、乙烯胺盐和三丁胺盐。在一个实施方案中,该盐是氯化物、溴化物和氢氧化物。在一个实施方案中,氯化胆碱和二硫苏糖醇的摩尔比为约1:2.5至1:3。在一个实施方案中,氯化胆碱和2-巯基乙醇的摩尔比为约1:2。在一个实施方案中,氯化胆碱和4-巯基-1-丁醇的摩尔比为约1:2。在一个实施方案中,氯化胆碱和1-巯基-2-丙醇的摩尔比为约1:2。在一个优选实施方案中,氯化胆碱和2-巯基乙磺酸钠的摩尔比为约1:1。
可将反应混合物或产物的一种或多种成分固定至固体支持物。反应混合物成分和固体支持物之间的附着可以是共价或非共价附着(非共价附着参见例如US 6,022,688)。固体支持物可以是系统的一个或多个表面,例如微量滴定板各孔中的一个或多个表面,载玻片或硅片的表面,BIAcore芯片,可选地连接至另一固体支持物的颗粒例如小球表面(参见例如Lam,Nature 354(1991)82-84)、或微流装置的通道。固体支持物的类型、用于共价和非共价附着至固体支持物的接头分子及用于将分子固定至固体支持物的方法是已知的(参见例如US 6,261,776;US 5,900,481;US 6,133,436;US 6,022,688;WO 2001/18234)。可以使用任何材料,例如塑料(例如聚苯乙烯)、金属、玻璃、纤维素、凝胶(例如至少部分形成自有机聚合物如PDMS)等。在一些实施方案中,该固体支持物是半固体和/或凝胶样的、可变形的、柔性的等。
在最终引入分选酶识别序列或寡聚甘氨酸后,可将任意多肽作为含有分选酶基序的多肽或含有分选酶受体序列的多肽用于本文报道的方法。
非分选酶基序部分
如果它不直接包含在多肽的氨基酸序列内,则可以将分选酶识别序列LPXTG(SEQID NO:21)缀合至治疗剂(药物)、毒性剂(例如毒素,如多柔比星或百日咳菌外毒素)、荧光团(例如荧光染料,如荧光素或罗丹明)、用于成像的螯合剂或放射性治疗金属、肽酰或非肽酰标记(标签,label)、标记、或清除修饰剂(如聚乙二醇的多种异构体)、结合第三成分的肽、或另一糖类或亲脂剂、或结合对的成员(例如生物素)。缀合可以是直接缀合或经居间接头缀合。
a)治疗剂
药物部分可以是具有治疗作用的任意化合物、部分或基团,如抗体、细胞毒性或细胞抑制化合物。
已知许多抗细胞表面分子及其配体的治疗性抗体,如美罗华(Rituxan)/MabThera/利妥昔单抗(Rituximab)、2H7/Ocrelizumab、泽娃灵(Zevalin)/Ibrizumomab、Arzerra/Ofatumumab(CD20)、HLL2/依帕珠单抗(Epratuzumab)、Inotuzomab(CD22)、赛尼哌(Zenapax)/达克珠单抗(Daclizumab)、舒莱(Simulect)/巴利昔单抗(Basiliximab)(CD25)、赫赛汀(Herceptin)/曲妥珠单抗(Trastuzumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)(Her2/ERBB2)、麦罗塔(Mylotarg)/吉妥珠单抗(Gemtuzumab)(CD33)、Raptiva/依法珠单抗(Efalizumab)(Cd11a)、爱必妥(Erbitux)/西妥昔单抗(Cetuximab)(EGFR,表皮生长因子受体)、IMC-1121B(VEGF受体2)、Tysabri/那他珠单抗(Natalizumab)(α4β1和α4β7整联蛋白的α4亚基)、阿昔单抗(ReoPro/Abciximab)(gpIIb-gpIIa和αvβ3整联蛋白)、OrthocloneOKT3/Muromonab-CD3(CD3)、Benlysta/Belimumab(BAFF)、Tolerx/Oteliximab(CD3)、Soliris/Eculizumab(C5补体蛋白质)、Actemra/Tocilizumab(IL-6R)、Panorex/依决洛单抗(Edrecolomab)(EpCAM,表皮细胞黏附分子)、CEA-CAM5/Labetuzumab(CD66/CEA,癌胚抗原)、CT-11(PD-1,程序性死亡-1T细胞抑制受体,CD-d279)、H224G11(c-Met受体)、SAR3419(CD19)、IMC-A12/Cixutumumab(IGF-1R,胰岛素样生长因子1受体)、MEDI-575(PDGF-R,血小板衍生生长因子受体)、CP-675、206/Tremelimumab(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)、RO5323441(胎盘生长因子或PGF)、HGS1012/Mapatumumab(TRAIL-R1)、SGN-70(CD70)、Vedotin(SGN-35)/Brentuximab(CD30)和ARH460-16-2(CD44)。
用本文报道的方法获得的缀合物可以用于制备用于治疗例如肿瘤学疾病、心血管疾病、感染性疾病、炎性疾病、自身免疫病、代谢性(例如内分泌)疾病或神经(例如神经变性)疾病的药物。这些疾病的示例性非限制性实例是阿尔茨海默病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞急性和慢性淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、多毛细胞白血病、急性和慢性髓细胞白血病、T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、癌(如口腔、胃肠道、结肠、腹部、肺道、肺、乳腺、卵巢、前列腺、子宫、子宫内膜、宫颈、膀胱、胰腺、骨、肝、胆囊、肾、皮肤和睾丸癌)、黑色素瘤、肉瘤、神经胶质瘤、皮肤癌、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、Sydenham舞蹈症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、Henoch-Schonlein紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu动脉炎、Addison病、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多发性动脉炎、强硬性脊柱炎、Goodpasture综合征、血栓闭塞性脉管炎、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、Wegener肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病或致纤维性肺泡炎。
已知许多细胞表面标志及其配体。例如,已报道癌细胞至少表达以下细胞表面标志和/或配体之一,包括但不限于:碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3(A33抗体特异性抗原)、ART-4、B7、Ba-733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CD1-1A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-l-α、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、GROB、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、HMGB-1、低氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2或la、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌黏蛋白、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活蛋白、存活蛋白-2B、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管发生标志、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、癌基因标志和癌基因产物(参见例如Sensi等,Clin.Cancer Res.12(2006)5023-5032;Parmiani等,J.Immunol.178(2007)1975-1979;Novellino等,Cancer Immunol.Immunother.54(2005)187-207).
因此,识别特异性细胞表面受体(包括其配体)的抗体可以用于特异性和选择性靶向和结合许多/大量疾病相关细胞表面标志。细胞表面标志是例如与信号发放事件或配体结合相关的定位在细胞表面(例如疾病相关细胞)的多肽。
在一个实施方案中,为了治疗癌症/肿瘤,产生靶向肿瘤相关抗原的多特异性结合分子/双特异性抗体,该肿瘤相关抗原如Fleisher(编辑),"The Clinical Biochemistryof Cancer",第347页(American Association of Clinical Chemists(1979))中的Herberman,"Immunodiagnosis of Cancer"中及US 4,150,149、US 4,361,544和US 4,444,744中报道的那些。
关于肿瘤相关抗原(TAA)的报道包括Mizukami等,(Nature Med.11(2005)992-997);Hatfield等,(Curr.Cancer Drug Targets 5(2005)229-248);Vallbohmer等,(JClin.Oncol.23(2005)3536-3544);和Ren等,(Ann.Surg.242(2005)55-63),每篇文献在此就所鉴定的TAA引入作为参考。
在疾病涉及淋巴瘤、白血病或自身免疫障碍时,靶向的抗原可以选自:CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、CXCR4、B7、MUC1或la、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纤连蛋白、癌基因、癌基因产物(例如c-met或PLAGL2)、CD66a-d、坏死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。
已知许多抗两种不同靶标的双特异性抗体,该两种不同靶标如BCMA/CD3;HER家族的不同抗原的组合(EGFR、HER2、HER3);CD19/CD3;IL17RA/IL7R;IL-6/IL-23;IL-1-β/IL-8;IL-6或IL-6R/IL-21或IL-21R;第一特异性针对选自Lewis x、Lewis b和Lewis y结构、Globo H结构、KH1、Tn抗原、TF抗原和黏蛋白的糖类结构、CD44、糖脂和糖苷神经鞘脂(如Gg3、Gb3、GD3、GD2、Gb5、Gm1、Gm2、唾液酰基四糖神经酰胺(sialyltetraosylceramide))的抗原的糖表位,第二特异性针对选自EGFR、HER2、HER3和HER4的ErbB受体酪氨酸激酶;GD2与选自T淋巴细胞NK细胞、B淋巴细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、间充质干细胞、神经干细胞的免疫细胞相关的第二抗原结合部位的组合;ANG2/VEGF;VEGF/PDGFR-β;血管内皮生长因子(VEGF)受体2/CD3;PSMA/CD3;EPCAM/CD3;选自VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、FLT3、c-FMS/CSF1R、RET、c-Met、EGFR、Her2/neu、HER3、HER4、IGFR、PDGFR、c-KIT、BCR、整联蛋白和MMP的抗原与选自VEGF、EGF、PIGF、PDGF、HGF和血管生成素的水溶性配体的组合;ERBB-3/C-MET;ERBB-2/C-MET;EGF受体1/CD3;EGFR/HER3;PSCA/CD3;C-MET/CD3;ENDOSIALIN/CD3;EPCAM/CD3;IGF-1R/CD3;FAPALPHA/CD3;EGFR/IGF-1R;IL 17A/F;EGF受体1/CD3和CD19/CD16。
b)毒性剂
毒性药物部分包括:(i)化疗剂,其可以作为微管抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂发挥作用;(ii)蛋白质毒素,其可以通过酶活性发挥作用;和(iii)放射性同位素。
示例性毒性药物部分包括但不限于美登木素生物碱(maytansinoid)、auristatin、多拉司他汀(dolastatin)、单端孢霉烯(trichothecene)、CC1065、加利车霉素(calicheamicin)及其他烯二炔类抗生素、紫杉烷(taxane)、蒽环类抗生素(anthracycline)、及其立体异构体、等构物、类似物或衍生物。
蛋白质毒素包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链(Vitetta等,Science,238(1987)1098)、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、香石竹毒蛋白蛋白质、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、(多花)白树毒蛋白、米托洁林(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯(WO 93/21232)。
c)包含放射性同位素的螯合剂
治疗性放射性同位素包括32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212B、212Pb及Lu的放射性同位素。
放射性同位素或其他标记可以以已知方式掺入(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57;"Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy"Chatal,CRC Press 1989)。碳14标记的3-甲基二乙烯三胺五乙酸1-异硫氰基苄酯(MX-DTPA)是用于将放射性核素缀合至复合物的示例性螯合剂(WO 94/11026)。
d)标记(标签,label)
非分选酶基序部分可以是标记。可以使用可以共价附着至分选酶氨基酸序列的任何标记部分(参见例如Singh等(2002)Anal.Biochem.304:147-15;Harlow E.和Lane,D.(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.;Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents forProtein Modification,第2版CRC Press,Boca Raton,Fla.)。标记可以发挥功能来:(i)提供可检测信号;(ii)与第二标记相互作用来修饰由该第一或第二标记提供的可检测信号,例如以提供FRET(荧光共振能量转移);(iii)通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数影响迁移率,例如电泳迁移率或细胞通透性;或(iv)提供捕获部分,如生物素。
包含半抗原化标记的缀合物可以用于诊断测定,例如用于检测目的抗原在具体细胞、组织或血清中的表达。对于诊断应用,将使用双特异性抗体,其中第一结合特异性结合靶标,第二结合特异性结合半抗原化标记。半抗原通常将用可检测部分标记。有许多标记可用,这些标记通常分为以下类别:
(a)放射性同位素(放射性核素),如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。放射性同位素标记的缀合物可以用于靶向报道分子的成像实验。可以使用Current Protocols inImmunology,(1991)1和2卷,Coligen等编辑Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs中所述的技术,用结合、螯合或以其他方式络合放射性同位素金属的配体试剂标记抗原(半抗原)。可以络合金属离子的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics,Dallas,Tex.)。放射性核素可以经与本文报道的复合物络合而靶向(Wu等,NatureBiotechnology 23(9)(2005)1137-1146)。用放射性核素标记复合物进行受体靶标成像,可以通过检测和定量复合物或对应的治疗性抗体在肿瘤组织中的进行性累积来提供途径激活的标志(Albert等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8:1207-1210)。
金属-螯合剂复合物适合作为用于成像实验的标志(US 2010/0111856;US 5,342,606;US 5,428,155;US 5,316,757;US 5,480,990;US 5,462,725;US 5,428,139;US 5,385,893;US 5,739,294;US 5,750,660;US 5,834,456;Hnatowich等,J.Immunol.Methods65(1983)147-157;Meares等,Anal.Biochem.142(1984)68-78;Mirzadeh等,BioconjugateChem.1(1990)59-65;Meares等,J.Cancer(1990),Suppl.10:21-26;Izard等,BioconjugateChem.3(1992)346-350;Nikula等,Nucl.Med.Biol.22(1995)387-90;Camera等,Nucl.Med.Biol.20(1993)955-62;Kukis等,J.Nucl.Med.39(1998)2105-2110;Verel等.,J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670;Camera等,J.Nucl.Med.21(1994)640-646;Ruegg等,Cancer Res.50(1990)4221-4226;Verel等,J.Nucl.Med.44(2003)1663-1670;Lee等,Cancer Res.61(2001)4474-4482;Mitchell等,J.Nucl.Med.44(2003)1105-1112;Kobayashi等Bioconjugate Chem.10(1999)103-111;Miederer等,J.Nucl.Med.45(2004)129-137;DeNardo等,Clinical Cancer Research 4(1998)2483-90;Blend等,CancerBiotherapy&Radiopharmaceuticals 18(2003)355-363;Nikula等J.Nucl.Med.40(1999)166-76;Kobayashi等,J.Nucl.Med.39(1998)829-36;Mardirossian等,Nucl.Med.Biol.20(1993)65-74;Roselli等,Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals,14(1999)209-220)。
(b)荧光标记,如稀土螯合剂(铕螯合剂);荧光素类型,包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素;罗丹明类型,包括TAMRA;丹磺酰;丽丝胺;花菁;藻红蛋白;德克萨斯红;及其类似物。可以用例如Current Protocols in Immunology,上文中所公开的技术将荧光标记缀合至抗原(半抗原)。荧光染料和荧光标记试剂包括可从Invitrogen/Molecular Probes(Eugene,Oregon,USA)和Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,Ill.)购得的那些。
检测标记如荧光染料和化学发光染料(Briggs等"Synthesis of FunctionalisedFluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids,"J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1(1997)1051-1058)提供了可检测信号,通常可用于标记,尤其是具有以下特性:(i)标记的缀合物应以低背景产生非常高的信号,使得可以在无细胞和基于细胞的测定二者中选择性检测小量缀合物;和(ii)标记的缀合物应光稳定,使得可以观察、监测和记录荧光信号而无显著的光漂白。对于涉及标记的缀合物与膜或细胞表面(尤其是活细胞)的细胞表面结合的应用,标记应(iii)具有良好的水溶性,以达到有效缀合浓度和检测灵敏度;和(iv)对活细胞无毒性,以便不破坏细胞的正常代谢过程或引起细胞提前死亡。
(c)多种酶-底物标记可用或已公开(参见例如US 4,275,149)。酶通常催化可以用多种技术测量的生色底物的化学改变。例如,酶可以在底物中催化可通过分光光度计测量的颜色变化。备选地,酶可以改变底物的荧光或化学发光。化学发光底物通过化学反应变为电子激发态,然后可以发射可以测量(用例如化学发光计)的光或贡献能量给荧光受体。酶标记的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶;US 4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶体等。Methods in Enzym.(J.Langone&IT Van Vunakis编辑),Academic Press,New York,73(1981)147-166中的O'Sullivan等"Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay"中描述了用于将酶缀合至多肽的技术。
酶-底物组合的实例(US 4,275,149;US 4,318,980)包括,例如:
(i)以过氧化氢酶为底物的辣根过氧化物酶(HRP),其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB));
(ii)以对硝基苯磷酸酯为生色底物的碱性磷酸酶(AP);和
(iii)具有生色底物(例如对硝基苯基-(3-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(4-甲基伞形基-(3-D-半乳糖苷酶))的3-D-半乳糖苷酶((3-D-Gal)。
本文报道的标记缀合物可以用于任何已知的测定方法,如ELISA、竞争结合测定、直接和间接夹心测定和免疫沉淀测定(Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques(1987)第147-158页,CRC Press,Inc.)。
本文报道的标记缀合物可用作多种生物医学和分子成像方法和技术的成像生物标志和探针,如:(i)MRI(磁共振成像);(ii)MicroCT(计算机化断层扫描);(iii)SPECT(单光子发射计算机化断层扫描);(iv)PET(正电子发射断层扫描)Tinianow,J.等,NuclearMedicine and Biology,37(3)(2010)289-297;Chen等,Bioconjugate Chem.15(2004)41-49;US 2010/0111856;(v)生物发光;(vi)荧光;和(vii)超声。免疫闪烁显像是成像方法,其中对动物或人患者施用放射性物质标记的缀合物,并采集缀合物在体内定位部位的图像(US 6,528,624)。成像生物标志可以作为正常生物学过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指示物客观地测量和评价。生物标志可以属于几种类型:0型标志是疾病的天然历史标志,与已知的临床指数纵向相关,例如类风湿性关节炎中滑液炎症的MRI评估;I型标志按照作用机制捕获干预的作用,即使该机制可与临床结果不相关;II型标志作为替代终点发挥作用,其中生物标志的变化或来自生物标志的信号预测临床收益来“验证”目标反应,如类风湿性关节炎中通过CT测量的骨侵蚀。成像生物标志因此可以提供关于以下的药效学(PD)治疗信息:(i)靶蛋白的表达;(ii)治疗剂与靶蛋白的结合,即选择性;和(iii)清除率和半衰期药代动力学数据。体内成像生物标志相对于基于实验室的生物标志的优势是:非侵入性处理、可定量、整体评估、重复给药和评估(即多个时间点)及从临床前(小动物)至临床(人)结果的潜在可转移效应。对于一些应用,生物成像取代了临床前研究中的动物实验或使临床前研究中的动物实验数目最小化。
肽标记方法众所周知。参见Haugland(2003)Molecular Probes Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.;Brinkley(1992)Bioconjugate Chem.3:2;Garman,(1997)Non-Radioactive Labeling:A PracticalApproach,Academic Press,London;Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2;Glazer等Chemical Modification of Proteins.Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology(T.S.Work和E.Work编辑)American Elsevier Publishing Co.,NewYork;Lundblad,R.L.和Noyes,C.M.(1984)Chemical Reagents for ProteinModification,I和II卷,CRC Press,New York;Pfleiderer,G.(1985)"ChemicalModification of Proteins",Modern Methods in Protein Chemistry,H.Tschesche编辑,Walter DeGruyter,Berlin and New York;及Wong(1991)Chemistry of ProteinConjugation and Cross-linking,CRC Press,Boca Raton,Fla.);DeLeon-Rodriguez等,Chem.Eur.J.10(2004)1149-1155;Lewis等,Bioconjugate Chem.12(2001)320-324;Li等,Bioconjugate Chem.13(2002)110-115;Mier等Bioconjugate Chem.16(2005)240-237。
e)结合对
间接检测系统包括例如检测试剂,例如用bioaffine结合对的第一配偶体标记检测抗体。适宜的结合对的实例有半抗原或抗原/抗体,生物素或生物素类似物如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素/亲和素或链霉抗生物素蛋白,糖/凝集素,核酸或核酸类似物/互补核酸,及受体/配体,例如类固醇激素受体/类固醇激素。优选的第一结合对成员包括半抗原、抗原和激素。尤其优选的是半抗原,如地高辛和生物素及其类似物。通常例如通过上文提到的标记来标记这种结合对的第二配偶体(例如抗体、链霉抗生物素蛋白等),以允许直接检测。
接头
术语“接头”指可用于将第一部分与第二部分缀合(连接)的双功能或多功能部分。可以用具有两种反应性功能的接头方便地制备连接的缀合物。
在一个实施方案中,接头具有这样的反应性部位,该反应性部位具有可与存在于分选酶氨基酸序列中的亲核基团反应的亲电子基团。有用的亲电子基团包括但不限于另一巯基、马来酰亚胺和卤乙酰胺基团(参加例如Klussman等,Bioconjugate Chemistry 15(4)(2004)765-773的第766页中的缀合方法)。
巯基反应官能团的实例包括但不限于巯基、马来酰亚胺、α-卤乙酰基、活化酯(如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯)、酸酐、酰基氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
接头可以包含将分选酶氨基酸序列连接至非分选酶基序部分的氨基酸残基。该氨基酸残基可以形成二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单位。氨基酸残基包括那些天然存在的,以及非天然存在的氨基酸类似物,例如瓜氨酸或β-氨基酸,例如β-丙氨酸,或ω-氨基酸,如4-氨基丁酸。
在另一实施方案中,该接头具有这样的反应性官能团,该官能团具有可与存在于分选酶氨基酸序列中的亲电子基团反应的亲核基团。有用的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子可以与分选酶氨基酸序列中的亲电子基团反应,与分选酶氨基酸序列形成共价键。接头上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸和芳基酰肼。抗原(半抗原)上的亲核基团提供了用于附着至接头的方便位点。
通常,可以通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备肽型接头。这类肽键可以例如按照肽化学领域公知的液相合成法(E.Schroder和K.Lubke"ThePeptides",1卷(1965)76-136,Academic Press)制备。
在另一实施方案中,可以用调节溶解性或反应性的基团取代该接头。例如,带电荷的取代基如磺酸(SO3 -)或铵或聚合物如PEG可以提高试剂的溶解性,便于接头试剂与抗原(半抗原)或药物部分的偶联反应,或便于取决于所利用的合成途径的偶联反应。
本文报道的包含非分选酶基序部分的缀合物明确考虑但不限于用以下接头试剂制备的复合物:BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(succinimidyl-(4-vinylsulfone)benzoate),且包括双马来酰亚胺试剂:DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3和BM(PEO)4,其可从Pierce Biotechnology,Inc.购得。双马来酰亚胺试剂允许以顺次或同时的方式将例如巯基附着至含巯基的药物部分、标记或接头中间体。除马来酰亚胺外可与例如巯基反应的其他官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
示例性接头包括具有马来酰亚胺延伸基团和对-氨基苄基甲氨酰(PAB)自降解间隔基团的缬氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接头试剂,及具有马来酰亚胺延伸单元和对-氨基苄基自降解间隔基团的phe-lys(Mtr)二肽接头试剂。
半胱氨酸巯基是亲核基团,能够与接头试剂和非分选酶基序部分或分选酶氨基酸序列上包括以下的亲电子基团反应形成共价键:(i)活性酯,如NHS酯、HOBt酯、卤甲酸和酰基卤;(ii)烷基和苄基卤,如卤乙酰胺;(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团;和(iv)二硫化物,包括吡啶基二硫化物,经硫化物交换。半抗原化化合物上的亲核基团包括但不限于:能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键的胺、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸和芳基酰肼基团。
IV.重组方法
任何多肽,例如本文报道的突变分选酶以及包含分选酶识别序列或分选酶受体序列的单链抗原结合多肽(如scFv、scFab或darpin)或多链抗原结合多肽(如dsFv或Fab)都可以从真核细胞(例如HEK293细胞、CHO细胞)的上清表达和纯化。多肽是分离的多肽还是包含在多聚或异聚实体中没有关系。
适合用于克隆或表达/分泌编码多肽的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如,尤其是在不需要糖基化时,可以在细菌中产生多肽(参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523,Charlton,Methods in Molecular Biology 248(2003)245-254(B.K.C.Lo,(编辑),Humana Press,Totowa,NJ),描述在大肠杆菌(E.coli.)中表达抗体片段)。表达后,可以从可溶性级分中的细菌细胞糊分离或可以从所谓包含体(且可以增溶并重折叠为生物活性形式)的不溶性级分分离多肽。然后可以进一步纯化多肽。
除原核生物外,诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适合用于编码多肽的载体的克隆或表达宿主,包括糖基化途径已“人源化”,导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株(参见例如Gerngross,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414和Li等,Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
适合用于表达糖基化多肽的宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已鉴定了许多杆状病毒株,其可以与昆虫细胞结合使用,尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可以用植物细胞培养物作为宿主(参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
可以用脊椎动物细胞作为宿主。例如,可以使用适应悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是COS-7细胞系(SV40转化的猴肾CV1细胞);HEK293细胞系(人胚肾细胞);BHK细胞系(幼仓鼠肾);TM4小鼠支持细胞系(例如Mather,Biol.Reprod.23(1980)243-251中所述的TM4细胞);CVl细胞系(猴肾细胞);VERO-76细胞系(非洲绿猴肾细胞);HELA细胞系(人宫颈癌细胞);MDCK细胞系(犬肾细胞);BRL 3A细胞系(buffalo大鼠肝细胞);W138细胞系(人肺细胞);Hep G2细胞系(人肝细胞);MMT 060562细胞系(小鼠乳腺肿瘤细胞);TRI细胞系(例如描述于Mather等,Anal.N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中);MRC5细胞系;和FS4细胞系。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括CHO细胞系(中国仓鼠卵巢细胞),包括DHFR阴性CHO细胞系(参见例如Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216);及骨髓瘤细胞系,如Y0、NS0和Sp2/0细胞系。某些适合用于多肽产生的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,Antibody Engineering 248(2004)255-268(B.K.C.Lo,(编辑),Humana Press,Totowa,NJ)。
提供以下实施例和序列来辅助理解本发明,本发明的真正范围在所附权利要求书中给出。应理解,可在所示方法中进行修改而不背离本发明的精神。
V.实施例
重组DNA技术
按Sambrook,J.等,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,纽约,1989中所述用标准方法来操作DNA。分子生物学试剂按厂家说明书使用。
基因和寡核苷酸合成
在Geneart GmbH(Regensburg,德国)通过化学合成制备希望得到的基因区段。将合成的基因片段克隆入大肠杆菌质粒进行繁殖/扩增。通过DNA测序验证所克隆的基因片段的DNA序列。备选地,通过退火化学合成的寡核苷酸或通过PCR组装短的合成DNA片段。各寡核苷酸由metabion GmbH(Planegg-Martinsried,德国)制备。
基本/标准哺乳动物表达质粒描述
为了表达希望得到的基因/蛋白质(例如全长抗体重链、全长抗体轻链或在其N端含有寡聚甘氨酸的Fc链),使用含有以下功能元件的转录单位:
-包含内含子A的来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV);
-人重链免疫球蛋白5’非翻译区(5’UTR);
-鼠免疫球蛋白重链信号序列;
-待表达的基因/蛋白质(例如全长抗体重链);和
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH pA)。
除包含所希望的基因的表达单元/盒外,基本/标准哺乳动物表达质粒包含:
-允许此质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点;和
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
蛋白质测定
使用根据多肽氨基酸序列计算的摩尔消光系数,通过测定280nm光密度(OD)来测定纯化多肽的蛋白质浓度。
实施例1
分选酶表达质粒的产生
除可溶性分选酶表达盒外,用于在HEK293细胞中瞬时表达可溶性分选酶的表达质粒包含允许此质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
可溶性分选酶的转录单位包含以下功能元件:
-包含内含子A的来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV);
-人重链免疫球蛋白5’非翻译区(5’UTR);
-鼠免疫球蛋白重链信号序列;
-纯化标记编码核酸;
-分选酶编码核酸;和
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH pA)。
成熟野生型可溶性分选酶的氨基酸序列是:
(SEQ ID NO:11)。
本文报道的突变分选酶的氨基酸序列是:
其中下划线残基突变为丝氨酸。可选地,还可以突变黑体残基之一。
纯化标记具有氨基酸序列MRGSHHHHHHGS(SEQ ID NO:51)。
实施例2
瞬时表达和分析表征
通过瞬时转染培养在F17培养基(Invitrogen Corp.)中的HEK293细胞(人胚肾细胞系293衍生)来进行重组产生。对于转染,使用“293-Fectin”转染试剂(Invitrogen)。转染按照厂家说明书中的说明进行。转染后三至七(3-7)天收集细胞培养上清。将上清保存于低温(例如-80℃)。
Meissner,P.等,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出了关于在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息。
使用根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数,通过测量280nm光密度(OD)来测定蛋白质浓度。通过存在和缺乏还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)情况下的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色来分析纯度。
实施例3
文库构建和表达
按Dennig,A.等(PLoS ONE 6(2011)e26222)所述进行同时多位点饱和(OminiChange)。按Wong,T.S.等(Nucl.Acids Res.32(2004)e26)所述进行EpPCR(序列饱和诱变,SeSam)。用在应突变的位置具有NNK的引物进行单位点饱和。用表达系统在4x酵母培养基中表达突变分选酶。因此,接种200μl并在37℃过夜孵育。用20μl此培养物接种200μl含IPTG的4x酵母培养基来诱导分选酶表达。37℃7小时后,将培养物与甘油混合至12.5%终浓度并保存于-20℃。
实施例4
用分选酶活性测定进行文库筛选
对于下文列出的方法,通过将葡萄糖脱氢酶作为报道酶与分选酶氨基酸基序(LPETG(SEQ ID NO:22))融合并用此作为第一底物,可以光度测定分选酶介导的酶促缀合/偶联反应的活性。使用第二底物生物素化寡聚甘氨酸或寡聚丙氨酸(亲核体)。在将分选酶加至含有第一和第二底物的溶液时,通过分选酶介导的第一和第二底物的缀合形成缀合物,该缀合物是生物素化报道酶。该生物素化报道酶可以用链霉抗生物素蛋白包被的多孔微量滴定板回收。在加入报道酶的底物时,可以通过光密度的变化来检测产物。
将纯化的分选酶与其底物(即含有LPETG基序的葡萄糖脱氢酶(20μM)和含有N端甘氨酸的生物素衍生物(20μM))混合在含有200mM NaCl的50mM Tris缓冲液pH 7.5中。37℃孵育反应混合物2小时。通过加入10至40倍过量的抑制缓冲液(50mM Tris、pH 7.5、200mMNaCl、10mM CaCl2、5mM碘乙酰胺)终止反应。5000x g离心终止的反应混合物10分钟。将上清(50μL)加至100μL含有200mM NaCl、10mM CaCl2的50mM Tris缓冲液(pH 7.5),加至链霉抗生物素蛋白包被的多孔微量滴定板上,并在30℃、200转/分钟孵育30分钟。然后洗涤多孔微量滴定板5次,每次使用300μL洗涤缓冲液(50mM Tris、pH 7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mg/mL BSA、0.1%Triton X-100)。向孔中加入150μL测试缓冲液(0.2M柠檬酸钠、pH 5.8、0.3g/L 4-亚硝基苯胺、1mM CaCl2、30mM葡萄糖)。
在5分钟的时期内在620nm测量报道酶的动力学。报道酶的活性与所固定的酶的量成比例,所固定的酶的量与生物素化酶的量成比例,生物素化酶的量与分选酶的活性成比例。
实施例5
Km值估计(低底物浓度下的活性)
分选酶突变体的Km值估计
用高和低底物浓度测定裂解物中突变体的活性。计算商数(低底物浓度活性/高底物浓度活性)并与突变体的亲本相比较。商数越高表示突变体Km越低。
对于LPKTG:低:4μM,高:20μM
对于GGGG:低:0.5μM,高:20μM
实施例6
分选酶变体稳定性测定
所筛选的突变体的稳定性估计
在不进行和进行预加热处理(30分钟,60-65℃)的情况下测定裂解物中突变体的稳定性。计算商数(加热处理后的活性/加热处理前的活性)并与突变体的亲本相比较。商数越高表示突变体稳定性越高。
Claims (12)
1.多肽,其由SEQ ID NO: 02、SEQ ID NO: 03、SEQ ID NO: 04、SEQ ID NO: 05、SEQ IDNO: 06、SEQ ID NO: 07、SEQ ID NO: 08、SEQ ID NO: 09或SEQ ID NO: 10的氨基酸序列组成。
2.多肽,其由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的多肽,其中所述多肽是分选酶。
4.根据权利要求2所述的多肽,其中所述多肽是分选酶。
5.用于产生多肽的方法,其包括将以下一起孵育并由此产生多肽的步骤:
i) 含有分选酶识别序列的第一多肽;
ii) 含有分选酶受体序列的第二多肽;和
iii) 权利要求1至4中任一项的多肽。
6.权利要求5的方法,其包括以下步骤:
- 将以下一起孵育
i) 含有氨基酸序列LPXTG (SEQ ID NO: 21)的第一多肽,其中X可以是任意氨基酸残基;
ii) 含有选自I)在其N端为甘氨酰化合物、II)在其N端为寡聚甘氨酸、III)在其N端为半胱氨酸氨基酸残基,后跟随1至3个甘氨酸氨基酸残基、或IV)在其N端5个氨基酸残基内有赖氨酸氨基酸残基的分选酶受体序列的第二多肽;
iii) 权利要求1至4中任一项的分选酶/多肽;和
- 从反应混合物回收多肽并由此产生所述多肽。
7.权利要求5或6的方法,其中所述方法用于酶促缀合两种多肽。
8.权利要求5或6的方法,其中第一多肽在其C端20个氨基酸残基内包含氨基酸序列LPXTG (SEQ ID NO: 21),其中X可以是任意氨基酸残基。
9.权利要求8的方法,其中第一多肽在其C端20个氨基酸残基内包含氨基酸序列LPETG(SEQ ID NO: 22)。
10.权利要求5或6的方法,其中第二多肽在其N端具有氨基酸序列GG (SEQ ID NO:23)、GGG (SEQ ID NO: 24)、CGG (SEQ ID NO: 25)或KGG (SEQ ID NO: 26)。
11.权利要求5或6的方法,其中第一多肽和第二多肽相互独立地选自抗体可变结构域、抗体重链Fab片段、抗体Fc区、标签、毒素和非分选酶多肽。
12.权利要求5或6的方法,其中第一多肽或第二多肽是标记。
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