JP2019516353A - 改善されたソルターゼ - Google Patents
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Abstract
Description
ソルターゼA(SrtA)は、タンパク質を細菌細胞壁に共有結合で付着させる膜結合型酵素である。SrtA基質上の特異的な認識モチーフは、LPXTGであり、酵素は、残基トレオニンとグリシンとの間で切断する。ペプチドグリカン上の認識モチーフは、ペンタグリシンモチーフである。N末端のトリグリシンモチーフ、そしてジグリシンモチーフですら、SrtA反応を支持するのに十分であることが示されている(Clancy, K. W. et al., Peptide science 94(2010)385-396(非特許文献1))。その反応は、チオエステルアシル酵素中間体を通して進行し、それが、オリゴグリシンからのアミン求核剤の攻撃によって分離され、ペプチドグリカンがタンパク質基質に共有結合で連結され、SrtAが再生される。化学合成されたペプチドを組換え発現されたタンパク質に共有結合でコンジュゲートするため、SrtAを使用することが可能である。
(i)変異D160S、K196S、およびE106G(SEQ ID NO:03);
(ii)変異D160S、K196S、およびN107W(SEQ ID NO:04);
(iii)変異D160S、K196S、およびF144L(SEQ ID NO:05);
(iv)変異D160S、K196S、およびG167E(SEQ ID NO:06);
(v)変異D160S、K196S、N107W、およびF144L(SEQ ID NO:07);
(vi)変異D160S、K196S、F144L、およびG167E(SEQ ID NO:08);
(vii)変異D160S、K196S、N107W、およびG167E(SEQ ID NO:09);または
(viii)変異D160S、K196S、N107W、F144L、およびG167E(SEQ ID NO:10)
を含む。
(i)変異D101S、K137S、およびE47G(SEQ ID NO:13);
(ii)変異D101S、K137S、およびN48W(SEQ ID NO:14);
(iii)変異D101S、K137S、およびF85L(SEQ ID NO:15);
(iv)変異D101S、K137S、およびG108E(SEQ ID NO:16);
(v)変異D101S、K137S、N48W、およびF85L(SEQ ID NO:17);
(vi)変異D101S、K137S、F85L、およびG108E(SEQ ID NO:18);
(vii)変異D101S、K137S、N48W、およびG108E(SEQ ID NO:19);または
(viii)変異D101S、K137S、N48W、F85L、およびG108E(SEQ ID NO:20)
を含む。
・(i)アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:21)を含み、Xが任意のアミノ酸残基であり得る、第1のポリペプチド、
(ii)(I)N末端のグリシニル化合物、
(II)N末端のオリゴグリシン、
(III)N末端のシステインアミノ酸残基に続く1〜3個のグリシンアミノ酸残基、または
(IV)N末端の5個のアミノ酸残基内のリジンアミノ酸残基
より選択されるソルターゼアクセプター配列を含む、第2のポリペプチド、
(iii)本明細書において報告されるソルターゼ/ポリペプチド
を共にインキュベートする工程;および
・反応混合物からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む。
本発明は、SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を有する黄色ブドウ球菌の全長野生型ソルターゼAのアミノ酸残基D160およびK196、またはSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する黄色ブドウ球菌の短縮型ソルターゼAの残基D101およびK137を、それぞれ、両方ともセリンに変異させることによって、ソルターゼの酵素活性を改善することができるという所見に少なくとも一部分基づく。
本明細書において使用されるように、与えられたアミノ酸位置は、言及されたアミノ酸配列におけるそれぞれの(連続的な)位置である。
からなるタグの群より選択される。
のコード配列(フレーム1リーディング)を開示するアクセッション番号AF162687の下で、またはSEQ ID NO:46:
のコード配列を開示するアクセッション番号WP_000759359.1の下で、寄託されている。
改善された触媒特性を有する黄色ブドウ球菌ソルターゼAが、本明細書において報告される。野生型黄色ブドウ球菌ソルターゼAに変異D160SおよびK196Sを導入することによって(SEQ ID NO:01からSEQ ID NO:02へ)、酵素特性が改善され得ることが見出された。本明細書において報告される変異型ソルターゼは、本明細書において報告されるアッセイを使用して、黄色ブドウ球菌由来の野生型ソルターゼAの酵素活性の約5倍である酵素活性を有する。6個の変異を有する当技術分野において公知の参照変異体は、本明細書において報告されるアッセイにおいて約4倍増加した活性しか有していなかった。黄色ブドウ球菌の野生型ソルターゼAの短縮バージョンにおけるそれぞれの位置における同一の変異も、本明細書において包含される。アミノ酸配列の長さ(即ち、残基の数)の違いのため、アミノ酸配列における異なる絶対的な位置を有するが、短縮バージョンにおいても、同一のアミノ酸残基を変異させることができる。
(i)変異D160S、K196S、およびE106G(SEQ ID NO:03);
(ii)変異D160S、K196S、およびN107W(SEQ ID NO:04);
(iii)変異D160S、K196S、およびF144L(SEQ ID NO:05);
(iv)変異D160S、K196S、およびG167E(SEQ ID NO:06);
(v)変異D160S、K196S、N107W、およびF144L(SEQ ID NO:07);
(vi)変異D160S、K196S、F144L、およびG167E(SEQ ID NO:08);
(vii)変異D160S、K196S、N107W、およびG167E(SEQ ID NO:09);または
(viii)変異D160S、K196S、N107W、F144L、およびG167E(SEQ ID NO:10)
を含む。
200mM NaClを含有している50mMトリス緩衝液pH7.5において、精製されたソルターゼまたはそのバリアントを、LPETGモチーフを含有しているグルコースデヒドロゲナーゼ(20μM)およびN末端グリシンを含有しているビオチン誘導体(20μM)と混合した。反応混合物を37℃で2時間インキュベートした。10〜40倍過剰の阻害緩衝液(50mMトリス、pH7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mMヨードアセトアミド)の添加によって、反応を停止した。停止された反応混合物を、5000×gで10分間遠心分離した。上清(50μL)を、200mM NaCl、10mM CaCl2を含む100μLの50mMトリス緩衝液(pH7.5)に添加し、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチタイタープレートに添加し、200rpmで30℃で30分間インキュベートした。その後、マルチタイタープレートを、各300μLの洗浄緩衝液(50mMトリス、pH7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mg/mL BSA、0.1%トリトンX-100)によって5回洗浄した。それに、150μLの試験緩衝液(0.2Mクエン酸ナトリウム、pH5.8、0.3g/L 4-ニトロソアニリン、1mM CaCl2、30mMグルコース)を添加した。
インビボでは共有結合で会合していない2種の要素を含む共有結合コンジュゲートを、酵素ソルターゼ、特に、ソルターゼAを使用することによって、インビトロで入手することができる。
ソルターゼ認識配列LPXTG(SEQ ID NO:21)は、ポリペプチドのアミノ酸配列内に直接含まれない場合、治療剤(薬)、毒性薬剤(例えば、ドキソルビシンもしくは百日咳毒素のような毒素)、フルオロフォア(例えば、フルオレセインもしくはローダミンのような蛍光色素)、イメージング用もしくは放射線治療用の金属のキレート剤、ペプチド性もしくは非ペプチド性の標識、タグ、またはポリエチレングリコールの様々な異性体のようなクリアランス修飾剤、第3の成分と結合するペプチド、またはもう一つの炭水化物、または親油性薬剤、または結合対のメンバー(例えば、ビオチン)にコンジュゲートされてもよい。コンジュゲーションは、直接的であってもよいしまたは介在するリンカーを介したものであってもよい。
薬物部分は、抗体、細胞傷害性もしくは細胞分裂阻害性の化合物のような、治療効果を有する任意の化合物、部分、または基であり得る。
毒性薬物部分には、(i)微小管阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはDNA挿入剤として機能し得る化学療法剤;(ii)酵素的に機能し得るタンパク質毒素;および(iii)放射性同位体が含まれる。
治療用放射性同位体には、32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212B、212Pb、およびLuの放射性同位体が含まれる。
非ソルターゼモチーフ部分は、標識であり得る。ソルターゼアミノ酸配列に共有結合で付着し得る任意の標識部分が使用され得る(例えば、Singh et al.(2002)Anal.Biochem.304:147-15;Harlow E.and Lane,D.(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification,2nd ed.CRC Press,Boca Raton,Fla.を参照すること)。標識は、(i)検出可能なシグナルを提供するか;(ii)第1もしくは第2の標識によって提供される検出可能なシグナルを修飾するため、例えば、FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)を与えるため、第2の標識と相互作用するか;(iii)電荷、疎水性、形、もしくはその他の物理的パラメータによって、移動度、例えば、電気泳動移動度もしくは細胞透過性に影響を与えるか、または(iv)ビオチンなどのキャプチャー部分を提供するよう、機能し得る。
(i)過酸化水素が色素前駆物質(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩(TMB))を酸化する、過酸化水素を基質として用いる西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP);
(ii)発色性基質としてパラニトロフェニルリン酸を用いるアルカリホスファターゼ(AP);および
(iii)発色性基質(例えば、p-ニトロフェニル-(3-D-ガラクトシダーゼ)または蛍光発生性基質4-メチルウンベリフェリル-(3-D-ガラクトシダーゼを用いる(3-D-ガラクトシダーゼ((3-D-Gal)。
間接検出系には、例えば、検出試薬、例えば、検出抗体が、バイオアフィニティ結合対の第1のパートナーによって標識されるものが含まれる。適当な結合対の例は、ハプテンまたは抗原/抗体、ビオチン、またはアミノビオチン、イミノビオチン、もしくはデスチオビオチンのようなビオチン類似体/アビジンまたはストレプトアビジン、糖/レクチン、核酸または核酸類似体/相補的核酸、および受容体/リガンド、例えば、ステロイドホルモン受容体/ステロイドホルモンである。好ましい第1の結合対メンバーには、ハプテン、抗原、およびホルモンが含まれる。特に好ましいのは、ジゴキシンおよびビオチンならびにそれらの類似体のようなハプテンである。そのような結合対の第2のパートナー、例えば、抗体、ストレプトアビジン等は、一般的には、例えば、前述のような標識によって、直接検出を可能にするために標識される。
「リンカー」という用語は、第1の部分を第2の部分とコンジュゲート(連結)するために使用され得る二官能性または多官能性の部分を意味する。2種の反応官能性を有するリンカーを使用して、連結されたコンジュゲートを便利に調製することができる。
例えば本明細書において報告される変異ソルターゼのような任意のポリペプチド、および、ソルターゼ認識配列またはソルターゼアクセプター配列を含む、scFv、scFab、もしくはdarpinのような単鎖抗原結合ポリペプチド、またはdsFvもしくはFabのような多鎖抗原結合ポリペプチドを、発現させ、真核細胞(例えば、HEK293細胞、CHO細胞)の上清から精製することができる。ポリペプチドが、単離されたポリペプチドであるか、それとも多量体またはヘテロマーの要素に含まれているかは、重要でない。
Sambrook,J. et al., Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されているような標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用された。
所望の遺伝子セグメントは、Geneart GmbH(Regensburg,Germany)において、化学合成によって調製された。合成された遺伝子断片を、増大/増幅のため、大腸菌プラスミドへクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。あるいは、化学合成されたオリゴヌクレオチドのアニーリングによって、またはPCRによって、短い合成DNA断片を組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、metabion GmbH(Planegg-Martinsried,Germany)によって調製された。
所望の遺伝子/タンパク質(例えば、全長抗体重鎖、全長抗体軽鎖、またはN末端にオリゴグリシンを含有しているFc鎖)の発現のため、以下の機能要素を含む転写単位を使用する:
−イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P-CMV)由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−発現させるべき遺伝子/タンパク質(例えば、全長抗体重鎖)、ならびに
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
−大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、および
−大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子。
ポリペプチドのアミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、280nmにおける光学濃度(OD)を決定することによって、精製されたポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。
ソルターゼのための発現プラスミドの生成
HEK293細胞における可溶性ソルターゼの一過性発現のための発現プラスミドは、可溶性ソルターゼ発現カセットに加えて、大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、および大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。
−イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P-CMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−精製タグをコードする核酸、
−ソルターゼをコードする核酸、ならびに
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
一過性発現および分析的特徴決定
F17培地(Invitrogen Corp.)において培養されたHEK293細胞(ヒト胎児腎臓細胞株293由来)の一過性トランスフェクションによって、組換え作製を実施した。トランスフェクションのため、「293-Fectin」トランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用した。製造業者の説明書に指定されたように、トランスフェクションを実施した。細胞培養上清をトランスフェクションの3〜7日後に採集した。上清を低温(例えば、-80℃)で保管した。
ライブラリーの構築および発現
同時多重部位飽和(OminiChange)を、Dennig,A.ら(PLoS ONE 6(2011)e26222)によって記載されたように行った。EpPCR(配列飽和変異誘発、SeSam)を、Wong,T.S.ら(Nucl.Acids Res.32(2004)e26)によって記載されたように行った。単一部位飽和を、変異させるべき位置においてNNKを有するプライマーを使用して行った。変異型ソルターゼを、4×酵母培地において発現系を使用して発現させた。従って、200μlを接種し、37℃で一晩インキュベートした。この培養物のうちの20μlを、ソルターゼ発現を誘導するためのIPTGを含有している200μlの4×酵母培地に接種するために使用した。37℃で7時間の後、培養物を、12.5%の最終濃度でグリセリンと混合し、-20℃で保管した。
ソルターゼ活性アッセイによるライブラリースクリーニング
以下に概説されるような方法によって、レポーター酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼをソルターゼアミノ酸モチーフ(LPETG(SEQ ID NO:22))と融合させ、第1の基質としてこれを使用することによって、ソルターゼによって媒介される酵素的コンジュゲーション/カップリング反応の活性を測光法で決定することができる。第2の基質として、ビオチン化されたオリゴグリシンまたはオリゴアラニンが使用される(求核剤)。ソルターゼが、第1および第2の基質を含有している溶液に添加される時、第1および第2の基質のソルターゼによって媒介されるコンジュゲーションによって、ビオチン化されたレポーター酵素であるコンジュゲートが形成される。ビオチン化されたレポーター酵素は、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチタイタープレートを使用して回収され得る。レポーター酵素の基質が添加される時、光学濃度の変化によって生成物を検出することができる。
Km値推定(低い基質濃度における活性)
ソルターゼ変異体のKm値の推定
溶解物中の変異体の活性を、高い基質濃度および低い基質濃度で決定した。商(低い基質濃度における活性/高い基質濃度における活性)を計算し、変異体の親と比較した。より高い商は、より低いKmを有する変異体を表す。
ソルターゼバリアントの安定性の決定
スクリーニングされた変異体の安定性の推定
熱による前処理(30分、60〜65℃)を行わない場合および行った場合の溶解物中の変異体の活性を決定した。商(熱処理後の活性/熱処理前の活性)を計算し、変異体の親と比較した。より高い商は、より高い安定性を有する変異体を表す。
Claims (10)
- SEQ ID NO:11のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であり変異D101SおよびK137Sを含むアミノ酸配列を含むソルターゼであって、ソルターゼによって媒介されるカップリング反応において、SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有するソルターゼより高い酵素活性を有する、ソルターゼ。
- A2E、A2T、E47G、N48W、F85L、およびG108E(SEQ ID NO:11に基づく位置)からなる変異の群より選択される1個または複数個の変異をさらに含む、請求項1記載のソルターゼ。
- (i)変異D101S、K137S、およびE47G;
(ii)変異D101S、K137S、およびN48W;
(iii)変異D101S、K137S、およびF85L;
(iv)変異D101S、K137S、およびG108E;
(v)変異D101S、K137S、N48W、およびF85L;
(vi)変異D101S、K137S、F85L、およびG108E;
(vii)変異D101S、K137S、N48W、およびG108E;または
(viii)変異D101S、K137S、N48W、F85L、およびG108E
を含む、請求項1または2記載のソルターゼ。 - アミノ酸配列が、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、またはSEQ ID NO:20である、請求項1〜3のいずれか一項記載のソルターゼ。
- (i)ソルターゼ認識配列を含む第1のポリペプチド、
(ii)ソルターゼアクセプター配列を含む第2のポリペプチド、および
(iii)請求項1〜4のいずれか一項記載のソルターゼ
を共にインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ポリペプチドを作製するための方法。 - ・(i)アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:21)を含み、Xが任意のアミノ酸残基であり得る、第1のポリペプチド、
(ii)(I)N末端のグリシニル化合物、
(II)N末端のオリゴグリシン、
(III)N末端のシステインアミノ酸残基に続く1〜3個のグリシンアミノ酸残基、または
(IV)N末端の5個のアミノ酸残基内のリジンアミノ酸残基
より選択されるソルターゼアクセプター配列を含む、第2のポリペプチド、
(iii)請求項1〜4のいずれか一項記載のソルターゼ
を共にインキュベートする工程;および
・反応混合物からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、請求項5記載の方法。 - 第1のポリペプチドが、C末端の20個のアミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:21)を含み、Xが任意のアミノ酸残基であり得る、請求項5または6記載の方法。
- 第1のポリペプチドが、C末端の20個のアミノ酸残基内にアミノ酸配列LPETG(SEQ ID NO:22)を含む、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
- 第2のポリペプチドが、N末端にアミノ酸配列GG(SEQ ID NO:23)、GGG(SEQ ID NO:24)、CGG(SEQ ID NO:25)、またはKGG(SEQ ID NO:26)を有する、請求項5〜8のいずれか一項記載の方法。
- 第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが、相互に独立に、抗体可変ドメイン、抗体重鎖Fab断片、抗体Fc領域、タグ、標識、毒素、および非ソルターゼポリペプチドからなる群より選択される、請求項5〜9のいずれか一項記載の方法。
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