ES2589769T3 - Proteínas modificadas con alta afinidad por quelatos de DOTA - Google Patents

Abstract

Una proteína modificada multiespecífica que comprende una primera secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina, una proteína de andamiaje, o una porción de unión al antígeno de una inmunoglobulina o una proteína de andamiaje que se une específicamente a una molécula diana, y una segunda secuencia de aminoácidos de un fragmento variable monocatenario (scFv) que se une específicamente a un quelato de metal que comprende DOTA, o uno de sus variantes activos, en la que el scFv comprende la secuencia de aminoácidos de los restos 1- 244 de SEQ ID NO:11 en la figura 3, según se representa en SEQ ID NO:12.

Description

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DESCRIPCION

Protemas modificadas con alta afinidad por quelatos de DOTA Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de prioridad de la solicitud provisional de EEUU n.° 61/156.467, que se presento el 27 de febrero, 2009.

Declaracion sobre la investigacion con fondos federales

Esta invencion se realizo con el apoyo gubernamental con el numero de subvencion 5-R01-CA101830 concedida por the National Institutes of Health. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invencion.

Antecedentes

Las estrategias de tratamiento del cancer tradicionales incluyen quimioterapia, radiacion con haces externos y extirpacion quirurgica. La quimioterapia no es espedfica y se dirige a todas las celulas que se dividen con rapidez, lo cual produce efectos secundarios indeseables. Ademas, los tumores pueden volverse resistentes a la quimioterapia. La radiacion con haces externos y la cirugfa solo pueden dirigirse a sitios tumorales conocidos, y no pueden tratar metastasis indetectables. En la ultima decada, el desarrollo de productos terapeuticos de anticuerpos dirigidos ha conseguido unas mejoras significativas en el tratamiento del cancer, aumentando el numero de respuestas al tratamiento de pacientes para varios tipos de canceres (Hudson y Souriau, Nat. Med., 9:129-134, 2003; Nayeem y Khan, Curr. Protein Pept. Sci., 7:165-170, 2006; Tassev y Cheung, Expert Opin. Biol., Ther., 9:341-353, 2009; y Weiner et al., Lancet, 373:1033-1040, 2009).

Sumario

En un aspecto, la presente invencion proporciona una protema modificada multiespedfica que comprende una primera secuencia de aminoacidos de una inmunoglobulina, una protema de andamiaje, o una porcion de union al antfgeno de una inmunoglobulina o una protema de andamiaje que se une espedficamente a una molecula diana, y una segunda secuencia de aminoacidos de un fragmento variable monocatenario (scFv) que se une espedficamente a un quelato de metal que comprende DOTA, o uno de sus variantes activos, en la que el scFv comprende la secuencia de aminoacidos de los restos 1-244 de SEQ ID NO:11 en la figura 3, segun se representa en SEQ ID NO:12.

La presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de los inventores de protemas de union a quelatos- DOTA versatiles. Las protemas pueden ser monoespedficas y unirse selectivamente solo a un quelato de metal que comprende DOTA (o un variante activo de DOTA) y un ion metalico. Como alternativa, las protemas pueden ser multiespedficas y se unen a una diana celular o molecular y a un quelato de metal que comprende DOTA (o un variante activo de DOTA) complejado con un ion metalico. La diana puede variar y las dianas adecuadas incluyen antfgenos del cancer, moleculas pequenas (por ejemplo, un compuesto farmacologicamente activo o inerte, tal como un tinte u otro marcador) y protemas expresadas por una celula eucariota, una celula procariota o un virus. Aunque se emplea el termino “antigeno” o "antfgenos" cuando se describen ciertas moleculas diana, hay que senalar que no se preve ni se requiere una respuesta inmunologica concreta. En otras palabras, no es necesario que un antfgeno del cancer sea un antfgeno que normalmente suscite una respuesta inmunologica concreta en un sujeto; cualquier molecula, incluyendo una protema o un antfgeno del cancer basado en una protema, que sea expresada exclusivamente por una celula cancerosa o una celula tumoral puede actuar como diana para las protemas modificadas de la presente invencion. De modo similar, cualquier molecula, incluyendo una protema o una molecula basada en una protema que sea expresada exclusivamente por un patogeno (por ejemplo, una celula bacteriana, una celula fungica, una celula de un parasito o un virus) puede actuar como diana para una protema modificada de la invencion, independientemente de la respuesta inmunologica que esta molecula pueda o no suscitar en un sujeto tras la infeccion.

Por consiguiente, la invencion incluye una protema modificada (por ejemplo, un scFv, otra inmunoglobulina, o una protema de andamiaje) que se une espedficamente a (a) un quelato de metal que comprende DOTA, o uno de sus variantes activos, y un metal (sin unirse tambien a una segunda diana), o (b) una molecula diana y un quelato de metal que comprende DOTA, o uno de sus variantes activos, y un metal. En cualquiera de los casos, la protema modificada puede ser una protema que se une al quelato de metal con alta afinidad (por ejemplo, una afinidad que sea mayor que la afinidad con la cual el anticuerpo representado en SEQ ID NO:1 se une al quelato de metal). La SEQ ID NO:1 es:

QVKLQESGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT DYGVHWVRQS PGKGLEWLGV 50

IWSGGGTATY AAFISRLNIY KDNSKNQVFF EMNSLQANDT AMYYCARRGS 100

YPYNYFDVWG QGTTVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSQAWTQ ESALTTSPGE 150

TVTLTCRSST GAVTTSNYAN WVQEKPDHLF TGLIGGNNNR PPGVPARFSG 200

SLIGDKAALT IAGTQTEDEA IYFCALWYSN HWVFGGGFRG RVLG 244

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Los restos 1-119 representa la cadena pesada variable del anticuerpo denominado 2D12.5 (Corneillie et al., J. Am. Chem. Soc., 125:15039-15048, 2003); los restos 120-134 representan un conector; y los restos 135-244 representan la cadena ligera variable de 2D12.5.

La protema modificada puede ser una protema de fusion que incluye una primera secuencia de aminoacidos que se une a la diana, y una segunda secuencia de aminoacidos que se une al quelato de metal. Como alternativa, la protema modificada puede configurarse como un complejo de protemas (por ejemplo, un complejo de protemas unido covalentemente, tal como un anticuerpo tetramero o un anticuerpo biespedfico, tal como el bsAb que se indica como ejemplo a continuacion). La primera secuencia de aminoacidos o la segunda secuencia de aminoacidos puede ser una inmunoglobulina, una protema de andamiaje, o una porcion de union al antfgeno de una inmunoglobulina o una protema de andamiaje, y estos tipos de protemas de union puede ser incorporados de diversa forma, segun se hayan configurado las protemas modificados como una protema de fusion, un complejo de protemas, o una de sus combinaciones (por ejemplo, cuando una o mas protemas de fusion forman complejos entre sf o con otros polipeptidos). Cuando se emplea una inmunoglobulina, o su porcion de union al antigeno, esta puede ser una inmunoglobulina humana o humanizada, o su porcion de union al antfgeno (por ejemplo, de la clase IgG).

Las inmunoglobulinas incluyen anticuerpos estructurados de modo convencional (por ejemplo, una IgG tetramera convencional), sus fragmentos de union al antfgeno, y anticuerpos monocatenarios. Cuando la protema modificada es o incluye un scFv que se une a un quelato de metal, la secuencia puede ser al menos o aproximadamente 70% (por ejemplo, al menos o aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) identica a SEQ ID NO:1, excluyendo el conector en los restos 120-134. Los inventores especifican que la identidad puede calcularse excluyendo al conector, puesto que muchas secuencias de conectores diferentes son adecuadas y pueden ser incorporadas cuando la protema modificada es o incluye un scFv. La secuencia de una protema modificada de la presente invencion, o una secuencia que se encuentre en su interior, tambien puede mostrar un cierto porcentaje de identidad con las regiones de cadena ligera o pesada de SEQ ID NO:1. Por ejemplo, una protema modificada de la presente invencion puede incluir una secuencia de aminoacidos que sea al menos o aproximadamente 70% (por ejemplo, al menos o aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) identica a la region de cadena ligera o a la region de cadena pesada de SEQ ID NO:1. Las protemas derivadas de SEQ ID NO:1 se pueden denominar como “maduradas por afinidad.”

Cuando la secuencia de una protema modificada de la presente invencion, o una secuencia que se encuentre en su interior, es similar a SEQ ID NO:1, ciertos restos aminoacidos pueden permanecer invariables. Por ejemplo, los restos aminoacidos que se ponen en contacto con el quelato de metal pueden ser invariables (por ejemplo, los restos que se corresponden con una o mas de las posiciones 35, 50, 52, 53, 98, 99, 101, 104, 168, 170, y 186 de SEQ ID NO:1 pueden ser invariables). Cuando se introducen mutaciones, estas pueden encontrarse a menos de aproximadamente 5 A de un resto aminoacido que se pone en contacto con el quelato de metal, dentro de la segunda cubierta o dentro de la tercera cubierta. De modo mas espedfico, las protemas modificadas de la presente pueden incluir una mutacion en una posicion que se corresponde con una o mas de las siguientes posiciones dentro de SEQ ID NO:1: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 47, 48, 49, 51, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 69, 71, 73, 94, 95, 96, 97, 102, 103, 105, 106, 107, 164, 165, 166, 167, 169, 171, 172, 184, 185, 188, 189, 223, 224, 225, 226, 228, 229, 230, 231, 233, y 234. Como alternativa, o ademas, las protemas modificadas (por ejemplo, un scFv o un complejo de protemas o protema que contiene scFv) pueden incluir una mutacion en una posicion que se corresponde con una o mas de las siguientes posiciones dentro de SEQ ID NO:1: 60, 61,63, 71, 80, 88, 108, 139, 157, 165, 187, 230, y 234. Como alternativa, o ademas, las protemas modificadas de la presente pueden incluir una mutacion en una posicion que se corresponde con una o mas de las siguientes posiciones dentro de SEQ ID NO:1: 100, 187, y 227.

De forma mas espedfica, las protemas modificadas de la presente pueden incluir la secuencia de los restos 1-244 de los mutantes C8.2-1 (SEQ ID NO:4); C8.2-2 (SEQ ID NO:6); C8.2-3 (SEQ ID NO:8); C8.2-4 (SEQ ID NO:10); C8.2-5 (SEQ ID NO:12); C8.2-6 (SEQ ID NO:14); C7.3 1 (SEQ ID NO:16); C7.3 2 (SEQ ID NO:18); C7.3 3 (SEQ ID NO:20); C7.3 4 (SEQ ID NO:22); C7.3 5 (SEQ ID NO:24); C7.3 6 (SEQ ID NO:26); C7.3 7 (SEQ ID NO:28); C7.3 8 (SEQ ID NO:30); C7.3 9 (SEQ ID NO:32); o C7.3 10 (SEQ ID NO:34).

En realizaciones concretas, las protemas modificadas pueden configurarse en un formato de anticuerpo biespedfico (bsAb), en el que un scFv, opcionalmente estabilizado con enlaces disulfuro, se condensa con el C-terminal de una o ambas de las cadenas ligeras de una IgG. Asf, las protemas modificadas pueden ser anticuerpos bifuncionales (o biespedficos) de IgG-scFv. Cuando se incluyen anticuerpos tetrameros en las protemas modificadas de la presente, las protemas se pueden denominar como moleculas “similares a inmunoglobulinas” o “similares a IgG”. Cuando se expresan en celulas de mairnfero y se purifican (por ejemplo, mediante una cromatograffa de protema A de una sola etapa), los anticuerpos biespedficos pueden conservar las afinidades parentales de cada dominio de union, mostrar una estabilidad similar a IgG, y mostrar una eliminacion de la sangre y un transporte dirigido al tumor similar a IgG in vivo. Los estudios de los inventores han demostrado que la cadena ligera de una IgG puede extenderse con un scFv sin afectar a la funcion y la estabilidad de la IgG. Asf, este formato puede actuar como plataforma estandarizada para la construccion de anticuerpos biespedficos funcionales.

Cualquiera de las protemas descritas en la presente puede incluir una region Fc, que puede prolongar la semivida en circulacion de la protema. Las moleculas similares a IgG que conservan dominios Fc tambien pueden provocar una mayor captacion tumoral que la observada con fragmentos mas pequenos. Las protemas modificadas tambien

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pueden incluir una mutacion que atenue la glicosilacion (por ejemplo, una mutacion en el sitio de glicosilacion N- enlazado (por ejemplo, la posicion 88 de SEQ ID NO:1) o cerca de este y/o restos cistema que facilitan la formacion de un enlace disulfuro (por ejemplo, las protemas pueden ser o pueden incluir una inmunoglobulina (por ejemplo, un scFv) que tenga un resto cistema en el fragmento ligero variable (Vl) y un resto cistema en el fragmento pesado variable (Vh), de modo que se forma un enlace disulfuro entre una cadena pesada y una cadena ligera de la inmunoglobulina). Cuando las protemas modificadas incluyen variantes de SEQ ID nO:1, el resto cistema en Vl puede estar colocado en la posicion 179, y el resto cistema en Vh puede encontrarse en la posicion 111.

Las protemas modificadas descritas en la presente pueden unirse a un quelato de metal con una Kd de aproximadamente 1 pM-1 nM (por ejemplo, aproximadamente 1-10 pM; 1-100 pM; 5-50 pM; 100-500 pM; o 500 pM-1 nM).

El ion metalico dentro del quelato de metal unido por la protema modificada puede ser un cation metalico trivalente y puede ser un radionuclido (por ejemplo, un emisor beta, un emisor alfa o un emisor de electrones de baja energfa) o un metal paramagnetico. De modo mas espedfico, el ion metalico puede ser actinio, bismuto, cobre, europio, gadolinio, galio, indio (por ejemplo, 111In), lutecio (por ejemplo, 177Lu), terbio, o itrio (por ejemplo, 86Y).

El quelato de metal tambien puede estar conjugado con una molecula pequena, un tinte, biotina, un polipeptido o dextrano.

Se ha indicado anteriormente que las protemas modificadas de la invencion pueden ser protemas de fusion, en las que una primera secuencia de aminoacidos se une a una diana, y una segunda secuencia de aminoacidos se une a un quelato de metal. Cuando la diana es un antfgeno del cancer, este puede ser, sin limitacion, el antfgeno carcinoembrionario (CEA), antfgeno A33, HER-2/neu, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-1, CDK4, MUC-1, N-acetilglucosaminiltransferasa, p15, gp75, beta-catenina, ErbB2, o el antfgeno del cancer 125 (CA-125). Algunos canceres estan asociados con una infeccion vmca, bacteriana o parasitaria, y la diana tambien puede ser un antfgeno expresado por el virus, la bacteria o el parasito atacante.

A continuacion se describen mas a fondo los variantes activos de DOTA (por ejemplo, los variantes que cumplen la formula I). Un “variante activo” mostrara una union suficiente de un ion metalico para ser util en lugar de DOTA.

Tambien se encuentran dentro del alcance de la presente invencion las moleculas de acidos nucleicos que codifican toda o una porcion de las protemas modificadas descritas en la presente (por ejemplo, el acido nucleico puede codificar la primera secuencia de aminoacidos o la segunda secuencia de aminoacidos). Tambien se incluyen vectores de expresion (por ejemplo, plasmidos) que comprenden estos acidos nucleicos, y celulas hospedantes que incluyen los acidos nucleicos per se o vectores de expresion que los incluyen.

Cualquiera de las protemas modificadas de la presente puede ser formulada para la administracion como composiciones de diagnostico o terapeuticas. Cuando se configuran para fines terapeuticos, las composiciones pueden emplearse para tratar un sujeto al que se le ha diagnosticado un trastorno proliferativo (por ejemplo, cancer u otro crecimiento celular no deseado) o una enfermedad infecciosa (es decir, una enfermedad provocada por un patogeno). Por consiguiente, la presente invencion incluye metodos que comprenden una primera etapa de administrar a un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica que incluye una protema modificada segun se describe en la presente (por ejemplo, un anticuerpo biespedfico que se dirige a una celula que esta proliferando de una manera no deseada o un agente infeccioso). En una segunda etapa, se administra un radionuclido que porta un hapteno, que se dirige al virus o a la celula de interes en virtud de un sitio de union espedfica sobre la protema modificada. La primera y la segunda etapa pueden realizarse de modo secuencial, y la segunda etapa puede realizarse horas o dfas (por ejemplo, dos, tres, cuatro o mas dfas) despues de la primera etapa. Si se espera a que la protema modificada haya alcanzado la diana antes de administrar la radiacion se podnan conseguir unas dosis diana mas altas (por ejemplo, tumor) y unas dosis no espedficas mas bajas.

Los inventores tambien han desarrollado un agente de bloqueo basado en dextrano que reduce la union de DOTA a protemas modificadas residuales (por ejemplo, anticuerpos biespedficos residuales) en la sangre. Cuando se emplea este agente, los metodos de diagnostico o tratamiento descritos en la presente incluyen las etapas de administrar una protema modificada (por ejemplo, un anticuerpo biespedfico), administrar el agente de bloqueo basado en dextrano, y administrar el DOTA radiomarcado. El agente de bloqueo y las composiciones fisiologicamente aceptables que lo incluyen tambien se describen en la presente. Este agente comprende aminodextrano conjugado con DOTA. Por ejemplo, el agente de bloqueo puede ser un aminodextrano de 500 kDa conjugado con DOTA. En general, el compuesto resultante puede incluir aproximadamente 100-150 (por ejemplo, aproximadamente 130) moleculas de DOTA por dextrano.

Cualquiera de las protemas modificadas de la presente puede ser formulada para la administracion como composiciones de diagnostico o farmaceuticas. Cuando se configuran para fines terapeuticos, las composiciones pueden emplearse para tratar un sujeto al que se le ha diagnosticado un trastorno proliferativo (por ejemplo, cancer u otro crecimiento celular no deseado) o una enfermedad infecciosa. Por consiguiente, en la presente se describen metodos para administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una composicion farmaceutica que incluye una protema

modificada que se une espedficamente a una molecula diana (por ejemplo, un anffgeno del cancer o un resto expresado por un agente infeccioso) y DOTA. Asf, la composicion se dirige espedficamente a celulas dianas que estan proliferando de una manera indeseable o a un agente infeccioso dentro del sujeto. La primera secuencia de aminoacidos se dirige espedficamente a la celula o al virus, y se une espedficamente a un anffgeno expresado 5 sobre ellos. Debido a que las composiciones tambien incluyen una segunda secuencia de aminoacidos que se une espedficamente a un quelato de metal que comprende DOTA, los haptenos radiactivos administrados posteriormente se dirigen espedficamente a la celula o virus diana (a lo cuales la protema modificada ya se ha unido). Las composiciones pueden utilizarse, por ejemplo, con los emisores beta 177Lu e 90Y, MRI dirigidos con agentes de contraste macromoleculares multivalentes que contienen DOTA-Gd, y terapia de captura de neutrones 10 con 157Gd.

Cuando se configuran para fines diagnosticos, las composiciones pueden emplearse para diagnosticar un sujeto sospechoso de padecer un trastorno proliferativo (por ejemplo, cancer u otro crecimiento celular no deseado) o una enfermedad infecciosa. Las composiciones pueden emplearse para centellograffa externa en una diversidad de formas, dependiendo de la sensibilidad requerida y la localizacion de la lesion sospechosa. Los ejemplos de 15 metodos incluyen la formacion de imagenes prelocalizadas con tomograffa de emision de positrones empleando 86Y, y tomograffa computerizada de emision de un solo foton que emplea ”1In.

Las protemas modificadas tambien son utiles en esquemas de purificacion, puesto que pueden ser inmovilizadas (por ejemplo, sobre una esfera o resina utilizadas en una columna o fundamentalmente cualquier sustrato solido) y emplearse para unirse espedficamente a quelatos de DOTA.

20 Los detalles de una o mas realizaciones de la invencion se indican en los dibujos adjuntos y en la siguiente descripcion. Otras caracteffsticas, objetos y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la descripcion y los dibujos, y de las reivindicaciones.

Breve descripcion de los dibujos

La FIG. 1A y la FIG. 1B son graficas que muestran un analisis de la retencion de haptenos en tumores como funcion 25 de la afinidad de union de haptenos. Se realizaron simulaciones de PRIT suponiendo un tumor vascularizado (FIG. 1A) y una pequena micrometastasis (FIG. 1B) con parametros farmacocineticos humanos. La concentracion de hapteno en el tumor como una funcion del tiempo se represento graficamente para diversas constantes de disociacion (indicadas por flechas). La actividad acumulada para un radionuclido de 90Y se tabula para diversos valores de Kd y tambien para una kf teorica igual a cero. Las unidades de actividad acumulada son gigabecquerel 30 segundos (GBq s) para el tumor vascularizado, y megabequerel segundos (MBq s) para la micrometastasis.

La FIG. 2 muestra las estructuras qmmicas de los variantes de DOTA empleados con cationes metalicos trivalentes.

La FIG. 3 es una representacion de las secuencias de mutantes obtenidas a partir de una seleccion de maduracion por afinidad de 2D12.5 scFV (SEQ ID NO:1). 2ddsg2 es la secuencia de aminoacidos de 2D12.5 scFV con sustituciones de aminoacidos en las posiciones 88 (N88E), 111 (Q111C), y 179 (L179C) (SEQ ID NO:2). Los puntos 35 representan el mismo resto que la secuencia 2ddsg2. Diversas secuencias mutantes son: mutante C8.2-1 (representado por SEQ ID NO:3; los restos 1-244 de SEQ ID NO:3 estan representados por SEQ ID NO:4); C8.2 2

(representado por SEQ ID NO:5; los restos 1-244 de SEQ ID NO:5 estan representados por SEQ ID NO:6); C8.2 3

(representado por SEQ ID NO:7; los restos 1-244 de SEQ ID NO:7 estan representados por SEQ ID NO:8); C8.2 4

(representado por SEQ ID NO:9; los restos 1-244 de SEQ ID NO:9 estan representados por SEQ ID NO:10); C8.2 5

40 (representado por SEQ ID NO:11; los restos 1-244 de SEQ ID NO:11 estan representados por SEQ ID NO:12); C8.2 6 (representado por SEQ ID NO:13; los restos 1-244 de SEQ ID NO:13 estan representados por SEQ ID NO:14); C7.3 1 (representado por SEQ ID NO:15; los restos 1-244 de SEQ ID NO:15 estan representados por SEQ iD NO:16); c7.3 2 (representado por SEQ ID NO:17; los restos 1-244 de SEQ ID NO:17 estan representados por SEQ ID NO:18); C7.3 3 (representado por SEQ ID NO:19; los restos 1-244 de SEQ ID NO:19 estan representados por 45 SEQ ID NO:20); C7.3 4 (representado por SEQ ID NO:21; los restos 1-244 de SEQ ID NO:21 estan representados por SEQ ID No:22); C7.3 5 (representado por SEQ ID NO:23; los restos 1-244 de SEQ ID NO:23 estan representados por SEQ ID NO:24); C7.3 6 (representado por SEQ ID NO:25; los restos 1-244 de SEQ ID NO:25 estan representados por SEQ ID NO:26); C7.3 7 (representado por SEQ ID NO:27; los restos 1-244 de SEQ ID NO:27 estan representados por SEQ ID No:28); c7.3 8 (representado por SEQ ID NO:29; los restos 1-244 de SEQ 50 ID NO:29 estan representados por SEQ ID NO:30); C7.3 9 (representado por SEQ ID NO:31; los restos 1-244 de SEQ ID NO:31 estan representados por SEQ ID nO:32); C7.3 10 (representado por SEQ ID NO:33; los restos 1-244 de SEQ ID NO:33 estan representados por SEQ ID NO:34).

La FIG. 4 es una grafica que muestra los resultados de un analisis de eliminacion de la sangre de haptenos basados en 111In-DOTA.

55 La FIG. 5 es una grafica que muestra los resultados de un analisis de la estabilidad de anticuerpos biespedficos a 37°C.

La FIG. 6 es un esquema que ilustra el proceso de una radioinmunoterapia prelocalizada.

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La FIG. 7 tambien es un esquema que ilustra un PRIT con un anticuerpo bifuncional.

La FIG. 8 es un esquema que ilustra el diseno de una protema de fusion de scFv C-terminal de cadena ligera de IgG. La cadena ligera esta modificada con una fusion de scFv con el C-terminal, mientras que se conserva una cadena pesada totalmente inalterada.

Descripcion detallada

La U.S. Food and Drug Administration aprobo el primer anticuerpo monoclonal para un uso terapeutico en 1986 y aprobo el primer anticuerpo directamente radiomarcado para el tratamiento del linfoma no hodgkiniano en 2002. En este campo en expansion rapida se han identificado anticuerpos para una gran diversidad de dianas, mediante el metodo tradicional in vivo de inocular animales con un antigeno diana y seleccionar clones de hibridoma, y mediante el uso in vitro de bancos y metodos de seleccion, tales como presentacion de fagos y levaduras. Se ha empleado la evolucion dirigida empleando tecnicas de biologfa molecular, tal como PCR propensa a errores, reordenamiento de ADN y mutagenesis de saturacion, para generar diversidad, y metodos de seleccion, tal como inmunoadsorcion de fagos y clasificacion celular activada por fluorescencia, para madurar por afinidad los anticuerpos para mejorar la union en varias veces a varios ordenes de magnitud.

Se han disenado anticuerpos multiespedficos para que contengan varios sitios de union y, asf, reconocer mas de un epitopo sobre el mismo antfgeno o multiples antigenos. Aunque los anticuerpos han tenido exito en el entorno clmico para una diversidad de enfermedades, los anticuerpos multiespedficas pueden mejorar aun mas la eficacia e introducir otros mecanismos de accion terapeutica. Los anticuerpos multiespedficos se han modificado para 1) dirigir celulas tumorales a celulas efectoras inmunologicas a traves de la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC), 2) dirigirse a multiples receptores de la superficie celular asociados a tumores para bloquear la activacion del receptor y para reticular los receptores para inducir una infrarregulacion, y 3) prelocalizar celulas tumorales para la administracion de radionuclidos, farmacos y profarmacos.

Los anticuerpos biespedficos se sintetizaron por primera vez coexpresando dos anticuerpos con diferentes especificidades a traves de la conjugacion qmmica de dos anticuerpos, o sus fragmentos, o con la tecnica del hibridoma Idbrido. Las condiciones necesarias para la conjugacion qmmica pueden inactivar, desplegar o agregar el anticuerpo biespedfico. La tecnica del hibridoma Idbrido no solo produce el anticuerpo biespedfico deseado, sino que tambien produce productos no deseados procedentes del desapareamiento de las dos cadenas pesadas y las dos cadenas ligeras, y por tanto requiere complejos esquemas de purificacion. En 1996, Carter y colaboradores publicaron un metodo de boton en ojal ("knobs into holes"), en el que la interfase del dominio pesado constante 3 (CH3) se modifica en un anticuerpo parental para que tenga un resto aminoacido grande y, en el otro anticuerpo parental, para que tenga una resto aminoacido pequeno. Estas mutaciones complementarias impiden estericamente la homodimerizacion y aumentan el rendimiento de los heterodfmeros de cadena pesada, aumentando asf el rendimiento del anticuerpo biespedfico deseado. En la ultima decada se han sintetizado diferentes formatos de anticuerpos multiespedficos mediante metodos recombinantes y de “dock and lock”, que mejoran aun mas los rendimientos y la facilidad de fabricacion.

El trabajo de los inventores trata sobre protemas de union a DOTA monoespedficas, asf como protemas modificadas, tales como anticuerpos multi- o biespedficos, para aplicaciones de radioinmunoterapia prelocalizada (PRIT). La PRIT desacopla la farmacocinetica del transporte dirigido de anticuerpos y la administracion de radionuclidos, y la tecnica ha demostrado aumentar la eficacia y disminuir la toxicidad en modelo preclmicos (Kraeber-Bodere et al., J. Nucl. Med., 47:247-255, 1999; Axworthy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:1802-1807, 2000; Gautherot et al., J. Nucl. Med., 41:480-487, 2000; Pagel et al., Blood 101:2340-2348, 2003; Sharkey et al., Cancer Res., 63:354-363, 2003; Karcay et al., Clin. Cancer Res., 11:7879-7885, 2005) y en modelos clmicos (Knox et al., Clin. Cancer Res., 6:406-414, 2000; Kraeber-Bodere et al., Clin. Cancer Res., 5(10 supl.):3183s-3189s, 2006). En la PRIT convencional, el anticuerpo se administra primero y se deja que se una al receptor de la superficie diana sobre las celulas del cancer. Despues se administra un radionuclido quelado que es “capturado” por el anticuerpo retenido en el sitio del cancer. Con este proceso en dos etapas, la molecula de radionuclido pequena se difunde con rapidez a traves del cuerpo y es eliminada muy rapido, lo cual reduce significativamente la radiacion no espedfica asociada con anticuerpos directamente conjugados.

Los primeros anticuerpos biespedficos para la prelocalizacion emplearon conjugados de estreptavidina/anticuerpo y han demostrado pruebas de concepto prometedoras. Sin embargo, recientes trabajos de prelocalizacion no han empleado estreptavidina debido a su inmunogenicidad, alta captacion del rinon y problemas con la biotina endogena. Se han empleado varios formatos biespedficos que no utilizan estreptavidina para aplicaciones de prelocalizacion, que incluyen formatos de Fab y (Fab)2 qmmicamente conjugados, anticuerpos biespedficos de hibridoma hfbrido, fusiones de diacuerpos recombinantes y scFv, y "dock and lock" de tri-Fab. Las presentes protemas modificadas incluyen anticuerpos biespedficos que no solo se unen simultaneamente a una diana (por ejemplo, un antfgeno del cancer) y a un radionuclido de molecula pequena, sino que tambien conservan el dominio de union de Fc, puesto que esto producira una retencion plasmatica prolongada y, por consiguiente, una mayor penetracion del tumor. El dominio de union de Fc tambien puede provocar funciones inmunologicas secundarias que pueden incurrir en mas beneficios terapeuticos. Los inventores tambien estan interesados en un formato biespedfico que no requiere la optimizacion de la construccion para cada nuevo par de dominios de union. Este formato proporcionana una

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plataforma para construir multiples anticuerpos biespedficos que podnan utilizarse para explorar diversas dianas de antigenos tumorales y capturar una diversidad de haptenos de molecula pequena.

En la presente se presenta, entre otros, un formato de anticuerpo biespedfico similar a IgG. Esta construccion de anticuerpo biespedfico se expresa como una fusion de scFv al C-terminal de la cadena ligera de una IgG, creando un agente biespedfico con dos sitios de union a diana (por ejemplo, sitios de union a tumor) y dos sitios de captura de haptenos. Se presentan varios anticuerpos biespedficos con este formato y se demuestra que se unen simultaneamente a su respectivo antigeno de la superficie celular y hapteno soluble. Las construcciones pueden producirse en celulas de mairnfero, ser purificadas mediante una cromatograffa de protema A y mostrar una retencion de las afinidades y estabilidades parentales.

El formato biespedfico se diseno como una fusion de scFv al C-terminal de una IgG. La cadena pesada es la misma que la de una IgG1 y se subclono en el vector de expresion de mamffero gWiz (Aldevron n.° de cat. 5008) entre los sitios de restriccion PST1 y SAL1 como VH-CH1-CH2-CH3. Los dominios constantes son los de una IgG1 humana. La cadena ligera se construye como FLAG-VL-VK-(G4S)2-scFv-cmyc y se subclono en un vector de expresion de mamffero distinto, gWiz, tambien entre los sitios de restriccion PsTl y SAL1. La construccion biespedfica se expreso de modo transitorio en celulas HEK293 (Invitrogen n.° de cat. 11625-019). Las celulas HEK293 se cultivaron en matraces en una plataforma de agitacion orbital que gira a 140 rpm a 37°C, 5% de CO2. Las celulas HEK293 se subcultivaron siguiendo los protocolos del fabricante. Se realizo una cotransfeccion de los plasmidos de cadena pesada y ligera con polietilenimina (PEI) como reactivo de transfeccion. Brevemente, el dfa antes de la transfeccion, las celulas HEK293 se subcultivaron hasta una densidad celular de 0,5-0,07 x 106 celulas/ml. Aproximadamente 24 horas despues, las celulas se cultivaron hasta 1,1-1,5 x 106 celulas/ml, y se diluyeron hasta 106 celulas/ml. Se anadieron 20 |jg de cada plasmido purificado (1 mg/ml) a 760 jl de OptiPRO (Invitrogen n.° de cat. 12309-019). Se anadieron 80 jl de PEI 1 mg/ml a 720 jl de OptiPRO. Ambas disoluciones de OptiPRO se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se anadio la disolucion de ADN/OptiPRO a la disolucion de PEI/OptiPRO y se incubo durante 10 minutos mas a temperatura ambiente y despues se anadio gota a gota a 40 ml del cultivo de HEK293 a 106 celulas/ml. El sobrenadante se recogio 6-8 dfas despues de la transfeccion. Los anticuerpos se purificaron mediante una cromatograffa de protema A (Pierce n.° de cat. 22811) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Protemas modificadas: Los inventores tienden a emplear el termino “protema” para indicar polfmeros de aminoacidos mas largos o mas grandes y moleculas proteicas de multiples cadenas o de multiples unidades, y a emplear el termino “polipeptido” para indicar secuencias mas cortas o una cadena de restos aminoacidos dentro de una molecula mas grande (por ejemplo, dentro de una protema de fusion) o complejo. Sin embargo, ambos terminos pretenden describir una entidad de dos o mas subunidades de aminoacidos, analogos de aminoacidos u otros peptidomimeticos, independientemente de la modificacion postraduccional (por ejemplo, amidacion, fosforilacion o glicosilacion). Las subunidades pueden estar unidas mediante enlaces peptfdicos u otros enlaces, tales como, por ejemplo, enlaces ester o eter. El termino “aminoacido” y la expresion “resto aminoacido” se refieren a aminoacidos naturales y/o no naturales o sinteticos, que pueden isomeros opticos de la forma D o L.

Inmunoglobulinas: El primer y/o el segundo polipeptido dentro de las protemas modificadas puede ser, o puede ser parte de una inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden asumir diversas configuraciones e incluyen protemas que consisten en uno o mas polipeptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Se puede emplear el termino “inmunoglobulina” como sinonimo de “anticuerpo.”

Una inmunoglobulina puede ser un tetramero (por ejemplo, un anticuerpo que tenga dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) o una inmunoglobulina monocatenaria, y cualquiera de los polipeptidos en el tetramero o el unico polipeptido del anticuerpo monocatenario puede utilizarse como el primer y/o el segundo polipeptido de las protemas modificadas de la presente. Por consiguiente, el primer y/o el segundo polipeptido puede ser una de las dos cadenas pesadas o regiones variables de cadena pesada, o una de las dos cadenas ligeras o regiones variables de cadena ligera. Las regiones de VHC y de VLC tambien pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas “regiones determinantes de la complementariedad” (CDR), intercaladas entre las regiones de marco mas conservadas (FR). La extension de las FR y las CDR ha sido definida (vease, Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edicion, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication n.° 91-3242, 1991; y Chothia, et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987).

La cadena Vh o Vl de una inmunoglobulina tambien puede incluir toda o parte de una region constante de cadena pesada o ligera. Por ejemplo, los presentes primer y segundo polipeptido pueden estar dentro de un tetramero de inmunoglobulina de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, en los que las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina estan interconectadas, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro. La region constante de cadena pesada incluye tres dominios: CH1, CH2 y CH3. La region constante de cadena ligera esta formada por un dominio: CL. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interacciona con un antfgeno. Los polipeptidos pueden ser los presentes en inmunoglobulinas intactas de los tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (asf como sus subtipos (por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, e IgG4)), y las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser del tipo kappa o lambda. Los genes de inmunoglobulina humana reconocidos incluyen los genes de las regiones constantes kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG-i, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon, y mu, asf como la minada de genes de la region variable de inmunoglobulinas.

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Los polipeptidos dentro de las protemas modificadas de la presente invencion pueden incluir CDR procedentes de una fuente humana o no humana. El marco de la inmunoglobulina puede ser un marco humano, humanizado o no humano (por ejemplo, un marco murino modificado para disminuir la antigenicidad en seres humanos), o un marco sintetico (por ejemplo, una secuencia consenso). Las inmunoglobulinas humanizadas son inmunoglobulinas en las que los restos del marco se corresponden con secuencias de la lmea germinal humana, y las CDR se producen por recombinacion V(D)J y mutaciones somaticas. Sin embargo, las inmunoglobulinas humanizadas tambien pueden comprender restos aminoacidos no codificados en las secuencias de acidos nucleicos de inmunoglobulinas de la lmea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o espedfica de sitio ex vivo). Se ha demostrado que la mutacion somatica in vivo de genes variables humanos produce una mutacion en los restos del marco (vease Nat. Immunol., 2:537, 2001). Este anticuerpo se denomina “humano” por su fuente, a pesar de las mutaciones del marco. Los dominios variables de anticuerpos de raton tambien contienen mutaciones somaticas en los restos del marco (vease Sem. Immunol., 8:159, 1996). Por consiguiente, los ratones transgenicos que contiene el locus de Ig humano producen inmunoglobulinas que se denominan habitualmente “totalmente humanas,” aunque posean un promedio de 4,5 mutaciones del marco (Nature Genet., 15:146-156, 1997). Por tanto, el uso aceptado indica que un gen de dominio variable de anticuerpo basado en una secuencia de la lmea germinal, pero que posee mutaciones del marco introducidas, por ejemplo, mediante un proceso mutacional somatico in vivo, se denomina “humano.” Tal como se indico anteriormente, las presentes protemas modificadas incluyen las que se unen espedficamente a una diana celular y a un receptor de Fc activador, incluso si estas protemas incluyen mutaciones (por ejemplo, mutaciones dentro de la FR) y sus fragmentos u otros variantes (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios que incluyen la VLC y la VHC de un anticuerpo humano multimerico).

La expresion “porcion de union al antigeno” de una inmunoglobulina o anticuerpo (o simplemente “porcion de anticuerpo,” o “porcion”), tal como se emplea en la presente, se refiere a una porcion de una inmunoglobulina que se une espedficamente a una diana celular. Una porcion de union al antfgeno de una inmunoglobulina es, por tanto, una molecula en la que una o mas cadenas de inmunoglobulina no son de longitud completa, pero que se une espedficamente a una diana celular. Los ejemplos de fragmentos o porciones de union al antfgeno que pueden emplearse en las presentes protemas incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VLC, vHc, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos a traves de un enlace disulfuro en la region de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VHC y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VLC y VHC de un unico brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento de dAb (Ward et al., Nature, 341:544-546, 1989), que consiste en un dominio VHC; y (vi) una region determinante de la complementariedad (CDR) aislada que tiene un marco suficiente para unirse espedficamente, por ejemplo, a una porcion de union al antfgeno de una region variable. Una porcion de union al antfgeno de una region variable de cadena ligera y una porcion de union al antfgeno de una region variable de cadena pesada, por ejemplo, los dos dominios del fragmento Fv, VLC y VHC, pueden unirse, empleando metodos recombinantes, mediante un conector sintetico que permite que pueda producirse una unica cadena de protema en la que las regiones VLC y VHC se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); vease, por ejemplo, Bird et al., Science, 242:423-426, 1988; y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:58795883, 1988).

Estas porciones de anticuerpos se obtienen empleando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y las porciones se seleccionan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Un fragmento Fab puede surgir de la ruptura de un anticuerpo tetramero con papama; los fragmentos Fab' y F(ab')2 pueden generarse mediante ruptura con pepsina.

En resumen, en las protemas modificadas pueden incorporarse inmunoglobulinas monocatenarias, e inmunoglobulinas quimericas, humanizadas o injertadas con CDR, que incluyen las que presentan polipeptidos derivados de diferentes especies.

Las diversas porciones de estas inmunoglobulinas pueden unirse de modo qmmico a traves de tecnicas convencionales, o pueden prepararse como polipeptidos contiguos empleando tecnicas de modificacion genetica. Por ejemplo, pueden expresarse acidos nucleicos que codifiquen una cadena quimerica o humanizada para que produzcan un polipeptido contiguo. Vease, por ejemplo, Cabilly et al., patente de EEUU n.° 4.816.567; Cabilly et al., patente europea n.° 0.125.023 B1; Boss et al., patente de EEUU n.° 4.816.397; Boss et al., patente europea n.° 0.120.694 b1; Neuberger et al., documento WO 86/01533; Neuberger et al., patente europea n.° 0.194.276 B1; Winter, patente de EEUU n.° 5.225.539; y Winter, patente europea n.° 0.239.400 B1. Vease tambien, Newman et al., BioTechnology, 10:1455-1460, 1992, con respecto a anticuerpos injertados con CDR; y Ladner et al., patente de EEUU n.° 4.946.778; y Bird et al., Science, 242:423-426, 1988, con respecto a anticuerpos monocatenarios.

En la presente tambien se describen secuencias de acidos nucleicos (por ejemplo, ADN) que codifican cualquiera de los polipeptidos dentro de las protemas modificadas de la presente, asf como los metodos para fabricar las protemas modificadas. Por ejemplo, pueden construirse regiones variables empleando metodos de mutagenesis de PCR para alterar secuencias de aDn que codifican una cadena de inmunoglobulina, por ejemplo, utilizando metodos empleados para generar inmunoglobulinas humanizadas (vease, por ejemplo, Kanunan et al., Nucl. Acids Res., 17:5404, 1989; Sato et al., Cancer Research, 53: 851-856, 1993; Daugherty et al., Nucleic Acids Res., 19(9):2471- 2476, 1991; y Lewis y Crowe, Gene, 101: 297-302, 1991). Empleando estos u otros metodos adecuados tambien pueden producirse con facilidad variantes. En un aspecto descrito en la presente, las regiones variables clonadas

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pueden mutagenizarse y seleccionarse las secuencias que codifican los variantes con la especificidad deseada (por ejemplo, a partir de un banco de fagos; vease, por ejemplo, Krebber et al., patente de EEUU n.° 5.514.548; Hoogenboom et al., documento WO 93/06213, publicado el 1 de abril, 1993)).

Otros metodos adecuados para producir o aislar inmunoglobulinas que reconocen espedficamente una diana celular incluyen, por ejemplo, metodos que se basan en la inmunizacion de animales transgenicos (por ejemplo, ratones) capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos (vease, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, 1993; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, 1993; Lonberg et al., patente de EEUU n.° 5.545.806; Surani et al., patente de EEUU n.° 5.545.807).

Las afinidades de union de una protema modificada de la presente invencion (por ejemplo, una inmunoglobulina, una protema similar a una inmunoglobulina, o cualquier otro tipo de entidad de union descrita en la presente como util en las protemas modificadas) pueden ser determinadas con facilidad por los expertos en la tecnica, por ejemplo, mediante un analisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci., 51:660-672, 1949).

Las protemas modificadas pueden unirse a un quelato de metal con una afinidad, por ejemplo, de 10-4 M o menor, 10-7 M o menor, 10-9 M o menor, o con una afinidad subnanomolar (0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 nM o incluso menor). En un aspecto descrito en la presente, las protemas modificadas tienen una afinidad por un quelato de metal (es decir, un resto que comprende DOTA, o un variante activo de DOTA, y un ion metalico quelado) que es mayor que la afinidad con la que la inmunoglobulina (un scFv) representada por SEQ ID NO:1 se une al quelato de metal. Las afinidades de las protemas modificadas y/o el scFv de SEQ ID NO:1 pueden ser determinadas mediante cualquier metodo conocido en la tecnica para medir la afinidad (por ejemplo, citometna de flujo) y, cuando se estan comparando las afinidades de dos protemas, las respectivas afinidades pueden determinarse bajo las mismas condiciones o bajo condiciones comparables (por ejemplo, a la misma temperatura (por ejemplo, 25°C o 37°C)). Vease, por ejemplo, el artmulo de Gai y Wittrup (Curr. Opin. Struct. Biol., 17:467-473, 2007), en particular la figura 3, que compara las constantes de disociacion determinadas mediante presentacion sobre la superficie de levaduras y otros metodos, que incluyen las afinidades medidas en un sistema Biacore™. Para las protemas modificadas de la invencion, la afinidad (por ejemplo, la afinidad por un quelato de metal) esta preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 pM, por ejemplo, de aproximadamente 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10, pM, 8 pM, 5 pM, 2,5 pM, 2 pM, o 1 pM. De modo mas espedfico, la afinidad puede ser de aproximadamente 8,2 pM.

Tal como se ha indicado, cuando las protemas modificadas de la presente se derivan de SEQ ID NO:1, o incluyen una secuencia derivada de SEQ ID nO:1 (es decir, cuando las protemas modificadas son o incluyen una secuencia que muestra un alto grado de identidad con SEQ ID NO:1 (por ejemplo, al menos 70% de identidad)), la protema puede ser invariable en uno o mas restos de contacto, y variable (por ejemplo, por la inclusion de una mutacion de sustitucion) en uno o mas de los restos dentro de la segunda o tercera cubierta. Estas porciones se indican a continuacion, con respecto a SEQ ID NO:1 y con el sistema de numeracion de Kabat. La correspondiente posicion en la secuencia y el resto en esa posicion pueden mostrarse entre parentesis.

Restos de contacto (<5 Angstroms)

Cadena ligera: L32 (es la posicion 34; Y), L34 (36; N), L50 (52; G), L51 (53; N), L91 (93; W), L96 (98; W).

Cadena pesada: H35 (35; H), H50 (50; V), H52 (52; W), H53 (53; S), H95 (98; R), H96 (99; G), H97 (100; S), H98 (101; Y), H100A (104; N).

Restos de la 2° cubierta (<5 Angstroms de los restos de contacto)

Cadena ligera: L28 (es 30; T), L29 (es 31; T), L30 (es 32; S), L31 (es 33; N), L33 (es 35; A), L35 (es 37; W), L36 (es 38; V), L48 (es 50; I), L49 (es 51; G), L52 (es 54; N), L53 (es 55; N), L87 (es 89; F), L88 (es 90; C), L89 (es 91; A), L90 (es 92; L), L92 (es 94; Y), L93 (es 95; S), L94 (es 96; N), L95 (es 97; H), L97 (es 99; V), L98 (es 100; F).

Cadena pesada: H29 (es 29; L), H30 (es 30; T), H31 (es 31; D), H32 (es 32; Y), H33 (es 33; G), H34 (es 34; V), H36 (es 36; W), H37 (es 37; V), H47 (es 47; W), H48 (es 48; L), H49 (es 49; G), H51 (es 51; I), H54 (es 54; G), H55 (es 55; G), H56 (es 56; G), H57 (es 57; T), H58 (es 58; A), H60 (es 60; T), H69 (es 69; I), H71 (es 71; K), H73 (es 73; N), H91 (es 94; Y), H92 (es 95; C), H93 (es 96; A), H94 (es 97; R), H99 (es 102; P), H100 (es 103; Y), H100B (es 105; Y), H100C (es 106; F), H101 (es 107; D).

Restos de la 3a cubierta (<5 Angstroms de los restos de la 2° cubierta)

Cadena ligera: L1, L2, L3, L4, L6, L21, L22, L23, L24, L25, L26, L27, L27B, L27C, L37, L38, L42, L44, L45, L46, L47, L54, L55, L56, L62, L63, L64, L65, L66, L71, L72, L73, L85, L86, L99, L100, L101.

Cadena pesada: H2, H4, H6, H20, H21, H22, H24, H26, H27, H28, H38, H39, H44, H45, H46, H59, H61, H63, H64, H67, H68, H70, H72, H74, H75, H76, H77, H78, H79, H80, H89, H90, H102, H103, H104, H105, H106, H107.

Las protemas modificadas (por ejemplo, inmunoglobulinas, moleculas similares a inmunoglobulinas, y otras

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protemas de andamiaje) pueden modificarse para reducir o abolir la glicosilacion. Una protema (por ejemplo, una inmunoglobulina) que carece de glicosilacion puede ser una inmunoglobulina que no este glicosilada en absoluto; que no este totalmente glicosilada; o que este atipicamente glicosilada (es decir, el patron de glicosilacion para el mutante se diferencia del patron de glicosilacion de la correspondiente inmunoglobulina de tipo salvaje). Los polipeptidos de IgG pueden incluir una o mas (por ejemplo, 1, 2, o 3 o mas) mutaciones que atenuan la glicosilacion, es decir, mutaciones que produzcan un dominio CH2 de IgG que carece de glicosilacion o que no esta totalmente glicosilado o que esta atipicamente glicosilado. Las mutaciones pueden estar en el sitio de glicosilacion N-enlazado, o adyacentes a este, por ejemplo, dentro del bucle C'/E del dominio CH2. Las mutaciones en las posiciones 297, 298 y 299 de la IgG1 humana son dos ejemplos de dichas mutaciones. Las IgG mutantes tambien pueden incluir mutaciones en el dominio CH2 fuera del bucle C'/E, por ejemplo, en la posicion 290, por ejemplo, K290N, K290E, o en la posicion 326, por ejemplo, K326E.

En un aspecto, se describe un anticuerpo biespedfico que incluye una primera secuencia de aminoacidos que se une espedficamente a una molecula diana, y una segunda secuencia de aminoacidos que se une espedficamente a un quelato de metal que comprende DOTA, o uno de sus variantes activos (el quelato que porta un ion metalico, tal como un radionuclido). La primera secuencia de aminoacidos puede incluir una cadena pesada variable y/o una cadena ligera variable de una inmunoglobulina, y puede tener la estructura de una IgG tetramera convencional. La segunda secuencia de aminoacidos puede ser o incluir un scFv. El scFv puede ser al menos o aproximadamente 70% (por ejemplo, al menos 75%, 80%, 85%, 90%, o 95%) identico a SEQ ID NO:1, excluyendo el conector en los restos 120-134. El scFv dentro del anticuerpo biespedfico puede unirse espedficamente a un quelato de metal que comprende DOTA con una Kd de aproximadamente 1 pM-1 nM. Al igual que en otros aspectos descritos en la presente, la molecula diana puede ser un antfgeno del cancer o un antfgeno expresado por un virus, una celula bacteriana o un parasito. Los acidos nucleicos que codifican estos anticuerpos biespedficos tambien se describen el presente, asf como los vectores de expresion que incluyen secuencias que los codifican, y las celulas hospedantes que los contienen. Los anticuerpos biespedficos pueden emplearse en los metodos de tratamiento descritos en la presente, en los metodos de purificacion descritos en la presente, y en metodos para la fabricacion de un medicamento (por ejemplo, para el tratamiento del cancer o una enfermedad infecciosa).

Protemas de andamiaje: Como alternativa o ademas de las inmunoglobulinas, las protemas modificadas de la presente invencion pueden incluir protemas de andamiaje. Estas protemas son protemas que comparten ciertas caractensticas estructurales con las inmunoglobulinas, por ejemplo, una estructura secundaria de lamina p. Los ejemplos de protemas de andamiaje utiles incluyen las siguientes.

Dominios de fibronectina: Las protemas modificadas pueden incluir un dominio de fibronectina de tipo III (Fn3) (por ejemplo, el decimo dominio de tipo III de Fn3 humano). El Fn3 es un pequeno sandwich p estable (aproximadamente 10 kDa), con un plegamiento similar a las inmunoglobulina; tres bucles expuestos denominados bC, DE, y FG son estructuralmente analogos a las regiones determinantes de la complementariedad de anticuerpos (CDR). Los ejemplos de secuencias de fibronectina humana incluyen NP.002017.1 G1:16933542; el decimo dominio de tipo III incluye una region que se extiende desde los aminoacidos 1447 a aproximadamente 1550.

Los polipeptidos de Fn3, los monocuerpos de polipeptidos de Fn3, y los metodos para fabricar estas composiciones se describen en la patente de EEUU n.° 5.153.661. Los polipeptidos de la patente de EEUU n.° 5.153.661 pueden utilizarse en las protemas modificadas de la presente o modificarse para alterar su especificidad de union y emplearse en las protemas modificadas de la presente. En la patente de EEUU n.° 7.115.396 tambien se describen protemas que, en general, emplean un andamiaje derivado de Fn3, y pueden utilizarse para fabricar el primer y/o el segundo polipeptido dentro de los polipeptidos modificados de la presente.

Otras construcciones que se basan en el dominio de tipo III de fibronectina incluyen, por ejemplo, iMab o “monocuerpos” descritos, por ejemplo, en Koide y Koide (Methods in Molecular Biology, vol. 352: Protein Engineering Protocols, (2007), p. 95-109), y las adnectinas o trinectinas, que se seleccionan para que incluyan dos, tres o cuatro bucles que conectan las hebras en un extremo del sandwich beta, similar a las CDR de un anticuerpo.

Otros miembros de esta clase incluyen: protema 4 asociada a linfocitos T citotoxicos humanos (CTLA-4) que comprende bucles similares a CDR similares a anticuerpos que permiten la sustitucion de bucles; neocarzinostatina, un cromoprotema de union a enediina aislada a partir de Streptomyces carzinostaticus que consiste en siete hebras p en dos laminas que forman un sandwich p, una topologfa similar al plegamiento de las inmunoglobulinas; el modulo de union a carbohidratos 4-2, derivado de la xilanasa Xyn10A de Rhodothermus marinus, que tiene una estructura de sandwich p formada por 11 hebras y que no contiene enlaces disulfuro; tendamistato, un inhibidor de la a-amilasa de 74 restos procedente de Streptomyces tendae, que incluye un bucle 1 de union a a-amilasa que permite la aleatorizacion; y el barril p de la protema fluorescente verde (GFP).

Andamiajes que no son de inmunoglobulinas: Tambien pueden emplearse andamiajes que no son de inmunoglobulinas en las protemas modificadas de la invencion. Los ejemplos de andamiajes utiles que pueden modificarse para que se unan selectivamente a una diana celular o a un receptor de Fc activador incluyen las siguientes clases generales de polipeptidos.

Andamiajes que muestran una region de bucle hipervariable contigua: Las lipocalinas son polipeptidos de 160 a 180

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restos implicados en el almacenamiento o el transporte de compuestos organicos hidrofobos y/o qmmicamente sensibles. Consisten en un p barril central de ocho hebras p antiparalelas, que mantienen un conjunto de cuatro bucles hipervariables que forman el sitio de union al ligando. Los cuatro bucles hipervariables conectan las hebras p en una forma apareada en el extremo abierto de este motivo de plegamiento central. La posicion de los aminoacidos mutantes depende de la naturaleza de la diana. Generalmente, cuando se emplea una lipocalina, esta puede incluir una o mas mutaciones en la cavidad, los bucles, o ambos. Los ejemplos de miembros de la familia de la lipocalina incluyen la apolipoprotema D (ApoD) y la protema de union a acidos grasos de corazon bovina (FABP).

Bucles de un solo peptido presentados sobre una protema portadora: Los inhibidores de serina proteasas de tipo Kunitz son un grupo de pequenos inhibidores de proteasas irregulares con pocas estructuras secundarias que exponen un tramo de peptido mas o menos largo con secuencia variable. Los ejemplos de inhibidores de serina proteasas de tipo Kunitz incluyen el inhibidor de tripsina de pancreas de vaca, el inhibidor de la coagulacion D1 asociado con la lipoprotema humana, el inhibidor de inter-a tripsina humana, el inhibidor de tripsina secretora pancreatica humana (PSTI), el inhibidor del precursor de la protema p amiloide del Alzheimer (APPl), el inhibidor de tripsina derivado de la sanguijuela (LTDI), el inhibidor de tripsina de mostaza II (MTI II) y el inhibidor de proteasas periplasmico de E. coli ecotina.

Las tiorredoxinas son enzimas pequenas, muy solubles y estructuralmente robustas implicadas en el equilibrio de tiol/disulfuro citosolico de E. coli. La secuencia corta del sitio activo de Cys-Gly-Pro-Cys forma un bucle accesible al disolvente y unido por un fuerte puente disulfuro en estado oxidado y permite la insercion de tramos peptfdicos largos. Se han seleccionado aptameros de peptidos de los correspondientes bancos de bucles aleatorios.

La “familia de la knotina” comprende protemas pequenas de 25 a 35 restos, algunas de las cuales actuan como inhibidores de proteasas. Incluyen enlaces disulfuro conservados, que conducen a la topologfa de nudos ("knotted") caractenstica, y bucles de peptidos variables intercalados. Generalmente contienen una pequena lamina b antiparalela tricatenaria y un motivo de nudo de cistema que surge de tres puentes disulfuro entrelazados. Los andamiajes de knotina tambien se conocen como miniprotemas o microcuerpos. Los ejemplos de knotinas utiles incluyen el inhibidor de tripsina del pepinillo del diablo Ecballium elaterium (EETI-II), el dominio de union a celulosa C-terminal (CBD) de la celobiohidrolasa I del hongo Trichoderma reesei.

Otros ejemplos utiles de protemas de andamiaje de esta clase incluyen la defensina A de insecto, que forma una a- helice y dos cadenas p, tiene dos regiones de bucle con tolerancia para las sustituciones, y esta estabilizada por dos puentes disulfuro; el dominio PDZ, un modulo de reconocimiento de protemas implicado en redes de senalizacion, que contiene tres a-helices y cinco cadenas p; las toxinas de escorpion, por ejemplo, la caribdotoxina de Leiurus quinquestriatus hebraeus, que incluye un motivo de 37 restos que consiste en una lamina p tricatenaria antiparalela, una a-helice corta y tres puentes disulfuro estabilizantes; la protema con dedo del homeodominio de plantas (PHD), una pequena protema con un nucleo bien estructurado que contiene dos iones de cinc, no contiene puentes disulfuro y presenta dos bucles variables y flexibles que parecen tolerantes a la mutagenesis, la expansion y el injerto de bucles; y p-lactamasa de TEM-1, una protema mas grande (263 restos) que tiene un esqueleto de protema que consiste en numerosas a-helices y laminas p, y un puente disulfuro.

Interfases que se apoyan en estructuras secundarias; marcos de a-helice y laminas (3: El dominio Z, uno de los cinco dominios de haces de tres a-helices de la region de union a Fc de inmunoglobulina de la protema A estafilococica, es muy soluble, proteolftica y termicamente estable, y no contiene enlaces disulfuro. Trece restos de la superficie implicados en la union a Fc se han aleatorizado para generar los llamados aficuerpos; la afinidad y la avidez de los aficuerpos ha sido aumentada mediante reordenacion de a-helices y multimerizacion.

Los dominios repetidos de ankirina consisten en unidades estructurales repetidas de 33 restos que comprende una vuelta p, seguida de dos a-helices antiparalelas y un bucle que enlaza con la vuelta de la siguiente repeticion. Pueden emplearse protemas de repeticion de ankirina (DARPin) con hasta cuatro repeticiones entre las repeticiones de cierre de cadena N- y C-terminales para generar un polipeptido que se une selectivamente a un FcR activador. Pueden introducirse mutaciones en una serie de regiones, por ejemplo, la vuelta p, una a-helice, y la region de bucle, que representan la superficie de union bajo condiciones naturales.

Otras protemas que se encuentran dentro de esta clase incluyen la secuencia repetida consenso de protemas de repeticion ricas en leucina (familia de inhibidores de ribonucleasas de mairnfero), y las afilinas, unas protemas modificadas que comprenden dos andamiajes de protemas diferentes: Y-cristalina humana, una protema duradera de la lente ocular, y la ubiquitina humana, una pequena protema que normalmente esta implicada en la degradacion de protemas intracelulares. En esta clase tambien se incluyen las protemas de inmunidad, ejemplificadas por el andamiaje formado por a-helices de la protema de la inmunidad E7 colicina de E. coli (ImmE7), una protema de 87 restos que no contiene cistemas y se pliega en una topologfa de haces de cuatro helices (a-helices I-IV). A las a- helices I y III les siguen dos bucles; el citocromo b562, una protema de haces de cuatro helices con dos bucles que conectan el marco de a-helices; el peptido a2p8, un peptido de 38 aminoacidos que comprende una horquilla de a- helice que se deriva de las dos helices N-terminales de la protema p8MTCP1 humana (una pequena protema de 8 kDa codificada por el oncogen humano MTCP1).

Estructuras de dominios oligomericos: Esta clase de protemas incluyen protemas de multiples dominios modificadas

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que forman complejos de estructura oligomerica e interacciones multiples. Un ejemplo de esta clase son los avfmeros, tambien conocidos como maxicuerpos, protemas de multiples dominios artificiales derivadas de los dominios A humanos, puesto que aparecen en el receptor de lipoprotemas de baja densidad (LDLR). El andamiaje comprende 35 aminoacidos, de los cuales las dos terceras partes pueden ser variables, y la confirmacion se determina mediante tres enlaces disulfuro y un ion calcio complejado. Otro ejemplo de esta clase son las trinectinas, protemas homotrimericas que incluyen un dominio de lectina de tipo C (CTLD) y un modulo de trimerizacion helicoidal. Los CTLD comparten un nucleo estructural conservado, que soporta un bucle que forma el sitio de union a azucar.

Dianas

Las protemas modificadas descritas en la presente son utiles para tecnicas de clasificacion y/o purificacion y como protemas terapeuticas. Las protemas pueden unirse espedficamente a dianas celulares implicadas en una amplia gama de enfermedades o trastornos (por ejemplo, cancer). Por ejemplo, las protemas pueden unirse a protemas de la superficie celular y otros tipos de antigenos y, en virtud de su union a la superficie celular, tambien pueden unirse a una celula per se. La diana puede ser una protema u otra molecula expresada por un virus, o puede ser una diana celular. Por ejemplo, la diana puede ser una protema u otro tipo de molecula expresada por una celula que este proliferando de modo indeseable (por ejemplo, una celula cancerosa en un paciente) o por una celula bacteriana o por una celula dentro de un parasito. Cuando la diana es expresada por las celulas del propio paciente puede ser un “antfgeno del cancer” o un “antigeno asociado a tumor” (TAA), que incluyen antigenos basados en polipeptidos, carbohidratos o lfpidos. Preferiblemente, el antigeno del cancer o TAA se diferencia cualitativamente de cualquier homologo expresado en celulas normales (es decir, en celulas no afectadas por el cancer y que no estan proliferando o que proliferan de modo normal).

Los ejemplos de canceres que pueden ser tratados con las protemas modificadas incluyen, sin limitacion, canceres hematologicos, tales como leucemias y linfomas (por ejemplo, linfoma de Burkitt, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Hodgkin, y leucemia de celulas T aguda), tumores neurologicos, tales como tumores cerebrales, astrocitomas o glioblastomas, melanomas, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de cabeza y cuello, tumores gastrointestinales, tales como cancer de estomago, colon o colorrectal, cancer de Idgado, cancer pancreatico, tumores genitourinarios, tales como cancer de ovario, cancer vaginal, cancer vulval, cancer de vejiga, cancer testicular, cancer de prostata, o cancer de pene, tumores oseos, y tumores vasculares. Los ejemplos de TAA espedficos incluyen, sin limitacion, antfgeno A33, HER-2/neu, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM- 1, CDK4, MUC-1, N-acetilglucosaminiltransferasa, p15, gp75, beta-catenina, ErbB2, o antfgeno del cancer 125 (CA- 125), antfgeno carcinoembrionario (CEA), RAGE, MART (antfgeno del melanoma), MUC (mucina) (por ejemplo, MUC-1, MUC-2, etc.), tirosinasa, Pmel 17 (gp100), secuencia V del intron GnT-V (secuencia V del intron de N- acetilglucoaminiltransferasa), psm de cancer de prostata, PRAME (antfgeno del melanoma), p-catenina, EBNA (antfgeno nuclear del virus de Epstein-Barr) 1-6, p53, protema de resistencia pulmonar (LRP) Bc1-2, antfgeno espedfico de la prostata (PSA), y Ki-67. La “primera” secuencia de aminoacidos, tal como se describe en la presente, puede ser una secuencia que se une espedficamente a cualquiera de estas moleculas.

La diana tambien puede ser una molecula (por ejemplo, un antfgeno de protema) expresada por un virus, una bacteria o un parasito. Cada uno de estos patogenos puede provocar una enfermedad y, en algunos casos, la enfermedad puede ser cancer. Por ejemplo, el virus de la hepatitis B y el virus de la hepatitis C estan asociados con cancer hepatocelular; el papilomavirus humano (en particular ciertos tipos que expresan el antfgeno E6 o E7) esta asociado con el cancer cervical, vaginal, vulvar, profarmgeo, anal, y de pene; el virus del herpes simplex esta

asociado con el cancer cervical; el virus de Epstein-Barr esta asociado con el linfoma de Burkitt, el linfoma de

Hodgkin y no hodgkiniano, y canceres nasofarmgeos; el virus linfotropico de celulas T humanas 1 (HTLV1) esta

asociado con la leucemia de celulas T aguda; la bacteria Helicobacter pylori esta asociada con el cancer de

estomago; el parasito esquistosoma (Schistosoma hematobium) esta asociado con el cancer de vejiga; y la duela hepatica (Opisthorchis viverrini) esta asociada con colangiocarcinomas. Los antfgenos expresados por estos patogenos pueden ser localizados por la primera secuencia de aminoacidos de las protemas modificadas de la presente, y la segunda secuencia de aminoacidos posteriormente une un complejo de radiometal-quelato de DOTA dirigido a destruir la celula diana.

Quelatos de metal

Las protemas modificadas de la invencion se unen a quelatos de metal que incluyen DOTA (acido 1,4,7,10- tetraazaciclododecan-N,N',N",N'"-tetraacetico), o un variante activo de DOTA, y un ion metalico (que incluye radionuclidos). El DOTA es un agente quelante macrodclico que forma complejos estables con metales que son fundamentalmente irreversibles bajo condiciones fisiologicas. El DOTA tiene un peso molecular de 405 Daltons, difunde con mucha rapidez y muestra una rapida eliminacion renal. Se muestran ejemplos de DOTA y variantes de DOTA activos en la FIG. 2. Un variante de DOTA que tiene una estructura que se diferencia hasta cierto punto de la estructura de DOTA y que conserva la capacidad para actuar (por ejemplo, conserva la actividad suficiente para ser empleado para uno o mas fines descritos en la presente) es un variante activo de DOTA. Estos variantes activos incluyen compuestos de formula I:

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imagen1

o su sal farmaceuticamente aceptable; en la que:

cada X se selecciona independientemente de carboxi, -C(=O)NHRd, -P(=O)(OH)(ORd), -S(=O)OH, -S(=O)2OH, -SH, -OH, -OC(=O)NHRd, -OC(=S)NHRd, -NHC(=O)NReRf, -NHC(=S)NReRf, -NReC(=O)NHRf, y -NReC(=S)NHRf;

cada L1 es, independientemente, alquileno C1-6, alquenileno Ci-6, o alquinileno Ci-6, cada uno de los cuales esta opcionalmente sustituido con 1, 2, o 3 grupos seleccionados independientemente de halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi C1-4, haloalcoxi C1.4, alquiltio C1.4, alquilsulfinilo C1-4, alquilsulfonilo C1.4, amino, alquilamino C1.4, dialquilamino C1.4, (alquil C1-4)carbonilo, carboxi, (alcoxi C1-4)carbonilo, (alquil C1-4)carbonilamino, (dialquil C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonil-(alquil C1-4)amino, carbamilo, (alquil C1-4)carbamilo, y (dialquil C1-4)- (alquil C1-4)carbamilo;

cada L2 es independientemente un alquileno de cadena lineal C2-4, que esta opcionalmente sustituido con un grupo R1 seleccionado independientemente y que esta opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, o 4 grupos seleccionados independientemente de alquilo C1-4 y haloalquilo C1-4;

cada R1 se selecciona independientemente de H, -D1-D2-D3, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi C1-6, haloalcoxi C1.6, alquiltio C1.6, alquilsulfinilo C1.6, alquilsulfonilo C1-6, amino, alquilamino C1.6, dialquilamino C1.6, (alquil C1-4)carbonilo, carboxi, (alcoxi C1-6)carbonilo, (alquil C1-6)carbonilamino, (dialquil C1-6)carbonilamino, (alcoxi C1-6)carbonilamino, (alcoxi C1-6)carbonil-(alquil C1-6)amino, carbamilo, (alquil C1-6)carbamilo, y (dialquil C1-6)carbamilo;

cada D1 se selecciona independientemente de (arilo C6-1o)-alquilo C1.4, (heteroaril C1_g)-alquilo C1.4, (cicloalquil C3-10)- alquilo C1.4, (heterocicloalquil C2-g)-alquilo C1.4, alquileno C1.8, alquenileno C1-8, y alquinileno C1.8; en la que dichos alquileno C1.8, alquenileno C1-8, y alquinileno C1.8 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos R4 seleccionados independientemente; y en la que dichos (arilo C6-1o)-alquilo C1-4, (heteroaril C1_g)-alquilo C1.4, (cicloalquil C3_1o)-alquilo C1.4, y (heterocicloalquil C2-g)-alquilo C1.4 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos R5 seleccionados independientemente;

cada D2 esta independientemente ausente o es alquileno de cadena lineal C1-20, en la que de 1 a 6 grupos metileno no adyacentes de dicho alquileno de cadena lineal C1-20 estan cada uno opcionalmente reemplazados por un resto - D4 seleccionado independientemente, con la condicion de que al menos una unidad de metileno en dicho alquileno de cadena lineal C1-20 no esta opcionalmente reemplazado por un resto -D4; en la que dicho alquileno de cadena lineal C1-20 esta opcionalmente sustituido con uno o mas grupos seleccionados independientemente de halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alquilo C1-4, haloalquilo C1-4, alcoxi C1-4, haloalcoxi C1-4, amino, alquilamino C1-4, dialquilamino C1-4, (alquil C1-4)carbonilo, carboxi, (alcoxi C1-4)carbonilo, (alquil C1-4)carbonilamino, (dialquil C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonil-(alquil C1-4)amino, carbamilo, (alquil C1-4)carbamilo, y (dialquil C1- 4)carbamilo;

cada D3 se selecciona independientemente de H, halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alquilo C1-6, haloalquilo C1.6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo C3-14, (cicloalquil C3-14)-alquilo C1.4, heterocicloalquilo C2-14, (heterocicloalquil C2-14)-alquilo C1-4, arilo C6-14, (aril C6-14)-alquilo C1.4, heteroarilo C1.13, (heteroaril C1-13)-alquilo C1-4; en la que dichos alquilo C1.6, haloalquilo C1.6, alquenilo C2-6, y alquinilo C2-6 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos R6 seleccionados independientemente; y en la que dichos cicloalquilo C3-14, (cicloalquil C3-14)-alquilo C1.4, heterocicloalquilo C2-14, (heterocicloalquil C2-14)-alquilo C1.4, arilo C6-14, (aril C6-14)-alquilo C1.4, heteroarilo C1-13, (heteroaril C1-13)-alquilo C1.4 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos R7 seleccionados independientemente;

cada D4 se selecciona independientemente de -O-, -S-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=S)-, -NRbC(=O)NRc-, -NRbC(=S)NRc-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -S(=O)NRa-, -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=O)O-, -OC(=O)NRa-, -OC(=S)NRa, -NRbS(=O)NRc-, y - NRbS(=O)2NR0-;

cada R4 y R6 se selecciona independientemente de halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi C1-4, haloalcoxi C1.4, alquiltio C1.4, alquilsulfinilo C1-4, alquilsulfonilo C1.4, amino, alquilamino C1.4, dialquilamino C1.4, (alquil C1-4)carbonilo, carboxi, (alcoxi C1-4)carbonilo, (alquil C1-4)carbonilamino, (dialquil C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonilamino,

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(alcoxi Ci-4)carbonil-(alquil Ci-4)amino, carbamilo, (alquil Ci-4)carbamilo, y (dialquil Ci-4)carbamilo;

cada R5 se selecciona independientemente de halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alquilo C1-4, alquenilo C2-4, alquinilo C2-4, alcoxi C1-4, haloalcoxi C1-4, alquiltio C1-4, alquilsulfinilo C1-4, alquilsulfonilo C1-4, amino, alquilamino C1-4, dialquilamino C1-4, (alquil C1-4)carbonilo, carboxi, (alcoxi C1-4)carbonilo, (alquil C1-4)carbonilamino, (dialquil C1- 4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonil-(alquil C1-4)amino, carbamilo, (alquil C1-4)carbamilo, y (dialquil C1-4)carbamilo;

cada R7 se selecciona independientemente de halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1-4, heterocicloalquilo C2-7, (heterocicloalquil C2-7)-alquilo C1-4, fenilo,

(fenil)-alquilo C1-4, heteroarilo C1-7, (heteroaril C1-7)-alquilo C1-4, -ORo, -SRo, -S(=O)RP, -S(=O)2RP, -S(=O)NRsR‘, - C(=O)RP, -C(=O)ORP, -C(=O)NRsR‘, -OC(=O)RP, -OC(=O)NRsR‘<, -NRsR‘, -NRqC(=O)Rr, -NRqC(=O)ORr, - NRqc(=O)NRr, -NRqS(=O)2Rr, y -NRPS(=O)2NRsR‘; en la que dichos alquilo C1.6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1,2, 3, o 4 grupos R' seleccionados independientemente; y en la que dichos cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1.4, heterocicloalquilo C2-7, (heterocicloalquil C2-7)-alquilo C1.4, fenilo, (fenil)- alquilo C1.4, heteroarilo C1.7, (heteroaril C1-4)-alquilo C1.4 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos R" seleccionados independientemente;

cada Ra, Rb, Rc, Rd, Re, y Rf se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-6, haloalquilo C1.6, alquenilo C2-6,

alquinilo C2-6, cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1.4, heterocicloalquilo C2-7, (heterocicloalquil C2-7)-alquilo C1.4, fenilo, (fenil)-alquilo C1-4, heteroarilo C1.7, y (heteroaril C1-7)-alquilo C1.4; en la que dichos alquilo C1-6, haloalquilo C1.6, alquenilo C2-6, y alquinilo C2-6 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos Rw seleccionados independientemente; y en la que dichos cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1-4, heterocicloalquilo C2-7, (heterocicloalquil C2-7)-alquilo C1-4, fenilo, (fenil)-alquilo C1.4, heteroarilo C1.7, y (heteroaril C1-7)-alquilo C1.4 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos Rx seleccionados independientemente;

cada Ro, Rp, Rq, Rr, Rs, y R4 estan cada uno seleccionado independientemente de H, alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1.4, heterocicloalquilo C2-7, (heterocicloalquil C2-7)-alquilo C1.4, fenilo, (fenil)-alquilo C1.4, heteroarilo C1.7, y (heteroaril C1-7)-alquilo C1.4; en la que dichos alquilo C1. 6, haloalquilo C1-6, alquenilo C2-6, y alquinilo C2-6 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos Ry seleccionados independientemente; y en la que dichos cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1-4,

heterocicloalquilo C2-7, (heterocicloalquil C2-7)-alquilo C1-4, fenilo, (fenil)-alquilo C1-4, heteroarilo C1-7, y (heteroaril C1- 7)-alquilo C1.4 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos Rz seleccionados

independientemente;

cada R', Rw y Ry se selecciona independientemente de hidroxilo, ciano, nitro, alcoxi C1-4, haloalcoxi C1-4, amino, alquilamino C1-4, y dialquilamino C1-4;

y cada R", Rxy Rz se selecciona independientemente de hidroxilo, halogeno, ciano, nitro, alquilo C1-4, haloalquilo C1- 4, alcoxi C1-4, haloalcoxi C1-4, amino, alquilamino C1-4, y dialquilamino C1-4;

con la condicion de la que no se exceda la Valencia de cada atomo en los restos opcionalmente sustituidos.

El DOTA esta disponible en el mercado y ha demostrado ser seguro en seres humanos cuando esta quelado con el gadolinio y se emplea en concentraciones milimolares como agente de contraste de MRI (Bourrinet et al., Invest. Radiol., 42:63-77, 2007).

El DOTA y los variantes de DOTA se quelan con una amplia gama de metales, que incluyen metales paramagneticos y radionuclidos. El metal dentro del quelato puede ser cualquiera de una amplia gama de metales, dependiendo de la forma en que se empleara la proterna modificada. Los ejemplos de metales incluyen itrio, indio,

galio, gadolinio, europio, terbio, lutecio, cobre, bismuto, actinio y todos los metales lantanidos. Cuando el metal es un radionuclido, este puede ser un emisor p, por ejemplo, 86Y, 90Y, 186Re, 188Re, 131I, 177Lu, o 67Cu, un a emisor, por Ac, o un emisor de electrones de baja energfa, concretamente un emision Auger, por

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At,

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ejemplo, 213Bi

ejemplo, 125I, 111In o 67Ga. En general, los radionuclidos utiles incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a 90Y, '"In 67Ga, 68Ga, 1>7Lu, o 157Gd, 64Cu, 67Cu, 89Zr, 47Sc, 153Sm 16^ 16^ 166— 21^ 212- 213- 22^- 227-

6Tb, 166Tb, 166HO,

2Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac y 227Ac.

Los quelatos de metal de la invencion pueden conjugarse con uno o mas restos adicionales, por ejemplo, una molecula pequena, un polipeptido o un carbohidrato. El enlace puede realizarse, por ejemplo, a traves de uno de los carbonos en el esqueleto del anillo macrodclico. Una molecula pequena puede ser, por ejemplo, un tinte, tal como Alexa 647 o Alexa 48; biotina o un resto de biotina. Un polipeptido puede ser un oligopeptido, por ejemplo, un peptido o polipeptido terapeutico, tal como un anticuerpo, por ejemplo, un scFv que se une a una diana celular. Los ejemplos de carbohidratos incluyen dextrano, polfmeros o copolfmeros lineales o ramificados (por ejemplo, polialquileno, polietilenlisina, polimetacrilato, poliaminoacidos, poli- u oligosacaridos, dendnmeros).

Acidos nucleicos

La expresion “acido nucleico” y el termino “polinucleotido” pueden emplearse de modo intercambiable en la presente, y se refieren ambos a ARN y ADN, que incluye ADNc, ADN genomico, ADN sintetico, y ADN (o ARN) que contenga

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analogos de acidos nucleicos. Los polinucleotidos pueden tener cualquier estructura tridimensional. Un acido nucleico puede ser bicatenario o monocatenario (es decir, una hebra sentido o una hebra antisentido). Los ejemplos no limitantes de polinucleotidos incluyen genes, fragmentos de genes, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm) y sus porciones, ARN de transferencia, ARN ribosomico, ARNmc, micro-ARN, ribozimas, ADNc, polinucleotidos recombinantes, polinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas y cebadores de acidos nucleicos, asf como analogos de acidos nucleicos. En el contexto de la presente invencion, los acidos nucleicos pueden codificar una protema modificada, por ejemplo, un anticuerpo, un anticuerpo mutante o uno de sus fragmentos, o una protema de fusion o uno de sus fragmentos.

Un acido nucleico “aislado” puede ser, por ejemplo, una molecula de ADN natural, o uno de sus fragmentos, con la condicion de que al menos una de las secuencias de acidos nucleicos que normalmente se encuentra inmediatamente flanqueante con dicha molecula de ADN en el genoma natural se haya eliminado o este ausente. Asf, un acido nucleico aislado incluye, sin limitacion, una molecula de ADN que existe como una molecula separada, independiente de otras secuencias (por ejemplo, un acido nucleico sintetizado de modo qmmico, o un ADNc o un fragmento de ADN genomico producido mediante una reaccion en cadena de polimerasa (PCR) o un tratamiento con endonucleasas de restriccion). Un acido nucleico aislado tambien se refiere a una molecula de ADN que esta incorporada en un vector, un plasmido de replicacion autonoma, un virus, o en el ADN genomico de un procariota o eucariota. Ademas, un acido nucleico aislado puede incluir un acido nucleico modificado, tal como una molecula de ADN que sea parte de un acido nucleico hubrido o de fusion. Un acido nucleico que existe entre muchos (por ejemplo, docenas, o cientos a millones) otros acidos nucleicos dentro, por ejemplo, de bancos de ADNc o bancos genomicos, o cortes de gel que contengan una digestion de restriccion de ADN genomico, no es un acido nucleico aislado.

Las moleculas de acidos nucleicos aisladas pueden producirse mediante tecnicas convencionales. Por ejemplo, pueden emplearse las tecnicas de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) para obtener un acido nucleico aislado que contenga una secuencia de nucleotidos descrita en la presente, que incluye secuencias de nucleotidos que codifican un polipeptido descrito en la presente (es decir, una protema modificada). La PCR puede utilizarse para amplificar secuencias espedficas a partir de ADN, y tambien de ARN, que incluyen secuencias procedentes del ADN genomico total o del ARN celular total. Se describen diversos metodos de PCR por ejemplo en PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach y Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. En general, se emplea la informacion de secuencia de los extremos de la region de interes o mas alla de esta para disenar cebadores oligonucleotidicos que son identicos o similares en secuencia a las hebras opuestas del molde que se va a amplificar. Tambien estan disponibles diversas estrategias de PCR por las cuales pueden introducirse modificaciones de la secuencia de nucleotidos espedficas de sitio en un molde de acido nucleico (como puede ser el caso, por ejemplo, cuando se esta fabricando una protema modificada, por ejemplo, un anticuerpo, un anticuerpo mutante, o uno de sus fragmentos, o una protema de fusion o uno de sus fragmentos). Tambien pueden sintetizarse de modo qmmico acidos nucleicos aislados, como una unica molecula de acido nucleico (por ejemplo, empleando la smtesis de ADN automatica en la direccion 3' a 5' utilizando la tecnologfa de fosforamidita) o como una serie de oligonucleotidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse una o mas parejas de oligonucleotidos largos (por ejemplo, >50- 100 nucleotidos) que contengan la secuencia deseada, y cada pareja contiene un segmento corto de complementariedad (por ejemplo, aproximadamente 15 nucleotidos) de modo que se forma un duplex cuando la pareja de oligonucleotidos se asocia. Se emplea la ADN polimerasa para extender los oligonucleotidos, lo cual produce una unica molecula de acido nucleico bicatenaria por pareja de oligonucleotidos, que despues puede asociarse en un vector. Los acidos nucleicos aislados de la invencion tambien pueden obtenerse mediante mutagenesis, por ejemplo, de una porcion natural de un ADN que codifica una protema modificada.

Se pueden describir dos acidos nucleicos, o los polipeptidos que codifican, como que tienen cierto grado de identidad entre sf. Por ejemplo, se puede describir una protema modificada, por ejemplo, un anticuerpo, un anticuerpo mutante, o uno de sus fragmentos, o una protema de fusion o uno de sus fragmentos, y uno de sus variantes biologicamente activos, como que muestra un cierto grado de identidad. Los alineamientos pueden ensamblarse localizando secuencias cortas en la protema modificada, por ejemplo, secuencias de anticuerpos en el sitio de Protein Information Research (PIR) (
http://pir-dot-georgetown-dot-edu), seguido de un analisis con el algoritmo de “secuencias cortas casi identicas” Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) en el sitio web de NCBI (
http://www-dot-ncbi-dot-nlm-dot-nih-dot-gov/blast).

Tal como se emplea en la presente, la expresion “porcentaje de identidad de secuencia” se refiere al grado de identidad entre cualquier secuencia interrogante concreta y una secuencia caso.. Por ejemplo, una protema (por ejemplo, un anticuerpo), natural o no natural, puede ser la secuencia interrogante, y una segunda protema, tal como una protema mutante (por ejemplo, un anticuerpo natural en el que se han introducido una o mas mutaciones) puede ser la secuencia caso. Por ejemplo, una secuencia conocida, tal como SEQ ID NO:1, puede actuar como la secuencia interrogante, y un nueva protema, tal como una protema descrita en la presente, puede ser la secuencia caso.

Para determinar la identidad de secuencia, una secuencia de aminoacidos o un acido nucleico interrogante puede alinearse con una o mas secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos caso, respectivamente, empleando el programa informatico ClustalW (version 1.83, parametros por defecto), que permite realizar alineamientos de secuencias de acidos nucleicos o protemas a lo largo de su longitud completa (alineamiento global). Vease Chenna

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et al., Nucleic Acids Res., 31:3497-3500, 2003.

ClustalW calcula el mejor apareamiento entre una secuencia interrogante y una o mas secuencias caso, y las alinea para poder determinar las identidades, las similitudes y las diferencias. Pueden insertarse huecos de uno o mas restos en una secuencia interrogante, una secuencia caso, o ambas, para maximizar los alineamientos de secuencia. Para un alineamiento de un par de secuencias de acidos nucleicos se emplean los siguientes parametros por defecto: tamano de la palabra: 2; tamano de la ventana: 4; metodo de puntuacion: porcentaje; numero de diagonales superiores: 4; y penalizacion de hueco: 5. Para multiples alineamientos de secuencias de acidos nucleicos se emplean los siguientes parametros: penalizacion de apertura de hueco: 10,0; penalizacion de extension de hueco: 5,0; y transiciones de peso: sf. Para un alineamiento rapido de un par de secuencias de protema se emplean los siguientes parametros: tamano de la palabra: 1; tamano de la ventana: 5; metodo de puntuacion: porcentaje; numero de diagonales superiores: 5; penalizacion de hueco: 3. Para multiples alineamientos de secuencias de protemas se emplean los siguientes parametros: matriz de peso: Blosum; penalizacion de apertura de hueco: 10,0; penalizacion de extension de hueco: 0,05; huecos hidrofilos: encendido; restos hidrofilos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, y Lys; penalizaciones de hueco espedficas de resto: encendido. La salida es un alineamiento de secuencias que refleja la relacion entre las secuencias. ClustalW puede ejecutarse, por ejemplo, en el sitio de the Baylor College of Medicine Search Launcher (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) y en el sitio de the European Bioinformatics Institute en la red mundial ("World Wide Web", ebi.ac.uk/clustalw).

Para determinar el porcentaje de identidad entre una secuencia interrogante y una secuencia caso, ClustalW divide el numero de identidad en el mejor alineamiento entre el numero de restos comparado (se excluyen las posiciones de hueco), y multiplica el resultado por 100. La salida es el porcentaje de identidad de la secuencia caso con respecto a la secuencia interrogante. Se hace notar que el valor del porcentaje de identidad puede redondearse hasta la decena mas cercana. Por ejemplo, 78,11, 78,12, 78,13, y 78,14 se redondean a 78,1, mientras que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18, y 78,19 se redondean a 78,2.

Los acidos nucleicos y los polipeptidos descritos en la presente pueden denominarse “exogenos”. El termino “exogeno” indica que el acido nucleico o el polipeptido es parte, o esta codificado por una construccion de acido nucleico recombinante, o no esta en su entorno natural. Por ejemplo, un acido nucleico exogeno puede ser una secuencia procedente de una especie introducida en otra especie, es decir, un acido nucleico heterologo. Generalmente, este acido nucleico exogeno se introduce en la otra especie a traves de una construccion de acido nucleico recombinante. Un acido nucleico exogeno tambien puede ser una secuencia que es nativa a un organismo y que se ha reintroducido en celulas de ese organismo. Un acido nucleico exogeno que incluye una secuencia nativa a menudo puede distinguirse de la secuencia natural por la presencia de secuencias no naturales unidas al acido nucleico exogeno, por ejemplo, secuencias reguladoras no nativas que flanquean una secuencia nativa en una construccion de acido nucleico recombinante. Ademas, los acidos nucleicos exogenos transformados de modo estable generalmente se integran en posiciones distintas de la posicion en la que se encuentra la secuencia nativa.

En la presente tambien se proporcionan construcciones recombinantes y pueden emplearse para transformar celulas para que expresen una protema modificada, por ejemplo, un anticuerpo, un anticuerpo mutante o uno de sus fragmentos, o una protema de fusion o uno de sus fragmentos. Una construccion de acido nucleico recombinante comprende un acido nucleico que codifica una protema modificada, por ejemplo, un anticuerpo, un anticuerpo mutante o uno de sus fragmentos, o una protema de fusion o uno de sus fragmentos, tal como se describe en la presente, unido operablemente con una region reguladora adecuada para expresar la protema modificada, por ejemplo, un anticuerpo, un anticuerpo mutante o uno de sus fragmentos, o una protema de fusion o uno de sus fragmentos en la celula. Asf, un acido nucleico puede comprender una secuencia codificadora que codifica cualquiera de los anticuerpos, segun se indica en SEQ ID NO:1-17 (por ejemplo, en la FIG. 3). En algunos casos, una construccion de acido nucleico recombinante puede incluir un acido nucleico que comprende una secuencia codificadora, un gen, o un fragmento de una secuencia codificadora o gen en una orientacion antisentido, de modo que se transcribe la hebra antisentido de ARN. Se apreciara que un conjunto de acidos nucleicos pueden codificar un polipeptido que tenga una secuencia de aminoacidos concreta. La degeneracion del codigo genetico es muy conocida en la tecnica. Para muchos aminoacidos, existe mas de un triplete de nucleotidos que actua como codon para el aminoacido. Por ejemplo, los codones en la secuencia codificadora para un fragmento concreto de un anticuerpo, un anticuerpo mutante, o uno de sus fragmentos, o una protema de fusion o uno de sus fragmentos, pueden modificarse de modo que se obtenga la expresion optima en un organismo concreto, empleando las tablas de sesgo de codones apropiadas para ese organismo.

Tambien se proporcionan vectores que contiene acidos nucleicos, tales como los descritos en la presente. Un “vector” es un replicon, tal como un plasmido, un fago o un cosmido, en el que puede insertarse otro segmento de ADN para provocar la replicacion del segmento insertado. En general, un vector es capaz de replicacion cuando esta asociado con los elementos de control apropiados. Los esqueletos de vectores adecuados incluyen, por ejemplo, los que se emplean habitualmente en la tecnica, tales como plasmidos, virus, cromosomas artificiales, BAC, YAC, o PAC. El termino “vector” incluye los vectores de clonacion y de expresion, asf como vectores vmcos y vectores de integracion. Un “vector de expresion” es un vector que incluye una region reguladora. Los vectores de expresion adecuados incluyen, sin limitacion, plasmidos y vectores vmcos derivados, por ejemplo, de bacteriofagos, baculovirus, y retrovirus. Numerosos vectores y sistemas de expresion estan disponibles en el mercado en empresas tales como Novagen (Madison, WI), Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA), e Invitrogen/Life

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Technologies (Carlsbad, CA).

Los vectores proporcionados en la presente pueden incluir, por ejemplo, ongenes de la replicacion, regiones de union de andamiajes (SAR) y/o marcadores. Un gen marcador puede conferir un fenotipo seleccionable a una celula hospedante. Por ejemplo, un marcador puede conferir resistencia a un biocida, tal como resistencia a un antibiotico (por ejemplo, kanamicina, G418, bleomicina, o higromicina). Tal como se indico anteriormente, un vector de expresion puede incluir una secuencia de marcador disenada para facilitar la manipulacion o la deteccion (por ejemplo, la purificacion o la localizacion) del polipeptido expresado. Las secuencias de marcadores, tales como las secuencias de marcadores de protema fluorescente verde (GFP), glutation S-transferasa (GST), polihistidina, c-myc, hemaglutinina, o Flag™ (Kodak, New Haven, CT) generalmente se expresan como una fusion con el polipeptido codificado. Estos marcadores pueden insertarse en cualquier lugar dentro del polipeptido, incluyendo el carboxilo- o amino-terminal.

El vector tambien puede incluir una region reguladora. La expresion “region reguladora” se refiere a secuencias de nucleotidos que influyen en el inicio y la tasa de transcripcion o traduccion y en la estabilidad y/o movilidad de un producto de la transcripcion o de la traduccion. Las regiones reguladoras incluyen, sin limitacion, secuencias de promotores, secuencias de potenciadores, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de protemas, elementos inducibles, secuencias de union a protemas, regiones sin traducir 5' y 3' (UTR), sitio de inicio de la traduccion, secuencias de terminacion, secuencias de poliadenilacion e intrones.

Tal como se emplea en la presente, la expresion “unido operablemente” se refiere a la colocacion de una region reguladora y una secuencia que se va a transcribir en un acido nucleico de modo que influya en la transcripcion o la traduccion de dicha secuencia. Por ejemplo, para que una secuencia codificadora este bajo el control de un promotor, el sitio de inicio de la traduccion del marco de lectura traduccional del polipeptido se coloca generalmente entre uno y aproximadamente cincuenta nucleotidos cadena abajo del promotor. Sin embargo, un promotor puede colocarse en un punto tan lejano como a aproximadamente 5.000 nucleotidos cadena arriba del sitio de inicio de la traduccion o a aproximadamente 2.000 nucleotidos cadena abajo del sitio de inicio de la transcripcion. Un promotor generalmente comprende al menos un promotor basico (basal). Un promotor tambien puede incluir al menos un elemento de control, tal como una secuencia de potenciador, un elemento cadena arriba o una region de activacion cadena arriba (UAR). La eleccion de los promotores que se van a incluir depende de varios factores, que incluyen, pero no se limitan a la eficacia, la capacidad de seleccion, la capacidad de induccion, el nivel de expresion deseado y la expresion preferente en celulas o tejidos. Los expertos en la tecnica habitualmente modulan la expresion de una secuencia codificadora seleccionando y colocando de forma apropiada los promotores y otras regiones reguladoras con relacion a la secuencia codificadora.

En la presente tambien se proporcionan celulas hospedantes. Una celula hospedante puede ser, por ejemplo, un procariota, por ejemplo, una bacteria tal como E. coli, o un eucariota, por ejemplo, una celula de levadura, de insecto o de mairnfero.

Metodos de uso: Las protemas modificadas descritas en la presente son utiles, en general y de forma variada, para generar respuestas inmunologicas, como vacunas profilacticas o productos terapeuticos que estimulan la respuesta inmunologica, y en programas de purificacion. Un paciente se trata con eficacia cuando se produce un resultado clmicamente beneficioso. Esto puede significar, por ejemplo, la resolucion completa de los smtomas de una enfermedad, una disminucion en la gravedad de los smtomas de la enfermedad, o el freno del avance de la enfermedad.

Los metodos descritos en la presente pueden aplicarse a una amplia gama de especies, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos), caballos u otro tipo de ganado, perros, gatos u otros mamnferos que se cuidan como mascotas, ratas, ratones u otros animales de laboratorio. Las protemas modificadas descritas en la presente son utiles en regfmenes y composiciones terapeuticas o para la fabricacion de un medicamento o para la fabricacion de un medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades o trastornos, tal como se describe en la presente (por ejemplo, un cancer descrito en la presente o una enfermedad infecciosa).

Administracion y formulacion: Las protemas modificadas descritas en la presente pueden administrarse directamente a un marnffero, al que tambien se le denomina “sujeto” o “paciente.” En general, las protemas modificadas pueden suspenderse en un vehmulo farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, disolucion salina fisiologica o una disolucion salina tamponada) para facilitar su administracion (por ejemplo, mediante administracion intravenosa). La encapsulacion de los polipeptidos en un vehmulo de administracion adecuado (por ejemplo, micropartmulas polimericas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficacia de transporte. Una composicion puede fabricarse combinando cualquiera de los peptidos proporcionados en la presente con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Estos vehmulos pueden incluir, sin limitacion, emulsiones, suspensiones y disoluciones acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes no acuosos incluyen aceite mineral, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales y esteres organicos inyectables. Los vehmulos acuosos incluyen, sin limitacion, agua, alcohol, disolucion salina y disoluciones tamponadas. Tambien pueden estar presentes conservantes, aromatizantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes (por ejemplo, galato de propilo), agentes quelantes, gases inertes y similares. Se apreciara que cualquier material descrito en la presente que se va a administrar a un mamffero puede contener uno o mas vehmulos farmaceuticamente aceptables.

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Cualquier composicion descrita en la presente puede administrarse a cualquier parte del cuerpo del receptor para el transporte posterior a una celula diana. Una composicion puede administrarse, sin limitacion, al cerebro, el fluido cerebroespinal, las articulaciones, la mucosa nasal, la sangre, los pulmones, los intestinos, los tejidos musculares, la piel o la cavidad peritoneal de un mairnfero. En terminos de vfas de administracion, una composicion puede administrarse mediante inyeccion intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea, intramuscular, intrarrectal, intravaginal, intratecal, intratraqueal, intradermica, o transdermica, mediante administracion oral o nasal, o mediante perfusion gradual a lo largo del tiempo. En otro ejemplo, puede administrarse una preparacion en aerosol al receptor mediante inhalacion.

La dosificacion requerida dependera de la via de administracion, la naturaleza de la formulacion, la naturaleza de la enfermedad del paciente, el tamano, el peso, la superficie espedfica, la edad y el sexo del paciente, otros farmacos que se esten administrando y el criterio de los medicos encargados. Las dosificaciones adecuadas estan en el intervalo de 0,01-1.000 pg/kg. Se espera una amplia variacion en la dosificacion necesaria, en vista de la diversidad de dianas celulares y de las diferentes eficacias de las diversas vfas de administracion. Pueden ajustarse variaciones en estos niveles de dosificacion empleando rutinas empmcas convencionales para la optimizacion, tal como se entiende en la tecnica. Las administraciones pueden ser unicas o multiples (por ejemplo, en 2 o 3, 4, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 150 o mas veces). La encapsulacion de las protemas modificadas en un vehmulo de administracion adecuado (por ejemplo, micropartmulas polimericas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficacia de transporte.

La duracion del tratamiento con cualquier composicion proporcionada en la presente puede tener cualquier longitud de tiempo, desde un tiempo tan corto como un dfa hasta la vida completa del receptor (por ejemplo, muchos anos). Por ejemplo, una protema modificada puede administrarse una vez semanal (por ejemplo, durante 4 semanas a muchos meses o anos); una vez mensual (por ejemplo, durante tres a doce meses o durante muchos anos); o una vez anual durante un periodo de 5 anos, diez anos o mas. Tambien se hace notar que la frecuencia del tratamiento puede ser variable. Por ejemplo, las protemas modificadas de la presente pueden administrarse una vez (o dos, tres veces, etc.) diaria, semanal, mensual, o anual.

Una cantidad eficaz de cualquier composicion proporcionada en la presente puede administrarse a un individuo que necesite tratamiento. El termino “eficaz”, tal como se emplea en la presente, se refiere a cualquier cantidad que induce una respuesta deseada sin inducir una toxicidad significativa en el paciente. Esta cantidad puede determinarse evaluando la respuesta de un paciente despues de la administracion de una cantidad conocida de una composicion concreta. Ademas, puede determinarse el nivel de toxicidad, si existe, evaluando los smtomas clmicos de un paciente antes y despues de administrar una cantidad conocida de una composicion concreta. Se hace notar que la cantidad eficaz de una composicion concreta administrada a un paciente puede ajustarse segun un resultado deseado, asf como segun la respuesta del paciente y el nivel de toxicidad. La toxicidad significativa puede variar para cada paciente concreto y depende de multiples factores que incluyen, sin limitacion, el estado de enfermedad, la edad y la tolerancia a los efectos secundarios del paciente.

Puede utilizarse cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica para determinar si se induce una respuesta concreta. Pueden emplearse metodos clmicos que puedan evaluar el grado de un estado de enfermedad concreto para determinar si se induce una respuesta. Los metodos concretos utilizados para evaluar una respuesta dependeran de la naturaleza del trastorno del paciente, de la edad y el sexo del paciente, de otros farmacos que se esten administrando y del criterio del medico encargado.

Como alternativa, un polinucleotido que contenga una secuencia de acido nucleico que codifica una protema modificada puede transportarse hasta una celula apropiada del animal. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante el uso de un vehmulo de transporte de microcapsulas o micropartmulas biodegradables polimericas, con un tamano adecuado para optimizar la fagocitosis por las celulas fagodticas, tales como macrofagos. Por ejemplo, pueden emplearse micropartmulas de PLGA (poli-lactida-co-glicolido) con un diametro de aproximadamente 1-10 pm. El polinucleotido se encapsula en estas micropartmulas, que son captadas por macrofagos y gradualmente se biodegradan dentro de la celula, liberando con ello el polinucleotido. Tras haber sido liberado, el ADN se expresa dentro de la celula. Un segundo tipo de micropartmula esta prevista para no ser captada directamente por las celulas, sino para actuar principalmente como deposito de liberacion lenta de un acido nucleico que es captado por las celulas solo tras su liberacion de las micropartmulas por biodegradacion. Por tanto, estas partmulas polimericas deben ser lo suficientemente grandes para impedir la fagocitosis (es decir, mas grandes que 5 pm y preferiblemente mas grandes que 20 pm).

Otra manera de lograr la captacion del acido nucleico es la utilizacion de liposomas preparados mediante metodos convencionales. Los vectores pueden incorporarse solos en estos vehuculos de transporte o pueden coincorporarse con anticuerpos espedficos de tejido. Como alternativa, se puede preparar un conjugado molecular compuesto de un plasmido u otro vector unido a poli-L-lisina mediante fuerzas electrostaticas o covalentes. La poli-L-lisina se une a un ligando que puede unirse a un receptor sobre las celulas diana. El transporte de “ADN desnudo” (es decir, sin un vehmulo de transporte) hacia un sitio intramuscular, intradermico o subcutaneo es otro medio de lograr la expresion in vivo.

En los polinucleotidos pertinentes (por ejemplo, vectores de expresion), la secuencia de acido nucleico que codifica

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la protema modificada con un iniciador de metionina y, opcionalmente, una secuencia de transporte dirigido, se une operablemente a una combinacion de promotor o potenciador-promotor. Los promotores y los potenciadores se han descrito anteriormente y muchos son muy conocidos en la tecnica.

Los polinucleotidos pueden administrarse en un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Los vehmulos farmaceuticamente aceptables son vehmulos biologicamente compatibles que son adecuados para la administracion a un ser humano u otro sujeto mairnfero (por ejemplo, disolucion salina fisiologica). Una cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad del polinucleotido que es capaz de producir un resultado medicamente deseable (por ejemplo, una disminucion en los smtomas motores clmicos) en un mai^ero tratado. Tal como se conoce en la tecnica medica, la dosificacion para cualquier paciente concreto depende de muchos factores, que incluyen el tamano del paciente, la superficie espedfica del cuerpo, la edad, el compuesto concreto que se va a administrar, el sexo, el momento y la via de administracion, la salud general y otros farmacos que se esten administrando al mismo tiempo. Las dosificaciones variaran, pero una dosificacion preferida para la administracion del polinucleotido es de aproximadamente 106 a 1012 copias de la molecula polinucleotfdica. Esta dosis puede administrarse repetidamente, segun sea necesario. Las vfas de administracion pueden ser cualquiera de las listadas anteriormente.

Terapia de combinacion: Las protemas modificadas descritas en la presente tambien pueden administrarse con otro agente terapeutico, tal como un agente citotoxico, o un producto quimioterapeutico del cancer. No es necesario que la administracion concurrente de dos o mas agentes terapeuticos se realice al mismo tiempo o a traves de la misma via, con la condicion de que exista un solapamiento en el periodo de tiempo durante el cual los agentes estan ejerciendo su efecto terapeutico. Se contempla la administracion simultanea o secuencial, asf como la administracion en diferentes dfas o semanas.

En algunos aspectos descritos en la presente, los metodos proporcionados contemplan la administracion de combinaciones, o “cocteles,” de diferentes protemas modificadas. Estos cocteles pueden tener ciertas ventajas puesto que contienen polipeptidos que aprovechan diferentes funciones efectoras. Estas protemas en combinacion pueden mostrar efectos terapeuticos sinergicos. Las protemas modificadas utiles incluyen las que se dirigen al receptor de EGF (por ejemplo, Cetuximab (Erbitux™)), las que se dirigen a VEGF (por ejemplo, Bevacizumab (Avastin™)) y las que se dirigen a Her-2 (por ejemplo, trastuzimab (Herceptin™)).

Un agente citotoxico se refiere a una sustancia que inhibe o evita la funcion de celulas y/o provoca la destruccion de

^ 1 1 1 'jel 1 on 1

celulas. El termino permite incluir isotopos radiactivos (por ejemplo, I, I, Y y Re), agentes quimioterapeuticos y toxinas, tales como toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal o toxinas sinteticas o sus fragmentos. Un agente no citotoxico se refiere a una sustancia que no inhibe ni evita la funcion de celulas y/o no provoca la destruccion de celulas. Un agente no citotoxico puede incluir un agente que puede ser activado para que se convierta en citotoxico. Un agente no citotoxico puede incluir una esfera, un liposoma, una matriz o una partmula (veanse, por ejemplo, la publicaciones de patente de EEUU 2003/0028071 y 2003/0032995). Estos agentes pueden conjugarse, acoplarse, unirse o asociarse con un anticuerpo descrito en la presente.

En algunos aspectos descritos en la presente, se administran medicamentos del cancer convencionales con las composiciones descritas en la presente. Los agentes adecuados incluyen los agentes que estimulan los danos en el ADN, por ejemplo, rupturas bicatenarias en el ADN celular, en las celulas del cancer. Puede emplearse cualquier forma de agente causante de danos en el ADN conocido por los expertos en la tecnica. Los danos en el ADN pueden producirse generalmente mediante terapia de radiacion y/o quimioterapia. Los ejemplos de terapia de radiacion incluyen, sin limitacion, terapia de radiacion externa y terapia de radiacion interna (tambien denominada braquiterapia). Las fuentes de energfa para la terapia de radiacion externa incluyen rayos X, rayos gamma y haces de partmulas; las fuentes de energfa empleadas en la radiacion interna incluyen yodo radiactivo (yodo125 o yodo131), y del estroncio89, o radioisotopos de fosforo, paladio, cesio, iridio, fosfato o cobalto. Los metodos para administrar la terapia de radiacion son muy conocidos por los expertos en la tecnica.

Tal como se ha indicado, las protemas modificadas de la presente tambien pueden utilizarse en programas de clasificacion y purificacion, y los inventores esperan que dichos metodos sean ventajosos frente a los metodos disponibles en la actualidad, tales como los que se realizan empleando HPLC, puesto que una clasificacion y purificacion realizadas empleando las protemas modificadas de la presente debenan ser mas rapidas. Esto puede ser importante cuando se estan purificando o aislado quelatos de metal que incluyan isotopos con semivida corta. Por consiguiente, las protemas modificadas de la invencion pueden unirse a un soporte solido, tal como una esfera, una resina u otro material adecuado para su uso con una columna de purificacion, y estas composiciones unidas a un sustrato estan dentro del alcance de la presente invencion. Para separar de forma satisfactoria restos radiomarcados (por ejemplo, un agente quimioterapeutico unido a un quelato de metal que comprende DOTA, o uno de sus variantes activos, y un ion metalico radiactivo) de los restos sin marcar, se utilizara una columna o un dispositivo similar al que se ha unido una protema de union a DOTA segun se ha descrito en la presente. Despues una mezcla (por ejemplo, una mezcla de reaccion) que contiene restos radiomarcados y no radiomarcados se hace pasar sobre la columna (u otro dispositivo) a la cual esta unida la protema de union a DOTA. La columna puede enjuagarse segun sea necesarios, y los restos radiomarcados pueden eluirse mediante metodos conocidos en la tecnica (por ejemplo, lavando con disoluciones de pH bajo).

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Ejemplos

Ejemplo 1: Analisis de modelizacion

Los modelos de PRIT desarrollados en la presente son extensiones de los sistemas de dos modelos desarrollados y descritos por Thurber y colaboradores (J. Nucl. Med., 48:995-999, (2007)). El modelo de micrometastasis emplea la geometna esferica y supone un transporte solo por difusion. El modelo de tumor vascularizado emplea la geometna cilmdrica alrededor de capilares. Se realizaron simulaciones numericas en MATLAB (The Math Works, Framingham, MA).

Las simulaciones de PRIT se realizaron para 1 gramo de tumor vascularizado y unas micrometastasis con un diametro de 400 micrometros, suponiendo un ser humano de 70 kg con 3,5 litros de volumen de sangre. El anticuerpo se administra como una dosis en embolada de 7 pmol en el momento cero. El hapteno se administra como una dosis en embolada de 350 nmol con una actividad inicial de 5 GBq a las 24 h. El modelo aplica una etapa de eliminacion 2 h antes de la dosificacion del hapteno, en la que 99,9% del bsAb (anticuerpo biespedfico) remanente se elimina de la sangre. Se calcula la concentracion de hapteno no unido en la sangre como la concentracion inicial de hapteno menos el hapteno que se une al anticuerpo residual en la sangre. El modelo supone un radionuclido 90Y que es 100% residualizante a lo largo del periodo de simulacion de 13 dfas.

Tal como se indico, se realizo una modelizacion matematica del efecto de la afinidad de union a DOTA sobre la administracion de radiacion ionizante en PRIT. Se aplicaron dos modelos matematicos que simulan una PRIT basandose en modelos previamente validados, uno que simula la distribucion de anticuerpos en tumores vascularizados y el otro en micrometastasis (Thurber et al., J. Nucl. Med., 48:995-999, 2007). Estos dos tipos de tumores fueron considerados por separado debido a los diferentes modos de transporte. Para las micrometastasis, el anticuerpo y el hapteno se difunden hacia el interior de la masa tumoral desde el fluido intersticial circundante. Aunque puede haber algun transporte desde el fluido intersticial circundante hacia los bordes de grandes tumores vascularizados, la mayona del transporte del anticuerpo y del hapteno se produce a traves de la vasculatura del tumor.

Los inventores extendieron ambos modelos para tomar en cuenta la cinetica del hapteno, suponiendo un bsAb con un sitio de union a hapteno y un sitio de union a antfgeno con especificidad para el antfgeno carcinoembrionario (CEA), con un semitiempo de internalizacion de 15 h (Schmidt et al., Cancer Immunol. Immunother., 12 de abril, 2008). Los inventores utilizaron una concentracion sangumea inicial de bsAb de 2 micromolar como variable de entrada. Los inventores esperan que esta concentracion inicial sature fundamentalmente los sitios de union al antfgeno para tumores vascularizados a partir de los resultados de la modelizacion de los inventores y de los de Fenwick y colaboradores (Fenwick et al., Int. J. Cancer, 44:1017-1027, 1989) que demuestran que son necesarias unas dosis de anticuerpo de varios cientos de microgramos o mas para obtener la saturacion en un modelo de xenoinjerto de raton. La aplicacion del modelo supone una dosificacion de bsAb en el momento 0, seguido de una etapa de eliminacion/bloqueo a las 22 h y la dosificacion del hapteno a las 24 h, con una concentracion sangumea inicial del hapteno de 100 nanomolar. El modelo de los inventores predice que esta dosis de hapteno saturara los sitios de union de bsAb prelocalizados en el tumor vascularizado. Notese que las dosis de bsAb y hapteno son unas ordenes de magnitud mayores que las predichas para saturar las micrometastasis. El modelo supone un hombre de 70 kg y unos parametros farmacocineticos de 2 compartimentos para el anticuerpo y el hapteno.

Se ejecutaron las simulaciones del modelo de PRIT, variando la tasa de disociacion del hapteno y manteniendo constante la tasa de asociacion. Se considero la concentracion de hapteno en el tumor como una funcion del tiempo y la actividad acumulada total suponiendo un radionuclido 90Y con una semivida de 64 h. Se predijo la retencion del hapteno en los tumores vasculares (FIG. 1A) y las micrometastasis (FIG. 1B) a traves de un intervalo de Kd del hapteno de seis ordenes de magnitud. El modelo supone que los quelatos de DOTA estan 100% residualizados despues de la internalizacion; la internalizacion de los complejos de hapteno-anticuerpo-CEA produce la meseta observada en la FIG. 1 en tiempos largos. Se relajo esta suposicion y se ejecutaron simulaciones con una constante de tasa no residualizante y se descubrio que la actividad acumulada total era constantemente menor para todas las afinidades, y la misma tendencia se conservo para afinidades distintas. Tambien se observo el efecto de variar la tasa de asociacion manteniendo una Kd constante, y no se descubrieron diferencias significativas en la retencion del hapteno para unas tasas de asociacion del hapteno tfpicas (5 x 105-5 x 107 M-1s-1), lo cual demuestra que el parametro importante es la Kd.

Para las condiciones de PRIT mencionadas anteriormente, se predice que una Kd del hapteno mayor que 100 pM permitira una significativa retencion del hapteno para tumores vascularizados y para micrometastasis.

Ejemplo 2: Complejos de DOTA

Se disolvio DOTA (Macrocyclics M-140) y DOTA-Bn (acido S-2-(4-aminobencil)-1,4,7,10- tetraazaciclododecantetraacetico; Macrocyclics B-200) en acetato de sodio 0,4 M, pH 5,2, para preparar disoluciones madre.

Se sintetizo DOTA-Bn-biotina disolviendo amina-PEG3-biotina (Pierce 21347) y p-SCN-Bn-DOTA (acido S-2-(4- isotiocianatobencil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecantetraacetico; Macrocyclics B-205) en sulfoxido de dimetilo (DMSO)

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con un exceso molar en 10 veces de trietilamina 30 (VWR #EM-TX 1200-5). La mezcla de reaccion se agito en vortice a temperatura ambiente durante 3 horas, y despues se purifico mediante una cromatograffa Kquida de alta resolucion (HPLC). La purificacion de HPLC se realizo en una columna de fase inversa C-18 (Agilent modelo 1100 HPLC, 1 x 25 cm, tampon A = acido trifluoroacetico al 0,05% (TFA), tampon B = TFA al 0,0425% en acetonitrilo al 80%, gradiente de B al 2-100% durante 98 minutos). La corriente se controlo mediante la deteccion de la absorbancia a 280 nanometros. Se confirmaron las fracciones que conteman DOTA-Bn-biotina empleado una espectrometna de masas de tiempo de vuelo-instrumento de desorcion de laser asistido por matriz (MALDI-TOF) (Applied Biosystems modelo Voyager DE-STR). Se evaluo la pureza qmmica mediante HPLC analftico (Agilent modelo 1100 HPLC, 2,1 x 150 mm, tampon A = TFA al 0,05%, tampon B = TFA al 0,0425% en acetonitrilo al 80%, gradiente de B al 2-100% durante 45 minutos). Se determino la concentracion de DOTA-Bn-biotina empleando un kit de cuantificacion de biotina (Pierce 28005) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se sintetizo DOTA-alquil-biotina siguiendo el procedimiento de Takenouchi et al. (J. Organic Chem., 58:1955-1958, 1993) comenzando con el compuesto H-Lys(Boc)-OMe (Bachem, E-1620). El H-Lys(Boc)-OMe se trato de modo discontinuo con bromoacetato de metilo y dietilentriamina para obtener 4-(3,12-dioxo-1,4,7,10-tetraazaciclododecan- 2-il)butilcarbamato de terc-butilo. Se empleo un complejo de borano-THF para reducir las amidas carboxflicas, seguido de la desproteccion del Boc del acido trifluoroacetico para obtener 4-(1,4,7,10-tetraazaciclododecan-2- il)butan-1-amina. Este compuesto posteriormente se hizo reaccionar con biotina-xx, SSE (Invitrogen, B-6352) en DMSO con un exceso molar en 10 veces de trietilamina durante 3 horas agitando en vortice a temperatura ambiente. En todas las etapas de smtesis, los compuestos se purificaron mediante HPLC y se confirmaron mediante espectrometna de masas con una espectrometna de masas-cromatograffa lfquida (LC/MS) de tiempo de vuelo- electronebulizacion (ES-TOF) de LCT Waters (Milford, MA) o mediante MALDI-TOF segun se describio anteriormente.

Se prepararon los complejos de metal de cada derivado de DOTA (vease la FIG. 2 para las estructuras qmmicas) como sigue. Se obtuvieron el nitrato de itrio hexahidrato, el cloruro de lutecio(III) hexahidrato, el cloruro de indio(III), el nitrato de galio(III) hidrato, y el cloruro de gadolinio(III) hexahidrato en Sigma y se prepararon como disoluciones madre en acetato de sodio 0,4 M, pH 5,2. A una disolucion 2 mM (para DOTA y DOTA-Bn) o 400 pM (para DOTA- Bn-biotina) del agente quelante se anadio un exceso molar en 5 veces de la disolucion madre del metal y se quelo mediante una rotacion durante la noche a temperatura ambiente. El pH se ajusto a 7 con NaOH 10 M y el complejo se diluyo con disolucion salina tamponada con fosfato con albumina de suero bovina al 0,1% (PBSA) hasta una concentracion final de 1 mM (para DOTA y DOTA-Bn) o 200 pM (para DOTA-Bn-biotina). Para los quelatos de gadolinio se empleo un procedimiento de carga de metal identico, excepto que la reaccion de complejacion se realizo a 80°C durante 12 h en un termociclador. La complejacion completa del quelante se confirmo mediante LC/MS empleando una columna de 75 pm x 150 mm C18 (Magic C18 de Michrom Bioresources).

Ejemplo 3: Caracterizacion de la cinetica

Mediciones de Kd para DOTA-Bn-biotina-metal: Se determinaron las constantes de disociacion en equilibrio (Kd) para la union de scFv presentados sobre la superficie de levadura a complejos de DOTA biotinilados a 37°C por triplicado, segun se describe en Chao et al. (Nat. Protoc., 1:755-768, 2006). Brevemente, se cultivaron levaduras que expresan un clon de scFv sobre su superficie, se lavaron con PBSA y se incubaron con diversas concentraciones de DOTA-Bn-biotina-metal durante un tiempo suficiente para permitir un aproximacion de al menos 95% al equilibrio. En general se emplearon 5 x 105 celulas inducidas para cada punto de concentracion. Cuando se ensayaron concentraciones de antfgeno menores que 10 pM, la titulacion se realizo con 2,5 x 104 celulas inducidas y 7,5 x 105 celulas no inducidas para asegurar un exceso de antfgeno frente al scFv sin requerir unos volumenes grandes poco practicos. La adicion de celulas no inducidas ayuda a la sedimentacion durante la centrifugacion (Hackel et al., J. Mol. Biol., 381:1238-1252, 2008). Cuando se emplean concentraciones mayores que 100 nM se toma en cuenta la union de antfgenos no espedfica a la superficie de las levaduras. Las levaduras que expresan un scFv irrelevante sobre su superficie se trataron de la misma manera que las levaduras que presentan el scFv de interes, y se midio el promedio de fluorescencia de ficoeritrema total (MFUtot) debida a la union no espedfica mediante citometna de flujo y se promedio para tres duplicados. Este valor se resto del MFUtot para la levadura de interes, y los datos se ajustaron mediante una regresion de mmimos cuadrados.

Mediciones de Kd para DOTA-metal y DOTA-Bn-metal: Para determinar la Kd para la union de scFv a haptenos no biotinilados se modifico el anterior protocolo para lograr un ensayo basado en la competicion como sigue. Despues de determinar la Kd para la union de scFv a DOTA-Bn-biotina-Y, se constituyo una titulacion con DOTA-Bn-biotina-Y 100 pM, 2,5 x 105 celulas por tubo, y concentraciones variables del complejo no biotinilado. La incubacion, la tincion y el analisis de citometna de flujo fueron los mismos que para el antfgeno biotinilado. MFUtot, como una funcion de la concentracion del antfgeno no biotinilado ([Ag]), una constante de normalizacion (MFUrange), el mmimo del promedio de la fluorescencia total (MFUmin), la Kd para DOTA-Bn-biotina-Y (KD,biot), la concentracion de DOTA-Bn- biotina-Y ([Agbiot]), y la Kd para el antfgeno de interes (Kd) siguen esta ecuacion modificada:

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Los datos se ajustaron mediante regresion de mmimos cuadrados como antes, variando MFUmin, MFUrange y Kd.

Cinetica de disociacidn: Para determinar la tasa de disociacion, koff, para los complejos de DOTA-Bn-biotina, se indujeron celulas y se lavaron como se indico anteriormente, y 1 x 107 celulas se incubaron en 1 ml de PBSA con DOTA-Bn-biotina-metal 1 nM durante 1 h para alcanzar la saturacion. Despues las levaduras se lavaron con 1 ml de PBSA, se resuspendieron en 1 ml de PBSA con antigeno no biotinilado 1 pM (en exceso) como competidor y se dividieron en partes alfcuotas de 100 pl. Estas partes alfcuotas se incubaron a 37°C durante diferentes longitudes de tiempo, despues se lavaron con PBSA fno y se mantuvieron en hielo. Todas las muestras se tineron de modo simultaneo con estreptavidina-ficoeritrema durante 10-20 min y se analizaron mediante citometna de flujo. Los datos se ajustaron a la siguiente ecuacion mediante una regresion de mmimos cuadrados, variando MFUmin, MFUrange y koff:

MFV,„ = MFU^

Para los antigeno no biotinilados el procedimiento fue identico, excepto que la saturacion inicial se realizo con el antigeno no biotinilados y se empleo DOTA-Bn-biotina-metal como competidor. Los datos cumplen la expresion:

MFVm * MFU^ + A(l - e'**')

Ejemplo 4: Maduracion por afinidad

El scFv 2D12.5 actuo como punto de partida y se sometio a nueve rondas de evolucion dirigida mediante mutagenesis aleatoria y posterior seleccion para una mayor union empleando la presentacion sobre la superficie de levaduras, segun describen Chao y colegas (Nat. Protoc., 1:755-768, 2006) que se adapto como sigue.

Preparacion de los complejos de DOTA: Los quelatos de DOTA se incubaron con itrio, gadolinio, lutecio, galio e indio durante la noche para la formacion de complejos con el metal. Los productos se analizaron mediante LC-MS para verificar que todo el quelato de DOTA habfa sido cargado con el metal. Todos los ejemplos muestran un pico o picos correspondientes a la masa esperada del complejo de metal con patrones de isotopos caractensticos. Las muestras no conteman DOTA no complejado detectable.

Mutagenesis: Para contrarrestar el sesgo mutacional de la PCR propensa a errores tambien se realizo una mutagenesis en cada ronda con el kit de mutagenesis Mutazyme (Stratagene) segun las instrucciones del fabricante, y el ADN mutagenizado resultante se reunio con el obtenido mediante PCR propensa a errores. Todas las demas etapas se realizaron segun metodos convencionales (vease Chao et al.).

Seleccion: Cada ronda de mutagenesis produjo un banco de tamano 0,5-4 x 107 y se clasifico 2-3 veces mediante citometna de flujo para ligantes mejorados. La diversidad calculada del banco se marco al menos cinco veces para la clasificacion celular. La tincion se realizo mediante incubacion en equilibrio a una concentracion de DOTA-Y biotinilado de aproximadamente 1/3 del promedio de Kd del banco previo (en las primeras rondas) o mediante saturacion con el antfgeno, seguido de disociacion para 2-3 semitiempos de disociacion (en las rondas posteriores), y el posterior marcaje con estreptavidina-ficoeritrema. Para marcar la expresion del scFv de longitud completa, las levaduras tambien se tineron con un anticuerpo primario anti-HA de raton (clon 12CA5, Roche Applied Science) o un anti-cmyc de raton (clon 9e10, Covance) y un anticuerpo secundario anti-raton de cabra Alexa-647 (Invitrogen). Se recogieron las levaduras que expresaban el mejor 0,01-0,1% de ligantes. Periodicamente se alterno el antfgeno entre DOTA-Bn-biotina-Y y DOTA-alquil-biotina-Y.

Estabilizacion con disulfuro e inactivacion de la glicosilacion: Se retiro el sitio de glicosilacion N-enlazado en la cadena pesada del scFv y se introdujo un enlace disulfuro entre la cadena pesada y ligera durante la septima mutagenesis de la maduracion por afinidad. Esto se logro introduciendo, mediante mutagenesis dirigida a sitio de PCR, las mutaciones N88E o N88D, Q111C, y L179C (la numeracion se corresponde con la secuencia de scFv; FIG. 3C).

Seleccion de los clones: Los clones individuales se aislaron transformando E. coli XL-1 azul qmmicamente competente (Stratagene) con ADN plasmfdico aislado del banco de levaduras (kit Zymoprep™ II, Zymo Research) y cultivando en placas de agar que conteman ampicilina. Se escogieron las colonias individuales y se cultivaron en medio lfquido durante la noche, y el ADN plasmfdico se aislo empleando el kit Qiagen Miniprep. El ADN plasmfdico se secuencio y se volvio a transformar en levaduras con el kit de transformacion EZ Yeast (Zymo Research). Se cultivaron los cultivos de levaduras clonales y se determinaron sus parametros cineticos.

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Ejemplo 5: Analisis de los anticuerpos madurados por afinidad

Los inventores realizaron una maduracion por afinidad del fragmento de anticuerpo 2D12.5 contra DOTA-Y biotinilado mediante evolucion dirigida. Se sintetizo el gen que codifica la IgG de DOTA 2D12.5 en un formato de scFv (FIG. 3C) a partir de su secuencia publicada (Corneillie et al., J. Am. Chem. Soc., 125:15039-15048, 2003). En total se realizaron nueve rondas de maduracion por afinidad. Se marcaron las levaduras que expresan los variantes 2D12.5 con DOTA-Bn-biotina-Y o DOTA-alquil-biotina-Y (FIG. 2), seguido de estreptavidina-ficoeritrema y se clasificaron mediante citometna de flujo para seleccionar los clones con mayor afinidad. El antigeno se cambio periodicamente para minimizar la seleccion de variantes con mutaciones que confieren una mejor union a la region del conector. Durante la septima mutagenesis, se introdujo un enlace disulfuro intramolecular entre las regiones variables pesada y ligera del scFv (Reiter et al., Nat. Biotechnol 14:1239-1245, 1996) y se elimino el sitio de glicosilacion N-enlazado en la cadena pesada. Estas mutaciones adicionales pueden mejorar la estabilidad y dar como resultado un procesamiento corriente abajo mas sencillo del scFv.

Las secuencias de aminoacidos para un panel de mutantes se muestran en la FIG. 6. Se determinaron las secuencias y las constantes cineticas para varios clones de los bancos 8.2 (8 rondas de mutagenesis, seguidas de 2 clasificaciones) y 9.3 (9 rondas de mutagenesis y 3 clasificaciones). Todos los clones del banco 9.3 habfan perdido el enlace disulfuro entre la cadena pesada y ligera y, por consiguiente, se desecharon. De los clones del banco 8.2, C8.2.5 mantuvo el enlace disulfuro y se unio con la mayor fuerza a DOTA-Bn-biotina-Y.

La secuencia del scFv C8.2.5 de alta afinidad se diferencia de 2D12.5ds (el scFv 2D12.5 original con la adicion del enlace disulfuro intramolecular y el sitio de glicosilacion eliminado) en 15 posiciones de aminoacidos. La distribucion espacial en la estructura cristalina del 2D12.5 de tipo salvaje se muestra en las figuras FIGS. 3A y 3B. Solo una mutacion, N53(L)H (la numeracion se corresponde con el fragmento de union al antfgeno (Fab) 2D12.5 para el cual se determino la estructura cristalina), se produjo dentro de 5 Angstroms del hapteno unido, lo cual indica que la mayona de las mutaciones potencian la afinidad a traves de sutiles perturbaciones estructurales muy alejadas de la interfase de union.

Se caracterizaron las propiedades cineticas de 2D12.5ds y C8.2.5, y se resumen en las tablas 1 y 2. La afinidad del scFv por DOTA-Bn-biotina-Y aumento en tres ordenes de magnitud, desde nanomolar a picomolar de un solo dfgito. El semitiempo de disociacion para DOTA-Bn-biotina-Y aumento desde 5,5 min para 2D12.5ds hasta justo mas de 5 horas para C8.2.5 (tabla 2).

El clon de alta afinidad C8.2.5 se unio a DOTA-Bn-biotina-Y, DOTA-Bn-Y, y DOTA-Y con unas constantes de disociacion en equilibrio de 8,2 ± 1,9 pM, 15,4 ± 2,0 pM, y 103 ± 35 pM, respectivamente, lo cual indica que existen algunas interacciones de union entre el scFv y el anillo de benceno y la region del conector de biotina. Las diferencias de afinidad entre estos diversos quelatos de itrio se reflejan en sus semividas de disociacion (tabla 2).

De forma notable, los complejos de DOTA con lutecio y gadolinio se unieron a C8.2.5 de forma similar a los del itrio (vease la tabla 1). El scFv de alta afinidad tambien se unio a los quelatos de indio y galio con afinidad nanomolar. Todos los quelatos de DOTA-metal se unieron a C8.2.5 con una afinidad de aproximadamente un orden de magnitud mas debil que el respectivo quelato de metal de DOTA-Bn, lo cual proporciona mas pruebas de las interacciones de union entre el scFv y el anillo de benceno.

Tabla 1

Constantes de disociacion en equilibrio para scFv presentados sobre la superficie de levaduras unidos a

complejos de DOTA

scFv

Hapteno Metal Kd* n

2D12.5ds

DOTA-Bn-biotina Y 3,7 ± 3,6 nM 3

C8.2.5

DOTA-Bn-biotina Y 8,2 ± 1,9 pM 3

DOTA-Bn Y 15,4 ± 2,0 pM 3

Lu 10,8 ± 2,5 pM 3

Gd 34,0 ± 5,3 pM 2

In 1,01 ± 0,04 nM 2

Ga 52 ± 12 nM 2

DOTA Y 103 ± 35 pM 3

Lu 390 ± 14 pM 2

Gd 149± 6 pM 2

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Constantes de disociacion en equilibrio para scFv presentados sobre la superficie de levaduras unidos a complejos de DOTA

scFv Hapteno

Metal Kd* n

In 23,7 ± 3,7 nM 2

Ga 216 ± 26 nM 2

*Kd aparece como promedio ± SE.

Tabla 2

scFv

Hapteno Metal Semivida de disociacion*

2D12.5ds

DOTA-Bn-biotina Y 5,5 ± 1,3

C8.2.5

DOTA-Bn-biotina Y 302 ± 13

DOTA-Bn Y 53,1 ± 2,3

DOTA Y 3,5 ± 0,7

Lu 3,8 ± 0,4

*Calculado como IN(2)/Koff y presentado en minutos como promedio ± DE para n = 3 experimented.

Ejemplo 6: Construccion de anticuerpos biespedficos

El formato biespedfico se diseno como una fusion de scFv con el C-terminal de la cadena ligera de una IgG. La cadena pesada es la misma que la de una IgG1 y se subclono en el vector de expresion de mairnferos gWiz, adquirido en Aldevron (Fargo, ND). La cadena ligera se construye como conductor-FLAG-VL-CK-(Gly4Ser)2-scFv- cmyc, en la que VL es el dominio variable ligero, Ck es el dominio constante de cadena ligera kappa, y FLAG y cmyc son marcadores de epitopo N- y C-terminales, respectivamente. Se clono en un plasmido gWiz separado. Ambos plasmidos se coexpresaron de forma transitoria en celulas HEK293 (n.° de catalogo no. R790-07) adquiridas en Invitrogen (Carlsbad, Calif.). Las celulas HEK293 se cultivaron en matraces en una plataforma de agitacion orbital que gira a 140 rpm a 37°C, 5% de CO2, y se subcultivaron siguiendo los protocolos del fabricante. Se realizo una cotransfeccion con polietilenimina (PEI) como reactivo de transfeccion. Brevemente, las celulas HEK293 se subcultivaron hasta una densidad celular de 0,5-0,07 x 106 celulas/ml 24 h antes de la transfeccion. Inmediatamente antes de la transfeccion, la densidad celular se ajusto a 1 x 106 celulas/ml. Se anadieron 500 |jg de cada plasmido purificado (1 mg/ml) a 19 ml de OptiPRO (Invitrogen). Se disolvieron 2 ml de PEI 1 mg/ml, pH 7,0 (PM 25.000) adquirido en Polysciences (Warrington, PA) disuelto en agua, a 18 ml de OptiPRO. Ambas disoluciones se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. Se anadio la disolucion de ADN/OptiPRO a la disolucion de PEI/OptiPRO y se incubo durante 10 min a temperatura ambiente y se anadio gota a gota a 1 l del cultivo de HEK293. El sobrenadante se recogio 6-8 dfas despues de la transfeccion. Los anticuerpos se purificaron mediante una cromatograffa de protema A (Thermo Fisher Scientific, Rockford, Ill.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se fabricaron construcciones espedficas mediante PCR de extension de solapamiento y mutagenesis QuikChange. El bsAb Sm3e/C825 se clono y se produjo tal como se describio anteriormente empleando los dominios VH y VL del scFv de anti-CEA Sm3e madurado por afinidad (Graff et al., Protein Eng. Des. Sel., 17:293-304, 2004) y el scFv C8.2.5 estabilizado con disulfuro. El bsAb Sm3e/4m5.3 sustituye a un scFv 4m5.3 que es un ligante de fluorescema femtomolar (Boder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:10701-10705, 2000) estabilizado con disulfuro mediante la introduccion de dos restos cistema, S43C en el dominio VL, y Q105C en el dominio VH (Reiter et al., Nat. Biotechnol., 14:239-1245, 1996). El bsAb A33/4m5.3 emplea los dominios VH y VL de un fragmento Fab humanizado de A33 (Rader et al., JBC, 275:13668-13676, 2000) para los dominios de union de IgG. Se produjeron los plasmidos Sm3e IgG y A33 IgG introduciendo dos codones de fin en la cadena ligera inmediatamente despues de la secuencia Ck mediante PCR QuikChange. El C-terminal de la cadena ligera de la IgG A33 se extendio por medio de un peptido de 18 aminoacidos ((G4S)2LPETGGSG), para fabricar la construccion de A33 IgG + peptido. La construccion de A33 IgG + peptido se estabilizo con disulfuro mediante la introduccion de dos parejas diferentes de restos cistema, VL G100C y VH G44C (dsl), y VL V43C y VH Q105C (ds2) (Reiter et al., 1996).

Ejemplo 7: Diseno del plasmido y expresion en celulas HEK293

Los inventores han disenado un anticuerpo biespedfico como fusion C-terminal a la cadena ligera de una IgG (FIG. 8). La cadena pesada es identica a la de una IgG. La cadena ligera se construye extendiendo una cadena ligera de IgG con un conector C-terminal (Gly4Ser)2 , seguido de un scFv. En este estudio, la cadena ligera se construye con un marcador FLAG N-terminal y un marcador cmyc C-terminal para fines de caracterizacion. El bsAb totalmente ensamblado contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, y es tetravalente con dos dominios de union de

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IgG y dos dominios de union de scFv.

Se sintetizo un bsAb con este formato que se une al anffgeno carcinoembrionario (CEA) y a los complejos del quelato de metal, DOTA. El bsAb Sm3e/C825 se construyo a partir de una IgG Sm3e y un scFv de union a DOTA, C8.2.5, clonando los dominios variables pesado y ligero del scFv Sm3e de afinidad picomolar (Graff et al., Protein Eng. Des. Sel., 17:293-304, 2004) en un plasmido que contema los dominios constantes pesados y el dominio constante de cadena ligera kappa de IgG1. El scFv C8.2.5 posteriormente se clono en el plasmido de cadena ligera inmediatamente despues del C-terminal del gen Ck. Los plasmidos de expresion de cadena pesada y ligera se cotransfectaron de forma transitoria en celulas de mairnfero HEK293. El anticuerpo segregado se purifico a partir de los sobrenadantes del cultivo celular mediante una cromatograffa de protema A. Los rendimientos de Sm3e IgG y Sm3e/C825 bsAb fueron de aproximadamente 5-7 mg/l.

Una electroforesis en gel de SDS-PAGE no reductora del bsAb purificado muestra una especie con un peso molecular de aproximadamente 200 kDa. Bajo condiciones reductoras, el bsAb produce dos bandas, ambas alrededor de 50 kDa, puesto que la fusion de scFv aumenta el peso molecular de la cadena ligera hasta aproximadamente 50 kDa. Una cromatograffa de exclusion molecular del bsAb purificado muestra un unico pico dominante con una pequena cantidad de especies de peso molecular mayor, similar al observado para la IgG recombinante y para la IgG purificada a partir de plasma humano.

Ejemplo 8: Transporte dirigido al tumor in vivo

En este punto se presenta un nuevo metodo en tres etapas para PRIT que emplea un anticuerpo biespedfico IgG- scFv, un agente de eliminacion basado en dextrano, y DOTA radiomarcado, y el ensayo de un estudio demostrativo preliminar en un modelo de xenoinjerto de raton. Ademas se emplea este sistema para analizar in vivo el efecto de la afinidad de molecula pequena sobre la captacion tumoral. Se evaluo la biodistribucion y la captacion tumoral en ratones con xenoinjertos de tumores CEA-positivos y CEA-negativos para 177Lu-DOTA, 111In-DOTA-Bn, y 111In-DOTA despues de una prelocalizacion con un bsAb anti-CEA. Se calcularon las dosis para rinon, hffgado y medula osea empleando la metodologfa de la dosis de radiacion interna medica (MIRD). El metodo PRIT produjo una capitacion tumoral de 177Lu-DOTA de aproximadamente 14% de ID/g a las 24 h y las 48 h, unas proporciones de tumor a rinon de aproximadamente 20 a las 24 h y las 48 h, y unas proporciones de tumor a sangre mayores que 300 a las 24 h y las 48 h. Una afinidad de aproximadamente 100 pM produjo un aumento 8 veces mayor en la captacion tumoral a las 24 horas que una afinidad de aproximadamente 1 nM, y una captacion 28 veces mayor que una afinidad de aproximadamente 10 nM.

Reactivos: El acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA), el acido S-2-(R-aminobencil)- 1,4,7,10-tetraazaciclododecantetraacetico (DOTA-Bn) y el acido S-2-(4-isotiocianatobencil)-1,4,7,10- tetraazaciclododecantetraacetico (DOTA-SCN) se adquirieron en Macrocyclics (Dallas, TX). Todos los demas productos qmmicos se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) o Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA), a menos que se indique lo contrario.

Sntesis del agente de bloqueo basado en dextrano: Se hicieron reaccionar 5 mg (10 nmol) del aminodextrano de 500 kDa adquirido en Invitrogen (Carlsbad, CA), con 136 moles de amina por mol de dextrano, con 3,7 mg (5,3 |jmol) de DOTA-SCN en 1 ml de DMSO con 1,9 jl (13,6 jmol) de TEA durante la noche a temperatura ambiente con una suave agitacion en vortice. La mezcla de reaccion de dextrano se diluyo con 14 ml de acetato de sodio 0,4 M, pH 5,2, y se anadieron 53 jmol de nitrato de itrio. La mezcla se incubo durante la noche a 37°C, se dializo frente a agua y despues se seco mediante una centrifugacion al vado. El compuesto de dextrano secado se resuspendio en PBS y se purifico mediante una cromatograffa de exclusion molecular empleando una columna Superdex 75 10/300 GL. Las fracciones que conteman el compuesto de dextrano se reunieron, se dializaron contra agua dos veces, se secaron mediante una centrifugacion al vado, se resuspendieron en disolucion salina y se filtraron a 0,2 jm. El dextrano-DOTA-Y final contema aproximadamente 130 moleculas de DOTA, segun se evaluo mediante un ensayo TNBSA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, Ill.).

Radiomarcaje: Los compuestos de DOTA se disolvieron a 0,5 mM en acetato de amonio, pH 5,6. Se anadio 177LuCl3 (PerkinElmer, Waltham, MA) o 111InCl3 (Cardinal Health, Dublin, OH) 1-2 mCi al quelato de metal y se incubo durante 1-2 h a 85-95 °C. Los compuestos radiomarcados se purificaron mediante RP-HPLC (Humblet et al., Contrast Media Mol. Formacion de imagenes: 1:196-211, 2006; Misra et al., J. Nucl. Med., 48:1379-1389, 2007) con deteccion gamma en una columna de 4,6 x 75 mm Symmetry C18 empleando un gradiente lineal de B del 0% al 40% B a lo largo de 15 minutos, con un caudal de 1 ml/min, siendo A = TEAA 10 mM y B = metanol. Los compuestos purificados se secaron al vado, se resuspendieron en disolucion salina y se esterilizaron mediante filtracion.

Las protemas de IgG y bsAb se conjugaron con p-SCN-Bn-DTPA (Macrocyclics) segun se ha descrito (Cooper et al., Nat. Protoc., 1:314-317, 2006). La protema marcada con DtPA concentrada se incubo con 111InCh de aproximadamente 1 mCi durante 30 minutos a temperatura ambiente. La protema se diluyo con 500 jl de disolucion salina y se concentro hasta aproximadamente 50 jl empleando columnas giratorias de valor de corte de peso molecular 5000 Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech, Aubagne, Francia). La protema marcada con 111In se diluyo con 500 jl de disolucion salina y se concentro dos veces mas.

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Se preparo 111In-DOTA-dextrano sintetizando el dextrano-DOTA tal como se describio anteriormente, sin carga de itrio fno. El dextrano-DOTA se incubo con 111 InCl31-2 mCi durante 1 h a 37°C, seguido de una concentracion y una dilucion con disolucion salina, tal como se describio anteriormente.

Modelos animales: Todas las manipulaciones de los animales se realizaron segun las directrices de BIDMC IACUC. Los ratones NCRU-nu/nu macho se adquirieron en Taconic Farms (Germantown, N.Y.). Para la biodistribucion y la captacion tumoral se inyecto hapteno marcado con 177Lu o 1111In 100-150 pCi por v^a intravenosa a los ratones. Se recogio sangre de la vena de la cola empleando tubos microcapilares y se conto en un contador gamma de 10 detectores modelo 1470 Wallac Wizard (Perkin Elmer, Wellesley, MA). Los ratones recibieron la eutanasia mediante una inyeccion intraperitoneal de pentobarbital, seguido de dislocacion cervical, un metodo coherente con las recomendaciones del Panel on Euthanasia of the American Veterinary Medical Association. Se retiraron los organos y los tumores, se lavaron en PCS tres veces, se pesaron y se contaron como se describio anteriormente.

Dosimetna: Se calcularon las dosis de radiacion absorbidas por los tejidos normales distintos a la medula roja, segun el esquema de MIRD. Se calculo el porcentaje de actividad inyectada en el tumor, los rinones, el tugado, la sangre y el cuerpo entero a partir de las mediciones de actividad. Se supuso que la actividad en el momento 0 era de 4% ID/g en el rinon y el tugado, de 50% ID/g en la sangre, de 0% ID/g en el tumor y de 100% en el cuerpo entero. La actividad ajustada a la descomposicion del isotopo se integro a lo largo del tiempo, con una suposicion conservadora de que el porcentaje de ID en los organos a las 48 h permanece constante despues. Se emplearon los valores S para 90Y y 177Lu para calcular las estimaciones de la dosimetna en machos adulos de referencia (Stabin y Siegel, Health Phys., 85:294-310, 2003). La dosis para la medula roja se calculo como se ha descrito (Wessels et al., J. Nucl. Med., 45:1725-1733, 2004) a partir de las mediciones de actividad en sangre. Se empleo la actividad en el cuerpo completo para calcular la actividad acumulada total del cuerpo utilizada para los calculos de dosis cruzada. Las dosis para el tumor se calcularon a partir de la autodosis utilizando solo factores S para una esfera de unidad de densidad del tamano de 500 g (el promedio del tamano del tumor LS174T se escalo en 2000).

Formacion de imagenes: Se realizaron barridos de SPECT/CT (tomograffa computerizada de emision de un solo foton/tomograffa computerizada) y analisis de las imagenes empleando un escaner para roedores (NanoSPECT/CT™, Bioscan, Washington, D.C.) equipado con una fuente de rayos X de 8 W que actua a 45 kV (177 pA), y un detector de rayos X CMOS-CCD de 48 pm de inclinacion. Los ratones se anestesiaron en una camara anestesica con isoflurano y se trasladaron a un lecho en un caballete para la formacion de imagenes, en donde se mantuvo la anestesia con gas durante toda la duracion del barrido. Despues de la adquisicion de un topograma de CT, se realizo un microSPECT helicoidal empleando una camara gamma de cuatro cabezas equipada con colimadores de multiples agujeros de alfiler (1,4 mm) y un tiempo total de barrido de 45 minutos. Las imagenes de SPECT se adquirieron a traves de 360 grados en 24 proyecciones, empleando en cada una un tamano de marco de 256 x 256 (1,0 mm pfxeles). Las imagenes se reconstruyeron con un programa informatico de reconstruccion iterativa Bioscan HiSPECT™ y se fusionaron con las imagenes de CT. Inmediatamente despues del barrido, los ratones se sacrificaron y los tejidos y tumores se pesaron y se contaron como se describio anteriormente.

Resultados: El bsAb Sm3e/C825 se produjo y se purifico como se describio anteriormente. La biodistribucion a las 24 h del bsAb y de la IgG Sm3e de origen en ratones atfmicos macho que portan tumores CEA-positivos (LS174T) y CEA-negativos (C6) demuestra una acumulacion espedfica similar en el tumor positivo al antfgeno con una captacion aproximadamente 4 veces mayor que el tumor negativo al antfgeno. Ademas permanecio una alta actividad en la sangre a las 24 h, tal como se esperaba, debido a la lenta eliminacion sangumea de los compuestos que contienen Fc.

Ratones prelocalizados con 500 pg de bsAb fueron inyectados con 111In-DOTA-Bn 24 h despues. La biodistribucion a las 4 h mostro una actividad significativamente mayor en todos los organos debido a la union a los bsAb. De especial consideracion es la alta actividad en la sangre y la baja proporcion de tumor a sangre. La alta actividad en sangre motivo el desarrollo de un agente de eliminacion/bloqueo.

Los inventores modificaron un agente de bloqueo basado en dextrano empleando un aminodextrano de 500 kDa (aproximadamente 136 grupos amino por molecula de dextrano) conjugado a DOTA. El compuesto resultante contiene aproximadamente 130 moleculas de DOTA por dextrano. El compuesto de dextrano-DOTA se cargo con itrio no radiactivo y, cuando se inyecta en ratones prelocalizados una hora antes de la administracion del hapteno, produce una eliminacion del hapteno en la sangre fundamentalmente identica a la del hapteno solo. Esto sugiere que se produce un bloqueo/eliminacion fundamentalmente completa de los bsAb residuales en la sangre. El dextrano-DOTA se radiomarco con 111In para caracterizar las propiedades in vivo del agente de dextrano solo. Se analizo la biodistribucion y la eliminacion de la sangre de 111In-DOTA-dextrano en ratones que portan tumores. El agente de dextrano se elimina con mucha rapidez de la sangre y muestra una captacion muy alta en el tugado y el bazo 4 h despues de la inyeccion ("post-injection", p.i.).

Despues se ensayo un protocolo que implica a los tres reactivos para determinar la eficacia del sistema de PRIT modificado de los inventores. Se inyectaron ratones por via intravenosa con 500 pg de bsAb, seguido de 250 pg de agente de eliminacion de dextrano-DOTA-Y 24 h despues. Despues de una hora mas, se inyecto 177Lu-DOTA 100150 pCi por via intravenosa. A las 4 h despues de la inyeccion del DOTA radiomarcado, la captacion tumoral era de 7,44 +/- 0,41% ID/g en el tumor positivo al antfgeno, 84 veces mayor que la captacion tumoral observada para 177Lu-

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DOTA solo. La actividad tambien es mayor en el tejido no tumoral debido a la union de 177Lu-DOTA a bsAb residuales en el compartimento extravascular. La captacion tumoral en el tumor negativo al antigeno era de 9,82 +/- 0,35% ID/g a las 4 h, similar al tumor positivo al antigeno, debido a la captacion no espedfica, por la mayor permeabilidad y retencion (EPR), del bsAb. A lo largo del tiempo, la actividad tumoral en el tumor negativo al antfgeno disminuyo hasta 4,23 +/- 0,54% ID/g a las 24 h y 2,89 +/- 2,28% ID/g a las 48 h, mientras que la actividad tumoral en el tumor positivo al antigeno aumento hasta 14,3 +/- 1,8% ID/g a las 24 h y permanecio fundamentalmente constante a las 48 h. La proporcion de tumor LS174T a sangre aumento desde 18 +/- 2 a las 4 h hasta 380 +/- 90 a las 24 h, y fue mayor que 450 a las 48 h. A las 48 h, la actividad en sangre no pudo medirse por encima del fondo. La proporcion de LS174T a rinon aumento desde aproximadamente 8 a las 4 h a aproximadamente 20 a las 24 y 48 h. Las imagenes de SPECT/CT confirmaron los datos de biodistribucion cuantitativa con una alta senal de PSECT en los tumores positivos a CEA, una menor senal en el tumor negativo a CEA, y sin senal observable en tejido no tumoral.

A partir de los datos de biodistribucion en organos de PRIT, se calculo la dosis de radiacion para el rinon, hngado, medula roja y tumor positivo al antfgeno para un hombre de 70 kg para 90Y and 177Lu. Hay que senalar que estos calculos se generan a partir de los datos de biodistribucion en ratones y, por tanto, son aproximaciones; seran necesarios datos clmicos en seres humanos para determinar una dosimetna mas precisa. Las dosis calculadas para el rinon, hngado y medula roja se calcularon a partir de la autodosis y la dosis cruzada, empleandose la actividad en el cuerpo entero para determinar la dosis cruzada. La dosis calculada para el tumor se determino solo a partir de la autodosis. Las toxicidades limitantes de la dosis (TD5/5) para el tngado, el rinon y la medula osea calculadas a partir de radiacion de haces externos fueron de 30 Gy, 23 Gy, y 1,5 Gy, respectivamente (Emami et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol., Phys., 21:109-122, 1991). A partir de los calculos de dosis de radiacion se predice que el organo limitante de la dosis es la medula roja para los haptenos de 90Y-DOTA y 177Lu-DOTA. A una dosis en medula roja de 1,5 Gy, la dosis calculada al tumor es de 98 Gy para 90Y, y de 156 Gy para 177Lu. En general se piensa que una dosis mayor que 50 Gy es suficiente para erradicar la mayona de los tumores (Govindan et al., Pharm. Sci. Technolo. Today, 3:90-98, 2000).

El protocolo de prelocalizacion descrito anteriormente se empleo para analizar el efecto de la afinidad sobre la captacion tumoral de DOTA radiomarcado. El bsAb muestra unas afinidades de aproximadamente 10 nM para 111In- dOtA, aproximadamente 1 nM para 111In-DOTA-Bn, aproximadamente 100 pM para 177Lu-DOTA, y aproximadamente 10 pM para 177Lu-DOTA-Bn. Se determino la biodistribucion en organos/tejidos a las 24 h en ratones que portan tumores con cada uno de los cuatro compuestos de DOTA radiomarcados. Las imagenes de SPECT/CT de un raton de cada grupo mostraron que es necesaria una afinidad nanomolar de al menos un dfgito para observar una senal en el tumor positivo al antfgeno. La actividad a las 24 h en el tumor LS174T aumento desde 0,5 +/- 0,1% ID/g para la afinidad de aproximadamente 10 nM, hasta 1,6 +/- 0,3% ID/g para una afinidad de aproximadamente 1 nM, y hasta 14,3 +/- 1,8% ID/g para una afinidad de aproximadamente 100 pM. La actividad tumoral para la afinidad de aproximadamente 10 pM no se diferencia significativamente de la de la afinidad de aproximadamente 100 pM. La actividad en el tumor negativo al antfgeno C6 aumenta con la afinidad, probablemente debido a la captacion no espedfica de bsAb. La actividad en los tejidos no tumorales tambien es mayor para los compuestos de mayor afinidad debido a la mayor afinidad de union a los bsAb residuales. La proporcion de tumor a rinon aumento desde 1,2 +/- 0,4 para aproximadamente 10 nM hasta 17 +/- 3 para aproximadamente 100 pM, pero despues disminuyo hasta 10 +/- 2 para una afinidad de aproximadamente 10 pM debido a la mayor captacion en el rinon con una captacion tumoral similar.

Los resultados experimentales a las 24 h de captacion tumoral frente a la afinidad se compararon con predicciones matematicas basadas en un modelo compartimental previamente publicado de captacion tumoral (Schmidt y Wittrup, Mol. Cancer. Ther., 8:2861-2871, 2009). Se calculo la permeabilidad vascular a partir del modelo de dos poros de la pared capilar para una molecula de 1 kDa. Se calculo que la densidad superficial era de 2 x 105 sitios de union a DOTA por celula, basandose en la acumulacion tumoral a las 24 h de bsAb, la actividad a las 24 h del scFv en suero, y la tasa de internalizacion a las 15 h de CEA que provoca que aproximadamente la mitad del bsAb acumulado se internalice y, por tanto, resulte inaccesible a la union. Se calcularon los parametros de eliminacion de la sangre a partir de un ajuste biexponencial de la eliminacion en sangre in vivo medida para 177Lu-DOTA.

Los resultados experimentales pueden cotejarse bien con la prediccion del modelo, aumentando significativamente la captacion tumoral a las 24 h desde 1 nM a 100 pM de afinidad, y despues alcanzando una meseta con una mejora adicional en la afinidad de 100 pM a 10 pM que no produce una mejora significativa en la afinidad desde 100 pM a 10 pM que no produce una mejora significativa en la actividad tumoral a las 24 h.

Analisis: Se presenta un nuevo metodo para una radioinmunoterapia prelocalizada que emplea un bsAb de IgG- scFv, un agente de bloqueo basado en dextrano, y DOTA radiomarcado. El sistema de PRIT modificado se ensayo en ratones con xenoinjertos que portan tumores CEA-positivos y CEA-negativos. El bsAb muestra una afinidad de aproximadamente 100 pM por 177Lu-DOTA. Se ha demostrado previamente que 177Lu-DOTA muestra una eliminacion del cuerpo entero muy rapida en ratones. En la presente se demuestra que la elevada captacion y retencion del tumor LS174T de 177Lu-DOTA, con una rapida eliminacion del tejido no tumoral, produce las proporciones mas altas indicadas de tumor a sangre y de tumor a rinon a las 48 h p.i. para el transporte dirigido de CEA.

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Se observo una cantidad significativa de captacion de 177Lu-DOTA en tumores CEA-negativos en los momentos tempranos. Una mayor permeabilidad y retencion (EPR) produce una acumulacion en el tumor no espedfica de compuestos de alto peso molecular. Aunque se observa una captacion de bsAb aproximadamente 4 veces mayor en los tumores LS174T frente a los tumores C6, la diferencia en la captacion de haptenos en los momentos tempranos sena menor porque una fraccion significativa del bsAb localizada en los tumores LS174T es inaccesible debido a la semivida de internalizacion de 15 h de CEA (Schmidt et al., Cancer Immunol. Immunother., 2008), mientras que todos los bsAb en los tumores C6 resultan accesible a la union de haptenos. Esto es coherente con la observacion de actividades similares en los dos tumores en los momentos tempranos. En momentos mas tardfos, el anticuerpo no unido se intravasa fuera del tumor CEA-negativo, mientras que el anticuerpo unido a CEA en los tumores LS174T internaliza los compuestos de 177Lu-DOTA, por lo que el radiomarcador queda atrapado dentro de la celula.

La estrategia de PRIT presentada en la presente se origina de una perspectiva de diseno de modificacion logica. Se ha empleado la modelizacion matematica para predecir la afinidad necesaria para una captura eficaz del hapteno y la retencion en el sitio del tumor. Despues se modifico un bsAb similar a IgG para conservar la lenta eliminacion de la sangre que produce una alta captacion tumoral, para conservar la funcion inmunologica secundaria potencialmente beneficiosa, y para permitir una produccion y purificacion identica a la de una IgG. Los inventores disenaron su sistema para emplear simplemente DOTA con el hapteno, sin que sean necesarias mas smtesis o modificaciones, con lo que se eliminan problemas con la escision del marcador y la estabilidad del peptido (van Gog et al., Nucl. Med., Biol., 25:611-619, 1998; van Schaijk et al., Clin. Cancer Res., 11:7130s-7136s, 2005). El DOTA quelado al gadolinio se ha administrado a sujetos humanos en concentraciones milimolares y tiene un perfil de seguridad establecido. Los quelatos de metal y DOTA muestran una rapida eliminacion de la sangre y se observa la eliminacion del cuerpo entero en ratones y seres humanos (Le Mignon et al., Invest. Radiol., 25:933-937, 1990). Cuando se compara sistematicamente con otros compuestos basados en DOTA, 177Lu-DOTA muestra una captacion en Idgado e intestino ligeramente menor a las 4 h p.i., comparado con DOTA-biotina y DOTA-Bn radiomarcados en ratones CD1 normales. Esto sugiere que DOTA muestra una eliminacion renal fundamentalmente completa, mientras que DOTA-biotina y DOTA-Bn muestran algo de eliminacion a traves de la bilis. Este efecto puede ser mas o menos pronunciado en seres humanos.

La eliminacion de tejidos no tumorales de DOTA no es siquiera tan rapida en ratones prelocalizados con bsAb, incluso con la adicion del agente de eliminacion de dextrano, debido a la eliminacion incompleta que deja anticuerpos residuales. Multiples dosis del agente de eliminacion o la infusion del agente de eliminacion a lo largo de un periodo de tiempo producina probablemente una eliminacion del bsAb mas completa del tejido no tumoral, puesto que los bsAb reiduales en el espacio extravascular se volvenan a reciclar hacia la corriente sangumea a lo largo del tiempo (Press et al., Blood, 98:2535-2543, 2001). Una menor masa de dextrano tambien mejorana la eliminacion de bsAb; sin embargo, sena necesario equilibrar la eliminacion mejorada con una posible captacion tumoral de agentes mas pequenos que producina el bloqueo de los sitios de union del hapteno.

Los inventores han descubierto unas excelentes proporciones de tumor:sangre, que aparecieron a pesar de la dosis excepcionalmente alta de bsAb. Otros estudios de metodos de prelocalizacion indican unas proporciones decrecientes de tumor:sangre a medida que aumentan las dosis de bsAb (Sharkey et al., Nat. Med., 11:1250-1255, 2005; van Schaijk et al., Clin. Cancer Res., 11:7130s-7136s, 2005). El metodo de los inventores produce un alto numero de sitios de union del hapteno en el tumor en el momento de la dosificacion del hapteno. Esto es importante, puesto que el numero de sitios de union del hapteno esta directamente relacionado con el numero de radioisotopos que pueden ser capturados y retenidos en el sitio del tumor, lo cual influye en la maxima dosis posible. Aunque la radioinmunoterapia prelocalizada en tres etapas anade complejidad frente a los procedimientos de dos etapas, aquella permite administrar unas dosis mas altas de bsAb, con lo cual se logran unas dosis tumorales mas altas, asf como una distribucion mas homogenea dentro del tumor. Ademas, permite la aparicion de posibles efectos inmunologicos secundarios que surgen del dominio Fc retenido que pueden ser significativos (Sharkey et al., J. Nucl. Med., 50:444-453, 2009). Las estrategias de dos etapas pueden ser suficientes para la formacion de imagenes moleculares para mejorar la busqueda y estadificacion del cancer (Sharkey et al., Nat. Med., 11:1250-1255, 2005; Sharkey et al., Radiology 246:497-507, 2008). Sin embargo, se anticipa que el mayor numero de sitios de union del hapteno que ofrecen las estrategias de tres etapas sera importante para la terapia.

Claims (14)

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   REIVINDICACIONES

   1. - Una protema modificada multiespedfica que comprende una primera secuencia de aminoacidos de una inmunoglobulina, una protema de andamiaje, o una porcion de union al antigeno de una inmunoglobulina o una protema de andamiaje que se une espedficamente a una molecula diana, y una segunda secuencia de aminoacidos de un fragmento variable monocatenario (scFv) que se une espedficamente a un quelato de metal que comprende DOTA, o uno de sus variantes activos, en la que el scFv comprende la secuencia de aminoacidos de los restos 1244 de SEQ ID NO:11 en la figura 3, segun se representa en SEQ ID NO:12.
2. 2. - La protema modificada de la reivindicacion 1, en la que la primera secuencia de aminoacidos comprende una region variable de cadena pesada o una region variable de cadena ligera de una inmunoglobulina, y en la que la primera secuencia de aminoacidos esta condensada con o sin un conector con el scFv.
3. 3. - La protema modificada de la reivindicacion 2, que es un anticuerpo biespedfico que comprende un scFv condensado con una region variable de cadena ligera de una inmunoglobulina, y que comprende ademas una secuencia de aminoacidos de una region variable de cadena pesada de la inmunoglobulina.
4. 4. - La protema modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el scFv esta humanizado.
5. 5. - La protema modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la diana es un antfgeno del cancer, una molecula pequena, un compuesto inerte, o una protema expresada por una celula eucariota, una celula procariota o un virus.
6. 6. - La protema modificada de la reivindicacion 5, en la que el antfgeno del cancer es el antfgeno carcinoembrionario (CEA), antfgeno A33, HER-2/neu, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, MUM-I, CDK4, MUC-1, N- acetilglucosaminiltransferasa, p15, gp75, beta-catenina, protema E6 del papilomavirus humano, protema E7 del papilomavirus humano, ErbB2, o antfgeno del cancer 125 (CA-125).
7. 7. - La protema modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la primera secuencia de aminoacidos comprende una protema de andamiaje, tal como el dominio de fibronectina de tipo III (Fn3).
8. 8. - La protema modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la protema modificada comprende una inmunoglobulina que comprende (a) una region Fc, y/o (b) una mutacion que atenua la glicosilacion.
9. 9. - La protema modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el variante activo de DOTA es un compuesto de formula I:

   imagen1

   o su sal farmaceuticamente aceptable; en la que:

   cada X se selecciona independientemente de carboxi, -C(=O)NHRd, -P(=O)(OH)(ORd), -S(=O)OH, -S(=O)2OH, -SH, -OH, -OC(=O)NHRd, -OC(=S)NHRd, -NHC(=O)NReRf, -NHC(=S)NReRf, -NReC(=O)NHRf, y -NReC(=S)NHRf;

   cada L1 es, independientemente, alquileno C1-6, alquenileno C1-6, o alquinileno C1-6, cada uno de los cuales esta opcionalmente sustituido con 1, 2, o 3 grupos seleccionados independientemente de halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi C1-4, haloalcoxi C1-4, alquiltio C1-4, alquilsulfinilo C1-4, alquilsulfonilo C1-4, amino, alquilamino C1-4, dialquilamino C1-4, (alquil C1-4)carbonilo, carboxi, (alcoxi C1-4)carbonilo, (alquil C1-4)carbonilamino, (dialquil C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonil-(alquil C1-4)amino, carbamilo, (alquil C1-4)carbamilo, y (dialquil C1- 4)carbamilo;

   cada L2 es independientemente un alquileno de cadena lineal C2-4, que esta opcionalmente sustituido con un grupo R1 seleccionado independientemente y que esta opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, o 4 grupos seleccionados independientemente de alquilo C1-4 y haloalquilo C1-4;

   cada R1 se selecciona independientemente de H, -D1-D2-D3, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi C1-6, haloalcoxi C1-6, alquiltio C1.6, alquilsulfinilo C1.6, alquilsulfonilo C1.6, amino, alquilamino C1-6, dialquilamino C1.6, (alquil C1-4)carbonilo, carboxi, (alcoxi C1-6)carbonilo, (alquil C1-6)carbonilamino, (dialquil C1-6)carbonilamino, (alcoxi C1-6)carbonilamino, (alcoxi C1-6)carbonil-(alquil C1-6)amino, carbamilo, (alquil C1-6)carbamilo, y (dialquil C1-6)carbamilo;

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   cada D1 se selecciona independientemente de (arilo C6-io)-alquilo C1-4, (heteroaril C1-g)-alquilo C1-4, (cicloalquil C3-10)- alquilo C1.4, (heterocicloalquil C2-g)-alquilo C1.4, alquileno C1.8, alquenileno C1-8, y alquinileno C1-8; en la que dichos alquileno C1.8, alquenileno C1-8, y alquinileno C1.8 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos R4 seleccionados independientemente; y en la que dichos (arilo Ca-10)-alquilo C1.4, (heteroaril C1.g)-alquilo C1-4, (cicloalquil C3-10)-alquilo C1.4, y (heterocicloalquil C2-g)-alquilo C1.4 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos R5 seleccionados independientemente;

   cada D2 esta independientemente ausente o es alquileno de cadena lineal C1-20, en la que de 1 a a grupos metileno no adyacentes de dicho alquileno de cadena lineal C1-20 estan cada uno opcionalmente reemplazados por un resto - D4 seleccionado independientemente, con la condicion de que al menos una unidad de metileno en dicho alquileno de cadena lineal C1-20 no esta opcionalmente reemplazado por un resto -D4; en la que dicho alquileno de cadena lineal C1-20 esta opcionalmente sustituido con uno o mas grupos seleccionados independientemente de halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alquilo C1-4, haloalquilo C1-4, alcoxi C1.4, haloalcoxi C1.4, amino, alquilamino C1-4, dialquilamino C1.4, (alquil C1-4)carbonilo, carboxi, (alcoxi C1-4)carbonilo, (alquil C1-4)carbonilamino, (dialquil C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonil-(alquil C1-4)amino, carbamilo, (alquil C1-4)carbamilo, y (dialquil C1- 4)carbamilo;

   cada D3 se selecciona independientemente de H, halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alquilo C1-a, haloalquilo C1-a, alquenilo C2-a, alquinilo C2-a, cicloalquilo C3-14, (cicloalquil C3-14)-alquilo C1.4, heterocicloalquilo C2-14, (heterocicloalquil C2-14)-alquilo C1.4, arilo Ca-14, (aril Ca-14)-alquilo C1.4, heteroarilo C1.13, (heteroaril C1-13)-alquilo C1.4; en la que dichos alquilo C1-a, haloalquilo C1-a, alquenilo C2-a, y alquinilo C2-a estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos Ra seleccionados independientemente; y en la que dichos cicloalquilo C3-14, (cicloalquil C3-14)-alquilo C1-4, heterocicloalquilo C2-14, (heterocicloalquil C2-14)-alquilo C1.4, arilo Ca-14, (aril Ca-14)-alquilo C1-4, heteroarilo C1-13, (heteroaril C1-13)-alquilo C1-4 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos R7 seleccionados independientemente;

   cada D4 se selecciona independientemente de -O-, -S-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=S)-, -NRbC(=O)NRc-, -NRbC(=S)NRc-, -S(=O)-, -S(=O)2-, -S(=O)NRa-, -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=O)O-, -OC(=O)NRa-, -OC(=S)NRa, -NRbS(=O)NRc-, y - NRbS(=O)2NR0-;

   cada R4 y Ra se selecciona independientemente de halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi C1-4, haloalcoxi C1-4, alquiltio C1-4, alquilsulfinilo C1-4, alquilsulfonilo C1-4, amino, alquilamino C1-4, dialquilamino C1-4, (alquil C1-4)carbonilo, carboxi, (alcoxi C1-4)carbonilo, (alquil C1-4)carbonilamino, (dialquil C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonil-(alquil C1-4)amino, carbamilo, (alquil C1-4)carbamilo, y (dialquil C1-4)carbamilo;

   cada R5 se selecciona independientemente de halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alquilo C1-4, alquenilo C2-4, alquinilo C2-4, alcoxi C1-4, haloalcoxi C1-4, alquiltio C1-4, alquilsulfinilo C1-4, alquilsulfonilo C1-4, amino, alquilamino C1-4, dialquilamino C1-4, (alquil C1-4)carbonilo, carboxi, (alcoxi C1-4)carbonilo, (alquil C1-4)carbonilamino, (dialquil C1- 4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonilamino, (alcoxi C1-4)carbonil-(alquil C1-4)amino, carbamilo, (alquil C1-4)carbamilo, y (dialquil C1-4)carbamilo;

   cada R se selecciona independientemente de halogeno, ciano, nitro, hidroxilo, alquilo C1-a, alquenilo C2-a, alquinilo C2-a, cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1-4, heterocicloalquilo C2-7, (heterocicloalquil C2-7)-alquilo C1-4, fenilo,

   (fenil)-alquilo C1-4, heteroarilo C1-7, (heteroaril C1-7)-alquilo C1-4, -ORo, -SRo, -S(=O)RP, -S(=O)2RP, -S(=O)NRsR*, - C(=O)RP, -C(=O)ORP, -C(=O)NRsR‘, -OC(=O)RP, -OC(=O)NRsR*<, -NRsR*, -NRqC(=O)Rr, -NRqC(=O)ORr, - NRqc(=O)NRr, -NRqS(=O)2Rr, y -NRPS(=O)2NRsR‘; en la que dichos alquilo C1-a, alquenilo C2-a, alquinilo C2-a estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1,2, 3, o 4 grupos R' seleccionados independientemente; y en la que dichos cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1-4, heteroarilo C1-7, (heteroaril C1-4)-alquilo C1-4 estan cada uno

   opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos R" seleccionados independientemente;

   cada Ra, Rb, Rc, Rd, Re, y Rf se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-a, haloalquilo C1-a, alquenilo C2-a,

   alquinilo C2-a, cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1-4, heterocicloalquilo C2-7, (heterocicloalquil C2-7)-alquilo C1-4, fenilo, (fenil)-alquilo C1-4, heteroarilo C1-7, y (heteroaril C1-7)-alquilo C1-4; en la que dichos alquilo C1-a, haloalquilo C1-a, alquenilo C2-a, y alquinilo C2-a estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos Rw seleccionados independientemente; y en la que dichos cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1-4, heterocicloalquilo C2-7, (heterocicloalquil C2-7)-alquilo C1-4, fenilo, (fenil)-alquilo C1-4, heteroarilo C1-7, y (heteroaril C1-7)-alquilo C1-4 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos Rx seleccionados independientemente;

   cada Ro, Rp, Rq, Rr, Rs, y R4 estan cada uno seleccionado independientemente de H, alquilo C1-a, haloalquilo C1-a, alquenilo C2-a, alquinilo C2-a, cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1-4, heterocicloalquilo C2-7, (heterocicloalquil C2-7)-alquilo C1-4, fenilo, (fenil)-alquilo C1-4, heteroarilo C1-7, y (heteroaril C1-7)-alquilo C1-4; en la que dichos alquilo C1- a, haloalquilo C1-a, alquenilo C2-a, y alquinilo C2-a estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos Ry seleccionados independientemente; y en la que dichos cicloalquilo C3-7, (cicloalquil C3-7)-alquilo C1-4,

   heterocicloalquilo C2-7, (heterocicloalquil C2-7)-alquilo C1-4, fenilo, (fenil)-alquilo C1-4, heteroarilo C1-7, y (heteroaril C1- 7)-alquilo C1-4 estan cada uno opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, o 4 grupos Rz seleccionados

   independientemente;

   cada R', Rw y Ry se selecciona independientemente de hidroxilo, ciano, nitro, alcoxi C1-4, haloalcoxi C1-4, amino, alquilamino C1-4, y dialquilamino C1-4;

   y cada R", Rx y Rz se selecciona independientemente de hidroxilo, halogeno, ciano, nitro, alquilo C1-4, haloalquilo C1- 4, alcoxi C1-4, haloalcoxi C1-4, amino, alquilamino C1-4, y dialquilamino C1-4;

   5 con la condicion de la que no se exceda la Valencia de cada atomo en los restos opcionalmente sustituidos.
10. 10. - Un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica la protema modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. 11. - Un vector de expresion que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 10.
12. 12. - Una celula hospedante que comprende el vector de expresion de la reivindicacion 11.

    10 13.- Una composicion farmaceutica que comprende la protema modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
13. 14. - Una protema modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso como un medicamento.
14. 15. - El uso de una protema modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un trastorno proliferativo o una enfermedad infecciosa, en el que la protema modificada se dirige a un antfgeno expresado por una celula que esta proliferando de una manera no deseada o un

    15 antfgeno expresado por un agente infeccioso.